UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM

ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO POR VIA FERMENTATIVA UTILIZANDO

CORVINA (Micropogonias furnieri) COMO FONTE DE NITROGÊNIO

SANDRIANE PIZATO

Orientador: Prof. Dr. Carlos Prentice-Hernández

Co-Orientadora: Profª. Drª. Christiane Saraiva Ogrodowski

RIO GRANDE, RS

2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM

ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁTICO POR VIA FERMENTATIVA UTILIZANDO

CORVINA (Micropogonias furnieri) COMO FONTE DE NITROGÊNIO

SANDRIANE PIZATO

Tecnóloga em Industrialização de Carnes

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia e Ciência de

Alimentos, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutora em

Engenharia e Ciência de Alimentos.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Prentice-Hernández

Co-Orientadora: Prof. Drª. Christiane Saraiva Ogrodowski

RIO GRANDE, RS

2015

ii

Dedicatória

Aos meus pais Waldir e Araci

Pelo amor e dedicação integral em todas as etapas de minha vida,

sempre me incentivando a lutar pelos meus ideais.

Pelo esforço sem limites em me fornecer a melhor herança... o Estudo.

Por estarem sempre presentes em minha vida, mesmo com a distância.

As minhas irmãs Luciani e Solange

Pela prova de afeição e estímulo em todos os momentos

Ao William

Pelo apoio e paciência incondicional e que apesar da distância sempre

esteve “perto”

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre me guiar, me ajudando a vencer os obstáculos que apareceram

durante toda esta caminhada.

Aos meus pais Waldir e Araci Pizato pelo exercício constante de amor, pela proteção e

apoio a cada passo, pela dedicação incondicional, sempre torcendo e me incentivando

a realizar meus sonhos.

Às minhas irmãs Luciani e Solange Pizato pelo apoio, incentivo e amizade, e por

sempre estarem torcendo por mim.

Ao meu marido William Cortez-Vega, pela compreensão, apoio, por estar sempre perto,

mesmo que na distância, me incentivando e me mostrando que os obstáculos surgem

para serem superados e por acreditar em mim...TE AMO!

Ao meu orientador Professor Dr. Carlos Prentice-Hernández pela colaboração,

paciência, amizade e conhecimentos repassados durante todo o desenvolvimento desta

tese.

A minha Co-Orientadora Professora Drª. Christiane Ogrodowski, pelo apoio e

conhecimentos repassados no desenvolvimento deste trabalho.

À Universidade Federal de Rio Grande por me proporcionar espaço físico para a

realização do meu trabalho e fazer com que eu crescesse profissionalmente.

Ao Professor Dr. Carsten Harms e a Applied University of Bremerhaven na Alemanha

por me proporcionar a oportunidade da realização do meu doutorado sanduíche e pelo

conhecimento por eles me repassados.

Ao Professor Dr. Gustavo Fonseca da UFGD pela doação dos micro-organismos

utilizados neste trabalho.

À Pós Doutoranda Drª. Michele de Souza, pela amizade, companheirismo e pela ajuda

na execução deste trabalho.

Aos técnicos de laboratório Sabrine, Roque, Ana e Rafael pelo apoio, preparo e

empréstimo de materiais durante a execução desta tese.

A todos os meus colegas LTAenses que sempre me ajudaram, me incentivaram e

torceram por mim.

Aos amigos, em especial a Elida e o Felipe, que sempre tiveram próximos a mim,

dividindo lágrimas, alegrias, momentos especiais que vão ficar para sempre na minha

memória.

À Secretária de Pós Graduação Islanda, por sempre estar à disposição para resolver os

problemas e ser tão solicita quando requisitada.

A CAPES pelo apoio financeiro durante todo o meu doutorado.

A todos os Professores do Programa de Pós Graduação em Engenharia e Ciência de

Alimentos da FURG, pelo constante conhecimento ensinado.

Enfim, a todos que de forma direta ou indiretamente me ajudaram para que a

conclusão desta tese, ou melhor, deste sonho, fosse possível.

Muito Obrigada!

iv

RESUMO

Os maiores custos na produção por via fermentativa de ácido lático estão no substrato

utilizado ao definir as fontes de carbono e nitrogênio. Sendo assim, a busca por fontes

de baixo custo e renováveis está em evidência. O objetivo do presente trabalho foi

produzir ácido lático por via fermentativa utilizando corvina (Micropogonias furnieri)

como fonte de nitrogênio. Inicialmente foram testadas dez bactérias ácido láticas

(Lactobacillus rhamnosus, Weisella viridescens, Oneococcus oeni, Lactobacillus sakei,

Bifidobacterium longum, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillus casei subespécie casei, Carnobacterium maltaromaticum e Lactobacillus

plantarum). Esses micro-organismos foram colocados em caldo Mann, Rogosa e Sharpe

enriquecido com 20% de glicose, previamente autoclavado e fermentados por 48 h. Para

verificar produção de biomassa, fator de conversão e µmax, foram retiradas alíquotas de

4 em 4 h; os cinco micro-organismos que mais produziram biomassa foram

selecionados para realizar um screening de variáveis para verificar quais delas seriam

mais influentes para a produção de biomassa e ácido lático, utilizando extrato de

levedura como fonte de nitrogênio. Foram verificados os efeitos mais significativos

(temperatura e concentração de nitrogênio). Também foi aplicado um planejamento

DCCR (delineamento composto central rotacional), para os dois micro-organismos que

mais produziram ácido lático e biomassa, porém foi substituído o extrato de levedura

pelo nitrogênio extraído por hidrólise ácida do músculo de corvina. Dos micro-

organismos que foram cultivados em caldo MRS, os que apresentaram maior produção

de biomassa, fator e conversão e µmax foram L. acidophilus, L. plantarum, W.

viridescens, B. longum e L. rhamnosus. Destes, apenas L. acidophilus e L. rhamnosus

apresentaram efeito significativo em relação à concentração de nitrogênio e

temperatura. A partir do DCCR, verificou-se que o micro-organismo que apresentou

maior produção de biomassa e ácido lático foi L. rhamnosus. A maior produção de

biomassa para esse micro-organismo foi de 2,72 g/L e, ácido lático de 19,21 g/L em 48

h. Pelo DCCR pode-se comprovar que a menor temperatura utilizada (28 ºC) e a menor

concentração de nitrogênio (1,05g/L) foram o que proporcionaram a maior produção nas

respostas avaliadas. Foi possível verificar a produção de ácido lático utilizando

proteínas provenientes do músculo de corvina como fonte de nitrogênio, o que poderia

diminuir os custos do processo considerando que a fonte de nitrogênio seria proveniente

de um pescado de baixo valor comercial.

Palavras chaves: Bactérias ácido láticas, pescado, screening, ácido lático, otimização.

v

ABSTRACT

The higher costs in the production by fermentation of lactic acid are in carbon and

nitrogen sources used, so the search for cheap and renewable sources is in evidence so

that the cost is less. The aim of this study was to produce acid lactic by fermentation

using Whitemouth croaker (Micropogonias furnieri) as nitrogen source. Ten acid lactic

bacteria were initially tested (Lactobacillus rhamnosus, Weisella viridescens,

Oneococcus oeni, Lactobacillus sakei, Bifidobacterium longum, Pediococcus

acidilactici, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei subspecie casei,

Carnobacterium maltaromaticum and Lactobacillus plantarum). These microorganisms

were placed in sterilized MRS broth supplemented with 20% glucose, and fermented for

48 h. To verify the production of biomass conversion factor and µmax, aliquots were

taken every 4 h. The five microorganisms that showed high biomass production were

selected to perform a screening to identify the most influential components in the

production of biomass and lactic acid using yeast extract as nitrogen source. The most

significant effects were verified (temperature and nitrogen concentration). CCRD

(Central Composite Rotatable Design), for the two microorganisms which higher

biomass and lactic acid production was applied, but the yeast extract was substituted by

nitrogen extracted from muscle of Whitemouth croaker obtained by acid hydrolysis. The

microorganisms cultivated in MRS broth which showed high biomass production,

conversion factor and µmax were: L. acidophilus, L. plantarum, W. viridescens, B.

longum and L. rhamnosus. Of these only L. acidophilus and L. rhamnosus showed

significant effects in relation to the nitrogen concentration and temperature. Applying

the CCRD design, the microorganism that showed the highest production of biomass

and lactic acid was L. rhamnosus. The highest production of biomass for this

microorganism was 2.72 g/L and 19.21 g/L of acid lactic in 48 h. By the CCRD it can

be seen that the lowest temperature used (28 °C) and the lowest concentration of

nitrogen (1.05 g/L) were what provided the greatest production evaluated response.

With CCD design was possible to verify the results found by the CCRD. It was also

possible verify the production of lactic acid using proteins derived from muscle of

Whitemouth croaker as a nitrogen source which could reduce process costing, taking in

account that this is a low commercial value fish.

Key words: Lactic acid bacteria, fish, screening, lactic acid, optimization.

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Propriedades físicas do ácido lático ............................................................. 9

Tabela 2 - Matriz experimental Plackett-Burman (valores reais e codificados) para L.

acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum, W. viridescens e B. longum ......................... 32

Tabela 3 - Matriz de delineamento composto central rotacional (DCCR) para os micro-

organismos selecionados ............................................................................................. 36

Tabela 4 – Análise físico química do músculo de corvina ........................................... 37

Tabela 5 - Determinação dos valores cinéticos obtidos para cada micro-organismo

avaliado ...................................................................................................................... 39

Tabela 6 - Respostas obtidas utilizando planejamento Plackett-Burman para produção

de biomassa e ácido lático após 48 h de cultivo ........................................................... 41

Tabela 7 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

concentração de ácido lático para o L. acidophilus ...................................................... 44

Tabela 8 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

concentração ácido lático para B. longum .................................................................... 45

Tabela 9 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e ácido

lático para W. viridescens ............................................................................................ 46

Tabela 10 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

ácido lático para L. rhamnosus .................................................................................... 47

Tabela 11 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

ácido lático para L. plantarum ..................................................................................... 48

Tabela 12 - Valores de pH após 48 h de fermentação apresentados pelo planejamento

DCCR para L. acidophilus e L. rhamnosus .................................................................. 50

Tabela 13 - Respostas encontradas no planejamento DCCR para produção de biomassa

e ácido lático por L. rhamnosus e L. acidophilus ......................................................... 51

Tabela 14 – ANOVA para a produção de biomassa obtida por L. rhamnosus ............. 52

Tabela 15 - ANOVA para a produção de ácido lático obtido por L. rhamnosus .......... 54

Tabela 16 - ANOVA para a produção de biomassa obtida pelo L. acidophilus............ 56

Tabela 17 - ANOVA para a produção de ácido lático obtido por L. acidophilus ......... 57

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Enantiômeros do ácido lático ....................................................................... 9

Figura 2 - Representação esquemática simplificada da rota do metabolismo

homofermentativo de bactérias láticas do Gênero Lactobacillus .................................. 11

Figura 3 - Representação simplificada da rota do metabolismo heterofermentativo de

bactérias láticas do Gênero Lactobacillus .................................................................... 12

Figura 4 - Corvina (Micropogonias furnieri) .............................................................. 23

Figura 5 - Fluxograma da hidrólise ácida para a obtenção das proteínas hidrolisadas do

músculo de pescado .................................................................................................... 34

Figura 6 - Superfície de contorno para a produção de biomassa de L. rhamnosus ....... 53

Figura 7 - Superfície de contorno para a produção de ácido lático pelo L.

rhamnosus........................................................................................................................55

Figura 8 - Superfície de contorno para a produção de ácido lático pelo L. acidophilus

.................................................................................................................................. .58

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

µmax – Velocidade específica máxima de crescimento

ANOVA – Análise de variância

ATP – Trifosfato de adenosina

BAL – Bactérias ácido láticas

C:N – carbono:nitrogênio

CO2 – Gás carbônico

DCCR – Delineamento composto central rotacional

DO – Densidade ótica

FC – Fator de conversão

Ln – Logaritmo neperiano

MRS – Mann, Rogosa & Sharpe

nm – nanômetros

ºC – Grau Celsius

P.A. – Puro para análise

RPM – Rotação por minuto

ix

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 3

2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 3

2.2 Objetivos específicos............................................................................................... 3

3. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 4

3.1 Bactérias láticas ...................................................................................................... 4

3.1.1 Gênero Lactobacillus ............................................................................................ 5

3.1.2 Gênero Lactococcus/Pediococcus ......................................................................... 6

3.1.3 Gênero Weisella ................................................................................................... 7

3.1.4 Gênero Carnobacterium ........................................................................................ 7

3.1.5 Gênero Bifidumbacterium .................................................................................... 7

3.2 Ácido lático ............................................................................................................. 8

3.2.1 Características físicas e químicas do ácido lático .................................................. 8

3.3 Vias do metabolismo das bactérias láticas / transformação de glicose em ácido lático

................................................................................................................................... 10

3.3.1 Bactérias ácido láticas homofermentativas .......................................................... 10

3.3.2 Bactérias ácido láticas heterofermentativas ......................................................... 12

3.4 Síntese de ácido lático ........................................................................................... 13

3.4.1 Produção de ácido lático por síntese química ...................................................... 13

3.4.2 Produção de ácido lático por fermentação ........................................................... 13

3.4.3 Comparação do uso de fermentação em relação à síntese química ...................... 15

3.5 Modos de cultivo ................................................................................................... 15

3.6 Fatores que afetam a eficiência da produção de ácido lático .................................. 16

3.6.1 Parâmetros do processo fermentativo.................................................................. 16

3.6.1.2 Fontes de carbono ............................................................................................ 16

3.6.1.3 Fontes de nitrogênio e vitaminas...................................................................... 18

3.6.1.4 Temperatura .................................................................................................... 19

x

3.6.1.5 pH ................................................................................................................... 19

3.7 Relação Carbono:Nitrogênio (C:N) ....................................................................... 20

3.8 Dificuldades encontradas na produção de ácido lático por via fermentativa ........... 20

3.9 Produção de ácido lático utilizando matérias primas renováveis ............................ 21

3.10 Pescado ............................................................................................................... 22

3.10.1 Proteínas do pescado ........................................................................................ 22

3.10.2 Corvina ............................................................................................................ 22

3.11 Hidrólise ácida do pescado para uso como fonte de nitrogênio ............................ 23

3.12 Aplicações do ácido lático ................................................................................... 24

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 26

4.1 Material................................................................................................................. 26

4.1.1 Pescado .............................................................................................................. 26

4.1.2 Micro-organismos e manutenção ........................................................................ 26

4.1.3 Reagentes ........................................................................................................... 27

4.1.4 Infraestrutura ...................................................................................................... 27

4.2 Metodologia .......................................................................................................... 27

4.2.1 Preparo do material ............................................................................................ 27

4.2.2 Caracterização físico química do pescado ........................................................... 27

4.3 Curva de crescimento microbiano para produção de biomassa ............................... 28

4.4 Estudo da cinética de crescimento ......................................................................... 29

4.4.1 Conversão da densidade ótica em massa seca ..................................................... 29

4.4.2 Velocidade específica máxima de crescimento (µmax) ......................................... 29

4.4.3 Produtividade máxima de biomassa .................................................................... 29

4.5 Screening de variáveis ........................................................................................... 29

4.6 Preparo do pré inóculo e inóculo ........................................................................... 30

4.7 Estudo do crescimento microbiano ........................................................................ 30

4.7.1 Matriz de delineamento experimental Plackett-Burman ...................................... 30

xi

4.8 Obtenção da hidrólise ácida das proteínas de pescado ............................................ 33

4.8.1 Determinação do teor de nitrogênio das proteínas hidrolisadas de pescado ......... 34

4.9 Obtenção de ácido lático e biomassa a partir de corvina ........................................ 34

4.10 Delineamento composto central rotacional (DCCR) ............................................ 35

4.11 Quantificação do ácido lático .............................................................................. 36

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 37

5.1 Composição proximal do músculo de corvina ........................................................ 37

5.2 Parâmetros cinéticos de crescimento dos diferentes micro-organismos estudados .. 38

5.3 Curva padrão para a determinação de ácido lático ................................................. 40

5.4 Produção de biomassa e ácido lático utilizando extrato de levedura como fonte de

nitrogênio.................................................................................................................... 40

5.5 Screening de variáveis na produção de biomassa e ácido lático.............................. 43

5.6 Obtenção de ácido lático e biomassa a partir de proteínas de corvina ..................... 48

5.7 pH e tratamento experimental do dados ................................................................. 49

5.7.1 pH ...................................................................................................................... 49

5.7.2 DCCR (Delineamento composto central rotacional) ........................................... 50

5.7.3 Proposição de um modelo matemático para L. rhamnosus .................................. 51

5.7.4 Proposição de um modelo matemático para L. acidophilus ................................. 56

6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 59

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................ 60

8. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 61

APÊNDICE 1 ............................................................................................................ 79

1

1. INTRODUÇÃO

As bactérias ácido láticas são amplamente empregadas na indústria porque tem um

grande potencial de bioconservação, e são seguras para o consumo (O'BRYAN et al., 2015).

