UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE PÓS … · para ser cada dia melhor, pois bondade...
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE PÓS … · para ser cada dia melhor, pois bondade...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANA GEORGINA OLIVEIRA PONTES
ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E
FARMACOLÓGICOS
FORTALEZA
2015
ANA GEORGINA OLIVEIRA PONTES
ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E
FARMACOLÓGICOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia,
Odontologia e Enfermagem da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas. Área de concentração:
Biologia para a Saúde.
Orientadora: Profª. Dra. Mary Anne Medeiros
Bandeira
Co-orientadora: Profª. Dra. Nirla Romero
Rodrigues
FORTALEZA
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde
P858e Pontes, Ana Georgina Oliveira. Estudo farmacognóstico das raízes de ipeca-da-praia (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza):
aspectos botânicos, químicos e farmacológicos. / Ana Georgina Oliveira Pontes. – 2015. 92 f.: il. color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará; Centro de Ciências da Saúde; Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem; Departamento de Farmácia; Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas; Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Fortaleza, 2015.
Área de Concentração: Biologia para a Saúde. Orientação: Profa. Dra. Mary Anne Medeiros Bandeira. Co-Orientação: Profa. Dra. Nirla Romero Rodrigues. 1. Raízes de Plantas. 2. Farmacognosia. 3. Inulina. I. Título. CDD 615.321
ANA GEORGINA OLIVEIRA PONTES
ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E
FARMACOLÓGICOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia,
Odontologia e Enfermagem da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas. Área de concentração:
Biologia para a Saúde.
Aprovada em: 14 / 12 / 2015
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________ Profª. Drª. Mary Anne Medeiros Bandeira (Orientadora)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
__________________________________________________________ Profª. Drª. Fabiana Pereira Soares
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA
__________________________________________________________ Profª. Drª. Regina Claudia Matos Dourado
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA
À minha família, em especial:
Ao meu querido pai, José Maria, pelo seu
exemplo de luta, de perseverança, de
dignidade e amor pela vida.
À minha querida mãe, Joaquina Vilmaci, que
com seu amor incondicional e sua força de
superação foi e é uma grande inspiração para
eu chegar até aqui.
AGRADECIMENTOS
À Deus, fonte inesgotável de luz, força e amor.
À Profª. Drª. Mary Anne Medeiros, pela orientação, dedicação, confiança e tantos
aprendizados ao longo desses bons anos de convivência entre nós e com as raízes de ipeca da
praia. Sua atitude acolhedora, paciente, persistente são exemplos de sabedoria de vida que
trarei comigo com carinho.
Ao meu esposo Daniel Costa nos diversos momentos presentes, na coleta do material vegetal
comigo ao sol a pino, de importância fundamental, na presença ao meu lado nos momentos
que muito precisei de uma força amiga, sincera e compreensiva.
À minha família, nas pessoas do meu irmão Daniel Pontes, minha mãe Joaquina Vilmaci e
meu pai, José Maria pelo apoio incondicional em todos os momentos.
À minha irmã Mariana pela compreensão dos meus momentos ausentes.
À Profª. Drª Nirla Rodrigues Romero, pela co-orientação, seu jeito autêntico, leve e agradável
na disponibilidade de auxiliar e contribuir com o enriquecimento desse trabalho sempre que
possível.
Ao Prof. Dr. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, com sua sabedoria compartilhada, paciência de
ouvir tantas dúvidas e alegria de ensinar e contribuir de forma valorosa, além de ceder um
espaço do Laboratório de Farmacotécnica por todas as vezes necessárias na realização de
ensaios.
Ao Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães, que gentilmente me acolheu em seu laboratório e
contribuiu com sincera dedicação na obtenção dos resultados farmacológicos.
A Profª Drª. Judith Pessoa de Andrade Feitosa do Laboratório de Polímeros do Departamento
de Química e seus bolsistas Venícios e Natália Pires.
Profª. Drª. Arlete Aparecida Soares, do Departamento de Biologia – Anatomia Vegetal, por
sua contribuição valorosa nesse trabalho, a quem reconheço sincera dedicação.
Ao técnico do laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia, Robson de
Jesus Mendes, por seu imprescindível auxílio, assim como à Doutoranda Ana Lúcia Castelo
Branco do Laboratório de Anatomia Vegetal.
Aos doutorandos Franzé Batista e Terezinha Brito que tiveram muita paciência para me
ensinar e pela convivência agradável no LAFARMULI.
À mestranda Aparecida Josino (Cida) e ao Técnico do laboratório de Farmacotécnica,
Ederson Laurindo, pelo auxílio em diversos momentos.
Às colegas de pós-graduação Gabrieli da Penha Bezerra e Wellyda Rocha Aguiar pelo
companheirismo nessa jornada, que muitas vezes parece uma aventura, por vezes bem
desafiadoras e outras de agradáveis aprendizados, que é a pós-graduação.
À Karine e Érica bolsistas de iniciação científica do laboratório de Farmacognosia pelo
auxílio em diversos momentos.
À D. Lourdes pela agradável companhia em diversos momentos, dentre eles, na coleta das
raízes, e sua prontidão em auxiliar sempre que possível.
Aos servidores Dino e “Seu” Geo pela disponibilidade de me acompanhar em diversos
momentos à praia da Tabuba para proceder à coleta do material vegetal.
Aos amigos e familiares que me auxiliaram de uma forma direta ou indireta nessa jornada de
baixos e altos que é a pós-graduação.
Ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso de Ressonância Magnética Nuclear -
CENAUREMN.
À Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa e Desenvolvimento Científico, pela concessão da
bolsa acadêmica.
Procuro semear otimismo e plantar sementes
de paz e justiça. Digo o que penso, com
esperança. Penso no que faço, com fé. Faço o
que devo fazer, com amor. Eu me esforço
para ser cada dia melhor, pois bondade
também se aprende. Mesmo quando tudo
parece desabar cabe a mim decidir entre rir
ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque
descobri, no caminho incerto da vida, que o
mais importante é o decidir.
Cora Coralina
RESUMO
ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DAS RAÍZES DE IPECA-DA-PRAIA (Pombalia
calceolaria (L.) Paula-Souza): ASPECTOS BOTÂNICOS, QUÍMICOS E
FARMACOLÓGICOS. Ana Georgina Oliveira Pontes. Orientadora: Profª. Drª. Mary Anne
Medeiros Bandeira. Dissertação de mestrado: Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas. Departamento de Farmácia. Universidade Federal do Ceará.
Pombalia calceolaria L., Violaceae, popularmente conhecida por ipeca-da-praia, ipeca-
branca, ipecacunha dos raizeiros é uma herbácea perene, predominante no sertão nordestino.
Embora não existam dados na literatura comprovando sua atividade farmacológica, por
décadas, suas raízes são preparadas na forma de decocto, lambedor e maceração, cujas
principais indicações populares são para tosse, expectoração, como vermífugo, antidiarréico e
para dentição. O presente estudo teve por objetivo realizar a caracterização farmacognóstica
das raízes de P. calceolaria nos aspectos botânicos, químicos e farmacológicos. A
importância da caracterização morfoanatômica está no fato de que não há registro em
literatura descrevendo o perfil botânico desta espécie vegetal. Assim, as raízes recém-
coletadas de P. calceolaria foram caracterizadas morfologicamente com vista desarmada e em
seguida realizada a caracterização anatômica através de secção histológica, reação
histoquímica, registro fotomicrográfico em campo de luz claro, onde foi evidenciado que a
raiz em estudo apresenta o xilema secundário oriundo do câmbio com dimorfismo no tamanho
dos vasos e floema secundário constituído de poucas camadas circundando o xilema. No
parênquima cortical foi visualizado e fotomicrografado, sob luz polarizada, a presença de
cristais de inulina. O estudo fitoquímico foi precedido por ensaios preliminares para a
obtenção da droga vegetal, onde foram obtidos as especificações de qualidade, como a
determinação do rendimento da droga vegetal, da umidade residual, do teor de cinzas totais,
seguida da prospecção fitoquímica que resultou majoritariamente em presença de saponinas,
açúcares redutores e esteróides. Em seguida, o extrato aquoso obtido por decocção foi
dividido em duas amostras, onde uma foi liofilizada e por meio da outra, foi obtido por
precipitação na presença de metanol, um polissacarídeo, com teor de 13,0% p/p, sendo este
submetido a análises por técnicas cromatográficas como CLAE e GPC, as quais indicaram a
presença de frutose e glicose, e o peso molecular de 4,0 x 10³ Da, respectivamente.
Posteriormente, após a obtenção de espectros uni- e bidimensionais de RMN de ¹H, ¹³C,
DEPT-135 e HSQC, a estrutura química do polissacarídeo foi identificada como sendo
inulina. Os testes farmacológicos foram realizados em traqueia isolada de rato tanto com o
polissacarídeo quanto com o extrato aquoso liofilizado das raízes de P. calceolaria (EALPC)
para avaliar a atividade miorrelaxante sobre a contratilidade do órgão. Após adição de CCh
1µM, para induzir contração sustentada no órgão isolado no sistema de cubas, em ensaio com
o polissacarídeo houve ausência de relaxamento significativo na contração sustentada. No
teste realizado com EALPC foi observado relaxamento da contração, o qual apresentou uma
redução efetiva da resposta contrátil do EALPC de aproximadamente 20% em relação ao
controle, caracterizando uma leve atividade broncodilatadora.
Palavras-chave: Pombalia calceolaria L. Raízes. Farmacognosia. Inulina.
ABSTRACT
PHARMACOGNOSTIC STUDY FROM IPECA-DA-PRAIA (Pombalia calceolaria (L.)
Paula-Souza) ROOTS: BOTANICAL, CHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL
ASPECTS. Ana Georgina Oliveira Pontes. Orientadora: Profª. Drª. Mary Anne Medeiros
Bandeira. Dissertação de mestrado: Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
Departamento de Farmácia. Universidade Federal do Ceará.
Commonly known as “ipeca-da-praia”, “ipeca-branca” or “ipecacunha dos raizeiros”,
Pombalia calceolaria L., a perennial herb of the family Violaceae, is predominant throughout
the Northeast Brazilian drylands. Despite the absence of studies demonstrating its
pharmacological properties, P. calceolaria has for decades been used in traditional medicine
as expectorant, cough medicine, anthelmintic, antidiarrheal and teething relief, in the form of
decoction, syrup and maceration. The aim of this study was to draw a pharmacognostic profile
of the roots of P. calceolaria, including botanical, chemical and pharmacological aspects. The
importance of morphoanatomical is the fact that there is no record in the literature describing
the botanical profile of this plant species. Therefore, newly collected roots of P. calceolaria
were characterized morphologically with the naked eye. Then histological sections were
submitted to anatomical and histochemical study documented by non-polarized light
photomicrography. The root of P. calceolaria has a vascular cylinder with exarch structure,
i.e. the phloem develops outward and the xylem inward. Inulin crystals observed in the
cortical parenchyma were registered by polarized light photomicrography. In preliminary
assays preceding the phytochemical analysis, quality specifications were determined,
including the plant drug yield, residual moisture, total ashes, followed by a phytochemical
prospection which revealed a predominance of saponins, reducing sugars and steroids.
Subsequently, an aqueous extract produced by decoction was divided into two samples. One
of these was lyophilized, while the other was submitted to precipitation with methanol,
yielding a polysaccharide with a content of 13,0% w/w. On HPLC and GPC, fructose and
glucose were identified and the molecular weight was determined (4.0 x 10³ Da), respectively.
After obtaining the 1D and 2D NMR spectra ¹H, ¹³C, DEPT-135 and HSQC, the chemical
structure of the polysaccharide was identified as inulin. Pharmacological tests were performed
on isolated rat tracheal smooth muscle using both polysaccharide and lyophilizate in order to
evaluate the myorelaxant properties of the compound. In the polysaccharide test, when 1µM
CCh was added to induce sustained contraction in an isolated organ bath assay, no change in
contraction was observed. In the lyophilizate test, the contractile response was reduced by
~20% in relation to controls, indicating a mild bronchodilatory effect.
Key-words: Pombalia calceolaria L. Roots. Pharmacognosy. Inulin.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Primeiro ciclotídeo isolado - espécie Oldenlandia affins (Rubiaceae)................... 32
Figura 2 - Pombalia calceolaria em seu habitat natural....................................................... 32
Figura 3 - Pombalia calceolaria - A: Flor; B: Folha; C: Fruto; D: Sementes. .................... 32
Figura 4 – Hyco A, evidenciando os loops e a estrutura tridimensional.
Em destaque amarelo, as pontes dissulfeto............................................................................ 32
Figura 5 - Estrutura inespecífica da inulina......................................................................... 37
Figura 6 - Coleta das raízes de P. Calceolaria e registro fotográfico da exsicata depositado no
Herbário Prico Bezerra – UFC............................................................................................... 42
Figura 7 - Fluxograma de obtenção do liofilizado e do
polissacarídeo......................................................................................................................... 47
Figura 8 -. Amostras do polissacarídeo bruto com extrato aquoso remanescente, antes de secos
em concentrador a vácuo.......................................................................................................... 49
Figura 9 – Esquema de eluição de amostra com polímero em coluna cromatográfica de
permeação em gel..................................................................................................................... 51
Figura 10 - Representação esquemática do sistema de cubas isoladas e captação de
dados........................................................................................................................................ 53
Figura 11 – Amostras in natura das raízes de Pombalia calceolaria...................................... 56
Figura 12 – Secções transversais da raiz de P. calceolaria. A- G. A. Corte transversal, da
epiderme ao cilindro vascular. B. Secção à mão livre da raiz in vivo. C: Células do
parênquima cortical da raiz in vivo, sob luz polarizada. D e F. Secção após 72 horas de
imersão em álcool absoluto. E e G: Células do córtex da raiz após imersão em etanol absoluto,
evidenciando cristais de inulina sob luz polarizada. ............................................................... 58
Figura 13 – Gráfico da distribuição granulométrica da droga................................................. 60
Figura 14 – Caracterização macroquímica do polissacaarídeo. 1: Polissacarídeo ao qual foi
realizado teste macroquímico; 2: a) Polissacarídeo após adição de timol 10%; b)
Polissacarídeo após adição de alfa-naftal
10%......................................................................................................................................... 63
Figura 15 – Cromatograma obtido a partir de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
presente nas raízes de Pombalia calceolaria..
................................................................................................................................................. 63
Figura 16 – Espectro de RMN - ¹³C (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P.
calceolaria.............................................................................................................................. 64
Figura 17 – Espectro de RMN - DEPT 135 (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de
Amostras in natura das raízes de P. calceolaria..................................................................... 64
Figura 18 - Espectro de RMN - ¹H (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de Amostras in
natura das raízes de P. calceolaria.......................................................................................... 66
Figura 19 - Espectro de RMN - HSQC (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo da Amostras
in natura das raízes de P. calceolaria..................................................................................... 66
Figura 20 – A. Estrutura química prevista para a inulina das raízes de P. calceolaria; B. Estrutura química da sacarose................................................................................................. 67
Figura 21 – Curva de calibração dos padrões de pululana Shodex P-82................................ 68
Figura 22 - Cromatograma do polissacarídeo de P. calceolaria obtido por Cromatografia de
Permeação em Gel................................................................................................................. 69
Figura 23 – Curvas dos padrões de pululanas.......................................................................... 69
Figura 24 - Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia de
rato na presença de diferentes concentrações de polissacarídeo
(n=7)........................................................................................................................................ 70
Figura 25 - Traçado representativo do efeito de EALPC sobre a contração induzida por
CCh......................................................................................................................................... 71
Figura 26 - Gráfico com efeito do EALPC sobre a contração induzida por CCh em traqueia
isolada de rato........................................................................................................................ 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação de tamises utilizados na análise granulométrica do pó da raiz de
Pombalia calceolaria.............................................................................................................. 45
Tabela 2 - Resultado do rendimento da droga veegtal e da umidade residual das raízes de P.
