UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA ... · Profa. Silvânia Maria Mendes de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
NATÁLIA BITU PINTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEUROPROTETORA DO EXTRATO
PADRONIZADO DE Camellia sinensis E DE SEUS PRINCIPIOS
BIOATIVOS: ENVOLVIMENTO DE AÇÕES ANTI-INFLAMATÓRIAS E
ANTIOXIDANTES.
FORTALEZA-CE
2015
NATÁLIA BITU PINTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEUROPROTETORA DO EXTRATO
PADRONIZADO DE Camellia sinensis E DE SEUS PRINCIPIOS
BIOATIVOS: ENVOLVIMENTO DE AÇÕES ANTI-INFLAMATÓRIAS E
ANTIOXIDANTES.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Orientador (a): Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
JANEIRO
2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde
P729a Pinto, Natália Bitu.
Avaliação da atividade neuroprotetora do extrato padronizado de Camellia sinensis e de seus principios bioativos: envolvimento de ações anti-inflamatórias e antioxidantes/
Natália Bitu Pinto. – 2015. 280 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2015.
Orientação: Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana.
1. Camellia sinensis. 2. Catequina. 3. Doença de Parkinson. 4. Inflamação. 5. Estresse Oxidativo. 6. Nociceptividade. I. Título.
CDD 615.1
Dedicatórias
A Deus pelo dom da vida e por ter me dado ânimo e me sustentado quando
precisei.
A Ele toda honra e toda glória!
A meu esposo Diego, que com imenso amor e companheirismo, passou comigo por
todos os momentos difíceis desta jornada, me incentivando sempre;
Á minha filha Letícia, por ser o meu maior estímulo;
A minha mãe Laura, por todo amor, dedicação e apoio, obrigada por ser meu
exemplo maior;
A meu pai e irmãos, por todo apoio, companheirismo e incentivo!
Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora, Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana,
agradeço pela orientação valiosa, paciência, confiança, atenção, dedicação e
amizade, bem como, pelo incrível aprendizado e pela oportunidade que me foi
concedida. Obrigada também pela oportunidade de trabalhar ao seu lado.
Aos Professores Antônio José Lapa e Carlos Augusto Ciarlini Teixeira e a
Profa. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos por terem prontamente aceitado
participar da minha banca.
Ao Professor Iri Sandro Lima, por ser um exemplo de humildade e
profissionalismo, obrigada, Iri, por ter aceitado participar da minha banca e por tudo.
À querida Kelly Rose pelo apoio na realização dos experimentos de
imunohistoquímica e pela amizade sincera.
Á Profa. Dra. Luzia Kalyne Moreira Leal pela padronização do extrato e pelo
apoio na realização dos experimentos in vitro
Aos meus companheiros e amigos do Laboratório de Biofisiologia: Daniel,
Elaine, Giovany, Beth, Monalisa, Ana Luiza, Adilfa. Agradeço pela contribuição na
parte experimental e pela amizade;
Aos alunos de iniciação cientifica Aline, Débora, Mirlla, Bruno, Anyssa, Alyne,
Jaíne, Gabriel, Pedro Ádamo, Lucas Samon, Raquel Melo, Stephany, Raquel Callou,
Felipe, Glenda e Eudes. Obrigada pela enorme contribuição e apoio na parte
experimental desta tese.
Aos técnicos de laboratório, Auri, Janice, Samuel e Fran, pela contribuição no
trabalho e amizade.
Á todos da Faculdade de Medicina Estacio de Juazeiro do Norte (Estacio-
FMJ), pelo apoio e parceria fundamentais para realização desta pesquisa;
Aos funcionários do departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC.
"Quanto melhor é adquirir a sabedoria do que o ouro! E quanto mais excelente é escolher o
entendimento do que a prata."
(prov. 16:16)
RESUMO
PINTO, Natália Bitu. Avaliação da atividade neuroprotetora do extrato padronizado de Camellia sinensis e de seus principios bioativos: envolvimento de ações anti-inflamatórias e antioxidantes. 2015. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, 2015.
A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela destruição dos neurônios nigroestriatais dopaminérgicos. O tratamento atual é apenas sintomático e, até o presente momento, não existem drogas capazes de inibir a degeneração neuronal. Assim é grande a procura por agentes neuroprotetores que possam impedir ou retardar a progressão desta doença. A Camellia sinensis é uma espécie da família Theaceae, popularmente conhecida como chá-verde (CV). Vários estudos têm demonstrado os efeitos benéficos desta planta e de seus princípios bioativos contra doenças neurodegenerativas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito neuroprotetor do extrato padronizado do chá-verde e de suas catequinas, epicatequina (EC) e epigalocatequina 3-galato (EGCG), no modelo de DP induzida por 6-OHDA em ratos, bem como estudar o efeito do CV em modelos de inflamação e nocicepção. Os animais (ratos Wistar machos, 180-250 g) foram tratados por via oral com CV (25 ou 50 mg/kg), catequinas (EC ou EGCG, na dose de 10 mg/kg), a associação de CV (25 mg/kg) + L-DOPA (25 mg/kg) e com L-DOPA sozinha (nas doses de 25 ou 50 mg/kg) durante 14 dias consecutivos; os tratamentos foram iniciados 1h antes da lesão estriatal unilateral por 6-OHDA (24 µg/2µL). Nos testes comportamentais, os resultados mostraram que houve um aumento significativo do número de rotações induzidas por apomorfina, diminuição da atividade locomotora no teste do campo aberto, aumento do tempo de imobilidade no teste no nado forçado, aumento do tempo de encontro da plataforma no teste do labirinto aquático e aumento do número de quedas no teste do rota rod nos animais lesionados com 6-OHDA, em comparação com os animais falso-operados. Essas modificações foram, em parte ou totalmente, revertidas após os tratamentos com CV, CV + L-DOPA, EC, EGCG e L-DOPA sozinha. A 6-OHDA provocou morte neuronal, evidenciada pela redução dos níveis de dopamina e metabolitos (DOPAC e HVA) no estriado direito lesionado quando comparado com o estriado esquerdo não-lesionado (contralateral). Essa depleção foi significativamente atenuada nos animais lesionados e tratados com CV, L-DOPA, EC, EGCG e associação CV 25 + L-DOPA 25; estas mesmas drogas diminuíram os níveis de TBARS (indicador de peroxidação lipídica) e nitrito/nitrato (indicador de estresse oxidativo) no estriado de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA. Experimentos in vitro demonstraram que o CV (0,1-100 µg/µl) apresentou um forte efeito antioxidante, ao reduzir a produção de substâncias oxidantes em neutrófilos humanos estimulados por PMA. Na coloração de Nissl, observou-se que nos animais lesionados e tratados com CV, EGCG e CV + L-DOPA houve uma preservação dos neurônios hipocampais. Os tratamentos com CV e CV+L-DOPA aumentaram a imunorreatividade para TH e diminuíram a imunomarcação para COX-2 no estriado, bem como o CV e EGCG atenuaram a marcação para iNOS no hipocampo dos animais tratados, em relação ao grupo controle. Observou-se que o CV potencializou os efeitos da L-DOPA, evidenciando um possível efeito sinérgico entre essas drogas. Em outra etapa do estudo, avaliou-se a atividade anti-
inflamatória/antinociceptiva do CV. Assim, no modelo de edema de pata, induzido por carragenina ou dextrano, verificou-se uma diminuição do volume do edema da pata dos ratos, após tratamento com CV, em relação aos do grupo controle (tratado apenas com água destilada). O CV produziu efeito antinociceptivo, nos testes da formalina e das contorções abdominais, induzidas por ácido acético, como também nos testes da placa quente e de Hargreaves, possivelmente através da ativação de receptores opioides e da redução do processo inflamatório. Nestes testes de nocicepção e inflamação, o CV potencializou os efeitos da morfina, indometacina e dexametasona. Portanto, nossos resultados evidenciaram os efeitos neuroprotetores do CV e de seus princípios bioativos, EC e EGCG, possivelmente decorrentes de suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, tornando-as opções terapêuticas futuras para a prevenção ou tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson.
Palavras-chave: Camellia sinensis, Chá-verde, Catequinas, Doença de Parkinson,
Inflamação, Estresse oxidativo, Nocicepção.
ABSTRACT
PINTO, Natália Bitu. Neuroprotective properties of the standardized extract from Camellia sinensis (Green tea) and its main bioactive components: involvement of anti-inflammatory and antioxidant actions. 2015. Thesis (Doctorate) – Post-graduation Program in Pharmacology, Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará. Fortaleza, 2015.
Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by the
destruction of nigrostriatal dopaminergic neurons. Current treatment is only
symptomatic and, to date, no drugs are capable of inhibiting neuronal degeneration;
so, there is a great demand for neuroprotective agents to prevent or slow down the
progress of neurodegenerative processes in this disease. Camellia sinensis is a
species of the family Theaceae, popularly known as green tea (CS). Several studies
have demonstrated its beneficial effects and of their bioactive principles against
neurodegenerative diseases. The objective of this study was to demonstrate the
neuroprotective effect of a standardized extract of green tea and of its catechins, EC
and EGCG, in animal models of PD induced by 6-OHDA, and to evaluate the effect
of CS in models of inflammation and nociception. The animals (male Wistar rats, 250-
280 g) were treated orally with CS (25 or 50 mg / kg), catechins (EC and EGCG, at a
dose of 10 mg / kg), the combination of CS (25 mg / kg) + L-DOPA (25 mg / kg) and
L-DOPA alone (at doses of 25 and 50 mg / kg), for 14 consecutive days; treatments
initiated 1 h before the unilateral striatal lesion with 6-OHDA (24 µg / 2μL). In
behavioral tests, the results showed a significant increase in the number of rotations
induced by apomorphine, decreased locomotor activity in the open field test,
increased immobility time in the forced swimming test, increased time to find the
platform in the water maze test and an increased number of falls in the rota rod test,
in rats lesioned with 6-OHDA, as compared to the sham-operated animals. These
changes were partially or fully reversed after treatment with CS, CS + L-DOPA, EC,
EGCG and L-DOPA alone. The 6-OHDA triggered neuronal death, as shown by
reduced levels of dopamine and its metabolites (DOPAC and HVA), as compared to
the unlesioned (contralateral) left side. This depletion was significantly attenuated in
animals lesioned but treated with CS, L-DOPA, EC, EGCG and the association CS
25 + L-DOPA 25; these same drugs decreased the levels of TBARS (indicator of lipid
peroxidation) and nitrite / nitrate (oxidative stress indicator) in the striatum of rats with
striatal lesions by 6-OHDA. In vitro experiments demonstrated that CS (0.1-100
µg/µl) showed a strong antioxidant effect, by reducing the production of oxidizing
substances in human neutrophils stimulated by PMA. In histological (Nissl staining)
and immunohistochemical (for Tyrosine Hydroxylase, iNOS and COX-2) studies, a
preservation of hippocampal neurons using Nissl's staining was seen in animals
treated with EGCG and CS. We observed that the treatment with CS and CS + L-
DOPA increased immunoreactivity for TH and decreased immunostaining for COX-2
in the striatum; and CS and EGCG attenuated the markup for iNOS in the
hippocampus of animals, as compared to the untreated 6-OHDA-lesioned control
group. We also noted that CS potentiated the effects of L-DOPA when used in
combination, demonstrating possible synergic actions of these drugs. In another part
of the study, we evaluated the anti-inflammatory / antinociceptive activity of CS.
Thus, in the paw edema model, induced by carrageenan or dextran in rats, there was
a decrease in edema volume after treatment with CS, with respect to the control
group untreated). CS produced an antinociceptive action in the formalin and the
writhing induced by acetic acid tests, but also in the hot plate and Hargreaves tests,
possibly through the activation of opioid receptors and reduction of the inflammatory
process. In these nociception and inflammation tests, CS potentiated the effect of
morphine, indomethacin and dexamethasone. Therefore, our results demonstrated
the neuroprotective effects of CS and its bioactive principles, EC and EGCG,
possibly due to their anti-inflammatory and antioxidant properties, making these
drugs potential therapeutic options for the prevention or treatment of
neurodegenerative pathologies such as Parkinson’s disease.
Keywords: Camellia sinensis, green tea, catechins, Parkinson's disease,
inflammation, oxidative stress, nociception.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mecanismos do desenvolvimento da doença de Parkinson: Interações
Genéticas e ambientais que convergem para a degeneração neuronal 33
Figura 2 - Vias de degradação enzimática da dopamina em neurônios nigrais ........ 36
Figura 3 - Estruturas dos gânglios basais, relacionadas ao Mal de Parkinson ......... 43
Figura 4 - Principais vias dopaminérgicas ................................................................ 46
Figura 5 - Regulação das vias direta e indireta através da via nigroestriatal. As setas
brancas indicam ativação (mediada pelo glutamato) e as setas pretas
indicam inibição (mediada pelo GABA) ................................................. 49
Figura 6 - Regulação das vias direta e indireta através da via nigroestriatal em
pacientes com doença de Parkinson. As setas brancas indicam ativação
(mediada pelo glutamato) e as setas pretas indicam inibição (mediada
pelo GABA) ........................................................................................... 51
Figura 7 - Balanço entre as ações estimulatórias e inibitórias mantendo o
funcionamento normal do circuito neuronal e as possíveis alterações que
ocorrem na doença de Parkinson .......................................................... 53
Figura 8 - Hipótese do mecanismo de toxicidade da 6-hidroxidopamina (6-OHDA) . 65
Figura 9 - Camellia sinensis (Chá-verde) ................................................................. 67
Figura 10 - Estruturas químicas das principais catequinas do chá verde ................. 68
Figura 11 - Atividades biológicas das catequinas e do chá verde ............................ 71
Figura 12 - Esquema representativo da farmacocinética do Chá-verde e das
catequinas ............................................................................................. 75
Figura 13 - Representação do protocolo experimental utilizado para avaliação do
efeito do CV e catequinas na doença de Parkinson induzida por 6-OHDA
.............................................................................................................. 84
Figura 14 - Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas
expostas ................................................................................................ 87
Figura 15 - Ilustração do aparelho do Rota Rod ....................................................... 90
Figura 16 - Cilindro de acrílico utilizado para realização do teste do nado forçado .. 92
Figura 17 - Labirinto aquático com plataforma submersa. ........................................ 94
Figura 18 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina
durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com
extrato padronizado do chá-verde.. ..................................................... 106
Figura 19 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina
durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com
as drogas ............................................................................................ 107
Figura 20 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (3
mg/kg, i.p.) durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e
tratados com as drogas. ...................................................................... 108
Figura 21 - Efeitos do extrato padronizado do CV na atividade locomotora avaliada
no teste de campo aberto no modelo de DP em ratos. ........................ 111
Figura 22 - Efeitos do extrato padronizado do CV (25 mg/kg) associado com L-DOPA
(25 mg/kg) e da L-DOPA sozinha na atividade locomotora avaliada no
teste de campo aberto no modelo de DP em ratos. ............................. 112
Figura 23 - Efeitos da epicatequina (EC, 10mg/kg, v.o) e epigalocatequina 3-galato
(EGCG, 10 mg/kg, v.o) na atividade locomotora avaliada no teste de
campo aberto no modelo de DP em ratos. .......................................... 113
Figura 24 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com extrato padronizado do chá-verde. ................................. 117
Figura 25 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com extrato padronizado do chá-verde na dose de 25mg/kg
associado com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA sozinha nas doses de
50 e 25 mg/kg,v.o. ............................................................................... 118
Figura 26 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com as catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e
epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). ............................... 119
Figura 27 - Tempo dispendido no comportamento de imobilidade em sessões de
nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA tratados com extrato padronizado do chá-verde. ..................... 120
Figura 28 - Tempo dispendido no tempo de imobilidade em sessões de nado forçado
durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados
com extrato padronizado do chá-verde na dose de 25 associado com L-
DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA sozinha nas doses de 50 e 25
mg/kg,v.o. ........................................................................................... 121
Figura 29 - Tempo dispendido no comportamento de imobilidade em sessões de
nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA tratados com as catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e
epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). ............................... 122
Figura 30 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com extrato padronizado do chá-verde. ................................. 123
Figura 31 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com extrato padronizado do chá-verde na dose de 25 associado
com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA nas doses de 50 e 25 mg/kg. 124
Figura 32 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado
forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
tratados com as catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e
epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). ............................... 125
Figura 33 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses
de 25 e 50 mg/kg, v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no
teste do labirinto aquático. ................................................................... 128
Figura 34 - Efeitos da administração do extrato padronizado do chá-verde associado
com L-DOPA 25 mg/kg e da L-DOPA (nas doses de 50 e 25 mg/kg,v.o)
em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no teste do labirinto aquático.
............................................................................................................ 129
Figura 35 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o)
e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão
estriatal por 6-OHDA no teste do labirinto aquático. ........................... 130
Figura 36 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses
de 25 e 50 v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no tempo de
permanência na barra giratória no teste do Rota Rod.. ....................... 134
Figura 37 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (na dose de
25 mg/kg, v.o.) associado com L-DOPA (25 mg/Kg,v.o) em ratos com
lesão estriatal por 6-OHDA no tempo de permanência na barra giratória
no teste do Rota Rod. ......................................................................... 135
Figura 38 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o)
e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão
estriatal por 6-OHDA no tempo de permanência na barra giratória no
teste do Rota Rod. .............................................................................. 136
Figura 39 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses
de 25 e 50 mg/kg, v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no
número de quedas da barra giratória no teste do Rota Rod. ............... 137
Figura 40 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (na dose de
25 mg/kg, v.o.) associado com L-DOPA (25 mg/Kg,v.o) em ratos com
lesão estriatal por 6-OHDA no número de quedas da barra giratória no
teste do Rota Rod. .............................................................................. 138
Figura 41 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o)
e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão
estriatal por 6-OHDA no número de quedas na barra giratória no teste do
Rota Rod. ............................................................................................ 139
Figura 42 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde nas doses de 25 e 50 mg/kg
sobre os níveis de malonildialdeído (MDA). ........................................ 143
Figura 43 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde associado com L-DOPA 25 e
L-DOPA nas doses de 25 e 50 mg/kg sobre os níveis de malonildialdeído
(MDA) no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. ......................... 144
Figura 44 - Efeito do das catequinas (EC e EGCG, na dose de 10 mg/kg,v.o) sobre
os níveis de malonildialdeído (MDA) no estriado de ratos lesionados com
6-OHDA .............................................................................................. 145
Figura 45 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde sobre formação de
nitrito/nitrato no estriado de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-
OHDA. ................................................................................................. 148
Figura 46 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde associado com L-DOPA 25 e
L-DOPA sozinha na formação de nitrito/nitrato no estriado de ratos
lesionados com 6-OHDA. .................................................................... 149
Figura 47 - Efeito das catequinas (EC e EGCG) na formação de nitrito/nitrato no
estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. ........................................ 150
Figura 48 - Efeito do extrato de chá verde sobre a produção de oxidantes por
neutrófilos humano estimulados com PMA mensurada por
quimioluminescência dependente de luminol (QL lum). ....................... 153
Figura 49 - Determinação das concentrações de DA em corpo estriado direito de
ratos lesionados com 6-OHDA . .......................................................... 160
Figura 50 - Determinação das concentrações de DA em corpo estriado direito de
ratos lesionados com 6-OHDA. ........................................................... 161
Figura 51 - Determinação das concentrações de DOPAC em corpo estriado direito
de ratos lesionados com 6-OHDA. ...................................................... 162
Figura 52 - Determinação das concentrações de DOPAC em corpo estriado direito
de ratos lesionados com 6-OHDA. ...................................................... 163
Figura 53 - Determinação das concentrações de HVA em corpo estriado direito de
ratos lesionados com 6-OHDA .. ......................................................... 164
Figura 54 - Determinação das concentrações de HVA em corpo estriado direito de
ratos lesionados com 6-OHDA . .......................................................... 165
Figura 55 - Fotomicrografias representativas da coloração de Nissl de neurônios do
hipocampo, área CA-1, de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-
OHDA e tratados com as drogas. ........................................................ 168
Figura 56 - Fotomicrografias representativas da coloração de Nissl de neurônios do
hipocampo, área CA-1, de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-
OHDA e tratados com as drogas ......................................................... 169
Figura 57 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
Tirosina Hidroxilase (TH) em corpo estriado (direito e esquerdo) de
animais falso-operado e de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-
OHDA e tratados com as drogas ......................................................... 171
Figura 58 - Quantificação da imunomarcação para Tirosina Hidroxilase (TH) no
estriado direito de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-
OHDA) e lesionados por 6-OHDA tratados com chá-verde na dose de 25
mg/kg. ................................................................................................. 172
Figura 59 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-
2 em corpo estriado (direito e esquerdo) de animais falso-operado e de
ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com as drogas
............................................................................................................ 174
Figura 60 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-
2 em corpo estriado direito de animais falso-operados e de ratos
submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com as drogas ... 175
Figura 61 - Quantificação da imunomarcação para COX-2 no estriado direito de
animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados
por 6-OHDA tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg ou com
EGCG de 10 mg/kg. ............................................................................ 176
Figura 62 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS
no hipocampo área CA-1 do grupo falso-operado (F.O) e dos animais
submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados as drogas .......... 178
Figura 63 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área CA-1 de
animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados
por 6-OHDA tratados com as drogas .................................................. 179
Figura 64 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS
no hipocampo área CA-3 do grupo falso-operado (F.O) e dos animais
submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com as drogas ... 180
Figura 65 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área CA-3 de
animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados
por 6-OHDA tratados com as drogas .................................................. 181
Figura 66 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS
no hipocampo área GD do grupo falso-operado (F.O) e dos animais
submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com as drogas ... 182
Figura 67 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área GD de
animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados
por 6-OHDA tratados com as drogas .................................................. 183
Figura 68 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 10, 25 e
50mg/kg), da associação CV com Indometacina e da Indometacina
sozinha (nas doses de 2 e 10 mg/kg) frente ao edema de pata induzido
por carragenina... ................................................................................ 187
Figura 69 - Efeito do extrato padronizado do Chá-verde (CV) sozinho ou associado
com dexametasona frente ao edema de pata induzido por dextrano.. . 190
Figura 70 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com a Indometacina sobre as contorções por ácido acético................ 193
Figura 71 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) na 1ª fase do teste da
formalina em camundongos. .............................................................. 197
Figura 72 - Efeito da Morfina (nas doses 2, 4 e 7.5 mg/kg, i.p) e da associação de
CV com Morfina na 1ª fase do teste da formalina em camundongos. .. 198
Figura 73 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) na 2ª fase do teste da
formalina em camundongos.. .............................................................. 201
Figura 74 - Efeito da Morfina (nas doses 2, 4 e 7.5 mg/kg, i.p) e da associação de
CV com Morfina na 2ª fase do teste da formalina em camundongos. .. 202
Figura 75 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar
(método de Hargreaves) ..................................................................... 205
Figura 76 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar
(método de Hargreaves) após 180min da aplicação de carragenina por
via plantar em ratos.. ........................................................................... 206
Figura 77 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar
(método de Hargreaves) após 240 min da aplicação de carragenina por
via plantar em ratos.. ........................................................................... 207
Figura 78 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina (4 e 2
mg/kg) e da associação de CV com Morfina no teste nocicepção térmica
na placa quente. .................................................................................. 210
Figura 79 - Visão geral de como toxinas como a 6-OHDA e MPTP provocam a
neurodegeneração na doença de Parkinson modelos animais ............ 234
Figura 80 - Mecanismos neuroprotetores do extrato padronizado do chá-verde e de
seus princípios bioativos (EC e EGCG) confirmados neste trabalho ... 251
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características dos principais receptores dopaminérgicos ...................... 45
Tabela 2 - Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA ............................ 87
Tabela 3 - Efeitos do extrato padronizado do chá-verde, da associação de CV com
L-DOPA, da epicatequina (EC) e epigalocatequina 3-galato (EGCG) e da
L-DOPA no comportamento rotacional induzido por apomorfina em ratos
após lesão estriatal induzida por 6-OHDA ........................................... 109
Tabela 4 - Efeitos das catequinas, epicatequina e epigalocatequina (, do extrato
padronizado do chá-verde sozinho ou associado com L-DOPA e da L-
DOPA sozinha na atividade locomotora avaliada no teste de campo
aberto no modelo de DP em ratos ....................................................... 114
Tabela 5 - Tempo dispendido no comportamento de nadar, flutuar e escalar em
sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal
por 6-OHDA tratados com extrato padronizado do chá-verde, com
associação de CV com L-DOPA, com epicatequina e epigalocatequina 3-
galato e com L-DOPA. ........................................................................ 126
Tabela 6 - Efeitos da administração do extrato padronizado do chá-verde, da
associação de CV com L-DOPA, da epicatequina e epigalocatequina e
da L-DOPA em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no teste do
labirinto aquático ................................................................................. 131
Tabela 7 - Tempo de permanência na barra giratória e número de quedas dos
animais no teste do Rota Rod em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA
e tratados com CV, catequinas (EC e EGCG), com associação de CV
com L-DOPA e com L-DOPA .............................................................. 140
Tabela 8 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde, das catequinas (EC e EGCG)
e da L-DOPA sozinha e/ou associado com CV sobre os níveis de
malonildialdeído (MDA) no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA146
Tabela 9 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), das catequinas (EC e
EGCG) e da L-DOPA sozinha e/ou associada com CV na concentração
de nitrito/nitrato no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA ........... 151
Tabela 10 - Efeito do extrato de chá verde sobre a produção de oxidantes por
neutrófilos humanos estimulados com PMA mensurada por
quimioluminescência dependente de luminol (QL lum) ........................ 154
Tabela 11 - Concentrações de DA e seus metabólitos (DOPAC e HVA) em corpo
estriado esquerdo (E) e direito (D) de ratos lesionados com 6-OHDA
tratados com as drogas ....................................................................... 158
Tabela 12 - Concentrações dos metabolitos DOPAC e HVA em corpo estriado
esquerdo (E) e direito (D) de ratos lesionados com 6-OHDA tratados as
drogas ................................................................................................. 159
Tabela 13 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde e da Indometacina sozinha
ou associada com CV frente ao edema de pata induzido por carragenina
............................................................................................................ 188
Tabela 14 - Efeito do extrato padronizado do Chá-verde (CV) sozinho ou associado
com dexametasona frente ao edema de pata induzido por dextrano ... 191
Tabela 15 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com a Indometacina sobre as contorções por ácido acético................ 194
Tabela 16 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), Morfina e da Naloxona
sozinha e associada com CV 10 e Morfina sobre a 1ª fase da nocicepção
induzida por formalina ......................................................................... 199
Tabela 17 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), Morfina e da Naloxona
sobre a 2ª fase da nocicepção induzida por formalina ......................... 203
Tabela 18 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da Indometacina e
da associação de CV com Indometacina sobre a hiperalgesia térmica
induzida por carragenina no teste de Hargreaves ............................... 208
Tabela 19 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina e da
associação de CV com Morfina no teste nocicepção térmica na placa
quente ................................................................................................. 211
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Evidências da neuroinflamação na fisiopatologia da doença de Parkinson
............................................................................................................ 39
Quadro 2 - Modelos experimentais de DP utilizando neurotoxinas: caracterização
geral de modelos animais ................................................................... 62
Quadro 3 - Principais materiais utilizados nos experimentos.................................... 81
Quadro 4 - Protocolo de tratamento experimental .................................................... 85
LISTA DE ABREVIATURAS
μg Micrograma
6-OHDA 6-hidroxidopamina
5-HT 5-hidroxitripamina
5-HIAA 5-Hydroxyindoleacetic acido
ALS Esclereose Lateral Amiotrofica
AIF Fator indutor de apoptose
AINES Antiinflamatórios não esteroidais
AMPA Alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico
ANOVA Análise de Variância
AP Antero posterior
ATV Área tegumentar ventral
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro
CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COMT Catecol-O-metiltransferase
COX Ciclooxigenase
CV Chá-verde
DA Dopamina
DOPAC Ácido dihidroxifenilacético
DP Doença de Parkinson
DV Dorso ventral
EC Epicatequina
ECG Epicatequina-3-galato
EGC Epigalocatequina
EGCG Epigalocatequina-3-galato ou 3-galato de
epigalocatequina
EO Estresse oxidativo
EPM Erro padrão da média
ERK Quinases reguladas por sinais extracelulares
ERO Especies reativas de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
FMJ Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte
FO Falso operado
g Grama
GABA Ácido gamaaminobutírico
GFAP Glial fibrillary acidic protein
GPe Globo pálido porção externa
GPi Globo pálido porção interna
GSH Glutationa reduzida
GSK Glicogênio sintase quinase
GSSG Glutationa oxidada
HDAC Histona desacetilases