Existem vários gêneros de bactérias ácido láticas, porém o Gênero Lactobacillus é o mais

utilizado (MAYO et al., 2010).

O ácido lático é utilizado há muito tempo em alimentos, indústrias farmacêuticas e

aplicações cosméticas. Recentemente, o ácido lático puro vem sendo estudado com grande

interesse para obtenção do polímero ácido polilático que é biodegradável e que pode ser

utilizado na produção de biopolímeros para melhorar suas propriedades físicas, para

elaboração de sacos de lixo e também computador e carros (YU et al., 2008).

O ácido lático é um ácido orgânico que pode ser produzido por síntese química ou por

fermentação. A vantagem significativa da produção biotecnológica por fermentação ao invés

da síntese química é a de poder utilizar matérias primas de baixo custo (CAPELLARI, 2010).

Na busca para o desenvolvimento de uma fermentação em larga escala para a obtenção

de ácido lático, matérias primas renováveis, com potencial biodegradável e outros compostos

"verdes", têm sido utilizadas como componentes de baixo custo (KWON et al., 2000).

Portanto, uma alternativa seria a utilização de fontes de nitrogênio obtidas de matérias primas

de baixo valor econômico. Sabe-se que subprodutos agrícolas e fontes de nitrogênio

inorgânico têm sido utilizados para alcançar uma parcial e até mesmo total substituição do

extrato de levedura, que é a fonte mais comumente utilizada na fermentação para a obtenção

de ácido lático (NANCIB et al., 2005).

A corvina (Micropogonias furnieri) é um dos peixes demersais e bentônicos sciaenídeos

com ampla distribuição conhecida que vai desde o Golfo do México, Antilhas até o Golfo de

San Matías, Argentina. Este é considerado um dos mais importantes recursos costeiros da

Plataforma Sul do Brasil. De acordo com Elsdon e Gillanders (2002), a corvina pode atingir

até 70 cm de comprimento.

Por outro lado, os pescados de baixo valor comercial e os subprodutos do

processamento do pescado constituem mais de 50% do volume da matéria prima da indústria,

configurando uma fonte de nutrientes de baixo custo (BOSCOLO, HAYASHI e MEURER,

2004). Nestes subprodutos descartados estão incluídas espécies de pescado não comerciais e

de baixa aceitabilidade no mercado como a corvina devido a fatores como sabor, aparência,

forma física, quantidade de espinhos, gordura e outros atributos sensoriais; exemplares

2

juvenis; e as partes não utilizadas (cabeça, vísceras, escamas, espinhas e caudas). Esses

subprodutos produzidos pelas indústrias acabam muitas vezes gerando um sério problema

ambiental, podendo se tornar potenciais fontes poluidoras dos recursos hídricos, do solo e do

ar (MINOZZO, 2010).

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a utilização da corvina, um pescado de

baixo valor comercial como fonte de nitrogênio para a obtenção de ácido lático por processo

fermentativo.

3

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi selecionar micro-organismos para produzir ácido

lático por via fermentativa utilizando corvina (Micropogonias furnieri) como fonte de

nitrogênio.

2.2 Objetivos específicos

Realizar curvas de crescimento microbiano para a produção de biomassa em caldo

MRS e verificar a cinética de crescimento dos micro-organismos avaliados;

Selecionar os micro-organismos que apresentam maior produção de biomassa, maior

fator de conversão e µmax utilizando extrato de levedura como fonte de nitrogênio;

Realizar um screening de variáveis e verificar quais apresentam efeito positivo para

produção de biomassa e ácido lático através de planejamento fatorial;

Produzir proteínas hidrolisadas de pescado;

Aplicar um delineamento composto central rotacional (DCCR) a fim de aumentar a

produção de biomassa e ácido lático pelos micro-organismos selecionados, utilizando

proteínas de músculo de pescado como fonte de nitrogênio;

4

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Bactérias láticas

Bactérias produtoras de ácido lático, frequentemente denominadas "Bactérias ácido

láticas" (BAL), são representadas pelos Gêneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,

Weisella, e Streptococcus (WANG et al., 2014). Bactérias láticas são caracterizadas

basicamente por serem Gram positivas, aeróbias ou anaeróbias facultativas, não formadoras

de esporos. Podem ter formas de bastão ou de cocos. Quanto às características bioquímicas

são catalase, oxidase e benzidina negativas, não reduzem nitrato a nitrito, são gelatinase

negativas e são incapazes de utilizar lactato (CARR, CHILL e MAIDA, 2002). Estas não são

bactérias patogênicas, sendo consideradas GRAS (Geralmente Reconhecidas Como Seguras)

e incapazes de sintetizar ATP pela respiração (TANAKA et al., 2002; VIJAYAKUMAR,

ARAVINDAN e VIRUTHAGIRI, 2008). Ademais, o isômero L-ácido lático é aceito como

uma sustância segura para o consumo humano (LIU, HAN e ZHOU, 2011).

Além da capacidade de produzir ácido lático, as BAL podem também contribuir para

outras características dos produtos como sabor, textura e nutrição. Sem dúvida, a aplicação

mais importante das BAL é na indústria de laticínios, embora sejam também aplicadas em

escala industrial em outras matérias primas alimentares como carne, vegetais, vinhos e nas

indústrias químicas e farmacêuticas (BUSTOS et al., 2004).

As bactérias láticas requerem nutrientes complexos para seu crescimento e manutenção,

tais como carboidratos, aminoácidos, vitaminas, minerais, ácidos graxos e sais, devido à sua

habilidade limitada em sintetizar vitaminas do complexo B e aminoácidos (ADSUL, VARMA

e GOKHALE, 2006; VIJAYAKUMAR, ARAVINDAN e VIRUTHAGIRI, 2008;

LITCHFIELD, 2009). Essas bactérias obtêm energia através da fermentação de açúcares e os

produtos finais do metabolismo são: lactato, acetato, etanol, CO2 e ácido fórmico. A

temperatura ótima de crescimento é em média de 30 °C dependendo do gênero, são acidófilas

e altamente tolerantes à acidez, sobrevivendo em valores de pH 5,0 ou inferiores. Estas

bactérias são encontradas naturalmente em ambientes ricos em nutrientes como leite, carne e

derivados, vinho, vegetais, frutas, sucos de frutas, picles e no corpo humano e de animais

(HOFVENDAHL e HÄGERDAL, 2000).

Originalmente, o grupo das BAL foi subdividido em quatro gêneros, dentre eles:

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus. Após revisões taxonômicas,

5

propôs-se a inclusão de novos gêneros, e, atualmente, esse grupo é composto por treze

Gêneros: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera,

Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus,

Vagococcus e Weisella (PATRICK, 2012). A classificação das BAL em diferentes gêneros

está intimamente relacionada com sua morfologia, tipo de fermentação, crescimento em

diferentes temperaturas e em elevadas concentrações de sal, bem como sua habilidade de

tolerância a ácidos e álcalis (KHALID, 2011).

3.1.1 Gênero Lactobacillus

Os Lactobacillus apresentam-se como bactérias, que taxonomicamente pertencem ao

filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Lactobacillales, família Lactobacillaceae (AUAD,

2014), sendo o maior dentre todos os gêneros das bactérias ácido láticas, com mais de uma

centena de espécies reconhecidas. Esse gênero, altamente heterogêneo, compreende bactérias

com propriedades fenotípicas, bioquímicas e fisiológicas muito variáveis (POT e

TSAKALIDOU, 2009). O Gênero Lactobacillus é um dos mais usados na produção industrial

de ácido lático (MAYO et al., 2010).

Esses micro-organismos crescem em diferentes habitats, tais como plantas, solo, água,

esgoto, esterco e alimentos fermentados (leite, carne e vegetais), cereais, silagem, alimentos

deteriorados, cerveja, frutas e grãos, pescado, resíduos da indústria de processamento de

açúcar, leite, carnes, bebidas fermentadas, na cavidade oral e no trato intestinal de seres

humanos. Estes são acidófilos, portanto reduzem o pH dos alimentos contendo carboidratos

fermentescíveis em torno de 4 e, como resultado, muitas vezes inibem o crescimento e/ou

destroem outras bactérias. É geralmente aceito que os Lactobacillus crescem até um pH

máximo de 7,2, apesar de existirem exceções com relação ao substrato e à cepa. Os

Lactobacillus são usados como culturas iniciadoras em muitas variedades de queijo, alimentos

vegetais fermentados, carnes fermentadas, vinho e cerveja, pão e silagem (BERNARDO,

2014).

Sendo homo ou heterofermentativas, essas bactérias são exigentes nutricionalmente e

podem ser encontradas em ambientes onde os carboidratos estão disponíveis, como plantas,

animais e alimentos (CLAESSON, VAN SINDEREN e O’TOOLE, 2008).

Espécies de Lactobacillus têm necessidades nutricionais e de incubação complexas, e

muitas vezes compartilham propriedades fisiológicas similares quando taxonomicamente

6

relacionadas (ASHRAF e SHAH, 2011; BERNARDEAU et al., 2008). Crescem em

temperaturas mesófilas (15-40 °C).

Por serem considerados seguros e dotados de grande variedade de atividade catabólica,

os Lactobacillus são um dos mais importantes micro-organismos no que diz respeito à

microbiologia de alimentos e à nutrição humana devido ao fato de algumas cepas possuírem

papel fundamental na produção e preservação de alimentos, além de possuir as propriedades

probióticas (HUYS et al., 2006).

Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus têm sido utilizados como ingredientes

em alimentos fermentados tradicionais e comerciais, além de alimentos fermentados incluindo

produtos probióticos (SAKAI et al., 2010). O Lactobacillus casei é significativamente

importante para a indústria de alimentos e, devido à sua versatilidade, tem sido utilizado como

bioconservante em diversos alimentos industrializados, como cultura iniciadora produtora de

ácido e intensificador de sabores em produtos lácteos e cárneos (TOH et al., 2013).

Lactobacillus plantarum é utilizado como cultura iniciadora em alguns embutidos

fermentados e produtos de cereais. Cresce em vegetais fermentados e produtos cárneos e está

relacionado à deterioração em citros, sucos, vinho e queijos (BERNARDO, 2014).

3.1.2 Gênero Lactococcus/Pediococcus

O Gênero Lactococcus/Pediococcus foi criado com o objetivo de reclassificar espécies

dos Gêneros Streptococcus e Lactobacillus (SCHLEIFER et al., 1985). Presentes em diversos

ecossistemas, como plantas, peles de animais e alimentos, micro-organismos desse gênero

apresentam-se em forma de cocos Gram-positivos, microaerofílicos e homofermentativos,

com produção exclusiva de ácido lático L (+) (CASALTA e MONTEL, 2008).

Bactérias desse gênero são frequentemente encontradas em produtos lácteos, sendo as

subespécies Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris comumente

utilizadas como culturas iniciadoras para a produção de produtos lácteos fermentados

(BERESFORD et al., 2001). Devido às suas propriedades tecnológicas, Lactococcus é

amplamente utilizado na indústria de produtos lácteos, como queijo e coalhada, tendo como

função principal o desenvolvimento de atividades acidificantes e proteolíticas, e,

consequentemente, de textura, sabor e aroma, de modo a contribuir positivamente para a

percepção sensorial (SMIT, SMIT e ENGELS, 2005). Ainda, os Lactococcus podem atuar

como bioconservadores por meio da produção de compostos antimicrobianos, como os ácidos

7

orgânicos e bacteriocinas (COSENTINO et al., 2012; HELLAL et al., 2012), fato que ressalta,

portanto, uma potencial solução para o controle de micro-organismos indesejados, como

Listeria monocytogenes.

3.1.3 Gênero Weisella

O Gênero Weisella foi estabelecido incluindo Leuconostoc paramesenteroides e alguns

Lactobacillus heterofermentadores, que são filogeneticamente muito próximos. A

classificação desse gênero é recente, pois a filogenia dessas bactérias só foi esclarecida em

1990 (COLLINS et al., 1993; VIEGAS et al., 2010). Pesquisas vêm sendo desenvolvidas com

o objetivo de descobrir novos micro-organismos com características funcionais, onde o

Gênero Weisella tem sido estudado como uma possibilidade. Recentemente, alguns trabalhos

mostraram o desenvolvimento de alimentos e fármacos a partir de alguns representantes desse

gênero, como Weisella confusa e Weisella kimchii (NAM et al., 2002).

3.1.4 Gênero Carnobacterium

O Gênero Carnobacterium é formado por bacilos Gram-negativos, que são capazes de

sobreviver a baixas temperaturas, anaerobicamente, e com concentração elevada de CO2.

Estes micro-organismos são tolerantes ao congelamento e descongelamento e metabolizam

carboidratos (LEISNER et al., 2007).

3.1.5 Gênero Bifidumbacterium

As bactérias deste Gênero são bastonetes, anaeróbicos, Gram positivos, não esporulados

e catalase negativos. Seu formato é em forma de Y. Estes são organismos que produzem ácido

lático sem geração de CO2. As bifidobactérias são de primordial importância no ecossistema

ativo e do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente e das abelhas.

Estes estão distribuídas em vários nichos ecológicos (GOMES e MALACATA, 1999).

Atualmente, bifidobactérias têm sido utilizadas em grande escala no Japão e na Europa,

sendo adicionadas em alimentos e bebidas em proporções cada vez maiores. O Japão é líder

mundial no fornecimento de produtos contendo bifidobactérias, produzindo cerca de 70 tipos

8

de preparações, onde mais de 50 delas são empregadas em laticínios, incluindo cultura de

leite, bebidas, queijos, leite em pó, biscoitos e sorvetes (SHAH et al., 1995).

3.2 Ácido lático

O acido lático, ou acido 2-hidróxipropanóico, é o ácido carboxílico mais abundante na

natureza. O ácido lático foi descoberto por Scheele em 1780 em leite azedo (REDDY et al.,

2008; WANG, TASHIRO e SONOMOTO, 2015). Em 1789, Lavoisier o considerou

componente do leite e o chamou ―acide lactique‖, que se tornou a possível origem da

terminologia atual do ácido lático. Em 1857, Pasteur descobriu que não era um componente

do leite, mas era um metabolito da fermentação gerado por alguns micro-organismos (WEE,

KIM e RYU, 2006). Sua produção comercial iniciou nos Estados Unidos por Charles Avery

em 1881 (NARAYANAN, ROYCHOUDHURY e SRIVASTAVA, 2004; JOHN et al., 2009).

Foi identificado como matéria prima para a síntese de plásticos biodegradáveis na

década de 1940 até início dos anos 1950. No início de 1960, foi desenvolvido um método para

sintetizar quimicamente o ácido lático (WEE, KIM e RYU, 2006). Desde 1982 o mercado de

consumo do ácido lático é dominado pelo setor de alimentos e bebidas (REDDY et al., 2008).

3.2.1 Características físicas e químicas do ácido lático

O ácido lático (CH3CHOHCOOH) é uma molécula bifuncional de característica ácido-

alcoólica e com um átomo de carbono assimétrico com quatro grupos diferentes ligados a ele:

-COOH (ácido carboxílico), -H (hidrogênio), -OH (hidróxido) e CH3 (metil) que lhe confere

isomeria espacial ótica. Portanto, existem dois enantiômeros (L)- e (D)-ácido lático (Figura 1)

que diferem no efeito de polarizar a luz; e uma mistura racêmica DL que é opticamente

inativa (LASPRILLA et al., 2012).

9

Figura 1 - Enantiômeros do ácido lático

Onde: C* é carbono assimétrico.

Fonte: Xavier (2011).

Dos isômeros do ácido lático, o isômero L-ácido lático é considerado como GRAS pela

FDA (Food and Drug Administration), o isômero D-ácido lático não é metabolizado pelos

animais, causando acidose e descalcificação (ADSUL, VARMA e GOKHALE, 2007).

Quimicamente, pode ser considerado como um ácido fraco, de caráter ácido e básico; puro é

um líquido branco cristalino com baixo ponto de fusão, miscível em água, álcool, glicerol e

furfural e insolúvel em clorofórmio (LUNELLI, 2010), comercializado em solução aquosa de

85-90%.