calceolaria.............................................................................................................................. 57
Tabela 3 - Resultados da análise granulométrica da droga vegetal........................................ 59
Tabela 4 - Perfil fitoquímico das raízes de P. calceolaria..................................................... 61
Tabela 5 - Resultado da solubilidade do polissacarídeo extraído das raízes de P. calceolaria.62
Tabela 6 - Dados de espectros de RMN 1H e RMN 13C da inulina de P. calceolaria versus
inulina da literatura................................................................................................................ 67
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AACT Academia Americana de Toxicologia
AAP Academia Americana de Pediatria
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATPase Adenosina trifosfatase
Ca Cálcio
CCD Cromatografia em camada delgada
CCE Curva concentração-efeito
CCh Carbacol
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COSY Homonuclear correlation spectroscopy
Da Daltons
DAE Diacilglicerol
DEPT-135 Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
EALPC Extrato aquoso liofilizado de Pombalia calceolaria
et al. ... e colaboradores
E.P.M. Erro padrão da média
FOS Fosfoligossacarídeo
GP Grau de polimerização
GPC Cromatografia de permeação em gel
HRB Hiperresponsividade brônquica
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
IP3 Inositol trifosfato
KCl Cloreto de potássio
LAFARMULI Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso
NaNO3 Nitrato de Sódio
OMS Organização Mundial da Saúde
Mg Magnésio
MF Medicamento Fitoterápico
PLC Fosfolipase C
p/p Peso por peso
PTF Produto tradicional fitoterápico
p/v Peso por volume
RDC Resolução da diretoria colegiada
RE Resolução específica
RID Detector de índice de refração
RMN ¹H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN ¹³C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
ROCC Canais de cálcio operados por receptor
SOCC Canais de cálcio operados por estoque
SUS Sistema Único de Saúde
TFA Ácido trifluoracético
UFC Universidade Federal do Ceará
v/v Volume por volume
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 21
1.1 O contexto do uso de plantas medicinais no Nordeste brasileiro ............................... 23
2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 25
3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 27
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 27
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 27
4 REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 29
4.1 A família Violaceae e o gênero Pombalia ..................................................................... 29
4.2 Pombalia calceolaria L. ................................................................................................ 31
4.2.1 Distribuição geográfica, aspectos botânicos e farmacoquímicos ............................. 31
4.2.2 Aspectos etnofarmacológicos .................................................................................... 33
4.2.3 Toxicidade ................................................................................................................. 34
4.3 Inulina........................................................................................................................... 35
4.4 Estudo da atividade broncodilatadora ........................................................................ 37
4.4.1 Canais de cálcio e a contratura do músculo liso das vias aéreas ............................. 37
5 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 42
5.1 Material ........................................................................................................................ 42
5.1.1 Material Botânico ...................................................................................................... 42
5.1.2 Animais ...................................................................................................................... 43
5.1.3 Solventes e reagentes ................................................................................................. 43
5.1.4 Composição das soluções ........................................................................................... 43
5.1.5 Equipamentos ............................................................................................................ 43
5.1.6 Outros materiais ........................................................................................................ 44
5.2 Métodos ........................................................................................................................ 44
5.2.1 Caracterização morfoanatômica das raízes de Pombalia calceolaria ...................... 44
5.2.2 Ensaios preliminares para caracterização dos parâmetros de qualidade da droga
vegetal ................................................................................................................................. 44
5.2.3 Trituração da droga vegetal ...................................................................................... 45
5.2.4 Determinação granulométrica da droga vegetal ...................................................... 46
5.2.5 Determinação do Teor de Cinzas Totais ................................................................... 45
5.2.6 Prospecção fitoquímica ............................................................................................. 46
5.2.7 Obtenção do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo .................................... 46
5.2.8 Testes de solubilidade ............................................................................................... 49
5.2.9 Caracterização macroquímica do polissacarídeo ..................................................... 50
5.2.10 Hidrólise e análise por CLAE ................................................................................. 50
5.2.11 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)............................................. 50
4.2.12 Determinação da massa molar por Cromatografia de permeação em gel (GPC) . 51
5.2.13 Protocolo experimental para avaliação do potencial miorrelaxante ..................... 52
5.3 Análise estatística ......................................................................................................... 54
6 RESULTADOS ............................................................................................................... 56
6.1 Análises morfoanatômicas das raízes de Pombalia calceolaria L. .............................. 56
6.1.1 Descrição macroscópica ............................................................................................ 56
6.1.2 Descrição microscópica ............................................................................................. 57
6.2 Operações de secagem .................................................................................................. 57
6.3 Determinação granulométrica ..................................................................................... 59
6.4 Determinação do Teor de Cinzas Totais ..................................................................... 60
6.5 Prospecção fitoquímica ................................................................................................ 60
6.6 Determinação do teor do liofilizado e do polissacarídeo obtidos ................................ 62
6.7 Testes de solubilidade ................................................................................................... 62
6.8 Caracterização macroquímica do polissacarídeo ........................................................ 62
6.9 Análise química do polissacarídeo em CLAE ............................................................. 63
6.10 Análise química do polissacarídeo por RMN ............................................................ 64
6.11 Análise química do polissacarídeo em CPG .............................................................. 68
6.12 Efeito da adição in vitro do polissacarídeo na contração induzida por CCh............ 70
6.13 Efeito da adição in vitro do EALPC na contração induzida por CCh ...................... 71
7 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 74
8 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 81
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 84
ANEXO .............................................................................................................................. 93
INTRODUÇÃO
21
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais pelo ser humano é tão antigo quanto à origem das
civilizações, sendo uma prática encontrada em todas as populações e em todos os grupos
étnicos conhecidos. No início dos tempos, a fitoterapia representava a principal forma
terapêutica conhecida, sendo que a partir dela foram descobertos diversos medicamentos
usados na medicina tradicional (MARTINS, 2000), e todas as informações referentes ao
conhecimento oriundo da utilização de plantas medicinais foram transmitidas às gerações
posteriores, que as compilou e documentou através da escrita.
A utilização da fitoterapia vem se expandindo em todo o mundo sendo uma
conseqüência, dentre outros fatores, do alto custo dos medicamentos industrializados e da
falta de uma assistência médica e farmacêutica eficazes, principalmente no sistema público de
saúde dos países em desenvolvimento. No entanto, o crescente consumo de medicamentos à
base de plantas em todo o mundo levanta uma preocupação sobre o uso racional do
fitoterápico. A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu o risco potencial de uso
descontrolado de fitoterápicos e de plantas medicinais em conjunto com outros medicamentos
e emetiu em 2004 a "Guide lines on safety monitoring of herbal medicines in
pharmacovigilance systems" que, em tradução livre, trata-se das diretrizes sobre
monitoramento de segurança de medicamentos à base de plantas em sistema de
farmacovigilância (MAZZARI; PRIETO, 2014).
Em países desenvolvidos, como o Reino Unido, aproximadamente 50% da
população tem utilizado plantas medicinais pelo menos uma vez na vida e,
surpreendentemente, quase 100% dos pacientes HIV positivos nesse país admite o uso de
plantas medicinais (HOMAR, 2005). Em países em desenvolvimento, a OMS estimou que 65-
80% da população confia em plantas medicinais como a primeira fonte de tratamento. Estas
estatísticas estão de acordo com a realidade brasileira, onde 66% da população não tem acesso
a medicamentos industrializados (MAZZARI; PRIETO, 2014; TROJAN-ROGRIGUES et al.,
2012).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) está em fase de mudança
no que diz respeito à regulação das plantas medicinais no Brasil e desde sua criação em 1999,
muitos avanços tem sido realizados a fim de controlar e garantir a eficácia e segurança do uso
medicinal de produtos de origem vegetal (BALBINO; DIAS, 2010). Nesse sentido, segundo
ANVISA (2015), a tradicionalidade de uso é uma forma de comprovação de segurança e
efetividade de fitoterápicos permitida no Brasil desde a publicação da RDC nº17/2000, que foi
22
revogada pela RDC nº48/2004, que por sua vez foi revogada pela RDC nº14/2010, todas
referentes ao registro de medicamentos fitoterápicos. Em todas essas normas era possível
utilizar quatro formas de comprovação de segurança e eficácia de fitoterápicos: por meio de
estudos não-clínicos e clínicos, por dados de literatura, por registro simplificado ou por
tradicionalidade. Porém, a população não tinha a informação sobre qual foi a forma utilizada
para comprovação de segurança e eficácia quando o produto era registrado. A RDC nº14/2010
foi revogada para a publicação da RDC nº26/2014 que separa os fitoterápicos em duas
classes: medicamento fitoterápico (MF) e produto tradicional fitoterápico (PTF), traz o
conceito de PTF, tendo a demonstração do tempo de uso por meio de literatura técnico-
científica como a principal forma de comprovação de segurança e efetividade. Os requisitos
para comprovar a tradicionalidade permanecem os mesmos preconizados pela ANVISA desde
2000 na RDC nº17.
Os requisitos básicos para o uso correto de uma planta medicinal ou um
fitoterápico são o controle de qualidade, a segurança e a eficácia. Para isso são necessários
anos de dedicação para: proceder à identificação botânica correta da espécie em estudo e os
aspectos agronômicos que a circundam; preparar o extrato adequado; identificar os
marcadores ativos e/ou analíticos, ou seja, os compostos presentes em maior quantidade que
podem ou não ter correlação com o princípio ativo; isolar e elucidar quimicamente os mesmos
para ser possível, então, realizar estudos farmacológico e toxicológico que comprovem sua
segurança e eficácia (SIMÕES et al., 2003).
No Brasil, em 2006, foi publicada a Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares no Sistema único de Saúde (SUS), que visa ampliar as opções terapêuticas
oferecidas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e
outros serviços relacionados, com segurança, eficácia e qualidade (BRASIL, 2006). Além
disso, há no país um enorme potencial a ser explorado na área dos fitoterápicos devido a sua
grande biodiversidade, que abrange uma imensa quantidade de espécies endêmicas, dentre
elas, aquelas que são morfologicamente similares, sendo motivo de uso incorreto no meio
popular e que põe em risco a saúde de muitos pacientes. Dessa forma, é premente o
desenvolvimento da pesquisa científica a fim de elucidar, comprovar e racionalizar o uso de
plantas medicinais e seus derivados (SILVA, 2009), através do desenvolvimento e validação
de métodos analíticos para o controle de qualidade das drogas vegetais e dos produtos
acabados.
23
1.1 O contexto do uso de plantas medicinais no Nordeste brasileiro
O nordeste brasileiro é constituído por três biomas, sendo eles, Caatinga
(predominante), Cerrado e Mata Atlântica e dentro dos mesmos há regiões chamadas
“ecótonos” que se caracterizam por áreas de transição ambiental, ou seja, pode haver em uma
mesma região espécies vegetais características da Caatinga, do Cerrado e da Mata Atlântica.
Esta característica é o que define a ampla biodiversidade desta região brasileira.
Muitos pesquisadores tem despertado o interesse de estudar a rica flora dessa
região na busca de conhecer as principais plantas com propriedades medicinais, de acordo
com o uso popular de plantas medicinais (CARTAXO; SOUZA; ALBUQUERQUE, 2010).
Muitas dessas plantas já foram ou continuam sendo objetos de estudo, tais como,
Myracrodruon urundeuva Allemão (BANDEIRA, 2002), Hymenaea courbaril
L.(BEZERRA,2013), Anadenanthera columbrina (Vell.) Brenan, Amburana cearensis A. C.
Smith (LEAL,2006), Aloe Vera (L.) Burm (LORENZI; MATOS, 2008; MORAIS et al.,
2005), entre outras. Enquanto muitas outras continuam sendo largamente usadas pela
comunidade, sem, no entanto, ter havido nenhum estudo que indicasse aquele uso
comprovado cientificamente, como é o caso da espécie Pombalia calceolaria.
Sendo a região nordestina uma das mais desassistidas do ponto de vista sócio-
econômico do Brasil, a falta de acesso a profissionais de saúde faz com que a comunidade,
principalmente das regiões mais afastadas dos centros urbanos, tenha como único recurso para
o tratamento de saúde, o uso empírico das plantas medicinais desta região. Assim, o
conhecimento popular sobre plantas medicinais passado oralmente através de gerações e que
muitas vezes é a fonte primária da maioria das pesquisas científicas com espécies vegetais, é o
grande legado da população local.
Nesse contexto, o presente estudo farmacognóstico das raízes de Pombalia
calceolaria L. (ipeca-da-praia), Violaceae, visa contribuir, além dos aspectos botânicos,
químicos e farmacológicos, com dados que possibilitem a diferenciação farmacognóstica
entre esta espécie e outra espécie também conhecida como ipeca, pepaconha, papaconha e
ipecacuanha, Psychotria ipecacuanha Stokes, Rubiaceae, para que haja o uso seguro de
ambas.
24
JUSTIFICATIVA
25
2 JUSTIFICATIVA
A Pombalia calceolaria é extensamente conhecida e utilizada popularmente,
principalmente, no Nordeste brasileiro. O conhecimento tradicional do uso das raízes desta
espécie medicinal repassado de geração a geração ainda não foi tópico de estudos científicos
que comprovassem sua eficácia e segurança terapêuticas. Uma vez que a referida espécie é
comumente confundida com a ipeca verdadeira (Psychotria ipecacuanha), revela-se de grande
importância o seu estudo farmacognóstico.
É válido ressaltar que em estudos anteriores (PONTES, 2012), as raízes de P.
calceolaria foram submetidas a várias purificações dos extratos alcoólicos e acetato de etila,
obtendo-se frações de baixo rendimento e com aspecto caramelizado de difícil purificação.
Procedeu-se, então, à decocção das raízes, onde se detectou a presença de açúcar redutor, o
que direcionou para a obtenção, neste extrato, de alto teor de um polissacarídeo. Esta
descoberta despertou a necessidade do desenvolvimento de uma metodologia que possibilite
identificar sua composição química e investigar suas propriedades farmacológicas.
Nesse contexto, tendo como base o uso tradicional de P. calceolaria nas formas
de chá e lambedor com indicação broncodilatadora foi importante observar esta eficácia no
referido extrato aquoso. Por ser uma espécie de ocorrência predominantemente litorânea –
principalmente no Nordeste e em parte do Sudeste – de fácil acesso, merece maiores
investimentos a fim de validar e racionalizar seu uso como planta medicinal de acordo com as
diretrizes da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos.
Assim, a realização do presente trabalho se propõe a contribuir com a validação
científica das propriedades farmacoquímicas e farmacognósticas desta espécie vegetal.
26
OBJETIVOS
27
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Realizar o estudo farmacognóstico das raízes de Pombalia calceolaria (L.)
Schulze et Menz (ipeca-da-praia) com vista aos seus aspectos botânicos, químicos e
farmacológicos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Realizar a caracterização morfoanatômica das raízes de P. calceolaria;
- Determinar parâmetros de qualidade para a droga vegetal a partir das raízes frescas de P.
calceolaria;
- Avaliar preliminarmente a constituição química e os parâmetros físico-químicos do
polissacarídeo extraído das raízes de P. calceolaria;
- Realizar a identificação estrutural do polissacarídeo por espectrometria uni- e
bidimensionais de ressonância magnética nuclear (RMN);
- Avaliar o potencial miorrelaxante do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo extraído
das raízes de P. calceolaria sobre a contratilidade do músculo liso traqueal de ratos.
28
REFERENCIAL TEÓRICO
29
4 REFERENCIAL TEÓRICO
4.1 A família Violaceae e o gênero Pombalia
A família Violaceae Batsch está constituída de 21 gêneros e aproximadamente
800 espécies, das quais 70 são nativas do Brasil. Além disso, a maior diversidade genérica de
Violaceae está na América Latina, onde ocorrem 14 dos 21 gêneros, sendo os mais
representativos primeiramente, o gênero Viola, predominantemente herbáceo, seguido do
Rinorea e Pombalia (SOUZA, 2009).
Descobertas tem indicado que a importância da família Violaceae do ponto de
vista farmacológico é potencialmente muito mais expressiva. Estudos tem demonstrado que as
plantas dessa família são ricas em um grupo especial de proteínas circulares, chamadas
ciclotídeos cuja função natural parece ser parte do sistema de defesa das plantas. O primeiro
ciclotídeo foi isolado da espécie Oldenlandia affinis, o qual apresenta a estrutura mostrada na
Figura 1. Resumidamente, a estrutura desse peptídeo compreende um anel formado por duas
pontes dissulfeto (I-IV e V-II) e uma terceira ponte de dissulfeto (III-VI) transpassando
ambas. Todo esse arranjo promove uma conformação que está associada a existência de
folhas-β, 6 loops e dobras (PINTO, 2013). Embora isto possa parecer um motivo estrutural
improvável, é, na verdade, comum em uma grande variedade de proteínas (CRAIK, 2010).
Estas proteínas possuem uma vasta gama de atividades biológicas, incluindo
citotóxicas, sendo um potente agente anti-cancerígeno, anti-HIV, inseticida e antimicrobiano,
conferindo-lhes um potencial interessantíssimo para pesquisas farmacêuticas e agroquímicas
(TRABI et al., 2004; CHEN et al., 2005; HALLOCK et al., 2005; JENNINGS et al., 2004).
Até o momento, sabe-se que aproximadamente dois terços das sequências já publicadas de
ciclotídeos são derivados de espécies de Violaceae (TRABI et al., 2004; SIMONSEN et al.,
2005; BROUSSALIS et al., 2001). Tais proteínas são interessantes, não apenas sob o ponto de
vista comercial, mas também científico, tendo Simonsen et al., (2005) referido que elas
representam uma ferramenta quimiotaxonômica bastante conveniente para a classificação da
família.
No ano de 2014, o gênero desta espécie passou por atualização, uma vez que
anteriormente era conhecido por Hybanthus, o qual, a partir de estudo realizado por Paula-
Souza; Ballard (2014) foi restabelecido como Pombalia Vand. pois descobriu-se que é a mais
antiga designação genérica para a predominante linhagem polifilética sul americana de
Hybanthus.
30
A Figura 1 ilustra em “A” as seis cisteínas conservadas, indicadas em negrito
(números romanos), e as ligações dissulfeto (I-IV, V-II, III-VI) mostradas pelo cruzamento
das linhas. O início do peptídeo é indicado pela seta (G1). E em “B” o diagrama de fita. A
estrutura cíclica (CCK) é caracterizada por três pontes de dissulfeto mostrados na
representação (em cinza) e uma pequena folha-β antiparalelo (setas).
