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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS Claudio Bruno Silva de Oliveira Determinação de Patogenicidade e Resistência à Sulfadiazina de Três Isolados de Toxoplasma gondii do Estado do Rio Grande do Norte e Atividade Anti- Toxoplasma do Timol e Estragol Natal/RN Fevereiro/2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM
MEDICAMENTOS
Claudio Bruno Silva de Oliveira
Determinação de Patogenicidade e Resistência à
Sulfadiazina de Três Isolados de Toxoplasma gondii do
Estado do Rio Grande do Norte e Atividade Anti-
Toxoplasma do Timol e Estragol
Natal/RN
Fevereiro/2016
CLAUDIO BRUNO SILVA DE OLIVEIRA
Determinação de Patogenicidade e Resistência à Sulfadiazina de
Três Isolados de Toxoplasma gondii do Estado do Rio Grande do
Norte e Atividade Anti-Toxoplasma do Timol e Estragol
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos.
Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Natal/RN
Fevereiro/2016
CLAUDIO BRUNO SILVA DE OLIVEIRA
Determinação de Patogenicidade e Resistência à Sulfadiazina de Três Isolados
de Toxoplasma gondii do Estado do Rio Grande do Norte e Atividade Anti-
Toxoplasma do Timol e Estragol
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos.
COMISSÃO JULGADORA:
Prof. Dra. Milena de Medeiros Clementino Andrade
Examinador externo - UFBA
Profa. Dra. Marilia Gabriela dos Santos Cavalcanti
Examinador externo - UFPB
Profa. Dra. Antônia Cláudia Jacome Câmara
Examinador interno - UFRN
Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes
Examinador interno - UFRN
Prof. Dr. Valter Ferreira Andrade Neto
Presidente da banca - UFRN
Natal/RN 25 de Fevereiro de 2016
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço ao senhor meu Deus por ter me dado forças para
superar todos os desafios que apareceram em minha vida, por ter me dado forças
para seguir e buscar meus sonhos e assim concluir este trabalho.
Agradeço também à minha família por me dar sempre exemplos de vida, pela
constante compreensão, pela confiança e apoio que sempre tiveram por mim e,
acima de tudo, pelo amor e carinho.
Ao meu orientador/amigo Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto por ter
confiado no meu trabalho e nas minhas proprostas, por ter sido sempre receptivo a
sanar dúvidas e repassar conhecimentos. Meu muito obrigado.
Aos meus companheiros de LaBMaT pela importante/fundamental
contribuição em todas as etapas desse trabalho. Agradeço em especial às pessoas
que lá, cada uma do seu jeito, foram importantíssimos para a realização deste
trabalho, em especial: Ywlliane, Valeska, Lis, Andrea, Marianne... Enfim, agradeço a
toda equipe LaBMat por tudo!!!
Agradecimento todo especial aos meus inesquecíveis amigos da
Biomedicina!!! Sem essa turma eu não seria a pessoa que sou hoje e sem as
conversas e pensamentos em conjunto eu não teria chegado ate aqui!!! Enorme
abraço meus amigos: Caio, Thales, Pedro, Lorena, Lis, Monique, Priscila, Hebert,
Jonas, entre outros da Biomedicina!!!
Aos meus conterrâneos que ajudaram nos meus primeiros passos da vida
científica e com os quais criei laços e enorme carinho. Muito obrigado a vocês, muito
obrigado minha cidade-mãe, Pau dos Ferros.
Agradeço à toda equipe da Parasitologia da Faculdade de Fármacia, aos
professores Plínio, Ana Cláudia e Antônia Cláudia, aos monitores e funcionários,
obrigado pelo carinho e pelos valiosos conhecimentos adquiridos.
Aos professores, alunos, funcionários e coordenação da Pós Graduação em
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos pelos ensinamentos e
pela contribuição em vários e importantes momentos;
Aos professores que participaram de minhas bancas de qualificação e defesa
de tese por todos os valorosos conhecimentos compartilhados;
Aos meus demais amigos, com os quais tenho certeza que posso sempre
contar;
Aos demais colegas, funcionários e professores pela receptividade em seus
laboratórios;
À CAPES e ao CNPq, pelo financiamento que permitiu a realização deste
trabalho.
Por fim, dedico todo meu carinho e amor para a minha hoje noiva e futura
esposa Joelma Andrade, ela que esteve presente em todos os momentos deste
trabalho, por melhores ou piores que fossem. Muito obrigado pela compreensão,
apoio, confiança e pelo amor que sempre manifestou acima de tudo! Sem você tudo
seria mais chato, mais difícil. Te amo!
RESUMO
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório amplamente distribuído,
ele é o etiológico da toxoplasmose, doença de curso normalmente benigno que pode
ter sérias repercursões em imunossuprimidos e fetos congenitamente infectados.
Esta doença é uma das principais responsáveis por hospitalização relacionada à
alimentos e, considerando o padrão atípico pelo qual esta se observa no Brasil, os
efeitos adversos no tratamento-padrão e os fenótipos emergentes de resistência o
presente estudo teve como objetivo padronizar a manutenção e determinar o perfil
de patogenicidade e resistência à sulfadiazina de isolados locais do T. gondii;
verificar o potencial imunogênico e alterações comportamentais; além de avaliar o
potencial antiparasitário do timol e estragol versus cepa clonal e isolados locais do
parasito. O efeito citopático induzido pelo parasito foi avaliado em cultura de células
RAW 264.7 e a patogenicidade foi determinada em modelo murino após infecção
com monitoramento por 30 dias e confirmada por PCR-RFLP, usando o marcador
CS3. A resistência fenotípica à sulfadiazina foi medida utilizando de uma curva de
doses em animais infectados (100, 200 ou 300 mg/kg) e a atividade anti-Toxoplasma
do timol e estragol contra isolados locais e cepa padrão foram determinadas em
camundongos Suiços infectados e tratados durante 6 dias. As alterações na
memória/aprendizado e impulsividade foram avaliados em labirinto em cruz elevado.
Polimorfismos foram determinados por sequenciamento do gene DHPS. Amostras
de sangue foram coletadas de camundongos C57BL/6 para o ELISA e dosagem de
citocinas em camundongos C57BL/6. O efeito citopático e a PCR-RFLP mostraram
que os isolados de galinhas representam diferentes populações do parasito. O
isolado Ck3 foi o mais patogênico in vivo, o isolado moderadamente patogênico Ck2
induziu uma resposta humoral e alterações comportamentais diferentes da cepa
ME49. Falhas terapêuticas foram observadas nos animais infectados com Ck3 e Pg1
e tratados com sulfadiazina, porém não foram observados polimorfismos no gene
DHPS. Foi possível estabelecer um modelo para determinação da atividade anti-
Toxoplasma de novos compostos e, através deste, foi obervado que timol e estragol
apresentaram efetividade contra a cepa ME49, mas apenas o estragol apresentou
ação contra o isolado Ck2, com forte resposta Th1. Timol, estragol e sulfadiazina
não tiveram ação contra Ck3 e Pg1. Estes perfis atípicos de patogenicidade e
resistência dos parasitos locais foram observados de forma inédita e podem explicar
os perfis diferenciados da toxoplasmose observados nessa região.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii. Patogenicidade. Resistência. Sulfadiazina.
Timol. Estragol.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan widely distributed, it is the
cause of toxoplasmosis, a usually benign disease that can have serious
repercussions in immunosuppressed and congenitally infected fetuses. This disease
is one of the main drivers of hospitalization related to food and, considering the
atypical pattern by which this can be seen in Brazil, the adverse effects on the
standard treatment and resistance emerging phenotypes present this study aimed to
standardize the maintenance and determine Profile of pathogenicity and resistance
to sulfadiazine of local isolates de T. gondii; check the immunogenic potential and
behavioral change; Besides evaluating the antiparasitic potential of thymol and
estragol versus clonal and local isolated of the parasite. The parasite-induced
cytopathic effect was evaluated in RAW 264.7 cell culture and pathogenicity was
determined in mice following infection with monitoring for 30 days and confirmed by
PRC-RFLP using CS3 marker. The phenotypic resistance to sulfadiazine was
measured using a curve doses in animals infected (100, 200 or 300 mg / kg) and
anti-Toxoplasma activity of thymol and estragole against local isolates and standard
strains were determined in infected Swiss mice and treated during 6 days. Changes
in memory/learning and impulsiveness were assessed in plus-maze discriminative
avoidance task. Polymorphisms were determined by sequencing of DHPS gene.
Blood samples were collected from C57BL/6 mice for the ELISA and measurement of
cytokines in C57BL/6 mice. The cytopathic effect and PCR-RFLP analysis showed
that the chicken populations represent different isolates of the parasite. Isolated CK3
was the most pathogenic in vivo, moderately pathogenic isolated CK2 induced a
humoral response and different behavior of ME49 strain changes. Treatment failures
were observed in animals infected with CK3 and Pg 1 and treated with sulfadiazine
but were not observed polymorphisms in the DHPS gene. It was possible to establish
a model for determination of anti-Toxoplasma activity of new compounds and,
through this, it was observable that thymol and estragole were effective against the
strain ME49, but only estragole was active against the isolated CK2 with a strong
Th1 response. Thymol, estragole, and sulfadiazine had no action against CK3 and
Pg 1. These atypical pathogenicity and resistance profiles of local parasites were first
observed in the literature and may explain the differential toxoplasmosis profiles
observed in this region.
Keywords: Toxoplasma gondii. Pathogenicity. Resistance. Sulfadiazine. Thymol.
Estragole.
LISTA DE FIGURAS E TABELA
FIGURA 1 - Ciclo vital do Toxoplasma gondii.......................................................................... 19
FIGURA 2 - Mapeamento genético dos 14 cromossomos do T. gondii.................................. 23
FIGURA 3 - Fluxograma apresentando o delineamento experimental desta pesquisa........... 35
FIGURA 4 - Labirinto em cruz elevado modificado utilizado para análise de
memória/aprendizagem e ansiedade...................................................................
41
FIGURA 5 - Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck2 do Toxoplasma
gondii....................................................................................................................
48
FIGURA 6 - Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck3 do Toxoplasma
gondii....................................................................................................................
49
FIGURA 7 - Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck3 do Toxoplasma
gondii. Caixa destacando célula com alta carga parasitária e lise celular ..........
50
FIGURA 8 - Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pela cepa ME49 do Toxoplasma
gondii...................................................................................................................
51
FIGURA 9 - Cultura de células RAW 264.7 infectadas pela cepa RH do Toxoplasma
gondii...................................................................................................................
52
FIGURA 10 - Porcentagem de sobrevivência de camundongos infectados com os isolados
Ck2, Ck3 e Pg1 do Toxoplasma gondii...............................................................
54
FIGURA 11 - Gel de eletroforese obtido por PCR-RFLP da região gênica CS3 do T. gondii
de isolados clonais, atípicos e parasitos isolados locais ....................................
55
FIGURA 12 - Porcentagem de sobrevivência de camundongos Suiços infectados com os
isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 do Toxoplasma gondii e tratados com sulfadiazina,
via oral, nas concentrações de 100; 200 e 300mg/Kg.........................................
56
FIGURA 13 - Eletroferograma parcial de uma região do gene DHPS, focando a asparagina
do códon 407. …..………………………………………………………………….….
57
FIGURA 14 - Análise comparativa do gene DHPS de sequências de Toxoplasma gondii de
diferentes regiões do mundo……………………………………………………..…..
58
FIGURA 15 - Níveis séricos de IgM (A) e IgG (B) em camundongos fêmeas C57BL/6
infectados com cinco cistos das linhagens Ck2 ou ME49………………..…….…
59
FIGURA 16 - Distância percorrida (treino e teste) por camundongos Suiços sadios ou
infectados com a cepa ME49 ou com o isolado Ck2 do Toxoplasma
gondii...................................................................................................................
60
FIGURA 17 - Permanência de camundongos Suiços sadios, ou infectados com a cepa
ME49 ou com o isolado Ck2 do Toxoplasma gondii, nos braços abertos de
Labirinto em cruz elevado modificado.................................................................
61
FIGURA 18 - Comparação entre tempo no braço não aversivo x tempo no braço aversivo de
camundongos Suiços, infectados ou não, no Labirinto em cruz elevado
modificado............................................................................................................
61
FIGURA 19 - Porcentagem de sobrevivência de camundongos suíços infectados com a
cepa ME49 ou com os isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 do Toxoplasma gondii e
tratados com Timol, Estragol, Sulfadiazina ou deixados sem
tratamento............................................................................................................
63
FIGURA 20 - Porcentagem de sobrevivência de camundongos suíços infectados com a
cepa ME49 ou com os isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 do Toxoplasma gondii e
tratados com Timol, Estragol, Sulfadiazina ou deixados sem tratamento (grupo
controle)...............................................................................................................
64
FIGURA 21 - Balanço sérico de citocinas induzidas por diferentes tratamentos em
camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa ME49 do T.
gondii...................................................................................................................
65
FIGURA 22 - Produção sérica de interferon-γ induzida por diferentes tratamentos em
camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa ME40 do T.
gondii……………………………………………………………………………….…...
66
FIGURA 23 - Produção de IgG em camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da
cepa ME49 do T. gondii e submetidos a tratamentos com Timol, Estragol,
Sulfadiazina ou não tratados..............................................................................
67
FIGURA 24 - Produção de IgM em camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da
cepa ME49 do T. gondii e submetidos a tratamentos com Timol, Estragol,
Sulfadiazina ou não tratados...............................................................................
68
TABELA 1 - Medicamentos usados para o tratamento da toxoplasmose, bem como seus
mecanismos de ação, dose, duração e efeitos adversos....................................
