UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PROGRAMA DE PÓS … · Agradeço aos demais amigos Bárbara, Mike,...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

CARACTERIZAÇÃO DOS FATORES DE RISCO DE NATUREZA VIRAL E

IMUNOLÓGICA RELACIONADOS AO PERFIL DE PROGRESSÃO À AIDS EM

PORTADORES DO HIV-1

SAMARA TATIELLE MONTEIRO GOMES

BELÉM – PARÁ

2017




PORTADORES DO HIV-1

BELÉM – PARÁ

2017

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará

como requisito para a obtenção do grau de Doutor em

Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto.

1




PORTADORES DO HIV-1

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto

Laboratório de Virologia, ICB-UFPA.

Banca Examinadora: Profª. Drª. Rita Catarina Medeiros de Sousa

Universidade Federal do Pará, UFPA.

Drª. Maria Alice Freitas Queiroz

Laboratório de Virologia, ICB, UFPA.

Profª. Drª. Rosimar Neris Martins Feitosa


Dr. Felipe Bonfim Freitas

Seção de Virologia, Instituto Evandro Chagas, MS.

Drª. Ednelza da Silva Graça Amoras (Suplente)


BELÉM – PARÁ

2017

2

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota

no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

3

Dedico este trabalho à minha família.

Mãe (in memoriam), irmãos, sobrinhos, tios e esposo por acreditarem que isso seria possível.

4

AGRADECIMENTOS

Gostaria inicialmente de agradecer a todos os pacientes envolvidos nesta pesquisa, já

que sem eles nada disso teria sido possível. Agradecer ao programa de pós-graduação

Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários (BAIP) e ao Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio ao desenvolvimento desta tese.

Agradeço a todos que contribuíram e apoiaram o desenvolvimento deste trabalho. No

entanto, os agradecimentos vão muito além desta tese. Preciso agradecer pela paciência em

ensinar, competência, amizade e carinho que foi a mim endereçada nesses nove anos de

Laboratório de Virologia, minha segunda casa.

Agradeço a todos os professores do laboratório por me acolher e ensinar. Ao professor

Ricardo Ishak por ter confiado a mim este trabalho que lhe é tão caro, mas também por tanto

ter contribuído na minha formação acadêmica.

Ao meu querido orientador, professor Antonio Vallinoto, pelo acolhimento no

mestrado e doutorado. Pela confiança e fé na minha capacidade, pela amizade, paciência e por

incentivar a sempre melhorar. Não poderia ter orientador melhor.

Aos muitos amigos que já saíram do laboratório Felipe, Caroline, Di Paula, Ethienne,

Renata, Rogério, Izete e Helena que foram verdadeiros professores, ensinando que trabalhar

com pesquisa não é só saber aplicar uma técnica, mas também é ter companheirismo e

cordialidade para com o outro.

Agradeço aos demais amigos Bárbara, Mike, Edilson, Cinthia, Leonn, Tuane,

Angélica, William, Larissa, Leonardo, Mauro, Orlando e Suzanne pela ajuda em tudo e pelas

boas risadas.

Aos colaboradores, Edivaldo Sousa, Janaína Vasconcelos Massafra, Poliana da Silva

Lemos e João Lídio Vianez por se disponibilizarem em realizar o sequenciamento e análise

molecular das amostras deste trabalho.

E por fim e não menos importante, agradeço a Alice e a Ednelza, que poderiam muito

bem se incluir na dedicatória deste trabalho por serem muito mais que colegas de trabalho,

mas membros honorários da minha linda família. Obrigada por acreditarem na minha

capacidade, por me defenderem antes de qualquer pessoa, por enxergarem algo melhor em

mim e pelo amor.

Aqui se encerra uma longa etapa na minha vida pessoal e acadêmica, mas logo

se iniciará outra, tão desafiadora quanto.

Obrigada a todos!

5

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 7

LISTA DE SIGLAS 8

RESUMO 9

ABSTRACT 10

1 INTRODUÇÂO............................................................................................................ 11

1.1 HISTÓRICO.................................................................................................................. 11

1.2 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA VIRAL............................................................... 12

1.3 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA.............................................................................. 13

1.3.1 Gene gag....................................................................................................................... 13

1.3.2 Gene pol........................................................................................................................ 14

1.3.3 Gene env........................................................................................................................ 14

1.3.4 Gene vif......................................................................................................................... 14

1.3.5 Gene vpr........................................................................................................................ 15

1.3.6 Gene nef........................................................................................................................ 15

1.3.7 Gene tat......................................................................................................................... 15

1.3.8 Gene rev........................................................................................................................ 16

1.3.9 Gene vpu....................................................................................................................... 16

1.4 CICLO REPLICATIVO................................................................................................ 16

1.5 FILOGENIA.................................................................................................................. 19

1.6 EPIDEMIOLOGIA........................................................................................................ 22

1.6.1 Modos de transmissão.................................................................................................... 22

1.6.2 Prevalência..................................................................................................................... 23

1.7 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO................................................................................ 24

1.8 PATOGÊNESE.............................................................................................................. 24

1.8.1 Progressão.................................................................................................................... 27

1.9 RESPOSTA IMUNOLÓGICA...................................................................................... 31

1.9.1 Mutações de escape da resposta imunológica........................................................... 33

1.10 TERAPIA ANTIRRETROVIRAL................................................................................ 35

1.11 OBJETIVOS.................................................................................................................. 38

1.11.1 OBJETIVO GERAL...................................................................................................... 38

1.11.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................ 38

2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 39

2.1 TIPO DE ESTUDO E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS............................... 39

2.2 GRUPO CONTROLE NÃO INFECTADO COM O HIV-1......................................... 41

2.3 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS.......... 41

2.4 QUANTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+ e TCD8

+ E DA CARGA VIRAL

PLASMÁTICA DO HIV-1............................................................................................ 41

2.5 DOSAGEM DE CITOCINAS....................................................................................... 42

2.6 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR............................................................... 42

6

2.6.1 Extração do DNA......................................................................................................... 42

2.6.2 Amplificação do genoma viral.................................................................................... 42

2.6.3 Eletroforese.................................................................................................................. 42

2.6.4 Purificação dos produtos amplificados...................................................................... 43

2.7 SEQUENCIAMENTO.................................................................................................. 43

2.8 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS.................................................. 43

2.8.1 Edição e alinhamento das sequências........................................................................ 43

2.8.2 Análise filogenética...................................................................................................... 45

2.8.3 Identificação de mutações de escape.......................................................................... 45

2.8.4 Modelagem tridimensional de proteínas................................................................... 45

2.9 MÉTODOS ESTATÍSTICOS....................................................................................... 48

2.10 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................................... 48

3 RESULTADOS............................................................................................................ 49

3.1 CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1............... 49

3.1.1 Avaliação das quantificações de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ e da carga viral

plasmática..................................................................................................................... 49

3.1.2 Avaliação dos níveis plasmáticos das citocinas ........................................................ 52

3.2 CARACTERIZAÇÃO VIROLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1................... 55

3.2.1 Análise filogenética...................................................................................................... 55

3.2.2 Avaliação das mutações de escape imunológico........................................................ 56

4 DISCUSSÃO................................................................................................................ 61

4.1 FATORES IMUNOLÓGICOS DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES. 61

4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS PROGRESSORES E NÃO

PROGRESSORES........................................................................................................... 64

4.2.1 Análise filogenética........................................................................................................ 64

4.2.2 Mutações de escape imunológico.................................................................................. 65

5 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 72

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 74

APÊNDICE.................................................................................................................. 102

ANEXOS....................................................................................................................... 115

7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Morfologia do HIV-1............................................................................................. 12

Figura 2 Mapa genético do HIV-1....................................................................................... 13

Figura 3 Reconhecimento dos receptores virais gp120 e gp41 a membrana de linfócitos

T CD4+ durante a replicação do HIV.................................................................... 17

Figura 4 Ciclo replicativo do HIV....................................................................................... 19

Figura 5 Distribuição dos subtipos e CRFs de HIV-1 no Brasil.......................................... 21

Figura 6 Estimativa da prevalência de adultos e crianças vivendo com HIV em 2015 no

mundo..................................................................................................................... 23

Figura 7 Evolução da infecção pelo HIV-1 em função da contagem de linfócitos T CD4+

e carga viral................................................................................................. 25

Figura 8 Estabelecimento e manutenção de reservatório de células TCD4+ infectadas em

latência do HIV...................................................................................................... 26

Figura 9 Características dos fenótipos de progressão à AIDS referidas por diferentes

termos na literatura................................................................................................ 29

Figura 10 Sítios de ação dos antirretrovirais durante as diversas fases do ciclo replicativo

do HIV.................................................................................................................... 36

Figura 11 Quantificação de LTCD4+, LTCD8

+ e a relação de LTCD4

+/TCD8

+ entre os

grupos investigados............................................................................................... 51

Figura 12 Concentração plasmática e comparação das citocinas Th1, Th2 e Th17 nos

grupos investigados............................................................................................... 54

Figura 13 Distribuição filogenética das amostras dos grupos CV e NCV............................. 55

Figura 14 Localização da mutação A146T na proteína P24 do gene gag do HIV-1............. 58

8

LISTA DE SIGLAS

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

AIDS/SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SIV Vírus da Imunodeficiência Símia

DNA Ácido Desoxirribonucleico

cDNA Ácido Desoxirribonucleico complementar

RNA Ácido Ribonucleico

LTCD4+ Linfócito T CD4

+

LTCD8+ Linfócito T CD8

+

CTL Linfócitos TCD8+ citotóxicos

HLA Antígenos Leucocitários Humanos/Human Leukocytes Antigens

MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal/Major Histocompatibility

Complex TARV Terapia antirretroviral

LTNP long-term nonprogressors / Não progressores de longo prazo

CE Controlador de elite

CV Controlador de viremia

CV1 Controlador de viremia 1

CV2 Controlador de viremia 2

NCV Não controlador de viremia

9

RESUMO

A infecção pelo HIV-1 acarreta uma disfunção progressiva do sistema imunológico, associada

a infecções oportunistas e/ou neoplasias. Para a maioria dos portadores de HIV, a infecção é

marcada por alta replicação viral e o declínio de linfócitos TCD4+ (LTCD4

+), desencadeando

a AIDS, que na ausência de TARV pode conduzir à morte. Entretanto, o fenótipo LTNP

(Long-term nonprogressors), controlador de elite ou controlador de viremia, compreendem

indivíduos que naturalmente controlam a replicação viral sem TARV, mantendo níveis

aceitáveis de LTCD4+. Assim, o objetivo foi descrever os fatores de risco virológico e

imunológico entre portadores do HIV-1, de acordo com suas características de progressão

para a AIDS. Para isso, 30 pacientes, virgens de tratamento, foram selecionados e distribuídos

em três grupos considerando o tempo de infecção >6 anos, contagem de LTCD4+ e carga

viral, sendo: (i) 2 controladores de viremia 1 (CV1), (ii) 7 contoladores de viremia 2 (CV2) e

(iii) 21 não controladores de viremia (NCV). Foi utilizado, ainda, um grupo controle não

infectado pareados em relação ao sexo e idade. Foram dosadas as citocinas IFN-γ, IL-2, 4, 5,

9, 10, 13 e 17. O genoma do vírus foi amplificado por nested-PCR e, posteriormente

sequenciado para a subtipagem e análise de mutações de escape imunológico. As

quantificações de LTCD4+, LTCD8

+, LTCD4

+/LTCD8

+ e carga viral, mostraram diferenças

significantes entre os grupos de portadores de HIV, assim como, com os controles saudáveis,

com exceção do LTCD8+. O grupo CV mostrou maiores quantificações de LTCD4

+ e

LTCD8+. As quantificações de carga viral entre 1001 a 10000 e >10000 cópias/mL

apresentaram diferença estatística entre o grupo CV e NCV. A concentração da citocinas IFN-

γ de perfil Th1 foi maior nos CV em relação aos NCV e de forma inversa para as de perfil

Th2 com maiores níveis em NCV. O grupo dos NCV apresentou níveis mais altos de todas as

citocinas analisadas com significância estatística, com exceção para o IFN-γ que apresentou

níveis mais baixos em comparação com o grupo CV. As amostras pertenciam aos subtipos B e

F. Foi observada pressão seletiva maior no grupo de controladores de viremia que apresentou

maior frequência das mutações de escape imunológico pesquisadas para todos os genes

analisados, sendo encontradas duas mutações novas no gene gag. Apesar de não conseguir

detectar uma associação entre o número de mutações e a progressão da doença, a associação

de altas frequências de mutações de escape, níveis elevados de LTCD8+ e o predominante

perfil Th1 observadas em CV, sugerem que nesses indivíduos a resposta CTL exerce maior

pressão de seleção sobre o vírus, contribuindo para o acúmulo de mutações que,

consequentemente levam a um controle efetivo da viremia pela diminuição do fitness viral.

10

ABSTRACT

HIV-1 infection leads to progressive immune system dysfunction associated with

opportunistic infections and / or neoplasms. For most HIV carriers, the infection is marked by

high viral replication and the decline of TCD4+ lymphocytes (LTCD4

+), triggering AIDS,

which in the absence of ART can lead to death. However, the LTNP (Long-term

nonprogressors) phenotype, elite controller or viremia controller, comprise individuals who

naturally control viral replication without ART while maintaining acceptable LTCD4+ levels.

Thus, the objective was to describe the virological and immunological risk factors among

HIV-1 carriers, according to their characteristics of progression to AIDS. To this end, 30

treatment-naive patients were selected and distributed in three groups considering the time of

infection> 6 years, LTCD4 + count and viral load, being: (i) 2 viremia controllers 1 (CV1) 7

viremia controllers 2 (CV2) and (iii) 21 non-viremia controllers (NCV). We also used an

uninfected control group matched for sex and age. The cytokines IFN-γ, IL-2, 4, 5, 9, 10, 13,

and 17 were dosed. The virus genome was amplified by nested-PCR and subsequently

sequenced for subtyping and analysis of immunological escape mutations. The quantifications

of LTCD4+, LTCD8

+, LTCD4

+/LTCD8

+ and viral load, showed significant differences

between groups of HIV patients, as well as healthy controls, with the exception of LTCD8+.

The CV group showed higher quantifications of LTCD4+ and LTCD8

+. Viral load

quantifications between 1001 and 10,000 and > 10,000 copies/mL presented a statistical

difference between the CV and NCV groups. The Th1 profile IFN-γ cytokines concentration

was higher in the CV in relation to the NCV and inversely in the Th2 profile with higher

levels in NCV. The NCV group had higher levels of all cytokines analyzed with statistical

significance, except for IFN-γ, which presented lower levels compared to the CV group. The

highest selective pressure was observed in the viremia control group, which showed a higher

frequency of the immunological escape mutations studied for all genes analyzed, and two new

mutations were found in the gag gene. Although it is not possible to detect an association

between the number of mutations and the progression of the disease, the association of high

frequencies of escape mutations, high levels of LTCD8+ and the predominant Th1 profile

observed in CV, suggest that in these individuals the CTL response exerts greater selection

pressure on the virus, contributing to the accumulation of mutations that, consequently, lead

to an effective control of viremia by the decrease of viral fitness.

11

1 INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO

Os retrovírus são designados pela sua capacidade de transcrição reversa, sintetizando

uma molécula de cDNA a partir de um RNA (Cullen, 1992). Estes vírus estão amplamente

distribuídos entre os vertebrados, principalmente aves, primatas não humanos e humanos e até

entre os invertebrados como descrito no gênero Drosophila (Varmus, 1988; Knipe, 2001). O

primeiro registro dos retrovírus ocorreu a partir do isolamento do vírus transmissor do

sarcoma das aves, descrito por Peyton Rous em 1911 (Rous & Murphy, 1913; Bishop, 1978).

Entretanto, em 1983, esse grupo de vírus ganhou grande notoriedade com o isolamento do

Vírus da imunodeficiência humana (Human immunodeficiency virus - HIV) pelo grupo do

virologista Luc Montagnier do Instituto Pasteur, em Paris (Barre-Sinoussi et al., 1983).