O gênero Pombalia (Violaceae) compreende mais de 100 espécies que são
distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do novo e do velho mundo. A maioria é
concentrada na América Latina com aproximadamente 70 espécies (SEO, 2009). Dentre os
países da América do Sul sua predominância está na Argentina, no Uruguai, no Paraguai e no
Brasil (SEO; SANSO; XIFREDA, 2011).
Fonte: Pinto, 2013
Figura 1: Primeiro ciclotídeo isolado, da espécie Oldenlandia affinis (Rubiaceae).
31
Em estudo realizado por Seo, Sanso; Xifreda (2011) foram caracterizadas
microestruturas das superfícies das folhas e margens de algumas espécies de Pombalia
provenientes da América do Sul usando a microscopia de varredura eletrônica, com o objetivo
de verificar se é possível determinar se esses caracteres possam ser utilizados para distinguir
os táxons ou grupos de táxons. E o que foi revelado por meio desta técnica foi que as margens
das folhas variam de acordo com a presença ou ausência de alguns tricomas e papilas. O
registro dessas diferenças na micromorfologia foliar forneceu características úteis na
diferenciação de espécies e grupos de espécies do gênero Pombalia.
4.2 Pombalia calceolaria L.
4.2.1 Distribuição geográfica, aspectos botânicos e farmacoquímicos
A Pombalia calceolaria (Figura 2) caracteriza-se como uma erva rasteira, cuja
raiz apresenta-se enrugada e tortuosa com casca espessa e pálida (LORENZI; MATOS, 2002),
onde, no Brasil, é predominante nas regiões costeiras e arenosas do Nordeste brasileiro, sendo
nativas do Maranhão até São Paulo. É uma herbácea perene, pouco ramificada, inteiramente
pubescente, de 10 a 30 cm de altura (LORENZI; MATOS, 2008). Caracteriza-se pela
presença de folhas elípticas, alternadas, pecioladas, de margens denteadas, 2-4 cm de
comprimento; flor branca com uma única pétala grande que se dilata em forma de bandeirola,
revirando-se para fora; os frutos são cápsulas oblongas e deiscentes contendo muitas sementes
escuras, conforme mostrado na Figura 3 (LORENZI; MATOS, 2002; MATOS, 2007).
Em estudo realizado por Seo; Sanso; Xifreda (2011), os autores, através de
fotomicrografia, registraram as características micromorfológicas das folhas de Pombalia
calceolaria, através de microscopia de varredura eletrônica, onde constatou-se a presença de
densa pelagem em ambas as faces e de margem denteada com presença de glândulas globosas
ou ovóides, características estas importantes para distinguir essa espécie de outras espécies do
gênero Pombalia.
Embora seja uma das plantas de uso muito antigo na medicina popular nordestina,
ainda não foi submetida a estudos de validação suficientes. Na literatura, dados a respeito de
seus constituintes químicos ou de suas propriedades farmacológicas são quase inexistentes.
Beauvisage (1889) indicou a presença de inulina nas raízes de P. calceolaria, Leal et al.
(2000) demonstraram a presença de cumarina em seu extrato e leve atividade
broncodilatadora, provavelmente compatível com seu uso popular, e Pinto (2013) isolou
ciclotídeos a partir dos extratos etanólicos das folhas, caules e sementes de P. calceolaria.
Neste último estudo as sementes da referida espécie destacaram-se pela maior diversidade
32
peptídica, de onde foi possível isolar e elucidar a estrutura de um ciclotídeo denominado Hyco
A (Figura 4).
Fonte: Autoria própria
Figura 2 - Pombalia calceolaria em seu habitat natural.
Fonte: Autoria própria
Figura 3 - Pombalia calceolaria - A: Flor; B: Folha; C: Fruto; D: Sementes.
Fonte: PINTO, 2013
Figura 4 - Hyco A, evidenciando os loops e a estrutura tridimensional.
Em destaque amarelo, as pontes dissulfeto.
33
4.2.2 Aspectos etnofarmacológicos
Em estudo realizado no Ceará, ficou demonstrada a alta frequência do uso dessa
planta em fitoterapia, incluindo a utilização pelos índios Tapebas (MORAIS et al., 2005). É
rara a mãe cearense que não tenha mantido na água de beber das crianças um pedaço dessa
raiz, como prática de medicina caseira para tratamento preventivo ou curativo de bronquite,
tosse rouca, “gripe velha”, diarreia e dos “males da dentição” (MATOS, 2007). Melhor
explicando esta última indicação, em um glossário de termos usados na medicina popular do
Ceará, a raiz de P. calceolaria encontra-se registrada como “remédio para nascer dente em
criança”, ou seja, ao chá da raiz é atribuída, popularmente, influência benéfica sobre a
odontogênese, evitando suas complicações (MATOS, 2002).
Segundo Matos (2007), as raízes de P. calceolaria são coletadas, em quantidades
relativamente grandes, na vegetação de dunas e preparadas para o mercado de ervas em forma
de pequenos feixes, sendo motivo de amplo comércio, vendidas em bancas de raizeiros como
raiz de pepaconha. Não é incomum a população indicar como remédio caseiro para expectorar
o cozimento das raízes de P. calceolaria preparado em mistura com folhas de malvarisco
(Plectanthus amboinicus), courama-branca ou courama comum (Kalanchoe crenata) e
cebola-branca (Allium ascalonicum).
A grande procura pela espécie das farmacopeias, Psychotria ipecacuanha,
denominada popularmente de ipeca, ipecacuanha, fez com que também fossem
comercializadas as falsas ipecas, que possuem propriedades semelhantes à P. ipecacuanha, e
que, segundo Gomes (2007), tais propriedades se devem à presença de emetina, porém com o
teor bem menor que na ipeca verdadeira. As principais espécies apontadas são: Richardia
brasiliensis Gomes (poaia-branca) e Richardia rosea St. Hil (poaia do campo ou rosa), da
família Rubiaceae; Pombalia calceolaria L., da família Violaceae; e Polygala angulata DC,
da família Polygalaceae.
Importante ressaltar que enquanto Gomes (2007) relata a presença de emetina em
baixo teor em P. calceolaria, como citado anteriormente, Matos (2007) relata que embora se
desconheça a presença de emetina, esta espécie de ipecacuanha tem sido indicada, em
medicina popular, também para o tratamento da amebíase, provavelmente por ser confundida
com a Psychotria ipecacuanha.
Em estudo realizado por Chaves (2008), na Paraíba, intitulado “Lambedor: um
conhecimento popular em abordagem científica”, a raiz de P. calceolaria apresentou uma
frequência de 18 citações frente a 22 raizeiros entrevistados. A planta é empregada na
medicina popular por grande número de pessoas, distribuído em várias classes sociais.
34
Pesquisas etnofarmacológicas procedidas nos estados nordestinos pelos autores
Agra et al. (2007), Albuquerque et al. (2007) e Cartaxo et al. (2010), principalmente no Ceará,
Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia, em coleta de dados quanto ao uso popular de
plantas medicinais, registraram em todas elas a presença do uso popular de P. calceolaria. O
objeto de pesquisa dos respectivos estudos era estabelecer “qual o conhecimento popular a
respeito das plantas medicinais, quais as plantas mais usadas na comunidade e como se dava
seu uso”. É válido salientar que de todas as espécies citadas nos três estudos, a Pombalia
calceolaria foi sempre mencionada, porém sua importância relativa (IR) era baixa.
Esse parâmetro de avaliação (IR) trata-se de um método quantitativo que
demonstra a importância de uma espécie baseada em sua versatilidade, ou seja, a espécie é
analisada baseada no número de propriedades medicinais dadas pelos informantes. O valor
máximo do RI é 2. Esta técnica presume que uma espécie é mais importante, ao apresentar um
grande número de propriedades, independente do número de pessoas que citam sua utilização
(CARTAXO et al., 2010) . Portanto, em ambos os estudos, o IR foi abaixo de 1, significando
que esta espécie apresenta pequena diversidade de propriedades medicinais atribuídas a ela,
mesmo que tenha havido altos índices de citações.
4.2.3 Toxicidade
Embora pesquisas envolvendo a espécie P. calceolaria sejam praticamente
escassas na literatura e em fontes primárias, como artigos científicos, em estudo recente,
publicado em revista científica, constatou-se que a presente espécie vegetal apresenta
potencial tóxico.
Carvalho et al. (2014) verificaram em estudo realizado em dois municípios dos
estados de Piauí e Pernambuco, no Nordeste brasileiro, que P. calceolaria em seu período de
frutificação, apresentou elevado grau de toxicidade, levando os animais que ingeriram suas
partes aéreas a um severo quadro neurológico reversível que poderia levar ao óbito,
dependendo da quantidade e frequência da ingestão. Nesta pesquisa, o quadro clínico da
neuropatia foi observado espontaneamente em relatos de muitos fazendeiros e,
experimentalmente, através da administração da planta fresca com frutos, em duas doses
diárias de 40 g/kg/peso corporal. Evidenciou-se assim, que a toxicidade está associada
exclusivamente à ingestão dos frutos, uma vez que a ingestão das folhas sem os frutos não
havia a ocorrência de nenhum quadro clínico com os animais.
Embora a parte da planta usada popularmente seja a raiz, e esta, por sua vez, ao
longo dos anos de seu uso tradicional não apresentou relatos de toxicidade, e que a pesquisa
35
científica está direcionada para identificar suas propriedades farmacológicas, é importante
essa informação do elevado grau de toxicidade de seus frutos, para contribuir com o uso
medicinal racional dessa espécie.
4.3 Inulina
A inulina é um polissacarídeo de reserva natural derivado de vegetais e
amplamente distribuída em uma variedade de plantas pertencentes às famílias Liliaceae,
Asteraceae, Campanulaceae, Violaceae entre outras (APOLINÁRIO et al., 2014;
OLIVEIRA; AKISUE, 2009). Está presente em mais de 30000 espécies, em particular nas
raízes. Dentre as espécies mais conhecidas ricas em inulina estão: tubérculos de Helianthus
tuberosus (alcachofra de Jerusalém), Cichorium intybus (chicória) e Smallanthus sonchifolius
(Yacon).
Trata-se de uma mistura de oligo- e/ou polissacarídeos compostos por unidades de
frutose com configuração β de um carbono anomérico, o que faz com que frutano do tipo
inulina resista a hidrólises por enzimas digestivas do intestino humano que tem uma
especificidade para ligações α-glicosídicas. Por essas razões, esses compostos tem sido
classificados como oligossacarídeos não-digeríveis (APOLINÁRIO et al., 2014;
ROBERFROID, 2002). A inulina é composta por polímeros de frutose lineares ou
ramificados com grau de polimerização (GP) variando de 2-100, geralmente com uma
unidade terminal de glicose ligada através de ligações glicosídicas β(2→1), conforme
mostrado na Figura 5 (JUDPRASONG et al., 2011; LI et al., 2015). A oligofrutose e/ou
oligossacarídeos são termos sinônimos utilizados para denominar frutanos do tipo inulina com
GP inferior a 10, enquanto que inulina com GP superior a 10 é definida como polissacarídeo
(SAAD, 2006).
O GP da inulina é espécie-dependente e também terá correlação com o estágio de
desenvolvimento da planta, o tempo de colheita, da duração e das condições de
armazenamento pós-colheita, uma vez que pode haver, na espécie vegetal, a presença de
endo-inulinazes capazes de hidrolisar a inulina antes de sua extração. Além disso, no processo
extrativo, o tempo de fervura, o pH e a polidispersão podem influenciar tanto no GP, quanto
nas propriedades físico-químicas finais da inulina obtida (KRUGER, 2002; MENSINK,
2015).
Cinco tipos de frutanos, com diferentes estruturas, já foram descritos em plantas
superiores, sendo a inulina o tipo de frutano mais conhecido e estudado. O eixo central da
estrutura da inulina é relativamente flexível quando comparado com outros polissacarídeos,
36
uma vez que em sua cadeia central não há a presença de anéis de açúcar (estruturas
aromáticas). Isso, combinado com uma temperatura de transição vítrea elevada faz com que a
inulina seja um estabilizador adequado das proteínas em estado seco para ambas as
aplicações, alimentares e farmacêuticas (MENSINK, 2015).
Na indústria de alimentos é amplamente aplicada e tem sido usada como
edulcorantes de baixo teor calórico, para formação de géis, para o aumento da viscosidade,
para melhorar as propriedades organolépticas dos alimentos, entre outras aplicações.
Entretanto, é usada principalmente como substituto do açúcar e da gordura em produtos
lácteos, como exemplo: leite, sorvete, iogurte, pães e biscoitos (MEYER et al., 2011) .
As aplicações da inulina como excipientes farmacêuticos são ainda mais diversos
e incluem: (1) a ação crioprotetora em vacinas, no campo dos sistemas de liberação de
fármacos, devido sua alta temperatura de transição vítrea e baixa taxa de cristalização
(AUDOY, 2011); (2) seu uso na avaliação da função renal, pois atua como marcador exógeno
da taxa de filtração glomerular em testes de função renal, uma vez que ela é completamente
filtrada e não é reabsorvida pelos túbulos (STEINMAN, 1989); (3) segundo pesquisa in vivo
realizada por Roberfroid (2005), atua no aumento da absorção de minerais pelo intestino, uma
vez que a capacidade natural de absorção de cálcio (Ca) pelo organismo diminui com o
avançar da idade e o aumento relativo dessa absorção, induzida pela inulina, aumenta à
medida que os animais envelhecem. Já em humanos, estudos indicam que a influência
positiva da inulina na absorção de Ca e Magnésio (Mg) é provável que aconteça na parte
inferior do intestino onde há maior atividade da microbiota intestinal. E, de acordo com Kaur
e Gupta (2002), outro fator favorável ao aumento da biodisponibilidade do Ca no cólon, tem
relação com a hidrólise do complexo cálcio-fitato, por ação de fitases bacterianas,
provavelmente aumentadas em virtude da fermentação causada pela inulina e que podem
promover a liberação do cálcio para sua absorção; e (4), como fibra dietética, por ser um
carboidrato resistente à digestão na parte superior do trato gastrointestinal, fermentando no
cólon, exercendo um efeito de aumento de volume, como consequência do aumento da
biomassa microbiana resultante de sua fermentação e, assim, promove o aumento da
frequência de evacuações o que caracteriza as fibras da dieta (SAAD, 2006).
Logo, a inulina apresenta a propriedade de um carboidrato não-digerível,
caracterizando-se por um alimento funcional de nome prebiótico. Os prebióticos afetam
beneficamente o hospedeiro, por estimularem seletivamente a proliferação e/ou atividade de
populações de bactérias desejáveis no cólon. Adicionalmente, o prebiótico pode inibir a
37
multiplicação de patógenos garantindo benefícios adicionais à saúde do hospedeiro (SAAD,
2006).
4.4 Estudo da atividade broncodilatadora
Uma vez que o uso tradicional de Pombalia calceolaria faz referência à ação
broncodilatadora tanto do extrato aquoso quanto do lambedor caseiro preparado com suas
raízes, foi considerado importante discorrer sobre essa temática – vias aéreas respiratórias.
4.4.1 Canais de cálcio e a contratura do músculo liso das vias aéreas
A musculatura lisa, presente em muitos órgãos, inclusive na traqueia, tem sua
inervação proveniente do Sistema Nervoso Autônomo. Além disso, o estado contrátil de suas
células pode ser controlado por hormônios, agentes autócrinos e/ou parácrinos e outros sinais
químicos locais (WEBB, 2003). Didaticamente, esse tecido é classificado em dois tipos
principais, o multiunitário e o unitário, sendo este último, o padrão encontrado nas vias
aéreas. Essas fibras denominadas unitárias ocorrem, em geral, em feixes ou camadas e suas
membranas celulares são aderentes entre si, possuindo diversos pontos de adesão
denominados junções abertas, pelos quais ocorre o fluxo de íons de uma célula a outra, de
forma que a força gerada por uma fibra muscular seja prontamente transmitida à seguinte e,
dessa maneira, todas as fibras musculares se contraiam a um só tempo (GUYTON; HALL,
2011).
Figura 5 - Estrutura inespecífica da inulina.
Fonte: CALEFFI et al., 2015
38
A contração do músculo liso ocorre por uma interação entre os filamentos de
actina e miosina. O aumento na concentração de Ca livre no sarcoplasma, citoplasma de
células musculares lisas, promovido por qualquer um dos estímulos contráteis já citados
anteriormente, resulta na ligação desse íon à calmodulina, uma proteína reguladora que, após
reagir com quatro íons cálcio (Ca++), ativa a miosina quinase, enzima responsável por
fosforilar as cadeias leves de miosina, permitindo a sua fixação ao filamento de actina,
resultando, então, na contração muscular (GUYTON; HALL, 2011).
A cadeia de processos que liga um estímulo a seus efeitos na modificação da
concentração de Ca no citoplasma é denominada acoplamento excitação-contração
(STEPHENS, 2002). Dois mecanismos principais controlam esse acoplamento na musculatura
lisa: a cascata de sinalização mediada pela alteração na concentração intracelular de Ca e a via
de sinalização Rho-quinase, que atua através de uma alteração na sensibilidade do sistema
contrátil ao Ca. Enquanto este último parece estar mais envolvido com função modulatória,
existe uma grande variação no mecanismo de sinalização mediado pelo Ca, sendo este o mais
relevante para o presente estudo (BERRIDGE, 2008).