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpo
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
ANOVA Analysis Of Variance
APICO Marcador gênico APICO
BtuB Beta-tubulin
CA California
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
Ck2 Isolado TgCkBrRn2
Ck3 Isolado TgCkBrRn3
CTBR21 Isolado de toxoplasmose congênita CTBR21
CTBR24 Isolado de toxoplasmose congênita CTBR21
CS3 Locus gênico CS3
DHPS Dihidropteroato Sintetase
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA Deoxyribonucleic Acid
Dntp Deoxynucleotide
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Eo Estragol via Oral
Esc Estragol via Subcutânea
GRA5 Proteína de Granulo denso 5
GRA6 Proteína de Granulo denso 6
H2SO4 Ácido Sulfúrico
IFN-γ Interferon-Gama
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
IL-10 Interleucina-10
IL-12 Interleucina-12
I/NT Infectado/Não Tratado
KHz QuiloHertz
Kg Quilograma
LaBMaT Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose
L358 Locus gênico 358
Mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de Magnésio
Mm Milimolar
NI/NT Não Infectado/Não Tratado
Nm Nanomolar
ON Óxido Nítrico
PABA Ácido Para-Aminobenzóico
PBS Phosphate Buffered Saline
PBS-T Phosphate Buffered Saline + Tween20
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction + Restriction Fragment Length Polymorphism
Pg1 Isolado TgPgBrRN1
PK1 Pyruvate Kinase-1
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
ROP18 Proteína de Roptrias 18
Rpm Rotações Por Minuto
SAG1 Surface Antigen 1
SAG2 Surface Antigen 2
SAG3 Surface Antigen 3
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SFB Soro Fetal Bovino
Th1 Células T helper tipo I
Th2 Células T helper tipo II
TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine
To Timol via Oral
Tsc Timol via Subcutânea
TTT Tratamento
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
USA United States of America
μL Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................. 16
1.1 HISTÓRICO...................................................................................... 16
1.2 BIOLOGIA DO PARASITO............................................................... 17
1.3 DIVERSIDADE DO PARASITO…………………………………......... 19
1.3.1 Marcadores de patogenicidade..................................................... 20
1.4 TOXOPLASMOSE HUMANA……………………………………......... 24
1.5 TRATAMENTO PARA TOXOPLASMOSE………………………....... 26
1.5.1 Tratamentos Clássicos……………………………………………..... 27
1.5.2 Novos Tratamentos………………………………………………….... 29
1.5.3 Resistência à Sulfadiazina…………………………………………… 31
2 OBJETIVOS…………………………………………………………...... 33
2.1 OBJETIVO GERAL…………………………………………………...... 33
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………...... 33
3 MATERIAIS E MÉTODOS…………………………………………….. 35
3.1 PADRONIZAÇÃO DO CULTIVO DOS ISOLADOS LOCAIS DE TOXOPLASMA GONDII IN VITRO...................................................
35
3.2 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS DO PARASITO IN VIVO............ 36
3.3 DETERMINAÇÃO DO EFEITO CITOPÁTICO.................................. 36
3.4 PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DO DNA......................................... 37
3.5 PCR-RFLP DO LOCUS CS3………………………………………...... 38
3.6 PERFIL FENOTÍPICO DE PATOGENICIDADE IN VIVO................. 38
3.7 PERFIL FENOTÍPICO DE RESISTÊNCIA Á SULFADIAZINA......... 39
3.8 SEQUENCIAMENTO DO GENE DHPS........................................... 39
3.9 ANÁLISE COMPORTAMENTAL...................................................... 40
3.9.1 Esquiva discriminativa em labirinto cruz elevado...................... 40
3.10 DOSAGEM DE CITOCINAS............................................................. 41
3.11 PROTOCOLO DE ELISA INDIRETO PARA TOXOPLASMOSE MURINA............................................................................................
43
3.11.1 Preparo do Antígeno de T. gondii para ELISA............................. 43
3.11.1.1 Preparação dos Parasitos................................................................ 43
3.11.1.2 Preparo do Lisado............................................................................ 43
3.11.1.3 Quantificação Proteica..................................................................... 43
3.11.2 Ensaio Imunoenzimático................................................................ 44
3.12 ATIVIDADE ANTI-TOXOPLASMA DE TIMOL OU ESTRAGOL CONTRA A CEPA ME49 DO PARASITO........................................
44
3.13 ATIVIDADE ANTI-TOXOPLASMA DE TIMOL OU ESTRAGOL EM ISOLADOS LOCAIS DO PARASITO................................................
45
3.14 COMITÊ DE ÉTICA.......................................................................... 45
3.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA……………………………………………….. 45
4 RESULTADOS………………………………………………………….. 47
5 DISCUSSÃO…………………………………………………………….. 69
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS…………………………………………… 78
REFERÊNCIAS…………………………………………………………………….... 79
APÊNDICE A – Artigo 1………...………………………………………………..... 89
APÊNDICE B – Artigo 2………………………………………………………….... 89
APÊNDICE C – Artigo 3………………………………………………………….... 89
APENDICE D – Artigo 4……….…………………………………………………… 89
APENDICE E – Artigo 5………………………………………………………..…… 89
APENDICE F – Patente 1………………………………………………………..…. 89
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO
O Toxoplasma gondii foi inicialmente observado por Splendore em coelhos,
em junho de 1908. Já no mês seguinte, em nota preliminar à Sociedade Científica de
São Paulo, referiu que estes parasitos provocavam uma doença semelhante ao
calazar humano. Também em 1908, Nicolle e Manceaux comunicaram à Academia
de Ciências Francesa a descoberta de um parasito intracelular no baço e no fígado
do “gundi” (Ctenodactylus gondi), roedor do norte da África (NICOLLE; MANCEAUX,
1908).
Este parasito foi inicialmente denominado de Leishmania gondii devido à sua
semelhança com os protozoários desse gênero. Contudo, observações mais
cuidadosas, mostraram que se tratava de outro gênero e não de uma nova espécie
de Leishmania. Então, em fevereiro de 1909, Nicolle e Manceaux em nota à
Academia de Ciências da França o denominaram Toxoplasma, pela sua forma
arqueada, e gondii, como referência ao roedor de onde eles inicialmente observaram
o parasito (NICOLLE; MANCEAUX, 1909). Durante os primeiros anos após a
descoberta do parasito, alguns casos clínicos foram atribuídos ao T. gondii. Aldo
Castellani (1914), médico da London School of Hygiene & Tropical Medicine, foi
provavelmente o primeiro a relatar um caso suspeito de toxoplasmose humana ao
descrever um parasito similar no sangue e baço de um menino de 14 anos que
morreu por anemia grave, febre e esplenomegalia. Dois anos depois Fedorovitch
(1916), na Rússia, observou parasitos semelhantes no sangue de uma criança de 10
anos que também apresentava anemia, febre e esplenomegalia.
Contudo, devido aos casos anteriores serem inconclusivos, o primeiro caso
descrito de toxoplasmose em humanos foi relatado pelo oftalmologista Janku, na
cidade de Praga, em 1923, durante a necropsia de uma criança que foi a óbito em
decorrência de uma doença disseminada e grave, com hidrocefalia congênita,
microftalmia e coloboma na região da mácula. Na época foi encontrado um cisto
tissular compatível com o T. gondii no globo ocular da criança (JANKU, 1923).
No Brasil, em 1927 Margarino Torres no Rio de Janeiro descreveu a presença
deste protozoário em cortes histológicos de músculo cardíaco, esquelético e tecido
nervoso de uma criança com aproximadamente um mês de vida, iniciando as
17
especulações acerca da possibilidade de doença congênita (TORRES, 1927). Wolf e
Cowen (1937) foram os primeiros a descrever lesões anátomopatológicas
características em um caso de encefalite granulomatosa infantil causada pelo T.
gondii (WOLF; COWEN, 1937) e em 1939 Wolf, Cowen e Paige realizaram a
primeira transmissão experimental de toxoplasmose humana para animais de
laboratório e confirmaram que este protozoário poderia ser transmitido
congenitamente (WOLF et al., 1939 a, b).
A introdução do teste do corante, em 1948, por Sabin e Feldman – Reação de
Sabin & Feldman ou dye-test, permitiu maior facilidade diagnóstica além de
possibilitar investigações epidemiológicas (SABIN; FELDMAN, 1948). Na década de
70, o ciclo biológico do T. gondii foi completamente elucidado, tendo a confirmação
dos felídeos como hospedeiros que albergam os ciclos sexuado e assexuado do T.
gondii. O parasito foi então classificado entre os coccídeos, confirmou-se que os
felídeos eram os únicos hospedeiros definitivos e que os animais homeotérmicos,
incluindo mamíferos e aves, eram seus hospedeiros intermediários ou acidentais
(revisado por TENTER; HECKEROTH; WEISS, 2000).
1.2 BIOLOGIA DO PARASITO
O T. gondii é um parasito intracelular obrigatório de baixa especificidade e
grande sucesso evolutivo, capaz de interagir com o hospedeiro utilizando
mecanismos imunomodulatórios que o tornam capaz de evadir ou de resistir aos
mecanismos da resposta imune (CARRUTHERS; SUZUKI, 2007). Esta espécie é
única no gênero Toxoplasma e tem, potencialmente, capacidade de infectar
qualquer vertebrado homeotérmico, tornando este um dos parasitos mais bem
sucedidos na natureza. Sendo à sua alta adaptabilidade e seus diversos
mecanismos de transmissão umas das razões para sua ampla distribuição e
prevalência (DUBEY; SU, 2009).
O ciclo vital desse parasito é bastante complexo (Figura 1) e inclui também
fases extracelulares (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; SACKS; SHER, 2002). A
infecção pelo T. gondii pode ocorrer por qualquer uma das três formas infectantes do
parasito: os taquizoítos; bradizoítos e esporozoítos (presentes nos oocistos)
(DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998).
18
Os taquizoítos são pequenos (2-6 µm) e apresentam uma rápida replicação,
caracterizando a fase aguda da parasitose, com capacidade de invadir ativamente
as células nucleadas e nelas se multiplicar em vacúolos denominados vacúolos
parasitóforos ou pseudocistos (DUBEY, 1998). Constituem a forma de menor
resistência do parasito, sendo facilmente destruídos por condições adversas, tais
como: desidratação e variáveis osmóticas; também são menos resistentes à tripsina
e pepsina (JACOBS et al., 1996).
Os bradizoítos, presentes emcistos tissulares, representam a forma
encontrada na fase crônica da infecçãodoença. Apesar destes cistos serem
inativados por temperaturas superiores a 67ºC por um tempo de 15 minutos ou pelo
congelamento overnight em temperatura de -12ºC (TENTER et al., 2009) o consumo
de carne crua ou mal cozida ainda segue como um fator importante na transmissão
da doença (CARELLOS et al. 2014). Os bradizoitos medem de 7 a 9 µm e, nos
cistos, se dividem lentamente por endodiogenia, podendo assim resistir às várias
condições adversas (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Os cistos apresentam
grande variação de tamanho, de acordo com o tempo de infecção, medindo cerca de
5 µm e contendo apenas 2 bradizoítos, até 70 -100 µm com milhares de bradizoítos
em seu interior (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Os cistos podem se desenvolver
em qualquer tecido, contudo eles se encontram principalmente nos tecido nervoso e
muscular, onde podem passar muitos anos em um status de equilíbrio imunológico
(CRISTINA et al., 2008). Atuando no controle destes cistos se encontram células-T e
células Natural Killers derivadas e produtoras do Interferon-γ, reforçando o papel da
resposta inflamatória no controle da infecção crônica (BLANCHARD; DUNAY;
SCHLÜTER, 2015).
Finalmente, os esporozoitos são as formas presentes nos oocistos, os quais
são produzidos no intestino de felinos (entre eles o gato) e eliminados em suas
fezes. Dentro desta estrutura os esporozoítos podem resistir à digestão gástrica e
assim chegar ao intestino delgado, onde ocorre a penetração ativa do T. gondii no
epitélio intestinal (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Cada oocisto apresenta em
seu interior dois esporocistos, cada qual contendo quatro esporozoítos, que passam
a ser infectantes no ambiente, após período de esporulação. No solo, após 1 - 21
dias os oocistos se tornam infectantes, mantendo-se viáveis por até 18 meses.
Neste intervalo, o consumo de um único oocisto pode gerar a produção de milhões
de esporozoitos em felinos susceptíveis (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; LELU et
19
al., 2012). Quando estes são de uma cepa virulenta, tipo I, a morte pode ocorrer em
apenas 21 dias em modelo murino (DUBEY et al., 2011).
Figura 1: Ciclo vital do Toxoplasma gondii (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998)
1.3 DIVERSIDADE DO PARASITO
Devido às características de seu ciclo de vida, o T. gondii pode apresentar
crescimento assexuado, independente do hospedeiro definitivo, desse modo se
desenvolve em linhagens clonais (HOWE; SIBLEY, 1995; MINOT et al., 2012). Estas
linhagens proporcionam diferentes manifestações clínicas em modelo murino,
apesar de apresentarem pouco mais de 1% de variabilidade genética entre si
(GRIGG et al., 2001a).
Classicamente o T. gondii é organizado dentro de três linhagens clonais com
diferentes níveis de patogenicidade em modelo murino: tipo I: patogênico; II:
parcialmente patogênico e III: não patogênico (HOWE; SIBLEY, 1995). Entretanto,
recentemente um novo grupo, chamado haplogrupo 12, foi descrito América do
Norte, representando a quarta linhagem clonal (KHAN; DUBEY; SU, 2011). A
propagação clonal do parasito é favorecida pela sua habilidade de ser transmitido
entre os hospedeiros intermediários, não passando necessariamente entre os
definitivos, através da ingestão de cistos tissulares (SU et al., 2003). No Brasil e
20
outros países da América do Sul, diferentemente, tem sido observado que não
ocorre uma distribuição clonal, mas sim atípica e multivariada (CARNEIRO et al.,
2013).
Possíveis explicações para o crescimento clonal se baseiam: primeiro, na não
obrigatoriedade da fase sexuada, uma vez que o ciclo pode ocorrer por carnivorismo
entre hospedeiros intermediários; segundo, no fato de um único parasito haploide
poder se diferenciar no hospedeiro definitivo e assim completar o ciclo, soma-se a
este a dificuldade de uma infecção mista ocorrer naturalmente em felinos (SIBLEY et
al., 2009).