O HIV é o agente etiológico da Síndrome da imunodeficiência adquirida

(SIDA/AIDS), sendo os primeiros casos registrados na década de 1980 principalmente entre

indivíduos jovens, do sexo masculino, de comportamento homossexual e muitas vezes

usuários de drogas endovenosas, que manifestavam quadros infecciosos causados por

Pneumocystis jiroveci, Citomegalovírus, Toxoplasma gondii, além de linfomas e Sarcoma de

Kaposi (CDC, 1981). Esta síndrome é caracterizada pela disfunção progressiva do sistema

imunológico, sobretudo mediante a depleção dos linfócitos TCD4+, encontrando-se

geralmente associada ao aparecimento de infecções oportunistas e/ou neoplasias (Pantaleo &

Fauci, 1996; Sáez-Cirión et al., 2013).

O isolamento do HIV ocorreu em 1983, quando foi observada a presença de um

retrovírus causador de efeito citopático em amostras de gânglios linfáticos provenientes de

paciente com linfoadenopatias generalizadas e baixo número de linfócitos TCD4+, recebendo

à denominação de Vírus associado à linfadenopatia (Lymphadenopathy-associated virus -

LAV) (Barre-Sinoussi et al., 1983). No entanto, no ano seguinte, Broder & Gallo, (1984)

conseguiram isolar um vírus idêntico a partir de linhagens de células T de pessoas com AIDS

do estado de São Francisco, nos Estados Unidos, denominando-o Vírus linfotrópico de células

T humanas III (Human T-cell lymphotropic virus III - HTLV-III). Em razão da discordância

de nomenclatura, a partir de 1986, o vírus causador da AIDS recebe a denominação de HIV,

proposta pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral – ICTV.

12

1.2 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA VIRAL

De acordo com o ICTV, o HIV pertence à família Retroviridae, subfamília

Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus (ICTV, 2016). O gênero Lentivirus compreende várias

espécies, entre elas as duas espécies de HIV: o HIV-1 e o HIV-2. A morfologia do HIV-1

caracteriza-se por uma partícula medindo 100 nm de diâmetro com a presença de um

envelope lipoproteico derivado da membrana celular do hospedeiro, com as glicoproteínas

como a gp120 (superfície) e gp41 (transmembranar), que são responsáveis pela ligação da

partícula viral ao receptor TCD4+ da célula-alvo (Turner & Summers, 1999).

O HIV possui uma matriz estrutural formada pela proteína p17 que circunda o

nucleocapsídeo viral, formado pela proteína p24, a qual envolve as duas cópias idênticas de

RNA de polaridade positiva, medindo aproximadamente 10 Kilobase (Kb). No interior do

nucleocapsídeo estão presentes as enzimas protease, transcriptase reversa e integrase,

importantes para a replicação do vírus (Vaishnav & Wong-Staal, 1991; Figura 1).

Figura 1 – Morfologia do HIV-1. gp120: glicoproteína 120; gp41: glicoproteína 41; p17:

proteína 17; p24: proteína 24; TR: transcriptase reversa; ssRNA+: RNA de fita simples de

polaridade positiva. (Fonte: Autoral).

13

1.3 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA

O genoma do HIV-1 é constituído de nove genes, sendo gag, pol e env denominados

genes estruturais e responsáveis pela codificação de poliproteínas, que são posteriormente

clivadas em proteínas individuais. Além dos genes estruturais, o genoma do HIV-1 é

constituído por mais seis genes adicionais, também chamados de acessórios, vif, vpr e nef que

constituem a partícula viral, tat e rev que realizam funções de regulação gênica e, por fim,

vpu, que atua indiretamente na montagem da partícula viral (Cullen, 1992; Frankel & Young,

1998; Watts et al., 2009; Figura 2).

Figura 2 – Mapa genético do HIV-1 (Adaptado de Sierra, Kupfer, Kaiser, 2005).

1.3.1 Gene gag

O gene gag codifica uma poliproteína precursora Pr55Gag, denominada com base em

seu peso molecular de 55 kDa, sendo composta por quatro grandes domínios estruturais que

são clivados durante ou após o brotamento das novas partículas virais pela protease viral,

dando origem a proteína de matriz (p17), a do capsídeo (p24), a do nucleocapsídeo (p7) e a

p6, importante para a liberação de partículas virais a partir da superfície da célula. Antes da

clivagem, a p17 constitui o domínio N-terminal da proteína e é essencial para a ligação e

localização da proteína precursora à membrana plasmática (Freed,1998; Inlora et al., 2011).

O processamento proteolítico da proteína precursora Pr55Gag induz uma mudança

conformacional na estrutura da nova partícula viral formada, em que a p17 permanece

associada à parte interna do envelope do vírus, enquanto que a p24 forma um arranjo

estrutural em torno do RNA viral, formando o capsídeo (Freed,1998, Figura 1).

14

1.3.2 Gene pol

O gene pol codifica uma poliproteína precursora de 160 kDa (Pr 160GagPol), a qual é

clivada em produtos que irão dar origem as enzimas virais, tais como a transcriptase reversa

(TR), integrase (IN) e protease (PR; Freed & Martin, 1995). Essas enzimas apresentam função

direta no ciclo replicativo viral, sendo a TR responsável pela transcrição da fita de RNA viral

em uma de cDNA que será posteriormente integrada, pela ação da IN, ao genoma da célula

hospedeira. Já a PR tem como função catalisar a formação da estrutura de um novo vírus,

através da clivagem das proteínas precursoras formadas no final do processo replicativo

(Jacks & Varmus, 1985; Panganiban & Fiore, 1988).

1.3.3 Gene env

O gene estrutural env é transcrito em uma glicoproteína de 160 kDa (gp160) que, ao

final do ciclo replicativo viral é processada pela protease viral gerando duas glicoproteínas

menores, a gp120 de superfície e a gp41 transmembranar, que têm como função intermediar o

reconhecimento e ligação do vírus à célula alvo (Hope & Trono, 2000; Barbour & Grant,

2005).

A evolução de env está relacionada ao surgimento de mutações em consequência da

pressão seletiva do sistema imunológico sobre o gene que é alvo dos anticorpos neutralizantes

específicos contra a infecção. Assim, a resposta desses anticorpos do hospedeiro impulsiona a

evolução através da resposta inicial ao vírus e, posteriormente, às variantes de escape (Arrildt

et al., 2012).

1.3.4 Gene vif

O gene vif codifica uma proteína de 23 kDa com função importante na produção de

partículas altamente infecciosas. Esta proteína está localizada no citoplasma da célula

infectada, sendo expressa tardiamente como um componente do complexo de transcrição

reversa, com função de co-factor para a atividade da enzima transcriptase reversa (Seelamgari

et al., 2004; De Maio et al., 2012).

A presença de mutações em vif tem como consequência a diminuição do potencial

infeccioso do vírus gerado, prejudicando a sua propagação e atenuando as suas propriedades

patológicas (Hassaïne et al., 2001).

15

1.3.5 Gene vpr

O gene vpr codifica uma proteína de 96 aminoácidos (14 kDa) que de acordo com

alguns estudos desempenha um papel crucial na patogênese viral, com função de ativação

viral (Levy et al., 1994), supressão de funções imunológicas (Poon et al., 1998) e a

diminuição dos níveis de linfócitos TCD4+ (Stewart et al., 1997).

A expressão do gene vpr, conduz a parada do ciclo celular na fase G2, seguido por

apoptose. A importância do bloqueio do ciclo celular em G2 se explica pela alta atividade

transcricional da região LTR viral durante essa fase do ciclo celular, aumentando a expressão

gênica. Da mesma maneira, a regulação da apoptose por meio da proteína Vpr ocorre pela

interação direta com a mitocôndria da célula, alterando o equilíbrio entre fatores pró-

apoptóticos e anti-apoptóticos, que contribui para a supressão imunológica e afeta a

patogênese do HIV tanto in vitro quanto in vivo (Andersen et al., 2008; Murakami & Aida,

2014).

A presença de polimorfismo no gene vpr está associado a níveis mais elevados de

oligomerização e um aumento da replicação do vírus em indivíduos com progressão rápida

para a AIDS (Hadi et al., 2014).

1.3.6 Gene nef

O gene nef codifica a proteína citoplasmática Nef de 27 kDa, que se liga à superfície

interna da membrana plasmática, tendo como função a diminuição da expressão de receptores

CD4 na superfície celular, inibindo a re-infecção das células e facilitando a disseminação do

vírus (Delassus et al., 1991; Greenway et al., 2003; Jere et al., 2004).

A proteína Nef também está relacionada com a capacidade de promover a evasão

imune, através da regulação negativa da expressão do Complexo de Histocompatibilidade

classe I (MHC-I), resultando em uma diminuição do reconhecimento das células TCD4+

infectadas pela resposta citotóxica mediada pelos linfócitos T CD8+

(Dirk et al., 2016).

1.3.7 Gene tat

A proteína Tat é transcrita a partir do gene tat, sendo composta por 101 aminoácidos.

Apresenta função de transativador viral potente, essencial para a replicação viral in vitro e in

vivo, atuando no controle da produção e processamento dos genes virais durante a transcrição,

16

aumentando os níveis de transcrição do promotor situado nas sequências LTR do HIV-1

(Liang & Wainberg, 2002).

É uma região imunogênica altamente conservada entre subtipos de HIV, o que a torna

uma excelente candidata para o desenvolvimento de vacinas preventivas e terapêuticas contra

a infecção (Ensoli et al., 2006).

1.3.8 Gene rev

A proteína transcrita pelo gene rev apresenta 19 kDa e é essencial para a replicação

viral (Gergerfelt et al., 2002). Atua na fase após a transcrição do RNA viral, direcionando o

transporte das moléculas de mRNA do núcleo para o citoplasma para a sua subsequente

tradução (Pollard & Malim, 1998; Fernandes et al., 2012).

Mutações no gene rev do HIV-1 implicam na incapacidade de induzir a síntese e

regulação das proteínas virais, portanto, apresentam uma replicação comprometida (Cullen,

1992).

1.3.9 Gene vpu

O gene vpu codifica uma proteína de 16 kDa com função relacionada ao aumento da

taxa de liberação do vírus da célula infectada, facilitando a maturação e montagem do vírus,

além de regular negativamente a expressão do receptor CD4 na superfície celular (Janvier et

al., 2000; González, 2015).

Este gene está presente somente em HIV-1 e não em HIV-2, fato relacionado a uma

patogênese mais branda, com sintomas menos severos na espécie 2 (Strebel et al., 1988).

Além do que mutações nesse gene parecem influenciar numa progressão mais lenta para a

AIDS (González, 2015).

1.4 CICLO REPLICATIVO

O HIV-1 tem tropismo por células que apresentam a molécula CD4 em sua superfície,

sendo que as principais células-alvo do vírus no organismo são os linfócitos TCD4+, além de

macrófagos, monócitos e células dendríticas (Douek et al., 2002, Turville et al., 2002).

A primeira etapa da replicação viral compreende a adsorção do HIV à célula-alvo.

Esse processo de reconhecimento consiste na ligação do vírus ao receptor da célula,

17

permitindo a sua entrada, através da ligação entre duas regiões conservadas da gp120 (C3 e

C4) do HIV ao receptor celular CD4. A ligação gp120/CD4 gera uma mudança

conformacional na proteína do vírus, que permite a exposição do peptídeo de fusão gp41 e a

sua ligação aos correceptores da superfície celular. Dependendo do tropismo viral, os

correceptores celulares podem ser o CCR5 ou o CXCR4 (Freed & Martin, 1995; Gomez &

Hope, 2005; Figura 3).

Figura 3 – Reconhecimento dos receptores virais gp120 e gp41 a membrana de linfócitos T

CD4+ durante a replicação do HIV (Adaptado de Abbas, 2011).

O HIV apresenta uma diferenciação no tropismo celular quanto aos correceptores

utilizados dependendo da cepa. Cepas que infectam, preferencialmente, células com CXCR4,

são denominadas T-trópicas (X4), enquanto que aquelas que infectam células com CCR5 são

denominadas M-trópicas (R5). Assim, as cepas X4 infectam preferencialmente linfócitos T,

enquanto que as cepas R5 infectam preferencialmente macrófagos e a células dendríticas.

Entre essas duas formas as cepas quiméricas X4R5 podem infectar ambas as populações

celulares (Seelamgari et al., 2004; Hoffmann et al., 2007).

Após a fusão do envelope viral com a membrana da célula, ocorre a dissociação do

capsídeo viral e a liberação do genoma e das enzimas virais no citoplasma da célula, alguns

componentes virais liberados se associam e formam um complexo enzimático denominado

Complexo de Pré-integração, composto pela enzima RT, o RNA viral, o RNA transportador

(tRNA), a integrase, p24, p17, p7 e Vpr (Fassati & Goff, 2001). Nesse momento ocorrerá a

transcrição do RNA viral, com a formação de uma molécula híbrida de RNA/DNA e

18

posteriormente uma molécula de DNA complementar (cDNA) pela ação da enzima RT,

utilizando o tRNA como iniciador da transcrição reversa das duas fitas de RNA viral, sendo

ambas degradadas, ao final processo, pela atividade de RNAse H da RT (Miller et al., 1997;

Frankel & Young, 1998; Hu & Hughes, 2012; Figura 4).

A nova fita de dsDNA viral é transportada para o núcleo da célula hospedeira, através

da ação das proteínas Vpr e Vif, que estão associadas ao transporte do complexo de pré-

integração ao núcleo e ao aumento do potencial infeccioso, respectivamente (Frankel &

Young, 1998). Dentro do núcleo, o DNA viral pode permanecer na forma circular não-

integrada ou na forma proviral, sendo essa última resultado da ação da enzima integrase, a

qual irá promover a integração do DNA viral ao DNA da célula hospedeira, caracterizando o

início da fase tardia da replicação do HIV. O provírus gerado pode permanecer na célula

hospedeira em um estado de latência durante meses ou anos ou na forma transcricional ativa

(Miller et al., 1997; Santos, 2008).

A integração do DNA viral é importante para que ocorra a síntese de novas fitas de

RNA viral pela maquinaria celular. O mRNA viral formado é transportado para o citoplasma

e traduzido nas suas poliproteínas. As glicoproteínas do envelope são sintetizadas pelos

ribossomos no retículo endoplasmático e transportadas para a membrana plasmática. As

poliproteínas precursoras Gag e Gag-Pol são sintetizadas e transportadas para a membrana

plasmática por um mecanismo não muito bem elucidado. Nesse momento, a poliproteína Gag-

Pol se associa a duas cópias de fita simples de RNA genômico que constituirá o ácido

nucléico da partícula viral nascente (Freed, 1998). Posteriormente, as glicoproteínas virais do

envelope, são incorporadas nas partículas virais nascentes, ocorrendo o brotamento. Após o

brotamento, a protease viral cliva a poliproteína precursora Gag-Pol e Gag para originar as

suas proteínas individuais, gerando a formação do core e a formaçãode um vírus completo e

infeccioso, capaz de infectar novas células (Freed, 1998; Figura 4).

19

Figura 4 – Ciclo replicativo do HIV (Adaptado de Engelman & Cherepanov, 2012).

1.5 FILOGENIA

Análises filogenéticas apontam a existência de duas espécies antigênicas de HIV: o

HIV-1 e o HIV-2. Estudos sobre o surgimento do HIV sugerem que o vírus entrou na

população humana através de múltiplas infecções zoonóticas, estando intimamente

relacionado com um vírus correlato encontrado em primatas não-humanos, o Vírus da

imunodeficiência símia (Simian immunodeficiency virus - SIV) de linhagens ancestrais

distintas para as espécies do vírus em humanos (Hahn et al., 2000; Sharp et al., 2001).

Para fundamentar a origem filogenética dos vírus, cinco linhas de evidências são

consideradas para a origem zoonótica das duas espécies de HIV, que são: semelhanças na

organização do genoma viral, relações filogenéticas, a prevalência no hospedeiro natural,

coincidência geográfica entre as espécies, e as rotas plausíveis de transmissão. O HIV-2 foi a

primeira espécie de HIV a ter a sua origem zoonótica confirmada, apresentando identificação

evolutiva de acordo com os critérios citados acima: (i) o HIV-2 e o SIV encontrado em

primatas Sooty Mangabei (SIVsm) compartilham uma estrutura de genoma idênticos, com

cada um dos vírus codificando uma proteína acessória, denominadas Vpx, encontrada

somente nesses lentivírus, (ii) cepas de SIVsm e HIV-2 apresentam origem ancestral comum,

não podendo ser separados em linhagens filogenéticas distintas, (iii) os primatas mangabei

20

são numerosos em muitos países do oeste africano e estão infectados com SIVsm com uma

frequência de 22%, (iv) existe uma coincidência geográfica entre o habitat natural de uma

espécie mangabei com as áreas onde HIV-2 é endêmico. Essa espécie de mangabei localiza-se

a oeste do litoral da África do sul no território entre o Rio Casamansa, no Senegal e o Rio

Sassandra na Costa do Marfim, correspondendo com a faixa territorial próxima aos epicentros

de epidemias do HIV-2, (v) Essa espécie de mangabei é frequentemente utilizada como

alimentos, e os animais órfãos são mantidos como animais de estimação, o que aumenta a

frequência de contato com animais possivelmente infectados (Gao et al., 1999; Hahn et al.,

2000).