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HVA Ácido homovanílico
IL Interleucina
IMAO Inibidores da Monoaminoxidase
iNOS Oxido nítrico sintase indutiva
ip Intraperitoneal
KCI Cloreto de potássio
KCN Cianeto de potássio
kg Quilograma
JNK Jun N-terminal kinases
Li Lítio
LPS Lipopolissacarídeos
l-dopa Levodopa
MAO-B Monoaminoxidase B
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno
MDA malonildialdeído
ML Medial Lateral
mg Miligrama
MIP Macrophage inflammatory protein
ml Mililitro
mM Milimol
MPP+ 1-metil-4-fenilpiridínio
MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridina
NE Norepinefrina
NFKB Fator Nuclear kappa B
nm Nanômetro
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico
NOAL No observed adverse effect level
NQO1 Quinona oxidorredutase 1
NST Núcleo subtalâmico
ONOO- Peroxinitrito
PBS Tampão fosfato salino
PFO Polifenol-oxidase
PG Prostaglandina
PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
REM Movimento Rápido dos Olhos
RNA Ácido ribonucleico
ROS Espécies reativas do oxigênio
SA Salicilato sódico
SNC Sistema nervoso central
SNM Sintomas não motores
SNPc Substancia negra Parte compacta
SNPr Substancia negra Parte reticular
SOD Superóxido dismutase
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TH Tirosina Hidroxilase
TNFα Fator de necrose tumoral - alfa
TNFR Receptor do fator de necrose tumoral
UFC Universidade Federal do Ceará
VPA Ácido Valproico
vo Via oral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 30
1.1 ASPECTOS GERAIS DA DOENÇA DE PARKINSON ....................................... 30
1.2 ETIOLOGIA DA DOENÇA DE PARKINSON ...................................................... 31
1.2.1 Predisposição genética e fatores tóxicos ambientais ................................ 31
1.2.2 Estresse oxidativo......................................................................................... 34
1.2.3 Excitotoxicidade ............................................................................................ 37
1.2.4 Neuroinflamação ........................................................................................... 37
1.2.5 Defeitos mitocondrais e falha do sistema proteossoma-ubiquitina .......... 40
1.2.6 Apoptose ....................................................................................................... 41
1.3 AS BASES NEURONAIS DA DOENÇA DE PARKINSON .................................. 42
1.4 SINAIS E SINTOMAS DA DOENÇA DE PARKINSON ....................................... 54
1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO .................................................................. 56
1.5.1 Levodopa + Inibidor de dopa descarboxilase ............................................. 57
1.5.2 Agonistas dos receptores de dopamina ...................................................... 58
1.5.3 Inibidores da Monoaminoxidase (IMAO) ..................................................... 58
1.5.4 Inibidores da catecol-O-metiltransferase (COMT)....................................... 59
1.5.5 Amantadina ................................................................................................... 59
1.5.6 Fármacos bloqueadores da acetilcolina ...................................................... 60
1.5.7 Terapia Neuroprotetora ................................................................................ 60
1.6 MODELOS ANIMAIS DE DOENÇA DE PARKINSON ........................................ 60
1.6.1 O Modelo do MPTP........................................................................................ 63
1.6.2 Modelo da 6-OHDA ........................................................................................ 63
1.7 Camellia sinensis (CHÁ) .................................................................................... 66
1.7.1 Camellia sinensis (Chá-verde), suas catequinas e a doença de Parkinson
...................................................................................................................... 72
1.7.2 Farmacocinética e Efeitos colaterais ........................................................... 73
1.8 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ...................................................................... 76
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 78
2.1 GERAL ............................................................................................................... 78
2.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................... 78
3 METODOLOGIA ................................................................................................... 81
3.1 MATERIAIS USADOS NOS EXPERIMENTOS .................................................. 81
3.2 ANIMAIS ............................................................................................................ 82
3.3 MATERIAL BOTÂNICO E DROGAS UTILIZADAS NA PESQUISA .................... 82
3.4 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENOIS TOTAIS NO EXTRATO SECO DE
Camelia sinensis ........................................................................................... 83
3.5 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DE Camellia sinensis (CHÁ-VERDE)....... 83
3.6 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DA DOENÇA DE PARKINSON ...................... 83
3.7 MODELO EXPERIMENTAL DE DOENÇA DE PARKINSON INDUZIDA POR 6-
OHDA ............................................................................................................ 86
3.8 TESTE ROTACIONAL COM APOMORFINA ..................................................... 88
3.9 TESTE DO CAMPO ABERTO ............................................................................ 88
3.10 TESTE DA BARRA GIRATÓRIA ROTA ROD .................................................. 89
3.11 TESTE DO NADO FORÇADO ......................................................................... 91
3.12 LABIRINTO AQUÁTICO ................................................................................... 93
3.13 DISSECAÇÃO DAS ÁREAS CEREBRAIS ....................................................... 95
3.14 DETERMINAÇÃO DE DOPAMINA E METABOLITOS ATRAVÉS DO HPLC ... 95
3.15 HISTOQUÍMICA VIOLETA DE CRESIL (COLORAÇÃO DE NISSL) ................ 96
3.16 IMUNOHISTOQUÍMICA PARA INOS, COX-2 E TIROSINA HIDROXILASE (TH)
...................................................................................................................... 97
3.17 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO PADRONIZADO
DO CHÁ-VERDE (CV) ................................................................................... 98
3.17.1 Determinação da peroxidação lipídica (TBARS) ....................................... 98
3.17.2 Determinação do conteúdo de nitrito ........................................................ 98
3.17.3 Avaliação do potencial antioxidante do extrato seco de C. sinensis (chá
verde) em neutrófilo humano por Quimioluminescência (QL) ................. 99
3.18 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DOS TESTES INFLAMAÇÃO E
NOCICEPÇÃO .............................................................................................. 99
3.19 TESTES DE ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA ........ 100
3.19.1 Edema de pata induzido por carragenina ................................................ 100
3.19.2 Edema de pata induzido por dextrano ..................................................... 100
3.19.3 Teste de Hiperalgesia térmica de Hargreaves ......................................... 100
3.19.4 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ............ 101
3.19.5 Teste da formalina..................................................................................... 101
3.19.6 Teste da placa quente ............................................................................... 102
3.20 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 102
4 RESULTADOS: TESTES COMPORTAMENTAIS .............................................. 104
4.1. DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO ROTACIONAL INDUZIDO POR
APOMORFINA EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL POR 6-OHDA
TRATADOS COM EPICATEQUINA (EC), EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO
(EGCG) E COM O EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV)
SOZINHO OU ASSOCIADO COM L-DOPA ................................................ 104
4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA ATRAVÉS DO TESTE DO
CAMPO ABERTO EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL TRATADOS COM
EPICATEQUINA, EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO, EXTRATO
PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO COM L-DOPA
.................................................................................................................... 110
4.3 EFEITO DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ VERDE NO TESTE DO
CAMPO ABERTO ........................................................................................ 115
4.4 EFEITOS DAS CATEQUINAS, EPICATEQUINA E EPIGALOCATEQUINA, DO
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO
COM L-DOPA NO TESTE DO NADO FORÇADO ....................................... 115
4.5 DETERMINAÇÃO DA MEMÓRIA ESPACIAL NO TESTE DO LABIRINTO
AQUÁTICO (WATER MAZE) EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL
TRATADOS COM EPICATEQUINA, EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO,
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO
COM L-DOPA .............................................................................................. 127
4.6 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA DOS RATOS LESIONADOS COM
6-OHDA APÓS TRATAMENTO COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-
VERDE (CV), COM EPICATEQUINA E EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO E
COM L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CHÁ-VERDE NO TESTE DO
ROTA ROD ................................................................................................. 132
5 RESULTADOS: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................... 141
5.1 DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-
VERDE, DAS CATEQUINAS (EC E EGCG) E DA L-DOPA SOZINHA OU
ASSOCIADA COM CV SOBRE O GRAU PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA (TBARS)
NO CORPO ESTRIADO DE RATOS LESIONADOS COM 6-OHDA ........... 142
5.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO/NITRATO NO
ESTRIADO DE RATOS SUBMETIDOS A LESÃO POR 6-OHDA E
TRATADOS COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV),
CATEQUINAS (EC E EGCG) E L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CV
.................................................................................................................... 147
5.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE C. SINENSIS
(CHÁ VERDE, CV) EM NEUTRÓFILO HUMANO POR
QUIMIOLUMINESCÊNCIA (QL) .................................................................. 152
6 RESULTADOS: DOSAGEM DE DOPAMINA E METABOLITOS ....................... 156
6.1 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE DOPAMINA (DA) E SEUS
METABÓLITOS (DOPAC E HVA) NO CORPO ESTRIADO DIREITO E
ESQUERDO DE RATOS SUBMETIDOS Á LESÃO POR 6-OHDA E
TRATADOS COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV),
CATEQUINAS (EC E EGCG) E L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CV
.................................................................................................................... 156
7 RESULTADOS: ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA .............. 166
7.1 EFEITOS DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV), DA
EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO (EGCG) E DA ASSOCIAÇÃO DE L-DOPA
COM CV EM HIPOCAMPO DE ANIMAIS COM DOENÇA DE PARKINSON
AVALIADO PELA COLORAÇÃO DE NISSL (VIOLETA DE CRESIL) .......... 167
7.2 ANÁLISES IMUNOHISTOQUÍMICAS .............................................................. 170
7.2.1 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com L-DOPA sobre a atividade da enzima tirosina hidroxilase no
estriado direito e esquerdo de animais com doença de Parkinson ....... 170
7.2.2 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com L-DOPA sobre a atividade da enzima COX-2 no estriado direito e
esquerdo de animais com parkinsonismo experimental ........................ 173
7.2.3 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) e da epigalocatequina
3-galato (EGCG) na imunomarcação para iNOS no hipocampo nas áreas
CA-1, CA-3 e GD de animais com parkinsonismo experimental ............ 177
8 RESULTADOS: ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA ..... 184
8.1 ESTUDO DOS EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIO/ANTINOCICEPTIVO DO
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO E ASSOCIADO
COM DROGAS ANTI-INFLAMATÓRIAS/ANTINOCICEPTIVAS EM
MODELOS AGUDOS DE INFLAMAÇÃO E NOCICEPÇÃO EM ROEDORES
.................................................................................................................... 185
8.1.1 Edema de pata induzido por carragenina em ratos .................................. 185
8.1.2 Edema de pata induzido por dextrano em ratos ....................................... 189
8.1.3 Avaliação do potencial antinociceptivo do extrato padronizado do chá-
verde (CV) no modelo de contorções por ácido acético......................... 192
8.1.4 Avaliação do potencial antinociceptivo do extrato padronizado do chá-
verde (CV) sozinho ou associado com Morfina no modelo de nocicepção
induzida pela formalina ............................................................................. 195
8.1.5 Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da Indometacina (10 e
2 mg/kg) e da associação de CV com Indometacina sobre a hiperalgesia
térmica induzida por carragenina no teste de Hargreaves ..................... 204
8.1.6 Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina (4 mg/kg e
2 mg/kg) e da associação de CV com Morfina no teste nocicepção
térmica na placa quente ............................................................................ 209
9 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 212
10 DISCUSSÃO: TESTES COMPORTAMENTAIS ............................................... 216
10.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS COMPORTAMENTAIS ................................ 217
11 DISCUSSÃO: EFEITOS NEUROQUÍMICOS DO CV E CATEQUINAS SOBRE
DOPAMINA E METABOLITOS ................................................................... 224
11.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS NEUROQUÍMICOS DO CV E CATEQUINAS
SOBRE DOPAMINA E METABOLITOS....................................................... 224
12 DISCUSSÃO: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .................................................... 227
12.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS ANTIOXIDANTES ........................................ 228
13 DISCUSSÃO: ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA ............... 231
14 DISCUSSÃO: ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA ....... 239
14.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIO E ANTINOCICEPTIVO
.................................................................................................................... 240
15 DISCUSSÃO: CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................... 246
16 CONCLUSÃO ................................................................................................... 248
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 253
ANEXO – Artigo aceito para publicação ............................................................. 282
29
1. DOENÇA DE PARKINSON
1.1. Aspectos gerais
INTRODUÇÃO
30
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS DA DOENÇA DE PARKINSON
A doença de Parkinson (DP) foi descrita pela primeira vez em 1817 por James
Parkinson através da monografia intitulada “Essay on Shaking Palsy”, onde o autor
descreveu seis casos de pacientes do sexo masculino com idades variando entre 50
a 72 anos com um tipo de manifestação chamada por ele de “paralisia agitante”
caracterizada por movimentos tremulantes involuntários. Decorrido meio século da
descrição de Parkinson, surgiram as contribuições do neurologista francês Jean-
Martin Charcot sobre a paralisia agitante, que além de caracterizar os sinais cardiais
da doença também foi o primeiro a propor o uso da denominação “doença de
Parkinson” para esta doença em homenagem a James Parkinson e também foi
pioneiro em propor um tratamento para a DP com hiosciamina, uma substância de
efeito anticolinérgico (ANDRADE et al., 1999).
A DP é uma afecção neurodegenerativa crônica e progressiva, caracterizada
pela presença de disfunções monoaminérgicas múltiplas, incluindo déficits dos
sistemas dopaminérgicos, colinérgicos, serotoninérgicos e noradrenérgicos, mas que
tem como característica principal a perda de neurônios dopaminérgicos da parte
compacta da substancia negra do mesencéfalo com a presença de um marcador
neuropatológico conhecido como corpos de Lewy (TEIVE, 2005). Esta doença
neurodegenerativa constitui a mais comum depois da doença de Alzheimer,
afetando 1 a 2% da população acima de 65 anos, e sua prevalência eleva-se para
4% em indivíduos acima de 85 anos (PERFEITO; CUNHA-OLIVEIRA; REGO, 2012;
WONG; GILMOUR; RAMAGE-MORIN, 2014).
Alguns sinais cardinais da DP são: rigidez, acinesia, bradicinesia, tremor e
instabilidade postural (O’SULLIVAN; SCHIMITZ, 2004). O diagnostico desta doença
baseia-se principalmente nos aspectos semiológicos, com destaque para a
apresentação da síndrome extrapiramidal (sinais cardiais), mas também é
necessário investigar se o paciente está fazendo uso de algum medicamento, como
antipsicóticos, que podem gerar parkinsonismo medicamentoso.
31
1.2 ETIOLOGIA DA DOENÇA DE PARKINSON
1.2.1 Predisposição genética e fatores tóxicos ambientais
De acordo com Rojo e Corbella (2009) e Teive (2005), o fator etiopatogênico
mais relevante da Doença de Parkinson é uma causa multifatorial, mas a
etiopatogenia da DP ainda não é totalmente compreendida, sendo o critério
multifatorial adotado, considerando-se relevantes a predisposição genética,
agregada aos fatores tóxicos ambientais (BENKRIS; MATA; ZABETIAN, 2010).
Dentre esses vários fatores que têm sido propostos para o desenvolvimento da
doença de Parkinson, estão: as alterações genéticas, a disfunção mitocondrial, a
falha do sistema proteossoma-ubiquitina, a exposição ambiental, a neuroinflamação,
o estresse oxidativo e a excitotoxicidade. Discutiremos alguns desses fatores a
seguir.
A principal hipótese para a causa da DP é a de que indivíduos com
predisposição genética ao serem expostos a agentes tóxicos do meio ambiente
teriam as condições necessárias para desenvolver a doença (RIEDER; BIANCHIN;
SCHRÖDER, 2004).
Acredita-se que aproximadamente 90% dos casos da doença de Parkinson
sejam idiopáticos, enquanto os outros 10% dos casos seriam familiares, sendo que,
alguns estudos sugeriram que indivíduos parkinsonianos com idade inferior a 50
anos são mais suscetíveis a manifestar alterações genéticas (TANNER et al., 1999).
No entanto, pacientes que possuem parentes de primeiro grau com DP, têm duas a
três vezes mais chance de desenvolver a doença. Em 1893, Gowers observou a
participação da genética na DP ao ver que 15% de seus pacientes tinham familiares
com tremor isolado ou parkinsonismo. Em 1949, Mjönes descreveu, pela primeira
vez, casos ocorridos na mesma família, propondo que a doença teria um traço
autossômico dominante com 60% de penetração.
Cada vez mais tem se evidenciado o envolvimento da proteína α-sinucleína
no desenvolvimento da doença de Parkinson, e isto têm sido confirmado através de
estudos genéticos com pacientes portadores da DP familiar: os quais incluem
mutações em genes como G209A em famílias gregas (POLYMEROPOULOS et al.,
1997), no gene G88C em famílias germânicas (KRUGER et al., 1998) e no gene
E46K em famílias espanholas (ZARRANZ et al., 2004). No entanto, a explicação
32
molecular de como os oligômeros anormais da proteína α-sinucleína provocam
disfunção e morte dos neurônios dopaminérgicos na substância negra parte
compacta permanece desconhecida (VON BOHLEN UND HALBACH; SHOBER;
KRIEGLSTEIN, 2004).
Inúmeras pesquisas têm identificado vários genes importantes na
etiopatogenia da DP, dentre eles estão: o PARK1, que codifica a alfa-sinucleína e o
PARK2, que codifica a Parkina; PINK1 (PARK6) que codifica a PTEN-quinase
induzida 1(PINK1); DJ-1 (PARK7) que codifica a DJ-1; e LRRK2 (PARK8) que
codifica a LRRK2 (Leucine-Rich Repeat Kinase 2) e até o momento, foram descritas
seis mutações neste gene, sendo a mutação G2019S a mais prevalente por ter
ocorrido em 1 a 25% da forma idiopática da DP e em 4% da forma hereditária.
Recentemente, descobriu-se que os polimorfismos em outros genes como RIT2 e
STX1B, também estão associados a etiologia da DP (WANG et al., 2014).
Na Figura 1, podemos ver que mutações gênicas levam á agregação de
proteínas, como alfa-sinucleína,á disfunção do sistema ubiquitina-proteassoma e a
anormalidades mitocondriais que contribuem para o estresse oxidativo,
neuroinflamação e finalmente para a morte neuronal. Assim, são as interações
genéticas e ambientais que convergem para a degeneração neuronal (GAO; HONG,
2011).
33
Figura 1 - Mecanismos do desenvolvimento da doença de Parkinson: Interações Genéticas e ambientais que convergem para a degeneração neuronal
Fonte: Gao e Hong (2011).
34
Pesquisas têm demonstrado a importância do fator ambiental no
desenvolvimento da doença de Parkinson, pois muitas substâncias neurotóxicas
presentes no ambiente podem atuar diretamente no sistema nigroestriatal (DI
MONTE et al., 2002). Estudos epidemiológicos associaram o desenvolvimento da
doença de Parkinson a fatores de risco ambientais, tais como residência rural,
agricultura e exposição a pesticidas (DI MONTE; LAVASANI; MANNING-BOG,
2002). Estudos de Liou et al. (1997) evidenciaram que o bipiridil (paraquat), os
compostos organoclorados, os organofosforados, os rotenoides e os derivados dos
carbamatos são agentes potencialmente tóxicos e podem estar relacionados ao
desenvolvimento da DP. Alguns estudos de Fleming et al. (1994) e Corrigan et al.
(1998) identificaram níveis de pesticidas, como os compostos organoclorados
(dieldrin), no cérebros de pacientes portadores da doença de Parkinson.
Além disso, pesquisas têm demonstrado que a exposição ocupacional a
alguns metais pesados, como o cobre, manganês, chumbo e ferro, oferece risco de
desenvolvimento de doença de Parkinson (GORELL et al., 1997; 1999). Entre outras
toxinas ambientais, envolvidas na etiologia da DP, está o MPTP (1-metil-4-fenil-
1,2,3,6-tetra-hidropiridina) que, inicialmente, foi identificada como causadora de
Parkinsonismo em pacientes usuários de heroína.
Estudos têm mostrado o papel do ferro na neurodegeneração nigroestriatal,
Earle (1968) descreveu, pela primeira vez, níveis elevados de ferro em cérebros
parkinsonianos e Dexter et al. (1989) confirmaram este acúmulo de ferro na
substância negra parte compacta e uma diminuição dos níveis de ferritina nos
tecidos nigrais de portadores de DP. Além disso, o ferro induz a agregação da α-
sinucleína, contribuindo para a formação dos corpos de Lewy, que culminariam no
processo de neurodegeneração (TEIVE, 2005; FERNANDEZ et al., 2007). Logo,
podemos associar a redução da ferritina com o acúmulo de ferro, no
desenvolvimento de processos tóxicos na doença de Parkinson.
1.2.2 Estresse oxidativo
Os radicais livres são moléculas altamente reativas, formadas a partir de
transferências de elétrons, podendo reagir e formar uma outra série de espécies
reativas, como as espécies reativas do oxigênio (ROS) e, se, não neutralizadas,
podem levar ao estresse oxidativo (EO), exacerbar a inflamação e promover dano
35
tecidual (MOSLEY et al., 2006). Sabe-se que os neurônios da substancia negra
parte compacta são mais vulneráveis ao estresse oxidativo, devido á presença de
neuromelanina, ferro e dopamina (ANDRADE et al., 1999).
A dopamina é degradada intracelularmente, tanto pela enzima monoamino
oxidase (GOTZ et al., 1994) quanto por oxidação. Entretanto, o metabolismo da
dopamina pela MAO-B leva à formação do ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) e
peróxido de hidrogênio (H2O2) sob consumo de O2 e H2O (GESI et al., 2001),
conforme podemos ver na Figura 2; já a oxidação intracelular da dopamina produz
H2O2 e dopamina-quinona (SULZER; ZECCA, 2000). Então, o próprio metabolismo
da dopamina leva à formação de peróxido de hidrogênio, o qual pode reagir com o
ferro e formar radicais livres, que são citotóxicos.
Além disso, na DP ocorre diminuição dos sistemas antioxidantes, o que
contribui para o aumento do estresse oxidativo e morte neuronal. Tem-se
encontrado um aumento do ferro, com diminuição dos níveis de glutationa nos
neurônios da substância negra de pacientes com DP, o que poderia aumentar o
dano oxidativo (FAHN; COHEN, 1992; JENNER; BRIN, 1998). Logo, a proporção
entre a glutationa reduzida e a glutationa oxidada (GSH/GSSG) encontra-se
reduzida durante a degeneração dopaminérgica, propiciando, então, a formação de
mais radicais livres (SIAN et al., 1994; SOFIC et al., 1992). Portanto, o estresse
oxidativo tem envolvimento na fisiopatologia da DP. Por isso, atualmente, várias
pesquisas têm estudado substâncias antioxidantes como possíveis agentes
neuroprotetores.
36
Figura 2 - Vias de degradação enzimática da dopamina em neurônios nigrais
Fonte: Siegel et al. (2006).
37
1.2.3 Excitotoxicidade
A excitotoxicidade refere-se ao processo neurodegenerativo iniciado pela
ativação excessiva de receptores do glutamato (CENTURIÃO, 2004). A morte celular
por excitotoxicidade parece estar relacionada com o influxo excessivo de cálcio,
devido á ativação dos receptores NMDA; e a liberação deste íon de organelas
intracelulares leva á ativação de enzimas, á produção de radicais de oxigênio, á
lesão de proteínas do citoesqueleto, membranas lipídicas e do DNA, além da morte
programada (apoptose) (CENTURIÃO, 2004; TEIVE, 2005). Na DP, a
excitotoxicidade está presente e relacionada á morte neuronal (VON BOHLEN UND
HALBACH; SHOBER; KRIEGLSTEIN, 2004).
A despolarização neuronal promove a liberação de glutamato no neurônio
pré-sináptico e este neurotransmissor pode ativar seus receptores pós-sinápticos
(AMPA, CAINATO e NMDA), promovendo o influxo de cálcio nas células gliais que
vai auxiliar na neurodegeneração. Nesse processo, pode ocorrer ativação da óxido
nítrico sintetase, a qual converte a L-arginina em L-citrulina e óxido nítrico (NO). A
maior parte das ações neurotóxicas do NO é mediada pelo peroxinitrito (ONOO-),
que é o produto da reação do ânion superóxido e do NO (DAWSON; DAWSON,
1996; EMERIT et al., 2004). Além disso, o óxido nítrico poderia contribuir para o
processo degenerativo celular, pela sua capacidade de deslocar o ferro de sua
ligação com a ferritina, induzindo peroxidação de lipídios e inibição da função
mitocondrial (TEIVE, 2005). Ou seja, o NO também pode induzir excitoxicidade.
1.2.4 Neuroinflamação
Vários estudos têm demonstrado, cada vez mais, a relação entre o processo
inflamatório e a fisiopatologia da doença de Parkinson. Vários anti inflamatórios já
foram testados em modelos animais de DP, como no estudo de SAIRAM et al.,
(2003) que mostraram que um inibidor não seletivo da COX, o salicilato sódico (SA),
atenuou significativamente a depleção estriatal dopaminérgica causada pelo MPTP;
já em outro estudo o ácido salicílico e o paracetamol apresentaram neuroproteção
em modelos animais da doença de Parkinson induzidos pelo cianeto de potássio
(KCN) (SAIRAM et al., 2003; MOHANAKUMAR; ,MURALIKRISHNAN; THOMAS et
al., 2000). Estudos epidemiológicos demonstraram que o uso de antiinflamatórios
38
não esteroidais (AINES) reduz o risco de desenvolvimento da DP (CHEN et al.,
2003).
Pesquisas, em todo mundo, têm constantemente relatado a presença de
micróglias e astrócitos ativados na DP (HUNOT; HIRSCH, 2003; McGEER et
al.,1988). Microglias são macrófagos residentes no SNC que podem ser ativados em
células apresentadoras de antígenos imunocompetentes, durante o processo
patológico. Essas células liberam citocinas pró-inflamatórias, incluindo o fator de
necrose tumoral alfa (TNFα) e interleucina-1β (CROSS; WOODROOFE, 2001; LIU;
HONG, 2003; MERRILL; BENVENISTE, 1996). Muitos pesquisadores encontraram
níveis elevados dessas citocinas no parênquima cerebral ou no fluido cérebro-
espinhal de pacientes com DP (NAGATSU et al., 2000). Micróglias ativadas também
aumentam a liberação de enzimas, como a óxido nítrico sintase indutiva (NOSi) e a
cicloxigenase 2 (COX 2) (MOSLEY et al., 2006). Logo, essas células produzem NO,
EROs, prostaglandinas e citocinas. Portanto, a ativação da micróglia está
diretamente associada com a morte dos neurônios dopaminérgicos na DP, podendo
até mesmo ser usada como marcador biológico para a doença (CHEN et al., 2003).
Vários estudos pré-clínicos e clínicos têm evidenciado o papel da neuroinflamação
na fisiopatologia da DP, conforme podemos ver no Quadro 1.
39
Quadro 1 - Evidências da neuroinflamação na fisiopatologia da doença de Parkinson
Fonte: Adaptado de Hald e Lotharius (2005).
40
Como a neuroinflamação é um fator essencial para o processo de
neurodegeneração crônica, nos modelos animais da doença de Parkinson, propôs-
se que a inibição da inflamação poderia ser uma estratégia neuroprotetora
promissora (GAO et al., 2003).
1.2.5 Defeitos mitocondrais e falha do sistema proteossoma-ubiquitina
Evidências sugerem a hipótese de que o complexo I mitocondrial tem
importante papel na etiologia da DP. A atividade do complexo I está reduzida em
35–40% em homogenatos de substância negra de pacientes da DP, em estudos
post mortem (SCHAPIRA et al., 1989; 1990). Recentemente foi reportada a
ocorrência de uma mutação no DNA mitocondrial, na forma idiopática da doença
(PARKER JUNIOR; PARKS, 2005), e uma redução associada da atividade do
complexo I, nas mitocôndrias do córtex frontal (PATHAK; DAVEY, 2008). Neste
caso, uma deficiência na cadeia respiratória poderia gerar produtos de oxidação e
desencadear uma série de processos que levariam à toxicidade celular e
consequente morte neuronal progressiva (apoptose) (TEIVE, 2005).
Uma das mais importantes proteínas mitocondriais é a PINK1; que pode
desempenhar um papel na proteção celular, em situações de estresse que afetam o
potencial de membrana mitocondrial. Uma vez que a maior parte das mutações
neste gene acomete o domínio quinase, é possível que a fosforilação anormal das
proteínas-alvo da PINK1 represente o mecanismo patogênico, causando uma
resposta anormal ao estresse oxidativo e neurodegeneração (VALENTE et al., 2004)
A perda de função da PINK1 interfere na função mitocondrial e na viabilidade celular
sob estresse, logo a PINK1 ganha destaque, pois é considerada uma das únicas
proteínas até o momento a serem identificadas na mitocôndria e a fazer com que
sua alteração desencadeie uma disfunção mitocondrial (GODEIRO JUNIOR et al.,
2007). Outra anormalidade presente na DP é a deficiência de alfa-cetoglutarato
desidrogenase que compromete, ainda mais, o metabolismo energético e facilita a
neurodegeneração (ANDRADE et al., 1999).
Outro fator que está envolvido na etiologia da DP é a falha no sistema
proteassoma-ubiquitina. Os proteossomas são grandes complexos proteicos
intracelulares que têm a função de degradar proteínas desnecessárias e, ainda,
41
atuar na concentração de alguns tipos de proteínas. Uma vez degradadas, as
proteínas formam uma pequena proteína, a ubiquitina.
Inúmeros estudos têm demonstrado que falhas neste sistema de eliminação
proteica podem contribuir para a morte celular que ocorre no desenvolvimento do
parkinsonismo. Estudos tem confirmado que o estresse oxidativo severo impede a
degradação das proteínas não ubiquitinizadas, pela via do proteossoma 20S, e com
isso aumenta o acúmulo de proteínas tóxicas e contribui para a morte neuronal
(MCNAUGHT; OLANOW, 2003). Em algumas formas hereditárias de DP, mutações
em componentes deste sistema estariam associadas à etiopatogenia da doença de
Parkinson (CHUNG et al., 2004). Sabe-se que toxinas do meio ambiente podem
aumentar os níveis de α-sinucleína e contribuir para a formação de corpos de Lewy,
o que resulta na inibição do sistema proteossoma-ubiquitina (BARTELS;
LEENDERS, 2009).
1.2.6 Apoptose
Vários estudos têm demonstrado que a apoptose dos neurônios
dopaminérgicos nigrais é um evento envolvido no processo de neurodegeneração na
DP (BATTISTI et al., 2008) e de outras doenças neurodegenerativas (BREDESEN,
2007). Essa hipótese foi demonstrada em estudos de modelos in vivo e in vitro
(NOVIKOVA et al., 2006).
O mecanismo celular de apoptose é marcado por alterações na
permeabilidade da membrana mitocondrial onde há formação de um canal de alta
condutância, com perda do potencial para fosforilação oxidativa; há extravasamento
de citocromo c para o meio intracitoplasmático e ativação de uma série de
substâncias serino-proteases como as caspases, transglutaminases, endonucleases
e fosfatidilserina/trombospondina. O processo implica na fragmentação da cromatina
e das organelas, com posterior clivagem das mesmas. Os corpúsculos apoptóticos
formados são fagocitados por macrófagos, que reconhecem suas sinalizações
(DAMIANI, 2004). A ativação das caspases pode ser observada em várias doenças
como no trauma (caspase-3), na DP (caspase-3), na ALS (caspase-3) e na doença
de Alzheimer (caspase-3 e caspase 9) (WALDMEIER; TATTON, 2004).
Vários estudos sugerem que a ativação dos TNFR pelo TNF-α pela via
extrínseca da apoptose possuem um papel importante na patogênese de algumas
42
doenças neurodegenerativas, como a DP e a doença de Alzheimer (WALDMEIER;
TATTON, 2004). Portanto, a apoptose esta presente na fisiopatologia da DP e esta
morte celular pode ser resultado de vários fatores, como estresse oxidativo,
neuroinflamação e disfunção mitocondrial.
1.3 AS BASES NEURONAIS DA DOENÇA DE PARKINSON
A DP é resultante de anormalidades primárias nos gânglios da base, uma
estrutura cerebral que atua em tarefas como a motivação crítica, planejamento motor
e funções de aprendizagem (PRESCOTT, 2009). Nesta doença, ocorre degeneração
dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal, ocasionando disfunção
dopaminérgica que irá comprometer o circuito dos gânglios da base. Sabe-se que os
sintomas iniciais da DP aparecem somente após a patologia ter alcançado um
estágio avançado, onde aproximadamente 50% das células dopaminérgicas da
substância negra já morreram com uma brusca depleção de 80% da dopamina
estriatal (BRAAK et al., 2003).
Os núcleos da base (gânglios da base) são massas de substância cinzenta
situadas na base do encéfalo que se relacionam com o córtex motor e,
consequentemente, possuem ações importantes no controle motor do corpo. São
constituídos por estruturas (núcleos) situadas no interior do centro branco medular
do cérebro que é a substância branca do telencéfalo, entre o córtex e o tálamo. As
principais estruturas que constituem os núcleos da base são corpo estriado (formado
pelo núcleo caudado, o putamem e o globo pálido - que se situa medialmente ao
corpo estriado e está dividido em uma porção interna (GPi) e externa (GPe) e outras
duas estruturas terminais, a substância negra- situada no mesencéfalo e dividida em
duas porções: a parte reticular (SNPr) e a parte compacta (SNPc) e núcleo
subtalâmico (Figura 3). Estas estruturas têm como principais funções: a diminuição
do tônus muscular, inibição da atividade muscular indesejada e a organização e
coordenação dos movimentos e da postura (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002).
43
Figura 3 - Estruturas dos gânglios basais, relacionadas ao Mal de Parkinson
.