Já os fenótipos atípicos possivelmente ocorrem devido a um maior número de
passagens pelo hospedeiro definitivo, onde ocorre recombinação gênica com
geração de variabilidade (KHAN; DUBEY; SU, 2011). Estima-se que a divergência
entre as cepas da América do Norte e do Sul ocorreu a aproximadamente um milhão
de anos atrás. Uma teoria para este fato seria a migração de felinos do norte para o
sul, ocorrida após o estabelecimento de um caminho de terra na região do canal do
Panamá que data desta época (JOHNSON et al., 2006; KHAN et al., 2007).
Após essa migração as populações do parasito na América do Sul se
desenvolveram de forma atípica em relação às populações europeias (CARNEIRO
et al., 2013). Pode-se explicar este fato pela maior diversidade de hospedeiros em
países da região amazônica, uma vez que é sabido que parasitos isolados de
animais selvagens apresentam mais genótipos atípicos (DUBEY et al., 2008) e
também são mais associados a aumento de mortalidade (SUNDAR et al., 2008).
Desse modo, uma atenção especial vem sendo dada às cepas atípicas com objetivo
de compreender melhor suas localizações e a mapear as que apresentam sintomas
graves em pacientes imunocompetentes, nos quais tem se observado quadros
desde lesão atípica ocular até a morte (DEMAR et al., 2007; KHAN et al., 2007;
MENDES et al., 2014).
1.3.1 Marcadores de patogenicidade
Os estudos a cerca da patogenicidade de T. gondii em modelo murino são
bem estabelecidos para as linhagens clonais, sendo a linhagem I altamente
patogênica em camundongos enquanto as linhagens II e III apresentam
patogenicidade significativamente menor (SIBLEY; BOOTHROYD, 1992;
21
BOOTHROYD; GRIGG, 2002). Contudo não há uma correlação direta do observado
nestes modelos com a doença em humanos, mas observa-se que as linhagens tipo
II são frequentemente encontradas causando toxoplasmose em humanos; as
linhagens tipo I são encontradas em casos graves de retinocoroidite (GRIGG et al.
2001b) e as linhagens atípicas se encontram particularmente em casos graves de
doença disseminada em pacientes imunocompetentes (BOSSI; BRICAIRE, 2004).
Assim, torna-se necessário, além do diagnóstico da doença a caracterização de
patogenicidade dos parasitos responsáveis, principalmente em regiões onde se
encontram casos graves em pacientes imunocompetentes.
Dubey e colaboradores (2002) propõem uma metodologia onde a avaliação
da patogenicidade de isolados de T. gondii in vivo seria feita durante o isolamento
primário em camundongos. A mortalidade e o tempo decorrido até a morte dos
camundongos devem ser observados por um período de 30 dias. Os isolados
patogênicos apresentam 100% de mortalidade entre os camundongos infectados; os
isolados não patogênicos apresentam 100% de sobrevivência entre os
camundongos infectados, enquanto os de patogenicidade intermediária apresentam
taxas de sobrevivência entre 0 e 100%.
Várias técnicas moleculares têm sido utilizadas para estudar a variabilidade
genética dos isolados de T. gondii, tais como: amplificação aleatória de DNA
polimórfico (RAPD); polimorfismo do comprimento de fragmentos gerados por
enzimas de restrição (PCR-RFLP) além de marcadores microssatélites (sequências
simples repetidas- SSR) (HOWE; SIBLEY, 1995; FERREIRA et al., 2004; YAI et al.,
2009; ZHOU et al., 2009; SILVA et al., 2011). Dentre essas, devido à sua maior
simplicidade, a metodologia mais utilizada é a PCR-RFLP (SU et al., 2010).
A PCR-RFLP rotineiramente tem utilizado um conjunto de 11 marcadores:
SAG1; SAG2 (3'SAG2 e 5'SAG2); SAG3; BtuB; GRA6; c22-8; c29-2; L358; PK1;
novo SAG2; e APICO (SU et al., 2010). Este modelo se mostra eficiente para
caracterização de genótipos do parasito em países onde ocorrem principalmente as
linhagens clonais. Contudo, estudos recentes sugerem que esta ferramenta seja
incapaz de determinar com precisão a patogenicidade em linhagens atípicas
(CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013; SILVA et al., 2014), as quais são mais
comuns em países da América do Sul (PENA et al., 2008).
22
Estudos com mapeamento genético tem sugerido que o marcador CS3, locus
gênico presente no cromossomo VIIa do T. gondii (Figura 2), está fortemente
associado com patogenicidade em camundongos (KHAN et al., 2005; PENA et al.,
2008). O mapeamento do gene ROP18, o qual codifica uma serina-treonina quinase
altamente polimórfica segregada na célula-alvo durante o momento da invasão
celular (TAYLOR et al., 2006), revelou uma grande proximidade deste com a região
CS3. Provavelmente CS3 apresenta-se associado à ROP18 e esta associação pode
explicar diversos fenótipos do parasito encontrados no Brasil (PENA et al., 2008).
Este novo fato tem estimulado vários autores, os quais estão utilizando a
amplificação desse marcador para determinação de patogenicidade em isolados
atípicos, onde as metodologias atuais não têm apresentado a mesma eficicência
(PENA et al., 2008; YAI et al., 2009; DUBEY et al., 2010; RAGOZO et al., 2010;
SILVA et al., 2011; SILVA et al., 2014).
23
Figura 2: Mapeamento genético dos 14 cromossomos do T. gondii. Marcadores de
polimorfismos exclusivos para o tipo I são mostrados em vermelho, aqueles únicos para o
Tipo II são mostrados em verde e aqueles exclusivos para o tipo III são mostrados a azul
(KHAN et al., 2005).
24
1.4 TOXOPLASMOSE HUMANA
A toxoplasmose em humanos é comumente assintomática resultando em uma
infecção latente com produção de cistos teciduais. As manifestações mais graves da
doença ocorrem em pacientes imunossuprimidos ou em fetos congenitamente
infectados, onde podem ocorrer desordens oculares e neurológicas (WEISS;
DUBEY, 2009).
Pacientes com imunodeficiência, que recebem tratamento com corticoides ou
drogas citotóxicas, além de pacientes com doenças malignas hematológicas,
transplantados ou com Síndrome da Imunodeficiência Adiquirida (SIDA/AIDS)
apresentam grande chance de desenvolver problemas neurológicos (WEISS;
DUBEY, 2009). Em pacientes imunocomprometidos também podem ocorrer
desordens psiquiátricas como: depressão, ansiedade e esquizofrenia (EL LAKKIS et
al., 2015). Nestes casos, a doença decorre da reativação de cistos de uma infecção
prévia já cronificada. Nos imunocompetentes, quando presentes, os principais
sintomas são: coriorretinite, linfadenopatia e miocardite. Destaque para a
linfadenopatia nos linfonodos cervicais (MCCABE et al., 1987; WEISS; DUBEY,
2009).
No ano de 1942, Albert B. Sabin, médico pediatra, descreveu uma síndrome
(tétrade de Sabin) caracterizada por sinais clínicos clássicos presentes na
toxoplasmose congênita, que são: microcefalia ou anencefalia, calcificações
cerebrais, convulsões e coriorretinite que, geralmente, compromete a mácula dos
dois olhos (SABIN, 1942). Atualmente, sabe-se que a toxoplasmose pode manifestar
doença neonatal; nos primeiros meses de vida; além de sequelas de infecções
prévias não diagnosticadas durante a infância até a adolescência (REMINGTON et
al., 2001).
A prevalência da toxoplasmose apresenta grandes variações, onde se estima
uma frequência de aproximadamente 13% a 60% da população mundial (JONES et
al., 2001). Nos Estados Unidos ela aparece em declínio de 14,1% entre 1988 - 1994
em pessoas de 12 - 49 de idade, enquanto em outro estudo, em indivíduos da
mesma faixa etária, a soroprevalência foi de 9,0% no período de 1999 – 2004
(NUTTER et al., 2004).
A toxoplasmose adquirida durante a gestação apresenta especial relevância
pelos danos causados ao desenvolvimento fetal. Em geral, o risco de adquirir
25
toxoplasmose durante o período gestacional correlaciona-se a três fatores: a
prevalência na comunidade, o número de contatos com uma fonte de infecção e o
número de mulheres suscetíveis (não imunizadas por infecção prévia) na
comunidade (SANTANA et al., 2003). A incidência de toxoplasmose congênita
mostra grande variação: na Suécia 0,07/1.000 nascimentos (EVENGARD et al.,
2001); 0,12/1.000 na Suiça (SIGNORELL et al., 2006); 0,3/1.000 somente em
Barcelona (MUNOZ BATET et al., 2004) e 1,9-3,2/1.000 em Paris (REMINGTON et
al., 2005).
Um boletim emitido pela Organização Mundial de Saúde (TORGERSON;
MASTROIACOVO, 2013) apresenta diversas informações acerca de dados atuais e
estimativas da toxoplasmose congênita a nível mundial. Nele é possível observar
que está doença apresenta uma incidência anual de 190.100 casos, representando
aproximadamente 1,5 casos para cada 1.000 nascidos vivos. Esta doença apresenta
diversidade de manifestações clínicas de acordo com o local ou período analisados.
Na França, uma análise de casos de toxoplasmose congênita do período entre 1987
e 2008 apresentou que a introdução de um protocolo mensal de acompanhamento
pré-natal reduziu a taxa de infecção materno-fetal (WALLON et al., 2013). Esse
mesmo estudo apresentou que a introdução da técnica de PCR usando o líquido
amniótico e consequente diagnóstico precoce, com início imediato do tratamento,
durante o pré-natal reduziu a apresentação de sintomas da doença nos primeiros
três anos de vida. Nesta pesquisa, as probabilidades de infecção materno-fetal
foram <10% para infecções maternas antes de 12 semanas de gestação, subiram
bruscamente para 20% em 19 semanas, e depois continuou aumentando para 52,
3%; 62,8% e quase 70% em 28, 35 e 39 semanas de idade gestacional,
respectivamente (WALLON et al., 2013).
As sequelas da toxoplasmose congênita se apresentam muito relacionadas à
cepa do parasito. As linhagens do tipo II, mais comuns na Europa e América do
Norte, costumam apresentar uma doença mais branda (AJZENBERG et al., 2002).
Sabe-se, contudo, que existe um importante polimorfismo genético das cepas do
parasito na América do Sul (CARNEIRO et al., 2013; SILVA et al., 2014),
repercutindo em uma doença atípica nessa região. Isso pode explicar porque no
Brasil são registrados casos de coriorretinite em 2/3 das crianças expostas enquanto
26
que na Europa ocorre em aproximadamente 1/6 das crianças (GILBERT et al.,
2008).
A doença ocular no Brasil tem se mostrado mais grave. Foi constatado que
até 80% dos casos de toxoplasmose congênita evoluíram para coriorretinite, e um
dado ainda mais preocupante é que em 63% dos casos ocorreu a bilateralidade da
lesão (VASCONSELOS-SANTOS et al., 2009). Dado similar ao observado no Estado
do Rio Grande do Norte, onde um estudo realizado em um centro de referência
oftalmológico relatou uma alta frequência de lesões bilaterais nos pacientes com
toxoplasmose ocular (MENDES et al., 2014). Desse modo, o conhecimento dos
parasitos que circulam na população humana pode ser de grande importância para o
entendimento dos diferentes sintomas e sinais clínicos que são observados nos
casos de toxoplasmose congênita.
1.5 TRATAMENTO PARA TOXOPLASMOSE
Embora a biologia e aspectos fisiológicos do T. gondii sejam amplamente
investigados, o tratamento para a toxoplasmose apresenta ainda limitações devido
aos seus efeitos secundários importantes (Tabela 1) e à baixa tolerância dos
pacientes aos fármacos disponíveis (SONDA; HEHL, 2006). Apesar desta baixa
tolerância, em alguns casos, como na doença ocular ou congênita o tratamento deve
ser agilmente utilizado visando diminuir mais rapidamente a multiplicação dos
parasitos e, desse modo reduzir os riscos de lesão grave (KAYE, 2011).
27
Tabela 1- Medicamentos usados para o tratamento da toxoplasmose, bem como seus mecanismos
de ação, dose, duração e efeitos adversos.
Medicamento Mecanismo de
Ação
Dose
Recomendada
Duração do
Tratamento
Efeitos Adversos
Sulfadiazina Inibe síntese do
ácido fólico
100mg/Kg/dia a
cada 12 horas
1 ano Supressão de medula
óssea, febre,
vasculite, rash,
nausea, vômito e
nefropatia
Pirimetamina Inibe síntese de
ácido
tetrahidrofólico
1mg/Kg/dia –
1mg/Kg/dia 3x
semana
Primeiro 6
meses-
Segundo seis
meses
Supressão de medula
óssea, febre, rash,
vômitos, diarréia e
hematúria
Ácido folínico Forma reduzida do
ácido fólico
5-10mg a cada 3
dias- 10mg 3x
semana
Primeiro 6
meses-
Segundo seis
meses
Rash, eritema,
urticária, trombocitose,
hipersensibilidade
Sulfametoxazol/
Trimetropim
Inibe síntese do
ácido dihidrofólico
Consultar médico Consultar
médico
Supressão de medula
óssea, hipotensão,
rash e febre
Clindamicina Inibe síntese
proteica
Não há dose
padronizada
Consultar
médico
Colite
pseudomembranosa,
hipotensão, arritimia,
rash e Supressão de
medula óssea
Azitromicina Inibe síntese
proteica
Consultar médico Consultar
médico
Hipersensibilidade,
ototoxicidade, nausea,
diarréia, rash e
palpitação
Fonte: KAYE, 2011
1.5.1 Tratamentos Clássicos
Como citado anteriormente, o tratamento para a toxoplasmose baseia-se
primordialmente em uma associação entre dois inibidores da síntese do ácido fólico,
a sulfadiazina e a pirimetamina (KAYE, 2011). Este tratamento é efetivo contra os
28
taquizoitos, mas não tem ação contra as formas císticas, encontradas na fase
crônica da doença (ARAÚJO et al., 1991; KAYE, 2011).
O primeiro relato de ação das sulfonamidas contra o parasito foi feito no ano
de 1942 (SABIN; WARREN, 1942). Eyles e Coleman (1953) foram pioneiros em
relatar que a associação de sulfonamidas com a pirimetamina teriam uma ação
sinérgica e efetiva no tratamento da toxoplasmose.