Hahn e colaboradores (2000) defenderam a origem filogenética de HIV-1 a partir de

linhagem viral de SIVcpz isolada de uma espécie de chimpanzé (Pan troglodytes) que

apresenta evidências de coincidência geográfica com os grupos de HIV-1 (M, N e O), sendo a

transmissão zoonótica favorecida pela prática da caça, comum no oeste da África central.

Além disso, a similaridade da região env de SIVcpz indica que essa espécie esteja

intimamente relacionada com o HIV-1 do grupo N, revelando uma relação filogeográfica

muito próxima entre o vírus de humano e do chimpanzé, sugerindo que o evento de

transmissão ocorreu nos arredores de Camarões, já que ambos são endêmicos dessa região,

reforçando ainda mais essa hipótese.

Devido à elevada taxa de replicação e ao fato da transcriptase reversa não ter

mecanismos de correção na incorporação das bases nitrogenadas, o HIV-1 acumulou uma

considerável taxa de diversidade em seres humanos, originando quatro grupos filogenéticos

distintos: o grupo M (major), de distribuição cosmopolita, grupo N (new), descrito em

Camarões, grupo O (outlier), comumente encontrados no oeste da África e o grupo P (Hahn et

al., 2000, Baesi et al., 2014). Dentro do grupo M, responsável pela maioria de casos de AIDS

em todo o mundo, existem nove subtipos designados pelas letras A, B, C, D, F, G, H, J e K,

juntamente com 61 formas recombinantes circulantes (Baesi et al., 2014).

As formas recombinantes (RF - Recombinant Forms) são o resultado da transferência

de material genético entre dois ou mais vírus de subtipos diferentes em um indivíduo com

infecção mista. Caso a ocorrência de uma forma recombinante tenha sido documentada em

mais de três indivíduos não relacionados, passa a ser denominada como CRF (forma

recombinante circulante - Circulating Recombinant Form; Sharp et al., 2001; Hemelaar et al.,

2006).

21

A divisão em grupos, subtipos e CRF permitiu acompanhar o curso da pandemia do

HIV-1 e evidencia uma distribuição heterogênea dos diferentes subtipos genéticos,

dependendo do país analisado (Vidal et al., 2000). A subtipagem do HIV-1 é um instrumento

epidemiológico útil para o rastreamento da transmissão do vírus e fornece informações sobre

os padrões de divergência genética que pode ter ocorrido durante a evolução viral (Sanabani

et al., 2011).

No Brasil, o subtipo B é o mais prevalente, tendo sido introduzido no Brasil por

indivíduos norte-americanos, estabelecendo-se no grupo de homens que fazem sexo com

homens (HSH). O subtipo F1 foi identificado principalmente em profissionais do sexo e

usuários de drogas, e provavelmente introduzido no Brasil no início de 1980 (Bello et al.,

2006). Embora a maioria das infecções pelo HIV-1 no Brasil seja pelo subtipo B, na região

sul do país o principal foco de infecção é pelo subtipo C, assim como nos Estados de Espírito

Santo, Goiás e Rio de Janeiro (Soares et al., 2003; Almeida et al., 2011; Figura 5).

No norte do País, Machado e colaboradores (2009), analisando as regiões gênicas env

e pol do HIV-1, descreveram a ocorrência do subtipo B e F em amostras de indivíduos

provenientes das cidades de Belém (Pará) e de Macapá (Amapá). Além de descrever pela

primeira vez a ocorrência do subtipo D na região norte (Figura 5).

Figura 5 – Distribuição dos subtipos e CRFs de HIV-1 no Brasil (Adaptado de Brasil, 2014).

22

1.6. EPIDEMIOLOGIA

1.6.1 Modos de transmissão

O HIV pode ser transmitido por meio da troca de fluídos corporais infectados tais

como sangue, sêmen, secreção vaginal e leite materno.

A transmissão sexual pode ocorrer através do contato de secreções contendo o vírus

com membranas mucosas ou pele lesionada durante a relação sexual (Schwartz & Nair,

1999). No Brasil, entre o período de 2007 a 2015 em indivíduos do sexo masculino maiores

de 13 anos de idade, verificou-se que 50,4% dos casos notificados no SINAN (Sistema de

Informação de Agravos de Notificação) estavam na categoria de exposição homossexual,

36,8% heterossexual e 9,0% bissexual. Já entre as mulheres na mesma faixa etária, observou-

se que a categoria de exposição heterossexual foi a responsável pela maioria dos casos

(96,4%; Brasil, 2016, Boletim epidemiológico).

A exposição a sangue contaminado abrange os indivíduos usuários de drogas

injetáveis que compartilham seringas e agulhas, os hemofílicos e os politransfundidos

(Gonçalves, 2006). No entanto, a participação da via transfusional na transmissão do HIV

vem diminuindo, principalmente, com o avanço das metodologias de detecção do vírus nos

bancos de sangue com a incorporação de técnicas mais sensíveis como a biologia molecular,

contribuindo para o aumento da segurança transfusional (Lajolo et al., 2008). A transmissão

pode ocorrer ainda através dos acidentes ocupacionais, tais como acidentes de trabalho em

profissionais da saúde, através de ferimento com material perfuro-cortante contendo sangue

contaminado (Shimoji et al., 2010).

No Brasil, a prevalência do HIV entre usuários de drogas injetáveis tende a diminuir

com o incentivo de política de conscientização mundial para o não compartilhamento de

seringas, correspondendo a 2%. Entretanto, em regiões como Europa Oriental e Ásia Central é

a forma de transmissão mais importante, com índices em torno de 51% (UNAIDS, 2016).

A transmissão vertical ou materno-infantil pode ocorrer durante a gravidez, no

momento do parto ou aleitamento materno e é responsável por 93% das infecções em menores

de 13 anos (Schwartz & Nair, 1999). Segundo o Boletim epidemiológico do Ministério da

saúde de 2016, no período de 2000 até junho de 2016, foram notificados 99.804 casos de

gestantes infectadas pelo HIV, com uma taxa de detecção crescente nos últimos dez anos de

2,1 casos/1.000 nascidos vivos em 2006 para 2,7 em 2015.

23

1.6.2 Prevalência

Estima-se que 36,7 milhões de pessoas viviam com o HIV até 2015 no mundo, com

diferentes prevalências entre as regiões e com um número de 2,1 milhões de novas infecções

pelo HIV em todo o mundo, mostrando um pequeno declínio em comparação ao ano de

2010 que apresentava 2,2 milhões de novas infecções (Figura 6). Ao mesmo tempo, o

número de mortes por AIDS também demonstra declínio, passando de 1,5 milhões em 2010

para 1,1 milhão de mortes por AIDS em 2015 (UNAIDS, 2016).

Figura 6 – Estimativa da prevalência de adultos e crianças vivendo com HIV em 2015 no

mundo (Fonte de dados: UNAIDS, 2016).

O aumento da frequência do comportamentos sexuais de risco em vários países como

Congo, Costa do Marfim, Etiópia, Gabão, Guiana, Ruanda, África do Sul, Uganda, República

Unida da Tanzânia e Zimbabwe estão relacionados com um aumento significativo no número

de parceiros sexuais, assim como um declínio no uso do preservativo na Costa do Marfim,

Nigéria, Senegal e Uganda (UNAIDS, 2013).

No Brasil, 136.945 casos de HIV/AIDS foram notificados no SINAN de 2007 a 2016,

com a maioria dos casos encontrados (52,3%) de infecção nas faixas de 20 a 34 anos (Brasil,

2016, Boletim epidemiológico). Um estudo de prevalência realizado com soldados do

24

Exército Brasileiro, com idade de 17 a 21 anos, detectou o aumento da infecção pelo HIV de

0,09% em 2002 para 0,12% em 2007, com aumento mais significativo entre os HSH, cuja

prevalência subiu de 0,56% em 2002 para 1,2% em 2007 (Szwarcwald et al., 2011).

Do início da epidemia de HIV/AIDS na década de 1980 até dezembro de 2014, foram

identificados 303.353 óbitos no Brasil cuja causa notificada foi a AIDS, com maiores

números na região Sudeste (60,3%), região Sul (17,5%), Nordeste (12,6%), Centro-Oeste

(5,1%) e Norte (4,4%; Brasil, 2016, Boletim Epidemiológico).

1.7 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO

Segundo o último Manual técnico para o diagnóstico da infecção pelo HIV do

Ministério da saúde (2016), o esquema considerado padrão-ouro para a testagem das amostras

de indivíduos com idade acima de 18 meses com suspeita de infecção é composto por dois

testes sorológicos: um de triagem (etapa I) e um confirmatório (etapa II). Esse esquema de

combinação de dois testes tem o objetivo de aumentar a confiabilidade do resultado da

amostra testada.

Os testes da etapa I e II variam de acordo como fluxograma do Manual técnico para o

diagnóstico da infecção pelo HIV (2016). De acordo com o fluxograma 1 do Manual de

diagnóstico do Ministério da Saúde, os testes rápidos são utilizados, principalmente em locais

que apresentam rotinas reduzidas com pequeno número de testagem e em ações de testagem

fora do ambiente laboratorial. Em casos de dois testes rápidos positivos, o indivíduo é

encaminhado para atendimento em uma Unidade Básica de Saúde ou para um Serviço de

Assistência Especializada. Para as amostras com resultado reagente ou indeterminado, é

realizado o exame de carga viral que além de demonstrar a situação atual do paciente, compõe

um terceiro teste e cujo resultado ratifica a presença da infecção (Brasil, 2016, Manual técnico

para o diagnóstico).

1.8 PATOGÊNESE

A história natural da infecção pelo HIV é caracterizada por uma infecção aguda com

altos níveis de carga viral e danos irreversíveis para o sistema imunológico, em particular, o

tecido linfóide associado ao intestino (Moir et al., 2011). Posteriormente, segue um período

de baixa replicação e aumento dos níveis de linfócitos, acompanhada por uma fase crônica

25

com ativação imune persistente e esgotamento dos linfócitos T CD4+, resultando, finalmente,

na progressiva exaustão do sistema imunológico e profunda imunodeficiência, levando a

morte por complicações decorrentes de infecções oportunistas (Berg et al., 2012; Hill et al.,

2012; Olson et al., 2014; Figura 7).

Figura 7 – Evolução natural da infecção pelo HIV-1 em função da contagem de linfócitos T

CD4+ e carga viral (Adaptado de: Kogan & Rappaport, 2011).

Após a entrada, o vírus se estabelece no local primário da infecção, invadindo as

células-alvo presentes no local. A partir dessa população de células infectadas, o vírus é

disseminado para os linfonodos locais e depois para os tecidos linfóides subjacentes,

estabelecendo um reservatório viral, principalmente nos tecidos linfóides (Schwartz & Nair,

1999; Moir et al., 2011; figura 8).

Na fase inicial da infecção, o indivíduo desenvolve um quadro semelhante à

mononucleose aguda ou síndrome gripal dentro de 3 a 6 semanas após o primeiro contato com

o vírus. O seu quadro clínico é caracterizado por níveis elevados de carga viral e uma queda

significativa no número absoluto de linfócitos T CD4+. Em seguida, ocorre a ativação de

linfócitos T CD8+, como uma tentativa de controle da replicação do vírus através da sua ação

26

de citotoxicidade. Durante esta fase, o HIV apresenta uma alta taxa de replicação nos

linfonodos com a liberação contínua de partículas virais e de linfócitos infectados (Kahn &

Walker, 1998, Schwartz & Nair, 1999).

Figura 8 - Estabelecimento e manutenção de reservatório de células TCD4+ infectadas em

latência do HIV. Processo de infecção de células TCD4+

em repouso, com posterior

integração do DNA viral no genoma da célula e replicação, resultando na morte celular por

apoptose natural ou induzida por citotoxidade e formação de reservatório (células TCD4+

em

latência) nos tecidos linfoides (Adaptado de: Moir et al., 2011).

A fase inicial da infecção é seguida por um estado estacionário de replicação viral ou

etapa de latência, com duração de meses a anos dependendo do indivíduo. Essa fase,

geralmente assintomática, é a tentativa de controle através de uma resposta imunológica

específica contra o vírus, limitando em níveis baixos ou indetectáveis de partículas virais

infecciosas no sangue periférico pelo aumento dos títulos de anticorpos neutralizantes contra

o vírus, e também pela ação dos linfócitos TCD8+ (Kahn & Walker, 1998, Schwartz & Nair,

1999). No entanto, apesar dos níveis de vírus circulante serem baixos ainda ocorre, nesta fase,

uma replicação contínua do vírus nos tecidos linfóides, mostrando que o HIV provoca uma

infecção persistente nos indivíduos acometidos (Schwartz & Nair, 1999; Moir et al., 2011).

27

A fase final da infecção pelo HIV é caracterizada por uma profunda imunodeficiência,

com a diminuição acentuada de linfócitos TCD4+ e CD8

+, com o rompimento dos centros

germinativos e dos gânglios linfáticos e, consequentemente, com uma intensa liberação de

partículas virais. Nesse estágio da infecção é estabelecida a AIDS. Seus sinais e sintomas

incluem desde infecções oportunistas de origem bacterianas, virais e fúngicas, febre,

caquexia, prurido maculopapular, suores noturnos, até manifestações clínicas mais severas

como meningite, demência e neoplasias (Kahn & Walker, 1998, Schwartz & Nair, 1999).

1.8.1 Progressão

Para a maioria dos portadores de HIV, a infecção é caracterizada por alta replicação

viral e o declínio de linfócitos TCD4+, provocando o desenvolvimento da AIDS, que na

ausência de terapia antirretroviral pode conduzir o indivíduo a morte (Okulicz et al, 2009).

Esse grupo de indivíduos com progressão normal, ou seja, que desenvolvem AIDS em um

período de, aproximadamente, de 2 a 4 anos após a infecção são denominado de progressores

típicos ou não controladores. No entanto, outros perfis de progressão podem ser observados.

Além disso, dependendo dos critérios adotados para a classificação e análise dos perfis de

progressão, estes podem receber denominações diferentes (Gurdasani et al., 2014) (Figura 9).

Um grupo de portadores de HIV que não segue o curso normal de progressão em

direção à AIDS é denominado de “Não progressores de longo prazo” (LTNP - long-term

nonprogressors) e são definidos com base na sua capacidade de manter níveis de linfócitos

TCD4+ acima de 500 células/mm

3 e baixos níveis de carga viral espontaneamente na ausência

de antirretroviral, durante 7 a 15 anos dependendo da definição usada (Saag & Deeks, 2010).

Dentro dos LTNP existem vários grupos distintos, tais como os controladores de

viremia, que apresentam baixos níveis detectáveis do RNA viral no plasma e os chamados

controladores de elite (CE), que representa o extremo da capacidade de contenção da

progressão à AIDS, mantendo baixos níveis de RNA viral plasmático indetectáveis pelos

métodos convencionais de quantificação (Pereyra et al., 2008).

Nos CE não ocorre progressão clinicamente ou o progresso ocorre em taxas muito

lentas. Estima-se que menos de 1% dos pacientes portadores de HIV-1 pertença a esse grupo,

porém, essa prevalência pode sofrer alterações, influenciada por fatores, como idade, sexo,

histórico de tratamento, etnia e, principalmente, por fatores virais e genéticos do hospedeiro

(Phair et al., 1992; Sheppard et al., 1993; Cao et al., 1995; Paxton et al., 1996; Miura et al.,

28

2009; Abdel-mohsen et al., 2013). Além disso, os critérios empregados para sua classificação

variam de acordo com a fonte utilizada (Saag & Deeks, 2010, Olson et al., 2014; Quadro 1).