Fonte: Bear, Connors e Paradiso (2002)
44
Cerca de 80% do conteúdo de catecolaminas no cérebro humano são de
dopamina (DA), e as principais projeções originárias de áreas cerebrais que
sintetizam este neurotransmissor são as vias: (1) Nigro-estriatal; (2) mesolímbica; (3)
mesocortical e (4) tuberoinfundibular, como podemos ver na Figura 4. Este
neurotransmissor pode ativar 5 tipos de receptores, subdivididos nas subfamílias D1-
símile (D1 e D5) e D2-símile (D2, D3 e D4), com base em suas propriedades
bioquímicas e farmacológicas. Os camundongos que não apresentam estes
receptores têm significantes déficits fisiológicos. Como, por exemplo, animais
knockout para receptor D1, apresentam hiperlocomoção e propriedades estriatais
alteradas. Os animais Knockout para receptor D2 apresentam os movimentos
comprometidos e, para o receptor D3, hiperlocomoção (Tabela 1).
Os receptores dopaminérgicos estão envolvidos em importantes ações, como
comportamento estereotipado e hiperlocomoção. Também podemos citar seu
envolvimento em doenças como a esquizofrenia, que é causada principalmente pela
superestimulação de receptores D2. O bloqueio destes receptores pode levar à
parkinsonismo ou discinesia tardia. Os ligantes destes receptores facilmente
discriminam as subfamílias D1- e D2-símile, porém a maioria deles não diferencia
claramente os diferentes membros de uma mesma subfamília (FEUERSTEIN, 2008).
45
Tabela 1 - Características dos principais receptores dopaminérgicos
Fonte: Kuhar et al. (1999).
46
Figura 4 - Principais vias dopaminérgicas
Fonte: Kerwin et al. (1999)
47
A via nigroestriatal origina-se de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo e
substantia negra pars compacta (SNpc) que inervam o estriado dorsal (caudado-
putamen); está envolvida no controle dos movimentos e sua degeneração leva a
patologias como a doença de Parkinson (STOCCHI, 2009). A via mesocortical
origina-se na área tegmentar ventral (ATV) e inerva diferentes regiões do córtex
frontal; já esta via parece estar envolvida no aprendizado e memória (PRITCHARD
et al., 2009). A via mesolímbica origina-se na ATV e inerva o estriado ventral (núcleo
accumbens), o tubérculo olfatório e partes do sistema límbico, está, por sua vez,
está implicada no comportamento motivacional (CHEN et al., 2009). Já a via
tuberoinfundibular inicia-se a partir de células dos núcleos arqueado e periventricular
do hipotálamo (FELDMAN; MEYER; QUENZER, 1997). As projeções desta via
alcançam a eminência média do hipotálamo onde ocorre liberação de DA nos
espaços perivasculares do plexo capilar do sistema hipotalâmico-hipofisário. Por
esta via a DA é transportada para a hipófise anterior onde atua inibindo a liberação
de prolactina.
O corpo estriado é o núcleo de entrada das aferências que chegam aos
gânglios da base (GB), vindas de múltiplas áreas do córtex cerebral, sendo vias
excitatórias mediadas pelo glutamato. O estriado também pode receber aferências
da SNC, através da via nigroestriatal. Os núcleos de saída dos GB são constituídos
por globo pálido interno (GPi) e substancia negra parte retircular (SNr) que mandam
eferências inibitórias, mediadas pelo GABA, até o tálamo e, daí, vão para o córtex.
Há duas vias pelas quais o sinal atravessa os GB, a via direta e a indireta. A via
direta facilita o movimento e a indireta inibe o movimento.
Na via direta ocorre a conexão direta do estriado aos núcleos de saída (GPi e
SNr) que age facilitando a desinibição do tálamo e promovem a ativação do tálamo e
córtex, por isso, esta via facilita o movimento. Sabe-se que anormalidadades na via
nigroestriatal causam alterações no circuito dos gânglios da base. Na via indireta,
começa a projeção que vai do estriado ao globo pálido externo (GPe) segue para o
núcleo subtalâmico (NST) e depois vai para o GPi e SNr, ocorrendo a via de inibição
do movimento através da inibição tálamo e consequentemente do córtex Quando
chega no estriado a dopamina apresenta efeitos opostos nas células das vias direta
e indireta, sendo excitatórios nas células da via direta e inibitórios nas células da via
indireta (OBESO et al., 2000).
48
O estriado recebe outra aferência importante mediada pela via nigroestriatal,
pois, além das aferências corticais que chegam ao estriado, existe outra projeção
que é a via dopaminérgica nigroestriatal, que se inicia na sistema nervoso central
(SNc) e termina no estriado, esta via modula o fluxo de informações corticais, em
que a dopamina ativa o receptor D1 (excitatório, pois está acoplado á Proteína Gs)
ativando a via direta e ativa o receptor D2 (inibitório, pois está acoplado á Proteína
Gi) ativando a via indireta, logo esta via facilita o movimento já que ativa a direta e
inibe a indireta, como podemos ver na Figura 5.
49
Figura 5 - Regulação das vias direta e indireta através da via nigroestriatal. As setas brancas indicam ativação (mediada pelo glutamato) e as setas pretas indicam inibição
(mediada pelo GABA)
50
No entanto, como na DP ocorre degeneração dopaminérgica na via
nigroestriatal e depleção de DA no estriado, a via direta fica inibida e a indireta
hiperativa. O resultado é que tanto o NST quanto os núcleos de saída (GPi/SNr)
ficam hiperativos, e, assim, o tálamo fica muito inibido e não facilita o movimento
(Figura 6).
51
Figura 6 - Regulação das vias direta e indireta através da via nigroestriatal em pacientes com doença de Parkinson. As setas brancas indicam ativação (mediada
pelo glutamato) e as setas pretas indicam inibição (mediada pelo GABA)
52
Além da dopamina, vários estudos comprovam que, em fases avançadas da
doença de Parkinson, ocorrem mudanças também em outros neurotransmissores e
em outros sistemas de neuromoduladores. A redução da noradrenalina está
relacionada com a destruição de neurônios noradrenérgicos e é responsável por
certos sintomas não-motores da DP como, por exemplo, demência, depressão e
disautonomia (FRANCIS; PERRY, 2007). Existe queda da concentração de
serotonina (5-HT), demonstrada em todas as regiões cerebrais, embora não existam
evidências de processos degenerativos envolvidos. Ocorre também uma diminuição
na atividade da enzima glutamato descarboxilase, enzima responsável pela
biossíntese do ácido gamaaminobutírico (GABA), que pode ser conseqüência da
neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal (FRANCIS;
PERRY, 2007).
Outro neurotransmissor que pode ser afetado pela DP é a acetilcolina (Ach);
Na verdade, as concentrações deste neurotransmissor não se alteram na doença de
Parkinson, mas com a depleção da dopamina ocorre redução do efeito inibitório nos
neurônios do estriado, ricos em acetilcolina, levando a uma hiperatividade relativa
desses neurônios colinérgicos (XU; BASTIA; SCHWARZSCHILD, 2005) (Figura 7).
53
Figura 7 - Balanço entre as ações estimulatórias (via glutamato-Glu e acetilcolina-ACh) e inibitórias (GABA e dopamina-DA) mantendo o funcionamento normal do circuito neuronal e as possíveis alterações que ocorrem na doença de Parkinson
Fonte: Aguiar (2009).
54
Sabemos que os efeitos excitatórios, mediados pela acetilcolina no estriado
parecem ser gerados pela ativação dos receptores M1, através do bloqueio da
condutância do potássio. Vários estudos recentes indicam que a acetilcolina também
pode aumentar a resposta aos receptores do glutamato (NMDA) e esta ação parece
envolver receptores M1. Estudos in vivo demonstraram que a acetilcolina pode
apresentar efeitos tanto excitatórios como inibitórios. Os receptores M1 são
responsáveis pela inibição pré-sináptica da liberação do GABA, enquanto os
receptores M3 exercem um controle inibitório da liberação do glutamato no estriado
(CALABRESI et al., 2000).
1.4 SINAIS E SINTOMAS DA DOENÇA DE PARKINSON
Um dos principais sintomas da DP é o tremor; Dois tipos de tremor podem ser
encontrados: de repouso e postural. No inicio da DP idiopática o tremor é
assimétrico. O tremor de repouso tem frequência de 4 a 6 Hz, afetando
principalmente os membros superiores. Embora infrequente, o aparecimento isolado
do tremor postural na DP o torna indistinguível do tremor essencial. Em alguns
pacientes, o tremor pode estar ausente, constituindo o tipo acinético-rígido da DP.
Outro sintoma motor importante é a bradicinesia que é responsável por uma
série de sintomas, tais como: hipomimia facial, diminuição da frequência do
pestanejar, disartria com hipofonia, períodos de injustificadas pausas no ato de falar
e redução da movimentação dos membros superiores durante a marcha. Toda a
musculatura estriada está afetada por uma rigidez uniforme, denominada plástica,
podendo estar acompanhada do sinal da roda denteada, uma crepitação periarticular
percebida durante a pesquisa do tônus muscular. A rigidez e a bradicinesia dos
músculos da deglutição constituem grave problema nos estágios mais avançados da
doença. Na DP, os músculos tornam-se mais tensos e contraídos e o paciente
sente-se rígido com pouca mobilidade (FERRAZ, 2005).
Com a evolução, a marcha apresenta-se do tipo festinante, com evidente
desequilíbrio postural. Até 60% dos pacientes em fases mais avançadas de DP
apresentam instabilidade postural com episódios de quedas. A causa deste distúrbio
está relacionada à acentuação da propulsão e da retropulsão do tronco, tratando-se
de um sintoma que evolui, provocando quedas e grande limitação motora, outro
55
sintoma que pode aparecer na fase avançada, é a alteração dos reflexos posturais
(FERRAZ, 2005).
Na DP, além dos sintomas motores característicos da doença cada vez mais
se reconhece a importância dos “sintomas não motores” (SNM). Estes sintomas
estão relacionados com os processos patológicos da doença, integram o quadro
clínico da mesma e alguns podem surgir anos antes dos sintomas motores (a
chamada “fase pré-motora” da DP (HAWKES; DEL TREDICI; BRAAK, et al., 2010;
SCHAPIRA; TOLOSA, 2010).
Há mais de duas décadas, são descritas na DP disfunções sensoriais com
intensidades variáveis. Olfação, sensibilidade visual ao contraste e percepção visual
de cores podem apresentar anormalidades, mas, devido à sua prevalência variável,
algumas dessas alterações não preenchem os requisitos de um marcador precoce
da DP (DOTY; BROMLEY; STERN et al., 1995).
A disfunção olfatória é um dos sinais mais prevalentes na DP, ocorrendo em
70 a 90% dos casos, embora apenas 28% dos pacientes relatem essa queixa.
Observam-se alterações de discriminação, identificação e limiar olfatório (DOTY;
BROMLEY; STERN et al., 1995). Essa disfunção pode ser chamada anosmia (perda
total do olfato) ou hiposmia (diminuição do olfato). A hiposmia é um dos sinais que
podem anteceder aos sintomas motores desta doença (KATZENSCHLAGER; LEES,
2004), sendo considerada um indicador pré-sintomático da DP. Dados recentes de
um estudo prospectivo, com familiares em primeiro grau de pacientes com DP
esporádica, correlacionam a hiposmia sem etiologia definida com risco de pelo
menos 13% de desenvolver DP (BERENDSE; PONSEN, 2006).. A disfunção olfatória
tem alta prevalência na fase pré-sintomática da DP, não se modifica com as
medicações antiparkinsonianas, nem sofre influência das fases "on" e "off"
(BUSENBARK et al., 1992).
Dentre outros sintomas não motores importantes na DP estão: disautonomia,
sialorreia, alterações urinárias, constipação, hipersudorese, disfunção erétil,
alterações do sono (insônia, perturbação do comportamento do sono REM ou RBD,
movimentos periódicos dos membros no sono, síndrome de pernas inquietas,
sonolência diurna excessiva), deterioração cognitiva (da deterioração ligeira até à
demência, sobretudo nas fases avançadas da doença), depressão (que ocorre em
até 30 a 60% dos pacientes parkinsonianos, sendo a complicação neuropsiquiátrica
mais comum na DP), apatia, ansiedade, fadiga e alterações psicóticas (sobretudo
56
alucinações visuais complexas, bem formadas e coloridas, como pessoas ou
animais), também apresentadas por pacientes que usam L-DOPA (FERRAZ, 2005;
MASSANO, 2009; MEIRELES; MASSANO, 2012; WERNECK, 2010).
Além destes sintomas relatados anteriormente, o paciente pode apresentar
sintomas sensitivos, atualmente, sabe-se que, aproximadamente, 40% dos
pacientes se apresentam com dor e dormência, local ou generalizada, pois apesar
da DP ser uma afecção motora, estudos mostram que até 60% dos pacientes podem
apresentar dor em algum momento da doença, e embora os mecanismos envolvidos
na produção de dor e sensações térmicas anormais não sejam totalmente
conhecidos. Pacientes com DP apresentam maior sensibilidade a diversos estímulos
dolorosos, por redução do limiar, sugerindo envolvimento dos núcleos da base na
fisiopatologia da dor (FERRAZ, 2005).
Pesquisa recente mostrou que os sintomas não-motores da DP foram
considerados tão incapacitantes quanto os sintomas motores. Neste estudo, os
problemas urinários foram os sintomas não motores mais prevalentes, sendo
importante o tratamento correto e rápido destes sintomas, para melhoria da
qualidade de vida dos pacientes com DP (VONGVAIVANICH et al., 2014).
1.5 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO
O tratamento farmacológico atual para a DP está restrito ao alívio sintomático,
porque não existem agentes capazes de inibir a degeneração neuronal. Esses
tratamentos levam a uma melhora inicial dramática e, com o passar do tempo, sua
eficácia diminui bastante. Outra limitação desses medicamentos consiste nos seus
efeitos colaterais com o desenvolvimento das discinesias que acabam por
impossibilitar a continuação do tratamento (RICHARDSON; KASE; JENNER, 1997).
As alternativas terapêuticas atuais dividem-se em: drogas que aumentam a
produção endógena de dopamina (como seu precursor a levodopa), em geral
utilizada juntamente com inibidores da dopa descarboxilase de ação periférica (como
a carbidopa ou benserazida); agonistas dopaminérgicos (bromocriptina, pergolida);
drogas que previnem a degradação endógena da dopamina (inibidoras da MAO-B
como a selegilina) e inibidores da catecol-O-metiltransferase (COMT): tolcapone e
entacapone; antiglutamatérgicos (amantadina) e antagonistas colinérgicos
(biperideno).
57
1.5.1 Levodopa + Inibidor de dopa descarboxilase
A dopamina não atravessa a barreira hematoencefalica e, quando
administrada na circulação sistêmica, não exerce nenhum efeito terapêutico sobre a
DP. No entanto, a L-dopa, precursor metabólico da dopamina, entra efetivamente no
cérebro através de um transportador de aminoácidos onde é descarboxilada a
dopamina, a L-dopa é usada em associação com inibidores da dopa descarboxilase
de ação periférica, como a carbidopa e benserazida, pois, quando administrada
isoladamente apenas 1 a 3% chegam de fato ao cérebro de maneira inalterada e o
restante é descarboxilado em dopamina pela dopa descarboxilase. Logo a
associação de L-dopa com inibidores da dopa descarboxilase é extremamente
vantajosa, pois aumenta a disponibilidade de L-dopa que chega ao cérebro dos
pacientes.
Até os dias de hoje, a levodopaterapia ainda é a melhor terapêutica para a
doença. A maioria dos artigos recentes indica que esta forma de tratamento deve
começar logo após o diagnóstico da DP. Nesta fase inicial, a levodopa deve ser
administrada na dosagem de 250 a 600mg/dia, em conjunto com a benserazida ou a
carbidopa.
Apesar de ser um dos fármacos mais usados na doença de Parkinson, a
Levodopa apresenta vários efeitos colaterais como: efeitos gastrintestinais (anorexia,
náuseas e vômitos), efeitos cardiovasculares (arritmias cardíacas, hipotensão
postural, taquicardia, extrassístoles ventriculares e, raramente, fibrilação atrial)
efeitos comportamentais (depressão, ansiedade, agitação, insônia, sonolência,
alucinações, euforia e alterações de humor) e discinesias e flutuações na resposta.
Ocorrem discinesias em até 30% dos pacientes que usam levodopa por mais de 10
anos; as apresentações mais comuns a coreoatetosa da face e da parte distal dos
membros, efeitos que estão relacionados á dose de levodopa. Já as flutuações
ocorrem com frequência à medida que o tratamento continua (em até 50-80% dos
pacientes). Dentre estas flutuações na resposta, está o “Fenômeno on-off ou liga-
desliga”, em que os períodos “desligados” de acinesia acentuada alternam-se
durante o curso de algumas horas com períodos de melhora “ligados” da mobilidade,
porém com discinesias acentuadas (KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
58
1.5.2 Agonistas dos receptores de dopamina
Os fármacos que atuam diretamente sobre os receptores de dopamina podem
ter efeito benéfico, além daquele da levodopa. Além disso, os fármacos que afetam
seletivamente determinados receptores de dopamina podem ter efeitos adversos
mais limitados do que a levodopa. Os agonistas da dopamina mais antigos
(bromocriptina e pergolida) derivam-se do esporão do centeio e raramente ou nunca
são usados no tratamento do parkinsonismo; os mais modernos como pramipexol e
ropinirol têm desempenhado um papel como terapia de primeira linha para DP e o
seu uso está associado a uma incidência baixa das flutuações da resposta e
discinesias que ocorrem na terapia a longo prazo com levodopa. Em consequência,
pode ser mais apropriado iniciar a terapia dopaminérgica com um agonista da
dopamina. Alguns efeitos colaterais são: gastrintestinais (anorexia, náuseas e
vômitos); cardiovasculares (hipotensão postural; edema periférico); discinesias;
confusões; alucinações; delírios entre outros (KATZUNG; MASTERS; TREVOR,
2014).
1.5.3 Inibidores da Monoaminoxidase (IMAO)
Existem dois tipos de monoaminoxidase no SNC, a MAO-A que metaboliza a
norepinefrina, serotonina e dopamina; a MAO-B que metaboliza seletivamente a
dopamina. A selegilina, um inibidor seletivo da MAO-B em doses normais (em doses
mais altas, o fármaco também inibe a MAO-A), retarda a degradação de dopamina;
em consequência, aumenta o efeito antiparkinsoniano da L-DOPA (possibilitando
assim uma redução da dose de L-dopa) e pode reduzir os fenômenos leves de liga-
desliga ou de desgaste. Por conseguinte, a selegilina é usada como terapia
adjuvante, para pacientes com declínio ou flutuação da resposta á levodopa.
A rasagilina, outro inibidor da MAO-B, é mais potente do que a selegilina na
prevenção do parkinsonismo induzido por MPTP e está sendo usado para
tratamento sintomático precoce. A administração combinada de levodopa e de um
inibidor de ambas as formas de MAO deve ser evitada, visto que pode levar a crises
hipertensivas, provavelmente devido o acúmulo periférico de norepinefrina
(KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
59
1.5.4 Inibidores da catecol-O-metiltransferase (COMT)
A inibição da dopa descarboxilase está associada a uma ativação
compensatória de outras vias de metabolismo da levodopa, em especial a COMT,
com consequente aumento dos níveis plasmáticos de 3-O-metildopa (3-OMD). Os
níveis elevados de 3-OMD têm sido associados a uma resposta terapêutica precária
á levodopa, talvez, em parte, pelo fato de a 3-OMD competir com a levodopa por um
mecanismo de transporte ativo que governa o seu transporte através da mucosa
intestinal e da barreira hematoencefálica.
Os inibidores seletivos da COMT, como tolcapone e entacapone, também
prolongam o efeito da levodopa, diminuindo o seu metabolismo periférico, ocorrendo
aumento da biodisponibilidade relativa da mesma. Esses agentes podem ser úteis
em pacientes em uso de levodopa que desenvolvem flutuações da resposta,
resultando em resposta mais estável, tempo “ligado” mais prolongado e redução da
dose diária de levodopa. Prefere-se a entacapona á tolcapona, geralmente, devido à
tolcapona ter mais risco de gerar hepatotoxicidade. A entacapona tem efeito mais
periférico e a tolcapona tanto central como periférico. Os principais efeitos colaterais
destes fármacos são: náuseas, vômitos, discinesias e confusão (KATZUNG;
MASTERS; TREVOR, 2014).
1.5.5 Amantadina
Descobriu-se, por acaso, que a amantadina, um agente antiviral, possui
propriedades antiparkinsonianas. Seu mecanismo de ação não está totalmente
conhecido, porém o fármaco potencializa a função dopaminérgica, ao influenciar a
síntese, a liberação ou a recaptação da dopamina. Relatou-se que a amantadina
antagoniza os efeitos da adenosina nos receptores de adenosina A2a.Também
possui efeito fraco anticolinérgico e bloqueia receptores NMDA do glutamato. A
amantadina é menos eficaz do que a levodopa e seus benefícios podem ser de curta
duração, atuando bem sobre o tremor, rigidez e acinesia. Os principais efeitos
colaterais são inquietação, depressão, insônia, agitação, confusão e irritabilidade
(KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
60
1.5.6 Fármacos bloqueadores da acetilcolina
Atualmente dispõe-se de vários fármacos antimuscarínicos de ação central;
agentes podem melhorar o tremor e a rigidez do parkinsonismo, porém exercem
pouco efeito sobre a bradicinesia; alguns exemplos desses fármacos são:
benzatropina, biperideno, triexifenidil, orfenadrina e prociclidina. Sua utilização, nos
dias atuais, pode ser explicada pela preponderância da acetilcolina que é observada
no estriado de pacientes com diminuição da neurotransmissão dopaminérgica a
partir da substância negra. Esses fármacos anticolinérgicos produzem vários efeitos
colaterais centrais, como confusão mental e disfunção cognitiva, e periféricos como
xerostomia, visão turva, retenção urinária, constipação e pele quente e seca. Tais
efeitos colaterais compreendem a maior limitação no uso de anticolinérgicos
(FERRAZ, 2005; KATZUNG; MASTERS; TREVOR, 2014).
1.5.7 Terapia Neuroprotetora
A busca por agentes neuroprotetores que venham a diminuir ou mesmo
anular a progressão da neurodegeneração, continua tendo importância primordial
nos estudos da doença de Parkinson (SCHAPIRA, 2008). Conhecendo os
mecanismos etiopatogênicos da DP, pode-se pensar em estratégias neuroprotetoras
racionais, como antioxidantes, bloqueadores de canais de cálcio, inibidores da NOS,
anti-inflamatórios, fatores neurotróficos e agentes que bloqueiam a apoptose; alguns
desses compostos estão em fase de pesquisa. Contudo, até o momento, essas
estratégias são apenas teóricas, necessitando de mais estudos sobre tais
substâncias (ANDRADE et al.,1999).
1.6 MODELOS ANIMAIS DE DOENÇA DE PARKINSON
Modelos animais são ferramentas importantes na ciência médica experimental
para se entender melhor a patogênese de doenças humanas. Esses modelos devem
mimetizar, tanto quanto possível, as patologias humanas. Uma vez desenvolvidos,
tais modelos podem ser explorados para se testarem em abordagens terapêuticas
para o tratamento de distúrbios funcionais observadas na doença de interesse. Na
base dos resultados experimentais e clínicos, a DP foi a primeira doença neurológica
61
a ser modelada e, subsequentemente, tratada por terapia de substituição de
neurotransmissor.
Os agentes que seletivamente perturbam ou destroem sistemas
catecolaminérgicos, tais como reserpina, metanfetamina, 6-hidroxidopamina (6-
OHDA) e MPTP têm sido usados para desenvolver modelos de DP. Recentemente,
verificou-se que produtos químicos agrícolas, tais como rotenona e paraquat,
quando administrados sistemicamente, podem reproduzir características específicas
de DP em roedores, aparentemente através de danos oxidativos. Os animais
transgênicos que superexpressam a α-sinucleína são usados para se estudar o
papel desta proteína na degeneração dopaminérgica (BETARBET; SHERER;
GREENAMYRE, 2002). Alguns desses modelos estão caracterizados na Tabela 5.
Discutiremos a seguir os principais.
62
Quadro 2 - Modelos experimentais de DP utilizando-se neurotoxinas: caracterização geral de modelos animais
Fonte: Adaptado de Sampaio (2014).
63
1.6.1 O Modelo do MPTP
O modelo de doença de Parkinson induzida por MPTP tem contribuído muito
para o estudo da morte celular presente na DP. Entre 1979 e 1982 um grupo de
jovens da Califórnia que utilizaram heroína desenvolveram o parkinsonismo
adquirido, porém responsivo ao tratamento com L-dopa (DAVIS et al., 1979). A
análise da heroína mostrou que esta droga era constituída por aproximadamente 3%
de MPTP (LANGSTON et al., 1983).
Quando administrado em animais, o MPTP atravessa a barreira
hematoencefálica e é convertido, principalmente nas células da glia, na sua forma
efetiva, o 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+), pela ação da MAO-B (CHIBA; TREVOR;
CASTAGNOLI JUNIOR, 1984). Após a recaptação, o MPP+ acumula-se nas células
dopaminérgicas e inibe então a atividade desta organela, reduzindo os níveis
celulares do ATP e subsequentemente levando à morte celular.
1.6.2 Modelo da 6-OHDA
A 6-OHDA é uma droga comumente usada na investigação de compostos
com atividade protetora em doenças neurodegenerativas, em humanos, incluindo-se
a DP (NOBRE JÚNIOR et al., 2003). Sendo um dos modelos de DP mais utilizados,
a 6-OHDA atua como um “falso substrato”, sendo rapidamente acumulada em
neurônios catecolaminérgicos. O complexo mecanismo de toxicidade envolve
alquilação, rápida autoxidação (gerando peróxido de hidrogênio, superóxidos e
radicais hidroxil) e o impedimento na produção de energia mitocondrial. Dessa
forma, dentro dos neurônios a neurotoxina acumula-se no citosol, promovendo alta
taxa de formação de radicais livres e, como mecanismo adicional, a 6-OHDA pode
também se acumular nas mitocôndrias, onde inibe a atividade de transporte de
elétrons, logo causando morte celular e necrose de células dopaminérgicas (CHOI et
al., 1999; JELLINGER, 1999; 2000; SCHOBER, 2004).
A neurotoxina 6-OHDA apresenta similaridade estrutural com as
catecolaminas e tem alta afinidade pelo sistema de transporte das mesmas,
mostrando assim a sua seletividade por neurônios catecolaminérgicos. Produz
lesões na SNc, pela indução da produção de peróxido de hidrogênio e espécies
64
reativas do oxigênio, como radical hidroxil, e também pela inibição do complexo I
mitocondrial (Figura 8) (MILLER et al., 2009).
De acordo com Schober (2004), nos modelos experimentais, a 6-OHDA
precisa ser injetada diretamente no encéfalo através da cirurgia de estereotaxia, já
que a toxina não é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica quando injetada
sistemicamente. A injeção de 6- OHDA deve ser realizada na substância negra,
estriado ou feixe prosencefálico medial. A injeção no estriado provoca indução de
morte neuronal mais progressiva e retrógrada, comparada às injeções da toxina na
substância negra e prosencéfalo medial. As lesões no estriado são lentas e parciais
e têm sido usadas para imitar o progresso lento da DP.
As lesões de 6-OHDA podem ser bilaterais ou unilaterais. Nos modelos de
lesão unilateral, há um comportamento motor rotacional contralateral ou ipsilateral
dos animais, induzido farmacologicamente após a administração sistêmica de
apomorfina (agonista dopaminérgico não-seletivo) ou anfetamina (estimulante da
liberação de dopamina). A principal vantagem do modelo é exatamente esse
comportamento rotatório, que tem correlação com o grau de perda dopaminérgica e
pode ser usado para rastreamento de terapias neuroprotetoras (DAUER;
PRZEDBORSKI, 2003).
65
Figura 8 - Hipótese do mecanismo de toxicidade da 6-hidroxidopamina (6-OHDA)
Fonte: Adaptado de Blum et al. (2001).
66
1.7 Camellia sinensis (CHÁ)
A Camellia sinensis é uma espécie da família Theaceae, popularmente
conhecida como chá (Figura 9). Frequentemente, o cultivo da Camellia sinensis no
Brasil está associado a colônias japonesas. Esta é uma árvore de até 15 metros de
altura, nativa das florestas do nordeste da Índia e sul da China. O chá, como é
genericamente denominada a infusão feita a partir da Camellia sinensis, é
consumido no mundo há mais de cinquenta séculos. Depois da água, o chá é a
bebida não alcoólica mais consumida no mundo, atualmente (CHANTRE; LAIRON,
2002).
Todo “chá” é proveniente dos arbustos da Camellia sinensis, no entanto,
quando colhidas e picadas, as folhas podem ser processadas para obtenção do chá
verde (CV), oolong e preto. A principal diferença entre estes tipos de chá baseia-se
no processo de auto-oxidação, catalisado pela enzima polifenol-oxidase (PFO). O
chá verde não é oxidado, o chá oolong é semi-oxidado e o chá preto é oxidado. De
todo o chá produzido e consumido no mundo, de 76% a 78% corresponde ao chá
preto, 20% a 22% ao chá verde e menos do que 2% ao oolong.
O chá verde, por não ser oxidado, é mais rico em catequinas (polifenois) e em
outras substâncias como quercetina, cafeína, kaempferol e miricetina. As folhas do
chá verde contêm um alto teor de catequinas, que constituem 30-45% do extrato
seco da planta (YANG; WANG, 1993). É importante relatar que a composição das
folhas do chá depende de uma variedade de fatores, incluindo-se clima, estação,
processo utilizado na horticultura, além do tipo e idade da planta.
Existem cerca de oito catequinas diferentes presentes no CV, mas as quatro
principais são: epicatequina (EC), epicatequina-3-galato ou galato de epicatequina
(ECG), epigalocatequina (EGC) e epigalocatequina-3-galato ou 3-galato de
epigalocatequina (EGCG) (Figura 10). A análise por HPLC de amostras do chá
verde mostra que EGCG é o principal constituinte de polifenóis (mais de 60% do
total de catequinas), representando mais do que. 10% do peso seco do extrato,
seguido por EGC e EC (MOYERS; KUMAR, 2004).
67
Figura 9 - Camellia sinensis (Chá)
Fonte: Plant Illustrations.org
68
Figura 10 - Estruturas químicas das principais catequinas do chá verde
Fonte: Adaptado de Sutherland, Rosanna e Appleton (2006).
69
Acredita-se que as propriedades favoráveis atribuídas ao consumo do chá se
devem aos seus componentes bioativos, as catequinas, capazes de agirem
diretamente como varredores de radicais e exercerem propriedades antioxidantes
indiretas através da ativação de fatores de transcrição e de enzimas antioxidantes
(WISEMAN; BALENTINE; FREI, 1997; HARBORNE; WILLIAMS, 2000; CROFT,
1998; DREOSTI, 2000; NANJO et al., 1996; LANGLEY-EVANS, 2000; SERAFINI;
GHISELLI; FERRO-LUZZI, 1994; LEAN et al., 1999).