Garin e Eyles (1958) demonstraram que a espiramicina tinha atividade
antitoxoplásmica in vivo em modelo murino. A partir de observações realizadas
durante 14 anos, na França, foi possível concluir que esta apresentava baixa
toxicidade em humanos e reduzia danos fetais. Pelo fato deste medicamento ser
incapaz de atravessar a membrana placentária vem sendo utilizado desde então
como medicamento profilático (DESMONTS; COUVREUR, 1974).
Eyles e Coleman (1953) mostraram que a associação de sulfonamidas e
pirimetamina também apresentavam eficácia no controle da doença ocular, mas
apenas em casos de reativação uma vez que estas drogas não apresentam ação
contra cistos. Esta associação vem sendo utilizada até hoje, com acréscimo de
prednisona e ácido folínico (ENGSTROM et al., 1991).
Para o tratamento da forma congênita da toxoplasmose o "U.S. Nacional
Collaborative Treatment Trial”, em Chicago, (MCAULEY et al., 1994; REMINGTON
et al., 2001) preconiza para os casos de infecção por T. gondii na gestação, que a
gestante deve ser tratada com a espiramicina até o final da gravidez, com o objetivo
de diminuir a transmissão vertical e desta forma prevenir o aparecimento da
toxoplasmose congênita. No caso de transmissão fetal confirmada recomenda-se
que a partir da 21ª semana de gestação, seja feita a substituição da espiramicina
(esquema medicamentoso 1) pela a associação da sulfadiazina, pirimetamina e o
ácido folínico (esquema medicamentoso 2), visando o tratamento da infecção
congênita no feto. Após 30 dias do esquema 2 alterna-se mensalmente o esquema 1
com o esquema 2 e assim sucessivamente até ao final da gestação. Após o
nascimento, recomenda-se a continuidade do tratamento no neonato com
toxoplasmose congênita subclínica ou aparente, com o uso do esquema 2 que
deverá se estender por todo o primeiro ano de vida. Os efeitos adversos podem
ocorrer devido aos tratamentos convencionas para toxoplasmose com a sulfadiazina
29
e pirimetamina. A combinação destes medicamentos pode trazer diversos efeitos
adversos incluindo o potencial efeito teratogênico da pirimetamina no primeiro
trimestre de gestação (DEGERLI et al., 2003). Outro efeito adverso deste tratamento
seria a supressão da medula óssea, embora este efeito possa ser prevenido pelo
uso simultâneo do ácido folínico (DEGERLI et al., 2003; SCHMIDT et al., 2006;
ELSHEIKHA, 2008).
Apesar de alguns estudos questionarem a eficácia dos tratamentos no
combate à toxoplasmose congênita (GILBERT et al., 2001; THIEBAUT et al. 2006;
CHÊNE; THIÉBAUT, 2009) Rodrigues e colaboradores (2014) relatam em seu
trabalho que este tratamento pode diminuir a carga parasitária, reduzindo a
exposição fetal ao parasito e consequentemente diminuindo as manifestações
clínicas da doença.
1.5.2 Novos Tratamentos
Devido aos significativos efeitos adversos do tratamento clássico para
toxoplasmose, com destaque para supressão de medula óssea, teratogênese, rash
cutâneo, eritema, febre, etc (KAYE, 2011), surge a necessidade de novas terapias
que possam também ser eficientes e menos agressivas ao paciente.
Valentini e colaboradores (2015) avaliaram uma alternativa para o tratamento
da toxoplasmose congênita e encontraram que a associação entre cotrimoxazol e
espiramicina apresenta uma melhor capacidade de reduzir a transmissão materno-
fetal, em humanos, comparada à espiramicina e à associação entre sulfadiazina e
pirimetamina.
Patil e colaboradores (2011) observaram que o tratamento com cotrimoxazol
foi capaz de reduzir quadros de convulsões e epilepsia em um paciente com quadro
clínico de neurotoxoplasmose associada à AIDS. Goswami e colaboradores (2014)
também em pacientes com AIDS associada à toxoplasmose observaram que a
associação de cotrimoxazol/clindamicina apresentava superior eficácia e melhor
tolerabilidade em relação ao tratamento padrão. Neste estudo, a mais comum
30
complicação do tratamento clássico foi a trombocitopenia, algo não observado no
tratamento proposto.
Os tratamentos utilizados para outras doenças, como os antifúngicos, também
aparecem como opções em modelos murinos, que eventualmente poderiam ser
utilizadas (MARTINS-DUARTE et al., 2010). Também em modelo murino diversas
moléculas como: derivados de vanilina, derivados de artemisinina e naftoquinonas
aparecem como possibilidades (FERREIRA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2009;
OLIVEIRA et al., 2014).
Baseado na presença de uma organela de estrutura vegetal, denominada
apicoplasto (MAZUMDAR et al., 2006; VAN DOOREN et al., 2008) alguns autores
sugerem que esta pode ser um novo alvo terapêutico em organismos Apicomplexa
(RALPH; D'OMBRAIN; MCFADDEN, 2001) e, com base em experimentos in vitro,
afirmam que alguns compostos com ação herbicida também poderiam ter ação anti-
Toxoplasma (ZUTHER et al., 1999; DUKE, 2010).
Compostos com origem a partir de plantas com ação medicinal também
representam uma alternativa promissora. A busca racional dessas moléculas
bioativas, utilizando de conhecimentos da medicina popular, associada à grande
diversidade em nosso país constitui, portanto, uma excelente estratégia para o
desenvolvimento de novos medicamentos (HARVEY, 2000). Neste caso merecem
destaque o timol e o estragol; pois ambos apresentaram atividade contra parasitos
intracelulares em cultura e em modelos animais (COSTA et al., 2008; MEDEIROS et
al., 2011), incluindo ação contra Plasmodium berghei em modelo murino e P.
falciparum in vitro (MOTA et al., 2012). Logo, também aparecem como alternativas
promissoras para substituir ou complementar os atuais esquemas terapêuticos para
toxoplasmose.
Desse modo, a ausência de dados concretos relacionados aos novos
tratamentos para toxoplasmose, bem como fármacos que tenham ação contra os
cistos tissulares, associados a baixo custo e efeitos adversos reduzidos, abre
perspectivas para novas linhas de pesquisa em desenvolvimento e inovação no
sentido de controlar e/ou minimizar a morbidade nessa parasitose ainda
negligenciada.
31
1.5.3 Resistência à Sulfadiazina
A resistência do T. gondii à sulfadiazina (2-sulfamilamidopirimidina) ainda se
apresenta como um evento relativamente raro na literatura, motivo pelo qual esta
droga, em associação com a pirimetamina, segue como tratamento padrão para
toxoplasmose (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; KAYE, 2011). Este tratamento é
geralmente necessário em casos de doença ocular, congênita e disseminada em
pacientes imunocompetentes e imunossuprimidos (PETERSEN, 2007).
A sulfadiazina apresenta uma conformação análoga estrutural, desse modo
se comportando como um antagonista competitivo, do ácido para-aminobenzóico
(PABA). O PABA, por sua vez, é utilizado no processo metabólico de síntese do
ácido fólico. Assim, a sulfadiazina compete com o PABA pelo sítio ativo da enzima
dihidropteroato sintetase (DHPS), envolvida na produção de ácido fólico. Logo, esse
medicamento inibe a replicação dos parasitos por inibir a produção de ácidos
nucleicos nos mesmos (MENECEUR et al., 2008). Contudo, o mesmo não leva à
cura, mas à cronificação da infecção.
Em estudos realizados com o Plasmodium falciparum, verifica-se que a
resistência à sulfadiazina apresenta mutações em regiões bem específicas. Essa
resistência costuma ser associada à mutações no gene DHPS, mais precisamente
com envolvimento no códon 437, onde há substituição de uma asparagina por uma
molécula de aspartato (ASPINALL et al., 2002; MENECEUR et al., 2008;
BOUGHATTAS et al., 2011; ASPINALL et al., 2012; DOLIWA et al., 2013a), com
consequente redução na ação do medicamento. Por outro lado, em T. gondii
alterações genéticas não costumam estar associadas há alteração na
susceptibilidade à sulfadiazina. Meneceur e colaboradores (2008) avaliaram diversas
cepas isoladas de animais e humanos na França, sendo estes envolvidos em
doenças congênitas, cerebral, etc. Mesmo com a observação de fenótipos com
aparente resistência in vitro, as analises genéticas não encontraram associação
destas com mutações, pois os isolados que apresentavam mutações não as
manifestaram fenotipicamente.
Famílias de transportadores ABC também não parecem estar associadas a
mecanismos de resistência, dando a entender que os casos já relatados de
32
resistência à sulfadiazina (ASPINALL et al., 2002; ALVES; VITOR, 2005;
MENECEUR et al., 2008) são provavelmente devido a mecanismos indiretos e
potencialmente associados a outras vias metabólicas (DOLIWA et al., 2013a;
DOLIWA et al., 2013b). Estas observações mostram que há necessidade de estudos
para entender os mecanismos de resistência à sulfadiazina em T. gondii.
33
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Determinar o padrão de patogenicidade e resistência à sulfadiazina de Três
Isolados de Toxoplasma gondii do Estado do Rio Grande do Norte. Além de analisar
o potencial anti-Toxoplasma dos compostos timol e estragol contra cepas clonais e
isolados de campo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Padronizar a manutenção de isolados TgCkBrRN2, TgCkBrRN3 e
TgPgBrRN1 do Toxoplasma gondii in vivo e in vitro;
• Determinar o padrão de patogenicidade dos isolados obtidos de galinhas in
vitro;
• Determinar fenotipicamente o perfil de patogenicidade dos isolados por
diferentes vias de infecção in vivo;
• Determinar o padrão molecular de patogenicidade utilizando o marcador CS3;
• Estabelecer fenotipicamente o perfil de resistência à sulfadiazina dos isolados
em modelo murino;
• Sequenciar uma região do gene DHPS associado à resistência à sulfadiazina
nos isolados locais;
• Quantificar a produção de anticorpos induzida pelos parasitos locais em
modelo murino;
• Verificar alterações motoras e na memória/aprendizado em camundongos
infectados com os isolados locais;
• Padronizar um modelo para determinação de atividade anti-Toxoplasma de
novas moléculas;
• Determinar alterações nos níveis de citocinas e imunoglobulinas em animais
infectados e tratados com timol ou estragol;
34
• Verificar a atividade anti-Toxoplasma do timol e estragol contra uma cepa
padrão e três isolados locais do T. gondii in vivo.
35
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Com o intuito de se cumprirem os objetivos propostos, foram empregadas as
seguintes metodologias (Figura 3), resumidas no desenho experimental abaixo:
Figura 3: Fluxograma apresentando o delineamento experimental desta pesquisa.
3.1 PADRONIZAÇÃO DO CULTIVO DOS ISOLADOS LOCAIS DE TOXOPLASMA
GONDII IN VITRO
Os parasitos utilizados nesta pesquisa foram recuperados a partir de animais
utilizados para consumo humano (galinhas, porcos, cabras, etc), de fazendas e
matadouros do Estado do Rio Grande do Norte, Brasil. A avaliação destes isolados
faz parte de um projeto do nosso grupo que tem como parte de seus objetivos
conhecer a diversidade local destes parasitos locais (CLEMENTINO ANDRADE et
al., 2013).
Após o isolamento e caracterização inicial dos parasitos, estes foram
mantidos congelados no Laboratório de Toxoplasmose da Universidade Federal de
Minas Gerais, que é parceira do grupo. Para a realização do presente estudo,
cérebros de camundongos previamente infectados foram então enviados ao
LABMAT. Os cérebros continham cistos dos seguintes isolados: TgPgBrRN1 (Pg1);
TgCkBrRN2 (Ck2) e TgCkBrRN3 (Ck3) (CLEMENTINO ANDRADE et al., 2013).
36
Estes cérebros foram então macerados em 1mL de solução salina tamponada
(PBS). A partir do macerado, um valor de 150 – 200 cistos de cada um dos isolados
foi então inoculado, via intraperitoneal, em 3 camundongos C57BL/6. Após 4 dias de
infecção os animais foram, então, eutanasiados e tiveram suas cavidades
peritoneais lavadas com 5mL de PBS estéril. O exsudato foi coletado e centrifugado
por 10 minutos à 3000rpm para precipitação dos taquizoítos.
Finalmente, o precipitado obtido foi acrescentado à uma cultura de células
RAW 264.7, a qual era mantida com meio de cultura DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle Medium) (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Life
technologies) e 40mg/L de Gentamicina (Neo Quimica). O meio de cultura foi
trocado a cada 48h e o crescimento do parasito foi monitorado pela observação em
microscópio invertido. O crescimento dos parasitos foi fotografado e a sua
capacidade patogênica foi confirmada pela inoculação destes em camundongos
sadios, com posterior observação.
3.2 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS DO PARASITO IN VIVO
Os cérebros de camundongos infectados, (Ck2; Ck3 e PG1) recebidos do
Laboratório de Toxoplasmose da UFMG, foram macerados em 1mL de PBS e após
quantificação da carga parasitária um total de 5 cistos foi inoculada por via oral em 4
camundongos machos suíços.
Após 3 dias de infecção a água fornecida aos animais foi substituída por uma
solução de sulfadiazina 500mg/L (DUBEY, 2010) por um período de 10 dias. Ao final
deste período os animais voltaram a receber água pura e a partir daí eles foram
acompanhados para monitorar a cronificação da infecção.
3.3 DETERMINAÇÃO DE EFEITO CITOPÁTICO
Inicialmente foram mantidas culturas estáveis de células RAW 264.7, com
trocas de meio DMEM suplementado de soro fetal bovino 10% em dias alternados,
com subcultivos realizados semanalmente. Então, 1 × 105 células foram transferidas
para placas de 24 poços e incubadas a 37 °C por 24 h. Em seguida, esta cultura foi
infectada na proporção de dois parasitos por célula, utilizando Ck2 ou Ck3. Como
37
controles positivos foram utilizadas as linhagens virulentas (RH) ou moderadamente
virulenta (ME49), poços com células livres de infecção foram mantidos como
controles negativos.