Na Tabela 1, apresentam-se algumas propriedades físicas do ácido lático.

Tabela 1 - Propriedades físicas do ácido lático

Propriedades Valor

Fórmula molecular C2H6O3

Massa molar 90,08 g/mol

Ponto de fusão L: 53 °C/D: 53 °C

Ponto de ebulição 122 °C, 12 mmHg

Constante de dissociação Ka a 25 °C 1,37x104

Calor de combustão 1361 Kg/mol

Calor específico 190 J/mol/°C

Fonte: Narayanan, Roychoudhury e Srivastava (2004).

10

Sua característica de álcool e ácido carboxílico lhe confere alta reatividade, participando

em reações de desidratação, descarboxilação, condensação, redução, desidrogenação,

esterificação e polimerização (ZHANG, LIN e CEN, 2008).

3.3 Vias do metabolismo das bactérias láticas / transformação de glicose em ácido lático

As bactérias ácido láticas podem fermentar a glicose em ácido lático por vias diferentes,

estas podem ser divididas em dois grupos: bactérias homofermentativas e bactérias

heterofermentativas; nomes que foram propostos por Orla-Jensen em 1919 (KASCAK,

KOMINEK e ROEHR, 2008).

Quanto a escolha das bactérias a trabalhar, têm que ser atendidas, além do substrato ou

fonte de carboidrato, as condições de crescimento da bactéria como o meio de cultura (fontes

de carbono e nitrogênio, temperatura e pH), já que esses parâmetros são característicos de

cada micro-organismo e um manuseio inadequado pode inibir o crescimento, diminuir o

rendimento de produção do ácido, variar a pureza ótica ou até inibir o micro-organismo

(LIMA et al., 2001).

Tanto bactérias homofermentativas quanto heterofermentativas degradam apenas

hexoses, mas diferem pelo modo como a cadeia de carbono de tais compostos é metabolizada

(GOMES, 2009).

3.3.1 Bactérias ácido láticas homofermentativas

Estas são bactérias que normalmente metabolizam glicose via frutose 6-fosfato para

produzir mais de 85% de acido lático (REDDY et al., 2008). As bactérias homofermentativas

são de grande interesse comercial para a produção de ácido lático devido a razões econômicas

como a fermentação de glicose e sacarose em ácido lático através da via Embden-Meyerhof-

Parnas (LOPES, 2008). Essas bactérias têm rendimento teórico de duas moléculas de lactato a

partir de uma molécula de glicose, de forma que ocorre a degradação anaeróbica da glicose

para produzir o ácido lático.

Essas bactérias fermentam glicose exclusivamente em ácido lático e não fermentam

gluconato e pentoses (BERNARDO, 2014). A esse grupo pertencem os Gêneros:

11

Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, e alguns Lactobacillus (L.

delbrueckii, L. helveticus, L. rhamnosus e L. acidophilus) (CUI, LI e WAN, 2011).

A Figura 2 mostra a rota simplificada do metabolismo homofermentativo de bactérias

láticas do Gênero Lactobacillus.

Além do ácido lático, outros ácidos podem ser formados por micro-organismos

homofermentadores mesmo que em pequenas quantidades. No entanto, a produção de ácido

lático é muito superior quando comparado aos outros compostos como o etanol, acetato e

formiato. Dentre esses homofermentadores podemos citar o Lactococcus, que em condições

limitadas de glicose e durante o crescimento em outros açúcares, por exemplo, Lactococcus

lactis em maltose, lactose e galactose, ou ainda em pH alto e baixa temperatura, pode formar

vários ácidos (XAVIER, 2011).

Figura 2 - Representação esquemática simplificada da rota do metabolismo

homofermentativo de bactérias láticas do Gênero Lactobacillus

Fonte: Silveira (2009).

12

3.3.2 Bactérias ácido láticas heterofermentativas

Estas são bactérias que metabolizam a glicose via 6-fosfogliconato, para produzir cerca

de 50% do ácido lático e subprodutos como etanol, ácido acético e CO2, fermentando um mol

de glicose para um mol do ácido lático, um mol de etanol e um mol de CO2; um mol de ATP é

gerado por mol de glicose (REDDY et al., 2008). A esse grupo pertencem os Gêneros

Leuconostoc, Oenocucus, alguns Lactobacillus (brevis) (CUI, LI e WAN, 2011) e o

Lactobacillus casei (BUSTOS et al., 2004).

A Figura 3 mostra a rota simplificada do metabolismo heterofermentativo de bactérias

láticas do Gênero Lactobacillus.

Figura 3 - Representação simplificada da rota do metabolismo heterofermentativo de

bactérias láticas do Gênero Lactobacillus

Fonte: Silveira (2009).

Portanto, a identificação das bactérias ácido láticas é um fator importante no

desenvolvimento de processos econômicos para a produção do ácido lático (MOON, WEE e

CHOI, 2012).

13

3.4 Síntese de ácido lático

O ácido lático pode ser obtido por síntese química e/ou pela ação fermentativa de

bactérias e fungos.

3.4.1 Produção de ácido lático por síntese química

A síntese química de ácido lático baseia-se principalmente na hidrólise da lactonitrila,

um derivado petroquímico, por ácidos fortes, que prevê apenas a mistura racêmica de D- e L-

ácido lático. A lactonitrila é hidrolisada com ácido sulfúrico ou clorídrico para produzir ácido

lático e sal de amônio como subproduto (LI e CUI, 2010). Posteriormente o ácido lático é

purificado por destilação. Para purificar o ácido lático, se adiciona metanol à solução anterior

para obter lactato de metila, o qual é purificado por destilação e hidrolisado com água na

presença de um catalisador ácido para produzir ácido lático. Finalmente, o ácido lático é

recuperado e purificado segundo as necessidades do produto; o metanol recuperado é

reciclado ao processo (NARAYANAN, ROYCHOUDHURY e SRIVASTAVA, 2004).

Outras possíveis rotas de síntese química de ácido lático incluem (a) oxidação de

propilenoglicol, reação de acetaldeído, monóxido de carbono e água em temperaturas e

pressões elevadas, (b) hidrólise de ácido 2-cloropropiônico, ácido acético, ácido nítrico e (c)

oxidação de propileno (CAPELLARI, 2010).

Os métodos sintéticos de produção do ácido lático são geralmente mais caros que os

fermentativos (CAPELLARI, 2010).

O ácido lático produzido sinteticamente é estável termicamente e não contém

quantidades residuais de carboidratos, presentes muitas vezes no ácido produzido por

fermentação, que comprometem a qualidade do produto, sobretudo quando estocado por

grandes períodos (TRINDADE, 2002). No entanto, a rota química sempre leva à formação de

uma mistura racêmica, onde as concentrações das formas D- e L- são iguais, o que dificulta a

purificação e separação dos isômeros (MOON, WEE e CHOI, 2012).

3.4.2 Produção de ácido lático por fermentação

A produção de ácido lático por método fermentativo data de milhares de anos, sendo

esta conhecida pela cultura chinesa, em que se usava para fermentar os alimentos para sua

conservação (LIU, HAN e ZHOU, 2011). O processo fermentativo à ácido lático

14

objetivamente é estudado desde 1935 usando diferentes tipos de micro-organismos e

condições operacionais de fermentação, como fonte de carbono, pH, temperatura e fontes de

nitrogênio (LUNELLI, 2010). Atualmente, representa 90% da produção de ácido lático

comercial (ZHOU et al., 2006; ADSUL, VARMA e GOKHALE, 2007).

O ácido lático pode ser produzido por muitos micro-organismos, como bactérias,

fungos, cianobactérias e algas. Cada micro-organismo pode alcançar uma produção melhor

que a outra, podendo utilizar ampla faixa de substratos, aumentando o rendimento e a

produtividade, reduzindo as exigências nutricionais ou melhorando a pureza óptica do ácido

lático (KLEEREBEZEM e VAN LOOSDRECHT, 2007). Estudos mostram que a mistura de

culturas na fermentação pode fornecer combinações úteis de vias metabólicas para a

utilização de matérias complexas e, consequentemente, aumentar a produção de ácido lático

(CUI, LI e WAN, 2011).

O ácido lático é obtido convencionalmente por processo biotecnológico, com as

seguintes características: baixo custo, baixos níveis de contaminantes, rápida taxa de

produção, alto rendimento, pouca ou nenhuma formação de subproduto, capacidade de ser

fermentado com pouco ou nenhum pré-tratamento e estar disponível para produção o ano todo

(WEE, KIM e RYU, 2006). Geralmente, o processo ocorre em duas etapas: a sacarificação,

seguida pela fermentação por Lactobacillus.

Na fermentação, os parâmetros como temperatura, agitação e pH são determinados

segundo as características fisiológicas dos micro-organismos empregado na fermentação

(LUNELLI et al., 2007).

Outro fator importante na fermentação é a fonte de nitrogênio, pois este ajuda no

crescimento e produção de ácido lático. Neste sentido, o extrato de levedura tem sido a fonte

de nitrogênio mais citada na literatura por causa do seu excelente desempenho (KWON et al.,

2000; WENZEL, MONTEIRO, PEREIRA, 2007). O alto custo do extrato de levedura é um

efeito negativo para a produção de grandes quantidades do ácido lático. Portanto, outros

substratos têm sido estudados para substituí-lo (TIMBUNTAM, SRIROTH e TOKIWA,

2006).

Em relação à separação e purificação de lactato, diversas técnicas como osmose reversa

(LIEW, TANAKA e MORITA, 1995), reação química esterosseletiva com posterior

separação por cromatografia (PAIK et al., 2011), extração por solventes (MARINOVA et al.,

2004), cromatografia preparativa (THANG e NOVALIN, 2008), reação extrativa

15

(JÄRVINEN et al., 2000) e separação por membranas (SCHLOSSER, KERTÉSZ e

MARTÁK, 2005) têm sido estudadas.

3.4.3 Comparação do uso de fermentação em relação à síntese química

A vantagem significativa da produção biotecnológica sobre a síntese química é que a

primeira pode usar matérias primas de baixo custo e ricas em carboidratos, já que o preço de

matéria prima é um dos fatores mais importantes na produção econômica do ácido lático.

Ainda assim, a eficiência e economia da fermentação do ácido lático final utilizando diversos

substratos são alvo de melhoria. Portanto, diversas pesquisas são enfocadas na busca de novas

e eficazes fontes nutricionais, como também de novas técnicas de fermentação que permitam

conversão do substrato em produtos com alto rendimento (REDDY et al., 2008). Outra

vantagem na produção do ácido lático pelo processo fermentativo é a possibilidade de obter

um isômero (D ou L) a partir do micro-organismo escolhido para a fermentação

(LASPRILLA et al., 2012; MOON, WEE e CHOI, 2012).

A principal desvantagem na produção do ácido lático por via fermentativa é o alto custo

de separação do composto (ESTELA et al., 2007). Quando são usados materiais refinados na

produção, o custo da purificação do produto pode diminuir significativamente. No entanto,

isto é ainda desfavorável, porque a purificação de carboidratos é ainda mais cara que o custo

da produção (WEE, KIM e RYU, 2006). Não obstante, diferentes fontes renováveis têm sido

empregadas na produção econômica do ácido lático.

3.5 Modos de cultivo

O processo fermentativo pode ser realizado por fermentação em batelada, fermentação

em batelada alimentada ou fermentação contínua. Além do conhecimento do comportamento

da bactéria na fermentação, suas condições de desenvolvimento e nutrientes, também é

importante saber que o modo de cultivo (batelada, batelada-alimentada ou contínua) pode ser

realizado para obter alta produtividade e concentração elevada do ácido lático (MOON, WEE

e CHOI, 2012).

Na fermentação por batelada, o inóculo e o meio de cultura são colocados no biorreator

onde a fermentação é realizada de possível com controle de pH, por adição de uma base,

controle de temperatura e agitação constante até obter a produção máxima do ácido lático.

16

Ainda que este processo tenha limitações pelo dano sofrido pela bactéria devido ao acúmulo

do ácido, na forma não dissociada, durante a fermentação (SERNA COCK e RODRIGUEZ

DE STOUVENEL, 2007). Uma série de fermentações tem sido realizadas mediante este

processo, especialmente em laboratório (QIN et al., 2010).

Lunelli (2010) reportou aumento na conversão de açúcar quando é trocado de processo

em batelada para batelada-alimentada. Este resultado pode ser explicado como um estresse

osmótico nas células bacterianas por altas concentrações de açúcar no meio, portanto, uma

alimentação sequencial em tempos adequados pode aumentar a conversão de substrato.

Geralmente, a concentração e a produtividade do produto final estão intimamente

relacionadas com a economia do processo de fermentação convencional; uma maior

concentração pode ser encontrada em processos descontínuos (batelada) ou em batelada-

alimentada, enquanto uma produtividade mais elevada pode ser conseguida em processo

contínuo (MOON, WEE e CHOI, 2012).

3.6 Fatores que afetam a eficiência da produção de ácido lático

As bactérias ácido láticas requerem complexos nutricionais para poder sintetizar seu

crescimento (AMRANE, 2000). Vários fatores são reportados para aumentar a produção de

ácido lático, incluindo, fontes de carbono, nitrogênio, pH, temperatura e vitaminas. Esses

fatores são mostrados a seguir.

As características desejáveis para as bactérias ácido láticas levam em conta a capacidade

de converter rápida e completamente matérias primas de baixo custo em ácido lático com

requisitos nutricionais e mínimos para fornecer elevados rendimentos, sem formação de

produtos secundários.

3.6.1 Parâmetros do processo fermentativo

3.6.1.2 Fontes de carbono

Os carboidratos são um dos compostos mais importantes do meio de cultivo, pois além

de serem uma fonte de energia para a fermentação, participam da produção de alguns

metabólitos secundários (KNOB, TERRASAN e CARMONA, 2007). Embora os resíduos

agroindustriais sejam ricos em carbono, sua utilização muitas vezes é limitada devido ao

17

baixo conteúdo de proteína e à baixa digestibilidade, decorrente da presença de resíduos

celulósicos (JOHN, NAMPOOTHIRI e PANDEY, 2007).

Diferentes fontes de carbono têm sido utilizadas para a produção fermentativa de ácido

lático por bactérias ácido láticas (HOFVENDAHL e HAHN-HÄGERDAL, 2000). Ilmén et al.

(2007) e Taniguchi et al. (2004), em seus trabalhos para produzir ácido lático utilizaram como

fonte de carbono a glicose, sendo que os micro-organismos utilizados foram Lactobacillus

helveticus e o Lactobacillus casei, respectivamente. Já Cui, Li e Wan (2011) usaram palha de

milho como fonte de carbono para produzir ácido lático, utilizando Lactobacillus rhamnosus

e Lactobacillus brevis como bactérias ácido láticas. Panesar et al. (2010) usaram soro de leite,

Wang et al. (2014) utilizaram xilose e Sasaki et al. (2012) utilizaram bagaço de cana de

açúcar também para produzir ácido lático. O produto mais puro é obtido quando um açúcar

puro é fermentado, resultando em menores custos de purificação. No entanto, isto é

economicamente desfavorável, porque a produção de açúcares puros possui custo elevado e o

ácido lático é um produto de baixo custo.

Durante a fermentação, a fonte de carbono é convertida pela célula microbiana em ácido

lático sob certos parâmetros fixos (pH, temperatura, tempo de incubação, etc). Geralmente,

concentrações limitantes de alguns nutrientes e excesso de carboidratos favorecem a produção

de polissacarídeos. Obtém-se um alto rendimento quando ocorre a conversão de 70-80% da

fonte de carbono utilizada em biomassa (SUTHERLAND, 1979).

Carboidratos como a glicose são uma boa opção para fornecer o crescimento em

condições laboratoriais. No entanto, dependendo das necessidades particulares do micro-

organismo é necessário utilizar alguns derivados, como lipídeos, álcoois, ácidos orgânicos,

hidrocarbonetos e compostos nitrogenados orgânicos. Micro-organismos autótrofos

necessitam de CO2 como fonte de carbono, não necessitando outros compostos que o

contenham. A fonte de carbono adequada e sua concentração são selecionadas por

comparação, analisando o crescimento celular e a produção do polissacarídeo. Uma fonte de

carbono específica pode oferecer excelentes resultados para o crescimento celular e não

necessariamente terá uma boa produção de biomassa (GANDHI, RAY e PATEL, 1997;

BOZA et al., 2004).