A atividade antioxidante das catequinas do CV está associada ao número de
grupos hidroxila; as que possuem de 3 a 6 grupos de hidroxila na sua estrutura
química têm melhor efeito antioxidante, logo a EGCG parece ter melhor efeito
antioxidante. As catequinas têm a propriedade de eliminar as EROs e quelar íons
metálicos, como o ferro e o cobre, prevenindo assim suas participações em algumas
reações de oxidação e também várias doenças (MILLER et al., 1996; SERAFINI;
GHISELLI; FERRO-LUZZI, 1996). Um estudo mostrou que a ingestão de Camellia
sinensis aumentou a expressão de Nrf2 (fator relacionado com o E2), Gst (glutationa
S-transferase), NQO1 (quinona oxidorredutase 1) e Ho1(heme oxigenase-1), sendo
alguns dos possíveis mecanismos através dos quais o chá branco pode proteger
contra o stress oxidativo (ESPINOSA et al., 2014).
Apesar dos benefícios atribuídos ao chá para a saúde desde o início da sua
história, as investigações científicas a seu respeito surgiram há aproximadamente
trinta anos. Muitos estudos têm demonstrado que o chá verde têm várias
propriedades farmacológicas, tais como: anti-hipertensivo (HENRY; STEPHENS-
LARSON, 1984), antioxidante (LEUNG et al., 2001), anticarcinogênico (SHI et al.,
1994) e hipocolesterolêmico (YANG et al., 2001; SABU et al., 2002; SAFFARI;
SADRZADEH, 2004). Além disso, ajuda a controlar os níveis glicêmicos de
pacientes diabéticos e a reduzir o peso corporal, tendo efeitos antiobesidade (ISO et
al., 2006; KIM et al., 2013; DULLOO et al., 1999; PIGNATELLI et al., 2000).
A maioria dos estudos sobre os possíveis benefícios do chá à saúde, têm
investigado seus efeitos quimiopreventivos contra o câncer (NAKACHI et al., 1998;
HAN, 2004; SABU et al., 2002; UESATO, 2001). Principalmente, a EGCG tem sido
extensivamente estudada por causa de seus efeitos anticancerígenos (LIN; LIANG,
2000; MOYERS; KUMAR, 2004; RECORD; DREOSTI, 1998; CHOAN et al., 2005;
GAO et al., 1994; IMAI; SUGA; NAKACHI, 1997). Muitos estudos epidemiológicos
demonstraram que o chá verde pode oferecer proteção contra vários tipos de câncer
70
como: de pele, bexiga, mama, próstata e pulmão (MUKHTAR; AHMAD, 2000;
YANG; MALIAKAL; MENG, 2002; CONDE et al., 2014). Estudo recente mostrou que
a combinação de CV mais ácido zoledrônico apresentou uma potente ação
anticancerígena e antimetástase contra o câncer de mama (LUO et al., 2014).
Também recentemente, verificou-se que a administração oral de CV impediu
a cardiotoxicidade, induzida pela doxorrubicina, através do aumento dos
mecanismos de defesa antioxidantes do coração (KHAN et al., 2014). Há evidências
de que o consumo de chá também pode reduzir o risco de doenças cardiovasculares
e neurodegenerativas, além de ter efeito anti-inflamatório (HERTOG et al., 1993;
MANDEL et al., 2008; WOLFRAM, 2007). Toda et al. (1992) descobriram que o CV
inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri,
Shigella dysenteriae e Vibrio spp., incluindo-se o Vibrio cholerae, Clostridium spp e
Pseudomonas ssp demonstrando assim uma boa atividade antimicrobiana, e esta
atividade é em grande parte atribuída a catequina EGCG. Um estudo feito por Otake
et al. (1991) demostrou que o chá verde (Camellia sinensis) apresentou
propriedades anticariogênicas, podendo atuar na prevenção da cárie.
Alguns dos principais efeitos biológicos do CV e das catequinas estão
ilustrados na Figura 11.
71
Figura 11 - Atividades biológicas das catequinas e do chá verde
Fonte: Mandel et al. (2008).
72
1.7.1 Camellia sinensis (Chá-verde), suas catequinas e a doença de Parkinson
Vários estudos têm demonstrado os efeitos protetores de plantas, como a
Camellia sinensis e seus princípios bioativos, as catequinas, contra o dano cerebral
na DP. Os efeitos neuroprotetores destes compostos são atribuídos em parte, à
remoção de radicais livres, à quelação de ferro/metais e às suas atividades
antiinflamatórias (SUN et al., 2008; VAFEIADOU et al., 2007; MANDEL et al., 2005;
SRIVIDHYA et al., 2008; ASSUNÇÃO et al., 2011). Além disso, o CV parece
melhorar a função cognitiva, auxiliando na prevenção da demência em
camundongos (PATIL et al., 2003). Na China a prevalência da DP é bem menor do
que em países ocidentais, possivelmente devido ao hábito dos chineses de beberem
chá, o que foi confirmado por estudos epidemiológicos (CHECKOWAY et al., 2002;
LI et al., 1985).
O pré-tratamento de camundongos com o extrato de chá verde preveniu a
morte de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal induzido MPTP (LEVITES
et al., 2001). Um estudo feito por Jeong et al. (2007) mostrou que a EGCG
aumentou a atividade de neurônios dopaminérgicos da substancia negra de ratos,
provavelmente pela inibição de correntes de potássio dependentes de cálcio. Além
disso, estudo recente mostrou que a infusão do chá-verde apresentou capacidade
de inibir a MAO (ADEMOSUN; OBOH, 2014). Já Guo, Bezard e Zhao (2005)
demonstraram que os polifenóis do chá verde protegeram as células da
neurotoxicidade induzida por 6-OHDA, através da inibição da oxidação da 6-OHDA e
do bloqueio da ativação de PKC e NF-κB. Recentemente, um artigo de revisão
apontou as catequinas do CV como um dos agentes neuroprotetores promissores
para o tratamento de doenças neurodegenerativas (SUBASH et al., 2014).
Nobre Júnior e colaboradores (2003), em um trabalho desenvolvido no nosso
laboratório de Neurociências e Comportamento da Universidade Federal do Ceará,
evidenciaram que a catequina apresentou efeito neuroprotetor em culturas de
células mesencefálicas expostas à 6-OHDA. Outro trabalho do mesmo grupo
confirmou o efeito neuroprotetor da catequina, no modelo animal de DP induzida por
6-OHDA (TEIXEIRA, 2011). No entanto, mais estudos são necessários para
confirmar e elucidar o mecanismo de ação neuroprotetor do CV e das catequinas,
principalmente in vivo.
73
O chá verde contém outros compostos, além das catequinas, como a cafeína
que podem desempenhar papel importante na neuroproteção. A cafeína bloqueia os
receptores A2A da adenosina, atenuando a neurodegeneração dopaminérgica em
modelos de animais com DP (KALDA et al., 2006; MACHADO-FILHO et al., 2014;
CHEN et al., 2001; PINNA et al., 2002).
1.7.2 Farmacocinética e Efeitos colaterais
Apesar de ser amplamente utilizado no mundo todo, o CV pode como
qualquer outra substância ocasionar efeitos tóxicos, dependendo da dose utilizada.
Pesquisas têm demonstrado o risco de hepatotoxicidade com doses elevadas (750
mg/kg, uma vez por dia durante 3 dias, por via oral) de chá-verde e a
epigalocatequina-3-galato (EGCG) em ratos e cães (JAMES; FORESTER;
LAMBERT, 2014). Um estudo evidenciou que o NOAEL de toxicidade sistêmica
após administração oral foi de 2000 mg/kg/dia para o extrato padronizado do CV
(CHENGELIS et al., 2008).
Pesquisas demonstraram que altas doses de polifenóis do chá verde (600 -
1800 mg/dia) não causaram efeitos adversos em humanos (CHOW et al., 2003).
Além disso, Rahman et al. (2005) monstraram que a administração de EGCG (50
mg/kg i.p) não causou qualquer deterioração do estado geral de saúde dos animais
ou hepatotoxicidade (avaliado pelos níveis de ALT). Kao et al. (2000) confirmaram
que administração de EGCG (82 mg/kg) não alteraram os níveis de ALT em ratos
adultos. Portanto, podemos considerar o CV e catequinas produtos naturais seguros
em doses terapêuticas, mas seu uso deve ser feito com cautela, pois doses altas
podem causar efeitos tóxicos.
Informações sobre a farmacocinética clínica de uma droga são extremamente
importantes para auxiliar na interpretação e extrapolação dos resultados de qualquer
estudo. Estudos farmacocinéticos têm mostrado que as catequinas do CV são
rapidamente absorvidas e eliminadas, em seres humanos. As concentrações
plasmáticas máximas são atingidas entre 1 a 3 h após a administração oral e com
meia-vida de 2-4 h. A biodisponibilidade do CV é satisfatória quando administrada
por via oral, no entanto, as catequinas isoladas apresentam menor
biodisponibilidade (EGCG < EC), sendo a da EGCG ainda menor do que a da EC, o
que pode ser devido ao extenso metabolismo de primeira passagem sofrido por esta
74
catequina. No entanto, uma pesquisa evidenciou o aumento de 60% na
disponibilidade sistémica de EGCG, após a administração crónica desse polifenol do
chá verde (CHOW et al., 2003). Estudo demonstrou que a EGCG na forma de pró-
fármaco apresentou maior estabilidade e biodisponibilidade do que o EGCG normal
(CHAO et al., 2010).
Na Figura 12 podemos ver que as catequinas do CV podem ser absorvidas no
intestino ou metabolizadas pela flora intestinal formando ácidos fenólicos que serão
excretados nas fezes ou absorvido. Após a absorção intestinal, parte das catequinas
chegará até o fígado onde sofrerá metabolismo de primeira passagem através de
reações de sulfatação, metilação ou glicuronidação e a outra parte atingirá a
circulação sistêmica onde será bem distribuída pelos tecidos e posteriormente
eliminada pela urina (CHOWA; HAKIMA, 2011).
75
Figura 12 - Esquema representativo da farmacocinética do Chá-verde e das catequinas
Fonte: Adaptado de Chowa e Hakima (2011).
76
1.8 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A DP é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum após a doença
de Alzheimer. É uma doença crônica, progressiva e multifatorial que resulta da perda
de neurônios dopaminérgicos na substância negra parte compacta. A depleção
progressiva da dopamina ocasiona o aparecimento de alterações motoras e não
motoras. A causa da DP é ainda desconhecida e as opções terapêuticas atuais são
apenas sintomáticas (WONG; GILMOUR; RAMAGE-MORIN, et al., 2014).
Apesar de extensas pesquisas, ainda não há nenhum tratamento definitivo
para a DP, levando cada vez mais pesquisadores em todo o mundo a buscarem
novas terapias capazes de retardarem ou, idealmente, pararem a neurodegeneração
dopaminérgica. Estudos têm demonstrado os efeitos neuroprotetores de plantas
fenólicas, como a Camellia sinensis, contra doenças neurodegenerativas. Estes
efeitos são atribuídos, em parte, à remoção de radicais livres, à quelação de
ferro/metais e às suas atividades anti-inflamatórias (SUN et al., 2008; VAFEIADOU
et al., 2007). Os princípios bioativos desta planta, as catequinas, têm ganhado
importância por demonstrarem exercer um papel protetor no processo de
neurodegeneração (TEIXEIRA, 2011).
Embora haja vários estudos sobre os efeitos neuroprotetores do chá verde e
de suas catequinas, a maioria deles utiliza modelos in vitro de DP (CHAO et al.,
2010; CHEN et al., 2012; LEE et al., 2013; LEVITES et al., 2002; LOPEZ; CALVO,
2011; LORENZEN et al., 2014; MOLDZIO et al., 2010; NIE et al., 2002; RAZA;
JOHN, 2008; TAI; TRUONG, 2010; VARÇIN et al., 2012). Assim, há relativamente
poucos trabalhos que estudaram estes produtos naturais em modelos animais de DP
(AL-AMRI; CHOI et al., 2002; GUO et al., 2007; HAGRAS; MOHAMED, 2013; KIM et
al., 2010; LEVITES et al., 2001). Por isso, resolvemos avaliar o efeito do CV e de
seus principais princípios bioativos, EC e EGCG, no modelo animais de DP induzida
por 6-OHDA.
77
OBJETIVOS
78
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Investigar os efeitos do extrato padronizado da Camellia sinensis (Chá-verde)
e de seus principais princípios bioativos, as catequinas epicatequina e
epigalocatequina 3-galato, no modelo experimental da Doença de Parkinson
produzido pela injeção estereotáxica de 6-OHDA em corpo estriado de ratos,
avaliando os possíveis mecanismos de ação envolvidos.
2.2 ESPECÍFICOS
a) verificar os efeitos do extrato padronizado da Camellia sinensis (Chá-
verde) isoladamente ou associada com a L-DOPA e de suas catequinas,
epicatequina e epigalocatequina 3-galato, sobre:
o comportamento rotacional induzido por apomorfina em ratos
submetidos à injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA;
a movimentação espontânea e a coordenação motora em ratos
submetidos à injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA através dos
testes do campo aberto e Rota-Rod, respectivamente;
a memória espacial e comportamento depressivo em ratos submetidos
à injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA através dos testes do
labirinto aquático e nado forçado, respectivamente;
as alterações nos neurotransmissores envolvidos no processo
neurodegenerativo da DP, através da determinação das concentrações
de dopamina e de seus metabólitos no estriado de ratos submetidos à
injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA;
a perda neuronal através da coloração de Nissl no hipocampo de ratos
submetidos à injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA;
a imunomarcação da enzima Tirosina Hidroxilase (TH) no estriado de
ratos submetidos à injeção estereotáxica unilateral de 6-OHDA;
a neuroinflamação induzida pela 6-OHDA através da
imunohistoquímica para COX-2 no corpo estriado e iNOS no
79
hipocampo de ratos submetidos ao modelo experimental de doença de
Parkinson induzido pela 6-OHDA;
o estresse oxidativo no corpo estriado de ratos submetidos à injeção
estereotáxica unilateral de 6-OHDA através da dosagem de TBARS e
nitrito;
sobre a produção de oxidantes por neutrófilos humano estimulados
com PMA mensurada por Quimioluminescência dependente de luminol
(QL lum);
b) avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato padronizado da Camellia
sinensis (Chá-verde) isoladamente ou associado com Indometacina ou
Dexametasona no edema de pata induzido por carragenina e dextrano;
c) estudar o efeito antinociceptivo do extrato padronizado da Camellia
sinensis (Chá-verde) isoladamente ou associado com Morfina ou
Indometacina nos testes de Hargreaves; da formalina; das contorções por
ácido acético e da placa quente.
80
METODOLOGIA
81
3 METODOLOGIA
3.1 MATERIAIS USADOS NOS EXPERIMENTOS
Quadro 3 - Principais materiais utilizados nos experimentos
MATERIAL MARCA/MODELO
Agitador de tubos Modelo 251, FANEN, SP, Brasil
Balança Analítica Modelo H5, Metter, Suíça
Banho Maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil
Bomba para HPLC LC-10AD Shimadzu, Japan
Centrífuga refrigerada Modelo Marathon 26 KMR, Fisher Scientific
Coluna para catecolaminas Modelo C 18, 5 μm, 250 x 4,6mm, Shimadzu, Japan
Cubetas de plástico para leitura de
espectrofotômetro
Sarstedt, Alemanha
Equipamento de milipore para filtração a vácuo
Milipore Apparatus, Bedford, MA, USA
Estufa para secagem Modelo 315SE FANEM, SP, Brasil
Guilhotina
Harvard, USA
Homogeneizadores manuais Bellico, USA
Medidor de pH modelo B374 Micronal, SP, Brasil
Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc. NY, USA
Pré-coluna CLC g-ODS, 4mm X 1cm
Shimadzu, Japan
Microscópio óptico BX41 Olympus
Pletismógrafo UGO BASILE, Itália
Teste Plantar do Hargreaves UGO BASILE, Itália
Microseringas Hamilton Hamilton
Broca de baixa rotação Dremel
Placa Quente UGO BASILE, Itália
82
3.2 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar, adultos e machos, com peso variando entre
180-250g provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina do Juazeiro do Norte
(Estácio-FMJ). Os animais foram mantidos em caixas de prolipropileno com no
máximo 6 animais, à temperatura média de 24 ± 2°C em ciclos de alternância
claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão e água a vontade.
No que se refere aos cuidados com os animais, este estudo seguiu os
princípios éticos da experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi submetido e aprovado pela
Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará
(UFC) sob o número de registro 104/2011. Todos os experimentos seguiram os
princípios éticos estabelecidos no Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de
Laboratório, EUA 1986.
3.3 MATERIAL BOTÂNICO E DROGAS UTILIZADAS NA PESQUISA
O extrato seco (spray drying) das folhas de Camelia sinensis (Chá-verde) a
35% de polifenois foi gentilmente doado pelo Grupo Centroflora®/Brasil. Esse
extrato seco ainda passou por um processo de padronização feito pela Profa. Dra.
Luzia Kalyne Moreira Leal da Universidade Federal do Ceará, conforme metodologia
abaixo descrita. As seguintes drogas foram utilizadas: 6-hidroxidopamina (Sigma
Aldrich, USA); Quetamina (König, Argentina); Xilazina (König, Argentina), padrões
das monoaminas (Sigma Co. St. Louis, USA); Apomorfina (Sigma Aldrich, USA),
epicatequina (Sigma Aldrich, USA) e epigalocatdequina 3-galato (Sigma Aldrich,
USA) e a L-DOPA foi obtida a partir da preparação comercial Prolopa®
(comprimidos com L-dopa 200 mg+ Benserazida 50 mg, Laboratórios Roche®).
Anticorpos para ensaios imunoistoquímicos eram de Santa Cruz Biotechnology
(Dallas, TX, EUA) ou Merck Millipore (Darmstadt, Alemanha).Os demais reagentes
foram de grau analítico.
83
3.4 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENOIS TOTAIS NO EXTRATO SECO DE
Camelia sinensis
A dosagem de fenóis totais deu-se com o emprego do reagente de Folin-
Ciocalteau. Amostra (10 mg) do extrato seco de Camelia sinensis foi transferida para
o balão volumétrico de 10 mL onde foram adicionados 0,25 mL do reagente de Folin-
Ciocalteau 1N e 4 mL de água ultra-pura. Após alcalinizar o meio (1,25 mL de
Na2CO3 a 20 %), o volume foi completado/10 mL. Decorrido 40 min, à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz, realizou-se leitura espectrofotométrica (715 nm)
(MAKKAR, 2000; SOUZA et al., 2007).
A curva de calibração foi construída a partir de concentrações crescentes de
ácido gálico - padrão (intervalo: 2 a 16 µg/mL) dissolvido em água ultra-pura e
realizada análise espectrofotométrica segundo metodologia descrita acima. Análise
de regressão linear permitiu determinar a equação da reta (y= 0,077x + 0,0468) e
comprovar a linearidade do método (r = 09985). A concentração de fenóis totais
(média ± DP) (Coeficiente de variação) no extrato seco foi de 326,03 ± 7,57 (2,32 %)
mg de fenóis totais/g de extrato seco, perfazendo um extrato a 32,6 % de fenóis
totais. Os fenóis totais são mensurados em EAG = equivalentes de ácido gálico
3.5 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DE Camellia sinensis (CHÁ-VERDE)
Nesta pesquisa os animais foram tratados com o extrato aquoso do chá-verde
que foi feito usando o extrato seco padronizado da Camellia sinensis dissolvido em
água destilada de acordo com as doses utilizadas, o extrato era preparado
diariamente para o tratamento dos animais. Foram utilizadas as doses de 25 e 50
mg/kg preparadas a partir de uma solução aquosa de 5 mg/ml.
3.6 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DA DOENÇA DE PARKINSON
O extrato aquoso de CV, as catequinas, EC e EGCG e a L-DOPA sozinha ou
associada com CV foram administradas por via oral uma hora antes e uma hora
depois da injeção estereotáxica intraestriatal de 6-OHDA e por 14 dias seguidos
após a cirurgia. Nos grupos que foram utilizadas associações de duas ou mais
84
drogas, o tratamento ocorreu simultanemante. Os grupos e protocolo experimental
no podem ser vistos na Figura 13 e Quadro 4, respectivamente.
Figura 13 - Representação do protocolo experimental utilizado para avaliação do efeito do CV e catequinas na doença de Parkinson induzida por 6-OHDA
85
Quadro 4 - Protocolo de tratamento experimental
GRUPOS TRATAMENTO
1 Falso operado (injeção estriatal estereotáxica de água destilada + água
destilada, v.o) – 6-8 animais
2 Controle Lesão (6-OHDA+ água destilada, v.o.) – 6-8 animais
3 CV 25 mg/kg (6-OHDA + CV 25 mg/kg v.o) – 6-8 animais
4 CV 50 mg/kg (6-OHDA + CV 50 mg/kg v.o) – 6-8 animais
5 Epicatequina (EC) 10 mg/kg (6-OHDA + EC 10 mg/kg v.o) – 6-8 animais
6 Epigalocatequina 3-galato (EGCG) (6-OHDA + EGCG 10 mg/kg v.o) – 6-8
animais
7 CV 25 mg/kg associado com L-DOPA 25 mg/kg (6-OHDA + CV 25 mg/kg + L-
DOPA 25mg/kg v.o) – 6-8 animais
8 L-DOPA 50mg/kg (6-OHDA + L-DOPA 50 mg/kg v.o) – 6-8 animais
9 L-DOPA 25 mg/kg (6-OHDA + L-DOPA 25 mg/kg, v.o) – 6-8 animais
86
3.7 MODELO EXPERIMENTAL DE DOENÇA DE PARKINSON INDUZIDA POR 6-
OHDA
Os animais foram anestesiados com uma mistura de cloridrato de xilazina (15
mg/kg, i.p) e quetamina (75mg/kg, i.p) sendo então submetidos à tricotomia da área
superior da cabeça e posteriormente fixados ao aparelho estereotáxico (Figura 14).
Duas coordenadas de acesso ao corpo estriado foram marcadas a partir do bregma
de acordo com o atlas de Paxinos e Watson (1986). O modelo experimental de lesão
do corpo estriado foi proposto por Ungerstedt (1968). Foram feitas perfurações nos
crânios dos animais com uma broca de baixa rotação (Dremel), permitindo entrada
da seringa Hamilton com a 6-OHDA diretamente no corpo estriado. As lesões foram
feitas unilateralmente, apenas no hemisfério direito dos animais. Os animais
receberam duas microinjeções de 6-OHDA na dose de 12 µg/µL (contendo 12μg de
6-OHDA em 1μl de uma solução dissolvida em salina 0,9% contendo 0,2% de ácido
ascórbico) em cada sítio através da seringa de Hamilton de 5μl, perfazendo um total
de 24 µg/ 2µL. Os sítios onde a lesão foi realizada situavam-se nas coordenadas
descritas na Tabela 2. Após as injeções, os animais tiveram sua pele suturada com
fio cirúrgico de algodão e desinfectada com povidine (KIM et al., 1998). Os animais
falso-operados foram submetidos a todos os procedimentos cirúrgicos, exceto que
no lugar da solução contendo 6-OHDA foi injetada água destilada.
87
Tabela 2 - Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA
Coordenadas estriatais 1º ponto 2º ponto
ANTERO POSTERIOR (AP) +0,5 -0,5
MEDIO-LATERAL (ML) -2,5 -3,7
DORSO-VENTRAL (DV) -5 -6,5
Fonte: Paxinos e Watson (1986).
Figura 14 - Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas expostas
A B
Fonte: MENEZES, 2011
88
3.8 TESTE ROTACIONAL COM APOMORFINA
A apormorfina é um agonista direto dos receptores dopaminérgicos e sua
administração em animais com lesão unilateral com 6-OHDA induz a rotações
contralaterais a lesão (UNGERSTEDT; ARBUTHNOTT, 1970). Sua ação ocorre nos
receptores dopaminérgicos D2 supersensibilizados no lado lesado. Esta avaliação
foi realizada duas semanas após a lesão com 6-OHDA através do monitoramento do
número de rotações completas em volta do próprio eixo durante 60 minutos após 30
min da aplicação de apomorfina (1 mg/kg, i.p) (KIM et al., 1998).
Os animais previamente submetidos à lesão estriatal de 6-OHDA e ao
tratamento oral de 14 dias com o CV (25, 50, 100 ou 200 mg/kg), catequinas (EC ou
EGCG 10 mg/kg), L-DOPA ( 25 ou 50 mg/kg), CV 25 + L-DOPA 25, foram, no
décimo quarto dia após a cirurgia, tratados por gavagem 60 minutos antes do início
do teste da apomorfina. Os animais do grupo falso-operado e lesão 6-OHDA foram
administrados com água destilada, para o mesmo período de tempo. Estes dados
são obtidos de maneira simples, barata, não exige treinamento do animal e nem
interação deste com o pesquisador. Esse teste tem sido amplamente utilizado e
todas as drogas atualmente empregadas no tratamento sintomático da doença de
Parkinson foram primeiramente estudadas na sua capacidade de induzir rotações
(FUKUZAKI; KAMENOSONO; NAGATA, 2000).
3.9 TESTE DO CAMPO ABERTO
Os animais previamente submetidos à lesão estriatal de 6-OHDA e ao
tratamento oral de 14 dias com o CV (nas doses de 25, 50,100 ou 200 mg/kg),
catequinas (EC ou EGCG 10 mg/kg), L-DOPA (25 ou 50 mg/kg), CV 25 + L-DOPA
25, foram, no décimo quarto dia após a cirurgia, tratados por gavagem 60 minutos
antes do início do teste do campo aberto. Os animais do grupo falso-operado e lesão
6-OHDA foram administrados com água destilada, para o mesmo período de tempo
Os animais foram colocados no centro do aparato que consiste em um quadrado
(72cm x 72cm x 36 cm) dividido em 4 quadrantes, sendo então observados durante
5 minutos o número de segmentos invadidos ou número de cruzamentos
(movimentação espontânea). Após o fim do teste com cada animal, o aparelho foi
89
lavado com solução de álcool a 5% a fim de evitar possíveis influências de odor
deixado pelo sujeito experimental anterior (MONTGOMERY; MONKMAN, 1955;
FRUSSA-FILHO, 2010; PALERMO NETO; DE OLIVEIRA MASSOCO;
ROBESPIERRE DE SOUZA, 1990).
3.10 TESTE DA BARRA GIRATÓRIA ROTA ROD
O rota-rod consiste numa barra que gira numa velocidade de 12 rpm e que
permite verificar o potencial de uma substância promover incoordenação motora,
seja por sedação e/ou relaxamento (ROSLAND, HUNSKAAR, HOLE, 1990). Os
animais previamente submetidos à lesão estriatal de 6-OHDA e ao tratamento oral
de 14 dias com o CV (25 ou 50 mg/kg), catequinas (EC ou EGCG 10 mg/kg), L-
DOPA ( 25 ou 50 mg/kg), CV 25 + L-DOPA 25, foram, no décimo quarto dia após a
cirurgia, tratados por gavagem 60 minutos antes do início do teste do rota rod. Os
animais do grupo falso-operado e lesão 6-OHDA foram administrados com água
destilada, para o mesmo período de tempo Neste teste foi contabilizado o número de
vezes que o animal caiu da barra giratória e o tempo de permanência do animal no
aparelho no tempo de 60 segundos (DALLMEIER; CARLINI, 1981).
90
Figura 15 - Ilustração do aparelho do Rota Rod
Fonte: Corrado Equipamentos Biológicos [s.d.].
91
3.11 TESTE DO NADO FORÇADO
Este modelo experimental é utilizado para avaliar comportamento depressivo
em animais submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA. Neste teste, roedores foram
submetidos a um período de nado forçado, uma situação inescapável de estresse
como o objetivo de identificar se os animais estavam em estado depressivo. Os
animais previamente submetidos à lesão estriatal de 6-OHDA e ao tratamento oral
de 14 dias com o CV (25 ou 50 mg/kg), catequinas (EC ou EGCG 10 mg/kg), L-
DOPA (25 ou 50 mg/kg), CV 25 + L-DOPA 25, foram, no décimo quarto dia após a
cirurgia, tratados por gavagem 60 minutos antes do início do teste do nado forçado.
Os animais do grupo falso-operado e lesão 6-OHDA foram administrados com água
destilada, para o mesmo período de tempo Eles foram colocados em um cilindro de
acrílico (40cm de altura e 20cm de diâmetro), contendo 20 cm de água por 5 minutos
(Figura 16). O tempo de imobilização (apenas com pequenos movimentos que os
impediam de submergir), natação e escalada foi registrado por 5 minutos (PORSOLT
et al., 1978).
92
Figura 16 - Cilindro de acrílico utilizado para realização do teste do nado forçado
Fonte: Kouzmine (2004).
93
3.12 LABIRINTO AQUÁTICO
Este teste avalia a capacidade do animal para a aquisição de memória
espacial, ao mensurar a latência para que o animal localize uma plataforma
submersa em um tanque com água opaca (MORRIS et al., 1982).
Os animais previamente submetidos à lesão estriatal de 6-OHDA e ao
tratamento oral de 14 dias com o CV (25 ou 50 mg/kg), catequinas (EC ou EGCG 10
mg/kg), L-DOPA (25 ou 50 mg/kg), CV 25 + L-DOPA 25, foram, no décimo quarto dia
após a cirurgia, tratados por gavagem 60 minutos antes do início dos testes de
memória operacional no labirinto aquático. Os animais do grupo falso-operado e
lesão 6-OHDA foram administrados com água destilada, para o mesmo período de
tempo. O labirinto aquático é um tanque com 70 cm de profundidade e 170 cm de
diâmetro. Este tanque foi dividido imaginariamente em quatro quadrantes que
passavam pelos pontos cardinais: norte, sul, leste e oeste, conforme representado
na Figura 17. No centro de um destes quadrantes foi colocada uma plataforma de
acrílico transparente com 11 cm de largura por 14 cm de comprimento, submersa
dois cm em relação à superfície da água e na sala onde estava localizado o labirinto
aquático foram colocadas marcações visuais nas paredes para auxiliar o rato a
localizar a plataforma em cada dia de treino. Nestes ensaios, os animais foram
colocados na piscina, virados para a parede, e tiveram um tempo máximo de 54s
para encontrar a plataforma submersa. Após encontrar a plataforma os animais
permaneciam na plataforma por 10s. Animais que não encontraram a plataforma no
final de 54s foram colocados sobre a mesma por 10s. Após este tempo, o animal foi
removido da piscina durante 30 s, e o procedimento foi repetido (6 vezes para cada
animal). Foi analisado o tempo que os animais levaram para encontrar a plataforma
em um período de 5 minutos. O procedimento foi repetido de novo após 24 h (pré-
teste). Após 48 horas do pré-teste, o procedimento foi repetido uma vez mais para a
avaliação do tempo necessário para que o animal se encontrar a plataforma, isto se
correlaciona com a capacidade de aprendizagem espacial memória do animal.
94
Figura 17 - Labirinto aquático com plataforma submersa.
Fonte: Kouzmine (2004).