Duas maneiras fundamentais possibilitam o aumento da concentração intracelular
de Ca: a liberação dos estoques intracelulares de Ca via receptores especializados presentes no
retículo sarcoplasmático ou o influxo de cálcio a partir do meio extracelular através de uma
variedade de canais iônicos na membrana plasmática ou ainda, por ambos os processos
(PEREZ-ZOGHBI et al., 2009).
Uma das vias de Ca mais bem caracterizadas utiliza canais de Ca operados por
voltagem (VOCC), ativados por variações no potencial de membrana. No entanto, existem
também na membrana das células musculares lisas outros canais que não são dependentes de
voltagem, incluindo os canais de Ca operados por receptor (ROCC), onde a ocupação de
receptores por agonistas específicos confere-lhe um estado de ativação e os canais de Ca
operados por estoque (SOCC) em que a depleção de estoques intracelulares de Ca ativa este
outro tipo de canal presente na membrana plasmática, os quais são permeáveis ao Ca e
possibilitam a recarga dos estoques de Ca do retículo através da entrada capacitativa deste íon
(SOMLYO et al., 1999; STEPHENS, 2002; PAREKH; PUTNEY, 2005).
O acoplamento eletromecânico opera uma mudança no potencial de membrana
devido ao efeito da concentração de Ca no citoplasma. O contato da membrana do tecido de
músculo liso traqueal com altas concentrações de potássio gera a despolarização desta e, em
seguida, os VOCC são ativados o que causa um influxo de Ca através da membrana. Portanto,
esse acoplamento excitação-contração consiste do controle da contração muscular por
39
potencial de membrana e é denominado acoplamento eletromecânico (SOMLYO; SOMLYO,
1994). Por outro lado, a ligação de agonistas colinérgicos como o carbacol (CCh), aos
receptores presentes na membrana promove a sua ativação através de acoplamento
farmacomecânico (SOMLYO et al., 1999). Uma vez estimulado o receptor, a proteína G se
cliva, ativando a fosfolipase C (PLC), que ativada, hidrolisa o fosfoinositídeo da membrana
celular produzindo pelo menos dois segundos mensageiros: o diacilglicerol (DAG) e o
inositoltrifosfato (IP3). A ligação do IP3 a receptores específicos na membrana do retículo
sarcoplasmático resulta na liberação de Ca para o citosol (WEBB, 2003; PAREKH;
PUTNEY, 2005).
A contratilidade da musculatura lisa das vias aéreas contribui para o aumento da
resistência das vias aéreas em doenças semelhantes à asma (KIM; HOQUE; HAI, 2004), pois
a musculatura lisa destas vias tem efeito no controle do calibre das vias aéreas, sendo
susceptível a disfunções na musculatura, contribuindo, assim, para a patogênese da asma
(BASTOS, 2009). A contração excessiva das células da musculatura das vias aéreas é uma
das causas do desencadeamento dessa patogênese. Essa mudança na função contrátil da
musculatura secundária à inflamação das vias aéreas pode contribuir para o aumento da
resistência do fluxo aéreo, devido à presença de hipersecreção e a espessura das vias aéreas
(BAI; ZHANG; SANDERSON, 2007). Tais alterações podem ser induzidas em animais de
laboratório através de sensibilização e desafio, por inalação de substâncias alérgenas irritantes
(HARKEMA; WAGNER, 2005). A musculatura lisa pode ser estimulada por agonistas, tais
como: colinérgicos (NAKAZAWA et al., 1990), norepinefrina (INOUE; KURIYAMA,
1993), endotelina (CHEN; WAGONER, 1991), histamina (KOMORI et al., 1992).
Em contrapartida, o relaxamento do músculo liso ocorre como resultado da
remoção do estímulo contrátil ou pela ação direta de substâncias que estimulem a inibição do
mecanismo contrátil. Independente disso, o processo de relaxamento requer uma diminuição
da concentração celular de Ca e o aumento na atividade da miosina fosfatase, enzima capaz de
remover o fosfato da cadeia leve de miosina, cessando a contração. O sarcolema contém Ca,
Mg-ATPases que proporcionam um mecanismo adicional para a redução da concentração
desse íon na célula. A inibição dos canais de Ca voltagem-dependentes e operados por
receptores também promovem o relaxamento do músculo liso (WEBB, 2003).
Assim, o presente trabalho, objetivou investigar as características fitoquímicas
preliminares da parte subterrânea de P. calceolaria e obter informações quanto aos seus
aspectos morfoanatômicos, de forma a contribuir com sua caracterização farmacognóstica e
com dados relativos à família Violaceae, a qual pertence. Além disso, foram realizados
40
estudos químicos e farmacológicos com o polissacarídeo já extraído das raízes de P.
calceolaria, quanto ao seu teor e aos seus aspectos físico-químicos e também estudos
farmacológicos de avaliação da atividade broncodilatadora do extrato aquoso das raízes da
referida espécie.
41
METODOLOGIA
42
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Material
5.1.1 Material Botânico
O material botânico foi constituído de raízes de ipeca-da-praia (Pombalia calceolaria),
as quais foram coletadas na Praia da Tabuba, Município de Caucaia, cuja exsicata foi
depositada no Herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob o
número 54070, para certificação botânica (Figura 6).
Fonte: Autoria própria.
Figura 6 – Coleta das raízes de P. Calceolaria e registro fotográfico da exsicata depositado no Herbário Prico Bezerra - UFC
43
5.1.2 Animais
Foram utilizados ratos wistar machos do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC mantidos em condições adequadas de luz,
temperatura e umidade, em gaiolas apropriadas, recebendo água e ração ad libitum. Os
protocolos utilizados nesse trabalho foram feitos de acordo com os padrões éticos
estabelecidos pela Comissão Ética em Pesquisa com Animais da UFC.
5.1.2.1 Aspectos éticos
Esse projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal
(Parecer nº 145/14) da UFC (Anexo).
5.1.3 Solventes e reagentes
Acetona, ácido sulfúrico, diclorometano, etanol, metanol, N,N-dimetilformamida
foram adquiridos da VETEC (Brasil), padrões de galactose, arabinose, xilose, glicose, frutose,
manose e maltose adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA), ácido trifluoroacético,
dimetilsulfóxido deuterado, azul de toluidina, α-naftol, timol, 2,2,2-tribromoetanol, cloreto de
potássio (KCl), carbacol (CCh), nitrato de sódio (NaNO3), padrões de pululana Shodex P-82.
5.1.4 Composição das soluções
Solução de Krebs-Henseleit (mmol/L): NaCl (118,0), KCl (4,7), CaCl2 (2,5), MgSO4
(1,2), NaHCO3 (25,0), KH2PO4 (1,2), glicose (10,0).
FAA 70: Formaldeido, ácido acético glacial e etanol 70%, nas proporções 1:1:8
(v:v:v).
Solução etanólica de α-naftol 10%: 1 g de α-naftol solubilizado em 10 mL de etanol.
Solução etanólica de timol 10%: 1 g de timol solubilizado em 10 mL de etanol.
5.1.5 Equipamentos
Espectrômetros Bruker modelos Avance DPX-300 e Avance DRX-500;
cromatógrafo Shimadzu LC-20AD com detector de índice de refração RID-10A;
cromatógrafo líquido de alta eficiência marca Shimadzu, composto dos módulos CBM -
Sistema de 10A, detector de RI (Shimatzu RID - 6A); concentrador de vácuo (modelo
Thermo Scientific Sorvall, modelo MTX 150 Micro-ultra-centrifuge); superfreezer (marca
Thermocientific); microscópio equipado com polarizador modelo Leica DM4000 B LED;
bomba a vácuo (Quimis, modelo Q.355.2. VC), balança analítica (marca Precisa, modelo 205
44
A SCS); chapa aquecedora retangular (marca Quimis, modelo Q313.22); cedidor de umidade
por infravermelho modelo IV2500 (marca GEHAKA); liofilizador de bancada Labconco
Freezone, com capacidade para 4,5 L, refrigeração 1/3 hp, temperatura -50ºC e acoplado à
bomba de vácuo da marca Labconco® com potência de 86 L/min; tamizador vibratório
(marca ERWEKA); transdutor de força isométrico (ML870B60/C-V, AD Instruments,
Australia); moinho de rotor tipo ciclone TE 651/2 Tecnal; forno mufla Linn Elektro Therm
modelo 06567 Bad Frankenhausen Kyfth;
5.1.6 Outros materiais
Funil de vidro sinterizado tamanho de porosidade nº 4 (10 a 16 µm); lâmina de
comum para corte histológico a mão livre; material cirúrgico; seringas e filtro de seringa
Nylon 25 mm x 0,45 µm.
5.2 Métodos
5.2.1 Caracterização morfoanatômica das raízes de Pombalia calceolaria
As raízes coletadas de P. calceolaria foram analisadas quanto ao seu
comprimento e ramificações sob vista desarmada.
Para análise anatômica, amostras da raiz fresca foram fixadas em FAA 70. As
lâminas foram confeccionadas segundo técnicas convencionais de corte à mão livre
(JOHANSEN, 1940). A coloração foi realizada com azul de toluidina (SAKAI, 1973).
Para a localização de frutanos do tipo inulina, amostras da raiz foram fixadas em
etanol absoluto por 48 h para verificar a formação de cristais do polissacarídeo.
Posteriormente, as secções transversais das amostras foram feitas à mão livre e com o auxílio
de lâmina comum e analisados sob luz polarizada (OLIVEIRA; AKISUE, 2009; JOHANSEN,
1940).
Os resultados foram registrados através de microscópio Leica DM4000 B LED
sob luz de campo claro e escuro.
5.2.2 Ensaios preliminares para caracterização dos parâmetros de qualidade da droga
vegetal
5.2.2.1 Obtenção e determinação do rendimento da droga vegetal
As raízes frescas de P. calceolaria foram desidratadas em estufa de circulação de
ar, a 50 ºC, até peso constante. Em seguida, foi determinado o rendimento da droga vegetal
obtido através desta operação.
45
5.2.2.2 Umidade residual
Em determinador de umidade por infravermelho foram pesadas três alíquotas da
raiz, aproximadamente 3 g cada, previamente secas em estufa de circulação de ar a qual foi
distribuída uniformemente no coletor de alumínio e a leitura realizada à 105ºC por 1 hora. Os
resultados foram expressos em perda de massa percentual, através da média das três
determinações.
5.2.3 Trituração da droga vegetal
O material vegetal foi triturado em moinho de facas usando malha de 2 mm. O pó
obtido foi identificado e armazenado em recipiente de vidro.
5.2.4 Determinação granulométrica da droga vegetal
A distribuição granulométrica foi realizada conforme metodologia descrita na
Farmacopeia Brasileira 5ª edição (método 5.2.11), (BRASIL, 2010b). Utilizou-se uma série
de tamizes, com abertura nominais de malha (µm) apresentados na Tabela 1. Esta série de
tamizes e a bandeja de recolhimento foram montados de acordo com a sequência apresentada,
todos previamente tarados e colocados no tamizador. Cerca de 170 g do pó da droga vegetal
foram pesados e colocados sob o tamis superior da série. Este tamis do peneirador foi
tampado e toda a série fixada para o início do teste, o qual durou 15 minutos, em tamizador
vibratório (marca ERWEKA). Finalizado o tempo, os tamises foram cuidadosamente pesados
para quantificação da porção retida em cada tamis.
Tabela 1 - Classificação de tamises utilizados na análise granulométrica do pó da raiz de P. calceolaria.
Abertura nominal do tamis (µm)
Nº do tamis (ABNT/ASTM)
2000 10
1400 14
1000 18
710 25
500 35
350 45
250 60
180 80
46
O percentual da Droga Retida (DR) em cada tamis foi calculado conforme equação que se
segue:
DR = 100 x
5.2.5 Determinação do Teor de Cinzas Totais
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita na Farmacopeia Brasileira
5ª edição (método 5.4.2.4), (BRASIL, 2010b): pesou-se aproximadamente 3 g da amostra
triturada, a qual foi transferida para cadinho previamente limpo, seco e calcinado em forno-
mufla a 600°C, resfriado em dessecador e tarado. Em seguida, a amostra foi distribuída
uniformemente no cadinho, que foi conduzido ao forno-mufla. O material foi submetido à
aquecimento, com aumento de temperatura gradual (30 minutos a 200 °C, 60 minutos a 400
°C e 90 minutos a 600 °C). Em seguida, resfriou-se o cadinho em dessecador e pesou-se a
amostra. O cadinho foi novamente aquecido em forno-mufla em temperatura de 600 °C por
90 minutos, resfriado em dessecador e novamente pesado, repetindo-se o processo até a
obtenção de peso constante. A porcentagem de cinzas foi calculada através da relação entre a
massa final obtida após a incineração e a massa inicial da amostra:
Teor de Cinzas Totais (%) =
5.2.6 Prospecção fitoquímica
A prospecção fitoquímica foi realizada de acordo com metodologias de COSTA
(1987), MATOS E MATOS (1989) e MATOS (1988).
5.2.7 Obtenção do extrato aquoso liofilizado e do polissacarídeo
Para melhor compreensão da metodologia desenvolvida nas etapas envolvidas
para liofilização do extrato aquoso e obtenção do polissacarídeo, ver figura 7.
Massa Final (g)
Massa inicial (g) x 100
Massa retida no tamis (g)
Soma das massas retidas em cada tamis e no coletor (g)
47
Figura 7 - Fluxograma de obtenção do liofilizado e do
polissacarídeo.
48
5.2.7.1 Preparação, liofilização do extrato aquoso e determinação do teor do liofilizado
O extrato aquoso, 20% p/v, foi obtido a partir das raízes de P. calceolaria
dessecadas, trituradas e após tamisadas, o pó, reunido no intervalo de 500 a 1400 µm,
homogeneizado e submetido à decocção (em triplicata) sob agitação constante, durante 5
minutos, seguida de filtração com algodão (Figura 6). O extrato aquoso obtido foi divido em
duas amostras. Uma (900 mL), foi reservada para obtenção do polissacarídeo, e a outra, (120
mL) distribuída para três tubos de falcon de 50 mL (três volumes de 40 mL em cada tubo). Os
tubos fechados com tampa própria foram levados à resfriamento em superfreezer até
temperatura de -70 ºC.
A liofilização foi realizada da seguinte forma: primeiro o equipamento foi ligado
para iniciar o resfriamento até -50 ºC, o qual demorou cerca de 20 minutos até chegar a essa
temperatura. Em seguida, o material previamente congelado a -70 ºC foi destampado,
colocado nos frascos de vidro do liofilizador, os quais posteriormente foram hermeticamente
fechados com tampa de borracha própria e adaptável para o acoplamento ao equipamento.
Uma vez acoplados, o sistema de vácuo foi ligado até atingir a pressão de 0,014 mBarr. O
critério de escolha do tempo de liofilização se deu através do teste com duas amostras em dois
períodos distintos: 48 h e 72 h, com o objetivo de avaliar qual deles o produto final obtinha
melhor secagem.
O teor do liofilizado obtido foi calculado segundo a equação abaixo:
Teor (%) =
5.2.7.2 Obtenção e determinação do teor do polissacarídeo
Ao extrato aquoso (900mL), condicionado em béquer, obtido conforme ítem
5.2.7.1 foi adicionado lentamente metanol, com auxílio de bureta, até atingir concentração de
33% v/v. Em seguida, esta amostra foi armazenada sob refrigeração por 48 h, condição esta
que otimiza a precipitação do polissacarídeo. O excesso de sobrenadante foi decantado e o
polissacarídeo resultante, ainda na presença de pequena alíquota do extrato aquoso, foi
cuidadosamente transferido para os tubos de ensaio do concentrador à vácuo (10h, a 50°C),
conforme Figura 8, para obtenção do polissacarídeo bruto. A purificação do polissacarídeo
obtido foi realizada através de lavagem com acetona em triplicata (100mL cada lavagem),
seguida por filtração à vácuo, por meio de funil de vidro sinterizado, e seco em estufa de
circulação de ar a 80°C até peso constante.
Massa obtida do liofilizado (g)
Raiz seca utilizada na obtenção do extrato aquoso (g) x 100%
49
O teor final do polissacarídeo purificado foi calculado segundo a equação abaixo:
5.2.8 Testes de solubilidade
Os testes de solubilidade foram realizados em quatro condições distintas: água a
temperatura ambiente, água quente (aproximadamente 100 ºC), etanol e diclorometano.
5.2.8.1 Teste de solubilidade em água a temperatura ambiente
Conforme metodologia descrita por Larsson (2010) pesou-se 0,1 g da amostra e
deixou-se sob agitação com 25 mL de água, a temperatura ambiente, durante 24 horas. Ao
final do tempo, o líquido foi filtrado em filtro de 0,45 μm, de modo a recolher pelo menos 10
mL. Após medir exatamente 10 mL e transferir para béquer tarado, foi posto para dessecar em
estufa a 100 ºC até peso constante. O peso obtido, em mg, correspondeu
à quantidade dissolvida em 10 mL de água, representando a solubilidade da amostra. O
resultado foi expresso em percentagem.