18

3.6.1.3 Fontes de nitrogênio e vitaminas

As bactérias láticas são micro-organismos muito exigentes nutricionalmente. Exigem

um meio rico principalmente em fontes de nitrogênio, vitaminas e ácidos nucléicos devido à

capacidade limitada de sintetizar vitaminas do complexo B (ZHANG, LIN e CEN, 2008).

A adição de nutrientes geralmente leva a uma melhora significativa dos processos

fermentativos. Porém, alguns desses nutrientes não são economicamente viáveis, por isso

ocorre uma grande busca por matérias primas provenientes de fontes renováveis e até mesmo

de resíduos agroindustriais. Um dos principais problemas na fermentação utilizando bactérias

láticas é a necessidade de assimilação de nitrogênio e suplementos de vitaminas para sustentar

o crescimento. O extrato de levedura é a fonte de nutriente comumente utilizada em

laboratório para o cultivo de micro-organismos. Trata-se de uma fonte muito rica de

nutrientes, e segundo diversos autores a melhor para o cultivo de bactérias láticas (NANCIB

et al., 2005; SILVEIRA, 2009).

Entretanto, quando se pensa em um processo industrial o uso de extrato de levedura

pode comprometer a viabilidade econômica do processo devido ao seu alto custo. Desta

forma, a substituição de extrato de levedura por fontes alternativas de nitrogênio mais

econômicas tem sido alvo de diversos estudos. Nancib et al. (2005) estudaram o efeito de

diversas fontes de nitrogênio no processo fermentativo do suco de tâmara, sendo que dentre

todas as fontes que os autores utilizaram, os melhores resultados foram obtidos utilizando

sulfato de amônia como fonte de nitrogênio. Os mesmos autores observaram que o sulfato de

amônia apresentava resultados semelhantes comparando-se com o extrato de levedura, com a

vantagem de ser muito mais econômico (seis vezes menor). Hujanen e Linko (1996) usaram

extrato de malte em combinação com o extrato de levedura, obtendo bons resultados e

diminuindo também os custos do processo.

Resíduos de alimentos como soro de leite são utilizados não só como fontes de carbono

para a produção de ácido lático, mas também como fontes de nitrogênio. Liu et al. (2010)

informaram que brotos de malte com água de maceração de milho obtiveram alto efeito

significativo sobre a produção de ácido L-lático por Lactobacillus plantarum. Além disso,

hidrolisado de penas de frango exibiu uma maior produção de ácido lático (38,5 g/L) do que

quando utilizado extrato de levedura (33,2 g/L) (TASKIN, ESIM e ORTUCU, 2012).

19

3.6.1.4 Temperatura

A temperatura é um dos fatores mais importantes no crescimento de micro-organismos.

A maioria das espécies possui uma série de características em relação à temperatura em que

podem crescer. As bactérias não crescem em uma mesma faixa de temperatura. O crescimento

microbiano é governado pela taxa de reação química catalisada por enzimas das células. As

bactérias ácido láticas são classificadas como termófilas ou bactérias mesófilas (SILVEIRA,

2009).

O efeito da temperatura sobre a produção de ácido lático foi estudada por alguns

pesquisadores (HOFVENDAHL e HAHN–HÄGERDAL, 2000). A temperatura ideal para

maior produtividade de ácido lático foi inferior em alguns casos do que a temperatura que

resulta em maior concentração de ácido lático, enquanto que outros autores observaram que a

mesma temperatura deu os melhores resultados de produção de ácido lático (HUJANEN e

LINKO, 1996).

Idris e Suzana (2006) estudaram o efeito da temperatura na produção de ácido lático em

resíduo de abacaxi utilizando Lactobacillus delbrueckii em uma faixa de 27 a 50 ºC, sendo

que a maior produção de ácido lático foi encontrada a 37 ºC. Quando a temperatura foi maior

que 37 ºC o micro-organismo apresentou menor capacidade de metabolizar os açúcares.

Hujanen e Linko (1996) pesquisaram sobre o efeito da temperatura na produção de ácido

lático pelo Lactobacillus casei (B-441). Esses autores variaram a temperatura entre 30 e 45

ºC. A temperatura ótima de produção tanto para a produção de ácido lático quanto para

produção de biomassa foi de 37 ºC.

3.6.1.5 pH

O pH da fermentação é ajustado no inicio, depois este diminui devido à produção de

ácido, ou é controlado por adição de alguma base. Foi reportado o efeito do pH quando

estudado na fermentação a diferentes valores do pH. Em todos os casos, a adição de uma base

para manter o pH constante resultou em maior rendimento e produtividade de ácido lático, em

comparação com nenhum controle de pH (CAVAZZONI, MANZONI e CRAVERI, 1988). O

pH ótimo para a produção de ácido lático varia entre 5,0 e 7,0. Um pH inferior a 5,7 foi ótimo

apenas para cepas de Lactobacillus, que são conhecidas por tolerar o pH mais baixo do que

Lactococcuss (HOFVENDAHL e HAHN–HÄGERDAL, 2000).

20

3.7 Relação Carbono:Nitrogênio (C:N)

A relação de fonte de carbono versus fonte de nitrogênio (relação C:N) é o principal

fator que afeta o processo de conversão de ácido lático. De um modo geral, uma relação C:N

adequada, através da adição de fontes complexas de nitrogênio, como por exemplo, extrato de

levedura, peptona ou extrato de carne, tem efeito positivo sobre a produção de ácido lático

(LU et al., 2010).

A relação C:N desempenha um papel importante no crescimento e produção de

polissacarídeos. Gandhi, Ray e Patel (1997) testaram relações de C:N variando as

concentrações de carbono e nitrogênio onde se observou que concentrações altas de

nitrogênio inibem a produção de polissacarídeo e melhoram o crescimento. Os autores

concluíram então, que a melhor produção do polissacarídeo ocorre sobre limitação de

nitrogênio.

Quando se usou milhocina como fonte de nitrogênio de menor valor agregado, a

produtividade do ácido lático aumentou com a redução da relação C:N (mol/mol) a partir de

37: 1 para 19:1 (HETÉNYI, NÉMETH e SEVELLA, 2008).

3.8 Dificuldades encontradas na produção de ácido lático por via fermentativa

Apesar de aproximadamente 90% do ácido lático ser produzido em todo o mundo por

fermentação microbiana, ainda existem muitos desafios para uma produção mais eficaz e

econômica. Um dos obstáculos no processo de fermentação é a utilização de açúcares mistos

(ABDEL-RAHMAN, TASHIRO e SONOMOTO, 2011). Alguns trabalhos têm demonstrado

que as bactérias ácido láticas conseguem consumir simultaneamente diferentes açúcares, tais

como, glicose/celobiose, xilose/arabinose/glicose e celobiose/glicose/xilose (WANG,

TASHIRO e SONOMOTO, 2015). Além disso, a estratégia de culturas tem sido estudada

para melhorar o rendimento do produto e o consumo de açúcar (CUI, LI e WAN, 2011).

Outro obstáculo que deve ser superado é a inibição do produto final (ácido lático) no

processo de produção por bactérias ácido láticas. Como a fermentação progride juntamente

com o consumo de substrato, a concentração de ácido lático aumenta gradualmente, causando

a acidificação do caldo de fermentação e levando ao retardamento do processo de

fermentação, incluindo o crescimento celular, consumo de substrato e à produção de ácido

lático. O custo de separação e purificação também aumenta com a pureza do ácido lático

obtido (WANG, TASHIRO e SONOMOTO, 2015).

21

Hoje, o maior obstáculo para a produção de ácido lático comercialmente é a

disponibilidade e custo da matéria prima para produção do ácido lático por fermentação

(VIJAYAKUMAR, ARAVINDAN e VIRUTHAGIRI, 2008). Os açúcares purificados e do

extrato de levedura como matérias primas para a produção de ácido lático são de alto valor

econômico. Do ponto de vista da economia de matéria prima, materiais renováveis, como

matérias primas de baixo valor comercial ou subprodutos da industrialização de alimentos,

seriam preferidos devido à a sua disponibilidade e baixo custo.

3.9 Produção de ácido lático utilizando matérias primas renováveis

A produção fermentativa de ácido lático tem gerado grande interesse nos últimos anos

porque também oferece soluções para a poluição ambiental que é causada pela indústria

petroquímica, devido à oferta limitada de recursos petroquímicos (ABDEL-RAHMAN,

TASHIRO e SONOMOTO, 2011), utilização de matérias primas renováveis, de baixo custo,

consumo de energia e condições de operação suaves. Há muitas matérias primas baratas e

renováveis sendo utilizadas como: amido, trigo, milho, batata, arroz, lignocelulose, soro de

leite, beterraba, melaço de cana e outros. Recursos renováveis não contribuem

significativamente com o aumento de dióxido de carbono liberado para a atmosfera, assim

como na produção de petróleo proveniente de fontes de combustíveis fósseis

(HOFVENDAHL e HAHN-HÄGERDAL, 2000).

Abdel-Rahman, Tashiro e Sonomoto (2013) reportaram também que vários materiais

têm sido considerados como substratos alternativos atraentes e recursos renováveis, incluindo

subprodutos de agroindústria, indústrias de alimentos e biomassa não utilizada, naturais, ricos

em amido, biomassa lignocelulósica, soro de leite, iogurte, glicerol, biomassa de algas, entre

outros.

Na maioria dos casos, a glicose é a fonte de carbono preferida para a fermentação por

bactérias ácido láticas para a obtenção de ácido lático. No entanto, o mais barato é o uso de

materiais renováveis, como fonte de carbono, como: amido e lignocelulose, pois, atendem os

requisitos biotecnológicos para produção de ácido lático sendo desta forma economicamente

eficientes (VIDAL et al., 2011).

22

3.10 Pescado

O pescado é, desde a antiguidade, uma importante fonte de alimentos e a pesca uma

atividade econômica promotora de benefícios sociais para a população humana em todo o

mundo. Possui também todos os aminoácidos essenciais ao crescimento e à manutenção do

organismo humano, aliado à presença de elementos minerais necessários às inúmeras funções

orgânicas do organismo (FARIAS, 2006).

O pescado é conhecido por ser uma fonte de proteína rica em aminoácidos essenciais

(lisina, metionina, cistina, treonina e triptofano) e vitaminas lipossolúveis (USYDUS,

SZLINDER-RICHER e ADAMCZYK, 2009).

Segundo Taskaya, Chen e Jaczynski (2009), a capacidade dos recursos naturais

aquáticos para fornecimento de produtos alimentares está no limite, e futuras demandas para

estes alimentos terão de ser preenchidas seja pela aquicultura ou pela eficiente utilização do

processamento de subprodutos.

Espécies de pescado de baixo valor comercial vêm sendo amplamente estudadas com a

finalidade de transformar essas matérias primas em produtos aceitáveis pela população,

conduzindo a um maior consumo, seja para uso alimentar ou não alimentar (CENTENARO,

2007).

3.10.1 Proteínas do pescado

As proteínas musculares do pescado apresentam a vantagem de possuírem elevado valor

biológico, decorrente de alta sensibilidade à hidrólise e composição balanceada em

aminoácidos, principalmente os limitantes em proteínas de origem vegetal, como a metionina

e a cisteína (NEVES, MIRA e MARQUEZ, 2004).

A proteína muscular é constituída de proteína sarcoplasmática, proteína miofibrilar e

proteínas do estroma, ou proteínas do tecido conectivo. Estas três frações de proteínas podem

ser diferenciadas pela sua solubilidade (BANDMAN, 1987).

3.10.2 Corvina

A corvina é um dos peixes demersais e bentônicos sciaenídeos com distribuição

conhecida desde o Golfo do México, Antilhas até o Golfo de San Matías, Argentina. No ciclo

23

de vida de Micropogonias furnieri, os indivíduos juvenis migram para áreas estuarinas e os

adultos alcançam a zona costeira adjacente para se reproduzir. Esta espécie é chamada de

demersais e bentônicos porque é encontrada em fundos lodosos e arenosos, mais comumente

em profundidades inferiores a 60 m (PORTO et al., 2009).

A corvina, apesar de ser uma espécie de baixo valor comercial, é considerada um dos

mais importantes recursos costeiros da plataforma Sul do Brasil. Em 2008, o desembarque no

estado de Rio Grande do Sul foi de 6.680.582 Kg, e o custo de comercialização desta espécie

é de R$ 0,75 por Kg (IBAMA, 2009). De acordo com Elsdon e Gillanders (2002), a corvina

pode atingir até 70 cm de comprimento, porém é permitida a captura de exemplares com no

mínimo 25 cm (BRASIL, 2003). A corvina é uma espécie muito comum na zona costeira do

sul do Brasil. No entanto, apesar da grande disponibilidade desta matéria prima, esta espécie

atinge no mercado menores preços (principalmente as espécies adultas por serem parasitadas)

em relação a outras espécies regionais, principalmente as de menor tamanho.

Na Figura 4 é mostrado um exemplar de corvina.

Figura 4 - Corvina (Micropogonias furnieri)

Fonte: Fish Base (2015).

3.11 Hidrólise ácida do pescado para uso como fonte de nitrogênio

Comumente, extrato de levedura é usado como fonte de nutriente em fermentações em

escala laboratorial. Como o extrato de levedura não é economicamente atraente, se deseja

24

encontrar alguns novos nutrientes adequados para um processo industrial e substituir o extrato

de levedura. Geralmente, as proteínas são nutrientes que precisam ser hidrolisados em

peptídeos e aminoácidos antes de serem aproveitados para a produção de produtos funcionais.

A hidrólise enzimática é uma alternativa para a recuperação de proteína e encontra ampla

utilização em indústrias de alimentos, pois traz produtos de alta funcionalidade e valor

nutritivo (GAO et al., 2006).

Do ponto de vista econômico, os hidrolisados de proteína produzida por hidrólise

enzimática não são aplicáveis como fontes de nutrientes na produção devido ao baixo custo

do ácido lático.

Ao contrário, a hidrólise ácida tem como vantagens de ser de baixo custo, ter tempo de

hidrólise curto, e modo operacional simples, o que faz com que este seja aplicável em

processos industriais. Alguns nutrientes, tais como aminoácidos, hidrolisado de soja e

proteína de chifres de carneiro, têm sido utilizados para a produção de ácido lático depois que

hidrolisados com ácidos (GAO et al., 2006).

Subprodutos e resíduos de pescado poderiam ser utilizados como fontes de nutrientes

para a produção de ácido lático. A indústria de pesca cria grande quantidade de resíduos e

subprodutos todos os anos e existe a procura de técnicas eficazes e ecológicas para tratar os

resíduos. Foi realizada uma pesquisa em relação a produção de hidrolisado ácido de proteína

de pescado (MARTONE, BORLA e SANCHEZ, 2005), e/ou uso de proteína de resíduos de

camarão (FERRER et al., 1996).

3.12 Aplicações do ácido lático

Algumas razões pelas quais o ácido lático é considerado o ácido carboxílico de maior

aplicação é por sua versatilidade, rentabilidade e produção a partir de fontes renováveis. Há

tempo, se sabe que o ácido lático é usado na indústria para preservar os alimentos (LIU, HAN

e ZHOU, 2011). A indústria de alimentos apresenta uma demanda de aproximadamente 85%

de ácido lático. Este é utilizado como acidulante, tampão, aromatizante ou inibidor de

deterioração bacteriana em uma grande variedade de alimentos processados como doces, pães

e outros produtos de panificação, refrigerantes, sopas, sorvetes, produtos lácteos, cerveja,

maionese e ovos na indústria de alimentos, sendo que mais de 50% do ácido lático produzido

é utilizado como agente emulsionante. A sua capacidade de reter água lhe confere o uso como

hidratante em cosméticos e umectante em formulações farmacêuticas, principalmente em

25

pomadas e loções (JOHN et al., 2009). Além disso, é utilizado nas indústrias farmacêutica,

têxtil, química e de curtumes (JAWAD et al., 2013).

Também o ácido lático é utilizado na síntese de polímeros biorreabsorvíveis para

utilizações médicas, tais como suturas cirúrgicas, próteses, medicamentos e sistemas de

distribuição controlada (WEE, KIM e RYU, 2006). O emprego do ácido lático na produção de

biopolímeros para aplicações médicas tem aumentado significativamente sua demanda

mundial. Este crescimento é motivado pela possibilidade de substituição de materiais

plásticos que não sejam biodegradáveis ou biocompatíveis por biomateriais que possam ser

aplicados em próteses artificiais, liberação controlada de medicamentos e em aplicações

médicas, como reconstituições em vítimas de queimaduras, fraturas e de grandes escoriações

(CAPELLARI, 2010).