95
3.13 DISSECAÇÃO DAS ÁREAS CEREBRAIS
Os animais foram decapitados com uma guilhotina (Harvard, USA) depois dos
testes comportamentais 14 dias após a cirurgia estereotáxica. Os encéfalos foram
retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com
gelo. Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi
liberada das leptomeninges com uma pinça reta de microdissecação que divulsionou
o córtex delicadamente, expondo o corpo estriado que foi retirado, foram retirados o
estriado direito e esquerdo de cada animal. Após pesados, os estriados foram
guardados no freezer a -20ºC ou colocados em formol tamponado e posteriormente
álcool a 70% para o estudo histológico ou foram preparados os homogenatos a 10%
para as analises neuroquímicas e antioxidantes. Um corte coronal no nível do
hipocampo (CA1, CA3, CT, giro e hilo) e corpo estriado também foi realizado para
posterior análise histológica e imunohistoquímica.
3.14 DETERMINAÇÃO DE DOPAMINA E METABOLITOS ATRAVÉS DO HPLC
Para a determinação dos níveis de catecolaminas foi utilizado o equipamento
High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Na cromatografia líquida
clássica, um adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído
por um líquido ideal (fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na
coluna, e é carregada através da mesma por um líquido eluente. Se um composto
da mistura (soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da fase sólida
estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto que
seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se
existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a
condutância do eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos
solutos. Para ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos,
e no segundo caso, os solutos devem ter a característica de serem relativamente
fáceis de se oxidar ou reduzir.
Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou
oxidação de solutos são chamados detectores amperimétricos ou coulométricos.
Neste estudo, foi utilizado o tipo amperimétrico que reage com uma quantidade
muito menos de soluto, em torno de 1%. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem
96
a aplicação de um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo),
oxidação da substância que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo,
seguindo a amplificação e medida da corrente produzida. As catecolaminas são
oxidadas nos grupos de anel hidroxil para produzir um derivado ortoquinona com a
liberação de dois elétrons (AGUIAR, 2009).
Os níveis cerebrais de dopamina e metabolitos (DOPAC e HVA) foram
analisados em homogenatos do estriado direito e esquerdo de cada animal a 10%
preparados em tampão fosfato de sódio (150nm; pH 7,4) 2 semanas após a injeção
estereotáxica de 6-OHDA. Para a determinação da dopamina e seus metabólitos foi
utilizado um equipamento de HPLC (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japão) com
detecção amper (Shim-Pak CLC- ODS, 25cm). A fase móvel foi preparada com
ácido cítrico monohidratado 150mM, octil sulfato de sódio 67mM, tetrahidrofurano
2%, acetonitrila 4%, preparados em água deionizada. O pH da fase móvel foi
ajustado para 3,0 utilizando NaOH 10mM. A quantificação dos picos obtidos será
realizada com o auxílio de uma curva padrão. Valores absolutos foram corrigidos
quanto à recuperação das cânulas e expressões de variações com relação aos
valores basais (BELLÍSSIMO et al., 2004). Foram utilizados padrões numa
concentração final de 4μg/ml e a partir da altura ou área dos picos padrões as
amostras foram processadas no programa Prisma® 5.0 e os resultados expressos
em ng/g de tecido.
3.15 HISTOQUÍMICA VIOLETA DE CRESIL (COLORAÇÃO DE NISSL)
A coloração de Nissl é uma das técnicas mais utilizadas para investigação do
sistema nervoso. Ela permite a evidenciação da substância de Nissl, material
granular constituído por DNA ribossomal, o qual se concentra principalmente no
nucléolo, possibilitando a discriminação desta estrutura celular específica
(BITTENCOURT, 2007).
Cortes de hipocampo de animais dos grupos (Lesão 6-OHDA; CV 25 e 50; CV
25+L-DOPA 25; EGCG) foram fixados em formalina e montados em um bloco de
parafina para preparar fatias de 10 μm. Posteriormente foram feitas lâminas que
foram mergulhadas em água destilada durante 1 (um) minuto para posterior
incubação na solução de violeta de cresil 0,5% em ácido acético, por um período de
3 (três) minutos. Em seguida, as lâminas foram desidratadas em álcool (50, 70 e
97
100%), diafanizadas e montadas em meio à base de xilol (Entelan®), e
posteriormente examinadas.
3.16 IMUNOHISTOQUÍMICA PARA INOS, COX-2 E TIROSINA HIDROXILASE (TH)
Os animais foram sacrificados por decapitação 14 dias após a injeção
estereotáxica de 6-OHDA e feitos cortes do estriado (para TH e COX-2) ou
hipocampo (para iNOS) para confecção das lâminas.
Todo o material selecionado foi inicialmente fixado em formol a 10% durante
24h, seguido por uma solução de álcool a 70% e,posteriormente, emblocado em
parafina, sendo feitos cortes histológicos de 5 µm de espessura colocados sobre
lâminas de vidro própria para imunohistoquimica. Foram feitas três lâminas de três
animais diferentes para cada grupo. Para iniciar o processo, as laminas contendo os
cortes histológicos foram deixados em estufa histológica a 58ºC por 10 minutos, em
seguida o protocolo seguiu as etapas abaixo:
a) desparafinazação em xilol e reidratação em uma série de álcool de
concentrações diferentes até a água e lavados duas vezes em águas
destiladas por cinco minutos cada;
b) recuperação antigênica com Tampão citrato pH 6.0 no microondas em
potencia máxima por 10 minutos, com intervalo na metade no período;
c) bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 0,3%;
d) incubação com anticorpos respectivos, diluídos em BSA overnight.
(Anticorpo Anti-TH na diluição 1:100; Anti-COX-2 na diluição 1:200 e o
Anti-iNOS na diluição1:200);
e) no dia seguinte após a retirada do anticorpo primário;
f) os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 2 horas;
g) em seguida foi feita a incubação com o Complexo Avidina-Biotina do kit
DAKO por 30 minutos;
h) para revelação foi utilizada a solução cromógena de diaminobenzidina do
mesmo kit, diluída em TRIS-HCL adicionada de peróxido de hidrogênio 20
volumes em câmara escura;
i) finalizando o processo, fez-se a desidratação em álcool e a diafanização
em xilol para montagem da lamínula com Entelan e analise utilizando o
Microscópio Óptico BX-41 com câmera acoplada.
98
Os dados imunohistoquímicos (fotomicrografias) foram quantificados através
do software Image J (National Institute of Health, USA). Posteriormente, esses
dados foram analisados através do Graph Pad Prism 5.0.
3.17 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO PADRONIZADO
DO CHÁ-VERDE (CV)
3.17.1 Determinação da peroxidação lipídica (TBARS)
O grau de lipoperoxidação nas áreas cerebrais foi medido através da
determinação dos níveis de substancias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS),
conforme o método de Draper e Hadley (1990), seguindo o protocolo a seguir.
Foram preparados homogenatos das áreas cerebrais dos animais tratados
com os respectivos grupos (Falso operado, lesão 6-OHDA, CV 25, CV 50, CV 25 +
L-DOPA 25, Epicatequina, Epigalocatequina 3-galato, L-DOPA 50 ou 25) a 10% em
solução de cloreto de potássio (KCl) 1,15 %. 0,25 mL do homogeneizado foi
misturado a 1 mL de solução de ácido tricloroacético a 10% e acrescido de 1 mL de
solução de ácido tiobarbitúrico 0,6%. Após a agitação, essa mistura foi mantida em
um banho de água fervente (95-100°C) por 15 min., adicionado o n-butanol (2:1 v/v),
a seguir foi resfriada em banho de gelo por alguns minutos e posteriormente
centrifugada (800xg, 5 min). O conteúdo de TBARS foi determinado em
espectrofotômetro a 535 nm. Os resultados foram expressos em micromol de
malonildialdeído (MDA) por g de tecido.
3.17.2 Determinação do conteúdo de nitrito
Antes da dosagem de nitrito no estriado foi feito uma curva padrão da
seguinte forma: Foram pesados 7mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água
destilada (estoque-10mM) foi feita as diluições em série (10 e 20x), ficando 1mM,
100µM, 10µM, 5µM, 2,5µM, 1,25µM, 0,625µM, 0,312µM. Foi feita uma equação da
reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN et al., 1981).
Posteriormente, foram preparados homogenatos do estriado dos animais
tratados com os respectivos grupos (Falso operado, lesão 6-OHDA, CV 25, CV 50,
CV 25 + L-DOPA 25, Epicatequina, Epigalocatequina 3-galato, L-DOPA 50 ou 25) a
99
10% (w/v) em solução de KCl 1,15 %. Após a centrifugação (800xg, 10 min) os
sobrenadantes foram coletados e a produção de NO determinada através da reação
de Griess. Uma alíquota de 100 μl do sobrenadante foi incubada com 100 μl do
reagente de Griess [sulfanilamida 1 % em H3PO4 1 %/N-(-1-naphthyl)-
ethylenediamine 0,1 %/ H3PO4 1 % / diluído em água (1:1:1:1)] a temperatura
ambiente por 10 minutos. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a 550nm.
A concentração de nitrito (μmol/g tecido) foi determinada a partir de uma curva
padrão de NaNO2.
3.17.3 Avaliação do potencial antioxidante do extrato seco de C. sinensis (chá
verde) em neutrófilo humano por Quimioluminescência (QL)
Neutrófilos humano (5 x 106 células/mL) foram incubados durante 20 minutos
a 37°C com extrato seco da Camellia sinensis (Chá-verde, CV) em diferentes
concentrações de 0,1 a 100μg/mL e a sonda quimioluminescentes luminol (280 µM).
Em seguida, os tubos foram transportados para o luminômetro e a eles foi
adicionado o estímulo (Forbol-miristato-acetato, PMA 10 -7 M) e, imediatamente,
acompanhou-se a produção de QL, em cpm (contagem de fótons por minuto),
durante 20 minutos a 37°C. Em todos os ensaios realizados foi mensurada a
produção espontânea de QL por neutrófilos na ausência de estímulo. A quercetina
(50 μg/mL), flavonol, foi utilizada como droga padrão (LI; ZHU; TRUSH, 1999; VAN
DYKE; CASTRANOV, 1987).
3.18 PROTOCOLO EXPERIMENTAL DOS TESTES INFLAMAÇÃO E
NOCICEPÇÃO
Os animais utilizados nos testes de avaliação da atividade anti-inflamatória e
antinociceptiva receberam uma aplicação única do extrato padronizado do CV (nas
doses de 10, 25 ou 50mg/kg, v.o) uma hora antes do início dos experimentos, nestes
experimentos foram, ainda, utilizados grupos de animais com associação do chá-
verde de 10 mg/kg com Morfina ou Indometacina ou Dexametasona com objetivo de
observar se o CV potencializava o efeito antinociceptivo/ antiinflamatório destes
fármacos. Os animais do grupo controle receberam administração oral de água
destilada (veículo).
100
3.19 TESTES DE ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
3.19.1 Edema de pata induzido por carragenina
O edema de pata foi induzido pela injeção de 0,1 mL de carragenina (1% p/v)
em salina e administrada na área subplantar da pata direita traseira de ratos
(WINTER; RISLEY; NUSS, 1962). Uma hora antes da injeção de carragenina foram
feitos os tratamentos por via oral com o CV (em diferentes doses 10, 25 ou
50mg/kg), Indometacina (2 ou 10 mg/kg), controle positivo, e com administração de
CV 10 mg/kg associado com Indometacina 2 mg/kg. A medida do edema foi feita
pela diferença entre o volume deslocado da pata direita nos momentos 1, 2, 3, 4 e
24 horas após a carragenina e antes da aplicação da mesma, esse volume foi
registrado através de um Pletismógrafo.
3.19.2 Edema de pata induzido por dextrano
Ratos Wistar machos divididos em 7 grupos de animais foram tratados por via
oral com veículo (água destilada), com o extrato padronizado do chá-verde (CV) nas
doses de 10, 25 ou 50mg/kg, com Dexametasona (2 ou 10 mg/kg, controle positivo)
e com a associação de CV 10 mg/kg com Dexametasona de 2 mg/kg. Após 60
minutos destes tratamentos, os animais receberam uma injeção intraplantar de
dextrano 0,15% (20 µL) para indução do edema na pata direita traseira. Foi
registrado o volume da pata antes e nos tempos de 30 min, 60 min, 120 min, 180
min e 240 min após a administração de dextrano (WINTER; RISLEY; NUSS, 1962).
O volume do edema em mililitros (mL) foi registrado através de um
Pletismógrafo e os resultados foram expressos como a diferença do volume da pata
após a aplicação de dextrano nos tempos observados (30 min, 60 min, 120 min, 180
min e 240 min) e o volume da pata no chamado tempo zero (antes da injeção
intraplantar de dextrano).
3.19.3 Teste de Hiperalgesia térmica de Hargreaves
101
O teste de Hargreaves foi descrito 1988 e consiste no aquecimento, por meio
de uma fonte radiante de luz infravermelha, da região central da planta da pata
traseira de ratos. O comportamento nociceptivo é avaliado como a sensibilidade ao
calor (hipernocicepção térmica), determinada pela latência de retirada da pata do
raio de luz (HARGREAVES et al., 1988). Os animais foram tratados por via oral com
o veículo (água destilada), com o extrato padronizado do chá verde (na dose de 10
mg/kg), com a indometacina (10 ou 2 mg/kg) e com a associação de CV 10 com
Indometacina 2 mg/kg uma hora antes da injeção intraplantar de carragenina. Uma
hora após a aplicação de carragenina os animais foram submetidos ao teste. Foi
também avaliado neste teste um grupo normal que não recebeu aplicação de
carragenina nem tratamento. Foi quantificada a latência para retirada da pata após
acionado o infravermelho juntamente com o sistema contador de tempo, que cessa
com a resposta de retirada de pata.
3.19.4 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Camundongos Swiss machos, com peso de 24-32g, divididos em grupos de
animais, foram tratados oralmente com veículo (água destilada), CV (nas doses 5,
10, 25 ou 50 mg/kg), com Indometacina (2 ou 10 mg/kg, controle positivo) e com
associação de CV 10 mg/kg com Indometacina 2 mg/kg. 60 minutos após os
tratamentos, os animais receberam uma injeção intraperitonial (i.p.) de ácido acético
0,6% (10mL/Kg). Após decorridos 10 minutos da administração do ácido acético, o
número de contorções abdominais foi registrado, para cada animal, durante um
período de 20 minutos. Uma contorção foi identificada como uma extensão das
patas traseiras, acompanhada de constrição do abdômen (KOSTER et al., 1959).
3.19.5 Teste da formalina
Camundongos Swiss machos, com peso de 24-32g, foram tratados com
veículo (água destilada,v.o), com CV (nas doses de 5,10,25 ou 50 mg/kg, v.o), com
Morfina (nas doses de 2, 4, ou 7,5 mg/kg, i.p., controle positivo) e com Morfina 2
mg/kg (i.p) associado com CV 10mg/kg. Também foram utilizados grupos com
Naloxona sozinha, Naloxona associada com Morfina 7,5 mg/kg ou com CV 10.
Nesses grupos os tratamentos com Naloxona (5 mg/kg, i.p) foi feito previamente 30
102
min antes da administração de Morfina e CV. Os tratamentos por via intraperitoneal
foram realizados 30 mina antes da aplicação de formalina e por via oral 60 min antes
da formalina. Após 30 minutos (i.p.) ou 60 minutos (v.o.) da administração das
drogas, os animais receberam uma injeção intraplantar de formalina 1% na pata
direita traseira (20µL). O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos,
de 0-5 min (1a Fase) e 20-25 min (2a. Fase) após a administração da formalina
(HUNSKAAR; HOLE, 1987).
3.19.6 Teste da placa quente
Camundongos Swiss machos, com peso de 24-32g, divididos em 8 grupos,
foram pré-selecionados pela passagem individual na placa quente mantida a uma
temperatura de 51 ± 0,5ºC. Aqueles que mostraram tempo de reação superior a 20
segundos foram descartados. Os camundongos selecionados foram postos na placa
quente e tiveram o tempo de reação (saltar ou lamber as patas) registrado antes e
30 (para os grupos que receberam morfina) ou 60 (para os demais grupos) min após
a administração de CV (nas doses de 5,10, 25 ou 50mg/Kg, v.o) ou morfina (2 ou 4
mg/Kg, i.p) ou veículo (água destilada, v.o) ou associação de Morfina 2 mg/kg (i.p)
com CV 10 mg/kg (v.o) (EDDY; LEIMBACH, 1953).
3.20 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M).
Para comparação múltipla dos parâmetros foi utilizado One-way ANOVA utilizando o
teste de Student-Newman-Keuls ou teste de Tukey como post hoc. Em todas as
análises, foi considerado estatisticamente significante valores de p< 0,05. Para
realização da análise estatística foi utilizado o programa Graph Pad Prism 5.0.
103
RESULTADOS
Testes Comportamentais
104
4 RESULTADOS: TESTES COMPORTAMENTAIS
4.1. DETERMINAÇÃO DO COMPORTAMENTO ROTACIONAL INDUZIDO POR
APOMORFINA EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL POR 6-OHDA TRATADOS
COM EPICATEQUINA (EC), EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO (EGCG) E COM O
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV) SOZINHO OU ASSOCIADO
COM L-DOPA
Para avaliar o comportamento rotacional de animais que sofreram lesão
estriatal pela 6-OHDA realizou-se o teste padrão que utiliza a apomorfina, um
agonista dopaminérgico, que induz rotações de 360° para o lado contralateral da
lesão. Duas semanas após a injeção intraestriatal de 6-OHDA foi administrada
apomofina (3 mg/kg, i.p.) e os animais exibiram comportamento rotacional na
direção oposta ao lado da lesão (rotação contralateral). Um aumento significativo no
número de rotações induzidas por apomorfina foi observado nos animais controles
lesionados com 6-OHDA (224.40 ± 38.33 rotações/hora) quando comparado ao
grupo falso operado (controle negativo) (3.0 ± 1.43 rotações/h). (Tabela 3)
Uma recuperação motora parcial foi observada nos animais lesionados com
6-OHDA e tratados com CV nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg v.o, onde houve uma
redução significativa do número de rotações induzidas por apomorfina em 55.9, 51 e
49,4%, respectivamente, quando comparados com o grupo controle lesionado com
6-OHDA. A dose do CV de 25 mg/kg não apresentou redução significativa das
rotações. Portanto, a dose de CV de 50 mg/kg foi mais efetiva na redução das
rotações induzidas por apomorfina e não houve diferença significativa entre as
diferentes doses de chá-verde testadas, não havendo, neste teste, dose
dependência (Figura 18).
O número de rotações por hora diminuiu, significativamente, em 63% nos
grupos lesionados com 6-OHDA e tratados com associação de CV 25 mg/kg e L-
DOPA 25mg/kg em relação ao grupo controle lesão. Já o grupo que recebeu apenas
L-DOPA 25 mg/kg teve uma redução de apenas 32,17% em relação ao grupo lesão
6-OHDA. A analise estatística demonstrou que o grupo que recebeu a associação de
CV 25 com L-DOPA 25 teve um efeito sinérgico ao potencializar a redução do
comportamento rotacional induzido por apomorfina em comparação com o grupo
que recebeu apenas a L-DOPA 25. Os resultados demonstraram ainda que os
105
animais do grupo tratado apenas com L-DOPA 50 tiveram uma redução significativa
(49.3%) nas rotações induzidas por apomorfina em relação ao grupo controle lesão
6-OHDA (Figura 19 e Tabela 3).
O tratamento com as catequinas do chá-verde, EC e EGCG na dose de 10
mg/kg,v.o, reduziu significativamente o número de rotações induzidas por
apomorfina em torno de 64.5 e 57.6 %, respectivamente, quando comparados com o
grupo controle lesionado com 6-OHDA e não houve diferença significativa entre os
grupos tratados com EC e EGCG (Tabela 3 e Figura 20).
106
Figura 18 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg, i.p.) durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com extrato padronizado do chá-verde (25, 50, 100 e 200 mg/kg, v.o.). Os resultados são
apresentados como médias ± EPM de 6 a 8 animais por grupo. O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada. a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls como teste post hoc).
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
6-OHDA +
CV 1
00
6-OHDA +
CV 2
00
0
100
200
300
ababab
a
a
Nu
mero
de r
ota
çõ
es/6
0 m
in
107
Figura 19 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg, i.p.) durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com
extrato padronizado do chá-verde na dose de 25 mg/kg v.o. associado com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA nas doses de 50 e 25 mg/kg,v.o. Os resultados são
apresentados como médias ± EPM de 6 a 8 animais por grupo. Sendo considerado a vs Falso Operado, b vs 6-OHDA e c vs L-DOPA 25, com p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu
administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V25+L
-DOPA 2
5
6+OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA +
L-DOPA
50
0
100
200
300
abc
ab
ab
a
Nu
mero
de r
ota
çõ
es/6
0 m
in
108
Figura 20 - Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg, i.p.) durante 60 min em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). Os resultados são apresentados como médias ± EPM de 6 a 8 animais por grupo. Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu
administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada
Falso
oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA +
EC 1
0
6-O
HDA +
EG
CG
10
0
100
200
300
ab
Nu
mero
de r
ota
çõ
es/6
0 m
in
a
ab
109
Tabela 3 - Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV 25, 50, 100 e 200 mg/kg), da associação de CV com L-DOPA, da epicatequina (EC) e epigalocatequina 3-galato
(EGCG) e da L-DOPA (25 e 50 mg/kg) no comportamento rotacional induzido por apomorfina em ratos após lesão estriatal induzida por 6-OHDA
GRUPOS
ROTAÇÕES/HORA
% REDUÇÃO DAS
ROTAÇÕES
FALSO OPERADO
3.0 ± 1.4
-
CONTROLE (6-OHDA) 224.4 ± 38.3a -
6-OHDA+ CV 25 179.4 ± 21.6a -
6-OHDA+ CV 50 98.8 ± 21.8ab 55,9
6-OHDA+ CV 100 109.9 ± 35.7ab 51,0
6-OHDA+ CV 200 113.6 ± 8.2ab 49,4
6-OHDA+ CV 25 + LDOPA
25
83.0 ± 10.8abc
64,5
6-OHDA+ EC 10 79.6 ± 10.4 ab 57,6
6-OHDA+ EGCG 10 95.1 ± 15.5 ab 63,0
6-OHDA+ L-DOPA 50 113.8 ± 17.8 ab 49,3
6-OHDA+ L-DOPA 25 152.2 ± 15.5 ab 32,1
O número de rotações contralaterais completas foi determinado durante 60
minutos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais
por experimentos (6-8). a vs Falso operado, b vs Controle (6-OHDA) com p<0,05 e c
vs L-DOPA 25 mg/kg, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como
teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-
OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta
neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
110
4.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA ATRAVÉS DO TESTE DO
CAMPO ABERTO EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL TRATADOS COM
EPICATEQUINA, EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO, EXTRATO PADRONIZADO
DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO COM L-DOPA
A lesão estriatal por 6-OHDA pode ocasionar alterações na atividade
locomotora dos ratos, que pode ser verificada no teste do campo aberto. Então, 14
dias após a lesão estriatal com a 6-OHDA foi realizado o teste de campo aberto que
avaliou a atividade locomotora dos animais através da observação dos
comportamentos de cruzamento do quadrante do campo aberto “crossing”
Os animais lesionados (Controle lesão 6-OHDA) tiveram uma diminuição
significativa no número de cruzamentos de quadrante quando comparados com o
grupo falso operado, confirmando que a lesão estriatal promoveu prejuízo na
atividade locomotora dos animais. O tratamento oral com CV nas doses de 50, 100 e
200 mg/kg protegeu de maneira significativa (p<0,05) os animais deste déficit. Não
houve dose dependência entre os grupos tratados com CV nas doses de 50, 100 e
200 mg/kg, e o CV na dose de 25 mg/kg não aumentou de forma significativa o
número de cruzamentos (Figura 21). Os animais tratados com a droga de referência
no tratamento da DP, a Levodopa, nas doses de 25 e 50 mg/kg, aumentaram
significativamente o número de cruzamento no quadrante quando comparados com
o grupo lesão 6-OHDA, indicando que a L-DOPA promoveu melhora da atividade
locomotora dos ratos (Figura 22).
Os animais que sofreram a lesão estriatal e foram tratados com as catequinas
(EC e EGCG) nas doses de 10 mg/kg tiveram um aumento significativo no número
de crossing em relação ao grupo lesionado não tratado (6-OHDA), bem como os
ratos tratados com associação de L-DOPA 25 mg/kg com CV 25mg/kg que também
tiveram um aumento significativo do número de cruzamentos. Estatisticamente, o CV
25 potencializou o efeito da L-DOPA 25, pois os animais deste grupo tiveram uma
melhora significativa na atividade locomotora quando comparado com os animais
que receberam apenas a L-DOPA 25 mg/kg (Figura 22 e Tabela 4).
111
Figura 21 - Efeitos do extrato padronizado do CV (nas doses de 25, 50, 100 e 200 mg/kg) na atividade locomotora avaliada no teste de campo aberto no modelo de DP
em ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
6-OHDA +
CV 1
00
6-OHDA +
CV 2
00
0
10
20
30
abab
ab
a
a
Nu
mero
de c
ruzam
en
tos/5
min
112
Figura 22 - Efeitos do extrato padronizado do CV (25 mg/kg) associado com L-DOPA (25 mg/kg) e da L-DOPA sozinha (nas doses 25 e 50 mg/kg) na atividade locomotora
avaliada no teste de campo aberto no modelo de DP em ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo
considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+C
V 25
+ L-D
OPA
25
6-O
HDA+L-D
OPA
25
6-O
HDA+L-D
OPA
50
0
10
20
30
ab
a
bc b
Nu
me
ro d
e c
ruzam
en
tos
/5 m
in
.
113
Figura 23 - Efeitos da epicatequina (EC, 10mg/kg, v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG, 10 mg/kg, v.o) na atividade locomotora avaliada no teste de campo aberto no modelo de DP em ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número
de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,001 e b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc).
O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso o
perado
6-OHDA
6-OHDA +
EC 1
0
6-OHDA+ E
GCG
10
0
10
20
30
b
b
Nu
mer
o d
e cr
uza
men
tos/
5 m
in
a
114
Tabela 4 - Efeitos das catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina
(EGCG,10 mg/kg,v.o), do extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25, 50,100 e 200 mg/kg, v.o.) sozinho ou associado com L-DOPA (25 mg/kg) e da L-DOPA sozinha (nas doses de 25 e 50 mg/kg,v.o) na atividade locomotora avaliada no teste de campo
aberto no modelo de DP em ratos
GRUPOS
NÚMERO DE CRUZAMENTOS NO
QUADRANTE
FALSO OPERADO
22,29 ± 1,74
CONTROLE (6-OHDA) 7,87 ± 0,95a
6-OHDA+ CV 25 11,13 ± 0,74a
6-OHDA+ CV 50 14,71 ± 1,78ab
6-OHDA+ CV 100 17,13 ± 1,40ab
6-OHDA+ CV 200 13,25 ± 2,12ab
6-OHDA+ CV 25 + LDOPA 25 19,83 ± 1,92bc
6-OHDA+ EC 10 19,5 ± 2,54b
6-OHDA+ EGCG 10 15,50 ± 2,54b
6-OHDA+ L-DOPA 50 20,67 ± 1,92b
6-OHDA+ L-DOPA 25 13,50 ± 1,60ab
Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA,
p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração
intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração
desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
115
4.3 EFEITO DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ VERDE NO TESTE DO
CAMPO ABERTO
Realizamos o teste do campo aberto após 60 min do tratamento oral com o
extrato padronizado do chá-verde nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg, com o objetivo
de analisar se o extrato padronizado do chá-verde causaria efeito inespecífico
(sedação, prejuízo da coordenação motora) nos ratos que prejudicasse a avaliação
da resposta nociceptiva. Neste teste, o CV nas doses testadas não alterou o número
de cruzamentos dos animais em relação aos animais que receberam apenas água
destilada, portanto, o extrato padronizado do CV não causou efeito sedativo nem
prejuízos da coordenação motora, não interferindo na avaliação da atividade
antinociceptiva feita neste trabalho.
4.4 EFEITOS DAS CATEQUINAS, EPICATEQUINA E EPIGALOCATEQUINA, DO
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO COM
L-DOPA NO TESTE DO NADO FORÇADO
O teste do nado forçado é utilizado para avaliação do comportamento
depressivo dos animais. Sabe-se que pacientes com DP podem apresentar
depressão que é o sintoma neuropsiquiátrico mais comum entre esses pacientes e
que animais submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA podem apresentar este tipo de
comportamento no teste do nado forçado. Neste teste e nos próximos utilizamos o
CV apenas nas doses de 25 e 50 mg/kg, pois escolhemos dar prosseguimento a
pesquisa utilizando as doses mais baixas do CV que apresentaram efeito.
Os resultados indicaram que os ratos lesionados com 6-hidroxidopamina
apresentaram uma redução do tempo de natação e de escalada e um aumento no
tempo de imobilidade no teste do nado forçado, sugerindo um efeito tipo anedônico
– depressivo. Nas Figuras 24, 25 e 25 e na Tabela 5 são mostradas as durações do
comportamento de escalar. A análise estatística mostrou que os tratamentos com
CV 25 e 50, EC e EGCG 10, L-DOPA 50 e associação de CV25 + L-DOPA 25
produziram uma melhora significativa na atividade de escalada em relação os ratos
lesionados com 6-OHDA e tratados com água destilada (controle 6-OHDA) que
tiveram um menor tempo de escalada quando comparados com o grupo falso
operado.
116
O comportamento de imobilidade no teste do nado forçado foi registrado nas
Figuras 26, 27 e 29 e na Tabela 5 em que se pode observar que os animais do
grupo lesão 6-OHDA tiveram um aumento significativo no tempo de imobilidade
quando comparados com o grupo falso operado, já o tratamento com a L-DOPA 50
mg/kg e com CV associado com L-DOPA 25 foram eficazes (p<0,05 vs controle
lesão) em diminuir o tempo de imobilidade dos animais lesionados com 6-OHDA. As
catequinas, EC e EGCG, também reduziram significantemente o tempo de
imobilidade quando comparados com grupo lesão (Figura 29).
Foi observado que o extrato padronizado do CV 25 potencializou o efeito da
L-DOPA 25 no teste do nado forçado nos parâmetros imobilidade e escalada
(Figuras 25 e 28).
Com relação ao parâmetro do tempo de natação no teste do nado forçado,
podemos observar na Figura 31 e 32 que os ratos do grupo lesão 6-OHDA tiveram
uma queda significante no tempo de natação dos ratos quando comparados com
grupo falso operado, e os tratamentos com L-DOPA 50, L-DOPA 25 + CV25, EC e
EGCG produziram um aumento significativo no tempo de natação dos ratos
lesionados.
Em nenhum dos três parâmetros analisados no teste do nado forçado
(escalada, natação e imobilidade) houve diferença significativa entre as doses de CV
25 e 50, nem entre os grupos tratados com as catequinas EC e EGCG.