Quadro 1 – Definições de controladores de elite encontradas na literatura (Adaptado de Olson

et al., 2014).

Definições

1

HIV ≥ 6 meses, com ≥ 2 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA

(Owen et al., 2010)

2 HIV ≥ 1 ano, com ≥ 1 contagem de <50 cópias/ml de HIV/RNA (Walker, 2007)

3

HIV ≥ 1 ano, com ≥ 1 contagem de <75 cópias/ml de HIV/RNA (Pereyra et al.,

2008)

4

HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens de <2000 cópias/ml de HIV/RNA (Okullicz et

al., 2010)

5

HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA

(Deeks & Walker, 2007)

6

HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA,

sem episódios anteriores ≥ 1000 cópias/ml (Okullcz et al., 2009)

7

HIV ≥ 2 anos, com ≥ 2 contagens de <75 cópias/ml de HIV/RNA (Eriksson et al.,

2012)

8

HIV ≥ 5 anos, com ≥ 5 contagens consecutivas de <500 cópias/ml de HIV/RNA

(Saez-Cirion et al., 2011)

9

HIV ≥ 10 anos, com todas as contagens <50 cópias/ml de HIV/RNA (Lopez et

al., 2011)

10

HIV ≥ 10 anos, com ≥ 90% das contagens <400 cópias/ml de HIV/RNA

(Lambotte et al., 2005)

29

Figura 9 – Características dos fenótipos de progressão à AIDS referidas por diferentes termos na literatura. HIC-1 e HIC-2 referem-se a

definições para controladores de HIV mais utilizadas. TARV, terapia antirretroviral; LTNP, não progressor de longo prazo; LTS, sobrevivência

de longo prazo; NP, não progressor; SP, progressor lento; RP, progressor rápida; EC, controlador de elite; HIC, controlador de HIV; VC,

controlador de viremia; NC, não controlador (Adaptado de Gurdasani et al., 2014).

30

Uma a cada 300 pessoas infectadas, aparentemente, são capazes de controlar o vírus

sem fazer uso de drogas antirretrovirais. Evidências de diferenças na resposta imunológica do

hospedeiro, já foram propostas (Carrington & Walker, 2012). Entretanto, pouco se tem

avaliado acerca do agente viral em sua diversidade. Um estudo com um grupo limitado de

crianças, mostrou substituições nucleotídicas na sequência de vif, que podem contribuir para a

melhor resposta imunológica do hospedeiro, quanto na atenuação do HIV-1 (De Maio et al.,

2012).

Como esperado, indivíduos com carga viral elevada apresentam uma progressão mais

rápida da doença quando comparados com aqueles com menor carga. Assim, os mecanismos

de supressão da infecção nesses indivíduos ainda não são bem compreendidos e podem ser

atribuídos a uma série de características virológicas, imunológicas e genéticas. As explicações

para essa progressão envolvem mecanismos de controle da replicação do HIV que incluem (1)

a baixa suscetibilidade à infecção viral pelos linfócitos TCD4+, (2) infecção por variantes

virais com replicação ineficiente, (3) eficiente controle da replicação viral pelo sistema

imunológico do portador, e/ou (4) regulação da inflamação induzida pelo vírus que limita a

disponibilidade de células-alvos suscetíveis à infecção (Abdel-Mohsen et al., 2013).

Alguns trabalhos foram desenvolvidos para tentar entender esse fenótipo progressor.

Julg et al., (2010) demonstraram dados indicativos de que os linfócitos TCD4+ de

controladores de elite são facilmente infectados com HIV ex vivo, indicando que essas células

não apresentam resistência a infecção e que o vírus isolado desses indivíduos parece ter

replicação competente. Outro trabalho isolando partículas virais de CE observou que os vírus

desses indivíduos apresentam cinética de replicação normal in vitro, mostrando que cepas

virais defeituosas não são a principal causa desse fenômeno (Blankson et al., 2007).

Além disso, fatores genéticos do hospedeiro podem influenciar na eficácia da resposta

imunológica, afetando assim a progressão para a AIDS. Variantes nos genes dos Antígenos

Leucocitários Humanos (HLA) podem estar fortemente associados com o fenótipo LTNP,

como demonstrado no trabalho de Balana et al., (2012). Os genes de HLA de classe I

codificam moléculas da superfície celular de apresentação de antígeno para os linfócitos

TCD8+, assim, as variantes desse gene têm sido relacionadas a níveis elevados de expressão

dessa molécula na superfície da célula, contribuindo para uma apresentação de antígeno mais

eficaz e, consequentemente, um melhor controle da ação viral pelo indivíduo portador de

HIV.

31

Outro fator genético encontrado no hospedeiro é uma deleção de 32 pares de base no

gene que codifica o receptor CCR5 (CCR532). Esta mutação age como um fator limitante

no curso da infecção pelo HIV ao produzir uma proteína defeituosa, que impede a ligação da

gp120 viral com o correceptor na membrana celular, impossibilitando a entrada na célula. A

CCR532 em homozigose reduz o risco de infecção pelo HIV-1, não tendo sido observada

qualquer alteração imunológica para o portador da mutação. A deleção em heterozigose para

este polimorfismo está fortemente associada a uma progressão mais lenta para o estado de

AIDS (Liu et al., 1996; Zimmerman, 1997; Hütter et al., 2009).

Desta forma, o entendimento dos mecanismos de controle da progressão para a AIDS

nos LTNP revela-se um caminho promissor para o desenvolvimento de novos antirretrovirais,

assim como, a elaboração de vacinas que impeçam a progressão ou o estabelecimento da

doença e até mesmo fornecendo modelos para a busca da cura efetiva da infecção pelo HIV

(Pereyra et al., 2008, Abdel-Mohsen et al., 2013, Olson et al., 2014).

1.9 RESPOSTA IMUNOLÓGICA

A resposta imunológica inata constitui a primeira linha de defesa contra patógenos e

estimula a ativação e maturação da resposta adaptativa subsequente (Berg et al., 2012,

Carrington & Alter, 2012). As células dendríticas e as natural killer (NK) são os principais

mediadores da resposta imunológica, estimulando a diferenciação das células T específicas

nos diferentes perfis de resposta Th1, Th2 e Th17 contra agentes infecciosos como o HIV

(Altfeld et al., 2011).

O receptor toll-like 3 presente nas células dendríticas é ativado na presença do RNA

viral e estimula a produção de níveis elevados de IFN-α (interferon alfa), o TNF-α (fator de

necrose tumoral alfa) e as interleucinas 6 (IL-6) e 12 (IL-12), que bloqueiam a proliferação

viral, induzindo a ativação e o recrutamento de outras células do sistema imunológico, tais

como os granulócitos, macrófagos e linfócitos (Ferraz, 2011; Carrington & Alter, 2012). As

células NK agem impedindo a propagação dos vírus circulantes também pela produção de

citocinas como o interferon-gamma (IFN-), combatendo as células infectadas, através do seu

mecanismo de citotoxidade (Altfeld et al., 2011).

A ação do sistema imune inato é importante para a contenção das partículas virais

circulantes, no entanto, apesar da consequente diminuição da carga viral e o aumento do

32

número de linfócitos TCD4+, o sistema imunológico do hospedeiro não é capaz de impedir a

propagação da infecção (Mogensen et al, 2010, Berg et al., 2012).

O desenvolvimento de uma resposta mais específica contra o HIV acontece a partir da

terceira semana após o contato e é caracterizada pela expansão de linfócitos TCD8+

específicos contra o vírus, a fim de conter a infecção (Poropatich & Sullivan, 2011). A

imunidade humoral é dirigida contra epítopos virais e trabalha na produção de anticorpos

neutralizantes das partículas virais circulantes e consequentemente, na diminuição da carga

viral plasmática. Porém, a sua ação no controle da infecção se mostra ineficaz, exigindo alta

produção desses anticorpos (Liu et al., 2011).

Clerici & Shearer (1994) propuseram um modelo em que uma mudança na expressão

de citocinas de perfil Th1 têm efeitos protetores contra a infecção pelo HIV, através da

fagocitose e destruição do vírus, ao contrário do perfil Th2, onde uma resposta humoral

aumentada pode ser adversa e ineficaz na contenção da infecção de patógenos intracelulares,

o que levaria a uma rápida progressão para a AIDS, uma vez que a imunidade celular parece

ser mais eficaz contra as infecções por agentes patogênicos intracelulares.

Nesse contexto, as citocinas têm papel fundamental no direcionamento do tipo de

resposta a ser estabelecida, já que apresentam o papel de mediadores solúveis do sistema

imunológico que regulam eventos como inflamações, alergias, e contribuem na regulação do

sistema imunológico (Soufian et al., 2012).

O perfil Th1 é caracterizado pela produção, principalmente, de IFN-, IL-2 e IL-12,

que promovem respostas efetoras no combate a patógenos intracelulares. Em contraste, o

perfil Th2 é marcado pela produção de algumas interleucinas, tais como IL-4, IL-5, IL-9, IL-

10 e IL-13, que influenciam no desenvolvimento de respostas humorais (Clerici et al., 1996).

Os perfis de diferenciação de células T apresentam respostas antagônicas em relação uma as

outras, com IFN- exercendo efeito supressor na expressão de citocinas de perfil Th2, da

mesma maneira que IL-10 parece promover a diminuição da expressão de citocinas Th1

(Clerici & Shearer, 1993; Roff et al., 2014).

No caso dos LTNP, alguns trabalhos mostraram um significativo aumento na

produção de citocinas de perfil Th1 e redução do perfil Th2, quando comparados com

indivíduos com progressão típica para a AIDS (Clerici et al., 1996). Evidenciando que o

balanço dos perfis é essencial para curso da infecção viral (Soufian et al., 2012).

O perfil Th17 é representado pela interleucinas IL-17, IL-20 e IL-21, que estão

envolvidas na resposta pró-inflamatória contra as infecções microbianas nos tecidos linfóides

33

associados ao trato gastrointestinal (GALT). Estas interleucinas estimulam o recrutamento de

neutrófilos para o sítio da infecção, através da secreção de citocinas e quimiocinas que

promovem a fagocitose e a destruição dos patógenos (Harrington et al., 2005). Ndhlovu et al.,

(2008), observaram que crianças portadoras de HIV com carga viral menor que 50 cópias/ml

apresentavam níveis detectáveis de IL-17, em contraste com aquelas com níveis mais

elevados de viremia, evidenciando que a manutenção dos níveis de Th17 podem auxiliar

numa progressão mais lenta da doença. Em outro estudo, a comparação entre LTNP e

progressores típicos também mostrou aumento do número de células Th17 nos LTNP,

demonstrando que esta citocina pode conduzir a uma resposta imune mais preservada,

principalmente contra infecções bacterianas (Salgado et al., 2011).

Apesar da grande diversidade de estudos sobre os mecanismos imunológicos

envolvidos na resposta contra a infecção pelo HIV, a interação entre os tipos de respostas

Th1, Th2 e Th17 envolvidos na patogênese viral, bem como, a sua relação com as mutações

genéticas encontradas nas cepas de HIV, precisam ser mais bem caracterizadas, a fim de

melhora o entendimento sobre a interação desse conjunto de fatores e sua influência no

desenvolvimento de diferentes perfis de progressão para a AIDS.

1.9.1 Mutações de escape da resposta imunológica

O HIV apresenta uma alta taxa de replicação e não possui mecanismos eficientes de

correção durante a sua transcrição reversa, o que pode inserir muitos erros no seu genoma, o

que contribui para a ocorrência de mutações (Coffin, 1995; Dapp et al., 2013). Embora a

maioria das mutações atribua efeitos deletérios sobre a replicação do vírus e sejam eliminadas

por seleção negativa, algumas mutações conferem vantagem, sendo transmitidas e fixadas

(Domingos & Holland, 1997; Roos & Rodrigo, 2002).

Consequentemente, este aumento contínuo da diversidade genética permite com que o

vírus se adapte rapidamente a uma variedade de pressões de seleção impostas pelo ambiente

hostil e flutuante no interior do organismo do hospedeiro, em meio a fatores de defesa

imunológica dos componentes da resposta tanto inata quanto adaptativa, que tentam conter a

propagação do vírus para evitar o estabelecimento de uma infecção crônica (Koup et al.,

1994; Yu et al., 2004; Boutwell et al., 2011). Esse conjunto de fatores da imunidade do

hospedeiro exerce uma grande força seletiva à condução da evolução e diversificação do HIV

em nível individual e populacional (Migueles et al., 2000; Miura et al. 2009; Le et al., 2014).

34

A imunidade antiviral adaptativa é mediada diretamente por dois fatores: os linfócitos

citotóxicos TCD8+

(CTL), que destroem células infectadas que expressam peptídeos virais

ligados ao MHC (Major Histocompatibility Complex) de classe I e pela produção de

anticorpos neutralizantes pelos linfócitos B (Phillips et al.,, 2001). Esses dois fatores quando

somados, contribuem para a diversidade viral, influenciando na seleção de formas virais

capazes de escapar do sistema imune (Price et al., 1997; Frost et al., 2005; Pillay & Phillips,

2005; O´Connor et al., 2002). Alguns trabalhos mostram que, os anticorpos neutralizantes não

contribuem em longo prazo para a contenção de vírus, provavelmente, devido ao rápido

surgimento de mutantes resistentes à neutralização (Wei et al., 2003; Le et al., 2014).

Com isso, a resposta CTL desempenha um papel central no controle da infecção pelo

HIV (Goulder & Watkins, 2004). Diversos estudos mostraram que mutações de escape da

resposta CTL de uma maneira geral levariam a uma rápida progressão para AIDS (Barouch et

al., 2002; Goulder et al., 1997; Koenig et al., 1995). Em contraste, outros estudos

demonstraram que esse escape desencadeava no decorrer da infecção pelo vírus um controle

subsequente de viremia (Fernandez et al., 2005; Friedrich et al., 2004; Leslie et al., 2004;

Matano et al., 2004). Isso pode ser explicado, pois, o surgimento de mutações de escape das

respostas imunológicas confere um benefício físico claro para o vírus, representando custos

na aptidão viral, o que define o “fitness” viral, que seria a habilidade de um dado genótipo

produzir progênie infecciosa em um determinado microambiente, sendo necessário que ocorra

um balanço entre a seleção de genótipos virais que apresentam mutações de escapes

imunológicos e a eficiência de replicação, sendo muita das vezes características inversamente

proporcionais (Troyer et al., 2005; Quiñones-Mateu & Arts, 2006; Sunshine et al., 2015).

Com isso, fatores associados com a genética do hospedeiro são de extrema

importância para o desempenho viral. Além da mutação CCR532 já citada anteriormente, a

presença de HLA protetivo como o HLA-B*57 e o HLA-B*27 estão associados com menores

cargas virais e progressão mais lenta para a AIDS, enquanto que HLA-B*35 está associado a

rápida progressão da doença (Migueles et al., 2000; Kiepiela et al., 2007; Carrington &

O'Brien, 2003; Lobritz et al., 2011; Le et al., 2014). Estudos ao nível populacional revelaram

que algumas substituições de aminoácidos no vírus são mutações adaptadas ao HLA,

destacando o papel fundamental do sistema imunológico na condução da evolução do HIV-1

in vivo (Carlson et al., 2012; Chikata et al., 2014; Kawashima et al., 2009; Moore et al.,

2002). As mutações CTL podem ser revertidas após a transmissão para outro hospedeiro na

35

ausência de pressão seletiva do HLA protetivo, pois, o custo e benefício para o fitness do

vírus em “manter” essas mutações acaba sendo elevado (Friedrich et al., 2004).

1.10 TERAPIA ANTIRRETROVIRAL

Os medicamentos que compõe a terapia antirretroviral altamente ativa (TARV) têm

como objetivo bloquear a maioria das etapas do ciclo replicativo do HIV, impedindo a entrada

do vírus na célula-alvo ou interrompendo os passos da replicação (Diaz & Vázquez, 2012;

Cohen et al., 2011; Figura 10).