Por outro lado, o ácido lático é atualmente de interesse devido ao seu uso potencial

como matéria prima principalmente na síntese do polímero plástico biodegradável

denominado de ácido polilático (PLA) ou poli (L-ácido lático) (LASPRILLA et al., 2012). Ao

mesmo tempo, o ácido lático é considerado um produto químico viável, por ser facilmente

convertido para uma gama de produtos químicos industriais importantes, como óxido de

propileno; propileno glicol; 2,3-pentanodiona; ésteres de lactato e ácido acrílico (MOON,

WEE e CHOI, 2012).

Apesar do vasto campo de aplicação, o uso do ácido lático é limitado pelo preço de

mercado do produto. Seu consumo seria consideravelmente aumentado, principalmente na

indústria de plásticos onde o custo da matéria prima é decisivo, nas aplicações descritas

anteriormente e em muitas outras nas quais o ácido lático possui enorme potencial. O custo

final de produção do ácido lático está associado, em sua maior parte, aos processos de

separação do produto final, que requerem muitas etapas e têm elevados custos (CAPELLARI,

2010).

26

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Pescado

O pescado utilizado foi a corvina adquirida no Mercado Público da cidade de Rio

Grande/Brasil. Esta foi filetada no próprio mercado e levada em caixas térmicas com gelo

para processamento até o Laboratório de Tecnologia de Alimentos e Laboratório de

Processamento de Pescado da Universidade Federal do Rio Grande (FURG).

4.1.2 Micro-organismos e manutenção

Foram utilizadas 10 espécies de bactérias ácido láticas, sendo estas: Lactobacillus

rhamnosus NRRL B-442, Weisella viridescens NRRL B-1951, Oneococcus oeni NRRL B-

3472, Lactobacillus sakei NRRL B-1917, Bifidobacterium longum NRRL B-41409,

Pediococcus acidilactici NRRL B-14958, Lactobacillus acidophilus NRRL B-23431,

Lactobacillus casei subespécie casei NRRL B-1922, Carnobacterium maltaromaticum NRRL

B-14852 e Lactobacillus plantarum NRRL B-4496. Esses micro-organismos foram obtidos

do Laboratório de Bioengenharia da Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD),

sendo que as cepas foram adquiridas da Coleção de Culturas ARS (NRRL), do Departamento

de Agricultura dos EUA (USDA). Esses micro-organismos foram transportados até o

Laboratório de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande (FURG), em

placas de Petri contendo ágar MRS, acondicionadas em caixas térmicas a 4±2 ºC.

Para a manutenção das cepas microbianas foram feitas estrias superficiais em placas de

Petri contendo Agar MRS (Mann, Rogosa & Sharpe) contendo em sua formulação: peptona

(10,0 g.L-1

), extrato de levedura (5,0 g.L-1

), extrato de carne (10,0 g.L-1

), glicose (20,0 g.L-1

),

monooleato de sorbitan (1,0 mL.L-1

), fosfato de dipotássio (2,0 g.L-1

), acetato de sódio (2,0

g.L-1

), citrato triamonical (2,0 g.L-1

), sulfato de magnésio (0,20 g.L-1

) e sulfato de manganês

(0,05 g.L-1

). As placas foram incubadas em estufa estática (Fanem, São Paulo, Brasil) a

37±1 °C por 48 h, e a seguir as mesmas foram armazenadas em refrigerador a 4±1 °C

(NEVES, 2009). Foram realizados repiques mensais de cada cultivo de micro-organismo com

o intuito de garantir a viabilidade da cultura e garantir o mesmo nível de atividade celular.

27

4.1.3 Reagentes

Os reagentes químicos e os meios de cultura utilizados para todas as análises realizadas

neste trabalho foram de qualidade P. A.

4.1.4 Infraestrutura

Para o processo tecnológico e determinações analíticas foram utilizados o Laboratório

de Tecnologia de Alimentos, Laboratório de Processamento de Pescado, além de outros

laboratórios do curso de Engenharia de Alimentos, todos estes localizados na Escola de

Química e Alimentos da FURG, localizada no Campus Carreiros desta Universidade.

4.2 Metodologia

4.2.1 Preparo do material

O músculo de pescado adquiridos no Mercado Público de Rio Grande foi cominutado e

este foi congelado em freezer a -18 ºC e foi sendo utilizado conforme necessário.

4.2.2 Caracterização físico química do pescado

Realizaram-se análises físicas e químicas de pH e de composição proximal do músculo

de corvina, onde se realizou análise de cinzas (método 920.153), proteínas (método 928.08),

lipídios (método 960.39) e umidade (método 950.46), conforme metodologia oficial da

AOAC (2000).

28

4.3 Curva de crescimento microbiano para produção de biomassa

Para a produção da biomassa, o caldo MRS foi enriquecido com mais 20% de glicose, a

fim de fornecer mais energia para o crescimento dos micro-organismos estudados. Em

seguida, o meio foi autoclavado a 121 °C por 15 min. Esperou-se esfriar, e para cada 400 mL

de caldo foram colocadas 6 alçadas de células (do crescimento realizado em placas) de cada

micro-organismo estudado (LUVIELMO, VENDRUSCOLO e SCAMPARINI, 2007). Em

seguida, colocou-se em incubadora refrigerada (Tecnal, modelo TE-420, Rio de Janeiro,

Brasil) com movimento rotatório de 150 rpm em 37±1 °C, por um período de 48 h.

Com o intuito de verificar qual micro-organismo obtinha maior produtividade celular,

foram feitas curvas de crescimento celular e de densidade ótica (DO) durante o período de 48

h de cultivo, onde foram retiradas alíquotas de 10 mL do caldo que estava sendo cultivado em

frascos Erlenmeyer de 500 mL em incubadora de agitação rotatória (rpm) (Cientec, modelo

CT-712 RNT) à 37 ºC em intervalos de 4 h sendo, transferidas para tubos Falcon

(previamente secos a 105 °C/24 h). Estes foram centrifugados em centrífuga (Hanil, modelo

Supra 22K) 14.308 x g por 15 min. O sobrenadante foi descartado e as células recuperadas

por centrifugação foram ressuspensas no mesmo volume (10 mL) de água destilada. Este

procedimento foi realizado por 3 vezes nas mesmas condições (HUJANEN et al., 2001).

Essas repetidas lavagens foram realizadas com o intuito de remover lipídios, carboidratos,

entre outras substâncias a fim dos mesmos não interferirem na massa final da massa celular

(biomassa). Após ser realizada essas repetidas lavagens os tubos Falcon foram secos em

estufa 105 ºC/ 24 h, até peso constante. A concentração de biomassa foi expressa em g/L. Em

paralelo foi retirado em um tubo Falcon 5 mL do caldo que estava sendo cultivado para a

realização da leitura de densidade ótica (DO). Este foi realizado em espectrofotômetro

(Shimadzu, Kyoto, Japão) previamente estabilizado em 600 nm, sendo, quando necessário,

multiplicado o valor encontrado nas diluições feitas para ficar na faixa entre 0,2 e 1. O

acompanhamento espectrofotométrico foi realizado para saber em que período de tempo o

micro-organismo apresentava sua maior produtividade devido a ter uma espera de tempo

muito grande para a determinação da biomassa por gravimetria.

Foram construídos gráficos de biomassa x tempo x DO para verificação do crescimento

celular de cada micro-organismo estudado (Apêndice 1). A amostragem foi realizada em

duplicata e expressa em gramas de biomassa por L. Com estas curvas foi possível calcular os

parâmetros cinéticos de crescimento para os micro-organismos avaliados.

29

4.4 Estudo da cinética de crescimento

4.4.1 Conversão da densidade ótica em massa seca

O Fator de conversão (FC) foi estimado através da correlação linear de Pearson (R2)

entre as medidas de DO (600 nm) das suspensões preparadas a partir do caldo fermentado e

suas respectivas massa secas (g/L) (MARTHOS, 2012).

4.4.2 Velocidade específica máxima de crescimento (µmax)

As velocidades específicas máximas de crescimento (µmax h-1

) foram determinadas

através da construção do gráfico Ln X/Xo em função do tempo, obtendo-se o valor de µmax

pelo coeficiente angular da reta ajustada aos dados experimentais na fase exponencial de

crescimento, conforme a Equação 1 (STROPPA et al., 2009):

Ln (X/Xo) = µmax. t [1]

4.4.3 Produtividade máxima de biomassa

A biomassa foi analisada também quanto ao parâmetro de produtividade (Xmax (g/L/h),

sendo que esta foi calculada pela maior concentração de biomassa obtida em 48 horas de

fermentação para todos os micro-organismos analisados (GERN, 2005).

4.5 Screening de variáveis

Após a realização das curvas de crescimento celular, e a verificação dos parâmetros

cinéticos, os micro-organismos que mais se destacaram foram utilizados para a realização do

screening de variáveis para obter maior produção de biomassa e ácido lático. Para a realização

do screening foi utilizado um planejamento experimental Plackett-Burman. Os ensaios foram

realizados em frascos Erlemnmeyer de 500 mL, em incubadora refrigerada com agitação

rotatória (Tecnal, modelo TE-420, Rio de Janeiro, Brasil), em diferentes condições de cultivo.

30

O planejamento experimental Plackett-Burman foi realizado com o intuito de serem

obtidos resultados em meio sintético padrão para depois serem comparados com um segundo

planejamento (DCCR), desta vez realizado com o músculo de corvina.

4.6 Preparo do pré inóculo e inóculo

Para o preparo do pré inóculo, o caldo MRS também foi enriquecido com 20% de

glicose, autoclavado a 121 °C por 15 min. Esperou-se esfriar (aproximadamente 30 ºC) e para

cada 400 mL de caldo foram colocados 6 alçadas de células (do crescimento realizado em

placas) de cada micro-organismo estudado (LUVIELMO, VENDRUSCOLO e

SCAMPARINI, 2007). Em seguida, colocou-se os Erlemnmeyers em incubadora (Tecnal,

modelo TE-420, Rio de Janeiro, Brasil) com movimento rotatório a 37±1 °C, 150 rpm, até ser

encontrado a mesma leitura de densidade ótica encontrada anteriormente na obtenção das

curvas de crescimento.

Após o período de crescimento de cada micro-organismo selecionado pela maior

produção de biomassa, foram colocados 10% do volume deste pré inóculo em frascos

Erlemnmeyers de 500mL contendo 400 mL caldo MRS com os valores das variáveis

estudadas nos experimentos Plackett-Burman (ver Tabela 2). Todos os experimentos foram

preparados utilizando água destilada.

Com os resultados do Plackett-Burman foram determinados os efeitos significativos e

não significativos que influenciaram a produção de biomassa e a concentração de ácido lático.

4.7 Estudo do crescimento microbiano

4.7.1 Matriz de delineamento experimental Plackett-Burman

Antes de definir as concentrações que seriam utilizadas neste trabalho para as variáveis

estudadas, foi realizada uma pesquisa na literatura científica relacionada para verificar as

concentrações utilizadas por outros autores e estipular algumas concentrações como máximas

e mínimas no estudo.

A temperatura ótima de crescimento das bactérias ácido láticas varia entre 20 a 45 °C

(WOOD e HOLZAPFEL, 1995). Em relação a isso foram definidas temperaturas de

31

crescimento na faixa de 28 a 40 °C, pois todos os micro-organismos avaliados neste estudo

crescem nesta faixa de temperatura.

Foram utilizados neste estudo variações de rotação entre 100 e 200 rpm para todos os

micro-organismos avaliados. Esses valores foram escolhidos devido a vários autores

reportarem o uso nesta faixa de agitação (150 rpm) Honorato et al. (2007); (200 rpm) Lunelli

et al. (2010); Nancib et al. (2001); (100 rpm) Oliveira et al. (2009); Gao et al. (2005) para o

crescimento de Lactobacillus para fins de produção de ácido lático.

Foram estabelecidos valores de Tween-80 (polissorbato) entre 5 e 7,5 ml/L, valores que

também foram utilizados por Meng et al. (2012) para a produção de ácido lático usando

Lactococcus lactis.

Segundo Brinques (2009), as bactérias ácido láticas crescem bem em pH próximo à

neutralidade, entre 5,5 e 7,5. Para os Lactobacillus estudados foram definidos valores na faixa

de pH ótimo que é de 5,5 até 7,5.

Em relação à fonte de glicose, vários autores reportaram o uso de 50 g/L (NANCIB et

al., 2001; HONORATO et al., 2007) para a produção de ácido lático. Já Chooklin,

Kaewsichan e Kaewsichan (2011) utilizaram 20 g/L de glicose como fonte de carbono para a

produção de ácido lático utilizando óleo de palma como substrato. Em geral foram utilizados

valores de glicose que variaram de 20 a 50 g/L.

Abdullah e Mat (2005) utilizaram 10 g/L de extrato de levedura para a produção de

ácido lático. Arasaratnam, Senthuran e Balasubramaniam (1996) utilizaram 20 g/L de extrato

de levedura para a produção de ácido lático com L. delbrueckii. Neste trabalho foi utilizada

uma concentração de extrato de levedura (como fonte de nitrogênio) que variou de 10 a 20

g/L, sendo que no ponto central foi utilizado 15 g/L de extrato de levedura.

Para este trabalho foi utilizado fosfato de potássio em uma faixa que variou de 1,5 a 3,5

g/L. Coelho (2011) utilizou em seu estudo 2 g/L de fosfato de potássio para a produção de

ácido lático.

Para determinar quais as variáveis que apresentaram o maior efeito na produção de

biomassa e ácido lático, um delineamento experimental Plackett-Burman foi realizado,

utilizando o programa Statistica 7.0, onde se realizou um planejamento para cada um dos

micro-organismos selecionados previamente.

A matriz do delineamento Plackett-Burman utilizado (valores reais e codificados) está

apresentada na Tabela 2.

32

Tabela 2 - Matriz experimental Plackett-Burman (valores reais e codificados) para L.

acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum, W. viridescens e B. longum

Experimentos Variáveis

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7

1 40(+) 100(-) 5,5(-) 7,5(+) 20(-) 10(-) 3,5(+)

2 40(+) 200(+) 7,5(+) 5,0(-) 20(-) 10(-) 1,5(-)

3 30(-) 200(+) 5,5(-) 7,5(+) 50(+) 10(-) 1,5(-)

4 40(+) 100(-) 7,5(+) 7,5(+) 20(-) 20(+) 1,5(-)

5 40(+) 200(+) 7,5(+) 5,0(-) 50(+) 20(+) 3,5(+)

6 40(+) 200(+) 5,5(-) 7,5(+) 20(+) 20(+) 1,5(-)

7 30(-) 200(+) 7,5(+) 7,5(+) 20(-) 20(+) 3,5(+)

8 30(-) 100(-) 7,5(+) 7,5(+) 50(+) 10(-) 3,5(+)

9 30(-) 100(-) 7,5(+) 5,0(-) 50(+) 20(+) 1,5(-)

10 40(+) 100(-) 5,5(-) 5,0(-) 50(+) 20(+) 3,5(+)

11 30(-) 200(+) 5,5(-) 5,0(-) 20(-) 20(+) 3,5(+)

12 30(-) 100(-) 5,5(-) 5,0(-) 20(-) 10(-) 1,5(-)

13 35(0) 150(0) 6,5(0) 6,25(0) 35(0) 15(0) 2,5(0)

14 35(0) 150(0) 6,5(0) 6,25(0) 35(0) 15(0) 2,5(0)

15 35(0) 150(0) 6,5(0) 6,25(0) 35(0) 15(0) 2,5(0)

Onde: X1 Temperatura (ºC); X2 agitação (rpm); X3 pH inicial; X4 Tween-80(g/L); X5

concentração de glicose (g/L); X6 concentração de extrato de levedura (g/L); X7 concentração

de fosfato de potássio (g/L).

No planejamento foram realizados 15 experimentos com 3 repetições no ponto central, a

fim de fixar os melhores parâmetros e avaliar as melhores condições de cultivo. Foram

utilizadas 7 variáveis: temperatura (ºC), agitação (rpm), pH, emulsificante Tween-80 (g/L)

(Synth); concentração de glicose (g/L); concentração de extrato de levedura (g/L) e

concentração de fosfato de potássio (g/L) (Synth). Como fonte de carbono foi utilizada

glicose (P.A) (Synth) e como fonte de nitrogênio foi utilizado extrato de levedura (Himedia).

Como variáveis resposta foram avaliadas a produção de ácido lático em g/L e a

produção de biomassa em g/L após 48 h de cultivo.