A partir da infecção, as células foram então monitoradas e as imagens das
interações parasito/célula feitas utilizando um microscópio Zeiss Axiovert (Carl Zeiss
Inc., Thornwood, NY, USA), o qual era equipado com camera e acoplado a um
sistema de incubação com CO2. O microscópio recuperou fotos dos poços a cada 30
min, durante 48 horas. Decorrido esse período as imagens foram submetidas a uma
análise qualitative, onde a presença e o tempo de inicio da lise celular foram
utilizados como critério de categorização do efeito citopático dos parasitos.
3.4 PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA
A extração do DNA dos parasitos foi feita utilizando o kit comercial QIAamp
DNA mini kit 250 da Quiagen. Inicialmente foi obtida uma massa densa de parasitos
a partir de cultura previamente infectada com as linhagens clonais RH88 (RH), ME49
ou VEG. Também foi obtida massa de linhagens não clonais Ck2, Ck3 ou Pg1. Essa
massa de parasitos foi então centrifugada em uma rotação de 8000rpm por 10
minutos, para concentrar os parasitos. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado ressuspendido em 200µL de PBS estéril. Posteriormente foi adicionado
20µL de proteínase K e adicionado 200µL de tampão AL, com posterior agitação por
15s em vortex. A mistura foi Incubada em banho-maria 56ºC por 10 minutos. Em
seguida foi adicionado 200µL de etanol PA e ressuspendido novamente em vortex
por 15s. Todo o conteúdo foi colocado na coluna com filtro fornecida pelo kit e
centrifugado a 8000rpm/1min e 30s /15ºC. O tubo com volume filtrado foi descartado
e um novo tubo foi utilizado. Adicionou-se 500µL de tampão AW1 e centrifugou-se a
8000rpm/1min e 30s /15ºC. A seguir o tubo foi novamente descartado. Adicionou-se
novo tubo e 500µL de tampão AW2 e centrifugou-se a 14000rpm/3 min e 30s/15ºC.
Após troca do tubo com filtrado e adição de novo tubo, foi dado spin em centrifuga a
15000rpm/1min. Finalmente, a coluna foi colocada em um eppendorf de 1,5mL e
adicionou-se 100µL de tampão AE ou água destilada com incubação por 1min em
temperatura ambiente. Centrifugou-se a 8000rpm/1min e 30s, descartou-se a coluna
e o DNA foi armazenado a -20ºC. O sucesso da extração foi observado pela
38
quantificação do DNA extraído utilizando nanodrop com leituras feitas em 260 e
280nm.
3.5 PCR-RFLP DO LOCUS CS3
A sequência alvo de DNA do marcador CS3 foi inicialmente amplificada
conforme descrito previamente (SILVA et al., 2014). As condições utilizadas para
amplificação foram as mesmas utilizadas por Pena e colaboradores (2008) para
PCR-RFLP. Foram usados 2,5 µL de DNA molde, com temperatura de anelamento
dos ciclos de 63°C por 30 segundos. Os produtos da PCR foram duplamente
digeridos, com as enzimas N1aIII e MboI (New England BioLabs) (SILVA et al.,
2014). Os produtos digeridos foram posteriormente purificados por extração com um
volume de fenol/clorofórmio (1:1). O padrão de bandas de DNA foi revelado em gel
de poliacrilamida corado com nitrato de prata e posteriormente fotografado. Foram
também utilizadas as cepas RH (tipo I), ME49 (tipo II) e VEG (tipo III) como padrões
clonais de referência. Adicionalmente foram utilizadas as cepas CTBR24 e CTBR21
como padrões recombinantes (PENA et al., 2008; CARNEIRO et al., 2013).
3.6 PERFIL FENOTÍPICO DE PATOGENICIDADE IN VIVO
A avaliação da patogenicidade dos isolados de T. gondii foi realizada de
acordo com Dubey e colaboradores (2002), com modificações. Neste caso, foi
observado o tempo de sobrevivência dos animais infectados durante 30 dias, a partir
da infecção em camundongos. Os isolados patogênicos apresentam 100% de
mortalidade entre os camundongos infectados; os isolados não patogênicos
apresentam 100% de sobrevivência entre os camundongos infectados, enquanto os
de patogenicidade intermediária apresentam taxas de sobrevivência intermediárias.
Para determinação desta característica patogênica nos isolados locais do
parasito foram utilizados camundongos suíços (n=4) ou C57BL/6 (n=3), os quais
foram organizados em três diferentes grupos:
- Infecção com 5 cistos, via oral em camundongos suíços;
- Infecção com 5 cistos, via oral em camundongos C57BL/6;
- Infecção com 5x104 taquizoitos, via intraperitoneal em camundongos suíços.
39
3.7 PERFIL FENOTÍPICO DE RESISTÊNCIA Á SULFADIAZINA
Para determinação de resistência à sulfadiazina foram separados grupos de
camundongos suíços (n=4). Estes foram infectados com 5 cistos das linhagens
atípicas Ck2, Ck3 ou Pg1 ou com a linhagem clonal ME49 (normalmente utilizada
como controle em testes com medicamentos). Decorridas 24h da infecção iniciou-se
o tratamento com sulfadiazina. Este tratamento foi feito nas concentrações de 100;
200 ou 300mg/Kg de animal, pela via oral. A avaliação da eficácia do tratamento foi
feita pela taxa de mortalidade destes animais, a qual foi acompanhada por 30 dias
consecutivos.
3.8 SEQUENCIAMENTO DO GENE DHPS
Uma região de 396pb de uma sequência codificante do gene DHPS,
correspondendo aos nucleotídeos das posições 968 – 1364 (considerando o
primeiro ATG da região codificante como o ponto inicial) foi amplificada a partir do
DNA total dos isolados Ck2, Ck3 e Pg1, usando os primers DHPS407F (5’-
ACGCGGATCAGATAATCAAGG-3’) e DHPS407R (5’- ACAGCATCTCTCGCGACT-
3’). Esta região abrange o códon 407, normalmente associado a resistência à
sulfadiazina. A PCR foi realizada em 20µL de reação, contendo 0,25µM de cada
primer; 1,5 mM de MgCl2; 1U de Taq; 0,2 mM de cada dNTP e tampão de reação
1X.
A amplificação ocorreu em termociclador (BIOER) e foram utilizados os
seguintes ciclos: desnaturação inicial à 94oC por 2 min, seguida por 35 ciclos de
94ºC por 40s, 57ºC por 40s e 70ºC por 40s com uma extensão final de 70ºC por
3min. Finalmente, os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5%
e corados com brometo de etídeo. Os amplicons foram purificados e sequenciados
utilizando a plataforma Applied Biosystems® 3500 Genetic Analyzer de acordo com
instruções do fabricante. Todos os amplicons foram sequenciados pelo menos duas
vezes (forward e reverse) e os eletroferogramas foram analisados usando o BioEdit
versão 7.2.5.
40
3.9 ANÁLISE COMPORTAMENTAL
3.9.1 Esquiva discriminativa em labirinto cruz elevado
Para avaliação de memória/aprendizagem/ansiedade nos animais sadios ou
infectados com a linhagem clonal ME49 ou isolado Ck2 (apenas esta linhagem local
apresentou sobrevivência ao final de 30 dias de infecção), foi utilizado um labirinto
cruz elevado (SILVA; FRUSSA-FILHO, 2000; MELO, 2012). Este foi feito de madeira
tendo dois braços fechados (28,5 x 7 x 14cm) opostos a dois braços abertos (28,5 x
7cm). O braço aversivo continha uma lâmpada de 100 W (Figura 4).
No primeiro dia de experimento foi realizado o treinamento dos animais. Estes
foram colocados no centro do aparato (após um período de 30 minutos de
ambientação na sala do experimento) e monitorados por 10 minutos. Sempre que o
animal entrava do braço aversivo, um estímulo aversivo era efetuado, no caso: a
lâmpada era acesa e um ruído de 80db emitido de um autofalante. Este estímulo
durava o tempo que o animal permanecia no braço.
No segundo dia de experimento após a ambientação (30 minutos) foi
realizada a sessão-teste. Neste caso os animais foram novamente posicionados no
centro do aparato e monitorados por 10 minutos cada. Contudo, neste dia nenhum
estímulo foi emitido no braço aversivo. Em cada lado externo do aparato foram
colocadas pistas visuais (desenhos) que os camundongos poderiam utilizar para
localização no aparelho.
Após as duas sessões, o tempo gasto no braço fechado aversivo e não
aversivo foi medido e comparado por análise de variância (ANOVA). O número de
entradas nesses braços foi comparado pelo teste t Student. A Memória foi avaliada
pelo tempo gasto no braço fechado aversivo versus braço fechado não aversivo. A
atividade locomotora foi avaliada pela distância percorrida pelos animais dentro do
aparato e a ansiedade pelo tempo gasto nos braços abertos.
O comportamento dos animais foi monitorado e analisado utilizando o
software de seguimento de vídeo Anymaze (Stoelting, EUA).
41
Figura 4: Labirinto em cruz elevado modificado utilizado para análise de
memória/aprendizagem e ansiedade.
3.10 DOSAGEM DE CITOCINAS
Cinco grupos contendo quatro camundongos C57BL/6 machos com 8 - 10
semanas foram primeiramente pesados para cálculo da concentração dos
tratamentos a serem realizados. Os grupos de animais foram organizados da
seguinte maneira:
1- Controle Não Infectado e Não Tratado;
2- Controle Infectado e Tratado com Veículo da diluição;
3- Infectado TTT Timol;
4- Infectado TTT Estragol;
5- Infectado TTT Sulfadiazina;
42
No dia 01 do experimento os camundongos foram infectados, via oral, com 10
cistos da cepa ME49 do T. gondii. Então após 24h os animais tiveram seus
diferentes tratamentos iniciados com Timol 80mg/Kg, Estragol 100mg/Kg ou
Sulfadiazina 200mg/Kg. Todos os tratamentos ocorreram por via oral e duraram 6
dias consecutivos.
No sétimo dia após a infecção os animais tiveram amostras de sangue coletas
a partir de seu plexo orbital. O material foi posteriormente centrifugado a 3000rpm
por 5min em 15ºC. O soro resultante foi então congelado em freezer -80ºC até o
momento da análise.
Esta dosagem foi realizada pelo método de ELISA Sandwich, de acordo com
instruções do fabricante (BD Biosciences). Inicialmente foi realizada a sensibilização
das placas de 96 poços com 50 μL do anticorpo (Ac) de captura, na diluição de
1/250. Após esta incubação a placa foi mantida overnight na geladeira. No dia
seguinte foram realizadas 3 lavagens com PBS-T.
Para o bloqueio de sítios inespecíficos foi utilizada uma solução de PBS +
10% de soro fetal bovino (SFB). Neste caso, um volume de 150 μL/poço foi incubado
por 1h em temperatura ambiente com posterior lavagem dos poços (3x, PBS-T).
Paralelamente foi preparada uma curva padrão com interleucinas recombinantes nas
concentrações a partir de 2000pg/mL, para IL-10 e 80ng/mL, para IL-12.
Posteriormente, 50 μL das amostras ou curva-padrão, foram incubadas na
placa por 2h em temperatura ambiente, com 5 lavagens com PBS-T após este
intervalo. Na sequência foi acrescentado o Ac de detecção (50 μL /1h), marcado
com estreptoavidina e peroxidase (1/250), diluído em PBS+SFB 10%, com
posteriores lavagens após a incubação (sete vezes com PBS-T)
Finalmente as reações foram reveladas com a adição de 50μL/poço da
solução reveladora de TMB, a qual foi mantida por 30 minutos ao abrigo da luz. Está
reação foi parada com 25 μL de H2SO4 2N. As leituras foram realizadas em
espectrofotômetro em comprimentos de onda de 450 e 570nm.
A dosagem de IFN-γ foi realizada utilizando o kit “BDTM cytokine cytometric
bead array (CBA) mouse Th1/Th2” (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). A
quantificação da citocina foi feita a partir do sangue obtido de camundongos
C57BL/6 seguindo instruções do fabricante.
43
3. 11 PROTOCOLO DE ELISA INDIRETO PARA TOXOPLASMOSE MURINA
3.11.1 Preparo do Antígeno de T. gondii para ELISA
3.11.1.1 Preparação dos Parasitos
Primeiramente foram retirados de camundongos, previamente infectados com
a cepa RH do T. gondii, um exsudato peritoneal rico em taquizoítos. Esse exsudato
foi, então, centrifugado em baixa rotação (500rpm, 5 minutos) e o sobrenadante foi
preservado. Deste modo foi possível separar os parasitos, menores, dos
macrófagos, maiores.
Após a separação dos parasitos, foi realizada uma centrifugação em alta rotação
(3000rpm, 5 minutos) e os parasitos presentes no precipitado foram recuperados e
diluídos em 1mL de PBS.
3.11.1.2 Preparo do Lisado
O eppendorf contendo os parasitos foi inicialmente mergulhado em nitrogênio
líquido, por 2 minutos. Após o descongelamento os parasitos foram submetidos a 3
banhos em ultrassom (40KHz) por 5 minutos (com ressuspensão entre cada banho).
Quando, se procedeu a centrifugação do material por 30min a 15000rpm. O
sobrenadante foi então guardado em freezer -20ºC até a quantificação proteica.
3.11.1.3 Quantificação Proteica
Para a determinação da curva de controle padrão se preparou uma solução
estoque de 1mg/mL de albumina. A partir desta foi construída a curva de
concentrações conhecidas de albumina.
Foi utilizada uma placa de 96 poços à qual foi adicionada 20 µL de amostra,
curva-padrão ou branco (água) mais 180 µL de reagente de Bradford. Esta reação
foi incubada por 10 minutos ao abrigo da luz. Decorrido este tempo a placa foi lida
em espectrofotômetro em comprimento de onda de 595nm.
44
3.11.2 Ensaio Imunoenzimático
Uma placa de 96 poços fundo chato foi sensibilizada com antígeno de T.
gondii na concentração de 1μg/mL. Um volume final de 100μL da solução de
antígeno, diluída em coating buffer, foi acrescentado por poço. A placa sensibilizada
foi então mantida, totalmente coberta, em papel alumínio overnight, em geladeira
(4ºC).