A TARV é uma combinação de medicamentos de diferentes classes, visando aumentar

a eficácia no bloqueio da infecção pelo HIV e diminuindo os níveis plasmáticos do vírus

(Ferreira et al, 2010). Esses antirretrovirais podem ser divididos em cinco diferentes classes:

os inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN), os inibidores da

transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (ITRNN), os inibidores da protease (IP),

os inibidores de fusão (IF) e os inibidores da integrase (INI) (Ferreira et al., 2010; Diaz &

Vázquez, 2012) .

Os ITRN foram os primeiros medicamentos desenvolvidos para o tratamento da AIDS

em 1987. Estes fármacos mimetizam os nucleosídeos naturais existentes nas células humanas,

os quais participam do processo de transcrição reversa do HIV no citoplasma da célula

hospedeira. Durante a formação do DNA proviral pelo processo de transcrição reversa, os

ITRN fosforilados irão competir com os nucleosídeos naturais celulares e, ao serem

incorporados, atuam como terminadores de cadeia, impossibilitando as ligações nucleosídicas

subsequentes, desestabilizando a cadeia e, consequentemente, interrompem o ciclo replicativo

do vírus (Farias et al., 2006). A maioria dos esquemas de TARV utilizam dois ITRN em sua

composição, sendo os principais tipos disponíveis zidovudina, azidotimidina e estavudina,

análogos de timidina, didanosina, lamivudina, entricitabina e o tenofovir (Diaz & Vázquez,

2012).

36

Figura 10 – Sítios de ação dos antirretrovirais durante as diversas fases do ciclo replicativo do

HIV (Gonzalo-Gil et al., 2017).

Já os ITRNN se ligam próximo ao sítio ativo da RT, fazendo com que uma alteração

alostérica na enzima interfira na polimerização, inibindo diretamente a ação da enzima RT.

Os representantes dessa classe são nevirapina (NVP), efavirenz (EFV), etravirina (ETR) e

rilpivirina (RPV) (Diaz & Vázquez, 2012; Günthard et al., 2014).

Os IP foram desenvolvidos em 1995 e possibilitaram a primeira combinação de

medicamentos de classes diferentes para o tratamento da infecção pelo HIV. Esses

medicamentos atuam bloqueando o processo final de clivagem exercido pela protease viral, o

que leva a produção de partículas virais incompletas e que são incapazes de infectar novas

células. Os principais representantes dos IP são o ritonavir, lopinavir, saquinavir e o tipranavir

(Simon et al., 2006; Diaz & Vázquez, 2012).

Os IF atuam antes da entrada do vírus na célula-alvo e tem como função impedir a

ligação do vírus aos receptores celulares, a fim de evitar a entrada da partícula viral no

citoplasma da célula. Um dos representantes desse grupo é a enfuvirtida que consiste em um

37

peptídeo sintético, cuja sequência deriva de uma parte da gp41 do HIV-1. Esta glicoproteína

está envolvida na fusão da membrana viral com a membrana celular do hospedeiro através da

ligação aos correceptores CCR5 e CXCR4. Quando administrado, esse fármaco se liga aos

correceptores de superfície da célula humana, bloqueando a ligação da gp41 viral e

impossibilitando o processo de entrada do vírus e, consequentemente, a sua replicação (Simon

et al., 2006; Diaz & Vázquez, 2012).

Outro IF é o maraviroque, que apresenta a função de bloquear o receptor de

quimiocina CCR5, agindo de forma similar ao enfuvirtida. No entanto, esse fármaco é eficaz

apenas no tratamento de infecções por cepas virais com tropismo para CCR5, sendo assim,

aconselhável a realização de ensaios para determinação do tropismo viral até no máximo três

meses antes do início do tratamento. O uso dos IF é recomendado no caso de indivíduos que

possuem infecção por cepas virais resistentes a múltiplas classes de antirretrovirais (Miranda

et al., 2010; Brasil, 2013, Nota técnica).

Os INI bloqueiam a atividade da integrase que é a enzima responsável pela integração

do DNA viral ao genoma da célula infectada, impedindo com isso a transcrição do DNA viral

pela maquinaria da célula hospedeira. Nesta classe estão inseridos o Raltegravir, Dolutegravir

e o Elvitegravir (Diaz & Vázquez, 2012, Günthard et al., 2014).

A TARV geralmente inicia com a combinação de três fármacos, sendo dois ITRN

associados a um ITRNN ou a um IP. A escolha da TARV deve ser adequada para cada

paciente, levando em consideração o histórico das terapias já utilizadas, histórico de

abandono, perfil de resistência aos antirretrovirais, existência de comorbidades, hábitos e

estilo de vida de cada paciente (Ferreira et al., 2010, Diaz & Vázquez, 2012).

Os critérios recomendados para o início da administração de TARV visam minimizar

os riscos de infecções oportunistas e de transmissão do HIV, promover uma progressão mais

lenta para AIDS e reduzir as chances de óbito (Brasil, 2013, Protocolo terapêutico, Gürthard

et al., 2014). A partir de 2013 o Ministério da Saúde brasileiro tem como política a

abordagem “test and treat”, que enfatiza a utilização dos testes rápidos para o diagnóstico do

HIV e o tratamento antirretroviral nos estágios iniciais da doença, independente da contagem

de linfócitos T CD4+ (Goldman et al., 2014). Essa abordagem visa à redução da

morbimortalidade com o início mais precoce de TARV, além de ser uma importante

ferramenta para a redução da transmissão do HIV, já que a TARV atua diretamente na

diminuição dos níveis plasmáticos da carga viral (Dieffenbach & Fauci, 2009).

38

1.11 OBJETIVOS

1.11.1 Objetivo geral

Descrever fatores de risco virológico e imunológico entre portadores do HIV-1, de

acordo com suas características de progressão para a AIDS, visando relacionar a influência

desses fatores com o desenvolvimento da infecção.

1.11.2 Objetivos específicos

i – Caracterizar os grupos de portadores, quanto ao perfil de progressão de acordo com as

contagens de linfócitos TCD4+, TCD8

+ e a determinação de carga viral plasmática do HIV-1;

ii – Avaliar os níveis de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ entre portadores de HIV-1 com diferentes

perfis de progressão e uma população controle não infectada com o vírus;

iii – Associar a progressão da doença com a determinação quantitativa das citocinas Th1

(IFN- e IL-2), Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13) e Th17 (IL-17);

iv – Identificar os subtipos do HIV-1 nas amostras analisadas;

v – Descrever o perfil das mutações de escape imunológico no genoma viral;

vi – Relacionar as mutações de escape imunológico encontradas com o perfil de progressão.

39

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 TIPO DE ESTUDO E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

O presente estudo é do tipo transversal e retrospectivo, sendo utilizadas amostras

pertencentes ao acervo do Laboratório de Virologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da

Universidade Federal do Pará que foram coletadas no período de 2007 a 2011 na Unidade de

Referência Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias Especiais (URE-DIPE) e

encaminhadas ao laboratório para a realização da contagem de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ e

carga viral plasmática, através da Rede Nacional de Contagem de Linfócitos CD4+/CD8

+ e

Carga Viral do Ministério da Saúde.

A seleção partiu de um banco contendo 300 amostras de indivíduos portadores de

HIV-1 com o diagnóstico confirmado para a infecção. Para a inclusão dos indivíduos nesta

pesquisa estes deveriam ser maiores de 18 anos, de ambos os sexos, com mais de seis anos de

infecção no momento da coleta da amostra, possuir, no mínimo, três anos de resultados de

quantificação de carga viral e linfócitos TCD4+

e TCD8+ e serem virgens de tratamento

(TARV). Ao final da aplicação dos critérios citados acima descritos, obteve-se um

quantitativo de 30 indivíduos que compuseram o número amostral deste estudo, sendo

divididos em três grupos de progressão para a AIDS, de acordo com os critérios contidos no

quadro 2, onde 2 pertenciam ao grupo controladores de viremia 1 (CV1), 7 ao grupo de

controladores de viremia 2 (CV2) e 21 ao agrupo de não controladores de viremia (NCV).

As informações sobre o uso de TARV e esquema terapêutico foram obtidas através da

análise dos prontuários e dos dados incluídos no Sistema de Controle Logístico de

Medicamentos Antirretrovirais (SICLOM) do Ministério da Saúde.

40

Quadro 2 – Critério de classificação dos indivíduos portadores de HIV quanto a sua progressão para a AIDS.

Grupos de progressão para a AIDS Tempo

de

infecção*

Tempo de coleta

de dados

Uso de

TARV

Quantificação

de LT CD4+

Quantificação de

carga viral

Observações importantes

CV1

Controladores de viremia 1

(Controlador de Elite)

> 6 anos A partir de 2007

(c/ mínimo de 3

anos de dados)

Sem TARV > 500 cel/mm³ < 50 cópias/mL Sem episódios de aumento de CV

e quantificação de LT CD4+ > 500

em 90 % das contagens.

CV2

Controladores de viremia 2


(c/ mínimo de 3

anos de dados)

Sem TARV > 500 cel/mm³ ≤ Log 4 (até

10.000

cópias/mL)

Episódios de aumento de CV ou

diminuição de LT CD4+,

independente do nº de

ocorrências, mas c/ remissão

natural, sem intervenção de

TARV e que representem no

máximo 50% das quantificações.

NCV

Não controlador de Viremia


(c/ mínimo de 3

anos de dados)

Sem TARV < 500 cel/mm³ > Log 4 (maior

que 10.000

cópias/mL)

*Compreende o período entre a data da primeira sorologia positiva e a data da coleta da amostra.

41

2.2 GRUPO CONTROLE NÃO INFECTADO COM O HIV-1

Foram utilizadas amostras de um grupo controle de 300 indivíduos não infectados com

o HIV-1, doadores de sangue aptos oriundos do Centro de Hemoterapia e Hematologia do

Pará – Fundação HEMOPA com finalidade de comparar as contagens de linfócitos TCD4+ e

TCD8+. O grupo controle foi pareado por sexo e idade com o grupo de HIV-1.

2.3 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS

A coleta das amostras foi realizada no período de 2007 a 2011 na URE-DIPE,

utilizando um sistema de colheita a vácuo, em tubos de 5 mL contendo EDTA como

anticoagulante. A separação do plasma e massa celular foi feita no Laboratório de Virologia

da UFPA por centrifugação a 3.000 rotações por minuto (RPM) durante 10 minutos e

posteriormente estocadas a -20º C até o momento da realização dos testes.

2.4 QUANTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+ e TCD8

+ E DA CARGA VIRAL

PLASMÁTICA DO HIV-1

Foi realizado o levantamento do histórico das quantificações de LTCD4+ e TCD8

+ e a

carga viral plasmática dos indivíduos infectados, através do banco de dados do Sistema de

Controle de Exames Laboratoriais da Rede Nacional de Contagem de Linfócitos CD4+/CD8

+

e Carga Viral (SISCEL). Foram considerados todos os resultados de exames realizados pelo

indivíduo desde a sua entrada para acompanhamento na Rede Nacional até o momento de

início de TARV, sendo desconsideradas as quantificações posteriores à data de início de

tratamento.

Foi realizada a quantificação de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ do grupo controle não

infectada pelo HIV-1 como parâmetro de comparação.

A determinação da carga viral plasmática foi efetuada seguindo metodologia padrão

da Rede Nacional de Carga Viral do Ministério da Saúde que obedece desde 2013 a

tecnologia de amplificação por PCR em tempo real, utilizando o Kit de Extração Sample

Purific CV HIV-1 (ABBOTT) e o Kit de Amplificação da Carga Viral do HIV-1 (ABBOTT).

As quantificações de carga viral foram trabalhadas em cópias/ml e log10

e divididas em quatro

categorias quantitativas para comparação que são: <50, 51-1.000, 1.001-10.000 e >10.000.

O nível de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ foi determinado através da metodologia de

citometria de fluxo utilizando equipamento BD FACSCalibur e os kits de monitoramento

FACSCountTM Reagents e TriTEST™/TruCount (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA),

42

padrão na Rede Nacional do Ministério da Saúde. As quantificações de linfócitos TCD4+ e

TCD8+

foram trabalhadas em cel/mm3.

2.5 DOSAGEM DE CITOCINAS

As dosagens dos níveis plasmáticos das citocinas foram realizadas para determinação

quantitativa das concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A e IFN-γ

no plasma, utilizando o kit Human Th1/Th2/Th17 Magnetic 8-Plex Panel (Novex – Life

Technologies) e leitura em sistema LUMINEX 200 (Luminex), obedecendo aos protocolos do

fabricante. As quantificações das citocinas foram trabalhadas na unidade de pg/L.

2.6 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

2.6.1 Extração do DNA

A extração do DNA total foi realizada a partir do sangue total das amostras estocadas

com o kit de extração Biopur Mini Spin Plus (Biometrix, Brasil), seguindo os procedimentos

técnicos recomendados pelo fabricante.

2.6.2 Amplificação do genoma viral

O genoma do HIV-1 foi amplificado por NestedPCR, utilizando os iniciadores

descritos por Sierra, Thomson, Ríos et al. (2005), sendo o genoma viral dividido em quatro

regiões, como demonstrado no Quadro 3. A reação de amplificação foi realizada em um

volume de 50 μL contendo 10 ng de DNA extraído, 200 Mm de cada dNTP, 200 nmol de

cada iniciador, KCl2 50 mM, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8,3 e 1 U de Taq DNA

polimerase para ambos os rounds.

2.6.3 Eletroforese

Os produtos das amplificações foram visualizados após eletroforese (100 V/45

minutos) em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase 1,6 M,

Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), contendo 5 µl de

corante GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, 10.000X (Biotium, EUA), mediante a utilização de

transluminador com fonte de luz ultra-violeta.

43

2.6.4 Purificação dos produtos amplificados

Os produtos amplificados foram purificados a partir de fragmento do gel de agarose

para a remoção de impurezas e produtos inespecíficos para não interferir no sequenciamento

das amostras. Para isso, foi utilizado o kit de purificação PureLink Quick Gel Extraction Kit

(Thermo Fisher Scientific, USA), seguindo os procedimentos técnicos recomendados pelo

fabricante.

2.7 SEQUENCIAMENTO

A metodologia empregada para o sequenciamento das amostras foi a plataforma Ion

PGM™ System (Life Technologies) baseado no protocolo para a preparação de amostra Ion

Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation (Life Technologies), capaz de processar

sequências longas de DNA e gerar altas taxas de cobertura no sequenciamento. Para o

sequenciamento foram realizadas as seguintes etapas: Preparação da Biblioteca, preparação

dos moldes e carregamento do chip. As amostras foram carregadas em um chip Ion 314 (Life

Technologies) com capacidade para 100mb de leitura no sequenciamento.

2.8 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS

2.8.1 Edição e alinhamento das sequências

A revisão e alinhamento nucleotídicos para a obtenção das sequências consensos

foram realizadas com auxílio do programa Geneious 8.1.2 (Kearse et al., 2012) e o genoma

foi posteriormente curado manualmente, tendo como referência utilizada para o mapeamento

o genoma viral do HIV-1 (NC_001802).

44

Quadro 3 – Sequência dos iniciadores utilizados para a amplificação do genoma do HIV-1 (Sierra, Thomson, Ríos et al., 2005).

Iniciadores Sequência (5’-3’) Posição

(nt)

Tamanho do produto

(pb)

Temperatura de

hibridização

A1F

A1R

GGGACTTTCCGCTGGGGACTTTC

TTTATGGCAAATACTGGAGTATTGTATGGA

350–372

2711–2740 2.391

55°C A2F

A2R

CGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGC

CTTTTGGGCCATCCATTCCTG

408–433

2590–2610 2.203

B1F

B1R

GCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTT

TCTCCTGTATGCAGACCCCAATATGT

2080–2107

5242–5267 3.188

57°C

B2F

B2R

AGCCCCACCAGAAGAGAGCTT

CCCTAGTGGGATGTGTACTTCTGAACTTA

2157–2177

5192–5220 3.064

C1F

C1R

TACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATA

TGTCTGGCCTGTACCGTCAGCG

4809–4891

7831–7852 3.044

C2F

C2R

CAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACA

GCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACC

4890–4917

7786–7808 2.919

D1F

D1R

TTGAACCAYTAGGAGTAGCACCCAC

AGTCACACAACAGACGGGCACACAC

7696–7720

9641–9665 1.970

58°C D2F

D2R

ACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTG

ACGTGCCCTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCT

7719–7742

9606–9630 1.911

nt, nucleotídeos, bp, pares de bases.