33

4.8 Obtenção da hidrólise ácida das proteínas de pescado

O músculo de corvina foi descongelado em geladeira a 4 ºC por 12 h. Em seguida foi

realizada uma hidrólise ácida para extrair as proteínas do músculo utilizando a metodologia

recomendada por Gao et al. (2006). As proteínas foram extraídas por hidrólise ácida para se

tornarem mais disponíveis aos micro-organismos.

Inicialmente o músculo de pescado (MP) foi misturado com água destilada na

proporção 1:1 (m/v). Em seguida o pH da solução foi diminuído para pH 1 adicionando ácido

clorídrico (HCl) 6 mol/L. A mistura formada foi hidrolisada a 121 ºC por 20 min em

autoclave. Esperou-se a suspensão esfriar (aproximadamente 40 ºC) e em seguida a mesma foi

centrifugada em centrífuga de piso (Hanil, modelo Supra K 22, Incheon, Coreia do Sul) a

14308 x g por 20 min. O sobrenadante (pescado hidrolisado) foi armazenado em refrigerador

a 4±1 ºC e foi sendo utilizado conforme os experimentos.

A Figura 5 apresenta o fluxograma para a obtenção das proteínas hidrolisadas do

músculo de pescado.

34

Figura 5 - Fluxograma da hidrólise ácida para a obtenção das proteínas hidrolisadas do

músculo de pescado

4.8.1 Determinação do teor de nitrogênio das proteínas hidrolisadas de pescado

Do sobrenadante do pescado hidrolisado foi realizada a determinação de proteínas por

Kjeldhal para verificar qual a concentração de nitrogênio. Este valor foi expresso em

mg/100mL, utilizando metodologia oficial da AOAC (2000).

4.9 Obtenção de ácido lático e biomassa a partir de corvina

Após ter estudado todo o crescimento e verificado o comportamento dos micro-

organismos e os efeitos que influenciaram na produção de biomassa e ácido lático, através do

uso do extrato de levedura como fonte padrão de nitrogênio, foi feito um segundo

planejamento com os micro-organismos mais eficientes encontrados, sendo que o extrato de

35

levedura foi substituído por proteínas do pescado como fonte de nitrogênio, para verificar o

comportamento das mesmas.

4.10 Delineamento composto central rotacional (DCCR)

Para fazer o DCCR o preparo do pré inóculo foi similar aos realizados anteriormente

para o planejamento Plackett-Burman. Durante o cultivo em agitador (Tecnal, modelo TE-

420, Rio de Janeiro, Brasil), o crescimento dos micro-organismos estudados foi monitorado

para verificar se a absorbância inicial condizia com a absorbância similar à encontrada,

quando realizado na produção de biomassa. Isso garantiria que as mesmas condições de

crescimento estavam sendo repetidas (OGRODOWSKI, 2006).

No planejamento DCCR, ao final do tempo de cultivo (48 horas) foram retiradas

alíquotas para verificar a produção de biomassa (como descrito anteriormente) e ácido lático.

Também foi realizada a determinação do pH final para cada experimento do DCCR.

Com os efeitos significativos encontrados para produção de biomassa e ácido lático no

delineamento Plackett-Burman foram definidos quais dos micro-organismos seriam utilizados

para a realização de um planejamento DCCR. Então foi aplicado um DCCR (delineamento

composto central rotacional) (22), com 4 pontos axiais e 3 pontos centrais, totalizando 11

experimentos, sendo que as variáveis estudadas foram fixadas de acordo com o gráfico de

efeitos, conforme as condições pré-estabelecidas pelo planejamento experimental Plackett-

Burman. Este delineamento foi utilizado para encontrar as melhores condições do processo

para produção de biomassa e ácido lático.

Os cultivos referentes ao planejamento DCCR foram realizados em frascos

Erlemnmeyer contendo meio de cultivo previamente autoclavado, e este foi colocado em

incubadora com agitação (Tecnal, Rio de Janeiro, Brasil). No planejamento DCCR o extrato

de levedura (fonte de nitrogênio) foi substituído pelo músculo de corvina hidrolisado.

Cálculos prévios foram realizados em relação à substituição e manutenção da mesma

concentração de nitrogênio na substituição de extrato de levedura por músculo de corvina

hidrolisado. Depois foi definida uma relação de gramas de nitrogênio por 100 mL para fazer a

substituição de uma pela outra (extrato de levedura/pescado hidrolisado).

A matriz DCCR com os valores reais e codificados das variáveis temperatura (ºC) e

concentração de nitrogênio utilizada para os micro-organismos selecionados está apresentada

na Tabela 3.

36

Tabela 3 - Matriz de delineamento composto central rotacional (DCCR) para os micro-

organismos selecionados

Experimentos X1 X2

1 30(-1) 1,98(-1)

2 40(+1) 1,98(-1)

3 30(-1) 3,3(+1)

4 40(+1) 3,3(+1)

5 28(-1,41) 2,64(0)

6 42(1,41) 2,64(0)

7 35(0) 1,05(-1,41)

8 35(0) 4,23(1,41)

9 35(0) 2,64(0)

10 35(0) 2,64(0)

11 35(0) 2,64 (0)

Onde: X1 Temperatura (ºC); X2 Concentração de Nitrogênio (g de N/L).

4.11 Quantificação do ácido lático

Inicialmente foi realizada uma centrifugação em centrífuga (Hanil, modelo Supra 22 K,

Incheon– Coreia do Sul) do caldo fermentado (após 48 horas) de cada ensaio do planejamento

por 14308 x g/30 minutos. Em seguida o sobrenadante foi filtrado em membrana (Millipore)

hidrofílica de 0,22µm. Logo, o filtrado foi diluído em água ultra pura por 3 vezes e passados

para vials. Estes vials foram sonificados em banho ultrassônico (Unique, UltraCleaner 800,

São Paulo, Brasil). Em seguida os mesmos foram colocados para ser quantificados por

cromatografia. A metodologia utilizada para a detecção do ácido lático foi seguida da descrita

por Oliveira, Buzato e Hauly (2005). O cromatógrafo líquido (Shimadzu, Kyoto, Japão)

possuía detector UV (ultravioleta) com comprimento de onda de 210 nm. A coluna utilizada

foi Aminex HPX - 87H (300 x 7,8 mm) (Bio Rad, California, Estados Unidos). Foi utilizado

H2SO4 (0,005Molar) como fase móvel, com um fluxo de 0,6 mL/min e temperatura de 35 °C.

37

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Composição proximal do músculo de corvina

A Tabela 4 apresenta os valores de composição proximal e de pH encontrados para o

músculo de corvina. Os valores foram expressos em base úmida e base seca. As análises

foram feitas em triplicata.

Como citado por autores como Yeannes e Almandos, (2003) e Martins, Costa e

Prentice-Hernández, (2009), o conhecimento da composição da matéria prima é de

fundamental importância na aplicação de diferentes processos tecnológicos, além de

influenciar no aspecto de qualidade geral, bem como nos atributos sensoriais e na estabilidade

do armazenamento do produto final.

Tabela 4 – Análise físico química do músculo de corvina

Tipo de análise Músculo de Corvina

B.U B.S

Umidade (%) 80,0±0,53 ---

Proteínas (%) 18,30±0,13 91,5±0,13

Lipídios (%) 0,40±0,04 2,0±0,04

Cinzas (%)

pH

1,22±0,04

6,67

6,1±0,04

6,67

Resultado expresso como média e desvio padrão de três determinações.

Onde: B.U.: Base úmida, B.S.: Base seca.

Segundo outros autores como Beirão, Teixeira e Meinert (2000) e Pizato et al. (2012), a

composição proximal de pescado é variável, pois depende da espécie, estado nutricional,

sazonalidade, idade, parte do corpo e/ou condições gonadais.

Como se pôde observar na Tabela 4, o valor de umidade encontrado para o músculo de

corvina foi de 80%. Esses resultados concordam com os encontrados por Centenaro e Salas-

Mellado (2008) que obtiveram 80,2% de umidade quando trabalharam com filé de corvina. Já

Cortez-Vega (2011) encontrou um valor aproximado pra umidade (78,53%) quando trabalhou

com CMS (carne mecanicamente separada) de corvina. Valores bem próximos de umidade

38

foram encontrados por Bonacina e Queiroz (2007) quando avaliaram os filés de corvina para a

produção de empanado de pescado (78,5%).

Em relação ao teor de proteína, o resultado encontrado foi de 18,3% em base úmida e de

91,5% em base seca. Bonacina e Queiroz (2007) também encontraram um valor semelhante

ao encontrado neste trabalho para a proteína de filé de corvina em base úmida (18,8%).

O teor de lipídios foi de 0,4% em base úmida e de 2% em base seca. Valor bem acima

do que o encontrado neste trabalho foi reportado em base úmida por Bonacina e Queiroz

(2007) (1,10%). Estes valores diferentes podem estar relacionados com o mês do ano em que

os pescados foram capturados, com o estado nutricional dos mesmos, entre muitos outros

fatores que faz com que as características encontradas sejam diferentes, mesmo sendo

analisada a mesma espécie.

O valor encontrado para cinzas neste trabalho foi de 1,22 % em base úmida e de 6,1%

em base seca. Valores similares foram determinados por Cortez-Vega (2011) trabalhando com

CMS encontrou 1,19% em base úmida. Bonacina e Queiroz (2007) encontraram 1,1% de

cinzas; já Amorim (2014) encontrou 1% de cinzas em filés de corvina.

O pH encontrado para o músculo de corvina foi de 6,67. Este valor foi similar ao

encontrado por Bonacina e Queiroz, (2007) que encontraram um valor de pH de 6,57.

Segundo Fontes et al. (2007), o pH do pescado fresco varia entre 6,6 e 6,8, e a medida que

este se deteriora os valores de pH aumentam e podem atingir 7,2. Os resultados encontrados

neste trabalho afirmam que o pescado utilizado era de boa qualidade e o pH apresentava-se

em uma faixa bom de conservação.

5.2 Parâmetros cinéticos de crescimento dos diferentes micro-organismos estudados

Foram avaliados os parâmetros cinéticos de crescimento para os 10 micro-organismos

estudados. A Tabela 5 apresenta os valores de fatores de conversão, µmax (h-1

), e produtividade

(g/L) para cada micro-organismo avaliado.

39

Tabela 5 - Determinação dos valores cinéticos obtidos para cada micro-organismo avaliado

Micro-organismos FC µmax (h-1

) Xmax (g/L)

Lactobacillus sakei 0,028±0,005e 0,056±0,012

bcd 0,095±0,001

i

Lactobacillus acidophilus 0,236±0,007ab

0,080±0,021ab

0,870±0,003d

Lactobacillus casei 0,0213±0,003e 0,080±0,018

ab 0,550±0,004

g

Lactobacillus plantarum 0,156±0,010cde

0,077±0,008abc

0,940±0,003b

Weisella viridescens 0,221±0,037bc

0,018±0,005e 0,890±0,005

c

Bifidobacterium longum 0,181±0,025bc

0,019±0,012e 0,860±0,005

de

Pediococcus acidilactici 0,185±0,016bcd

0,046±0,005cde

0,50±0,012h

Carnobacterium maltaromaticum 0,124±0,007bcde

0,094±0,003a 0,850±0,003

e

Lactobacillus rhamnosus 0,335±0,065a 0,108±0,03

a 5,240±0,007

a

Oneoococcus oeni 0,062±0,043de

0,041±0,002de

0,780±0,005f

Onde: FC – Fator de conversão de densidade óptica (600 nm) em biomassa; µmax (h-1

) –

Velocidade específica máxima de crescimento; Xmax (g/l-1

): concentração máxima de

biomassa.

Pode-se observar que em relação ao parâmetro fator de conversão (FC) de densidade

óptica (600 nm) em biomassa que os valores ficaram próximos para a maioria dos micro-

organismos estudados, sendo que o Lactobacillus rhamnosus apresentou maior fator de

conversão (0,335) em relação aos outros micro-organismos seguido pelo Lactobacillus

acidophilus (0,236).

Em relação a velocidade específica máxima de crescimento (µmax h-1

) podemos observar

que o micro-organismos L. rhamnosus apresentou maior velocidade de crescimento (0,108 h-

1) do que os outros micro-organismos estudados, demostrando que seu crescimento por hora

foi maior. Oliveira (2011) quando trabalhou com fermentação em batelada também com o L.

rhamnosus, porém utilizando lactose como fonte de carbono, encontrou uma velocidade

específica de crescimento de 0,19 h -1

este valor está um pouco acima do encontrado neste

trabalho para o mesmo micro-organismo, podendo esse fato estar relacionado com a fonte de

nutriente utilizada, sendo que no presente trabalho a fonte de carbono utilizada para a

verificação da velocidade máxima de crescimento foi a glicose.

Silveira (2009) avaliou a velocidade especifica máxima de crescimento para o L. casei

utilizando suco de caju clarificado contendo 60 g/L de açúcares redutores a uma temperatura

de 37 ºC encontrou um µmax de 0,32 (h-1

). Este valor foi acima do encontrado no presente

trabalho (0,08 h-1

). Isso pode estar relacionado ao substrato fornecido para o crescimento

40

deste micro-organismo, sendo que neste estudo foi utilizado somente o caldo MRS

enriquecido com 20% de glicose.

Resultados inferiores de velocidade específica máxima de crescimento foram relatados

neste trabalho para o L. acidophilus, quando comparado com o trabalho de Figueiredo e

Passos (2003). Estes autores encontraram um µmax de 0,92 (h-1

) quando trabalharam com o

caldo MRS, já no presente trabalho utilizando o mesmo micro-organismo e o mesmo

substrato foi encontrado um µmax de 0,08 (h-1

).

Para a concentração máxima de biomassa (Xmax g/L) foram encontrados valores

elevados somente para o L. rhamnosus (5,24 g/L), sendo este valor atingido em 28 horas de

cultivo. Trabalho realizado por Xavier (2001) encontrou uma concentração máxima de

biomassa de 1,61 g/L que foi atingida em 54 horas de fermentação quando trabalhou com o

Lactobacillus pentosus. Neste trabalho a menor concentração máxima de biomassa foi

encontrada para o L. sakei (0,095).

Observando a Tabela 5 podemos verificar que os micro-organismos que apresentaram

maior produção de biomassa, maior velocidade específica máxima de crescimento e maior

fator de conversão de densidade óptica (600 nm) em biomassa em caldo MRS foram L.

acidophilus, L. plantarum, W. viridescens, B. longum e L. rhamnosus.

t

5.3 Curva padrão para a determinação de ácido lático

Antes de serem feitas as leituras para a determinação de ácido lático por cromatografia,

uma curva padrão de ácido lático foi construída. Como padrão foi utilizado ácido L (+) -

lático puro (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). Foram feitas diluições com concentrações de

10 a 70 g/L de ácido lático.

A equação gerada foi de Y = 6,89143E10-7

X – 0,239071. O R (coeficiente de

correlação) encontrado foi de 0,9995.

5.4 Produção de biomassa e ácido lático utilizando extrato de levedura como fonte de

nitrogênio

Na Tabela 6 são apresentados os valores encontrados para produção de biomassa e

ácido lático dos cinco micro-organismos selecionados em um período de 48 h utilizando um

planejamento Plackett-Burman.