No dia seguinte a solução foi descartada e a placa foi então lavada 4x com
solução de lavagem PBS + tween 0,05% (PBS-T). Após a lavagem foi realizado o
bloqueio de sítios inespecíficos. Neste sentido foi administrado 200μL de solução de
bloqueio (Leite Molico 2%) em cada poço. Esta incubação ocorreu por 1h em estufa
a 37ºC. Decorrido este tempo foram realizadas 4 lavagens com PBS-T.
A seguir, os soros que estavam sendo testados foram diluídos em PBS na
concentração de 1/200 e 200μL deste/poço foi incubado por 1h à 37ºC. A placa foi
separada em poços para controles positivos, negativos e branco (PBS no lugar do
soro), além dos soros-teste. Ao final da incubação foram realizadas 4 lavagens com
PBS-T.
Posteriormente foi adicionado 100μL de solução de Ac conjugado (1:10.000
IgG ou 1:1000 IgM) por poço e levado à estufa por 1h, diluído em PBS. Decorrido
este tempo o conjugado foi descartado e placa lavada por 5 vezes com PBS-T.
Finalmente foi adicionado 50μL de solução reveladora TMB/poço. Esta reação
aconteceu por 10 min ao abrigo da luz e a reação foi parada com 30μL de H2SO4
diluído em água destilada (1:20). A leitura foi feita em espectrofotômetro no
comprimento de onda de 450nm.
3.12 ATIVIDADE ANTI-TOXOPLASMA DE TIMOL E ESTRAGOL CONTRA A CEPA
ME49 DO PARASITO
No experimento com a cepa ME49 os camundongos foram infectados por via
oral com 25 cistos. O tratamento com timol (80mg/Kg), estragol (100 mg/Kg) ou
controles sulfadiazina (200 mg/Kg) e não tratados, foi realizado por via oral ou
subcutânea 24 horas após a infecção durante 6 dias, com administração de doses
únicas diárias. A mortalidade dos animais foi acompanhada por 30 dias. Após este
período os animais sobreviventes foram eutanasiados e tiveram seus cérebros
45
removidos e mascerados para pesquisa de cistos cerebrais, confirmando assim a
infecção (OLIVEIRA et al., 2014).
3.13 ATIVIDADE ANTI-TOXOPLASMA DE TIMOL E ESTRAGOL EM ISOLADOS
LOCAIS DO PARASITO
Os camundongos suíços foram infectados com 5 cistos dos isolados Ck2, Ck3
ou Pg1 do parasito ou com linhagem controle ME49, via oral. Decorrido um intervalo
de 24h após a infecção estes animais iniciaram o tratamento com timol (80mg/Kg),
estragol (100mg/Kg) ou sulfadiazina (200mg/Kg). Um grupo controle foi deixado sem
tratamento, porém mantendo todas as demais condições experimentais. Estes
tratamentos foram feitos por via oral, dose única diária, e tiveram duração de seis
dias consecutivos (OLIVEIRA et al., 2014). A mortalidade dos animais foi monitorada
diariamente por 30 dias. Animais moribundos ou com sinais típicos de dor foram
eutanasiados com doses letais de anestésicos.
3.14 COMITÊ DE ÉTICA
Este estudo foi realizado seguindo estritamente as recomendações do Comitê
de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(CEUA/UFRN parecer número 46/2013). Todos os procedimentos cirúrgicos
realizados nos animais foram feitos sob efeito de analgesia e anestesia (Cetamina +
Xilazina) e todos os esforços foram feitos de modo a amenizar o sofrimento dos
animais.
3.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todos os gráficos foram desenvolvidos utilizando o software GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Software, La Jolla, California). Os valores aparecem descritos como
media + desvio padrão ou erro padrão. Comparações intragrupos foram feitas antes
e após tratamentos utilizando teste-T. O One way foi utilizado para comparações
multiplas. Métodos não paramétricos foram utilizados quando necessário. Todas as
análises estatísticas também foram desenvolvidas pelo software GraphPad Prism
46
5.0. e as diferenças foram consideradas significaticas quando o valor p < 0,05 e
altamente significativas quando p < 0,001.
47
4 RESULTADOS
MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS LOCAIS E DETERMINAÇÃO DE EFEITO
CITOPÁTICO IN VITRO
As figuras (5-9) mostram que em todos os grupos celulares a infecção foi
bem-sucedida, uma vez que em todos foi possível observar a interação parasito-
célula em diferentes períodos após infecção com os isolados de galinhas e
controles. Dentre os isolados locais de galinhas foi observado um maior efeito
citopático em Ck3 (Figura 6), pois nestes ocorreu lise celular de forma mais precoce.
As linhagens clonais ME49 (Figura 8) e RH (Figura 9) apresentaram crescimentos
característicos com maior efeito citopático observado na cepa RH.
48
Figura 5: Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck2 do Toxoplasma gondii.
A: 1,5h; B: 17,5h e C: 20h de infecção, aumento de 20X. Setas destacando a forma
taquizoítos do parasito e caixa destacando célula infectada.
49
Figura 6: Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck3 do Toxoplasma gondii.
A: 22,5h; B: 23h e C: 23,5h de infecção, aumento de 20X. Caixa destacando célula
parasitada.
50
Figura 7: Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pelo isolado Ck3 do Toxoplasma gondii.
Caixa destacando célula com alta carga parasitária (A: 43h e B: 43,5h de infecção) e lise
celular (C: 44h de infecção), aumento de 20X.
51
Figura 8: Cultura de Célula RAW 264.7 infectada pela cepa ME49 do Toxoplasma gondii. A:
15h; B: 15,5h; C: 16h e D: 29,5h após infecção, aumento de 20X. Setas destacando
vacúolos parasitóforos e caixa maior destacando macrófagos ativados e vacúolos
parasitóforos.
52
Figura 9: Cultura de células RAW 264.7 infectadas pela cepa RH do Toxoplasma gondii. A:
Caixa destacando célula com alta carga parasitária e seta destacando um taquizoíto (13,5h
de infecção); B e C: Caixa destacando macrófago ativado infectado (14,5h e 16,5h após
infecção); D e E: Caixa destacando macrófago imediatamente antes e logo após lise celular;
F: Caixa destacando conjunto de taquizoitos em contato com células em divisão, aumento
de 20X.
53
MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS LOCAIS IN VIVO
Através de um protocolo de infecção com 5 cistos por via oral, associado a
subdoses de sulfadiazina (500mg/L durante 10 dias), foi possível estabelecer no
Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose (LaBMaT) uma rotina para
manutenção dos isolados Ck3, Pg1 e Ck2 do T. gondii em camundongos suíços,
com passagens sendo feitas a cada três, oito e doze semanas, respectivamente.
Estas cepas encontram-se desde então sendo mantidas em camundongos.
PATOGENICIDADE DOS ISOLADOS DE CAMPO
A análise de patogenicidade em modelo murino foi feita utilizando as vias de
infecção intraperitoneal (Figura 10A) e oral (Figura 10B e 10C). Por ambas as vias
foi possível observar uma patogenicidade semelhante, onde a mortalidade ocorreu
mais precocemente em animais infectados com os isolados Ck3, Pg1 e Ck2,
respectivamente. Os controles RH, ME49 e VEG apresentaram padrão de
mortalidade característico.
54
Figura 10: Porcentagem de sobrevivência de camundongos (n=4) infectados com os isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 ou cepas clonais RH, ME49 ou VEG do Toxoplasma gondii. A: camundongos suíços infectados por via intraperitoneal; B: camundongos suíços infectados por via oral; C: Camundongos C57BL/6 infectados por via oral.
0 1 0 2 0 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
C k 2
C k 3
P g 1
*
RH
M E 4 9
V E G
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
0 1 0 2 0 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0**
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
0 1 0 2 0 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
*
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
A
B
C
PADRÃO MOLECULAR DE PATOGENICIDADE COM O MARCADOR CS3
A análise molecular feita por PCR-RFLP a partir do marcador CS3 revelou
que os isolados Ck3, Pg1 e Ck2 apresentavam padrão molecular semelhante às
linhagens clonais RH (tipo I), ME49 (tipo II) e VEG (tipo III), respectivamente (Figura
11). Complemetando assim o achado em modelo murino.
55
Figura 11: Gel de eletroforese obtido por PCR-RFLP da região gênica CS3 do T. gondii de isolados clonais (RH, ME49 e VEG), atípicos (CTBR24 e CTBR21) e parasitos isolados locais (Ck2, Ck3 e Pg1).
PERFIL DE RESISTÊNCIA À SULFADIAZINA DOS ISOLADOS LOCAIS
O perfil fenotípico de resistência à sulfadiazina em modelo murino foi obtido a
partir de infecção seguida de tratamento por seis dias consecutivos com três
diferentes doses (100, 200 ou 300mg/Kg) de sulfadiazina. A mortalidade ocorreu em
dois grupos, apesar do tratamento, nos animais infectados com os isolados Ck3 e
Pg1 do parasito. Nos animais infectados com a linhagem Ck2 não houve mortalidade
em nenhuma concentração testada (Figura 12).
56
Figura 12: Porcentagem de sobrevivência de camundongos Suiços (n=4) infectados com os isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 do Toxoplasma gondii e tratados com Sulfadiazina, via oral, nas concentrações de 100; 200 e 300mg/Kg.
0 1 5 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
C k 2 - 1 0 0
C k 2 - 2 0 0
C k 2 - 3 0 0
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
0 1 5 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
C k 3 - 1 0 0
C k 3 - 2 0 0
C k 3 - 3 0 0
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
0 1 5 3 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
P g 1 - 1 0 0
P g 1 - 2 0 0
P g 1 - 3 0 0
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
A
B
C
SEQUENCIAMENTO DE REGIÃO DO GENE DHPS ASSOCIADA À RESISTÊNCIA
À SULFADIAZINA NOS ISOLADOS LOCAIS
A avaliação de polimorfismos gênicos foi feita em uma região de 396
nucleotídeos do gene da enzima dihidropteroato sintase (DHPS), normalmente
associada à resistência à sulfadiazina em Plasmodium spp (codon 407). Em nenhum
dos três isolados foi possível observar polimorfismos (Figuras 13 e 14).
57
Figura 13: Eletroferograma parcial de uma região do gene DHPS, focando a asparagina do códon 407. A sequência foi amplificada a partir do DNA de isolados Ck2, Ck3 e Pg1.
58
Figura 14: Análise comparativa do gene DHPS de sequências de Toxoplasma gondii de
diferentes regiões do mundo incluindo os isolados Ck2, Ck3 e Pg1.
59
PRODUÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS INDUZIDAS PELOS PARASITOS LOCAIS
Após 30 dias de infecção com as linhagens locais Ck2, Ck3 ou Pg1, ou
controle ME49, apenas os animais infectados com Ck2 ou ME49 permaneceram
vivos para quantificação da produção de anticorpos. Neste caso, foi encontrada uma
produção significativamente menor de IgG e IgM nos animais infectados com a
linhagem clonal ME49 em relação aos animais infectados com o isolado local (Figura
15).
Figura 15: Níveis séricos de IgM (A) e IgG (B) em camundongos fêmeas C57BL/6 (n=3) infectados com cinco cistos das linhagens Ck2 ou ME49.
60
ALTERAÇÕES MOTORAS E NA MEMÓRIA/APRENDIZADO/ANSIEDADE EM
CAMUNDONGOS INFECTADOS COM PARASITOS LOCAIS
Após 30 dias de infecção com parasitos locais ou clonais foi possível proceder
a análise comportamental apenas com dois grupos experimentais, ME49 e Ck2, pois
nos outros tratamentos houve 100% de mortalidade. Ocorreu um aparente dano na
área motora cerebral, representado pela redução no deslocamento de animais
infectados por Ck2 no aparato (Figura 16). O grupo de animais não infectados
apresentou o maior deslocamento entre todos os grupos.
Figura 16: Distância percorrida (treino e teste) por camundongos Suiços (n=6) sadios ou infectados com a cepa ME49 ou com o isolado Ck2 do Toxoplasma gondii.
Sad
io T
rein
o
Sad
io T
este
ME
49 T
rein
o
ME
49 T
este
Ck2 T
rein
o
Ck2 T
este
0
5
1 0
1 5
2 0
Dis
tân
cia
(m
)
As figuras 17 e 18 mostram que apenas os animais infectados com a cepa
ME49 tiveram alterações comportamentais em relação aos animais sadios. Nestes
ocorreu um aumento de impulsividade, representado pelo aumento do tempo nos
braços abertos, e também déficit de aprendizagem, pelo fato deste grupo não
aumentar sua permanência nos braços não aversivos com o passar do tempo. Os
animais infectados com o isolado Ck2 apresentaram um curso similar aos animais
mantidos sem infecção.
61
Figura 17: Permanência (em segundos) de camundongos Suiços (n=6) sadios ou infectados com a cepa ME49 ou com o isolado Ck2 do Toxoplasma gondii nos braços abertos de Labirinto em cruz elevado modificado.
Sad
io T
rein
o 0
-200
ME
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o 0
-200
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Ck2 T
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0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
Te
mp
o (
s)
Figura 18: Comparação entre tempo (segundos) no braço não aversivo x tempo (segundos) no braço aversivo de camundongos Suiços (n=6), infectados ou não, no Labirinto em cruz elevado modificado.
PADRONIZAÇÃO DE MODELO PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-
TOXOPLASMA DE NOVAS MOLÉCULAS
A falta de modelos estabelecidos de ensaios de atividade anti-Toxoplasma
dificultam as avaliações pré-clínicas na busca por novos medicamentos contra este
parasito. Portanto, a padronização deste novo modelo, com infecção via oral,
tratamento por seis dias consecutivos, tendo inicio 24h após a infecção, com
Sadio NA x AV treino
NAV 0
-200
AV 0
-200
NAV 2
00-4
00
AV 2
00-4
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NAV 4
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Tem
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00
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1 0 0
1 5 0
2 0 0
Te
mp
o (
s)
62
posterior acompanhamento dos animais por um período de 30 dias (anexo 1), foi um
fator importante para os próximos passos da pesquisa.