117
Figura 24 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com
extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o.). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way
ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA
receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
0
10
20
30
40
50
b b
a
Tem
po
de e
scala
da/5
min
118
Figura 25 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com extrato padronizado do chá-verde na dose de 25mg/kg associado com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA sozinha nas doses de 50 e 25 mg/kg,v.o. Os resultados são
expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,001; b vs 6-OHDA, p<0,01 e c vs L-DOPA 25,
p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V 25
+ L-D
OPA 2
5
6-OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA+L
-DOPA 5
0
0
10
20
30
40
50
b
bc
a
Tem
po
de e
scala
da/5
min
119
Figura 26 - Tempo dispendido no comportamento de escalar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados
com as catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,001; b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O
grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso o
perado
6-OHDA
6-OHDA +
EC 1
0
6-OHDA+ E
GCG
10
0
10
20
30
40
50
b b
Tem
po d
e es
cala
da/5
min
a
120
Figura 27 - Tempo dispendido no comportamento de imobilidade em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com
extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o.). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,001; b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way
ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA
receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
0
50
100
150
b b
Tem
po
de I
mo
bil
idad
e/5
min
a
121
Figura 28 - Tempo dispendido no tempo de imobilidade em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com extrato
padronizado do chá-verde na dose de 25 associado com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA sozinha nas doses de 50 e 25 mg/kg,v.o. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs
Falso Operado, p<0,05; b vs 6-OHDA, p<0,01 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não
recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água
destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V 25
+ L-D
OPA 2
5
6-OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA+L
-DOPA 5
0
0
50
100
150
bcab
a
a
Tem
po
de I
mo
bil
idad
e/5
min
.
122
Figura 29 - Tempo dispendido no comportamento de imobilidade em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com as
catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais
por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,05; b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA +
EC 1
0
6-O
HDA+ E
GCG
10
0
50
100
150
abab
Tem
po
de Im
ob
ilid
ad
e/5
min a
123
Figura 30 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com
extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o.). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way
ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA
receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
0
20
40
60
ab
a
a
Tem
po
de N
ata
ção
/5 m
in
124
Figura 31 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com
extrato padronizado do chá-verde na dose de 25 associado com L-DOPA 25 mg/kg e com L-DOPA nas doses de 50 e 25 mg/kg. Os resultados são expressos como média ±
EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta
neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+C
V 25
+ L-D
OPA
25
6-O
HDA+L-D
OPA
25
6-O
HDA+L-D
OPA
50
0
20
40
60
a
ab
b
Tem
po
de N
ata
ção
/5 m
in
125
Figura 32 - Tempo dispendido no comportamento de nadar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com as
catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o). Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais
por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
opera
do
6-OHDA
6-OHDA +
EC 1
0
6-OHDA+ E
GCG
10
0
20
40
60
Tem
po
de N
ata
ção
/5 m
in
a
ab ab
126
Tabela 5 - Tempo dispendido no comportamento de nadar, flutuar e escalar em sessões de nado forçado durante 5 minutos em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA tratados com extrato padronizado do chá-verde, com associação de CV com L-DOPA, com epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o)
e com L-DOPA (25 e 50mg/kg).
GRUPOS
TEMPO DE
ESCALADA (s)
TEMPO DE
NATAÇÃO (s)
TEMPO DE
IMOBILIDADE
(s)
FALSO OPERADO
36,50 ± 5,14
51,33 ± 4,73
32,67 ± 1,05
CONTROLE (6-OHDA) 16,00 ± 1,29a 19,50 ± 0,61a 128,00 ± 13,36a
6-OHDA +CV 25 31,33 ± 2,02b 27,67 ± 2,74b 91,00 ± 13,22a
6-OHDA +CV 50 30,17 ± 3,00b 36,00 ± 2,51b 92,17 ± 13,81ab
6-OHDA +CV 25 + L-
DOPA 25
39,17 ± 2,45bc 40,33 ± 4,89b 63,25 ± 6,43bc
6-OHDA +EC 35,00 ± 1,61b 37,00 ± 4,86ab 77,83 ± 7,96ab
6-OHDA +EGCG 32,50 ± 2,87b 36,83 ± 4,26ab 64,67 ± 9,14ab
6-OHDA +L-DOPA 50 33,67 ± 2,88b 42,83 ± 6,22ab 75,67 ± 9,71b
6-OHDA +L-DOPA 25 25,50± 3,61ab 29,25 ± 7,12 a 106,30 ± 13,45a
Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (6-8). Sendo a vs Falso Operado, p<0,05; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs
L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post
hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já
os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas
foram tratados apenas com água destilada.
127
4.5 DETERMINAÇÃO DA MEMÓRIA ESPACIAL NO TESTE DO LABIRINTO
AQUÁTICO (WATER MAZE) EM RATOS COM LESÃO ESTRIATAL TRATADOS
COM EPICATEQUINA, EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO, EXTRATO
PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO OU ASSOCIADO COM L-DOPA
Avaliar a memória espacial e qualquer alteração na resposta (maior tempo
para encontrar a plataforma submersa) é sugestiva de disfunção hipocampal, logo
este teste foi utilizado para determinar se a lesão estriatal por 6-OHDA prejudicou a
formação de memória, já que alguns artigos relatam que a lesão pode se estender
até o hipocampo dos ratos ocasionando prejuízos cognitivos.
De acordo com a Figura 33 e na Tabela 6 podemos perceber que os animais
do grupo controle lesão 6-OHDA gastaram mais tempo para encontrar a plataforma
quando comparados com o grupo falso operado, mostrando que a lesão com 6-
OHDA prejudicou a formação da memória espacial nestes ratos. O tratamento com
CV na dose de 50 mg/kg,v.o foi eficaz em reduzir o tempo que os animais levaram
para encontrar a plataforma em relação aos animais lesionados e tratados com água
destilada, já o CV 25 não apresentou redução significativa neste teste. As
catequinas, a EC e EGCG, também diminuíram significantemente o tempo de
encontro da plataforma em relação ao grupo controle lesão (Figuras 33 a 35).
Os tratamentos dos ratos com L-DOPA 50 mg/kg e com a associação de CV
25 com L-DOPA 25 também melhoraram a memória espacial dos ratos lesionados
ao diminuir, de maneira significativa (p<0,05), o tempo de encontro da plataforma.
Neste teste, observamos que o tratamento com CV 25 potencializou o efeito da L-
DOPA 25 mg/kg quando estas drogas foram usados em associação e em
comparação com o grupo que recebeu apenas L-DOPA 25 mg/kg. (Figura 34 e
Tabela 6)
128
Figura 33 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no teste do labirinto
aquático. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado * a vs Falso Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
oper
ado
6-OHDA
6-OHDA +
CV 2
5
6-OHDA+
CV 5
0
0
5
10
15
20
b
a
a
Tem
po
para
en
co
ntr
ar
a p
lata
form
a(s
)
129
Figura 34 - Efeitos da administração do extrato padronizado do chá-verde associado com L-DOPA 25 mg/kg e da L-DOPA (nas doses de 50 e 25 mg/kg,v.o) em ratos com
lesão estriatal por 6-OHDA no teste do labirinto aquático. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo
considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais
controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
opera
do
6-OHD
A
6-OHD
A +
CV 2
5 +LDO
PA 25
6-OHD
A+ L
-DO
PA 5
0
6-OHD
A +
L-D
OPA 2
5
0
5
10
15
20
Tem
po
para
en
co
ntr
ar
a p
lata
form
a(s
)
a a
bcb
130
Figura 35 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA no teste do labirinto aquático. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls post hoc).
O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso O
perado
6-O
HDA
6-OHDA +
EC 1
0
6-OHDA +
EGCG
10
0
5
10
15
20
b b
Tem
po
par
a e
nco
ntr
ar a
pla
tafo
rma(
s)
a
131
Tabela 6 - Efeitos da administração do extrato padronizado do chá-verde (nas doses
de 25 e 50 mg/kg, v.o.), da associação de CV com L-DOPA, da epicatequina (EC, 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina (EGCG,10 mg/kg) e da L-DOPA (25 e 50 mg/kg) em
ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no teste do labirinto aquático
GRUPOS
TEMPO PARA ENCONTRAR A
PLATAFORMA (s)
FALSO OPERADO
4.75 ± 0.85
CONTROLE (6-OHDA) 15.25 ± 2.13a
6-OHDA +CV 25 11.60 ± 2.01a
6-OHDA +CV 50 7.60 ± 0.92b
6-OHDA +CV 25 + L-DOPA 25 8.60±1.56bc
6-OHDA +EC 10 9.00±1.00b
6-OHDA +EGCG 10 7.25 ±2.62b
6-OHDA +L-DOPA 50 7.00±1.41b
6-OHDA +L-DOPA 25 15.20 ± 1.93a
Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA,
p<0,05 e c
vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração
intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração
desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
132
4.6 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA DOS RATOS LESIONADOS COM
6-OHDA APÓS TRATAMENTO COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-
VERDE (CV), COM EPICATEQUINA E EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO E
COM L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CHÁ-VERDE NO TESTE DO
ROTA ROD
O teste da barra giratória (Rota Rod) serve para avaliar coordenação motora
dos animais, os parâmetros utilizados foram o tempo de permanência do animal na
barra giratória e o número de quedas em 1 minuto, estes parâmetros servem para
verificar se o animal em teste teve prejuízo da coordenação motora após a lesão
estriatal com 6-OHDA.
Está comprovado que em roedores as alterações do sistema de
neurotransmissão dopaminérgica ou degenerações do sistema nigroestriatal e vias
acessórias se encontram associadas a incoordenação motora dos animais.
Os resultados das Figura 36 e 37 mostraram que o grupo lesão 6-OHDA teve
um menor tempo de permanência na barra giratória em comparação com o grupo
falso operado, e os tratamentos com CV 25 e 50 e com a associação de CV 25 com
L-DOPA 25 foram eficazes em aumentar significantemente (p<0,01) o tempo de
permanência na barra giratória dos animais lesionados com 6-OHDA. Os grupos
tratados com EC e EGCG aumentaram, de forma significante, o tempo de
permanência na barra giratória, assim como os ratos lesionados e tratados com L-
DOPA 50 que tiveram uma média de permanência em relação ao grupo controle
(Figuras 37 e 38).
As Figuras 39, 40 e 41 e Tabela 7 mostram os resultados do número de
quedas dos ratos no teste do Rota Rod, em que pode-se observar que os animais
lesionados por 6-OHDA e tratados com água destilada tiveram um maior número de
quedas quando comparados com o falso operado. Os tratamentos com CV 25
associado com L-DOPA 25, EC, EGCG e L-DOPA 50 mg/kg foram capazes de
reduzir o número de quedas dos animais lesionados de maneira significativa em
comparação ao grupo controle 6-OHDA. Neste teste, observou-se que o tratamento
com CV 25 potencializou o efeito da L-DOPA 25 mg/kg quando estas drogas foram
administradas em associação nos ratos e ao se comparar com o grupo que recebeu
apenas L-DOPA 25 mg/kg. Não houve diferença significativa entre os grupos
133
tratados com CV 25 e 50, nem entre os grupos tratados com EC e EGCG (Figuras
39, 40 e 41 e Tabela 7).
134
Figura 36 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no tempo de permanência na
barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado,
p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc).O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina,
mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6OHDA
6OHDA +
CV 2
5
6-OHDA +
CV 5
0
0
20
40
60
80
a
bb
Tem
po
de p
erm
an
ên
cia
(s)
135
Figura 37 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (na dose de 25 mg/kg, v.o.) associado com L-DOPA (25 mg/Kg,v.o) em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA no tempo de permanência na barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos
(6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O
grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6O
HDA
6-O
HDA+ C
V25+LD
OPA
25
6-O
HDA+L-D
OPA
50
6-O
HDA+L-D
OPA
25
0
20
40
60
80
Tem
po
de p
erm
an
ên
cia
(s)
a abc b
136
Figura 38 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA no tempo de permanência na barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). Foram utilizados 6-8 animais por experimentos. O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de
6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA +
EC 1
0
6-O
HDA +
EG
CG
10
0
20
40
60
80
b b
Tem
po
de p
erm
an
ên
cia
(s)
a
137
Figura 39 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o.) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no número de quedas da barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado,
p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina,
mas foram tratados apenas com água destilada.
Fals
o Ope
rado
6-O
HDA
6-O
HDA+
CV 2
5
6-O
HDA+
CV 5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
a
b
Nu
mero
de q
ued
as/6
0s
138
Figura 40 - Efeitos da administração extrato padronizado do chá-verde (na dose de 25 mg/kg, v.o.) associado com L-DOPA (25 mg/Kg,v.o) em ratos com lesão estriatal por 6-
OHDA no número de quedas da barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8).
Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O grupo
falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados
apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-OHDA+
CV 2
5+L-D
OPA
25
6-OHDA+
L-DOPA
50
6-OHDA +
L-D
OPA 2
5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
bc b
Nu
mero
de q
ued
as/6
0s a
a
139
Figura 41 - Efeitos da administração das catequinas, epicatequina (EC 10mg/kg,v.o) e epigalocatequina 3-galato (EGCG,10 mg/kg,v.o) em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA no número de quedas na barra giratória no teste do Rota Rod. Os resultados
são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8), sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way
ANOVA e Teste de Newman-Keuls post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+E
C 1
0
6-O
HDA +
EGCG 1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
b
b
Nu
mero
de q
ued
as/6
0s
a
140
Tabela 7 - Tempo de permanência na barra giratória e número de quedas dos animais no teste
do Rota Rod em ratos com lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com CV, catequinas (EC e EGCG), com associação de CV com L-DOPA e com L-DOPA
GRUPOS
TEMPO DE PERMANÊNCIA
NA BARRA (s)
NÚMERO DE
QUEDAS
FALSO OPERADO
59,17 ± 0,83
0,16 ± 0,16
CONTROLE (6-OHDA) 45,00 ± 2,23a 1,40 ± 0,24a
6-OHDA + CV 25 56,67 ± 2,10b 0,33 ± 0,210b
6-OHDA + CV 50 53,33 ± 3,33b 0,66 ± 0,33
6-OHDA + CV 25 + LDOPA
25
58,33 ± 1,66bc 0,16 ± 0,16bc
6-OHDA + EC 10 55,00 ± 3,41b 0,50 ± 0,34b
6-OHDA + EGCG 10 56,67 ± 2,10b 0,33 ± 0,21b
6-OHDA + L-DOPA 50 58,33 ± 1,66b 0,16 ± 0,16b
6-OHDA + L-DOPA 25 49,17 ± 3,27a 1,00 ± 0,25a
Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA,
p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
como teste post hoc). O grupo falso operado não recebeu administração
intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração
desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
141
RESULTADOS
Atividade Antioxidante
142
5 RESULTADOS: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
5.1 DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-
VERDE, DAS CATEQUINAS (EC E EGCG) E DA L-DOPA SOZINHA OU
ASSOCIADA COM CV SOBRE O GRAU PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA (TBARS)
NO CORPO ESTRIADO DE RATOS LESIONADOS COM 6-OHDA
Foi realizada uma avaliação do efeito do CV e das catequinas (EC e EGCG)
na lesão oxidativa induzida pela lesão com 6-OHDA através do teste do TBARS para
a quantificação dos níveis de malonildialdeído (MDA), como índice de peroxidação
lipídica, como a finalidade de determinar a neurotoxiciade induzida pela 6-OHDA
com relação ao estresse oxidativo e a geração de radicais livres.
Os resultados do teste do TBARS mostraram que o corpo estriado dos ratos
pertencentes ao grupo lesão 6-OHDA tiveram um maior índice de peroxidação
lipídica quando comparado aos controles negativo (Falso operado) (Figura 42). Por
sua vez, o estriado dos animais tratados com CV 50, EC e EGCG o grau de
peroxidação lipídica foi reduzida, significantemente, em 39.4, 47.3 e 47.3 % em
relação ao grupo controle 6-OHDA (Figuras 42 e 44). Pode-se observar que os
grupos de animais tratados com as catequinas (EC e EGCG) conseguiram a maior
redução do grau de peroxidação lipidica, indicada pelos níveis de MDA, mostrando
que a EC e EGCG apresentam um excelente efeito antioxidante neste teste e não
houve diferença significativa entre os grupos tratados com estas catequinas (Figura
44 e Tabela 8).
O tratamento com L-DOPA 25 associada com CV 25 reduziu,
significantemente, o grau de peroxidação lipídica em 39.4% quando comparados
com controle lesão 6-OHDA e através da analise estatística demonstramos que o
CV 25 potencializou o efeito da L-DOPA 25 quando estes foram associados em
relação ao grupo que recebeu somente L-DOPA 25 (Figura 43 e Tabela 8).
143
Figura 42 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde nas doses de 25 e 50 mg/kg sobre os níveis de malonildialdeído (MDA), como índice de peroxidação lipídica, no
estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso
Operado, p<0,05 e b vs 6-OHDA, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc).O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal
de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+
CV 2
5
6-O
HDA+
CV 5
0
0
100
200
300
400
500
b
a
TB
AR
S (
µm
ol
MD
A/g
de t
ecid
o)
a
144
Figura 43 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde associado com L-DOPA 25 e L-DOPA nas doses de 25 e 50 mg/kg sobre os níveis de malonildialdeído (MDA), como
índice de peroxidação lipídica, no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos
(6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc). O
grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+C
V25+LD
OPA
25
6-O
HDA+ L
-DO
PA 5
0
6-O
HDA+L-D
OPA
25
0
100
200
300
400
500 a
TB
AR
S (
µm
ol
MD
A/g
de t
ecid
o)
a
bc
145
Figura 44 - Efeito do das catequinas (EC e EGCG, na dose de 10 mg/kg,v.o) sobre os níveis de malonildialdeído (MDA), como índice de peroxidação lipídica, no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso Operado, p<0,001 e b vs 6-OHDA, p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc).
O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada.
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-OHDA+
EC 1
0
6-OHDA +
EGCG 1
0
0
100
200
300
400
500
bb
a
TB
AR
S (
µm
ol
MD
A/g
de t
ecid
o)
146
Tabela 8 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde, das catequinas (EC e EGCG) e da L-DOPA sozinha e/ou associado com CV sobre os níveis de malonildialdeído
(MDA), como índice de peroxidação lipídica, no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA
GRUPOS
TBARS (µmol MDA/g tecido)
REDUÇÃO DA
PEROXIDAÇÃO
LIPIDICA EM %
FALSO OPERADO 166 ± 15,36 -
CONTROLE (6-OHDA) 388,3 ± 46,51a -
6-OHDA + CV 25 330 ± 21,21a 13,1
6-OHDA + CV 50 238 ± 24,37b 39,4
6-OHDA + CV 25 + LDOPA
25
238,3 ± 27,38bc 39,4
6-OHDA + EC 10 200 ± 16,33b 47,3
6-OHDA + EGCG 10 203,3 ± 26,92b 47,3
6-OHDA + L-DOPA 50 274 ± 31,08 28,9
6-OHDA + L-DOPA 25 378 ± 37,60a 2,6
Fonte: elaboração da autora.
A peroxidação lipídica foi determinada através do teste de ácido tiobarbitúrico
para a quantificação dos níveis de MDA nos homogenatos de estriado dos ratos. Os
resultados são expressos como média ± EPM do número de experimentos (6-8).
Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-
DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post
hoc). O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já
os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas
foram tratados apenas com água destilada.
147
5.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO/NITRATO NO
ESTRIADO DE RATOS SUBMETIDOS A LESÃO POR 6-OHDA E TRATADOS
COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV), CATEQUINAS (EC E
EGCG) E L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CV
Os conteúdos de nitrito, que são usados como marcadores indiretos da
formação de radicais livres, foram significativamente aumentados (cerca de 2.6
vezes) no estriado dos animais controles (lesionados com 6-OHDA), quando
comparados ao grupo falso operado (Figura 45).
Os tratamentos com CV nas doses de 25 e 50mg/kg, com a associação de
CV 25 + L-DOPA 25, com a epicatequina e epigalocatequina promoveram uma
redução significativa dos níveis de nitrito no estriado, conforme pode-se observar
nas Figuras 45, 46 e 47 e Tabela 9. O chá verde de 50 mg/kg reduziu em 44,9%, já
a EC e EGCG reduziram em 45,4 e 46,7%, respectivamente, enquanto que a
associação de L-DOPA associada com CV 25 diminuiu em 54,9% o conteúdo de
nitrito nas amostras em relação ao grupo controle 6-OHDA (Tabela 9).
Estatisticamente foi demonstrado que o CV 25 potencializou o efeito da L-DOPA 25
quando estas foram administradas em associação e em comparação com o grupo
que só recebeu L-DOPA 25 (Figura 46).
148
Figura 45 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o) sobre formação de nitrito/nitrato no estriado de ratos submetidos a lesão estriatal
por 6-OHDA. Os animais receberam CV (25 e 50 mg/kg, v.o.) iniciando 1h antes da lesão com 6-OHDA e continuando diariamente durante 14 dias. O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água
destilada. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA,
p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc).
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+C
V 2
5
6-O
HDA+C
V 5
0
0
1
2
3
4
5
6
b
b
a
Nit
rito
/Nit
rato
(µ
mo
l/g
de t
ecid
o)
149
Figura 46 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde associado com L-DOPA 25 e L-DOPA sozinha (nas doses 25 e 50 mg/kg) na formação de nitrito/nitrato no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os animais receberam L-DOPA (nas doses de 25 e 50 mg/kg) e CV 25 associado com L-DOPA 25 por via oral, iniciando 1h antes da lesão
com 6-OHDA e continuando diariamente durante 14 dias. O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA
receberam a administração desta neurotoxina, mas foram tratados apenas com água destilada. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (6-8). Sendo considerado a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como
teste post hoc)
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+C
V25+LD
OPA
25
6-O
HDA+ L
-DO
PA 5
0
6-O
HDA+ L
-DO
PA 2
5
0
1
2
3
4
5
6
bc
a
a a
Nit
rito
/Nit
rato
(µ
mo
l/g
de t
ecid
o)
150
Figura 47 - Efeito das catequinas (EC e EGCG) na formação de nitrito/nitrato no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os animais receberam as catequinas
(Epicatequina (EC) e Epicagalocatequina 3-galato (EGCG) na dose de 10 mg/kg (v.o), iniciando 1h antes da lesão com 6-OHDA e continuando diariamente durante 14 dias.
O grupo falso operado não recebeu administração intraestriatal de 6-OHDA, já os animais controle 6-OHDA receberam a administração desta neurotoxina, mas foram
tratados apenas com água destilada. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). a vs Falso Operado, p<0,01 e b vs 6-OHDA, p<0,01 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+E
C 1
0
6-OHDA+E
GCG 1
0
0
1
2
3
4
5
6
b b
a
Nit
rito
/Nit
rato
(µ
mo
l/g
de
te
cid
o)
151
Tabela 9 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), das catequinas (EC e EGCG) e da L-DOPA sozinha e/ou associada com CV na concentração de
nitrito/nitrato no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA
GRUPOS
CONCENTRAÇÃO DE
NITRITO/NITRATO
(µmol/g TECIDO)
REDUÇÃO DO
CONTEÚDO DE
NITRITO %
FALSO OPERADO 1,82 ± 0,13 -
CONTROLE (6-OHDA) 4,76 ± 0,68a -
6-OHDA+ CV 25 3,32 ± 0,37a 30,3
6-OHDA+CV 50 2,62 ± 0,35b 44,9
6-OHDA+CV 25 + LDOPA 25 2,15 ± 0,27bc 54,9
6-OHDA+EC 10 2,60 ± 0,35b 45,4
6-OHDA+EGCG 10 2,54 ± 0,26b 46,7
6-OHDA+L-DOPA 50 3,94 ± 0,66a 17,3
6-OHDA+L-DOPA 25 4,47 ± 0,48a 6,1
Os resultados são expressos como média ± EPM do número animais por
experimentos (6-8). a vs Falso Operado, p<0,01; b vs 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-
DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls como teste post
hoc).
152
5.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO EXTRATO DE C. SINENSIS
(CHÁ VERDE, CV) EM NEUTRÓFILO HUMANO POR QUIMIOLUMINESCÊNCIA
(QL)
Para confirmar o efeito antioxidante do CV in vivo, realizou-se teste in vitro
utilizando neutrófilos humanos estimulados por forbol-miristato-acetato (PMA)
através de quimioluminescência dependente de luminol (QL lum).
Os resultados obtidos demonstraram que o CV em diferentes concentrações
(0.1, 1, 50 e 100 µg/mL) foi capaz de inibir significantemente em 25.6, 71.5, 76.6,
79.5 e 80.7%, respectivamente, a produção de QL lum pelos neutrófilos estimulados
por PMA em comparação com o grupo controle, tendo resultados semelhantes á
quercetina, droga antioxidante utilizada como controle positivo no referido teste, que
reduziu em 80,7% a produção de QL lum (Figura 48 e Tabela 10).
153
Figura 48 - Efeito do extrato de chá verde sobre a produção de oxidantes por neutrófilos humano estimulados com PMA mensurada por quimioluminescência
dependente de luminol (QL lum). Neutrófilos (5 x 106) foram incubados com extrato do chá-verde (CV, 0,1 - 100 µg/mL), quercetina (droga padrão) ou controle (salina) e
posteriormente estimulados com PMA (0,1 µmol/L). Espontâneo: células não estimuladas; Controle: DMSO – veículo; Quercetina - droga padrão antioxidante. Os resultados estão expressos como média ± E.P.M. a vs Espontâneo; b vs Veículo (p <
0,05 – ANOVA e Teste de Tukey).
Espontâ
neo
Contr
ole 0.1 1 50100
Querc
etina 5
0
0
1000
2000
3000
PMA
a,ba,bb
a
a,b
a,b
Qu
imio
lum
ines
cen
cia
(lu
m)
CV
154
Tabela 10 - Efeito do extrato de chá verde sobre a produção de oxidantes por neutrófilos humanos estimulados com PMA mensurada por quimioluminescência
dependente de luminol (QL lum)
GRUPOS
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
DEPENDENTE DE
LUMINOL (QL LUM)
REDUÇÃO DO
METABOLISMO
OXIDATIVO DOS
NEUTROFILOS %
ESPONTÂNEO 1,82 ± 0,13 -
CONTROLE 4,76 ± 0,68a -
CV 0,1 µg/mL 3,32 ± 0,37a 25,6
CV 1 µg/mL 2,62 ± 0,35b 71,5
CV 50 µg/mL 2,15 ± 0,27b 76,6
CV 100 µg/mL 2,60 ± 0,35b 79,5
QUERCETINA 2,54 ± 0,26b 80,7
Neutrófilos (5 x 106) foram incubados com extrato (0,1 - 100 µg/mL),
quercetina (droga padrão) ou controle (salina) e posteriormente estimulados com
PMA (0,1 µmol/L). Espontâneo: células não estimuladas; Controle: Salina – veículo;
Quercetina - droga padrão antioxidante. Os resultados estão expressos como média
± E.P.M. a vs Espontâneo; b vs Veículo (p < 0,05 – ANOVA e Teste de Tukey).
155
RESULTADOS
Dosagem de Dopamina e metabolitos
156
6 RESULTADOS: DOSAGEM DE DOPAMINA E METABOLITOS
6.1 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE DOPAMINA (DA) E SEUS
METABÓLITOS (DOPAC E HVA) NO CORPO ESTRIADO DIREITO E
ESQUERDO DE RATOS SUBMETIDOS Á LESÃO POR 6-OHDA E TRATADOS
COM EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV), CATEQUINAS (EC E
EGCG) E L-DOPA SOZINHA OU ASSOCIADA COM CV
Sabendo que a doença de Parkinson é caracterizada pela destruição de
neurônios dopaminérgicos na via nigroestriatal, realizamos a determinação de
dopamina e metabolitos. A injeção de 6-OHDA produziu dano oxidativo que resultou
em destruição neuronal dopaminérgica, como indicado pela redução das
concentrações de dopamina, DOPAC e HVA no lado ipsilateral em 87, 88 e 88 %,
respectivamente, quando comparado com o mesmo lado do grupo falso operado.
Observou-se uma redução significativa da concentração de dopamina (82,5
%) e seus metabolitos, DOPAC (84,3%) e HVA (78,4%), no lado ipsilateral dos
controles lesão 6-OHDA em comparação com o lado contralateral da lesão,
comprovando que a neurotoxina 6-OHDA produziu destruição dos neurônios
dopaminérgicos. No entanto, nos animais tratados com CV nas doses de 25 e 50
mg/kg, a redução dopaminérgica foi de 36,1 e 41,9 %, respectivamente, em relação
ao lado contralateral da lesão dos mesmos grupos, indicando uma recuperação
significativa da dopamina no lado lesionado (p<0,05). No grupo tratado com
associação de CV com L-DOPA 25 os níveis de dopamina reduziram em apenas
10,2% e no grupo tratado com apenas L-DOPA 25 a redução foi de 45,3 %, dessa
forma o CV 25 potencializou de maneira significativa o efeito da L-DOPA 25 quando
usados em associação, já que a redução de dopamina foi bem menor no grupo que
recebeu a associação do que o que recebeu apenas L-DOPA. Já nos grupos
tratados com EC e EGCG a redução foi de 58,1 e 27,7 %, respectivamente, em
comparação com o lado contralateral da lesão dos respectivos grupos, comprovando
que as catequinas também foram eficazes em recuperar os níveis de dopamina no
estriado (Tabela 11).
O mesmo ocorreu com metabólito, DOPAC, que teve uma redução de 84,3%
no estriado direito do grupo controle lesão 6-OHDA em relação ao lado contralateral
da lesão (estriado esquerdo). Este metabolito dopaminérgico diminuiu em torno de
157
12,8 e 59,2 % no estriado direito lesionado (ipsilateral) dos ratos tratados com
extrato padronizado do chá-verde, nas doses de 25 e 50 mg/kg, em relação ao
estriado esquerdo, respectivamente. Nos grupos tratados com associação de CV 25
com L-DOPA 25 a redução de DOPAC foi de 17,1%, e nos animais que receberam
tratamento apenas com L-DOPA 25 a redução foi de 39,6 %, já nos grupos tratados
com EC e EGCG este percentual de redução foi de 52,1 e 4,2%, respectivamente,
todos em relação ao lado contralateral da lesão (Tabela 12).
Além disso, a concentração de HVA também diminuiu em torno de 78,4 % no
estriado direito dos animais do grupo controle lesão 6-OHDA, e cerca de 35,2 e 8,7
%, respectivamente, nos grupos lesionados e tratados com extrato padronizado do
chá-verde nas doses de 25 e 50 mg/kg em relação ao lado contralateral da lesão. Já
a associação do extrato padronizado do chá-verde (25 mg/kg) com L-DOPA 25
reduziu 15,6 % e a L-DOPA 25 sozinha reduziu em 21,1 % a concentração de HVA
em relação ao lado contralateral da lesão. As catequinas, epicatequina e
epigalocatequina na dose de 10 mg/kg, diminuíram em 8,4 e 31,6 % a quantidade de
ácido homovanílico em relação ao estriado esquerdo da lesão (Tabela 12).