41

Tabela 6 - Respostas obtidas utilizando planejamento Plackett-Burman para produção de biomassa e ácido lático após 48 h de cultivo

Experimentos

Respostas

Biomassa

(g/L)

L.

acidophilus

Ácido lático

(g/L)

L.

acidophilus

Biomassa

(g/L)

B. longum

Ácido lático

(g/L)

B. longum

Biomassa

(g/L)

W.

viridescens

Ácido

lático (g/L)

W.

viridescens

Biomassa

(g/L)

L.

rhamnosus

Ácido

lático (g/L)

L.

rhamnosus

Biomassa

(g/L)

L.

plantarum

Ácido lático

(g/L)

L. plantarum

1 0,150±0,007 2,000±0,001 0,009±0,001 3,240±0,001 0,120±0,012 2,660±0,001 0,150±0,001 15,36±0,015 0,060±0,001 0,120±0,001

2 0,430±0,002 14,200±0,009 0,007±0,001 3,540±0,001 0,400±0,014 11,68±0,001 0,550±0,007 12,07±0,012 0,100±0,001 2,780±0,001

3 0,180±0,05 20,600±0,012 0,020±0,001 0,040±0,001 0,560±0,001 2,460±0,001 0,300±0,002 20,42±0,002 0,150±0,001 2,730±0,001

4 0,350±0,002 17,600±0,015 0,057±0,002 8,460±0,026 0,400±0,001 8,380±0,005 0,380±0,006 18,30±0,003 0,320±0,005 4,420±0,001

5 0,130±0,001 26,200±0,017 0,018±0,002 9,820±0,012 0,400±0,005 5,800±0,004 0,650±0,012 30,56±0,010 0,300±0,001 5,520±0,002

6 0,440±0,001 19,100±0,016 0,009±0,001 3,360±0,002 0,100±0,003 9,400±0,012 0,800±0,012 14,82±0,018 0,048±0,002 0,060±0,007

7 0,570±0,003 15,900±0,018 0,070±0,001 9,100±0,010 0,340±0,001 11,26±0,015 0,860±0,002 18,16±0,016 0,140±0,012 1,440±±0,001

8 0,200±0,007 22,200±0,001 0,050±0,010 7,800±0,001 0,470±0,001 10,12±0,015 1,930±0,002 21,54±0,017 0,360±0,001 5,140±0,004

9 0,600±0,001 15,100±0,003 0,076±0,012 4,160±0,001 0,320±0,001 12,20±0,016 0,680±0,003 32,26±0,010 0,160±0,001 4,920±0,012

10 0,610±0,004 8,220±0,004 0,090±0,001 5,670±0,002 0,160±0,002 3,580±0,012 0,870±0,005 27,16±0,002 0,060±0,001 0,740±0,010

11 0,330±0,002 14,300±0,008 0,040±0,001 3,880±0,005 0,400±0,002 2,680±0,002 0,480±0,006 15,62±0,001 0,150±0,007 1,180±0,010

12 0,300±0,002 13,300±0,001 0,100±0,001 5,240±0,001 0,420±0,003 4,640±0,004 1,200±0,002 18,86±0,001 0,250±0,015 2,280±0,014

13 1,300±0,015 29,100±0,013 0,110±0,016 7,680±0,005 0,440±0,015 12,74±0,045 1,620±0,045 19,86±0,018 0,430±0,032 5,360±0,045

14 1,380±0,017 25,000±0,022 0,150±0,025 7,640±0,002 0,420±0,015 9,100±0,032 1,420±0,056 23,07±0,015 0,470±0,47 5,920±0,062

15 1,370±0,015 26,000±0,017 0,120±0,020 5,960±0,034 0,440±0,012 8,400±0,034 1,440±0,038 24,05±0,042 0,370±0,044 8,000±0,032

42

Pritchard e Coolbear (1993) afirmam que a síntese do acido lático por processo

fermentativo é associada ao crescimento celular, isto é, não há formação de produto se o

meio não possuir uma concentração adequada de nitrogênio para promover este

crescimento. Isso pode ser confirmado pela Tabela 6, pois, na maioria das vezes, quanto

maior a concentração de biomassa produzida pelos micro-organismos, maior a produção

de ácido lático.

Pode se observar na Tabela 6 que a produção de biomassa e ácido lático variou

para L. acidophilus. Hwang et al. (2015) encontraram uma produção de biomassa de 1,3

g/L para L. acidophilus, quando utilizaram glicose como fonte de carbono. Esses

mesmos autores encontraram uma produção de biomassa de 0,11 g/L para L.

acidophilus quando utilizaram extrato de carne como fonte de nitrogênio Para a

produção de ácido lático foi observada uma maior produção no experimento 13 (29,10

g/L) e menor produção de ácido lático para L. acidophilus foi observado no

experimento 1, em que obteve apenas 2,0 g/L.

B. longum apresentou uma produção máxima de biomassa no experimento 14. A

menor produção de biomassa seca para este micro-organismo foi no experimento 2, em

que obteve 0,007 g/L. A produção de ácido lático para B. longum também foi baixa,

sendo que o máximo de ácido lático alcançado por este micro-organismo foi de 9,82 g/L

(experimento 5). O experimento que obteve menor crescimento de ácido lático para este

micro-organismo foi o experimento 3 (0,04 g/L).

Observando a Tabela 6, pode se verificar que a produção máxima de biomassa

seca para W. viridescens foi de 0,56 g/L.

L. rhamnosus obteve maior produção de biomassa e também maior produção de

ácido lático quando comparados com os outros micro-organismos estudados, sendo que

o melhor experimento para a produção de biomassa seca foi o experimento 8 com

produção de 1,93 g/L. Já para a produção de ácido lático, o melhor experimento foi o 9,

com produção de 32,26 g/L. Estudo realizado por Wang et al. (2010), encontrou 175,4

g/L de ácido lático na fermentação em batelada, quando trabalharam com pó de

mandioca, onde neste pó havia uma concentração total de açúcar de 222,5 g/L.

L. plantarum apresentou uma produção máxima de biomassa seca quando

utilizado extrato de levedura como fonte de nitrogênio de 0,47 g/L (experimento 14) em

48 horas de fermentação e uma produção mínima de biomassa seca de 0,048 g/L

(experimento 6). Em relação à produção de ácido lático, L. plantarum apresentou como

máximo 5,92 g/L de ácido lático. Essa produção máxima foi observada no experimento

43

14. Panda e Ray (2008) encontraram uma produtividade de ácido lático para L.

plantarum de 23,86 g/L quando utilizaram como fonte de carbono, farinha de batata

doce (55 g) e uma produção de biomassa de 0,2 g/L.

Em algumas respostas a reprodutibilidade dos pontos centrais demostraram não

ser boa, podendo ser atribuída a erros na execução ou injurias do próprio micro-

organismo.

Essa diferença entre maior ou menor produção tanto de ácido lático como de

biomassa encontrado para esses micro-organismos estudados pode estar relacionada

com os nutrientes utilizados na composição do meio ou até mesmo na concentração

destes nutrientes sendo mais fáceis ou mais difíceis de serem assimilados pelos micro-

organismos.

5.5 Screening de variáveis na produção de biomassa e ácido lático

Após ter sido realizada a produção de ácido lático e biomassa pelo planejamento

Plackett-Burman, foi verificado quais variáveis apresentaram maior efeito sobre a

produção de biomassa e ácido lático (screening) para os 5 micro-organismos

selecionados.

As análises de efeitos foram executadas em erro puro com 95% de significância.

Foi escolhido 95% de significância devido ao fato de se querer obter o máximo de

confiança para depois otimizar o processo.

A Tabela 7 apresenta os efeitos encontrados para L. acidophilus. A temperatura

apresentou efeito significativo negativo para a produção de ácido lático. A variação de

temperatura de 30 ºC (nível -1) para 40 ºC (nível +1) resultou em um efeito negativo

para a produção de ácido lático. Os outros parâmetros estudados não apresentaram

efeito significativo para a produção de ácido lático.

Ainda observando a Tabela 7, podemos perceber que somente a variável

concentração de nitrogênio teve efeito significativo em relação à produção de biomassa.

44

Tabela 7 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

concentração de ácido lático para o L. acidophilus

Micro-organismo Variáveis

Biomassa (g/L) Concentração de ácido

lático (g/L)

Efeito Erro

padrão P-valor Efeito

Erro

padrão P-valor

Lactobacillus

acidophilus

Temperatura -0,0062 0,0255 0,8302 -5,541 1,2589 0,0479

Rotação -0,0271 0,0255 0,4006 5,1482 1,2589 0,0549

pH -0,0795 0,0255 0,0897 -0,2015 1,2589 0,8874

Tween-80 -0,0326 0,0279 0,3636 -3,8205 1,3745 0,1087

Concentração

de Carbono -0,0004 0,0255 0,988 -1,4584 1,2589 0,3663

Concentração

de Nitrogênio 0,2462 0,0255 0,0106 1,1649 1,2589 0,4524

Fosfato de

potássio -0,0462 0,0255 0,2125 -4,0449 1,2589 0,0847

Números em negrito significam que as variáveis foram significativas ao nível de

significância de 95% para produção de biomassa e/ou ácido lático.

A Tabela 8 mostra os efeitos encontrados para B. longum. Não foram observados

efeitos significativos tanto para a produção de biomassa quanto para ácido lático no

caso do B. longum.

Estudo realizado por Guilherme, Pinto e Rodrigues (2009) também mostraram

que o uso de extrato de levedura como fonte de nitrogênio não apresentou influência

significativa na produção de ácido lático.

45

Tabela 8 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

concentração ácido lático para B. longum

Micro-organismo Variáveis

Biomassa (g/L) Concentração de Ácido

lático (g/L)

Efeito Erro

padrão P-valor Efeito

Erro

padrão P-valor

Bifidobacterium

longum

Temperatura -0,0253 0,0122 0,1733 0,1978 0,5764 0,7641

Rotação -0,0386 0,0122 0,0872 -0,3578 0,5764 0,598

pH -0,017 0,0122 0,2976 -0,4988 0,5764 0,478

Tween-80 -0,0136 0,0133 0,4137 2,6831 0,6293 0,0508

Concentração

de Carbono -0,0056 0,0122 0,6913 0,0121 0,5764 0,985

Concentração

de Nitrogênio 0,0207 0,0122 0,232 1,2721 0,5764 0,158

Fosfato de

potássio 0,0036 0,0122 0,7955 2,0044 0,5764 0,0736

A Tabela 9 mostra os efeitos encontrados para o micro-organismo W. viridescens.

Pode se verificar que nenhuma das variáveis estudadas apresentou efeito significativo

para a produção de biomassa e ácido lático.

46

Tabela 9 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e ácido

lático para W. viridescens

Micro-organismo Variáveis

Biomassa (g/L) Concentração de Ácido

lático (g/L)

Efeito Erro

padrão P-valor Efeito

Erro

padrão P-valor

Weisella

viridescens

Temperatura -0,1644 0,0646 0,1261 -1,273 1,3681 0,45

Rotação 0,061 0,0646 0,4446 1,247 1,3681 0,4581

pH -0,0277 0,0646 0,7097 -0,347 1,3681 0,8233

Tween-80 0,0564 0,0706 0,5079 5,783 1,4937 0,0606

Concentração

de Carbono -0,0022 0,0646 0,9752 1,34 1,3681 0,4304

Concentração

de Nitrogênio -0,0989 0,0646 0,2657 2,653 1,3681 0,1919

Fosfato de

potássio -0,061 0,0646 0,4446 -3,073 1,3681 0,1536

A Tabela 10 mostra os efeitos significativos e não significativos encontrados para

o micro-organismo L. rhamnosus. Foi observado que a temperatura apresentou

influência significativa ao nível de confiança de 95%, tanto para a produção de

biomassa quanto para a produção de ácido lático. Para a produção de ácido lático e

biomassa, a variável temperatura apresentou efeito negativo, o que significa que quando

a mesma diminui do nível +1 (40 ºC) para o -1 (30 ºC) ocorreu um aumento na

concentração de acido lático e biomassa. Trabalho realizado por Coelho (2011)

demonstrou que as variáveis que obtiveram maior efeito significativo na produção de

ácido lático foram Tween-80, água de maceração do milho e sulfato de magnésio.

Ambas as variáveis apresentaram efeito positivo.

Outra variável que apresentou efeito significativo foi a concentração de

nitrogênio. Esse efeito somente foi observado para a produção de ácido lático. Houve

um aumento na produção de ácido lático quando o nível passou de -1 (20 g/L) para +1

(50 g/L).

47

Tabela 10 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

ácido lático para L. rhamnosus

Micro-organismo Variáveis

Biomassa (g/L) Concentração de Ácido

lático (g/L)

Efeito Erro

padrão P-valor Efeito

Erro

padrão P-valor

Lactobacillus

rhamnosus

Temperatura -0,3358 0,0714 0,0423 -5,6774 1,2868 0,0477

Rotação -0,2674 0,0714 0,0644 -0,7259 1,2868 0,6294

pH 0,0041 0,0714 0,9589 -4,9007 1,2868 0,0625

Tween-80 -0,0349 0,0779 0,698 3,4743 1,4049 0,1319

Concentração

de Carbono 0,2625 0,0714 0,0667 0,3107 1,2868 0,8316

Concentração

de Nitrogênio -0,1241 0,0714 0,2243 8,8307 1,2868 0,0205

Fosfato de

potássio 0,1774 0,0714 0,1309 3,6992 1,2868 0,1027

Números em negrito significam que as variáveis foram significativas para produção de

biomassa e/ou ácido lático.

A Tabela 11 apresenta os efeitos encontrados para L. plantarum. Não foi

observada influência significativa a um nível de confiança de 95%, tanto para a

produção de biomassa quanto para a produção de ácido lático para L. plantarum.

48

Tabela 11 - Efeitos encontrados no planejamento Plackett-Burman para biomassa e

ácido lático para L. plantarum

Micro-organismo Variáveis

Biomassa (g/L) Concentração de ácido

lático (g/L)

Efeito Erro

padrão P-valor Efeito

Erro

padrão P-valor

Lactobacillus

plantarum

Temperatura -0,0628 0,0295 0,1671 -1,0824 0,8167 0,3161

Rotação -0,0444 0,0295 0,2714 -0,2441 0,8167 0,7931

pH 0,0004 0,0295 0,989 -0,9924 0,8167 0,3482

Tween-80 0,0552 0,0322 0,2289 2,4449 0,8917 0,1112

Concentração

de Carbono 0,0188 0,0295 0,5883 1,5558 0,8167 0,197

Concentração

de Nitrogênio -0,0477 0,0295 0,2472 -0,5608 0,8167 0,5632

Fosfato de

potássio -0,0022 0,0295 0,9471 -0,9158 0,8167 0,3787

5.6 Obtenção de ácido lático e biomassa a partir de proteínas de corvina

A intenção de substituir o extrato de levedura pelo músculo de corvina como fonte

de nitrogênio foi devido ao músculo possuir elevado teor de proteína e de vitaminas do

complexo B. Segundo Cock, Guerrero e Restrepo (2013), um bom conteúdo de

aminoácidos essenciais, vitaminas, nitrogênio e minerais são necessários para o

crescimento celular ótimo de bactérias produtoras de ácido lático.

Após a realização da hidrólise ácida foi encontrado um valor de nitrogênio de 0,33

g de nitrogênio/100mL. Com esse valor foi possível equivaler a quantidade de

nitrogênio presente no pescado com o que continha no extrato de levedura para que

ficassem valores semelhantes na utilização de um substrato e outro.

A partir da realização do planejamento Plackett-Burman, foi possível a seleção

das variáveis que mostraram efeito significativo quando utilizado extrato de levedura

como fonte de nitrogênio. Neste caso os micro-organismos que apresentaram variáveis

com efeitos significativos foram o L. acidophilus e o L. rhamnosus.

49

Assim, foi definido que esses dois micro-organismos seriam estudados para

substituição do extrato de levedura pelo músculo de corvina como fonte de nitrogênio, e

também que as variáveis respostas que seriam estudadas no planejamento DCCR seriam

a temperatura e a concentração de nitrogênio, já que foram estas variáveis que

apresentaram efeito significativo. Os valores que não foram influentes foram fixados.

Para o micro-organismo L. rhamnosus foram fixados os valores de rotação em

200 rpm, pH em 6,5, Tween-80 em 5 g/L, concentração de carbono em 20 g/L e fosfato

de potássio em 1,5 g/L. Já para o micro-organismo L. acidophilus foram fixados os

valores de rotação em 150 rpm, pH em 6,5, Tween-80 em 6,25 g/L, concentração de

carbono em 35 g/L e fosfato de potássio em 2,5 g/L.

5.7 pH e tratamento experimental do dados

5.7.1 pH

Ao final de cada experimento do Planejamento DCCR (48 h) foi medido o pH do

caldo fermentado. A Tabela 12 apresenta os valores finais de pH encontrados para L.

acidophilus e L. rhamnosus.

Como o pH inicial do meio foi fixado em 6,5, pode se observar pela Tabela 13

que houve uma queda do pH durante as 48 h de fermentação. Essa queda foi mais

acentuada para o L. rhamnosus do que para o L. acidophilus e, isto pode estar

relacionado pelo fato que este micro-organismo apresentou maior produção de ácido

lático, e quanto maior a produção de ácido no meio, menor seria o pH. De acordo com

Oliveira et al. (2009), as bactérias láticas iniciam seu crescimento em pH neutro ou

alcalino e continuam crescendo através da fermentação, resistindo até mesmo ao pH

ácido. Essa capacidade das bactérias de produzir e tolerar uma concentração

relativamente alta de ácido lático é também de grande valor seletivo, já que as capacita

para eliminar a competição da maioria das outras bactérias (SILVA et al., 2010).