Polissacarídeo purificado (g)
Raiz seca utilizada na obtenção do polissacarídeo (g) x 100% Teor (%) =
Figura 8 - Amostras do polissacarídeo bruto com extrato aquoso remanescente, antes de secos em concentrador a vácuo.
Fonte: Autoria própria
50
5.2.8.2 Teste de solubilidade em água quente, etanol e diclorometano
Foram realizadas três pesagens do polissacarídeo, de 20 mg cada uma e, em
seguida, transferidas para três tubos de ensaio. Posteriormente, foram adicionados 2 mL de
cada solvente, sendo no primeiro tubo água quente, a temperatura de aproximadamente
100ºC, no segundo etanol e ao terceiro tubo foi adicionado diclorometano seguida de agitação
manual.
5.2.9 Caracterização macroquímica do polissacarídeo
A determinação macroquímica do polissacaraídeo foi realizada segundo Johansen
(1940), com solução de timol 10% e ácido sulfúrico e para confirmação, procedeu-se ao
ensaio com solução de α-naftol a 10% e ácido sulfúrico (BRASIL, 2010b).
5.2.10 Hidrólise e análise por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A hidrólise foi realizada com ácido trifluoroacético, segundo recomendação de
Matos (1988).
Realizou-se a análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE), utilizando-se como padrão interno galactose, arabinose, xilose, glicose, frutose,
manose e maltose nas seguintes condições: coluna Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid
H+ (8%); fase móvel: Ácido sulfúrico, 8 mmol L-1, e fluxo 0,8 mL/min (HARRIS, 2008).
Em seguida a análise foi complementada com dados de espectros de Ressonância
Magnética de 1H, 13C, DEPT-135, HSQC expandido e Cromatografia de Permeação em Gel.
5.2.11 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros unidimensionais de RMN de 1H, 13C e DEPT 135 e bidimensional
RMN HSQC expandido foram obtidos em espectrômetros Bruker, modelo Avance DRX-500,
pertencente ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da
UFC (CENAUREMN-UFC), operando na frequência do hidrogênio a 500 MHz, e na
frequência do carbono a 125 MHz. Os experimentos uni e bi-dimensionais de 1H, 13C, DEPT
135 e HSQC foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm com detecção inversa ou em
sonda dual de 5 mm com detecção direta. Os deslocamentos químicos (δH e δC) foram
expressos em ppm, tendo como referência interna o sinal residual do solvente deuterado
utilizado para a obtenção dos espectros. Foi empregado o solvente dimetilsulfóxido-d6
(DMSO-6).
51
Figura 9: Esquema de eluição de amostra com polímero em coluna cromatográfica
de permeação em gel.
FONTE: Florenzano, 2015
5.2.12 Determinação da massa molar por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)
A GPC (sigla em inglês) também conhecida por cromatografia de exclusão de
tamanho é um método de separação aplicada a polímeros. Dentre as diversas características
das técnicas cromatográficas, duas são pertinentes, a fase móvel e a fase estacionária. No
GPC, a fase estacionária é constituída por uma resina gel com poros e cavidades de diferentes
tamanhos. A separação das substâncias (polímeros) se dá pelo seu volume hidrodinâmico,
sendo as menores partículas capazes de acessar um volume maior de eluente, e assim passam
mais tempo retidas na coluna. Já as partículas maiores não acessam todo o volume da fase
estacionária e por isso eluem mais rápido (BILLMEYER, 1984) (Figura 9). O raio
hidrodinâmico apresenta relação com a massa molar, de forma que é esperada a relação entre
volume de eluição e a massa molar. Essa relação depende da coluna, do sistema de solvente,
da temperatura e da natureza do polímero. Para a determinação da massa molar por GPC
realizou-se no presente trabalho a calibração clássica, onde foi usado padrões de massa molar
conhecida (pululanas) de onde se obteve a curva analítica, ou seja, a relação entre a massa e o
volume de eluição. Assim, a determinação da massa molar do polissacarídeo em estudo se deu
52
em relação à massa molar do padrão determinada na curva analítica.
A massa molar da amostra foi determinada por GPC. As análises foram realizadas
com coluna PolySep Linear (7,8 mm × 300 mm), fluxo de 1,0 mL/min, tendo NaNO3 0,1
mol/L como eluente com forno mantido a 30 °C. O volume injetado de amostra foi de 50 μL.
Para a construção da curva de calibração foram utilizados padrões de pululana Shodex P-82.
A amostra foi dissolvida em água na concentração de 1 mg/mL e filtrada em membrana 0,45
μm.
5.2.13 Protocolo experimental para avaliação do potencial miorrelaxante
5.2.13.1 Avaliação do efeito do polissacarídeo e do extrato aquoso liofilizado de P.
calceolaria (EALPC) sobre a contratilidade de traqueia de rato:
Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em condições térmicas
adequadas (22 a 26ºC), com sistema de exaustão de ar e com ciclo claro/escuro de 12 horas,
tendo livre acesso à água e ração padrão (Biotec®). Os animais foram anestesiados com
2,2,2,tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.) e, então, sacrificados por exsanguinação,
imediatamente antes do início dos protocolos experimentais para obtenção do tecido. O
animal foi colocado na posição de decúbito dorsal para a rápida excisão da traqueia. A região
cérvico-torácica anterior foi aberta cirurgicamente e a traqueia então removida
cuidadosamente e levada a uma placa de petri contendo solução de Krebs-Henseleit, onde foi
feita a remoção do tecido conectivo.
Após esta remoção, a traqueia foi cortada transversalmente em segmentos
cilíndricos com aproximadamente 3 - 4 mm de comprimento e ligados a peças triangulares de
fio de aço (0,3 mm de diâmetro) que foram suspensas em cuba para órgão isolado de 5 mL
contendo solução de Krebs a 37 °C, continuadamente aerada com mistura carbogênica (95%
de O2 e 5% de CO2) e conectadas a transdutor de força isométrico (ML870B60/C-V, AD
Instruments, Australia) conectado a sistema de aquisição de dados (PowerLab™ 8/30, AD
Instruments, Austrália), conforme mostrado na Figura 9.
A tensão aplicada à cada seguimento traqueal foi ajustada em 1 g. Dentro do
período com esta tensão (60 min) houve a troca do líquido de incubação a cada 15 min.
Para avaliar a responsividade do tecido no início do experimento, as preparações
foram expostas a solução despolarizante de concentração 60 mM de KCl até que fossem
obtidas duas respostas de amplitudes semelhantes, quando então o tecido tenha sido
considerado responsivo e apto ao experimento.
53
5.2.13.2 Quantificação dos dados para elaboração da curva concentração-efeito (CCE)
A curva concentração-efeito (CCE) foi elaborada a partir dos dados captados pelo
sistema de aquisição de dados. Estes, por sua vez, inicialmente, foram obtidos pela adição de
carbacol (CCh) 1 μM para obtenção de contração submáxima do músculo liso traqueal.
Posteriormente, foi adicionado, sequencialmente, em intervalos de tempo de 10 minutos,
concentrações cumulativas crescentes (1 – 1000 μg/mL) da substância estudada em questão,
ou seja, do polissacarídeo ou do EALPC. Ao final, após adição da última concentração, o
tecido foi lavado com solução de Krebs e sua responsividade foi novamente avaliada com
solução de KCl 60 mM, para verificar a viabilidade do tecido após a exposição a substância
teste.
A Figura 10 ilustra todo o processo da obtenção da CCE a partir do órgão já
isolado: 1- Sistema de captação de dados onde são obtidos os traçados que registram as
contrações no tecido, 2: Transdutor de força acoplado, através de fio de algodão, a uma das
extremidades da peça triangular de aço, onde contém os anéis de traqueia e transmite as
alterações contráteis para o sistema de aquisição de dados, 3: Haste fixa à qual se acopla a
outra extremidade da peça triangular de aço com a traqueia e o ponto de aeração com mistura
carbogênica, 4: cuba para banho de tecido com circulação de água a 37ºC.
Fonte: Figura adaptada de AGUIAR, 2009
Figura 10 - Representação esquemática do sistema de cubas isoladas e captação de
dados.
54
5.3 Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa SigmaPlot 11.0. Os
resultados foram expressos calculando-se a média aritmética de cada determinação, sendo a
amplitude de variação em torno da média determinada através do cálculo do erro padrão da
média (E.P.M.). A comparação entre grupos foi realizada utilizando análise de variância
(ANOVA) seguido de teste de Tukey. A significância estatística foi considerada quando a
probabilidade de ocorrência da hipótese de nulidade foi menor que 5% (p < 0,05). Os dados
de contratilidade foram expressos em percentual (%) da pré-contração induzida com CCh (1
μM) durante os protocolos experimentais.
55
RESULTADOS
56
6 RESULTADOS
6.1 Análises morfoanatômicas das raízes de Pombalia calceolaria
6.1.1 Descrição macroscópica
As raízes de coloração amarelo-claro é do tipo pivotante, com ramificações nas
extremidades a medida em que vai crescendo em profundidade (Figura 11). O diâmetro
dificilmente ultrapassa 1,5 cm, variando entre raízes finas, de desenvolvimento primário, e
raízes mais grossas, de desenvolvimento secundário. O comprimento médio é de 70 cm,
podendo chegar até um metro. Apresenta aspecto tortuoso, com casca espessa. Quando frescas
retem alto teor de umidade e caracterizam-se por consistência interna macia e suculenta. Após
secas, as raízes finas são quebradiças, porém aquelas de maior diâmetro apresentam um cerne
muito rígido, devido ao crescimento secundário.
A
B C
Figura 11 - Amostras in natura das raízes de Pombalia calceolaria. A: Comprimento da raiz P. calceolaria L.; B: Aspecto natural da raiz após coleta; C: Secção tranversal da raiz in natura.
Fonte: Autoria própria
57
6.1.2 Descrição microscópica
A Figura 12 mostra a raiz de P. calceolaria em início de crescimento secundário
com periderme desenvolvida, parênquima cortical constituído de células isodiamétricas, as
quais ricas em frutanos do tipo inulina, está demonstrada sob luz polarizada após as raízes
serem submetidas a etanol absoluto. O xilema secundário, oriundo do câmbio, apresenta
dimorfismo no tamanho dos vasos e os raios parenquimáticos em geral são bi ou trisseriados.
O floema secundário, em menor proporção que o xilema, é constituído de poucas camadas
circundando o xilema. De acordo com a respectiva figura é possível visualizar com melhor
nitidez em 12B e 12C, a característica isodiamétrica das células parenquimáticas.
6.2 Operações de secagem
As operações de secagem com as raízes de P. calceolaria foram realizadas em
triplicata e os valores médios foram expressos em porcentagem, como mostra a Tabela 2. O
rendimento equivale à quantidade de droga vegetal obtida após a secagem em estufa de
circulação de ar até peso constante.
Figura 12 - Secções transversais da raiz de P. calceolaria. A- G. A. Corte transversal, da epiderme ao cilindro vascular. B. Secção à mão livre da raiz in natura. C: Células do parênquima cortical da raiz in natura, sob luz polarizada. D e F. Secção após 72 horas de imersão em álcool absoluto. E e G: Células do córtex da raiz após imersão em etanol absoluto, evidenciando cristais de inulina sob luz polarizada. Escalas: A: 200 μm; B,C: 50 μm; D-G: 200 μm.
Operações de secagem das raízes de P. calceolaria
Rendimento (%) 51,0
Umidade residual (%) 5,4
Tabela 2 - Resultado do rendimento da droga vegetal e da umidade residual das raízes de P. calceolaria
Fonte: Autoria própria
58
Fonte: Autoria própria
59
6.3 Determinação granulométrica
Como pode ser observado pelos resultados mostrados na tabela 3 e na Figura 13, o
pó obtido da divisão das raízes de P. calceolaria apresenta distribuição granulométrica
heterogênea. Além disso, como mostrado em destaque na tabela 3, o tamanho médio das
partículas é classificado como pó grosso segundo BRASIL, 2010. Os tamises que reteram
maior porcetagem da droga vegetal foram os de intervalo de 1400 a 500 µm, que variou de
17,21% a 13,83%, respectivamente e que equivale a 70,42% do total da raiz tamisada.
Tabela 3 - Resultados da análise granulométrica da droga vegetal.
Abertura nominal da malha (mm)
% Retida dos pós
1 2 3 Média (%)
2,00 6,47 17,93 2,71 9,03
1,40 20,69 20,43 10,51 17,21
1,00 26,63 24,30 22,65 24,53
0,710 14,04 12,17 18,35 14,85
0,500 11,32 10,49 19,68 13,83
0,350 5,22 5,03 9,77 6,67
0,250 3,56 3,02 4,27 3,61
0,180 4,12 3,00 4,57 3,89
<0,180 7,92 3,61 7,49 6,34
Tamanho médio das partículas
(mm)
0,951 1,06 0,709 -----
Fonte: Autoria própria
60
6.4 Determinação do Teor de Cinzas Totais
De acordo com a metodologia descrita no ítem 5.2.5, a amostra constituída de
raízes de P. calceolaria apresentou teor de cinzas totais e de cinzas insolúveis em ácido de 3,7
e 2,8%, respectivamente.
6.5 Prospecção fitoquímica
Como mostrado na Tabela 4, os principais constituintes químicos encontrados
após prospecção fitoquímica das raízes de P. calceolaria foram saponinas, açúcares redutores
e esteróides, tendo sido encontrado também em quantidade menos significante a presença de
cumarina e alcalóide.
Figura 13 - Gráfico da distribuição granulométrica da droga vegetal.
Fonte: Autoria própria
70,42% do total da
raiz tamisada.
61
Forte: +++ Médio: ++ Fraco: + Vestígio: V Ausente: O
Tabela 4 - Perfil fitoquímico das raízes de P. calceolaria.
CLASSE
QUÍMICA
TIPO DE
AMOSTRA MÉTODO
REAÇÃO
POSITIVA RESULTADO
Saponinas Extrato
Aquoso Agitação vigorosa
Espuma estável
por mais de 30
min.
+++
Alcalóides Extrato
Aquoso
Dragendorff
Bertrand Hager
Presença de
precipitado V
Flavonóides Extrato
Hidroalcoólico HCl-R e fita de Mg
Coloração rósea
ou vermelha O
Antociânico Extrato
Hidroalcoólico Alteração do pH
Mudança de
coloração O
Taninos Extrato
Aquoso
Sol.alcaloídica
Sol. de FeCl3
Sol. K2Cr2O7
Formação de
precipitado O
Fenóis Totais Extrato
Aquoso Sol. de FeCl3
Mudança de
coloração O
Açúcares
Redutores
Extrato
Aquoso e
Polissacarídeo
Reagente de Benedict Coloração
vermelho tijolo +++
Amilo Polissacarídeo Lugol Azul violácea
intenso O
Cumarinas Extrato
Hidroalcoólico
CCD em sílica.Eluente:
Hex:AcOET:MeOH
(6:13:1) Revelada com
KOH 5%
Fluorescência
verde sob luz +
Esteróides Extrato Etéreo Anidrido Acético e
H2SO4 Coloração verde ++
Triterpenóides Extrato Etéreo Anidrido Acético e
H2SO4
Coloração
castanha O
Fonte: Adaptado de Bezerra, 2013
62
6.6 Determinação do teor do liofilizado e do polissacarídeo obtidos
O tempo de liofilização definida para a obtenção do produto final em condições
apropriadas de desidratação foi de 72 horas. Para a amostra do extrato aquoso submetido à
liofilização, foi utilizado o total de 32,69 g de raiz, resultando em 17,71% de massa residual
de liofilizado.
Quanto à amostra do extrato aquoso, da qual foi obtido o polissacarídeo, foi
utilizado o equivalente à 147,14 g da raiz dessecada e triturada, no intervalo granulométrico
de 500 µm a 1400 µm e resultou em 13,0% de polissacarídeo seco e purificado.
6.7 Testes de solubilidade
A tabela 5 mostra o resultado encontrado para a solubilidade do polissacarídeo nas
quatro condições estabelecidas na metodologia: água a 100 ºC, etanol, diclorometano e água a
temperatura ambiente. Dessas quatro condições, foi quantificado apenas a solubilidade em
água a temperatura ambiente, a qual resultou em 7%.
6.8 Caracterização macroquímica do polissacarídeo
A caracterização macroquímica do polissacarídeo foi positiva para inulina nos dois
testes aplicados, conforme mostrado na Figura 14.
Tabela 5 - Resultado da solubilidade do polissacarídeo extraído
das raízes de P. calceolaria.
SOLVENTE RESULTADOS
ÁGUA (25°C) PRATICAMENTE INSOLÚVEL
ÁGUA (100°C) SOLÚVEL
ETANOL (25° C) INSOLÚVEL
DICLOROMETANO (25°C) INSOLÚVEL
Fonte: Autoria própria
63
6.9 Análise química do polissacarídeo por CLAE
Após a hidrólise do polissacarídeo, realizou-se análise por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência como mostrado na Figura 15, nos tempos de retenção 13,24 para frutose e
12,37 para glicose.
Fonte: Autoria própria
Figura 14 – Caracterização macroquímica do polissacarídeo. 1: Polissacarídeo ao qual foi realizado teste macroquímico; 2: a) Polissacarídeo após adição de timol 10%; b) Polissacarídeo após adição de alfa-naftal 10%.