Quando comparamos os valores da concentração de dopamina dos grupos
com o controle negativo (falso operado), percebemos que os animais do grupo lesão
6-OHDA tiveram uma redução significativa de 83% nos níveis estriatais de
dopamina. O tratamento com CV de 25 e 50mg/kg foi capaz de atenuar
significantemente o déficit de dopamina, pois a redução foi de apenas 44,2 e 43%
em relação ao F.O. O grupo que recebeu L-DOPA 25 associado com CV 25 reduziu
em apenas 17%, e o que recebeu L-DOPA 25 sozinho diminuiu em 58,2% os níveis
de dopamina no estriado direito dos ratos, também comprovando que o CV 25
realmente potencializou o efeito da L-DOPA 25 quando usados em associação
(Figura 49). As catequinas, EC e EGCG, reduziram em 45,8 e 47,1%,
respectivamente, os níveis dopaminérgicos em comparação com o grupo falso
operado (Figura 50). Todos os grupos testados apresentaram níveis dopaminérgicos
significativamente (p<0,05) maiores do que o grupo lesão 6-OHDA (Figuras 49 e 50),
isto também aconteceu com os metabolitos DOPAC (com exceção dos grupos que
receberam EC e CV 50) e HVA (com exceção dos grupos que receberam L-DOPA
25 e CV 25) (Tabela 12 e Figuras 51, 52, 53 e 54).
158
Tabela 11 - Concentrações (ng/g tecido) de DA e seus metabólitos (DOPAC e HVA) em corpo estriado esquerdo (E) e direito (D) de ratos lesionados com 6-OHDA tratados com extrato padronizado chá-verde (CV), com Epicatequina (EC), Epigalocatequina 3-galato
(EGCG) e com L-DOPA sozinha ou associada com CV
GRUPOS
DA D
DA E
FALSO OPERADO 3066 ± 501,3 2365 ± 220
LESÃO 6-OHDA 384,6 ± 54,89 a (82,5%) 2194 ± 289,9
6-OHDA+CV 25 1710 ± 340,9 b (36,1%) 2678 ± 633,1
6-OHDA+CV 50 1749 ± 398,2b (41,9%) 3010 ± 441,2
6-OHDA+CV 25+L-DOPA 25 2546 ± 324,2bc (10,2%) 2737 ± 357,6
6-OHDA+L-DOPA 25 1281 ± 204b (45,3%)
2342 ± 209,3
6-OHDA+EC 10 1660 ± 470,8b (58,1%) 3970 ± 656,8
6-OHDA+EGCG 10
1621 ± 287b (27,7%) 2242 ± 652,3
Os resultados são expressos como média ± EPM (ng/g tecido) do número de animais por experimentos (6-8). a vs falso
operado, p<0,001; b vs controle lesão 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
post hoc). % de redução em relação ao lado contralateral da lesão
159
Tabela 12 - Concentrações dos metabolitos DOPAC e HVA em corpo estriado esquerdo (E) e direito (D) de ratos lesionados com 6-OHDA tratados com extrato padronizado chá-verde (CV), com Epicatequina (EC), Epigalocatequina 3-galato (EGCG) e com L-
DOPA sozinha ou associada com CV
GRUPOS
DOPAC
D
DOPAC
E
HVA
D
HVA
E
FALSO OPERADO 2801 ± 389,8 2864 ± 262,2 1688 ± 345
969,5 ± 518,2
LESÃO 6-OHDA 324,9 ± 73,62a (84,3%) 2071± 142 195,2 ± 32,8a (78,4%)
905,9 ± 283,5
6-OHDA+CV 25 2110 ± 372,3b (12,8%) 2421 ± 351,3 345,3 ± 78,8 (35,2%)
532,8 ± 56,76
6-OHDA+CV 50 1073 ± 301,4a (59,2%) 2635 ± 466,2 949,9 ±165 b (8,7%) 1040 ± 599,7
6-OHDA+CV 25+L-DOPA 25 2379 ± 327,7bc (17,1%) 2870 ± 641,3 514,6 ± 90,4b (15,6%)
609,5 ± 161,5
6-OHDA+L-DOPA 25 1944 ± 309,8b (32,4%) 3222 ± 353,8 514,6 ± 90,4 (21,1%) 652,8 ± 240,6
6-OHDA+EC 10 1225 ± 358,8 (52,1%) 2561 ± 416,1 811,4 ± 123,6 b (8,5%) 886 ± 337
6-OHDA+EGCG 10
2143 ± 403,8b (4,2%) 2237 ± 179,4 749,1 ± 225,6 b (31,6%) 1095,8 ± 360,1
Os resultados são expressos como média ± EPM (ng/g tecido) do número de animais por experimentos (6-8). a vs falso
operado, p<0,001; b vs controle lesão 6-OHDA, p<0,05 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls
post hoc). % de redução em relação ao lado contralateral da lesão.
160
Figura 49 - Determinação das concentrações de DA em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias com extrato padronizado chá-verde (CV) nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o., com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 e com L-DOPA 25 mg/kg sozinha. Os resultados são expressos como média ± EPM do
número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso operado, p<0,05, b vs Controle (6-OHDA), p< 0,001 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de
Newman-Keuls post hoc).
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+
CV 2
5
6-OHDA+C
V 50
6-OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA+C
V 25+
L-DOPA 2
5
0
1000
2000
3000
4000
abb
bc
a
ab
a
Do
pam
ina (
ng
/g t
ecid
o)
161
Figura 50 - Determinação das concentrações de DA em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias com a epicatequina (EC) e
epigalocatequina 3-galato (EGCG) na dose de 10 mg/kg. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso
operado, p<0,01 e b vs Controle, p<0,05 (6-OHDA) (One-Way ANOVA e Teste de Newman-Keuls post hoc).
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+E
C 1
0
6-OHDA+E
GCG 1
0
0
1000
2000
3000
4000
a
abab
Do
pam
ina (
ng
/g t
ecid
o)
162
Figura 51 - Determinação das concentrações de DOPAC em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias com extrato padronizado chá-verde (CV) nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o., com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 e com L-DOPA 25 mg/kg sozinha. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso operado, p<0,01; b vs Controle (6-OHDA), p<0,001 e c vs L-DOPA 25, p<0,05 (One-Way ANOVA e Teste de
Newman-Keuls post hoc).
Fals
o Ope
rado
6-OHDA
6-OHDA+
CV 2
5
6-OHDA+C
V 5
0
6-OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA+C
V 2
5+L-
DOPA 2
5
0
1000
2000
3000
4000
b
a
bc
b
a
DO
PA
C (
ng
/g t
ecid
o)
163
Figura 52 - Determinação das concentrações de DOPAC em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias com Epicatequina (EC) e Epigalocatequina 3-galato (EGCG) na dose de 10 mg/kg, v.o. Os resultados são
expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso operado, p<0,01 e b vs Controle (6-OHDA), p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc).
Falso
Oper
ado
6-O
HDA
6-O
HDA+EC
10
6-O
HDA+EG
CG
10
0
1000
2000
3000
4000
a
b
a
DO
PA
C (
ng
/g t
ecid
o)
164
Figura 53 - Determinação das concentrações de HVA em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias tratados com extrato
padronizado chá-verde (CV) nas doses de 25 e 50 mg/kg, v.o., com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 e com L-DOPA 25 mg/kg sozinha. Os resultados são expressos
como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso operado, p<0,001 e b p<0,001 vs Controle (6-OHDA), p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc).
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V 25
6-OHDA+C
V 50
6-OHDA+L
-DOPA 2
5
6-OHDA+C
V 25+
L-DOPA 2
5
0
500
1000
1500
2000
2500
b
a
b
aa
HV
A (
ng
/g t
ecid
o)
165
Figura 54 - Determinação das concentrações de HVA em corpo estriado direito de ratos lesionados com 6-OHDA tratados durante 14 dias as catequinas, Epicatequina (EC) e Epigalocatequina 3-galato (EGCG)) na dose 10 mg/kg,v.o. Os resultados são
expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). Sendo a vs Falso operado, p<0,001 e b vs Controle, p<0,05 (6-OHDA) (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc).
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+E
C 1
0
6-OHDA+E
GCG 1
0
0
500
1000
1500
2000
b b
aHV
A (
ng
/g t
ecid
o)
166
RESULTADOS
Análise Histológica e Imunohistoquímica
167
7 RESULTADOS: ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
7.1 EFEITOS DO EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE (CV), DA
EPIGALOCATEQUINA 3-GALATO (EGCG) E DA ASSOCIAÇÃO DE L-DOPA
COM CV EM HIPOCAMPO DE ANIMAIS COM DOENÇA DE PARKINSON
AVALIADO PELA COLORAÇÃO DE NISSL (VIOLETA DE CRESIL)
Sabe-se que o hipocampo é particularmente vulnerável as lesões estriatais
por 6-OHDA, além disso, muitos pacientes com DP apresentam déficits cognitivos
sugestivos de disfunção hipocampal, por isso avaliamos as alterações morfológicas
induzidas por 6-OHDA nesta área cerebral.
Nota-se no hipocampo dos animais lesionados com 6-OHDA (A) uma grande
alteração morfológica dos neurônios nas áreas CA1 e CA3 em relação aos demais
grupos. Parte dessas alterações foi revertida nos animais lesionados e tratados com
CV 25 e 50 (B e C). Do mesmo modo, essas alterações morfológicas dos neurônios
foram, em grande parte, revertidas pelo tratamento com epigalocatequina 3-galato
(E) e com L-DOPA associada com CV 25 (D) nas áreas CA1 e CA-3, conforme
podemos ver nas Figuras 55 e 56.
168
Figura 55 - Fotomicrografias representativas da coloração de Nissl de neurônios do hipocampo, área CA-1, de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA e tratados
com água destilada (6-OHDA – A), com extrato padronizado do CV 25 (6-OHDA+CV 25 - B) e 50 mg/kg (6-OHDA+CV50 - C), com associação de CV 25 com L-DOPA (6-OHDA +
CV 25 + L-DOPA 25 - D) e com a Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+Epigalo - E). Aumento de 100X e escala de 50µm.
Fonte: elaboração da autora.
169
Figura 56 - Fotomicrografias representativas da coloração de Nissl de neurônios do hipocampo, área CA-1, de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA e tratados
com água destilada (6-OHDA – A), com extrato padronizado do CV 25 (6-OHDA+CV 25 - B) e 50 mg/kg (6-OHDA+CV50 - C), com associação de CV 25 com L-DOPA (6-OHDA +
CV 25 + L-DOPA 25 - D) e com a Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+Epigalo - E). Aumento de 100X e escala de 50µm.
Fonte: elaboração da autora.
170
7.2 ANÁLISES IMUNOHISTOQUÍMICAS
7.2.1 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com L-DOPA sobre a atividade da enzima tirosina hidroxilase no estriado
direito e esquerdo de animais com doença de Parkinson
Uma anormalidade bioquímica presente na DP é a degeneração de neurônios
dopaminérgicos na substância negra, levando à redução nos níveis de DA. Como a
enzima tirosina hidroxilase (TH) catalisa a formação de L-dihidroxifenilalanina (L-
DOPA), etapa limitante na biossíntese de DA, a DP pode ser considerada uma
síndrome estriatal com deficiência de TH. Assim essa enzima é considerada um
biomarcador em modelos de DP. Por isso, realizamos uma análise quali-quantitativa
para TH através da técnica de imunohistoquímica e utilizando o programa Image J.
Os resultados evidenciaram que os animais controle 6-OHDA tiveram uma
diminuição de mais de 80% da imunomarcação para TH no lado direito lesionado (C)
em relação ao mesmo lado dos animais falso operado (A) (Figura 57). Por outro
lado, o tratamento com CV 25 (D) e com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 (F)
atenuou a redução de TH no lado direito que foi lesionado pela 6-OHDA (Figura 57).
O tratamento com CV 25 reduziu em apenas 19,2% a imunorreatividade para TH
estriado direito em relação ao mesmo lado do grupo falso operado, revertendo de
maneira significativa (p<0,001) a diminuição de TH induzida por 6-OHDA nesta área
cerebral (Figura 57).
171
Figura 57 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Tirosina Hidroxilase (TH) em corpo estriado (direito e esquerdo) de animais falso-operado e de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 (Grupo 6-
OHDA+CV 25+L-DOPA25). A coloração marrom representa células imunorreativas para TH no estriado. Escala 200µm e Aumento de 400x.
172
Figura 58 - Quantificação da imunomarcação para Tirosina Hidroxilase (TH) no estriado direito de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados por 6-OHDA tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg. Essa
quantificação foi feita utilizando o programa Image J® através da densidade óptica. a vs Falso Operado, com p<0,05 e b vs 6-OHDA, com p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V 25
0
50
100
150
200
250
a
ab
TH
(D
en
sid
ad
e O
pti
ca)
173
7.2.2 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado
com L-DOPA sobre a atividade da enzima COX-2 no estriado direito e
esquerdo de animais com parkinsonismo experimental
A ciclooxigenase (COX) catalisa a síntese de prostanóides. A COX existe em
isoformas constitutivas e induzíveis. A COX-2 é a isoforma induzível, rapidamente
expressa em vários tipos de células em resposta a fatores de crescimento, citocinas
e moléculas pró-inflamatórias. Esta enzima no cérebro tem sido associada a
atividades pró-inflamatórias que se acredita serem fundamentais para os processos
de várias doenças neurodegenerativas, como a DP (MINGHETTI, 2014). Sabendo
da importância da COX-2 para a neuroinflamação e DP, avaliamos quali-
quantitativamente a imunomarcação para esta enzima no estriado de ratos falso-
operado e submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA.
Através das imagens obtidas a partir da técnica de imunohistoquímica para
COX-2 pode-se verificar que os animais controle 6-OHDA tiveram uma maior
imunomarcação para COX-2 no lado direito lesionado (C) em relação ao mesmo
lado do grupo falso operado (A) e também em relação ao lado contralateral (lado
esquerdo) da lesão no grupo 6-OHDA (D). O tratamento com CV 25 sozinho (D) e
associado com L-DOPA 25 (F) reduziu a marcação para a enzima COX-2 no lado
direito do estriado dos respectivos grupos em comparação com o mesmo lado do
grupo lesão 6-OHDA (C) conforme podemos ver na Figura 59.
Nas Figuras 60 e 61, observa-se que os animais lesionados e tratados com
água destilada tiveram um aumento de 4,2 vezes na imunomarcação para COX-2 no
estriado direito em comparação com os animais falso operado. O tratamento com CV
25 e com EGCG 10 foi capaz de reduzir significativamente esta marcação em 35,7 e
40,4%, respectivamente, em relação ao grupo controle 6-OHDA.
174
Figura 59 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 em corpo estriado (direito e esquerdo) de animais falso-operado e de ratos
submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 (Grupo 6-OHDA+CV 25+L-DOPA25). A coloração marrom representa células imunorreativas para COX-2 no estriado. Escala
200µm e Aumento de 400x
175
Figura 60 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 em corpo estriado direito de animais falso-operados e de ratos submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato
padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+EGCG 10) A coloração marrom representa células
imunorreativas para COX-2 no estriado. Escala 200µm e Aumento de 400x
176
Figura 61 - Quantificação da imunomarcação para COX-2 no estriado direito de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados por 6-OHDA
tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg ou com EGCG de 10 mg/kg. Essa quantificação foi feita utilizando o programa Image J® através da densidade óptica. a vs Falso Operado e b vs 6-OHDA, com p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste de Newman-
Keuls post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V 25
6-OHDA+E
GCG10
0
50
100
150
200
250
a
ab ab
CO
X-2
(D
en
sid
ad
e Ó
tica)
177
7.2.3 Efeitos do extrato padronizado do chá-verde (CV) e da epigalocatequina
3-galato (EGCG) na imunomarcação para iNOS no hipocampo nas áreas
CA-1, CA-3 e GD de animais com parkinsonismo experimental
Sabemos que a lesão estriatal por 6-OHDA promove neuroinflamação com
aumento da expressão de iNOS em algumas áreas cerebrais como estriado e
hipocampo. Avaliamos de maneira quali-quantitativa a imunorreatividade para iNOS
no hipocampo nas áreas CA-1, CA-3 e GD (giro denteado).
Observou-se através da análise quantitativa das imagens imunohistoquímica
para iNOS nas áreas CA-1, CA-3 e GD do hipocampo que os animais do grupo
lesão 6-OHDA (B) tiveram uma aumento de 24, 129 e 10 vezes, respectivamente, na
imunomarcação para a enzima oxido nítrico sintase induzida (iNOS) em comparação
com as mesmas áreas dos animais do grupo falso operado (A).
Os grupos tratados com CV 25 mg/kg (C) e com a EGCG 10 mg/kg (D)
tiveram uma redução significativa na imunomarcação para iNOS nesta área CA-1,
de modo que não foram observadas diferenças significativas entre esses grupos e o
falso-operado (Figura 62 e 63).
Na área CA-3 observou-se que os tratamentos com CV 25 (C) e com EGCG
10 (D) reduziram drasticamente a imunomarcação para iNOS, de modo que não
foram observadas diferenças significativas entre esses grupos e o falso-operado
(Figura 64 e 65).
No giro denteado (GD), o grupo lesão 6-OHDA (B) teve aumento de 9,8
vezes na imunomarcação para iNOS em relação ao falso operado e os tratamentos
com CV25 (C) e EGCG 10 (D) reduziram significantemente em 72,5 e 68,1% a
imunorreatividade para iNOS em relação ao grupo lesão 6-OHDA (Figuras 66 e 67).
178
Figura 62 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS no hipocampo área CA-1 do grupo falso-operado (F.O) e dos animais submetidos á
lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com
Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+EGCG 10). Escala 200µm e Aumento de 400x
179
Figura 63 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área CA-1 de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados por 6-OHDA
tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg ou com EGCG de 10 mg/kg. Essa quantificação foi feita utilizando o programa Image J® através da densidade óptica. a vs Falso Operado, com p<0,05 e b vs 6-OHDA, com p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V25
6-OHDA+E
GCG10
0
50
100
150
200 a
b b
iNO
S (
De
ns
ida
de
Óp
tic
a)
180
Figura 64 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS no hipocampo área CA-3 do grupo falso-operado (F.O) e dos animais submetidos á
lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com
Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+EGCG 10). Escala 200µm e Aumento de 400x
181
Figura 65 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área CA-3 de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados por 6-OHDA
tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg ou com EGCG de 10 mg/kg. Essa quantificação foi feita utilizando o programa Image J® através da densidade óptica. a vs Falso Operado, com p<0,05 e b vs 6-OHDA, com p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V25
6-OHDA+E
GCG10
0
50
100
150
200 a
b b
iNO
S (
De
ns
ida
de
Óp
tic
a)
182
Figura 66 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS no hipocampo área GD do grupo falso-operado (F.O) e dos animais submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA e tratados com água destilada (Grupo 6-OHDA), com extrato padronizado do CV na dose de 25 mg/kg (Grupo 6-OHDA+ CV 25) e com
Epigalocatequina 3-galato (6-OHDA+EGCG 10).Escala 200µm e Aumento de 400x
183
Figura 67 - Quantificação da imunomarcação para iNOS no hipocampo área GD de animais falso operado, lesionados por 6-OHDA (6-OHDA) e lesionados por 6-OHDA
tratados com chá-verde na dose de 25 mg/kg ou com EGCG de 10 mg/kg. Essa quantificação foi feita utilizando o programa Image J® através da densidade óptica. a vs Falso Operado, com p<0,05 e b vs 6-OHDA, com p<0,001 (One-Way ANOVA e Teste
de Newman-Keuls post hoc)
Falso
Oper
ado
6-OHDA
6-OHDA+C
V25
6-OHDA+E
GCG10
0
50
100
150
200a
ab ab
iNO
S (
De
ns
ida
de
Op
tic
a)
184
RESULTADOS
Atividade Antiinflamatória e Antinociceptiva
185
8 RESULTADOS: ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
8.1 ESTUDO DOS EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIO/ANTINOCICEPTIVO DO
EXTRATO PADRONIZADO DO CHÁ-VERDE SOZINHO E ASSOCIADO COM
DROGAS ANTI-INFLAMATÓRIAS/ANTINOCICEPTIVAS EM MODELOS
AGUDOS DE INFLAMAÇÃO E NOCICEPÇÃO EM ROEDORES
A participação da inflamação na fisiopatologia da doença de Parkinson tem
sido confirmada por diversos autores, estudos evidenciaram que fármacos
antiinflamatórios possuem propriedades neuroprotetoras. Além disso, apesar da
doença de Parkinson ser uma afecção essencialmente motora é comum o
aparecimento de dores em várias regiões do corpo, por isso investigou-se o efeito do
CV em modelos de inflamação e nocicepção.
8.1.1 Edema de pata induzido por carragenina em ratos
O CV (25 e 50 mg/kg) diminuiu de modo significante o edema de pata
induzido por carragenina nos tempos de observação de 1, 3, 4 e 24h após
administração da carragenina, mas não houve diferença significativa entre as
respectivas doses de CV. Já o CV 10 apresentou redução significante do edema
apenas na 3h após a aplicação de carragenina (Figura 68).
A indometacina (INDO, 10 mg/kg, vo) usada como droga de referência
reduziu significantemente o edema induzido por carragenina em todos os tempos
analisados. Inibições mais intensas foram observadas no grupo tratado com
associação de Indometacina 2 mg/kg com CV 10 mg/kg que também diminuiu o
edema em todos os tempos obervados, de maneira bastante significativa. Já a
indometacina 2 mg/kg reduziu o volume do edema da pata dos ratos
significativamente nos tempos 1, 3, 4 e 24h após a aplicação de carragenina (Figura
68).
186
De maneira geral, o extrato padronizado do CV (na dose 50 mg/kg) e a
Indometacina (10 mg/kg) foram efetivas em reduzir o edema em todos os tempos
observados, de maneira bastante significativa (p<0,01), quando comparada ao grupo
controle que recebeu apenas veículo (grupo controle). Nos tempos 1, 2 e 3h após a
aplicação de carragenina, o tratamento com CV 10 e Indo 2 potencializou de forma
significativa (p<0,05) a redução do edema e, consequentemente, o efeito anti
inflamatório em relação ao grupo que recebeu apenas Indometacina 2 mg/kg
(Tabela 13).
187
Figura 68 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 10, 25 e 50mg/kg), da associação CV com Indometacina e da Indometacina sozinha (nas doses
de 2 e 10 mg/kg) frente ao edema de pata induzido por carragenina. Nos animais do grupo controle foram administrados apenas água destilada. Os volumes das patas (ml) foram medidos através de pletismômetro antes da aplicação de carragenina e
após a aplicação da mesma nos tempos de observação (1, 2, 3, 4 e 24h). Os resultados do edema foram expressos como a diferença entre os volumes da pata do
animal. a vs Indo 2, p<0,05 e b vs controle, p<0,05 (One-Way ANOVA e Student Newman-Keuls, post hoc)
1 Hor
a
2 Hor
a
3 Hor
a
4 Hor
a
24 H
ora
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 Controle
CV 10 mg/Kg
CV 25 mg/Kg
CV 50 mg/Kg
Indo 10 mg/kg
Indo 2 + CV 10bIndo 2 mg/kg
*
Vo
lum
e d
o e
dem
a (
mL
)
bab
ab abb b b
b
b
bbb
b
bb
bb
bb
bb
188
Tabela 13 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (nas doses de 10, 25 e 50mg/kg) e da Indometacina sozinha (nas doses de 2 e 10 mg/kg) ou associada com CV frente ao edema de pata induzido por carragenina
Grupo
Medida do Edema (mL)
60 Min. 120 Min. 180 Min. 240 Min. 24 horas
CONTROLE
0,66 ± 0,01s 0,68 ± 0,02 0,77±0,01 0,67± 0,04
0,58± 0,01
CV 10 0,62 ± 0,02 (5%) 0,64± 0,02(11,4%) 0,68±0,01b
(5,7%) 0,59 ±0,03(11%) 0,58± 0,02 (1%)
CV 25 0,58 ± 0,21b
(12%) 0,63± 0,02(25,1%) 0,57±0,01b
(7%) 0,52±0,03b
(21,9%) 0,46±0,02b
(20,6%)
CV 50 0,53±0,04b
(18,4%) 0,56± 0,03b
(27,7%) 0,55±0,03b
(18,4%) 0,54±0,03b
(18,7%) 0,44±0,01b
(23,5%)
INDO 10 0,46±0,01b
(30,3%) 0,52±0,018b
(24,2%) 0,58±0,01b
(24%) 0,47±0,01b
(29,6%) 0,40±0,02b
(30,3%)
INDO 2 + CV10 0,41±0,01ab
(28%) 0,57± 0,01ab
(32,2%) 0,52±0,01ab
(16,7%) 0,47±0,02b
(30,1%) 0,42± 0,03b
(28%)
INDO 2 0,54±0,02b
(17,8%) 0,63± 0,03(19%) 0,62±0,03b
(8,2%) 0,54±0,02b
(19,2%) 0,48±0,01b
(17,8%)
189
Os valores são expressos como média ± E.P.M. do volume do edema em mL.
O CV (10, 25 ou 50 mg/kg), CV 10 mg/kg associado com Indometacina 2 mg/kg ou
indometacina, usada como droga de referencia (INDO, 2 e 10 mg/kg) foram
administrado por via oral nos animais (8 por grupo), 1 h antes da injeção de
carragenina a 1% na pata traseira direita. Os animais do grupo controle foram
tratados por via oral água destilada. Os volumes das patas (ml) foram medidos
através de pletismômetro, imediatamente antes e nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 24 h
após a injeção de carragenina, a diferença entre os volumes da pata (antes e depois
da aplicação de carragenina) foi considerado o volume do edema Os valores entre
parênteses representam a porcentagem de inibição do edema em relação ao grupo
controle que recebeu apenas veículo Os resultados do edema foram expressos
como a diferença entre os volumes da pata do animal. a vs Indo 2, p<0,05 e b vs
controle, p<0,05 (One-Way ANOVA e Student Newman-Keuls, post hoc
8.1.2 Edema de pata induzido por dextrano em ratos
No edema de pata induzido por dextrano, o tratamento com CV nas doses de
25 e 50mg/kg reduziu o edema nos tempos (60, 120 e180 min após a aplicação de
dextrano) de forma significativa (p<0,01). No entanto, o CV 50 foi eficaz em reduzir o
edema de pata também após 30 e 240 min da aplicação de dextrano. Neste modelo,
a dexametasona (Dexa, 10 mg/kg,v.o) usada como diminuiu o edema
significantemente após administração intraplantar de dextrano em todos os tempos
observados, já a Dexa na dose de 2 mg/kg reduziu o volume da pata dos animais,
de maneira significativa (p<0,05), apenas nos tempos 60 e 120 min (Figura 69).
A associação do CV 10 com Dexa na dose de 2 mg/kg potencializou, de modo
significativo, a redução do edema de pata nos tempos 120,180 e 240 min após a
aplicação intraplantar de dextrano em relação a Dexa2 mg/kg sozinha,
demonstrando que CV 10 potencializou o efeito antiinflamatório da dexa 2 mg/kg
(Tabela 14).
190
Figura 69 - Efeito do extrato padronizado do Chá-verde (CV) sozinho ou associado com dexametasona frente ao edema de pata induzido por dextrano. O CV (10, 25 ou 50
mg/kg), CV 10 mg/kg associado com Dexametasona 2 mg/kg ou dexametasona sozinha, usada como droga de referencia (Dexa, 2 e 10 mg/kg) foram administrado por
via oral nos animais (8 por grupo), 1 h antes da injeção de carragenina a 1% na pata traseira direita. Nos animais do grupo controle foram administrados apenas água
destilada. Os volumes das patas (ml) foram medidos através de pletismômetro antes da aplicação de dextrano e depois nos tempos de observação (30, 60,120,180 e 240min), a diferença entre os volumes da pata (antes e depois da aplicação de
dextrano) foi considerado o volume do edema. a vs Dexa 2, p<0,05 e b vs controle, p<0,05 (One-Way ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc)
30 60
120
180
240
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Controle
CV 50 mg/Kg
Dexa 10 mg/kg
CV10 +Dexa 2 mg/kg
Tempo(min)
Dexa 2 mg/kg
CV 10 mg/Kg
CV 25 mg/Kgb
b
b
Vo
lum
e d
o e
dem
a(m
L)
bb
bb
bb
bb
bb
b
abab
ab
191
Tabela 14 - Efeito do extrato padronizado do Chá-verde (CV) sozinho ou associado com dexametasona frente ao edema de pata induzido por dextrano
Grupos
Volume da pata (mL)
30 min 60 Min. 120 Min. 180 Min.
240 min
CONTROLE 0,41 ±0,01 0,45 ± 0,01 0,42±0,03 0,38± 0,01
0,32 ± 0,01
CV 10 0,37 ±0,02 (8,7%) 0,40± 0,01 (11,7%) 0,37±0,01(11,7%) 0,34 ±0,01(11,4%) 0,32± 0,01(1,4%)
CV 25 0,24±0,02 (40,8%) 0,36 ± 0,02 b (20,6%) 0,32±0,01b(23,8%) 0,30±0,01b (21%) 0,30±0,02(6,7%)
CV 50 0,37 ±0,01 (10,6%) 0,26±0,03 b (41,9%) 0,26±0,02 b(39,1%) 0,20±0,01b(46,3%) 0,21±0,01b(34,5%)
DEXA 10 0,32±0,01b (21,5%) 0,26±0,01 b (41,5%) 0,26±0,01 b(37,9%) 0,20±0,03b(47,6%) 0,18±0,01b(42,2%)
DEXA 2 + CV10 0,33±0,06 (19,1%) 0,26±0,03 b (41,9%) 0,27±0,001ab(34,8%) 0,27±0,01ab(28,4%) 0,27±0,01a(15,8%)
DEXA 2 0,32±0,01(22,7%) 0,35± 0,01b(21,9%) 0,33±0,03 b(21,7%) 0,34±0,006(10,9%) 0,32±0,01
192
Os valores são expressos como média ± E.P.M. volume do edema. Os
volumes das patas (ml) foram medidos através de pletismômetro antes da aplicação
de dextrano e depois nos tempos de observação (30, 60, 120,180 e 240min), a
diferença entre os volumes da pata (antes e depois da aplicação de dextrano) foi
considerado o volume do edema. Os valores entre parênteses representam a
porcentagem de inibição do edema em relação ao grupo controle que recebeu
apenas veículo. Veículo (água destilada, v.o.), Chá-verde (CV) nas doses de 10, 25
e 50 mg/Kg, v.o., Dexametasona (DEXA) 10 e 2 mg/Kg e associação de CV 10 com
DEXA 2 foram administrados 60 min antes da injeção intraplantar de carragenina.
Foram utilizados 8 animais por grupos. a vs Dexa 2, p<0,05 e b vs controle, p<0,05
(One-Way ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
8.1.3 Avaliação do potencial antinociceptivo do extrato padronizado do chá-
verde (CV) no modelo de contorções por ácido acético
O teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, baseado na
aplicação de um estímulo químico de alta intensidade (ácido acético) produzindo
uma resposta nociceptiva de curta duração, tem a desvantagem de ser inespecífico,
com a resposta sendo bloqueada por muitas classes de drogas, tais como, anti-
histamínicos, hipotensores, estimulantes e depressores do SNC (HENDERSHOT;
FORSAITH, 1959).