50

Tabela 12 - Valores de pH após 48 h de fermentação apresentados pelo planejamento

DCCR para L. acidophilus e L. rhamnosus

Experimentos Micro-organismo

L. acidophilus L. rhamnosus

1 5,15±0,12abc

3,54±0,1d

2 5,01±0,1bc

3,6±0,1d

3 5,25±0,1ab

3,64±0,15d

4 4,92±0,15c 3,74±0,1

d

5 5,11±0,09abc

3,51±0,1d

6 5,26±0,1ab

5,32±0,1bc

7 5,25±0,1ab

5,08±0,1c

8 5,31±0,12ª 5,04±0,0c

9 5,2±0,12abc

5,9±0,1ª

10 5,07±0,1abc

5,83±0,1ª

11 5,15±0,1abc

5,51±0,15b

5.7.2 DCCR (delineamento composto central rotacional)

As respostas obtidas utilizando as variáveis do delineamento composto central

rotacional (DCCR) estão apresentadas na Tabela 13.

Pode se observar que a produção tanto de biomassa quanto de ácido lático foi

maior para o L. rhamnosus, sendo que a produção máxima de biomassa foi encontrada

no experimento 5. Neste experimento a concentração de nitrogênio utilizada estava no

ponto central (2,64 g/L) e a temperatura estava no nível -1 (30 ºC). A produção máxima

de biomassa encontrada foi de 2,72 g/L, e a maior produção de ácido lático encontrada

neste planejamento para L. rhamnosus foi de 19,21 g/L (ensaio 3).

Em relação ao L. acidophilus, este apresentou a maior produção de biomassa

(0,96 g/L) no experimento 4. E a maior produção de ácido lático para esse micro-

organismo foi encontrado no ponto central (12,64 g/L).

51

Tabela 13 - Respostas encontradas no planejamento DCCR para produção de biomassa

e ácido lático por L. rhamnosus e L. acidophilus

Experimentos

Respostas

Biomassa (g/L)

L. rhamnosus

Ácido lático (g/L)

L. rhamnosus

Biomassa (g/L)

L. acidophilus

Ácido lático (g/L)

L. acidophilus

1 1,92 18,79 0,32 5,58

2 1,68 17,76 0,3 8,39

3 2,44 19,21 0,4 6,48

4 1,8 17,74 0,96 6,92

5 2,72 17,94 0,68 7,86

6 0,88 17,97 0,38 2,92

7 0,52 16,8 0,1 2,94

8 1,4 14,24 0,25 3,34

9 0,36 13,25 0,72 11,16

10 0,37 12,47 0,68 12,64

11 0,38 12,78 0,7 12,32

Estudo realizado por Capellari (2010) mostrou que quando utilizada uma

combinação de melaço (35,6 g/L) e amido (35,6 g/L) ocorreu uma produção de ácido

lático de 4,5 g/L em 84 h de fermentação utilizando o L. amylovorus. Quando o mesmo

autor utilizou melaço e milhocina a concentração de ácido lático obtida foi de 4,6 g/L

durante o mesmo período de fermentação. Os valores obtidos por Capellari (2010) estão

abaixo da concentração de ácido lático encontrada neste trabalho para L. rhamnosus.

Esse mesmo autor apesar de ter utilizado concentrações maiores de componentes para

suplementar o meio de cultivo, não influenciou para a maior produção de ácido lático.

5.7.3 Proposição de um modelo matemático para L. rhamnosus

Foi realizada a verificação da validade estatística do modelo para a produção de

biomassa obtida pelo L. rhamnosus. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela

14.

52

Tabela 14 - ANOVA para a produção de biomassa obtida por L. rhamnosus

Fonte de

Variação SQ GL MQ Fcalculado Ftabelado

Regressão 6,40 5 1,28 5,96 5,05

Resíduos 1,07 5 0,21

Total 7,48 10 0,74

Onde: SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; MQ: Quadrado médio; F:

Fischer.

Segundo a Tabela 14, pode-se observar que o Fcalculado encontrado para a produção

de biomassa para L. rhamnosus foi maior que o Ftabelado, então pode se dizer que o

modelo é significativo, porém não é preditivo, pois a superioridade do Fcalculado não foi 5

vezes maior que o Ftabelado (GACULA e SINGH, 1984).

O ajuste do modelo também foi expresso pelo coeficiente de correlação R2 que foi

de 0,85, indicando que 85% da variabilidade na resposta podem ser explicados pelo

modelo de regressão obtido para a produção de biomassa por L. rhamnosus (BLR)

mostrado pela Equação 2.

BLR = 0,36 - 0,87T + 1,72T2 + 0,47N + 0,88N

2 - 0,2TN [2]

Onde:

BLR: Produção de biomassa por L. rhamnosus;

T: Temperatura (ºC);

N: concentração de nitrogênio (g/L).

A Figura 6 apresenta a superfície de contorno, que permite a visualização das

condições de processo para a produção de biomassa por L. rhamnosus, expondo as

interações de concentração de nitrogênio e a temperatura.

Pela análise da Figura 6 é possível visualizar que a região que apresentou maior

produção de biomassa para L. rhamnosus variou entre as concentrações de 3,3 e 4,23

gramas de nitrogênio por litro de meio e na menor temperatura de processo (28 ºC). Em

concentrações menores de nitrogênio e maiores de temperatura ocorreu uma diminuição

da produção de biomassa. Oliveira (2011), quando trabalhou com açúcar redutor (91

g/L) em fermentação por batelada alimentada por pulso, encontrou em 48 h de produção

53

5,3 g de biomassa por litro utilizando L. rhamnosus. Este valor esta acima do

encontrado neste trabalho. Vale ressaltar que as condições de trabalho e as matérias

primas utilizadas por Oliveira (2011) foram diferentes das utilizadas neste estudo.

Figura 6 - Superfície de contorno para a produção de biomassa de L. rhamnosus

Parâmetros fixos: rotação: 200 rpm; pH 6,5; Tween-80: 5 g/L; concentração de carbono:

20 g/L; fosfato de potássio: 1,5 g/L.

Estudos anteriores mostraram que o crescimento celular de bactérias do Gênero

Lactobacillus podem ser inibidos pelo substrato (GONÇALVES et al., 1991; BURGOS-

RUBIO, OKOS e WANKAT, 2000). Dentro das faixas estudadas neste trabalho, foi

observado que, quando se aumentou a concentração de substrato (nitrogênio) houve

uma maior produção de biomassa, indicando que o nitrogênio do pescado ajudou na

produção dessa biomassa. A fonte de nitrogênio é um grande fator de influência sobre o

crescimento de Lactobacillus (WOOD e HOLZAPFEL, 1995). A síntese do ácido lático

por processo fermentativo está associada ao crescimento celular, então se pode dizer

que não há formação de produto se o meio não possuir uma concentração adequada de

nitrogênio e carbono para promover este crescimento (PRITCHARD e COOLBEAR,

1993). Por outro lado, elevadas concentrações de nitrogênio podem levar à morte celular

(DE LIMA et al., 2009).

54

Na Tabela 15 é apresentada a verificação da validade estatística do modelo para a

produção de ácido lático por L. rhamnosus.

Tabela 15 - ANOVA para a produção de ácido lático obtido por L. rhamnosus

Fonte de

Variação SQ GL MQ Fcalculado Ftabelado

Regressão 350,78 3 116,92 8,63 4,35

Resíduos 94,77 7 13,53

Total 445,55 10 44,55

Onde: SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; MQ: Quadrado médio; F:

Fischer.

O Fcalculado encontrado na produção de ácido lático para L. rhamnosus foi maior

que o Ftabelado, demonstrando que o modelo é significativo, mas não é preditivo. Com o

coeficiente de correlação de R2= 0,88 construiu-se o modelo expresso na Equação 3,

indicando que 88% da variabilidade na resposta podem ser explicados pelo modelo.

A Equação 3 apresenta o modelo de regressão obtido para a produção de ácido

lático pelo L. rhamnosus (ALLR).

ALLR = 12,81 - 6,41T + 13,79T2 + 5,00N

2 [3]

Onde:

ALLR: Produção de ácido lático de L. rhamnosus;

T: Temperatura (ºC);

N: Concentração de nitrogênio (g/L).

A Figura 7 apresenta a superfície de contorno, que permite a visualização das

condições de processo para a produção de ácido lático por L. rhamnosus, expondo as

interações de concentração de nitrogênio e temperatura.

55

Figura 7 - Superfície de contorno para a produção de ácido lático pelo L. rhamnosus

Parâmetros fixos: rotação: 200 rpm; pH 6,5; Tween-80: 5 g/L; concentração de carbono:

20 g/L; fosfato de potássio: 1,5 g/L.

Pela análise de superfície de contorno (Figura 7), pode se observar que as maiores

concentrações de ácido lático foram produzidas na menor temperatura utilizada neste

estudo (28 ºC). Em relação às concentrações de nitrogênio utilizadas neste trabalho foi

observado que tanto a maior quanto a menor concentração de nitrogênio foram

influentes na produção de ácido lático. Gao et al. (2006) observaram que maiores

concentrações de nitrogênio apresentaram um efeito positivo na produção de ácido

lático.

Capellari (2010) observou que a produção de ácido lático foi maior utilizando

concentrações de melaço de cana de açúcar na faixa de 35 a 40 g/L, e de milhocina a

partir de 18 g/L, enquanto que a utilização de baixas concentrações do melaço e

milhocina simultaneamente conduziram a uma baixa produção de ácido lático. Neste

trabalho, utilizando proteínas de pescado como fonte de nitrogênio, mesmo em

condições favoráveis de temperatura para este micro-organismo, os resultados

mostraram que foram produzidas concentrações de ácido lático muitas vezes inferior em

alguns experimentos quando comparado a alguns outros autores citados neste trabalho.

Isto pode ocorrer devido às exigências nutricionais do Gênero Lactobacillus (WOOD e

HOLZAPFEL, 1995). Oliveira (2009) obteve uma produção de ácido lático por L.

amylovorus em agitador a 37 °C em torno de 11 g/L, utilizando 20 g/L de melaço e 204

56

g/L de milhocina. Quando as concentrações dos substratos foram reduzidas pela metade

apresentaram valores próximos de 3 g/L, estes valores estiveram abaixo dos encontrados

neste trabalho.

5.7.4 Proposição de um modelo matemático para L. acidophilus

Na Tabela 16 é apresentada a verificação da validade estatística do modelo para a

produção de biomassa por L. acidophilus.

Tabela 16 - ANOVA para a produção de biomassa obtida pelo L. acidophilus

Fonte de

Variação SQ GL MQ Fcalculado Ftabelado

Regressão 0,49 4 0,12 4 4,53

Resíduos 0,19 6 0,03

Total 0,68 10 0,06

Onde: SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; MQ: Quadrado médio; F:

Fischer.

O Fcalculado encontrado na produção de biomassa para L. acidophilus foi menor que

o Ftabelado, demonstrando que o modelo não foi significativo. O R2 apresentado foi de

0,71. Com isso não foi possível gerar a equação para o modelo de regressão e também

não foi possível gerar a superfície de resposta para a produção de biomassa pelo L.

acidophilus.

Na Tabela 17 é apresentada a verificação da validade estatística do modelo para a

produção de ácido lático pelo L. acidophilus.

57

Tabela 17 – ANOVA para a produção de ácido lático obtido por L. acidophilus

Fonte de

Variação SQ GL MQ Fcalculado Ftabelado

Regressão 98,88 2 49,43 13,69 4,46

Resíduos 28,88 8 3,61

Total 127,76 10 12,77

Onde: SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; MQ: Quadrado médio; F:

Fischer.

O Fcalculado encontrado para a produção de ácido lático para L. acidophilus foi

maior que o Ftabelado, então pode se dizer que o modelo é significativo, porém não é

preditivo.

O ajuste do modelo também foi expresso pelo coeficiente de correlação R2 que foi

de 0,75, indicando que 75 % da variabilidade na resposta podem ser explicados pelo

modelo de regressão obtido para a produção de ácido lático para L. acidophilus

(ALLA).

A Equação 4 apresenta o modelo de regressão obtido para a produção de ácido

lático pelo L. acidophilus (ALLA).

ALLA = 12,02 - 5,35T2 - 7,62N

2 [4]

Onde:

ALLA: Produção de ácido lático de L. acidophilus;

T: Temperatura (ºC);

Concentração de nitrogênio (g/L).

A Figura 8 apresenta a superfície de contorno, que permite a visualização das

condições de processo para a produção de ácido lático por L. acidophilus, exibindo as

interações de concentração de nitrogênio e temperatura.

58

Figura 8 - Superfície de contorno para a produção de ácido lático pelo L. acidophilus

Parâmetros fixos: rotação: 150 rpm; pH 6,5; Tween-80: 6,25 g/L; concentração de

carbono: 35 g/L; fosfato de potássio: 2,5 g/L.

Pela Figura 8 podemos observar que as condições escolhidas neste trabalho como

ponto central foram as melhores para a produção de ácido lático pelo L. acidophilus. As

maiores concentrações foram observadas quando se utilizou uma temperatura de 35 ºC e

uma concentração de nitrogênio de 2,64 gramas de N/L. Oliveira, Buzato e Hauly

(2005), utilizando melaço de cana-de-açúcar a 10% (m/v) tratado com invertase e

suplementado com peptona 4% (m/v) e extrato de levedura 2% (m/v), atingiram um

valor de 10,2 g/L de ácido lático. O resultado encontrado por esses autores está acima

do encontrado neste trabalho quando utilizado proteínas de pescado como fonte de

nitrogênio para a produção de ácido lático, porém vale ressaltar que a quantidade de

carbono utilizado por Oliveira, Buzato e Hauly (2005) foi maior do que a utilizada neste

trabalho.

59

6. CONCLUSÃO

Os L. acidophilus, L. plantarum, W. viridescens, B. longum e L. rhamnosus

produziram maiores concentrações de biomassa, maior fator de conversão e uma

velocidade máxima específica de crescimento maior em caldo MRS após 48 h, sendo

que estes micro-organismos aumentaram a produção de biomassa quando foi adicionado

extrato de levedura como fonte de nitrogênio ao meio de cultivo.

Com o uso do planejamento Plackett-Burman foi possível fazer um screening das

variáveis que foram as mais influentes (temperatura e concentração de nitrogênio) para

o processo de produção de biomassa e de ácido lático para os micro-organismos

escolhidos.

Através do delineamento composto central rotacional (DCCR) os coeficientes de

regressão mostraram que a fonte de nitrogênio e a temperatura exerceram efeitos

significativos influenciando diretamente na produção de biomassa e ácido lático.

L. rhamnosus foi o micro-organismo que apresentou a maior produção de

biomassa e ácido lático nas condições propostas neste estudo, quando se utilizou extrato

de levedura e também músculo de corvina como fonte de nitrogênio. Quando se utilizou

músculo de corvina foi observado que os melhores parâmetros para a produção de ácido

lático por este micro-organismo foi temperatura de 28 ºC e concentração de nitrogênio

de 1,5 (g/L).

O rendimento de ácido lático utilizando músculo de corvina constitui uma

alternativa economicamente viável, se considerarmos o baixo custo deste pescado

quando comparado com o preço dos meios sintéticos utilizados corriqueiramente.

60

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Avaliar diferentes fontes de carbono e de nitrogênio, a partir de resíduos

agroindustriais, para a substituição de fontes tradicionais na produção de ácido

lático;

Utilizar uma fonte de nitrogênio alternativa juntamente com extrato de levedura

para poder aumentar a produção de ácido lático e acompanhar o controle de pH

do meio de cultura;

Realizar a extração do ácido lático produzido pelo micro-organismo L.

rhamnosus;

Produzir o biopolímero ácido poli lático (PLA) a partir do ácido lático extraído e

estudar as suas características e degradabilidade em tempo real.

61

8. REFERÊNCIAS

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acid production by microbial fermentation processes. Biotechnology Advances, v. 31,

p. 877–902, 2013.

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delbrueckii to lactic acid. Proceeding in Second International Seminar on

Environmental Chemistry and Toxicology, v. 73, p. 169-185, 2005.

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482–486, 1996.

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Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp. in yoghurt - a review. International

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79

APÊNDICE 1

Curva de crescimento do L. sakei para produção de biomassa

Curva de crescimento para o L. casei para produção de biomassa

80

Curva de crescimento do P. acidilactici para produção de biomassa

Curva de crescimento do C. maltaromaticum para produção de biomassa

81

Curva de crescimento do O. oeni para produção de biomassa

Curva de crescimento do W. viridescens para produção de biomassa

82

Curva de crescimento do L. plantarum para produção de biomassa

Curva de crescimento do B. longum para produção de biomassa

83

Curva de crescimento do L. rhamnosus para produção de biomassa