ATIVIDADE ANTI-TOXOPLASMA DO TIMOL E ESTRAGOL CONTRA CEPA-
PADRÃO E TRÊS ISOLADOS LOCAIS DO T. GONDII IN VIVO
Após infecção com cepa ME49 do parasito e tratamento com timol, estragol
ou controle sulfadiazina foi observado que o timol teve a capacidade de aumentar a
sobrevivência dos animais quando aplicado por via subcutânea; o estragol teve
eficiência tanto por via oral como pela subcutânea. Nestes casos a ação foi
semelhante ao controle com sulfadiazina (Figura 19).
63
Figura 19: Porcentagem de sobrevivência de camundongos suíços (n=4) infectados com a cepa ME49 do T. gondii e tratados com Timol, Estragol ou Sulfadiazina. I/NT: Infectado e não tratado; S: Infectado e tratado com Sulfadiazina; Esc e Eo: Infectado e tratado com Estragol por via subcutânea ou oral; Tsc e To: Infectado e tratado com Timol por via subcutânea ou oral.
0 1 0 2 0 3 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
I/N T
T o
T s c
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S
D ia s a p ó s in fe c ç ã o
Po
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en
tag
em
de
So
bre
viv
ên
cia
Porém, ao se observar a eficácia dos tratamentos contra os isolados locais do
T. gondii não houve redução de mortalidade em nenhum dos grupos infectados com
Ck3 e Pg1 e tratados, incluindo o grupo controle (Figura 20). Nesses a mortalidade
foi de 100%. Nos animais infectados com o isolado Ck2 houve uma redução na
mortalidade nos animais tratados com sulfadiazina e com o estragol.
64
Figura 20: Porcentagem de sobrevivência de camundongos suíços (n=4) infectados com a
cepa ME49 ou com os isolados Ck2, Ck3 ou Pg1 do Toxoplasma gondii e tratados com
Timol, Estragol, Sulfadiazina ou deixados sem tratamento (grupo controle).
PERFIL DE PRODUÇÃO DE CITOCINAS
No tocante a resposta imune, verificou-se uma elevada relação IL-12/IL-10
(Figura 21) principalmente no grupo de animais que recebeu tratamento com o
estragol, onde ocorreu uma alta produção de IL-12 e baixa de IL-10 o que indica
uma polarização para a via Th1. Os animais tratados com timol ou sulfadiazina ou
deixados sem tratamento apresentaram baixa relação IL-12/IL-10.
Ck2
Ck3
Pg1
65
Figura 21: Balanço sérico de citocinas induzidas por diferentes tratamentos em
camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa ME49 do T. gondii. A: Produção
de IL-12; B: Produção de IL-10; C: Relação IL-12/IL-10. (***=ρ<0,001 comparado ao grupo
NI/NT; δ= ρ<0.001 comparado ao grupo I/NT; ○= ρ<0.01 comparado ao I/NT; Φ= ρ<0.05
comparado ao I/NT). NI/NT= Não infectado e não tratado; I/NT= Infectado e não tratado; I/S=
Infectado e tratado com sulfadiazina; I/T= Infectado e tratado com timol; I/E= Infectado e
tratado com estragol.
Os níveis séricos de IFN- γ mostram que também houve uma maior produção
desta citocina (Figura 22) nos animais infectados e tratados com estragol, em
relação aos demais tratamentos. A maior produção geral foi encontrada nos animais
infectados e não tratados.
66
Figura 22: Produção sérica de interferon-γ induzida por diferentes tratamentos em
camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa ME40 do T. gondii. NI/NT= Não
infectado e não tratado; I/NT= Infectado e não tratado; I/S= Infectado e tratado com
sulfadiazina; I/T= Infectado e tratado com timol; I/E= Infectado e tratado com estragol.
RESPOSTA HUMORAL AOS DIFERENTES TRATAMENTOS
Quanto ao efeito dos compostos nos níveis séricos de imunoglobulinas, houve
redução significativa na produção de IgG no grupo tratado com sulfadiazina 15 e 30
após a infecção (Figura 23). Os animais que receberam os outros tratamentos
mantiveram alta produção imunoglobulinas, semelhante ao controle não tratado.
67
Figura 23: Produção de IgG em camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa
ME49 do T. gondii e submetidos a tratamentos com Timol, Estragol, Sulfadiazina ou não
tratados.
A análise da produção de IgM (Figura 24) mostra que em animais infectados
com sulfadiazina houve redução significativa da produção deste anticorpo no 15º dia
de infecção. Neste mesmo período houve elevação significativa na produção de IgM
no grupo tratado com timol. Os animais tratados com estragol apresentaram níveis
semelhantes aos animais não tratados.
68
Figura 24: Produção de IgM em camundongos C57BL/6 infectados com 10 cistos da cepa
ME49 do T. gondii e submetidos a tratamentos com Timol, Estragol, Sulfadiazina ou não
tratados.
0 1 5 3 0 4 5 6 0
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
In fe c ta d o T T tim o l
In fe c ta d o T T e s tra g o l
In fe c ta d o T T s u lfa d ia z in a
C o n tro le in fe c ta d o n ã o
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(OD
)
69
5 DISCUSSÃO
Na região Nordeste do Brasil o consumo de churrasco mal-passado de
coração de galinha é apreciado como uma iguaria (CLEMENTINO ANDRADE et al.,
2013). Esta situação pode ser considerada como importante fator de risco para
transmissão do T. gondii porque esta carne potencialmente possui cistos ainda
viáveis do parasito (TENTER et al., 2000; KIJLSTRA; JONGERT, 2008; HALOS et
al., 2010), os quais constituem uma das principais rotas de infecção pelo parasito
(SUKTHANA, 2006).
No ano de 2013, Clementino Andrade e colaboradores caracterizaram
parcialmente o padrão de patogenicidade de 19 isolados de T. gondii, os quais foram
obtidos de animais de criação utilizados para consumo humano; 13 dos quais foram
recuperados de galinhas caipiras. Contudo, no trabalho citado não foi feita a analise
de patogenicidade a partir de inóculuo padronizado ou por outras vias de infecção.
Neste estudo também não foi possivel determinar o padrão de resistência à
sulfadiazina, utilizando um modelo próximo ao natural de infecção, por via oral.
Então, especula-se que esses padrões atípicos de patogenicidade e resistência à
sulfadiazina, observada nos parasitos, poderiam explicar as manifestações clínicas
que são encontradas nesta região (MENDES et al., 2014). Embora até o momento
seja difícil correlacionar os achados em modelo murino com a sintomatologia
observada em pacientes humanos (MORISSET et al., 2008; SILVA et al., 2014).
Nesta pesquisa foi possível manter culturas estáveis dos isolados do parasito
in vivo e in vitro, isso constitue um avanço importante por permitir possibilidades de
novas investigações futuras dessas cepas também a partir de ferramentas
moleculares e filogenéticas. A pesquisa contribuiu de forma importante por reafirmar
a utilidade do marcador CS3 na determinação de patogenicidade, assim
complementando o modelo de patogenicidade utilizado por Clementino Andrade e
colaboradores (2013), o qual sugeria que os isolados de galinhas pareciam ter a
mesma fonte de infecção.
No entanto, foi possível confirmar por meio da análise do efeito citopático dos
parasitos Ck2 e Ck3 em cultura de células RAW 264.7 que esses não possuem a
mesma origem. A análise realizada in vitro, de forma inédita, mostra os períodos de
lise celular provocadas por esses parasitos, onde os isolados Ck2 não causam
morte nas células infectadas após 48 horas de infecção, enquanto, o isolado Ck3
70
provoca morte por lise celular após 23h de infecção. Isso demonstra que, mesmo
tendo sido recuperados da mesma região, esses protozoários possuem uma
dinâmica de crescimento diferente, logo é provável que os mesmos tenham uma
diferente origem. Este achado demonstra uma limitação do modelo de determinação
de patogenicidade proposto por Su e colaboradores (2010), o qual não pode
diferenciar esses isolados. Este modelo é de grande valor na distinção de parasitos
de linhagens clonais, os quais são mais prevalentes nos Estados Unidos (KHAN et
al., 2011) e Europa (HOWE; SIBLEY, 1995). Porém, tem se observado limitações em
diferenciar cepas com padrão atípico de patogenicidade, como observado nos
países de América do Sul, por exemplo, o Brasil (PENA et al., 2008).
Neste contexto, um novo marcador que pode completar e aperfeiçoar o
modelo atual é o CS3. Pesquisas com mapeamento genético do T. gondii sugerem
que este marcador, presente no cromossomo VIIa do parasito está associado com
patogenicidade em camundongos. Diversos autores estão utilizando a amplificação
desse marcador neste contexto (PENA et al., 2008; YAI et al., 2009; DUBEY et al.,
2010; RAGOZO et al., 2010; SILVA et al., 2011) e ele vem se mostrando efetivo na
diferenciação de isolados atípicos do parasito. Após análise do resultado da PCR-
RFLP do locus CS3 foi então possível diferenciar, claramente, os três isolados, onde
Ck2 apresentou alelo tipo III (normalmente apatogênicos) o qual correspondeu à
baixa patogenicidade observada em modelo murino. Os isolados Ck3 e Pg1
possuíam alelos dos tipos I (normalmente patogênicos) e II (moderadamente
patogênicos), respectivamente. Este padrão também correspondeu aos achados in
vivo e confirmam a utilidade deste novo marcador na diferenciação de isolados do
parasito no Brasil (PENA et al., 2008; RAGOZO et al., 2010; SILVA et al., 2014).
A determinação da patogenicidade in vivo foi feita a partir de um inóculuo
padronizado e por duas vias de infecção (oral e intraperitoneal). Esta análise
permitiu confirmar a presença de parasitos com diferentes perfis e corroborou os
dados obtidos a partir do marcador CS3. Em ordem de maior patogenicidade foi
observado: Ck3, Pg1 e Ck2, onde os dois primeiros foram classificados como
patogênicos e o ultimo como moderadamente patogênico por não ter causado
mortalidade em 100% dos animais (CARNEIRO et al., 2013). Logo, foi demonstrado
que os dois isolados de galinhas, mesmo tendo sido coletados da mesma região
71
apresentam origens diferentes, comprovando a grande diversidade genética desse
parasito.
A via de infecção, oral ou intraperitoneal, não gerou diferenças no curso da
infecção, uma vez que não foram encontradas diferenças no perfil patogênico das
cepas. Então na maior parte da pesquisa foi utilizada a via oral por esta simular de
uma forma mais real a infecção natural pelo parasito (DUBEY; LINDSAY; SPEER,
1998).
Tendo se determinado que há variabilidade nos isolados locais, foi então
investigado se esta estaria relacionada à uma resposta imune diferenciada.
Decorridos 30 dias de monitoramento dos animais infectados apenas o isolado Ck2,
além do controle ME49 ainda apresentavam viabilidade. Logo, a dosagem de
imunoglobulinas só foi possível nos animais com essas infecções. Houve uma
produção significativamente maior de IgM e IgG nos camundongos infectados com
Ck2 em relação aos infectados com a cepa ME49, após 15 dias de infecção. É
conhecido que o tratamento para toxoplasmose pode causar em humanos e em
modelos experimentais uma redução na produção de anticorpos (ALVARADO-
ESQUIVEL et al., 2011). Porém, considerando que os animais não foram sujeitos à
tratamento, tais variações devem ter ocorrido exclusivamente por alterações
antigênicas presentes nestes dois grupos de parasitos. Morisset e colaboradores
(2008) utilizaram proteinas de grânulos densos (GRA5 e GRA6) e nestes
observaram que diferenças nos perfis de polipeptídeos podem ser utilizadas na
diferenciação e categorização dos parasitos. Desse modo, o sequenciamento de
regiões de GRA5 e GRA6 dos parasitos Ck2 poderia contribuir na elucidação destes
diferentes perfis imunes.
Reconhecendo o perfil polimórfico desses parasitos surge a necessidade de
averiguar se isso acarretaria em redução na sensibilidade ao tratamento-padrão com
a sulfadiazina. A falha terapêutica em modelo murino foi associada à resistência e
neste caso foi observado que apenas o genótipo Ck2 apresentou cronificação da
infecção e, consequentemente, sobrevivência de todos os animais infectados e
tratados com sulfadiazina. Já os animais infectados com isolados Ck3 ou Pg1
tiveram uma mortalidade total ou parcial. Estes dados são de grande relevânia pois
72
a sulfadiazina é um medicamento de referência no tratamento da toxoplasmose
(KAYE, 2011).
A avaliação da resistência à sulfadiazina em modelo murino é importante, pois
os atuais marcadores moleculares não correspondem aos achados in vivo, logo não
reproduzem o achado fenotípico (DOLIWA et al., 2013a). Apesar disso, foi realizada
a busca por polimorfismos. Esta foi direcionada à polimorfismos normalmente
presentes no gene DHPS, o qual produz a enzima que é alvo da sulfadiazina. Mais
especificamente a busca foi direcionada a uma região de 396 nucleotídeos que
compreende o códon 407. Embora poucas mutações sejam associadas à resistência
à sulfadiazina, neste ponto há uma substituição de asparagina por aspartato
(ASPINALL et al., 2002; MENECEUR et al., 2008; BOUGHATTAS et al., 2011;
ASPINALL et al., 2012; DOLIWA et al., 2013a) que confere resistência à sulfadiazina
no gênero Plasmodium. Contudo, nenhum polimorfismo foi encontrado nos isolados
locais do parasito, o que sugere que este fenótipo de resistência deve ocorrer por
outros mecanismos indiretos (DOLIWA et al., 2013b).
Dentre os mecanismos indiretos normalmente investigados também não
foram observadas alterações nas famílias de transportadores-ABC (DOLIWA et al.,
2013a). Logo, a origem dessa resistência segue sendo um campo desafiador na
área da parasitologia.
Essa resistência já foi demonstrada em outros estudos por outras
metodologias (ASPINALL et al., 2002; ALVES; VITOR 2005; MENECEUR et al.,
2008). Todavia, o padrão de resistência apresentado neste estudo é o primeiro
relato de populações de parasitos resistentes à sulfadiazina no Brasil, a partir de um
modelo natural de infecção. Alves; Vitor (2005) também descreveram populações de
parasitos resistentes utilizando outros modelos de infecção. Eles especularam que
esses parasitos podem explicar falhas terapêuticas em 10% dos casos de encefalite
toxoplásmica em pacientes tratados com sulfadiazina (ASPINALL et al., 2002).