Figura 15 - Cromatograma obtido a partir de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
presente nas raízes de Pombalia calceolaria.
Fonte: Autoria própria
64
6.10 Análise química do polissacarídeo por ressonância magnética nuclear (RMN)
O espectro de RMN 13C (Figura 16) ilustra um espectro típico de inulina. De
acordo com a literatura, em um mesmo espectro podem haver sinais sobrepostos e não
sobrepostos (YANG et al., 2011). Dessa forma, são divididos em duas categorias. No espectro
de RMN 13C, os sinais de átomos de carbono em δ 92,05, 71,61, 72,97, 70,03, 72,66 e 60,65
ppm foram atribuídos a uma unidade α- D-glucose, correspondendo a uma categoria. Os
sinais δ 61,28-61,64, 102,81-103,72, 77,14-77,83, 74,28-76,02, 81,75-82,21 e 61,77-62,06
ppm foram sinais de sobreposição, aos quais, devido à pequena diferença de desvios químicos
em cada faixa foram atribuídos as cadeias de unidades de frutose com ligações β (2→1)-D-
frutosil-frutose. A presença da ligação β-D- fructofuranosil foi confirmada pelos sinais em δ
81,75-82,21 ppm (CH-5). Além disso, o mesmo espectro evidencia claramente a presença de
seis sinais sobrepostos do carbono anomérico da frutose (C-2), como indicado na Figura 15,
sugerindo, de acordo com a literatura (APOLINÁRIO et al., 2014), um alto grau de
polimerização, GP>20.
Figura 16 - Espectro de RMN - ¹³C (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.
Fonte: Autoria própria
65
No espectro do DEPT- 135 (Figura 17) é possível identificar pelos sinais em δ
61,28 – 62,06 os CH2 presentes nas moléculas de frutose que correspondem aos carbonos C1
e C6.
Os espectros de RMN 1H (Figura 18) e HSQC foram realizados para atribuir
prótons correlacionados ao carbono (Figura 19). Esta experiência demonstrou sinais de
correlação CH para o grupo D-glicosil: CH-1g (δ 92,05 / 5,3 ppm), CH-2g (δ 71,6 / 3,68
ppm), CH-3g (δ 72,97 / 3,10 ppm), CH-4g (δ 70,03 / 3,45 ppm), CH-5g (δ 72,66 / 3,2 ppm) e
CH2-6g (δ 60,55 / 3,82 ppm), onde “g” corresponde aos “CH”s da glicose. Três correlações
CH foram visivelmente atribuídos ao grupo frutosil: CH-3 (δ 77,14-77,83 / 4,38 ppm, banda
larga), CH-4 (δ 74,28-76,02 / 4,02-4,38) e CH-5 (δ 81,75-82,21 / 3,82-3,85 ppm) (LIU et al.,
2012).
Na Tabela 6, pode-se observar os sinais dos espectros de RMN 1H e RMN 13C da
inulina de P. calceolaria os quais apresentaram-se aproximados com os da inulina descrita na
literatura (YANG et al., 2011), de acordo com a Figura 20 e com os da sacarose, exceto que
os sinais da inulina provenientes de P. calceolaria foram mais sobrepostos.
Figura 17 - Espectro de RMN - DEPT 135 (125 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.
Fonte: Autoria própria
66
Figura 18 - Espectro de RMN - ¹H (500 MHz, DMSO-6) do
polissacarídeo de P. calceolaria.
Fonte: Autoria própria
Figura 19 - Espectro de RMN - HSQC (500 MHz, DMSO-6) do polissacarídeo de P. calceolaria.
Fonte: Autoria própria
67
Amostra
Monossacarideos
e resíduos
δ 1H/13C (ppm)
H-1/C-1 H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C-6
Sacarose
(literatura)*
δ Glcp (1→
β – Fruf(2→
5,29
92,1
3,57
61,3
3,44
71,0
-
103,6
3,65
72,5
4,10
76,4
3,36
69,2
3,94
71,9
3,88
69,2
3,94
73,9
3,81
60,1
3,71
62,3
Inulina
(literatura)**
δ Glcp (1→
-β -Fruf(2 →
5,34 92,1
3,44 71,1
3,68 72,5
3,37 69,2
3,75 72,3
3,74 60,1
3,57-3,83 60,5-61,0
103,0-103,6
4,01-4,18 76,7-77,4
3,93-4,01 73,8-74,4
3,74-3,77 81,0-81,2
3,72-3,83 61,0-62,3
Inulina
(P.
calceolaria)
δ Glcp (1→
β – Fruf (2 →
5,3 92,05
3,68 71,6
3,10 72,97
3,45 70,03
3,20 72,66
3,82 60,55
3,57-3,68
61,2- 61,6
-
102,8-
103,7
4,38 largo
77,1-77,8
4,02-4,38
74,2-76,0
3,82-3,85
81,7-82,2
3,83-3,99
61,7- 62,0
Tabela 6 - Dados de espectros de RMN 1H e RMN 13C da inulina de P. calceolaria
versus inulina da literatura.
Fonte: Autoria própria
* Oliveira et al., 2007
** Jarrell et al, 1979
Figura 20 – A. Estrutura química prevista para a inulina das raízes de P. calceolaria; B. Estrutura química da sacarose.
OHO
OH
HO
OOHO
OH
OHO
OHOH
OH
HO
O
OHO
OH
HO
OH
On
1g
2g3g
4g
5g
6g
1
2
34
5
6
n+1
n+2
n+3n+4
n+5
n+6
A. B.
Fonte: A. Jarrell et al, 1979; B. Oliveira et al., 2007
68
6.11 Análise química do polissacarídeo em CPG
Para o volume de eluição (Ve) do pico da amostra, em 10,24 mL (Figura 22) foi
estimada uma massa molar de pico (Mp) correspondente a 4,0 x 10³ Da, quando substituído
esse valor (Ve) na equação de regressão linear (1) obtida pela curva de calibração (Figura 21)
com padrões de pululana, como mostrado na Figura 23.
Figura 21 - Curva de calibração dos padrões de pululana Shodex P-82.
logMp = 17,186 - 1,327 Ve (1)
Fonte: Autoria própria
69
Figura 22: Cromatograma do polissacarídeo de P. calceolaria
obtido por Cromatografia de Permeação em Gel.
Fonte: Autoria própria
Figura 23 – Curvas do padrões de pululana.
Fonte: Autoria própria
70
6.12 Efeito da adição in vitro do polissacarídeo na contração induzida por CCh
No início dos experimentos com o polissacarídeo, uma vez que este é insolúvel
em água a temperatura ambiente, foi preparada uma solução mãe do mesmo, solubilizando-o
em água a temperatura de aproximadamente 100ºC. A solução, após retornar à temperatura
ambiente, foi então diluida para as concentrações realizadas no experimento.
Conforme metodologia descrita na seção 5.2.13, no início dos ensaios, o tecido
traqueal teve sua responsividade avaliada através da exposição do mesmo à solução
despolarizante de K+ (60 mM), o qual produziu contrações sustentadas. Após a confirmação
da responsividade do tecido, foi realizada a lavagem da preparação e por conseguinte o
retorno à linha de base. Em seguida, foi adicionado CCh (1 μM) à cuba, produzindo
contrações submáximas a partir de onde, após se estabelecido o platô, foi iniciada a adição
cumulativa de concentrações crescentes do polissacarídeo (1-1000 μg/mL), com intervalo de 5
minutos entre as concentrações. Conforme pode se observar na Figura 24, a exposição do
tecido traqueal à solução do polissacarídeo não provocou alteração na contração sustentada
induzida pelo CCh 1 μM, onde o máximo de relaxamento obtido ocorreu na última
concentração, 5,2 ± 1,5% (n=7, p>0,05 ANOVA).
Figura 24 - Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia
de rato na presença de diferentes concentrações de polissacarídeo (n=7).
Fonte: Autoria própria
71
6.12 Efeito da adição in vitro do EALPC na contração induzida por CCh
Após o período de avaliação da viabilidade tecidual com K+ (60 mM), deu-se
início ao ensaio. Este experimento foi realizado fazendo a comparação entre a resposta do
controle e a resposta do EALPC simultaneamente. Ficou estabelecido como controle as cubas
contendo anéis de traqueia apenas na presença de CCh, com o objetivo de avaliar a contração
sustentada no tecido traqueal ao longo do experimento sem a adição do EALPC.
Simultaneamente, em outras cubas, além do CCh inicialmente adicionado, foram adicionadas
as concentrações cumulativas de EALPC (1-1000 μg/mL), com intervalo de 10 min entre as
concentrações. Foi observado que tanto o grupo controle quanto o grupo tratado com EALPC
relaxaram, embora tenha havido uma diminuição mais pronunciada em função da adição de
EALPC a partir da concentração de 300 μg/mL (p<0,05, ANOVA seguido de teste de Tukey).
O valor de tensão chegou a 38,46±5,10% da pré-contração de CCh na concentração de 1000
μg/mL de EALPC, enquanto no ponto equivalente do controle a queda atingiu 55,4±9,5%
(Figuras 25 e 26), resultando em uma redução efetiva da resposta contrátil do EALPC de
aproximadamente 20% em relação ao controle.
Figura 25 - Traçado representativo do efeito de EALPC sobre a contração
induzida por CCh
Fonte: Autoria própria
72
Gráfico com valores médios para a contração submáxima de anéis de traqueia de
rato na presença de diferentes concentrações de EALPC (n=8). Cada ponto
representa a média ± E.P.M.
Figura 26 - Gráfico com efeito do EALPC sobre a contração induzida por CCh em traqueia
isolada de rato.
Fonte: Autoria própria
73
DISCUSSÃO
74
7 DISCUSSÃO
O presente estudo com as raízes de Pombalia calceolaria, herbácea perene, pouco
ramificada, predominante no Nordeste brasileiro, trata-se de uma pesquisa farmacognóstica
inédita em muitos aspectos, uma vez que dessa espécie vegetal existem poucos registros em
literatura.
Na raiz de P. calceolaria a presença de frutanos do tipo inulina, caracterizam este
sistema como sendo de reserva. Como descrito no ítem 5.1.1, a retenção de alto teor de
umidade nas raízes (frescas) de P. calceolaria, tem relação direta com o alto teor de inulina
presente em suas raízes, uma vez que este polissacarídeo exerce função biológica de proteção
contra a desidratação deste órgão vegetal que, no caso dessa espécie, é nativa de regiões
salinas e semi-áridas..
Além disso, o registro do predomínio deste carboidrato de reserva nas células do
córtex parenquimático caracteriza com mais precisão o local de reserva da inulina nas raízes
de P. calceolaria, uma vez que em muitas outras espécies vegetais, o local de reserva
acontece tanto no córtex parenquimático, quanto no córtex cambial, ou apenas no córtex
cambial. Este registro, somado ao registro morfoanatômico isodiamétrico das células
parenquimáticas, do floema e xilema, demonstradas na Figura 11, ambos inéditos, é de alta
relevância, pois além de caracterizar melhor esta espécie, também demonstra a diferença
anatômica desta raiz frente à raiz de Psychotria ipecacuanha, esta por sua vez já
extensamente registrada em literatura (GOMES, 2007). Na raiz de P. calceolaria essas
reservas, provavelmente, são utilizadas para a propagação vegetativa da planta (RIZZINI;
HERINGER, 1961; CARVALHO, 1999; BELL, 1993).
Diferentemente do que está registrado na literatura por Lorenzi & Matos (2002),
de que a propagação de P. calceolaria é somente por sementes, foi constatado por Silva
(2011), que houve enraizamento desta espécie utilizando a propagação vegetativa por
estaquia. Desta forma, pode-se dizer também que é possível o enraizamento de estacas desta
espécie sem necessidade do uso de reguladores de crescimento para estimular a rizogênese.
Isto facilita a propagação por estaquia da P. calceolaria em casa de vegetação.
Atualmente o uso da planta medicinal como recurso alternativo para o tratamento
da saúde está em contínua expansão em nível mundial. Para o desenvolvimento de
medicamentos a partir de uma droga vegetal algumas barreiras necessitam serem vencidas,
dentre elas a questão da contaminação microbiana da matéria-prima. As preparações obtidas a
partir de drogas vegetais, geralmente, são oriundas de plantas coletadas, secas e empacotadas
sem muitos cuidados de higiene e/ou controle sanitário, situação essa muito comum com as
75
plantas medicinais dessecadas a sombra vendidas em mercados populares, como é o caso das
raízes de P. calceolaria. Nesse sentido, a literatura registra que a qualidade microbiológica de
matérias-primas vegetais e produtos derivados geralmente apresentam índice de contaminação
microbiana acima dos níveis internacionalmente aceitos para medicamentos (SOUZA,
LIONZO, PETROVICK, 2006).
Para o controle de qualidade da droga vegetal, a secagem, tem uma alta relevância
na obtenção da mesma, uma vez que o produto final, que chega ao consumidor, deve ser
isento de condições favoráveis ao crescimento microbiano e às reações de hidrólise. Tais
condições comprometem tanto a qualidade do material vegetal, através da degradação de seus
constituintes químicos, quanto também a saúde do consumidor, além de facilitar o
armazenamento e o transporte sem riscos de deterioração (SHARAPIN, 2000).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou em Maio de
2014 a RDC nº 26, a qual define droga vegetal a planta medicinal ou suas partes, que
contenham as substâncias responsáveis pela ação terapêutica, após processos de
coleta/colheita, estabilização, quando aplicável, e secagem, podendo estar na forma íntegra,
rasurada, triturada ou pulverizada. Por isso a preocupação da ANVISA ao publicar a RDC nº
10 de março de 2010 que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais e a RDC Nº 26 de
maio de 2014 que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a
notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. A publicação destas RDCs demonstram, por
parte da agência regulatória de saúde do país, a preocupação em garantir matéria-prima
vegetal de qualidade, sejam para a produção de fitoterápicos ou ainda para o uso pelo
consumidor, da droga vegetal ou do produto tradicional fitoterápico em preparações caseiras.
Por esta razão, a realização de estudos para obtenção tanto da droga vegetal quanto do
produto tradicional fitoterápico de qualidade, que atenda a legislação vigente, se faz
necessária (AGUIAR, 2013).
A etapa de secagem e determinação final da droga seca é um ensaio que determina
a quantidade de água presente na droga. Segundo Oliveira, Akisue e Akisue (1991) o teor de
umidade nos vegetais frescos é conhecido. As raízes apresentam teor de umidade de 50 a 85%
de tal forma que condiz com os valores encontrados para as operações de secagem (p. 57). As
raízes de P. calceolaria predominante nas regiões litorâneas, salinas e do semi-árido
nordestino, são ricas em frutanos do tipo inulina, a qual exerce função biológica de proteção
contra a desidratação na própria raiz, de forma que esta retém um alto teor de umidade. Nesse
contexto, a produção da droga vegetal a partir dessas raízes exige um cuidado a mais pelo
caráter higroscópico de seu marcador químico, a inulina.
76
Segundo BRASIL (1988), pelos motivos já descritos nos parágrafos anteriores, o
estabelecimento do teor de umidade residual para drogas vegetais é de 8 a 14%, valor este
compatível com o resultado expresso na Tabela 2 (p. 57), o qual demonstra que a escolha do
método de secagem para a obtenção de droga vegetal das raízes de P. calceolria foi
satisfatória.
Quanto aos aspectos granulométricos, a heterogeneidade obtida deve-se às
características morfológicas da raiz, a qual tem um aspecto tortuoso e com diâmetro bastante
diversificado ao longo de seu comprimento. O grau de divisão pode ser expresso por meio da
referência à abertura nominal da malha do tamis utilizado. Segundo Sharapin (2000), a
extração de uma droga em partes inteiras ou dividida em fragmentos grossos seria incompleta
devido a pobre penetração de solvente no tecido vegetal. O processo de extração seria ainda
igualmente muito lento, uma vez que as membranas celulares atuam como verdadeiras
barreiras que dificultam o processo de extração. A partir do cálculo do tamanho médio das
partículas, obtido do pó triturado homogeneizado de P. calceolaria, é possível classificar este,
segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª edição, como pó grosso, o qual não seria apropriado para
a extração aquosa de seus ativos.
De outra forma, a divisão excessiva, com formação de pós muito finos, pode
causar problemas durante a extração, como por exemplo, compactação do pó nos processos de
percolação o que dificulta a passagem do solvente e gera uma extração incompleta da droga.
Nos processos de maceração, as partículas muito finas podem passar para o extrato causando
turbidez. Por essa razão, a preparação do extrato foi procedida com a raiz de P. calceolria no
intervalo granulométrico entre 500 a 1400 µm (p. 60).
A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de impurezas
inorgânicas não-voláteis que podem estar presentes como contaminantes, (FARIAS,
2003), assim como a determinação do teor de cinzas insolúveis em ácido destina-se à
verificação da presença de sílica e constituintes silicosos na droga (BRASIL, 2010). As
raízes de ipeca-verdadeira devem apresentar no máximo um teor de 5% de cinzas
totais (BRASIL, 1977). Observa-se, assim, que a P. calceolaria atende a esse parâmetro.
Essas determinações constituem referências de qualidade e caracterização da matéria-prima
vegetal.