45

2.8.2 Análise filogenética

Para a determinação dos subtipos do HIV-1 as sequências geradas foram submetidas à

análises filogenéticas. As inferências filogenéticas foram realizadas pelo método de análise

Beasiana, através do programa Beast 1.8.2 (Drummond et al., 2012) com um bootstrap

baseado em 1000 reamostragens para determinação da consistência dos ramo.

2.8.3 Identificação de mutações de escape

A seleção das mutações relacionadas à resposta CTL foi realizada com base no banco

de dados de epítopos disponível em Los Alamos HIV Immunology Database

(https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/index.html) e através de artigos disponíveis

na literatura. Para cada indivíduo, foram realizados alinhamentos das sequências de

aminoácidos e analisados manualmente para cada epítopo escolhido. As tabelas com a

descrição as mutações selecionadas para análise seus respectivos epítopos e localizações estão

representados nos quadros 4 e 5.

A qualidade do sequenciamento variou entre as regiões gênicas, o que influenciou no

quantitativo de amostras analisadas, sendo: 16 amostras para o gene gag, 10 para o gene rev,

9 para tat, 10 para o gene nef, 9 para vif , 11 para vpr e 9 para o gene vpu.

2.8.4 Modelagem tridimensional de proteínas

A estrutura proteica tridimensional foi construída utilizando-se a modelagem de

proteínas por homologia através do software Modeller 9.15 (Sali & Blundell, 1993). Com

uma busca inicial e seleção de templates utilizando o Protein Database Bank

(https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), aplicando a sequência da proteína p24 do HIV

como parâmetro inicial. O template selecionado foi o 5HGK. A visualização e produção das

imagens foram realizadas utilizando-se o software PYMOL 1.8 (Delano, 2002).

46

Quadro 4 – Epítopos proteicos do gene gag do HIV que apresentam mutações relacionadas

(aminoácido variante) ao escape CTL e seus HLA relacionados.

Gene Epítopo Posição Aminoácido

original

Aminoácido

variante HLA associado

gag

IW9

146 A P/S B*57, B*13

147 S T B*57

148 I X B*57; B*13

163 A N/G B*57

KF11 166 P Q B*57

TL9

182 Q E/G/T/S B*07; B*42; B*81

184 L X B*81

186 T S B*07; B*42; B*81

TW10

242 T N B*57; B*58

244 Q A B*57; B*58

247 I X B*57; B*58

248 A/G Q/T B*58

NY10 256 I V B*35

KK10

260 E D B*27; B*35

264 R X B*27

268 L M B*27

QW9 310 T S B*57

312 D E B*57

NI9 326 A S B*51

GL9 357 S G B*07

QK10 380 R K B*27

383 F Y B*27

RI9 436 K L/R B*13

437 I X B*13

47

Quadro 5 – Epítopos proteicos dos genes rev, tat, nef,vif, vpr e vpu do HIV que apresentam

mutações relacionadas (aminoácido variante) ao escape CTL e seus HLA relacionados.

Gene Epítopo Posição Aminoácido

original

Aminoácido

variante HLA associado

rev

TY9 17 R K/Q A*03

LI9 21 I F B*57

SL9 71 V G Cw*05

QV9

105 E G A*02

106 P H A*02

108 T P A*02

tat

PW9 7 R S/K A*25

9 E D A*25

NF9

24 N X A*29

29 K R/Q A*29

30 C Y A*29

32 Y/F C/L A*29; Cw*12

CC8 36 V X Cw*12

nef

RM9 71 R T B*07

77 R K B*42

QY9

78 P A B*35

80 T N A*03

81 Y F/H A*03; B*07; B*35

KF9 83 A G B*57; B*58

90 F X B*08; B*57

FT9 120 F Y B*51

125 K X B*51

VL10 184 R K A*02; B*15; B*27

WF9 188 R X B*27

vif

RK10 13 V I

A*03 19 R S/N

SY9 33 K G/Q/R B*15

HI10 50 R K B*07

SV10 55 V T B*07

LL9 81 L M B*35

KK11 159 R T/G A*03; B*27

RK11 166 I V A*03

167 A T A*03

vpr

VL9 32 R K B*27

36 R G/X/W B*27

EI9 37 I L/P/A/V B*07; B*51; B*57

AL9 63 I S/M A*02

vpu

Sítio

conservado

52 S X

56 S X

AA9 75 A V A*2

HL9 82 L M Cw*0102

48

2.11 MÉTODOS ESTATÍSTICOS

A análise estatística foi realizada utilizando dois softwares, GraphPad Prism versão

5.0 e BioEstat versão 5.3 (Ayres et al., 2011).

Todas as contagens de LTCD4+, LTCD8

+ e carga viral disponíveis para todos os

indivíduos foram utilizadas para as comparações. Para comparar as contagens de LTCD4+,

LTCD8+

e suas razões entre os grupos, assim como as diferenças dos níveis de citocina foi

utilizado o Teste Mann-Whitney. O Teste Qui-quadrado e Análise de resíduos foram

utilizados para avaliar a associação da carga viral plasmática de HIV-1 entre os grupos de

controladores (CV) e não controladores (NC).

Para todos os testes estatísticos utilizados o nível de significância considerou-se o

valor de p <0,05.

2.12 ASPECTOS ÉTICOS

O presente projeto foi submetido a aprovação no Comitê de Ética em Pesquisas do

Núcleo de Medicina Tropical – NMT da Universidade Federal do Pará e obedeceu as

resoluções vigentes 196/1996 e 347/2005, ambas do Conselho Nacional de Saúde, conforme

cópia de parecer em anexo (Anexo).

49

3 RESULTADOS

3.1 CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1

3.1.1 Avaliação das quantificações de linfócitos TCD4+ e TCD8

+ e da carga viral

plasmática

As características de sexo e idade dos 30 portadores de HIV-1 que participaram desta

pesquisa estão demonstradas no quadro 6. Para o grupo CV1 o sexo estava distribuído em

uma proporção 1:1 com idade de 52 anos para o homem e 45 anos para a mulher. Em CV2, o

sexo feminino foi o mais numeroso (4/7) com faixa etária de 35 a 53 anos. Já para NCV o

sexo masculino foi o mais encontrado (11/21) com faixa etária de 28 a 68 anos. Estas

informações de sexo e idade foram utilizadas como base para o pareamento dos controles

saudáveis não infectados com HIV como modo de comparação com as quantificações de

linfócitos TCD4+, TCD8

+ e relação entre as contagens de linfócitos TCD4

+/TCD8

+.

Quadro 6 – Distribuição em sexo e faixa etária dos indivíduos portadores de HIV de acordo

como o perfil de progressão para a AIDS.

Grupos de progressão para

a AIDS

Sexo Faixa etária

masculina

Faixa etária

feminina Masculino Feminino

CV1 1 1 52 45

CV2 3 4 34 – 47 35 – 53

NCV 11 10 28 – 68 24 – 68

Foram considerados todos os valores individuais das quantificações de linfócitos

TCD4+ e TCD8

+ presentes no histórico dos pacientes do estudo até o momento do início da

TARV, desta forma, constou no gráfico das quantificações de linfócitos mais de um ponto

(valor da quantificação) por indivíduo. Foram também avaliadas as contagens de linfócitos,

após o pareamento de sexo e idade, de um ou mais indivíduos controles não infectados com

HIV-1. As medianas das contagens de LTCD4+ nos controladores de viremia, tanto CV1 e

CV2, apresentaram valores maiores (839 e 673, respectivamente) em comparação com o NCV

(370; p<0,0001), embora ainda fossem significativamente menores (p=0,0350 e p<0,0001)

quando comparados aos seus controles individuais não infectados (1166, 1114 e 1110,

50

respectivamente, Figuras 11A e 11B), sendo observada diferença estatística, também, entre os

níveis de TCD4+ dos dois grupos de progressão lenta, CV1 e CV2 (p=0,0155; Figura 11A).

Para os linfócitos TCD8+ os maiores valores de quantificações encontravam-se no

grupo CV1 (mediana 1014). Contudo, somente foi observada diferença estatística quando

comparado às medianas dos grupos de portadores de HIV-1 (CV1, 1014; CV2, 903; NC,

915,5) e com seus controles (660, 674, 660, respectivamente), estes últimos apresentando

menores níveis de linfócitos T citotóxicos (Figura 11C e 11D).

A relação de TCD4+/TCD8

+ foi maior e estatisticamente significativa nos grupos de

progressão lenta CV1 (0,73) e CV2 (0,82) quando comparado ao grupo de progressão rápida

NCV (0,42; p<0,0001). Ademais, as medianas dos grupos controles mostraram valores

significativamente maiores que os de seus grupos infectados (1,83, 1,64, 1,76; p<0,0001,

Figura 11E e 11F).

51

Figura 11 – Quantificação de LTCD4+, LTCD8

+ e a relação de LTCD4

+/TCD8

+ entre os

grupos investigados. A, C e E comparação entre os grupos virais (CV1, CV2 e NC); B, D e F

comparação entre grupos virais e um grupo controle não infectado (CTRL) pareado quanto

sexo e idade. *Mann-Whitney (p<0,05).

52

A carga viral plasmática do HIV-1 de CV1 foi consistentemente abaixo do limite de

detecção dos testes utilizados para a quantificação de ácido nucléico viral ao longo do período

de observação. A Tabela 1 mostra a distribuição de frequência de CV (CV1 e CV2) e NCV de

acordo com quatro categorias, variando de indetectável a valores superiores a log104 (>10.000

cópias/mL). A frequência de valores de carga viral indetectáveis e mais baixas (até log102) foi

significativamente diferente entre os dois grupos (análise de resíduos p>1,96, indicando que

há um número menor de pessoas do que o esperado). A frequência de cargas virais mais altas

foi significativamente diferente (análise de resíduos p<1,96, indicando que há um número

maior de pessoas do que o esperado) entre o grupo NCV, conforme medido pela análise de

resíduos.

Tabela 1 – Frequência da carga viral plasmática de acordo com os grupos infectados pelo

HIV-1 (controlador de viremia – CV e não controlador de viremia – NCV) investigados.

Carga viral CV (1+2) % NCV % χ

2 (p)

< 50 13 (+) 22 8 (-) 5

57,01

(<0,0001)

51 – 1000 19 (+) 32 14 (-) 10

1001 – 10000 28 (+) 46 45(-) 32

> 10000 0 (-) 0.0 75 (+) 53

Total 60 100 142 100

Análise de resíduos (para o nível de significância, os valores devem ser > 1,96 ou <-1,96;

nível alfa 0,05); (+) Associação significativa positiva; (-) associação negativa significativa;

CV (1 + 2): controlador de viremia 1 e controlador de viremia 2; NCV: não controlador de

viremia.

3.1.2 Avaliação dos níveis plasmáticos das citocinas

Para a avaliação quanto aos níveis plasmáticos das citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5,

IL-9, IL-10, IL-13 e IL-17, os indivíduos portadores de HIV foram divididos em dois grupos

53

com relação à progressão da doença, CV (CV1 e CV2) e NC, para que fosse possível

comparação e a aplicação de teste estatístico.

O grupo NCV apresentou níveis mais altos para quase todas as citocinas analisadas,

com significância estatística para IL-4 (p=0,0362). No entanto, os níveis plasmáticos de IFN-γ

(mediana de 1 pg/L) foram significativamente mais elevados no grupo CV quando

comparados ao NCV (2,5 pg/L; p= 0,0393; Figura 12A).

Para a avaliação das citocinas em conjunto foi realizada a análise heatmap por perfil

Th1 (IFN-γ e IL-2), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) e Th17 (IL-17) entre os grupos

estudados, sendo possível observar que as maiores concentrações do perfil Th1 (IFN-γ)

ocorreram no grupo dos CV, enquanto que o perfil Th2 foi predominante no grupo NCV. O

perfil Th17 não mostrou concentração acentuada em ambos os grupos, sendo apenas

observadas dosagens aumentadas em amostras pontuais no grupo NCV (Figura 12B).

A comparação entre os perfis imunológicos, Th1 e Th2, dentro do grupo CV não

mostrou significância estatística quando avaliados (Figura 12C). Entretanto para NCV, as

concentrações do perfil Th1 (IFN-γ1 e IL-2

2) apresentaram menores níveis e foram

estatisticamente significativas quando comparado com Th2 entre as citocinas IL-4 (15 pg/L;

p<0,00011; p<0,0001

2), IL-5 (2 pg/L; p=0,0372

1; p=0,0033

2), IL-9 (4 pg/L; p=0,0060

1;

p<0,00012) e IL-10 (4 pg/L; p 0,0157

1; p=0,0025

2; Figura 12D).

54

Figura 12 - Concentração plasmática e comparação das citocinas Th1, Th2 e Th17 nos grupos

investigados. Concentração plasmática de citocinas entre os grupos CV e NCV (A);

comparação dos perfis Th1, Th2 e TH 17 nos dois grupos (B); Comparação dos perfis Th1e

Th2 em cada grupo (C e D). *Mann-Whitney (p<0,05). CV (controladores de viremia); NCV

(não controladores de viremia).

55

3.2 CARACTERIZAÇÃO VIROLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1


A filogenia das 16 amostras sequenciadas foi realizada através da análise da região do

gene estrutural gag, pela comparação entre si das sequências analisadas e com a sequência de

referência, sendo classificadas nos subtipos B (68,75%) e F (31,25%). O grupo CV totalizou 7

amostras sequenciadas que estavam distribuídas em 57,14% (4/7) no subtipo B e 42,86%

(3/7) no subtipo F. Já no grupo NCV foram 9 amostras sequenciadas, sendo 77,78% (7/9) do

subtipo B e 22,22% do subtipo F (Figura 13).

Figura 13 – Distribuição filogenética das amostras dos grupos CV (controlador de viremia) e

NCV (não controlador de viremia).

56

3.2.2 Avaliação das mutações de escape imunológico

Foi analisada a presença de mutações de escape CTL dentro dos genes gag, rev, tat,

nef, vif, vpr e vpu em coletas pontuais de cada indivíduo no período dos anos 2007 a 2011

antes do início de TARV. As sequências obtidas a partir do processamento na plataforma Ion

PGM™ System foram avaliadas para mutações a nível aminoacídico, descritas na literatura e

que conferem escape imunológico durante a infecção pelo HIV.

Para o gene gag foram obtidas 16 amostras de boa qualidade no sequenciamento,

constituindo de 7 sequências do grupo CV e 9 do NCV. Estas sequências foram avaliadas para

24 sítios de mutações selecionados na literatura, onde 12 (50%) foram encontradas em cada

grupo do presente estudo. Além disso, foram identificadas duas mutações novas para esse

gene, uma troca de Alanina para Treonina na posição 146 da proteína p24 (A146T; Figura 14)

em dois indivíduos do grupo CV, tendo esta mutação apenas uma descrição em um trabalho

experimental em 2013 em cultura celular (Martrus et al.) e outra mutação com troca de

Fenilalanina para Leucina na posição 383 da proteína p7 (F383L) em NCV sem descrição na

literatura (Quadro 7).

57

Quadro 7 – Mutações de escape imunológico encontradas no gene gag do HIV-1. CV

(controladores de viremia); NCV (não controladores de viremia). Quadros em azul sinaliza

troca de aminoácidos. *Mutação nova encontrada com descrição na literatura. **Mutação

nova sem descrição na literatura.

58

Figura 14 – Localização da mutação A146T na proteína P24 do gene gag do HIV-1. A –

ampliação do sítio de troca dos aminoácidos Alanina (A146) para Treonina (T146) na posição

146. B – representação tridimensional da proteína P24 com a localização da mutação A146T.

Para os genes regulatórios rev e tat, o número de sequências analisadas variou em

virtude da qualidade do sequenciamento obtido. Para o gene rev foram analisadas 10

59

sequências (4 CV e 6 NCV) para um total de 6 mutações descritas na literatura, sendo

encontradas duas mutações nas posições 17 e 21 do gene em CV, representando um

percentual de 33,34% e uma mutação na posição 21 em NCV (16,66%). Para tat foram

analisadas 9 sequências (4 CV e 5 NCV) para 7 principais mutações descritas na literatura,

onde foram localizadas 6 mutações nas posições 7, 9, 24, 29, 32 e 36 do gene com

distribuição nos grupos de 85,71% (6/7) em CV e 42,86% (3/7) em NCV (Quadro 8).