Devido a ausência de marcadores genéticos efetivos para resistência à
sulfadiazina outras propostas que podem ser utilizadas incluem análises
proteômicas dos parasitos. Esta metodologia tem se mostrado eficiente em avaliar
resistência em Trypanosoma cruzi (ANDRADE et al., 2008) e Leishmania spp.
(KUMAR et al., 2010). Doliwa e colaboradores (2013b) demonstraram diferenças no
padrão de eletroforese de proteínas (envolvidas em diversos mecanismos, como:
73
metabolismo de carboidratos, interação com célula hospedeira, etc) entre cepas
sensíveis e resistentes do T. gondii (DOLIWA et al., 2013b). Desse modo, embora
nenhuma destas proteínas permita identificar diretamente os mecanismos de
resistência à sulfadiazina, elas oferecem mais uma alternativa que pode ser utilizada
neste contexto e assim confirmar o padrão observado fenotipicamente.
A emergência de cepas resistentes aos medicamentos usuais merece ser
comunicada às autoridades locais de saúde, pois estes parasitos foram recuperados
de animais normalmente utilizados para consumo humano e pode estar envolvido
em complicações clínicas e falhas terapêuticas observadas na cidade do Natal/RN
(MENDES et al., 2014).
O conhecimento da existência de cepas resistentes aos tratamentos
convencionais, além dos importantes efeitos adversos destes (KAYE, 2011) torna
premente a busca por novas moléculas que possam ser utilizadas para este fim.
Uma fonte sempre requisitada de novas moléculas inclue os produtos naturais. Entre
as espécies utilizadas na medicina tradicional da região nordeste destacam-se a
Croton zehntneri Pax e K. Hoffm. e a Lippia sidoides Cham., (OLIVEIRA et al.,
2016b) conhecidas popularmente como “canelinha” e “alecrim-pimenta”,
respectivamente. Elas apresentam importante ação antibacteriana e contra
promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis (COSTA et al., 2008;
MEDEIROS et al., 2011). Além disso, os óleos essenciais destas possuem ação
contra outro Apicomplexa o: Plasmodium in vivo e in vitro (MOTA et al., 2012),
motivo pelo qual os compostos majoritários destes óleos (timol e estragol) foram
estudados para possível ação contra T. gondii.
A segurança dos compostos foi investigada inicialmente e a baixa
citotoxicidade observada neste estudo em células HeLa, HepG2 e macrófagos
peritoneais murinos corroboram o observado por Mota e colaboradores (2012)
(OLIVEIRA et al., 2016b). Muller e colaboradores (1994) mostraram que o estragol
não causa alterações cromossomais em células V79 ou nas vias metabólicas, após
exposição aos hepatócitos de ratos. Além disso, o estragol foi capaz de induzir
reparo de DNA em hepatócitos in vitro e in vivo. A citotoxicidade do timol foi
estudada por Llana-Ruiz-Cabello e colaboradores (2014 a,b) que não encontraram
efeitos citotóxicos, mas verificaram nas concentrações mais altas a presença de
74
alterações ultraestruturais, evidenciadas por danos como degeneração lipídica, dano
mitocondrial e fragmentação nuclear.
De forma correspondente ao achado in vitro os estudos in vivo de toxicidade
aguda mostram uma toxicidade baixa ou moderada (OLIVEIRA et al., 2016b). A
baixa toxicidade do estragol foi similar ao dado observado por Gori e colaboradores
(2012). O conjunto destes dados de toxicidade fornece um suporte de segurança
para utilização destes compostos em testes com animais.
A análise inicial da ação anti-Toxoplasma dos compostos foi feita utilizando a
cepa ME49 do T. gondii. Esta cepa é uma boa alternativa para testes anti-
protozoários in vivo (MARTINS-DUARTE et al., 2010) por apresentar uma menor
patogenicidade, o que leva a um curso crônico na infecção (COSTA-SILVA;
PEREIRA-CHIOCCOLA, 2010). Esta cronicicidade permite um maior tempo para
avaliar os esquemas de tratamento e se aplica de forma mais eficiente por simular
melhor o curso da infecção em humanos.
A atividade anti-toxoplásmica foi avaliada pela taxa de sobrevivência dos
animais infectados, e tratados ou não, monitorados durante 30 dias. Neste sentido,
foi constatada a eficácia do timol principalmente pela via subcutânea e do estragol
pela via oral e subcutânea (OLIVEIRA et al., 2016b). A redução de mortalidade foi
similar ao observado com a infusão de Artemisia annua (OLIVEIRA et al., 2009),
onde também se verificou um efeito similar à droga-padrão sulfadiazina em reduzir a
mortalidade dos animais.
O timol já havia apresentado efeito contra formas promastigotas de
Leishmania amazonensis (MEDEIROS et al., 2011) e contra Trypanosoma cruzi
(Santoro et al., 2007; Escobar et al., 2010a). Enquanto outros terpenos como
carvacrol já haviam demonstrado eficácia contra a cepa PRU do T. gondii (DAHBI et
al., 2010). Entretanto, ainda não havia sido encontrada ação anti-Toxoplasma do
timol em animais infectados com a cepa ME49 do parasito.
O estragol apresentou uma menor toxicidade e superior capacidade anti-
Toxoplasma em relação ao timol por ambas as vias testadas, sugerindo que a forma
de administração não interfere em sua ação biológica. Já havia sido demonstrado
que óleo essencial rico em estragol apresentava capacidade de inibir o crescimento
de Trypanosoma cruzi (ESCOBAR et al., 2010b). Contudo, esse foi o primeiro relato
de atividade do estragol contra T. gondii em modelo murino.
75
A ação antiparasitária destes compostos também pode ser explicada por sua
ação antiinflamatória, a qual tem papel importante na patogenia da infecção (PONTE
et al., 2012; RIELLA et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2016a). Em adição o timol
também possui uma potente capacidade antioxidante, o que poderia conferir certa
proteção aos protozoários por reduzir o estresse oxidativo gerado pela infecção.
Porém, ele proporcionou uma maior sobrevida aos animais infectados, o que pode
ser explicado pelo menor dano tecidual proveniente da menor produção desses
radicais.
Outro possível mecanismo de ação do timol e estragol é baseado em seus
efeitos imunomodulatórios. É bem estabelecido que a via Th1 é a principal no
combate a parasitos intracelulares como o T. gondii, por meio da produção de
Interleucina-12 (IL-12), Interferon-gama (INF-γ) e óxido nítrico (PIFER;
YAROVINSKY, 2011). Para manter uma infecção bem sucedida o parasito induz
uma inibição parcial da síntese de óxido nítrico (ON) por meio da enzima óxido
nítrico sintase (SEABRA; SOUZA; MATTA, 2002). A modulação da resposta imune é
de grande importância por esta molécula, fazer parte da resposta primária ao
parasito (BRUNET, 2001; CARRUTHERS; SUZUKI, 2007).
Estudos anteriores realizados pelo grupo demonstraram que o estragol
apresenta efeito imunomodulatório em cultura de macrófagos peritoneais de
camundongos (dados não apresentados). Neste caso a molécula induziu a produção
de ON in vitro. A confirmação desse potencial foi realizado in vivo, onde o tratamento
com estragol em animais infectados proporcionou um importante direcionamento
para a via Th1 (com elevada produção de IL-12 e INF-γ associada a baixa produção
de IL-10). Este resultado é relevante pelo fato do INF-γ ser fundamental na geração
de uma potente resposta Th1, a qual é altamente eficiente no controle de parasitos
intracelulares. Esta resposta imune limita a replicação do protozoário e conduz a
uma resposta de células-T específicas (MUNOZ et al., 2011). O timol não
apresentou direcionamento direto para a via Th1, desse modo sua ação anti-
Toxoplasma deve ocorrer por outros mecanismos.
Quando se observa a resposta humoral, timol e estragol não afetaram a
produção dos anticorpos IgM e IgG, enquanto estes anticorpos foram
significativamente reduzidos pelo tratamento com sulfadiazina, como já havia sido
observado anteriormente (ALVARADO-ESQUIVEL et al., 2011). Imunoglobulinas
específicas para T. gondii previnem a invasão celular e limitam a disseminação
76
sistêmica dos taquizoitos durante a fase inicial da infecção aguda. Desse modo, as
diferentes imunoglobulinas contribuem para a proteção contra o protozoário
(MUNOZ et al., 2011). Logo, a redução na produção de anticorpos é uma importante
desvantagem do tratamento convencional, comparado às moléculas propostas, pois
é bem conhecido que o balanço entre as vias Th1/Th2 é fundamental para uma
gestação bem sucedida (SAITO et al., 2010) e que a redução de imunoglobulinas
maternas pode facilitar a transmissão vertical. Uma possível explicação para a
menor produção de anticorpos é o dano hematológico provocado pela sulfadiazina,
que pode ter como consequência uma redução das células produtoras de anticorpos
(LEPORT et al., 1988; KAYE, 2011).
Diferentes cepas do T. gondii também são reconhecidas por causar
alterações comportamentais em animais infectados, entre as quais destacam-se:
perda de medo inato, aumento de impulsividade e déficit de memória (VYAS et al.,
2007; AFONSO et al., 2012; XIAO et al., 2012; DANIELS et al., 2015). Nesta
pesquisa, utilizando animais infectados com cepas atípicas, clonal e animais sadios
foi verificado um aparente dano motor nos animais infectados com o isolado Ck2,
uma vez que estes se deslocaram menos no aparato. A confirmação deste dano
necessita de análise histológica do tecido com marcadores de morte celular. A
diminuição de memória/aprendizado e o aumento de impulsividade ocorreu apenas
nos animais infectados com a cepa ME49. Este dado já havia sido observado
anteriormente com cepas clonais do tipo II do parasito (DANIELS et al., 2015).
Alterações na distribuição cerebral dos cistos (AFONSO et al., 2012) e na via
dopaminérgica (PRANDOVSZKY et al., 2011) ajudam a explicar este dado, o qual
ainda necessita de mais experimentos para maiores esclarecimentos. Kerns e
colaboradores (2014) realizaram um estudo com crianças que foram expostas a um
surto de toxoplasmose congênita e que receberam os tratamentos convencionais.
Neste foi possível observar que as crianças (numa faixa etária entre 7 - 8,5 anos)
apresentavam um funcionamento cognitivo, acadêmico e comportamental
adequados à idade, com uma redução significativa na sustentação da atenção e no
controle da impulsividade. Apesar dessas pequenas alterações o tratamento precoce
é de grande importância, principalmente quando se verifica que as crianças que não
receberam tratamento apresentam repercussões maiores como: deficiência visual,
cegueira, coriorretinite, convulsões, retardo motor e mental além de déficit intelectual
ao longo do tempo (VASCONCELOS-SANTOS et al., 2009; KERNS et al., 2014).
77
Assim, apesar de não haver uma associação definida entre as diferentes cepas do
parasito e alterações comportamentais, foi demonstrado que o isolado Ck2 não
proporcionou alterações desse tipo em modelo animal e que o tratamento eficiente é
de muita importância na redução de sinais/sintomas.
Finalmente, quando foi analisada a ação anti-Toxoplasma dos compostos
contra isolados locais do T. gondii, constatou-se que estes não apresentavam uma
ação efetiva, pois apenas o isolado Ck2 apresentou sobrevivência após o tratamento
com sulfadiazina ou estragol. Esta ação diferencial já era esperada por esses
parasitos apresentarem características divergentes entre si. Características
patogênicas diferenciadas associadas à mutações nas vias metabólicas do ácido
fólico podem explicar esse fato. Destaque neste resultado para o estragol que exibiu
ação similar à sulfadiazina na redução de mortalidade em animais infectados e que
futuramente pode ser utilizada isoladamente ou em associação à sulfadiazina de
modo a otimizar a terapêutica da toxoplasmose.
78
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir de tudo que foi exposto é possivel concluir que os isolados Ck2 e Ck3
representam diferentes populações do T. gondii, com importante patogenicidade do
Ck3 in vitro. In vivo o isolado Ck3 foi o mais patogênico, seguido do Pg1. A via de
infecção parece não interferir no curso da infecção. O atual modelo molecular de
categorização de patogenicidade não se mostrou eficiente para estas cepas,
recomenda-se a adição do locus CS3 para complementar esse modelo. O isolado
Ck2 gerou um diferente padrão de produção de imunoglobulinas e manifestações
comportamentais em relação à cepa clonal. Duas moléculas, timol e estragol, são
propostas como tendo potencial anti-Toxoplasma. Elas apresentam-se pouco tóxicas
in vivo e in vitro e apresentam capacidade de diminuir mortalidade em animais
infectados com cepas clonais. Elas também apresentam capacidade de influenciar
na resposta imunológica, o que pode ser parte de seu mecanismo de ação. A ação
destas contra isolados locais clonais foi evidente apenas para o estragol contra o
isolado Ck2. Finalmente, o padrão de patogenicidade e resistência aqui descritos
são inéditos na literatura e as moléculas testadas apresentam-se promissoras na
otimização do atual esquema terapêutico para toxoplasmose.
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APÊNDICES
Apêndice 1- Artigo: Comparative Study on the Antioxidant and Anti-Toxoplasma Activities of Vanillin and Its Resorcinarene Derivative
Apêndice 2- Artigo: Epidemiological and Serological Profiles of Ocular Toxoplasmosis in the Municipality of Natal, North Eastern Brazil
Apêndice 3- Artigo: Anti-Toxoplasma Activity of Estragole and Thymol in Murine Models of Congenital and Non-Congenital Toxoplasmosis
Apêndice 4- Artigo: Anti-Inflammatory Activity of Thymol and Estragole
Apêndice 5- Artigo: Pathogenicity and phenotypic sulfadiazine-resistance of isolates of Toxoplasma gondii obtained from livestock, at northeastern Brazil
Apêndice 6- Patente: Sequência de ácidos nucleicos e uso para detecção do protozoário Toxoplasma gondii