Todo extrato vegetal, seja ele de natureza aquosa ou orgânica, refere-se a um
fitocomplexo, ou seja, é constituído por substâncias chamadas metabólitos vegetais, primários
e/ou secundários, que apresentam uma potencial ação farmacoterapeutica quando
administrados como medicamentos. Enquanto medicamentos farmacoterápicos apresentam
77
como principal característica a presença do princípio ativo isolado. Os fitoterápicos ou
produtos tradicionais fitoterápicos caracterizam-se pela ação sinérgica de um conjunto de
substâncias químicas, dentre as quais podem existir uma prevalente, chamada de marcador, ou
seja, aquela que terá uma influência mais evidente na ação farmacoterapeutica ou no controle
de qualidade daquela espécie vegetal. Segundo a RDC nº 26/2014, marcador é definido como
substância ou classe de substâncias (ex.: alcaloides, flavonoides, ácidos graxos) utilizada
como referência no controle da qualidade da matéria-prima vegetal e do fitoterápico,
preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico. O marcador pode ser do tipo
ativo, quando relacionado com a atividade terapêutica do fitocomplexo, ou analítico, quando
não demonstrada, até o momento, sua relação com a atividade terapêutica do fitocomplexo.
A constituição química das raízes de P. calceolaria foi inicialmente investigada
através do preparo de extratos orgânicos, etanólico e acetônico, os quais foram purificados,
em trabalhos anteriores (PONTES, 2012), em coluna cromatográfica clássica onde foram
obtidas frações de baixo teor e alta polaridade. Na sequência, ao ser realizada a prospecção
fitoquímica nas raízes dessa espécie vegetal, foi verificada a presença de saponinas, esteróides
e açúcares redutores. Uma vez conhecido o potencial terapêutico de polissacarídeos extraídos
de espécies vegetais como arabinogalactanas, as quais, segundo Matos (2007), apresentam
mais de seiscentos trabalhos científicos referenciando a sua atividade imunoestimulante,
procedeu-se o preparo do extrato aquoso a partir das raízes de P. calceolaria seguida da
adição de solvente orgânico (como descrito no item 5.2.7) com o intuito de investigar a
presença e o teor de açúcar, onde foi obtido um polissacarídeo branco, com aspecto amorfo,
com odor e sabor neutros.
A separação de misturas complexas de oligossacarídeos não é fácil devido à
semelhança estrutural e o peso molecular, além de que também a sua identificação é
dificultada pela falta de produtos comerciais disponíveis (BROKL et al., 2011).
Uma vez que os frutanos são normalmente encontrados na forma de misturas
complexas de carboidratos com diferentes GPs, composição de monômeros e ligações
glicosídicas, a sua análise é um passo fundamental para adquirir a informação básica sobre o
próprio polímero, bem como para aprofundar a compreensão do seu mecanismo de ação, que
é dependente da sua estrutura química.
A inulina está presente em plantas com misturas heterogêneas, com diferentes
graus de polimerização (GP) e estruturas químicas variadas. Os tipos de frutanos encontrados
em plantas (moléculas oligoméricas ou poliméricas) são dependentes da espécie relacionados
com as condições ambientais e estágios de desenvolvimento da planta (MANCILLA-
78
MARGALLI; LOPEZ, 2006). As propriedades físico-químicas e funcionais da inulina estão
diretamente correlacionados com o GP, assim como com a presença de ramificações.
Dentre o amplo leque de pesquisas a serem realizadas em estudos posteriores com
as raízes de P. calceolaria, um diz respeito a investigação das propriedades farmacológicas
atribuídas ao frutano proveniente dessas raízes. Ao considerar o resultado obtido de 13,0% de
inulina presente nas raízes de P. calceolaria e correlacionando-o com o teor obtido do
liofilizado a partir do extrato aquoso nas referidas raízes, que foi de 17,71%, é possível
verificar o alto teor desse polissacarídeo nas mesmas. Além disso, tendo como referência os
registros em literatura do teor de inulina na chicória (Cichorium intybus) 28% (SILVA et al.,
2008), na alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus), 12,21% (GUO et al., 2015) e na
batata Yacon (Smallanthus sonchifolius) 19,75% (ALLES; TESSARO; NOREÑA, 2015) o
valor encontrado nas raízes de P. calceolaria mostraram-se como resultados promissores, para
torná-la uma fonte de extração de inulina proveniente de espécie de origem brasileira,
diferentemente das três citadas anteriormente, principais fontes atuais de extração de inulina
no mercado mundial e que são de origem estrangeira
Atualmente já é conhecido na literatura que a inulina pode ser uma alternativa
como adjuvantes de medicamentos por apresentar estabilidade na presença das enzimas
gástricas e intestinais. Uma ampla revisão publicada recentemente por Imran et al. (2012)
aborda diversas aplicações da inulina como carreadores de fármacos. Além de ser um
estabilizador adequado de vacinas, vários trabalhos têm relatado um papel adjuvante na
obtenção da inulina para resposta imune após a vacinação (MENSINK et al., 2015). O fato da
inulina não ser destruída no trato gastrointestinal (TGI) representa uma alternativa para
proteger o TGI de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINE´S) (IMRAN et al.,
2012).
Segundo Kim, Faqih, Wang (2001), a solubilidade da inulina na água aumentou
notavelmente com a temperatura, sendo praticamente insolúvel a 25ºC e atingindo cerca de
35% (p/v) a 90ºC, além de que a produção industrial é baseada na difusão em água quente.
Este estudo, mais uma vez, corrobora com as propriedades de solubilidade da inulina extraída
das raízes de P. calceolaria, onde foi encontrado 7% de solubilidade em água a temperatura
ambiente, insolubilidade em solventes orgânicos como etanol e diclorometano e solubilidade
em água quente. Normalmente a solubilidade dos polímeros diminuem com o aumento do
grau de polimerização (WADA, 2005).
Segundo revisão realizada por Mensink (2015), uma transição vítrea (Tg) mais
elevada está correlacionada com um peso molecular mais elevado, de forma que este também
79
indica que os cristais de inulina que se dissolvem a temperaturas mais elevadas são compostos
de inulina de maior peso molecular. Ainda segundo o mesmo autor, a inulina pode apresentar
uma variação de peso molecular no intervalo de 5,0 x 10² a 1,3 x 104 Da. Exemplos mais
conhecidos são as inulinas comercializadas provenientes da marca Sigma®, sendo aquela
extraída da chicória (Cichorium intybus) com peso molecular de 4,6 x 10³ Da e a inulina
obtida da Alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus) de peso molecular aproximado de
3x10³ Da. Enquanto que para a inulina extraída do extrato aquoso das raízes de P. calceolaria
foi encontrado, neste trabalho, o peso molecular estimado de 4,0 x 10³ Da, evidenciando que
este resultado encontra-se dentro do esperado descrito em literatura para esse tipo de
polissacarídeo.
Pelas razões expostas acima, o presente trabalho fez um estudo preliminar com a
inulina proveniente das raízes de P. calceolaria, uma vez que o polissacarídeo, ao ser obtido
do extrato aquoso das raízes, no início do estudo, ainda tinha sua natureza química
desconhecida. Este estudo preliminar foi realizado através de avaliação miorrelaxante do
polissacarídeo em traqueia isolada de rato, a fim de investigar a correlação deste com a ação
antitussígena e expectorante popularmente atribuída ao extrato aquoso. Porém, não houve,
nessa avaliação, um resultado significativo que justificasse o polissacarídeo como responsável
pelo conhecido uso popular dessa raiz ainda que o teor encontrado no extrato aquoso tenha
sido alto. Para verificar o grau de polimerização, as ramificações, os tipos de ligações
presentes nesse polímero, serão necessários maiores investimentos nessa pesquisa.
No entanto, ainda que a inulina, isoladamente, tenha inúmeras atividades
terapêuticas já relatadas na literatura, este trabalho também teve o propósito de avaliar a
atividade miorrelaxante em traqueia de rato, tanto do polissacarídeo isolado, como já foi
mensionado anteriormente, quanto do extrato aquoso obtido das raízes. O principal motivo
para a realização deste experimento farmacológico no modelo citado é pelo fato de o amplo
uso popular do extrato aquoso das raízes de P. calceolaria fazer referência à conhecida ação
antitussígena e expectorante (CARTAXO, SOUZA, ALBUQUERQRE, 2010; LORENZI,
MATOS, 2008; SARAIVA et al., 2015). Porém, a avaliação miorrelaxante do extrato aquoso
liofilizado de P. calceolaria (EALPC) como possível agente miorrelaxante sobre traqueia
isolada de rato pré-contraída com carbacol foi de apenas 20%, resultado este insuficiente para
justificar o efeito expectorante conhecido popularmente. No entanto, outros modelos
farmacológicos podem ainda ser avaliados com o intuito de investigar o potencial uso
antitussígeno e expectorante do extrato aquoso da raízes de P. calceolaria.
80
CONCLUSÕES
81
8 CONCLUSÕES
O estudo inédito morfoanatômico das raízes de Pombalia calceolaria é uma
contribuição relevante na diferenciação das raízes dessa espécie vegetal em relação às
raízes de Psychotria ipecacuanha, muitas vezes confundidas pela semelhança
morfológica.
A confirmação da presença de cristais de inulina nas raízes de P. calceolaria, revela,
no aspecto botânico, que trata-se de orgão vegetal de reserva, pelo alto teor de
polissacarídeo.
O presente estudo é de importante contribuição para o controle de qualidade desta
espécie vegetal, uma vez que traz ao conhecimento do meio científico resultados
farmacopeicos até então desconhecidos como o teor de umidade residual, o teor de
cinzas totais, a determinação granulométrica das raízes trituradas de P. calceolaria, de
forma a contribuir com o desenvolvimento da droga vegetal dentro das especificações
estabelecidas pelas normas vigentes do Brasil;
Revela que no Nordeste brasileiro a ipecacunha dos raizeiros (Pombalia calceolaria)
tem como marcador analítico a inulina, constituindo-se como um parâmetro de
diferenciação da espécie Psychotria ipecacuanha, conhecida por ipecacuanha
verdadeira, que de acordo com a literatura (GOMES, 2007) indica a presença de
amido em sua constituição química.
O polissacarídeo encontrado nas raízes de Pombalia calceolaria apresenta potenciais
propriedades, no campo farmacêutico e alimentar, que tem despertado interesse
crescente em pesquisas em todo o mundo.
Os primeiros estudos farmacológicos registrados em literatura com as raízes de
Pombalia calceolaria, cujos resultados estão descritos neste trabalho, mostraram-se ainda
preliminares, evidenciando a necessidade de continuidade na pesquisa de novos modelos
82
farmacológicos para comprovar o uso popular broncodilatador extensamente difundido
no Nordeste Brasileiro.
83
REFERÊNCIAS
84
REFERÊNCIAS
AGUIAR, L.A. Inibição da contratilidade do músculo liso traqueal de ratos por um diterpeno caurano isolado de Croton argyrophylloides. 2009. 96f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Fortaleza-CE, UECE, 2009. AGUIAR, W.R. Desenvolvimento de técnicas farmacêuticas para obtenção da droga vegetal a partir dos brotos e renovos de Myracrodruon urundeuva Allemão ("Aroeira-do-sertão"). 2013. 103f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Fortaleza: UFC, 2013.
AGRA, M.F., BARACHO, G.S., NURIT, K., BASÍLIO, I.J.L.D.,COELHO, V.P.M. Medicinal and poisonous diversity of the flora of “Cariri Paraibano”, Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 111, p. 383 – 395. (2007) ALBUQUERQUE, U.P., MEDEIROS, P.M., ALMEIDA, A.L., MONTEIRO, J.M., NETO, E.M.F.L., MELO, J.G., SANTOS, J.P. Medicinal plants of the caatinga (semi-arid) vegetation of NE Brazil: A quantitative approach”. Journal of Ethnopharmacology, v. 114, p. 325-354. 2007. ALLES, M. J. L.; TESSARO, I. C.; NOREÑA, C.P.Z. Concentration and purification of Yacon (Smallanthus sonchifolius) root fructooligosaccharides using membrane technology. Food Technol. Biotechnol., v. 53 (2), p.190-200, 2015. ANVISA. Consolidado de normas da COFID, 2015. Brasília, 2015. Disponível em:http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/f8183a004707cee086319741cdd33a01/Consolidado+COFID+V.pdf?MOD=AJPERES. Acessado em: 01 Nov 2015. APOLINÁRIO, A.C., et al. Inulin-type fructan: A review on different aspects os biochemical and pharmaceutical technology. Carbohydrate polymers. V. 101. p. 368-378.(2014). AUDOY, S. A. L. et al. Development of a dried influenza whole inactivated virus vaccine for pulmorary immunization. Vaccine, v. 29, n. 26, p. 4345-52, 2011. AYROSA, A. M. I. B. Liofilização: ciência ou arte? Revista Engenharia FAAP, São Paulo, v. 16, n. 44, p. 40-45, 2004. BALBINO, E. E.; DIAS, M. F. Farmacovigilância: um passo em direção ao uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos. Rev. Bras. Farmacogn. 20, 992–1000, 2010. BAI, Y.; ZHANG, M.; SANDERSON, M.J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. Am J. Respi. Cell. Mol. Biol., v. 36, p.122-130, 2007. BANDEIRA, M.A.M. Aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Fr. Allemão): constituintes químicos e ativos da planta em desenvolvimento e adulta. 322f. Tese (Doutorado em Química). Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2002.
85
BASTOS, V. P. D. Ação broncodilatadora e antiinflamatória do 1,8-cineol em modelo experimental de asma em cobaias. 2009. 163f. Tese (Doutorado). Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Universidade Federal do Ceará – Fortaleza, 2009. BEAUVISAGE, M. L’inuine das lês Ionidium. Étude anatomique du faux ipecacuanha Blanc du Brésil, Ionidium ipecacuanha Vent. Bull. Soc. Bot. Lyon 2, 12-23, 1889.
BELL, A.D. Plant form: an illustrated guide to flowering plant morphology. Oxford: Oxford University Press, 1993. 341 p.
BERRIDGE, M.J. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms. The journal of Physiology, v. 586, p. 5047-5061, 2008. BEZERRA, G. P. Estudo farmacoquímico bioguiado pela atividade miorrelaxante do extrato etanólico das cascas do caule de Hymenaea courbaril L. (Jatobá). 128 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Fortaleza: UFC, 2013. BILLMEYER, FREUD W. Textbook of polymer science. 3ª Ed. New York: Willey, 1984. 578p. BOERS J.E.; AMBERGEN A.W.; THUNNISSEN F.B. Number and proliferation of basal and parabasal cells in normal human airway epithelium. Am J Respir Crit Care Med., v. 157 (6), p. 2000-2006, 1998. BORSATO, Aurélio Vinícius. Secagem da Camomila sob diferentes temperaturas e vazões específicas de ar. 2003. 77f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2003. BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 3. ed. Brasilia: ANVISA, 1977. BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 4. ed. Brasília: ANVISA, 1988. BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 5. ed. Brasília: ANVISA, 2010. BRASIL, Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de Assistência Farmacêutica. Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos - Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 60p. BROKL, M.; HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, O.; SORIA, A.C.; SANZ, M.L. Evaluation of different operation modes of high performace liquid chromatography for the analysis of complex mixtures of neutral oligasoccharides. J. Chromatogr. A.,v.1218, n.42, p.7697-703, 2011. BROUSSALIS, et al., First cyclotide from Hybanthus (Violaceae). Phytochemistry, v. 58, p. 47 – 51, 2001.
86
CALEFFI et al., Isolation and prebiotic activity of inulin-type fructan extracted from Pfaffia glomerata (Spreng) Pederson roots. International Journal of Biological Macromolecules, 80:392-399, 2015. CARABIN, I.G.; FLAMM, W.G. Evaluation of safety of inulin and oligofructose as dietary fiber. Regul. Toxicol. Pharmacol., New York, v.30, p.268-282, 1999. CARTAXO, S. L.; SOUZA, M.M.A.; ALBUQUERQUE, U.P. Medicinal plants with bioprospecting potential used in semi-arid northeastern Brazil. Journal of Ethnopharmacology. v. 131, p.326-342, 2010. CARVALHO, M.A.M. Variações no conteúdo e na composição de frutanos em rizóforos de Vernonia herbacea (Vell) Rusby. Campinas, 1991. 111p. Tese (Doutorado) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas. CARVALHO, J. C. et al. Anti-inflammatory activity of the crude extract from the fruits of Pterodon emarginatus. Vog. J Ethnopharmacol. v. 64; p. 127-133, 1999. CARVALHO, et al. Hybanthus calceolaria poisoning in cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. v. 26, n. 5, p. 674-677, 2014. CHAVES T. P. et al. Lambedor: um conhecimento científico popular em abordagem científica. Revista de Biologia e Farmácia, João Pessoa, v. 2, n. 1, p. 1-19. 2008. CHEN, et al.. Isolation and characterization of novel cyclotides from Viola hederacea. Solution structure and anti-HIV activity of vh-1, a leaf-specific expressed cyclotide. J. Biol. Chem., v. 280, n. 23, p. 22395 – 22405, 2005. CHEN, C.; WAGONER, P.K. Endothelin induces a nonselective cation current in vascular smooth muscle cells. Circ. Res., v. 69, p.447-454, 1991. COSTA, Aluizio Fernandes. Farmacognosia. 3. ed. V.III, Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1987. 549p. CRAIK, D. J. Discovery and applications of the plant cyclotides. Toxicon., v. 56, p. 1092-1102, 2010. DUBOIS, et al. Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Analytical Chemistry, v. 28, n. 3, p. 350 – 356, 1956 EVANS M.J.; VAN WINKLE L.S.; FANUCCHI M.V.; PLOPPER C.G. Cellular and molecular characteristics of basal cells in airway epithelium. EXP Lung Res., v. 27, p.401-415, 2001. FLORENZANO, F., H. Cromatografia por exclusão de tamanho – SEC, GPC ou GFC. Disponível em: HTTP://www.slideplayer.com.br/slide/4336026/. Acesso em: 5 nov. 2015. GOMES, R. S. D. L. Estudo comparativo da Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes – Rubiaceae – do Bioma da Amazônia obtida na mata nativa e do cultivo in vitro submetido a diferentes tratamentos de interceptação da radiação solar. 2007.101p.