Assim como para os genes regulatórios, os genes acessórios sofreram variação na

qualidade do sequenciamento, variando o número de sequências analisadas individualmente.

Para o gene nef foi realizada a análise de 10 sequências (5 CV e 5 NCV), sendo pesquisadas

11 mutações de escape e encontradas 6 delas com uma distribuição de 54,55% (6/11) em CV

e 45,45% (5/11) em NCV. Para o gene de infectividade vif, 9 (3 CV e 6 NCV) amostras foram

analisadas para a presença de 9 mutações de escape descritas na literatura, sendo encontrado

66,67% (6/9) de mutações nas sequências analisadas em ambos os grupos. O gene vpr foi o

que apresentou maior número de sequências analisadas com um total de 11 (5 CV e 6 NC),

para a pesquisa de 4 mutações descritas na literatura, tendo sido encontradas 25% em CV

(1/2) e 50% em NCV (2/2). O último gene analisado foi vpu, não sendo encontrada nenhuma

das 4 mutações entre as 9 (3 CV e 6 NCV) amostras analisadas, mostrando-se bem

conservado nos dois grupos (Quadro 8).

60

Quadro 8 – Mutações de escape imunológico encontradas nos genes regulatórios e acessórios do HIV-1. CV (controladores de viremia); NCV (não

controladores de viremia). Quadros em azul sinaliza troca de aminoácidos. Traços indicam a ausência de sequência para o gene.

61

4 DISCUSSÃO

Os indivíduos infectados pelo HIV-1 que permanecem assintomáticos por longos

períodos de tempo e que conseguem manter as contagens de linfócitos TCD4+ normais e

carga viral baixa, estando sem tratamento, são denominados de Não-progressores de longo

prazo – LTNP (Okulicz et al., 2009). Para explicar esse perfil de progressão existem duas

principais teorias: a primeira de que os LTNP estão infectados com uma cepa viral defeituosa

e uma segunda teoria que sustenta uma maior eficácia da resposta imune ao HIV-1 por esses

indivíduos (International HIV Controllers Study, 2010; Martrus et al., 2013). No entanto,

nenhuma das duas hipóteses foi ainda comprovada como responsável por essa forma de

progressão (Pereyra et at., 2008).

Estudos com controladores de elite oferecem uma oportunidade única para

compreender os mecanismos envolvidos no controle natural da infecção pelo HIV e entender

os fatores que afetam o modo de progressão dos indivíduos portadores, fornecendo

conhecimentos cruciais para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e,

principalmente, de mecanismos que bloqueiem a infecção viral, principalmente para o

desenvolvimento de uma vacina eficaz (Blankson et al., 2007; Abdel-Mohsen et al., 2013).

Contudo, os critérios de classificação dos controladores de viremia, incluindo os

controladores de elite, ainda não estão bem estabelecidos (Gurdasani et al., 2014). A

caracterização deste fenótipo raro de pessoas infectadas pelo HIV-1 auxiliaria não somente na

estimativa das prevalências reais desses indivíduos, mas também, na elucidação dos

mecanismos biológicos envolvidos no controle viral (Mellors et al., 1997; Lambotte et al.,

2005; Deeks et al., 2007; Olson et al., 2014).

4.1 FATORES IMUNOLÓGICOS DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES

Após a infecção pelo HIV-1, ocorre a destruição progressiva dos linfócitos TCD4+,

que leva a imunodeficiência severa e, consequentemente, a progressão para a AIDS (Kagan et

al., 2015). Sendo assim, a quantificação dos linfócitos TCD4+ representa uma variável

altamente relevante para o monitoramento dos resultados clínicos das pessoas infectadas com

HIV-1 e de progressão da doença, além, de ser uma ferramenta para a avaliação da

recuperação imunológica após o início da TARV (Hulgan et al., 2007; Eholié et al., 2016).

Para o grupo de controladores de viremia (CV1 e CV2) foram observados níveis

elevados de LTCD4+ em relação ao grupo de progressão típica NC. Os mecanismos

62

envolvidos na lenta progressão da doença nos CV ainda não são totalmente conhecidos, no

entanto, a classificação em não progressores está diretamente ligada a baixos níveis de carga

viral do HIV, o que foi observado para esse grupo, além de níveis aumentados de linfócitos

TCD4+ (International HIV Controllers Study, 2010). O menor nível de linfócitos TCD4

+ nos

NCV pode ser consequência da alta e contínua replicação viral que leva a destruição dessas

células através da ação direta do vírus (Ogg et al., 1998) ou pela ação de células T citotóxicas

sobre as células infectadas, através da liberação de suas enzimas (Hersperger et al., 2010) ou

pelo desencadeamento de mecanismos apoptóticos (Ji et al. 2007; Hermes et al., 2015).

Ademais, os níveis desses linfócitos foram maiores no grupo controle não infectado,

reforçando ainda mais esse conceito.

Dentro dos mecanismos citotóxicos, os linfócitos TCD8+ apresentam a função de um

importante fator relacionado ao controle viral (Schellens et al., 2008; Tansiri et al., 2015).

Para as contagens de LTCD8+, os grupos CV e NCV apresentaram níveis maiores quando

comparados aos dos controles não infectados, devido à estimulação constante do agente viral

(Lambotte et al., 2005). Estudos recentes mostraram que a atividade de supressão mediada

por LTCD8+ in vitro foi significativamente maior nas células do grupo de controladores do

HIV do que em células de indivíduos de progressão típica, demonstrando uma relação inversa

entre a atividade supressora e a carga viral plasmática (Hersperger et al., 2010; Tansiri et al.,

2015; Noel et al., 2016).

Além das contagens de LTCD4+ e LTCD8

+ individuais, outro parâmetro avaliado foi a

relação (razão) entre essas duas contagens. A razão TCD4+/TCD8

+ pode ser entendida como

uma relação entre as características imunológicas versus a sobrevivência do indivíduo, onde

em alguns trabalhos as porcentagens de LTCD8+ aumentam, enquanto que as contagens de

LTCD4+ diminuem com o aumento da idade ou certas doenças (Ferguson et al., 1995; Wikby

et al., 1998). Na população em geral, uma razão TCD4+/TCD8

+ inferior a 1,0 é considerada

como um marcador de imunossenescência e pode representar um preditor da ocorrência de

mortalidade celular, independente da presença de infecção viral (Hadrup et al., 2006),

entretanto, uma razão TCD4+/TCD8

+ invertida é característica da infecção pelo HIV e está

ligada tanto à depleção de células TCD4+

como à expansão da ativação de linfócitos T

citotóxicos (LTCD8+) contra as células infectadas pelo vírus (Sauce et al., 2011; Triplette et

al., 2017). Ainda, valores baixos da razão TCD4+/TCD8

+ (<0,5) estão associados com risco

aumentado de "Eventos não relacionados à AIDS" como doenças cardiovasculares, renais,

enfisema pulmonar e neoplasias (Serrano-Villar et al., 2014; Triplette et al., 2017).

63

Os resultados do presente estudo mostraram que nos grupos virais existe uma inversão

clara da razão TCD4+/TCD8

+, embora em um nível menor entre os controladores de viremia

(CV1 e CV2) quando comparado ao NC, demonstrando a influência de maiores níveis de

carga viral no aumento da atividade citotóxica dos linfócitos TCD8+, intensificando a

depleção dos linfócitos TCD4+ (Hersperger et al., 2010; Tansiri et al., 2015; Noel et al.,

2016). Assim como evidenciado pela diferença estatística entre os grupos controles não

infectados com os seus respectivos grupos virais no presente estudo.

A infecção pelo HIV resulta em uma desregulação dos perfis de citocinas (Kedzierska

& Crowe, 2001). Clerici & Shearer (1994) descreveram que uma ativação das citocinas

associadas ao perfil Th1 (resposta imune celular) desempenha efeitos protetores contra a

infecção pelo HIV, enquanto que uma mudança para uma resposta Th2 aumentada (resposta

imune humoral) pode ser adversa e levar à progressão da infecção para a AIDS, tendo outros

trabalhos corroborando essa hipótese (Klein et al., 1997; Orsilles et al., 2006; Osakwe et al.,

2010). Neste estudo, foi possível observar que as concentrações plasmáticas das citocinas Th2

eram superiores no grupo NCV e citocinas Th1 maiores no grupo CV, confirmando que uma

resposta imune centrada em citocinas Th1, como IFN-γ, resulta em um portador de HIV-1 que

progride mais lentamente para a AIDS, indicando uma provável proteção, pode promover a

fagocitose das células infectadas, estimulando células NK, linfócitos T e uma consequente

eliminação do vírus, além da persistência e replicação viral de baixo nível. A exacerbação do

perfil de citocinas Th2, principalmente IL-4, leva a um aumento da resposta humoral que não

é suficiente para a contenção de agentes infecciosos intracelulares, contribuindo para

multiplicação e uma progressão mais rápida para a AIDS (Clerici & Shearer, 1994; Fenoglio

et al., 2009; Medeiros et al., 2016).

O IFN-γ foi a única citocina que apresentou um nível mais alto no grupo CV. Esta

citocina é secretada, principalmente, pelos LTCD8+

e células NK e desempenha um efeito

importante na ativação direta de células fagocíticas e na regulação da apresentação de

antígenos pelos macrófagos e células dendríticas (Roff et al., 2014), além de indutor de

quimiocinas inflamatórias (MIG e IP-10) que são responsáveis pelo recrutamento de

leucócitos para o local da inflamação e atua na ativação imunológica crônica (Kamat et al.,

2012; Noel et al., 2014). Estudos comparando diferentes grupos mostraram que as citocinas e

quimiocinas inflamatórias eram produzidas em níveis mais baixos entre os controladores de

elite em relação a outros grupos, tais como: controladores de viremia do HIV-1, indivíduos

não infectados pelo vírus e portadores do HIV-1 sob TARV; no entanto, em progressores

64

típicos, os níveis plasmáticos desses marcadores eram sempre mais elevados (Gorenec et al.,

2016; Platten et al., 2016). Ademais, o IFN-γ apresenta alta relevância na diminuição dos

níveis plasmáticos de carga viral, tendo sido sugerido como biomarcador da progressão da

infecção pelo HIV (Sarol et al., 2002; Lambotte et al., 2005).

Foi avaliado o perfil Th17, um subconjunto distinto de células TCD4+, representado

pela citocina pró-inflamatória IL-17, que tem como função a manutenção da integridade da

superfície gastrointestinal, através do recrutamento de neutrófilos e da produção de

antimicrobianos como defensina e mucina (Ndhlovu et al., 2008; Schuetz et al., 2014).

Apesar disso, IL-17 já foi correlacionada a vários distúrbios de natureza autoimunes e

inflamatórios, incluindo asma e alergia (Wong et al., 2001; Molet et al., 2001), psoríase (Li et

al., 2007) e doença inflamatória do intestino (Fujino et al., 2003).

No presente trabalho não foi encontrada significância estatística entre os grupos CV e

NC, o que é contraditório com outros estudos, tendo em vista que os níveis dessa citocina já

foram correlacionados a indivíduos LTNP, a altas contagens de LTCD4+ e baixas de carga

viral (Macal et al., 2008; Ndhlovu et al., 2008; Ciccone et al., 2011), características

compreendidas no grupo CV. Ainda, células TCD8+ que apresentaram medianas maiores nos

grupos de controladores de viremia também são capazes de produzir IL-17 (Huber et al.,

2013). Uma justificativa para esse baixo nível plasmático é que mesmo os indivíduos que

progridem lentamente para a AIDS apresentaram, na fase aguda da infecção, uma depleção

das células TCD4+, principalmente as localizadas na mucosa gastrointestinal, fonte principal

da produção de IL-17, levando à perda da imunidade da mucosa que, por sua vez, se torna

uma fonte de ativação contínua do sistema imunológico inato, mantendo um estado

inflamatório sistêmico persistente (Vidal et al., 2012; Krishnan et al., 2014; Ipp et al., 2014).

4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES


A análise filogenética das sequências de progressores (NCV) e não progressores (CV)

foi realizada a partir da região gênica gag. As 16 amostras estavam distribuídas entre os

subtipos B e F, onde as sequências de progressores lentos não apresentaram uma origem

comum, descartando uma ancestralidade compartilhada de virulência reduzida (De Maio et

al., 2012). O subtipo B é o mais prevalente em regiões como o Leste Europeu, América,

Austrália e em alguns países asiáticos (Louwagie et al., 1994; Kitsutani et al., 1998; Se-thoe

65

et al., 1998; Herring et al., 2003). No Brasil este subtipo também é o mais prevalente, sendo o

subtipo F o segundo de maior predominância (Soares et al., 2003; Bello et al., 2006; Almeida

et al., 2011). Para a região norte o trabalho de Machado et al. (2009) descreveu a ocorrência

do subtipo B e F em amostras de indivíduos atendidos em uma unidade de referência nos

Estados do Pará e Amapá, analisando as regiões gênicas env e pol.

4.2.2 Mutações de escape imunológico

Para a maioria dos portadores de HIV na ausência de TARV, a infecção progride para

a AIDS em um período de, aproximadamente, 2 a 4 anos. No entanto, outros perfis de

progressão podem ser observados (Saag & Deeks, 2010). Essas diferentes formas de

progressão são determinadas pela complexa interação entre fatores genéticos do hospedeiro e

características intrínsecas do vírus ainda não muito conhecidas (Cao et al., 1995; Paxton et

al., 1996; Miura et al., 2009; Abdel-mohsen et al., 2013).

Indivíduos portadores de HIV que demonstram um controle sobre a progressão da

doença na ausência de TARV, como o grupo CV1 e CV2, são raros e os mecanismos

envolvidos no estabelecimento desse fenótipo ainda não foram completamente entendidos.

Contudo, mesmo demonstrando níveis de carga viral indetectáveis no plasma (<50

cópias/mL), metodologias ultrassensíveis evidenciaram que estes pacientes apresentam níveis

basais de replicação, o que permite algum nível de evolução viral, devido ao alto potencial de

variabilidade genética do HIV (Pereyra et al., 2009).

Nesse contexto, um perfil de resposta imunológica Th1 mais robusta nesse grupo,

como evidenciado neste trabalho e em outros, deve refletir numa maior pressão seletiva na

população viral desses indivíduos controladores (Klein et al., 1997; Pereyra et al., 2008;

Platten et al., 2016). Dessa forma, a pressão seletiva da resposta CTL atuaria como uma força

contínua ao longo de toda a infecção, implicando no surgimento de mutações de escape da

resposta imunológica, principalmente nos pacientes com alelos HLA relacionados a não

progressão clínica (Coffin, 1995; Friedrich et al., 2004; International HIV Controllers Study,

2010).

Desta forma, foi possível observar que de uma forma geral, as mutações de escape

imunológico pesquisadas no presente estudo estavam em maior frequência no grupo de

controladores de viremia (CV1 e CV2) para todos os genes estudados, com exceção para o

gene gag que apresentou igual distribuição em CV e NC. As mutações analisadas estão

66

relacionadas a escapes na apresentação de antígenos pelo MHC de classe I, que ativa a

resposta dos linfócitos TCD8+ (Kløverpris et al., 2016).

As mutações analisadas no gene gag, estão situadas principalmente na região da

proteína p24 do capsídeo viral, que consiste em uma proteína conservada, sendo assim, as

mutações de escape CTL que ocorrem nessa região estão sob forte pressão de seleção (Yusim

et al., 2002). Foram pesquisadas 24 mutações de maior relevância na literatura, sendo

encontradas 12 delas nos grupos analisados. A mutação na posição 146 (A146X/P/S) está

relacionada ao escape de processamento dos epítopos virais (Draenert et al., 2004; Naruto et

al., 2011). No entanto, a mudança encontrada nessa região de alanina para treonina, no

presente trabalho, não foi ainda descrita espontaneamente em amostras humanas. Matrus et al.

(2013) através de manipulação genética do vírus, observou que diferentes graus de

modificações no gene de gag, incluindo a mutação em questão, produziu um vírus com

capacidade replicativa significativamente menor em culturas de células.