87
Dissertação. (Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte: UFMG, 2007. GUO et al. Extration, degree of polymerization determination and prebiotic effect evaluation of inulin from Jerusalem artichoke. Carbohydrate polymers, 121, p. 315-319, 2015. GUYTON, A.C.; HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica. 11. ed. Rio de Janeiro; Ed. Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, 2011, 1128p. HALLOCK, et al. Cycloviolins A-D, Anti-HIV Macrocyclic Peptides from Leonia cymosa. J. Org. Chem, v. 65, p. 124-128, 2005. HARKEMA, J. R; WAGNER, J. G. Epithelial and inflammatory responses in the airway of laboratory rats coexposed to ozone and biogenic substances: Enhancement of toxicant-induced airway injury, Experimental and Toxicologic Pathology, v. 57, p. 129-141, 2005. HIROTA, et al. Effects of three different L-type Ca2+ entry blockers on airway constriction induced by muscarinic receptor stimulation. Br. J. Anaesth., v. 90, n. 5, p. 671-675, 2003. HOMAR, J.C.¿Medicinas complementarias o alternativas? Un dilema para el sistema público. Atención Primaria, v. 35, 389–391, 2005. IMRAN, et al. Application and use of Inulin as a tool for therapeutic drug delivery. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, v. 28, 33–45, 2012. INOUE, R.; KURIYAMA, H. Dual regulation of cation-selective channels by muscarinic and a1-adrenergic receptors inthe rabbit portal vein. J. Physiol. Lond, v. 465 p.427-448, 1993. JARRELL, H. C.; CONWAY, T. F.; MOYNA, P.; SMITH, L.C.P. Manifestation of anomeric form, ring structure, and linkage in the ¹³C NMR spectra of oligomers and polymers containing D-Fructose: maltulose, isomaltulose, sucrose, leucrose, I-kestose, Nystose, Inulin, and Grass levan®. Carbohydrate research, v. 76, p. 45-57, 1979. JENNINGS, et al. Isolation, solution structure and insecticidal activity of kalata B2, a circular Protein with a twist: Do Möbius Strips Exist in Nature? Biochemistry, v. 44, p. 851-860, 2004. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: Mc Graw-hill, 1940. 523 p. JUDPRASONG, K., TANJOR, S., PUWASTIEN, P., SUNGPUAG, P. Investigation of Thai plants for potencial sources of inulin-type fructans. Journal of food composition and analysis, v. 24, 642-649, 2011. JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIRO, J. Histologia básica .7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1990. 388 p. KARNOVSKY, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. J. Cell Biol. v. 27, n.137, 1965.
88
KAUR, N.; GUPTA, A.K. Applications of inulin and oligofructose in health and nutrition. J. Biosci., Bangalore, v.27, p.703-714, 2002. KIM, H.R.; HOQUE, M; HAI, C.M. Cholinergic receptor-mediated differential cytoskeletal recruitment of action- and integrin-binding proteins in intact airway smooth muscle. Am J. Physiol. Cell. Physiol., v. 287, p. 1375-1383, 2004. KOMORI, S.; KAWAI, M.; TAKEWAKI, T., OHASHI, H. GTP-binding protein involvement in membrane currents evoked by carbachol and histamine in guinea-pig ileal muscle. J. Physiol. Lond., v. 450, p.105-126,1992. KLANDEER, O.; HOPF, H. Occurrence, metabolism and function of oligosaccharides. In: PREISS, J. (Ed.) The Biochemistry of plants, New York: Academic Press, Carbohydrates: Structure and function. v.3, p. 221-270, 1980. KOZARSKI, M.; et. al. Antioxidative and immunomodulating activities of polysaccharide extracts of the medicinal mushrooms Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis, Ganoderma lucidum and Phellinus linteus Food Chemistry, v. 129, Issue 4, p. 1667-1675, 2011. KRUGER, C. L. Generally recognised as safe (GRAS) notification for Frutafit®. SilverSpring, MD: U.S. Food and Drug Administration, 2002. LAW, K.W.; NG, K.K.; YUEN, K.N.; HO, C.S. Detecting asthma and bronchial hyperresponsiveness in children. Hong Kong Medical Journal, v. 6, p. 99 – 104, 2000. LEAL L. K., et al. Antinociceptive, anti-inflamatory and broncodilator activities of Brazilian medicinal plants containing coumarin: a comparative study. J. Ethnopharmacol., v. 70, n. 2, p. 151-159, 2000. LEAL, L. K. A. M. Contribuição para a validação do uso medicinal de Amburana cearensis (CUMARU): Estudos farmacológicos com o isocampferídeo e o amburosídio. 179f. Tese (Doutorado em Farmacologia). Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. LI, W., ZHANG, J., YU, C., LI, Q., DONG, F., WANG, G., GU, G., GUO, Z. Extraction, degree of polymerization determination and prebiotic effect evaluation of inulin from Jerusalem artichoke. Carbohydrate polymers, 121, 315-319, 2015.
LIU, J., SUN, Y., YU, C., LIU, L. Chemical structure of one low molecular weight and water-
soluble polysaccharide (EFP-W1) from the roots of Euphorbia fischeriana. Carbohydrate
polymers, v. 87, 1236-1240, 2012.
LORENZI, H.; MATOS, F. J. A.. Plantas medicinais no Brasil: Nativas e exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum. 2002. 512 p. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas, 2. ed. Nova Odessa: Editora Plantarum, 2008, p. 544.
89
MANCILLA-MARGALLI, N.A.; LÓPEZ, M.G. Water-soluble carbohydrates and fructan structure patterns from Agave and desylirion species. Journal of Agricultural and food chemistry, v. 54, p.7832-7839, 2006. MARQUES, M. A. Secagem e armazenamento de sementes de Anadenanthera peregrina Var. falcata (Benth.) Altschul e A. colubrina (Vell.) Brenan var. cebil (Griseb.) Altschul. 2007. TESE (Doutorado) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual Paulista, São Paulo: UNESP, 2007. MARTINS, P. M. Influência da temperatura e da velocidade do ar de secagem no teor e composição química do óleo essencial de capim-limão (Cymbopogon citratus D. C. STAPF). 2000. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, 2000. MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais, 3. ed. Fortaleza: Edições UFC, 2007. MAZZARI, A. L. D. A.; PRIETO, J. M. Herbal medicines in Brazil: pharmacokinetics profile and potential herb-drug interactions. Frontiers in Pharmacology, v. 5, p. 162, 2014. MENSINK, M. A., FRIJLINK, H. W., MAARSCHALK, K. V., HINRICHS, W. L. J. Inulin, a flexible oligosaccharide I: Review of its physicochemical characteristics. Carbohydrate polymers, v. 130, p. 405-419, 2015. MEYER, D., BAYARRI, S., TÁRREGA, A., & COSTELL, E. Inulin as texture modifier indairy products. Food Hydrocolloids, v. 25, p. 1881–1890, 2011. MORAIS S. M. et al., Plantas medicinais usadas pelos índios Tapebas do Ceará. Rev. Bras. Farmacogn. v. 15, n. 2. p. 169-177, Abr/Jun 2005. NAKAJIMA M., et al., Immunohistochemical and ultrastructural studies of basal cells, clara cells and bronchiolar cuboidall cells in normal human airways. Pathol. Int. v. 48, p. 944-953, 1998. NAKAZAWA, K.; INOUE, K.; FUJIMORI, K.; TAKANARA, A. Diference between substance P- and acetylcholine-induced currents in mammalian smooth muscle cells. Eur. j. Pharmacol., v.179, p.453-456,1990. OLIVEIRA. et al. Efficacy of Plectranthus ambionicus (Lour.) Spreng in a Murine Model of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Skin Abscesses. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 291592, 9 pages, 2013. OLIVEIRA, D. F. et. al. Atividade de Carboidrato Purificado a Partir da Cebola (Allium cepa L.) e de Carboidratos Comerciais sobre Juvenis de Meloidogyne exigua Goeldi. Nematologia Brasileira, 31 (3), p. 202 – 209, 2007. OLIVEIRA, Fernando de; AKISUE, Gokithi; AKISUE, Maria Kubota. Farmacognosia. São Paulo, SP: Ateneu, 1991. 412p. OLIVEIRA, F. & AKISUE, G. Fundamentos de farmacobotânica e de morfologia vegetal. 3. ed., Ed. Atheneu, SP, 2009.
90
PAREKH, A.B., PUTNEY, J.W. JR., Store-operated calcium channels. Physiological Reviews, v. 85, p. 757-810, 2005. PATTEMORE, et al. The interrelationship among bronchial hyperresponsiveness, the diagnosis of asthma and asthma symptoms. The American Review of Respiratory Disease, v. 142, p. 549-554, 1990. PAULA-SOUZA, J.; BALLARD, JR., H.E. Re-establishment of the name Pombalia, and new combinations from the polyphyletic Hybanthus (Violaceae). Phytotaxa (Online), 183, 1-15, 2014. PEREZ-ZOGHBI, et al. Íon channel regulation of intracelular calcium and airway smooth muscle function. Pulm. Pharmacol. Ther., v. 22, n.5, p.388-397, 2009. PILON-SMITS, et al. Improve performace of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress. Plant Physiology, v. 107, p.125-130, 1995. PINTO, M. E. F. (2013). Peptídeos cíclicos em espécies do semiárido brasileiro e uma cultivada: caracterização e atividade biológica. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista (Instituto de química). Araraquara –SP. (pp. 123-147). 168p, 2013. PONTES, M.T. Biossíntese e degradação de frutanos em diferentes regiões do rizóforo de Vernonia herbácea (Vell.) Rusby – ASTERACEAE. 2005. 111f. Dissertação (Mestrado) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de São Paulo. Piracicaba, SP. 2005. PONTES, A.G.O. Caracterização de glicofrutosanas nas raízes de Hybanthus calceolaria (L.) Schulze et Menz (ipeca-da- praia). 2012. 39f. Monografia. Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, 2012. PONTIS, H.G.; DEL CAMPILLO, E. Biochemistry of storage carbohydrates in green plants. London: Academic press, p.205-227, 1985. RIZZINI, C., HERINGER, E. Underground organs of plants from some southenrn brazilian savannas, with special reference to xylopodium. Phyton Horn. v. 17, n.1, p.105 - 124, 1961. ROBERFROID, M.B. Functional food concept and its application to prebiotics. Dig. Liver Dis., Rome, v.34, suppl.2, p.S105-S110, 2002. ROBERFROID, M.B. Introduction inuling-type fructans. British Journal of Nutrition, Belgium, v. 93, Suppl. 1, p. S13-S25, 2005. RONKART, et al. Isolation and identification of inulooligosaccharides resulting from inulin hydrolysis. Analytica chimica Acta, v. 604, p.81-87, 2007. ROSS, H.M.; REITH, E.J.; ROMRELL, L.J. Sistema respiratório. In:____. Histologia: texto e atlas. 2. ed. São Paulo: panamericana, 1993. Cap. 18, p.501-525. SAAD, S. M. I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas – v. 42, n.1, 2006.
91
SAKAI, W.S. Simple method for differential stain of paraffin embedded plant material using toluidine blue. Stain technology, Baltimore, v.48, p.47-249, 1973. SEO, M. N. Meiotic studies in tem species of Hybanthus Jacq. (Violaceae) from South America. Cytologia, v.74, n. 2, p. 141 – 146, 2009. SEO, M. N., SANSO, A.M., XIFREDA, C.C. Foliar micromorphology in the classification of South American Hybanthus species (Violaceae). ANN. BOT. FENNICI, v.48, n. 3, p. 247 – 255, 2011. SHARAPIN, N. Fundamentos de tecnologia de produtos fitoterapêuticos. Niterói: Universidade Federal Fluminense, 2000. 246 p. SILVA J.M.C, TABARELLI M., FONSECA M.T., LINS L.V.. Biodiversidade da Caatinga: áreas e ações prioritárias para a conservação. Parte 1- Fatores Abióticos. Ministério do Meio Ambiente, Brasília- DF, 2003. 41p. SILVA, M. D. Estudo farmacobotânicode três espécies medicinais da caatinga em Pernambuco – 2008. Dissertação (Mestrado em botânica). Departamento de biologia – Universidade Federal Rural de Pernambuco – UFRPE, 2008. SILVA, R.C.P.; MAIA, S.S.S.; COELHO, M.F.B.; SILVA, F.N.; CANDIDO, W.S. Propagação vegetativa de ipeca-branca (Hybanthus calceolaria (L.) Schulze - Menz - Violaceae) utilizando diferentes substratos. Revista Verde, v.6, n.3, p.186-191, 2011. SILVA, V. P.; COURI, S.; GOMES, F.S.; NOGUEIRA, R.I.; FREITAS, S.P. Otimização do processo de extração aquoso de inulina de chicória. Revista Brasileira de Tecnologia Industrial, v. 2, n.1, p. 115-122, 2008. SIMÕES, et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis, 5. ed., Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2003. SIMONSEN, et al.. A continent of plant defense peptide diversity: cyclotides in Australian Hybanthus (Violaceae). Pl. Cell., v. 17, p. 3176-3189, 2005. SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA – III Consenso brasileiro no manejo da asma. Jornal de Pneumologia, v.28 (Supl.1), 2002. SOMLYO, A.P.; SOMLYO, A.V. Signal transduction and regulation in smooth muscle. Nature, v. 372, n.17, p. 231-236, 1994. SOMLYO, A.P.; WU, X.; LALKER, L.A.; SOMLYO, A.V. Pharmacomecanical coupling: the role of calcium, G-proteins, kinases and phosphatase. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, v. 134, p.201-234, 1999. SNOWMAN, J. W. Freeze Dryers In BAKER, C. G. J. Industrial Drying of foods, p. 134-145, London, Weinheim, New York, Tokyo, Melbore, Madras, 1997.
92
SOUSA, et al. Constituintes químicos ativos e propriedades biológicas de plantas medicinais brasileiras. 2. ed. Fortaleza: Edições UFC, 2004, 448p. SOUZA, J.P. Estudos filogenéticos em Violaceae com ênfase na Tribo Violeae e Revisão taxonômica dos gêneros Lianescentes de Violaceae na Região Neotropical. 2009. 259f. Tese (Doutorado). Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. São Paulo, 2009. SOUZA, T.; LIONZO, M. I. Z.; PETROVICK, P. R. . Avaliação da redução da carga microbiana de droga vegetal através do processamento tecnológico: decocção e secagem por aspersão. Revista Brasileira de Farmacognosia (Impresso), v. 16, n.1, p. 94-98, 2006. STEINMAN T. I.; PERRONE R.D.; HUNSICKER L.G., MDRD Study Group. GFR determination in chronic renal failure by 3 radionuclide markers and inulin: coeficient of variation of the methods (abstract). Kidney Int. v. 35, p. 201, 1989. STEPHENS, N.L. Airway smooth muscle. Lung, v. 179, p.333-373, 2002. STERK, P. Virus-induced airway hyperresponsiveness. The European Respiratory Journal, v.6, p. 894-902, 1993. TRABI, et al. Variations in cyclotide expression in Viola Species. J. Nat. Prod., v. 67, p. 806-810, 2004. TROJAN-RODRIGUES, M., ALVES, T. L., SOARES, G. L., AND RITTER, M. R. Plants used as antidiabetics in popular medicine in Rio Grande do Sul, southern Brazil. J. Ethnopharmacol. v. 139, p. 155–163, 2012. VAN ROSUN J. M. Cumulative dose-response curves. II Technique for making of dose-response curves in isolated organs and the evaluation of drug parameters. Archives Internationales de Pharmacodinamie et de Therapie, v. 143, p.299-330, 1963. WADA, et al. Physi-cochemical characterization and biological effects of inulin enzymatically synthesized from sucrose. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, p.1246–1253, (2005). WEBB, R. C. Smooth muscle contraction and relaxation. Advances in Physiology Educations, v. 27, n. 1-4, p. 201-206, 2003. YANG, Z., HU, J., ZHAO, M. Isolation and quantitative determination of inulin-type oligosaccharides in roots of Morinda officinalis. Carbohydrate polymers, v. 83, p. 1997 – 2004, 2011.
93
ANEXO
DECLARAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL
(CEPA) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.