Entre as mutações encontradas no epítopo TW10, a substituição de treonina por

asparagina no resíduo 242 (T242N) representa um escape CTL bem conhecido e importante

ligado ao HLA-B*57B e resulta na perda do reconhecimento do epítopos pela resposta CTL,

contudo, a sua presença implica em um vírus com capacidade de replicação comprometida

(Martinez-Picardo et al., 2006). Estudos anteriores identificaram a mutação A/G248 associada

à compensação do escape induzido por T242N, por induzir parcialmente a recuperação da

aptidão replicativa, no entanto, a mutação T242N não foi encontrada neste trabalho (Leslie et

al., 2004; Martinez-Picado et al., 2006; Brockman et al., 2007).

A variação A/G248 quando sozinha acarreta pouco ou nenhum custo para o vírus, não

sendo uma variante efetiva de escape, o que traz apenas uma perda parcial de reconhecimento

do epítopo, o que ocorre geralmente em infecções pelo subtipo B e quando o tipo de HLA não

apresenta grande pressão de seleção do sistema imunológico. Esta mutação também está

associada à troca de isoleucina na posição 256, independentemente do tipo de HLA, a

associação das duas mutações é forte, porém, ambas com baixo custo replicativo para o vírus

(Martinez-Picado et al., 2006).

O epítopo KK10 de p24 é uma região imunodominante particular relacionada ao HLA

B*27, onde o surgimento de mutações de fuga dentro deste epítopo tem sido relacionado ao

aumento da replicação viral e a progressão para a AIDS (Goulder et al., 1997; Kelleher et al.,

2001). Mutação nesse epítopo foi encontrada em dois indivíduos todos do grupo CV, sendo

um deles CV1, o que vai de encontro ao perfil de progressão em que eles foram classificados.

67

Porém, já foi relatado que indivíduos HLA B*57 são capazes de controlar o vírus mesmo na

presença da mutação (Leslie et al., 2004), uma indicação de que esses dois controladores

apresentam um HLA protetivo, o que não pôde ser investigado no presente estudo.

O epítopo QW9 diminui o reconhecimento pelo LTCD8+ (Sanchez-Merino et al.,

2005) e estão mais presentes entre as sequências do subtipo B com maior ocorrência em

progressores do que em LTNP. Porém, Migueles et al. (2003) não encontraram diferenças de

resposta citotóxica entre LTNP e progressores, sendo possível que as diferenças possam estar

na sinergia com a resposta específica para outros epítopos mutantes já que a resposta a um

único epítopo pode não ser uma representação precisa do panorama global da resposta T

CD8+ do paciente ao HIV.

O epítopo RI9 é intimamente relacionado ao HLA B*13 e está localizado dentro da

proteína p1 em gag, sem apresentar função específica atribuída. No entanto, a sequência p1

faz parte do RNA ribossomal viral que atua diretamente na clivagem da poliproteína

precursora Gag-Pol, onde se supõem que mudanças nessa região afetaria a montagem da

partícula viral, gerando um acúmulo de precursores Gag-Pol não processados (Fellay et al.,

2007; Goonetilleke et al., 2009). Estudo anterior mostrou que a variação de aminoácidos nos

resíduos 436 e 437 de gag é responsável por reduzir o reconhecimento de CTL, apesar de

ocorrer perda significativa de aptidão replicativa nos mutantes (Prado et al., 2009).

A troca aminoacídica de fenilalanina para leucina na posição 383 de p7 em gag ainda

não apresenta descrição na literatura, tendo sido encontrada em um indivíduo NCV no

presente trabalho. No entanto, a troca na mesma posição de fenilalanina para tirosina já está

documentada e relacionada à perda de reconhecimento pela resposta CTL (Kløverpris et al.,

2016). Com base no conhecimento de que esta proteína apresenta papel estrutural na

formação do nucleocapsídeo do HIV, além de funções adicionais críticas para a replicação

viral, modificações nessa região podem resultar em um vírion defectivo, com montagem

anormal que podem ocasionar a internalização ou maior exposição dos epítopos virais,

dificultando o reconhecimento ou ainda aumentando a reatividade da proteína, impactando

diretamente na interação com sistema imunológico (Maynard et al., 1998; Goel et al., 2002).

Os genes acessórios e regulatórios também foram analisados para mutações de escape

CTL. O gene rev é essencial para replicação viral, pois é o responsável pela exportação de

RNA viral não processado ou incompletamente processado do núcleo para o citoplasma.

Neste trabalho foram encontradas duas modificações nas posições 17 e 21 em um domínio

básico, originalmente rico em arginina, que tem a função de ligação especifica a uma região

68

do complexo secundário do RNA, denominado RRE, que medeia a exportação do mRNA do

núcleo para o citoplasma, onde são traduzidos para produzir proteínas virais essenciais

(Fernandes et al., 2012). A maior diversidade de mutações estava presentes no grupo CV na

posição 17, que apresentam menor carga viral, o que corrobora com o trabalho de Rousseau et

al., (2008) que associou a presença da variante com menores cargas virais, sugerindo um

custo de aptidão da mutação para o vírus.

Para o gene tat foram encontradas seis das sete mutações pesquisadas, com maior

frequência no grupo CV. Os estudos mostram que a proteína Tat é particularmente eficaz no

controle replicação do vírus in vivo (Allen et al., 2000; O’Connor et al., 2002; Stittelaar et al.,

2002). O epítopo CC8 foi indicado como indutor de escape imunológico da resposta CTL,

onde os mutantes apresentaram aumento de 41% na probabilidade de sobrevivência e

replicação em relação ao tipo selvagem em um estudo longitudinal que analisou 15 diferentes

momentos de coleta de amostras nos primeiros três anos de infecção de um portador de HIV

(Liu et al. 2006). Para a mutação na posição 32 (NY9) na sequência da proteína Tat ocorre o

bloqueio do processamento da Epítopo MY9 adjacente à região, este epítopo apresenta alta

imunogenicidade para indivíduos com o HLA B*15 relacionado. As respostas CTL que

dirigiram seleção completa mais rápida para mutações de escape foram direcionadas contra os

epítopos NY9 e MY9 no trabalho de Jones et al. (2004).

A proteína Nef está envolvida na baixa expressão do receptor CD4 na superfície da

célula infectada e, consequentemente, contribui para a rápida progressão à AIDS (Hua et al.,

1997). Foi observado que as amostras analisadas do grupo NCV estão mais conservadas em

relação às sequências dos CV, uma vez que essas últimas apresentaram maior número de

mutações. Esta maior frequência de mutações em não progressores também foi demonstrada

por Kirchhoff et al. (1995) que analisaram sequências gênicas de nef de cinco pacientes

LTNP, encontrando elevado número de formas mutantes, gerando a atenuação da partícula de

HIV-1. Esses resultados indicam que a presença de mutações de escape imunológico nessa

região gera um vírus com baixo fitness, contribuindo para a ausência da progressão da doença

em algumas pessoas (Deacon et al., 1995).

O gene vif codifica uma proteína que é central para a replicação do vírus devido a sua

capacidade de neutralizar a proteína antiviral APOBEC3 do hospedeiro (De Maio et al.,

2012). Esta proteína apresenta grande importância para a otimização da capacidade

replicativa, atuando como componente integral do complexo de transcrição reversa na função

de co-fator da atividade da enzima transcriptase reversa, dessa forma, sendo relevante para a

69

determinação do tempo de progressão para a AIDS (Kataropoulou et al., 2009). No trabalho

de Hassaïne et al. (2001) foi demonstrado que a proteína tirosina quinase (Hck) foi capaz de

inibir produção e a infectividade do vírus vif mutante, mas não do vírus do tipo selvagem,

demonstrando, o papel de algumas mutações na perda da efetividade da proteína. Ronsard et

al. (2015) observaram que as mutações nas posições 166 e 167 de Vif podiam afetar a

infecciosidade viral quando analisaram sequências de indivíduos do norte da Índia. Rousseau

et al. (2008) associaram a variante da posição 33 a menores cargas virais, sugerindo um custo

da mutação na aptidão do vírus. De maneira semelhante, um estudo de caso nos Estados

Unidos mostrou o mapeamento viral de mãe e filha (transmissão congênita) progressoras

lentas, sendo identificada uma inserção de dois aminoácidos em Vif, que reduz, em 20x, a

capacidade replicativa do vírus em PBMC in vitro. No entanto, após a remoção da mutação a

eficiência de replicação foi restaurada para níveis equivalentes ao do vírus selvagem,

sugerindo um mecanismo de perda de função de Vif. Além disso, o mapeamento mostrou que

os vírus de mãe e filha apresentavam alta identidade, apesar de passados 15 anos da gestação,

evidenciando a manutenção do vírus mutante, provavelmente por este causar uma infecção

mais branda (Alexander et al., 2002).

A proteína Vpr está associada a uma variedade de funções biológicas, incluindo a

permanência da célula na fase G2 do ciclo celular, indução de apoptose, importação nuclear

do complexo pré-integração, modulação da expressão gênica e supressão da ativação imune

(Andersen et al., 2008). Para esta proteína foram analisadas quatro mutações descritas na

literatura, sendo encontradas modificações nas posições 37 e 63.

Assim como no presente trabalho, estas mutações foram observadas no estudo de Hadi

et al., (2014) que analisaram 192 sequências de indivíduos LTNP e 102 de progressores

rápidos contidas no banco de sequências Los Alamos e encontrou a troca de Isoleucina para

Serina (posição 63) somente em progressores rápidos, porém, na posição 37 não houve

diferença na frequência da mutação entre os grupos, semelhante a distribuição observada aqui

para ambas as mutações. Esses resultados indicam que as mutações associadas no gene vpu

podem prejudicar o bloqueio da célula no estado estacionário G2 do ciclo celular, que estão

mais frequentes em LTNP do que em progressores rápidos, já que o bloqueio em G2,

provavelmente, proporciona condições favoráveis para expressão viral, o que facilita a

replicação viral, além de induzir ao escape imunológico, evadindo da detecção,

principalmente, por células NK, por facilitar a formação de reservatórios virais. No entanto,

os mecanismos envolvidos nos fenômenos acima ainda não estão bem esclarecidos.

70

Pacientes infectados com o HIV-1 que apresentam mutação em Vpr apresentam

progressão mais lenta para a AIDS (Lum et al., 2003; Saksena et al., 1996; Wang et al.,

1996), em consequência do seu efeito na desregulação das principais vias imunológicas,

incluindo apresentação de antígeno, produção de citocinas e ativação de células T (Majumder

et al., 2005; Muthumani et al., 2002). No entanto, o efeito direto de Vpr em células T

infectadas e suas funções imunes não são claramente compreendidos.

Por fim, a análise de mutações no gene vpu para ambos os grupos de progressão,

demonstrou alto índice de conservação das sequências, não sendo encontradas alterações

aminoacídicas. A proteína Vpu possui um domínio citoplasmático hidrofílico que consiste em

duas alfas hélices unidas por uma região de dobradiça formada pelo motivo DSGNES

conservado (serinas S52 e S56) que necessita ser fosforilado para exercer a função de

degradação de moléculas CD4 recém-sintetizadas ainda no citoplasma da célula (Janvier et

al., 2011; González et al., 2015). Além disso, a Vpu exerce um papel de potente antagonista

do fator de restrição CD317/tetherina que evita a liberação de partículas virais e de modulação

da expressão receptores de MHC I na superfície celular e ainda diminui a ativação de células

NK. No estudo de Chen et al. (2015) também não foi possível demonstrar diferenças

significativas entre as sequências de indivíduos com formas diversas de progressão, dessa

forma, os autores sugerem que ausência de diferenças entre os dois grupos se deve a ampla

importância da função exercida pela proteína Vpu, onde qualquer mutação ocorrida na região

sofreria grande pressão de seleção do sistema imunológico sobre a proteína mutante,

dificultando o seu estabelecimento.

A partir dos resultados obtidos no presente trabalho é possível sugerir que a

progressão da doença induzida pelo HIV-1 é regulada por vários fatores virais e do

hospedeiro que trabalham em sinergia. A grande ocorrência de mutações de escape em

controladores a infecção pelo HIV, em parte, está relacionada aos custos acumulativos dessas

mutações na aptidão viral. Vários estudos associaram mutações de escape CTL em p24 Gag

com progressão lenta da doença como resultado dos custos no fitness incorridos por essas

mutações (Schneidewind et al., 2009; Brockman et al., 2007; Miura et al., 2009).

Este estudo demonstra que as respostas de CTL nos hospedeiros, provavelmente,

influenciam fortemente a evolução viral durante a infecção pelo HIV-1. Esse tipo de cenário

fornece alguma indicação de que as vacinas terapêuticas que induzem respostas robustas para

epítopos conservados, como a p24, podem aumentar a pressão de seleção para os vírus,

conseguindo, dessa forma, diminuir a replicação viral em longo prazo.

71

Apesar de não conseguir detectar uma associação entre o número de mutações e a

progressão da doença, o panorama da associação de altas frequências de mutações de escape

de CTL, níveis elevados de linfócitos TCD8+ e o predominante perfil de citocinas Th1

observadas em CV, sugerem que nesses indivíduos a resposta CTL exerce pressão de seleção

considerável sobre o vírus e que essa pressão, pode contribuir para o acúmulo de mutações

que, consequentemente, levam a um controle efetivo da viremia durante a infecção, pela

diminuição do fitness viral, como evidenciado no trabalho de Goonetilleke et al. (2009). No

entanto, a subtipagem do HLA proporcionaria uma importante ferramenta de análise da

pressão seletiva do sistema imunológico desses indivíduos.

A falta de consenso na classificação dos indivíduos de progressão lenta impossibilita,

muitas vezes, a correlação de resultados de pesquisas científicas pela heterogeneidade nos

critérios empregados pelos autores (Okulicz et al., 2009). Com base nisso, este trabalho

propôs o estabelecimento de critérios unificados no estudo deste tipo de população e

conseguiu demonstrar diferenças claras entre os grupos estabelecidos.

72

5 CONCLUSÕES

- Os maiores níveis de TCD4+ e TCD8

+ foram associados aos controladores de viremia (CV1

e CV2);

- Os níveis de linfócitos TCD4+ foram superiores no grupo controle (não infectado) quando

comparados aos dos grupos de portadores do HIV (CV e NCV), enquanto que os níveis de

linfócitos TCD8+ foram maiores nos grupos virais;

- A relação de LTCD4+/TCD8

+ foi estatisticamente significativa nos grupos de progressão

lenta CV1 quando comparado ao grupo de progressão rápida NCV e nos grupos controles

mostraram valores significativamente maiores que os dos grupos infectados;

- A carga viral plasmática do HIV-1 de CV1 foi consistentemente abaixo do limite dos testes

utilizados para a detecção de ácido nucléico viral ao longo do período de observação,

enquanto que NCV apresentaram cargas virais mais elevadas;

- As concentrações plasmáticas das citocinas Th1 e Th2 foram superiores nos grupos CV e

NCV, respectivamente, no entanto, para o perfil Th17 (IL-17) não houve diferenças

significativas entre os grupos;

- Os subtipos virais B e F foram igualmente encontrados em ambos os grupos CV e NCV, o

que não indica origem filogenética comum entre os progressores lentos;

- Foi observada maior pressão seletiva no grupo de controladores de viremia, caracterizada

por elevada frequência das mutações de escape imunológico pesquisadas;

- As mutações analisadas no gene gag estavam em igual número nos dois grupos de

progressão (CV e NCV), porém, essas mutações representam baixo custo replicativo para o

vírus;

- Foram encontradas duas mutações novas nas proteínas p24 e p7 do gene gag, uma

substituição de alanina para treonina na posição 146 e uma de fenilalanina para leucina na

posição 383;

73

- As modificações no gene rev estavam mais presentes no grupo CV que apresenta menor

carga viral, sendo duas modificações, nas posições 17 e 21 em um domínio básico, que

medeia a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma;

- Foi observada uma maior frequência de mutações no gene tat no grupo CV;

- Foi observado que as amostras do grupo NCV estão mais conservadas em relação às

sequências de CV para o gene nef;

- O gene vpr foi o que apresentou maior número de sequências analisadas, onde foram

encontradas 2 mutações tanto em CV quanto em NC;

- A análise de mutações no gene vpu, para ambos os grupos de CV e NCV, demonstrou alto

índice de conservação das sequências, não sendo encontradas alterações aminoacídicas.

74

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APÊNDICE

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ANEXO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PROGRAMA DE PÓS … · Agradeço aos demais amigos Bárbara, Mike,...

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