Neste teste, o CV nas doses de 25 e 50 mg/kg reduziu de forma significativa
(p<0,001) em 58 e 69% o número de contorções abdominais em relação ao grupo
tratado apenas com veiculo (grupo controle). No entanto, não houve diferença
significativa entre o número de contorções dos grupos CV 25 e 50. Já o grupo
tratado com Indometacina 10 mg/kg (v.o), usado como controle positivo, teve uma
redução das contorções dos animais de forma bastante significativa em 75%
(p<0,001) (Figura 70 e Tabela 15).
Os animais tratados com associação de CV 10 mg/kg com Indo, numa dose
baixa de 2 mg/kg, também tiveram uma redução (69%) bastante significativa do
número de contorções, demonstrando que o CV 10 promoveu uma potencialização
significativa do efeito antinociceptivo da Indo, já que a Indo de 2 mg/kg sozinha
reduziu em apenas 30% as contorções induzidas por ácido acético em relação ao
grupo controle (Figura 70 e Tabela 15).
193
Figura 70 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado com a Indometacina sobre as contorções por ácido acético Os resultados são expressos
como média ± EPM do número de animais por experimentos (8). b vs controle, p<0,05 e
a vs Indometacina 2, p<0,01 (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc)
Contr
ole
CV 5
CV 1
0
CV 2
5
CV 5
0
INDO 1
0
INDO 2
+CV 1
0
INDO 2
0
10
20
30
40
50
bb
b
b
b
ab
Nú
mero
de c
on
torç
ões
/ 2
0 m
in
194
Tabela 15 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) sozinho e associado com a Indometacina sobre as contorções por ácido acético
Grupo
Número de contorções
Redução (%)
CONTROLE 40,63 ± 3,85
CV 5
CV 10
35,80 ± 4,85
30,86 ± 4,16
CV 25 17,13 ± 4,85b 57,8
CV 50 12,75 ± 2,21 b 68,6
INDO 10 10,13 ± 1,60 b 75
CV 10 + INDO 2 mg/kg 28,33 ± 4,17 ab 69,2
INDO 2 mg/kg 28,40 ± 1,03 b 30
Os valores são expressos como média ± E.P.M. do número de contorções
dos animais (8) em 20 minutos submetidos ao teste. Os animais foram tratados
oralmente com grupo com água destilada (grupo controle), com Chá-verde (CV) nas
doses de 10, 25 e 50 mg/Kg, v.o., com Indometacina (INDO) nas doses de 10 e 2
mg/Kg e com associação de CV 10 com INDO 2 uma hora antes da aplicação de
ácido acético no abdômen dos animais . Os resultados são expressos como média ±
EPM do número de animais por experimentos (8). b vs controle, p<0,05 e a
vs
Indometacina 2, p<0,01 (One-Way ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc). Os
valores da redução (%) representam a porcentagem de inibição das contorções por
ácido acético em relação ao grupo controle que recebeu apenas veículo.
195
8.1.4 Avaliação do potencial antinociceptivo do extrato padronizado do chá-
verde (CV) sozinho ou associado com Morfina no modelo de nocicepção
induzida pela formalina
Um dos testes mais utilizados para avaliação do efeito antinociceptivo de
drogas é o teste da formalina, esta induz comportamento doloroso bifásico, a fase I,
fásica e rápida, ocorre estimulação direta dos nociceptores e a fase II, fase tônica e
prolongada, em que o estímulo doloroso é inflamatório.
Os animais que receberam apenas veículo (água destilada, grupo
CONTROLE) (76,75 ± 7,01 s) previamente à administração intraplantar de formalina
exibiram comportamento nociceptivo intenso de lambedura da pata. Os tratamentos
dos animais previamente com CV nas doses 10 mg/kg (60,13 ± 6,56, p<0,05), 25
mg/Kg (44,63 ± 3,60 s, p<0,001) e 50 mg/Kg (38,88 ± 3,07 s, p<0,001), na primeira
fase do teste, ou seja, 0 - 5 minutos, foram capazes de reduzir em 21.6, 41.8 e
49.3%, respectivamente, o tempo de lambedura da pata (Figura 71).
Na primeira fase do teste, o pré-tratamento com Morfina 7,5 mg/Kg, i.p.
(controle positivo) foi capaz de reduzir com significância o tempo de lambedura da
pata nos animais do grupo que a receberam (28,88 ± 3,87 s, p<0,001) em 62%. Já
os animais que receberam tratamento prévio com a associação de CV 10 com
Morfina 4 mg/kg e com Morfina 2 mg/kg tiveram os tempos de lambedura da pata
reduzidos, significantemente, em 63 (28.33 ± 4,17s) e 65% (26,71 ± 4,05s),
respectivamente. Ao compararmos a associação do CV com morfina 2 mg/kg com
Morfina 2 mg/kg sozinha (56,83±6,77s) podemos concluir que o CV 10 potencializou
o efeito antinociceptivo da Morfina 2 mg/kg, de forma significativa, na primeira fase
do teste da formalina (Figura 72).
A fim de observamos a participação dos receptores opioides no mecanismo
de ação do CV foi utilizado alguns grupos com tratamento prévio com Naloxona
(Antagonista opioide), no entanto não houve diferença significativa entre o grupo
tratado com CV 10 e o tratado com Naloxona + CV 10, logo, na primeira fase do
teste da formalina, a Naloxona não reverteu o efeito do CV 10. E como já era
esperado o grupo que recebeu Naloxona com Morfina 7,5 mg/Kg teve um aumento
no tempo de lambedura da pata em relação ao grupo que só recebeu morfina 7,5
mg/Kg, ou seja, o tratamento prévio com o antagonista opioide reverteu o efeito
antinociceptivo da morfina. Estatisticamente, verificamos que quando comparamos
196
entre si as diferentes doses de CV (10, 25 e 50 mg/kg), os animais tratados com CV
50 apresentaram um efeito antinociceptivo maior do que o grupo tratados com CV 10
(Figuras 72 e Tabela 16).
Na segunda fase do teste, ou seja, 20-25 min. após a aplicação de formalina,
o pré-tratamento com CV nas doses de 10 (11,83 ± 1,32 s, p<0,001) 25 (3,25 ±
1,04s) e 50 mg/Kg (1,12 ± 0,74 s, p<0,001) foi efetivo em diminuir,
significativamente, em 21,7, 67,1 e 90,9%, respectivamente, o tempo de lambedura
comparado aos animais que receberam apenas veículo, grupo controle (36,00 ± 4,60
s) (Figura 73 e Tabela 17).
Já a morfina 7,5 mg/kg reduziu significantemente o tempo de lambedura da
pata em 97,8% (0,75 ± 0,41s, p<0,001) em comparação com os animais que
receberão apenas o veículo (grupo controle). A associação de CV 10 com Morfina 4
mg/kg e com Morfina 2 mg/kg foi muito eficiente em reduzir a lambedura da pata em
92,8 (2,57± 0,92s, p<0,001) e 79,1% (7,5 ± 2,14s, p<0,001), respectivamente, em
comparação com o grupo controle (Figura 74 e Tabela 17).
Verificamos que o CV 10 potencializou, significativamente, o efeito
antinociceptivo da Morfina 2 mg/kg quando usados em associação em comparação
com a Morfina 2 mg/kg usada sozinha na 2ª fase. O tratamento prévio com Naloxona
reverteu o efeito antinociceptivo da Morfina e do CV 10, confirmando o envolvimento
do receptor opioide no mecanismo de ação do extrato padronizado do chá-verde. Na
segunda fase do teste da formalina, observamos que os animais tratados com CV 25
e 50 tiveram um efeito antinociceptivo maior do que os tratados com CV 10, no
entanto, não houve diferença significativa entre os grupos tratados com CV 25 e CV
50 (Figura 74).
197
Figura 71 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) na 1ª fase do teste da formalina em camundongos. Os animais foram previamente tratados com extrato
padronizado do chá-verde (CV) nas doses de 5,10,25 e 50 mg/Kg (CV 5,CV 10,CV 25, CV50) 60 min antes injeção de formalina 1%. O grupo controle é aquele que só
recebeu água destilada (veículo). A naloxona (5 mg/kg, i.p) foi administrada 30 min antes da aplicação do CV. O tempo de lambedura foi registrado no intervalo de 0-5
min. após a aplicação de formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). b vs controle, p<0,05 (veículo) (One-Way
ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc)
Con
trol
e
CV 5
CV 1
0
CV 2
5
CV 5
0
CV 1
0 +
Nal
oxon
a
0
20
40
60
80
100
bb
b
Tem
po
da l
am
bed
ura
da p
ata
(s)
198
Figura 72 - Efeito da Morfina (nas doses 2, 4 e 7.5 mg/kg, i.p) e da associação de CV com Morfina na 1ª fase do teste da formalina em camundongos. O grupo controle é
aquele que só recebeu água destilada (veículo). A naloxona (5 mg/kg, i.p) foi administrada previamente a Morfina 7,5 mg/kg, i.p e ao CV 10 mg/kg, v.o, bem como
foi administrada sozinha. O tempo de lambedura foi registrado no intervalo de 0-5 min. após a aplicação de formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do
número de animais por experimentos (6-8). a vs Morfina+Naloxona, p<0,001; b vs controle, p<0,001 (veículo) e c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,01 (One-Way ANOVA Student-
Newman-Keuls, post hoc)
Contr
ole
MORF 7
.5
MORF 4
+CV 1
0
MORF 2
MORF 4
CV 1
0+ M
ORF 2
MORF 7
.5+N
aloxo
na
Nal
oxona
0
20
40
60
80
100
ab bb
bc
Tem
po
da l
am
bed
ura
da p
ata
(s)
199
Tabela 16 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), Morfina e da Naloxona sozinha e associada com CV 10 e Morfina sobre a 1ª fase da nocicepção induzida por
formalina
Grupo
Tempo de Lambedura(s)
Redução (%)
CONTROLE 76,75 ± 7,01
CV 5
CV 10
65,38 ± 2,38
60,13 ± 6,56b
21,6
CV 25 44,63 ± 3,60b 41,8
CV 50 38,88 ± 3,07 b 49,3
MORF 7,5 mg/Kg 28,88 ± 3,87 ab 62,4
CV 10 + MORF 4 mg/kg 28,33 ± 4,17 b 63,1
MORF 4 mg/kg 19,83 ± 2,83b 74,1
MORF 2 mg/kg 56,83 ± 6,77
CV 10 + MORF 2 mg/kg 26,71 ± 4,05 bc 65,2
MORF 7,5 + Naloxona 5 mg/kg 68,75 ± 5,20
CV 10 + Naloxona 5 mg/kg 64,88 ± 4,66
Naloxona 5 mg/kg 68,29±6,09
Os valores representam a média ± E.P.M do tempo de lambedura da pata
direita traseira . Os animais foram previamente tratados com extrato padronizado do
chá-verde (CV) nas doses de 5,10,25 e 50 mg/Kg (CV 5,CV 10,CV 25, CV50), com
associação de CV 10 (v.o) com morfina 2 mg/kg (i.p) ou com 4 mg/kg, com Morfina
(MORF) nas doses de 7,5 mg/Kg, 4 mg/kg e 2 mg/kg i.p. 30 min ou 60 min
(dependendo da via de administração, se for via oral foi 60 e se for i.p foi 30 min)
antes injeção de formalina 1%. Além disso, em alguns grupos foi feito tratamento
200
prévio com Naloxona (5 mg/kg, i.p) sozinha ou associada com CV 10 ou com Morfina
7,5 mg/kg. O grupo controle é aquele que só recebeu água destilada (veículo). O
tempo de lambedura foi registrado no intervalo de 0-5 min. após a aplicação de
formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais
por experimentos (6-8). a vs Morfina+Naloxona, p<0,001; b vs controle, p<0,001
(veículo) e c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,01 (One-Way ANOVA Student-Newman-
Keuls, post hoc).
201
Figura 73 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV) na 2ª fase do teste da formalina em camundongos. Os animais foram previamente tratados com extrato
padronizado do chá-verde (CV) nas doses de 5,10,25 e 50 mg/Kg (CV 5,CV 10,CV 25, CV50) 60 min antes injeção de formalina 1%. O grupo controle é aquele que só
recebeu água destilada (veículo). A naloxona (5 mg/kg, i.p) foi administrada 30 min antes da aplicação do CV. O tempo de lambedura foi registrado no intervalo de 20-25 min. após a aplicação de formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8).b vs controle, p<0,001 (veículo) e d vs
CV 10 + Naloxona, p<0,001 (One-Way ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc)
Con
trol
e
CV 5
CV 1
0
CV 2
5
CV 5
0
CV10
+Nal
oxon
a
0
10
20
30
40
50
bd
bbT
em
po
da lam
bed
ura
da p
ata
(s)
202
Figura 74 - Efeito da Morfina (nas doses 2, 4 e 7.5 mg/kg, i.p) e da associação de CV com Morfina na 2ª fase do teste da formalina em camundongos. O grupo controle é
aquele que só recebeu água destilada (veículo). A naloxona (5 mg/kg, i.p) foi administrada previamente 30 min antes da Morfina 7,5 mg/kg, i.p e do CV 10 mg/kg, v.o, bem como foi administrada sozinha. O tempo de lambedura foi registrado no
intervalo de 20-25 min. após a aplicação de formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (6-8). ). a vs Morfina 7.5 +
Naloxona, p<0,001; b vs controle, p<0,001 (veículo) e c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,01 (One-Way ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc)
Contr
ole
MORF 7
.5
MORF 4
+CV 1
0
MORF 2
MORF 4
CV 1
0+ M
ORF 2
MORF 7
,5 +
Nal
oxona
Nal
oxona
0
10
20
30
40
50
ab b bbc
Tem
po
da l
am
bed
ura
da p
ata
(s)
203
Tabela 17 - Efeito do extrato padronizado do chá-verde (CV), Morfina e da Naloxona
sobre a 2ª fase da nocicepção induzida por formalina
Grupos Tempo de lambedura da
pata(s)
Redução (%)
CONTROLE 36,00 ± 4,60 -
CV 5
CV 10
28,17 ± 2,96
11,83 ± 1,32bd
-
21,7
CV 25 3,25 ± 1,04 b 67,1
CV 50 1,12 ± 0,74 b 90,9
MORF 7,5 mg/Kg, i.p 0,75 ± 0,41 ab 97,9
CV 10 + MORF 4 mg/kg 2,57± 0,92 bc 92,8
MORF 4 mg/kg 3,33 ± 1,66 b 90,7
MORF 2 mg/kg 29,20 ± 4,25 -
CV 10 + MORF 2 mg/kg 7,50 ± 2,14 b 79,7
MORF 7,5 + Naloxona 5 mg/kg 29,00 ± 2,36 -
CV 10 + Naloxona 5 mg/kg 29,50 ± 2,30 -
Naloxona 5 mg/kg 33,40 ± 2,50 -
Os valores representam a média ± E.P.M do tempo de lambedura da pata
direita traseira. Os animais foram previamente tratados com extrato padronizado do
chá-verde (CV) nas doses de 5,10,25 e 50 mg/Kg (CV 5,CV 10,CV 25, CV50), com
associação de CV 10 (v.o) com morfina 2 mg/kg (i.p) ou com 4 mg/kg, com Morfina
(MORF) nas doses de 7,5 mg/Kg, 4 mg/kg e 2 mg/kg i.p. 30 min ou 60 min
(dependendo da via de administração, se for via oral foi 60 e se for i.p foi 30 min)
antes injeção de formalina 1%. Além disso, em alguns grupos foi feito tratamento
prévio com Naloxona (5 mg/kg, i.p) sozinha ou associada com CV 10 ou com Morfina
7,5 mg/kg. O grupo controle é aquele que só recebeu água destilada (veículo). O
tempo de lambedura foi registrado no intervalo de 20-25 min. após a aplicação de
204
formalina. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais
por experimentos (6-8). a vs Morfina 7.5 + Naloxona, p<0,001; b vs controle, p<0,001
(veículo);c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,01 e d vs CV10+Naloxona, p<0,001 (One-Way
ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc).
8.1.5 Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da Indometacina (10 e
2 mg/kg) e da associação de CV com Indometacina sobre a hiperalgesia
térmica induzida por carragenina no teste de Hargreaves
No teste de Hargreaves o comportamento nociceptivo é avaliado como a
sensibilidade ao calor (nocicepção térmica), determinada pela latência de retirada da
pata do raio de luz após a administração intraplantar de carragenina na pata traseira
de ratos. Este é também um importante teste utilizado para avaliar a atividade
antinociceptiva periférica associada à atividade anti-inflamatória. Observamos que
os animais tratados apenas com veículo (grupo controle) após a injeção de
carragenina na pata tiveram uma menor latência de retirada da pata nos tempos
observados (1ª, 3ª e 4ª hora após a aplicação de carregenina) (Tabela 18).
Enquanto que na 1ª hora após a aplicação de carragenina, apenas o grupo
tratado com Indometacina 10mg/kg foi capaz de aumentar, significativamente, a
latência de retirada da pata (Figura 75). Na 3ª hora, o tratamento com CV 10
(12,90±0,35s) e com associação de CV 10 + Indo 2 (19,00±1,15s) aumentou
significativamente a latência de retirada da pata em relação ao grupo controle
(tratado só com água destilada) (8,84±0,34s), já a Indo de 10 e 2 mg/kg aumentou
em 17,13±0,47 e 12,03±0,16s a latência de retirada da pata no teste,
respectivamente (Figura 76). Na 4ª hora, os tratamentos com CV 10, com
associação de CV10 + Indo 2 e Indo 2 sozinha foram efetivos em aumentar o tempo
de latência de retirada da pata, conforme podemos ver na Figura 76 e na Tabela 18.
O grupo tratado com associação de CV 10 + Indo 2 potencializou, significativamente,
o efeito antinociceptivo da Indometacina 2 mg/kg, caracterizado pelo aumento da
latência de retirada da pata, quando comparado com o grupo que recebeu apenas
Indometacina 2 mg/kg na 3ª e 4ª hora após a aplicação de carragenina (Figuras 76 e
77).
205
Figura 75 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar (método de Hargreaves) após 60min da aplicação de carragenina por via plantar em ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por
experimentos (8). a vs controle; b vs normal e c vs Indometacina 2 mg/kg com p< 0,01 (One-Way ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc). Os animais controle são
aqueles que foram tratados com água destilada e após 60 min deste tratamento foi injetado na pata carragenina, e os normais são aqueles que receberam tratamento
com água destilada e que não foram submetidos a aplicação de carragenina na pata.
Contr
ole
CV 1
0
CV 1
0 +I
ndo 2
Indo 1
0
Indo 2
Norm
al0
5
10
15
20
abc
abc
Carragenina
b
Latê
ncia
de r
eti
rad
a d
a p
ata
(s)
206
Figura 76 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar (método de Hargreaves) após 180min da aplicação de carragenina por via plantar em
ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (8). a vs controle; b vs normal e c vs Indometacina 2 mg/kg com p< 0,01
(One-Way ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc). Os animais controle são aqueles que foram tratados com água destilada e após 180 min deste tratamento foi injetado na pata carragenina, e os normais são aqueles que receberam tratamento
com água destilada e que não foram submetidos a aplicação de carragenina na pata.
Contr
ole
CV 1
0 m
g/kg
CV 1
0 +In
do 2
Indo 1
0
Indo 2
Norm
al
0
5
10
15
20
25
ab
abcabc
ab
b
Carragenina
Latê
ncia
de r
eti
rad
a d
a p
ata
(s)
207
Figura 77 - Efeito do CV sozinho e associado com Indometacina no teste plantar (método de Hargreaves) após 240 min da aplicação de carragenina por via plantar em
ratos. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (8). a vs controle; b vs normal e c vs Indometacina 2 mg/kg com p< 0,01
(One-Way ANOVA Student-Newman-Keuls, post hoc). Os animais controle são aqueles que foram tratados com água destilada e após 240 min deste tratamento foi injetado na pata carragenina, e os normais são aqueles que receberam tratamento
com água destilada e que não foram submetidos a aplicação de carragenina na pata.
Contr
ole
CV 1
0
CV 1
0 +In
do 2
Indo 1
0
Indo 2
Norm
al0
5
10
15
20
25
Carragenina
b
abc
abc
Latê
ncia
de r
eti
rad
a d
a p
ata
(s)
a
a
208
Tabela 18 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da Indometacina (10 e 2 mg/kg) e da associação de CV com Indometacina sobre a hiperalgesia térmica
induzida por carragenina no teste de Hargreaves
Tempo de retirada da
pata (s)
Grupos
60 min 180 Min. 240 Min.
Controle
12,17 ± 0,36b 8,84 ± 0,34b 8,50±0,59b
CV 10 11,73 ± 0,50 12,90± 0,35 ab 13,07±0,28a
CV 10 + INDO 2
14,12 ± 0,56abc 19,00 ±1,15abc 19,56±1,09abc
INDO 10
15,50±1,15abc 17,23±0,47abc 16,27±0,79abc
INDO 2
11,82±0,59 12,03± 0,16 ab 10,77±0,47a
NORMAL
11,88±0,53 11,37± 0,22 12,36±0,54
Os valores representam a média ± E.P.M do tempo de latência de retirada da
pata direita traseira em segundos após a aplicação de carragenina 1%. Os animais
foram previamente tratados oralmente com extrato padronizado do chá-verde (CV)
nas doses de 10 mg/kg, com associação de CV 10 mg/kg com Indo 2 mg/kg e com
Indometacina de 10 mg/kg 45 min antes da carragenina na pata traseira dos ratos.
Os animais normais são aqueles que foram tratados apenas com água destilada e
que não foram administrados carragenina na pata. Já o grupo controle é aquele que
recebeu água destilada 45 min antes da aplicação de carragenina nos ratos. O
tempo de lambedura foi registrado nos tempos 60, 180 e 240min após a aplicação
de carragenina. Foram utilizados 8 animais por grupo, sendo a vs controle; b vs
normal e c vs Indometacina 2 mg/kg com p< 0,01 (One-Way ANOVA Student-
Newman-Keuls, post hoc).
209
8.1.6 Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina (4 mg/kg e
2 mg/kg) e da associação de CV com Morfina no teste nocicepção térmica
na placa quente
Os grupos de animais que receberam veículo (grupo controle tratado com
água destilada, v.o.) tiveram um tempo de latência maior exibindo maior
comportamento nociceptivo. O tratamento com morfina 4 mg/Kg, droga de
referência, foi capaz de aumentar significativamente (p<0,001) o tempo de latência
para o inicio da nocicepção em relação ao grupo tratado apenas com veículo (Grupo
Controle) (Figura 78 e Tabela 19).
Também os tratamentos com CV nas doses de 25 e 50 mg/kg foram capazes
de aumentar, significantemente (p<0,01), o tempo de latência de retirada da pata. No
entanto, não houve diferença significante entre os grupos tratados com CV 25 e 50.
Já o CV 10 quando associado com a morfina de 2 mg/kg foi efetivo em aumentar o
tempo de latência de retirada da pata de maneira significativa (p<0,001) em relação
ao grupo controle. Percebemos também que o CV 10 potencializou de forma
significativa o efeito antinociceptivo da morfina de 2 mg/kg, já que o grupo que
recebeu apenas esta ultima droga não foi capaz de aumentar o tempo de latência de
retirada da pata. Os resultados podem ser vistos na Figura 78 e Tabela 19.
210
Figura 78 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina (4 e 2 mg/kg) e da associação de CV com Morfina no teste nocicepção térmica na placa
quente. Os resultados são expressos como média ± EPM do número de animais por experimentos (8). Neste teste foi verificado a resposta dos animais após serem postos
na placa aquecida (51 ± 0,5 ºC), esta resposta consiste em saltar ou lamber a pata traseira. b vs controle, p<0,01 e c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,05 (One-Way ANOVA e
Student-Newman-Keuls, post hoc)
CONTR
OLE
CV 5
CV 1
0
CV 2
5
CV 5
0
MORF 4
MORF 2
+CV 1
0
MORF 2
0
10
20
30
40
b
b b
Latê
ncia
de r
eti
rad
a d
a p
ata
(s)
bc
211
Tabela 19 - Efeito do extrato padronizado do chá verde (CV 10), da morfina (2 e 4 mg/kg) e da associação de CV com Morfina no teste nocicepção térmica na placa
quente
GRUPOS
TEMPO DE LATÊNCIA DE RETIRADA
DA PATA (s)
CONTROLE 12,13 ± 1,09
CV 5 11,50 ± 1,46
CV 10 13,25 ± 1,31
CV 25 18,13 ± 1,14b
CV 50 19,50 ± 1,33 b
MORF 4 28,38 ± 1,11 b
CV10 + MORF 2 22,00 ± 1,59 bc
MORF 2 16,00 ± 1,46
Os valores representam a média ± E.P.M do tempo necessário para os
animais exibirem respostas frente ao estímulo térmico, registrados após os
tratamentos com CV nas doses de 5, 10, 25 e 50 mg/Kg, v.o., com CV 10 associado
com Morfina 2 mg/kg, com veículo (água destilada v.o, grupo controle) e com
Morfina (nas doses de 2 e 4 mg/Kg, i.p). A resposta consiste em saltar ou lamber a
pata traseira após serem postos na placa aquecida (51 ± 0,5 ºC). Foram utilizados 8
animais por grupo. b vs controle, p<0,01 e c vs Morfina 2 mg/kg, p<0,05 (One-Way
ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
212
DISCUSSÃO
213
9 DISCUSSÃO
A DP é a segunda desordem neurodegenerativa mais comum após a doença
de Alzheimer. É uma doença crônica, progressiva e multifatorial, e resulta da perda
de neurônios dopaminérgicos na substancia negra parte compacta. A depleção
progressiva da dopamina ocasiona o aparecimento de alterações motoras e não
motoras. A causa da DP é ainda desconhecida e as opções terapêuticas atuais são
apenas sintomáticas (WONG; GILMOUR; RAMAGE-MORIN, 2014).
Apesar de extensas pesquisas ainda não há nenhum tratamento definitivo
para a DP levando cada vez mais pesquisadores em todo o mundo a buscar novas
terapias capazes de retardar ou, idealmente, parar a neurodegeneração
dopaminérgica. É evidente a necessidade de mais estudos sobre a levodopa, sobre
a própria DP, e sobre novas opções terapêuticas. Estas novas opções terapêuticas
devem ser compostos capazes de atravessar a BHE e produzir os efeitos
farmacológicos desejados com poucos efeitos colaterais (NAKAGAWA; MIYAZAMA,
1997).
Atualmente, existem vários modelos experimentais de DP que são capazes
de reproduzir a perda de neurônios dopaminérgicos e outras características
fisiopatológicas da doença, sendo essenciais para o desenvolvimento de novos
agentes terapêuticos (MEREDITH; SONSALLA; CHESSELET, 2008). A primeira
neurotoxina utilizada para induzir parkinsonismo experimental foi a 6-
hidroxidopamina (6-OHDA) (UNGERSTEDT, 1968).
Essa neurotoxina tem estrutura semelhante à dopamina e à noradrenalina e
possui alta afinidade para o transportador de membrana plasmática destas
catecolaminas e seu mecanismo de toxicidade consiste na sua entrada nos
neurônios catecolaminérgicos, onde é rapidamente oxidada e produz peróxido de
hidrogênio e quinonas, que são altamente tóxicos, além de inibir o complexo I e IV
da cadeia transportadora de elétrons (MEREDITH; SONSALLA; CHESSELET,
2008). A excessiva geração de espécies reativas do oxigênio produzida por 6-OHDA
provoca estresse oxidativo levando a lesão e morte celular por apoptose (BLUM et
al., 2001; TAKATA et al., 2005; HANROTT et al., 2006). A 6-OHDA também provoca
a ativação da micróglia com consequente neuroinflamação. Este modelo é um dos
mais usados para estudar a DP, pois a 6-OHDA causa lesão/destruição seletiva dos
neurônios dos sistemas catecolaminérgicos (DAUER; PRZEDBORSKI, 2003). No
214
entanto, este modelo não reproduz todas as características fisiopatológicas e
clínicas da DP, como, por exemplo, a formação de inclusões citoplasmáticas
(corpúsculos de Lewy) (HIRSCH et al., 2003).
Apesar da disponibilidade de novos modelos para DP, a 6-OHDA permanece
sendo a ferramenta experimental mais utilizada para induzir a lesão nigroestriatal em
ratos (BLANDINI; ARMENTERO; MARTIGNONI, 2008), pois este modelo torna mais
acessível a evidenciação de danos motores através de testes específicos, como no
caso de lesões unilaterais que promovem assimetria, como por exemplo o teste
rotacional induzido por apomorfina, que é o “gold standard” para avaliar a magnitude
da perda nigroestriatal (UNGERSTEDT; ARBUTHNOTT, 1970). Assi sendo, este foi
o modelo utilizado nesta pesquisa.
A Camellia sinensis é uma espécie da família Theaceae, popularmente
conhecida como chá-verde (CV). O CV é a bebida mais consumida, além de água,
no Japão, China e outras nações asiáticas, sendo considerado como um produto
seguro pela Food and Drug Administration (FDA) (WU; WEI, 2002). Este produto
natural e seus compostos bioativos, as catequinas, tem sido alvo inúmeras
pesquisas a respeito do seu potencial para a prevenção e tratamento do câncer,
doenças cardiovasculares, doenças inflamatórias, envelhecimento e doenças
neurodegenerativas (HOLLMAN; FESKENS; KATAN, 1999, LAU; SHUKITT-HALE;
JOSEPH, 2005; WEIBURGER; CHUNG, 2002).
Estudos epidemiológicos tem evidenciado que o consumo de chá-verde pode
proteger contra doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (TAN;
ALVAREZ; JENSEN, 2006; HELLENBRAND et al., 1996; NG et al., 2008;
CHECKOWAY et al., 2002). Alguns trabalhos do nosso laboratório de
Neurofarmacologia da UFC já demonstraram o efeito neuroprotetor da catequina e
cafeína, que também está presente no CV, em modelo de DP induzida por 6-OHDA
em ratos (MACHADO-FILHO et al., 2014; TEIXEIRA, 2011). Embora haja vários
estudos sobre os efeitos neuroprotetores do chá verde e de suas catequinas a
maioria deles utiliza modelos in vitro de DP (VARÇIN et al., 2012; CHEN et al., 2012;
LORENZEN et al., 2014; LEE et al., 2013; LOPEZ; CALVO, 2011; CHAO et al.,
2010; TAI et al., 2010; MOLDZIO et al., 2010; RAZA; JOHN, 2008; NIE et al., 2002;
LEVITES et al., 2002). Assim, há relativamente poucos trabalhos que estudaram
estes produtos naturais em modelos animais de DP (LEVITES et al., 2001; CHOI et
al., 2002; GUO et al., 2007; KIM, 2010; AL-AMRI; HAGRAS; MOHAMED, 2013).
215
Portanto, resolveu-se avaliar o efeito neuroprotetor do extrato padronizado do
chá-verde (CV) (Camellia sinensis) de seus principais principios bioativos, as
catequinas (EC e EGCG), no modelo experimental de DP induzida por 6-OHDA em
ratos. Para isso, estudamos as alterações comportamentais, neuroquímicas e
imunohistoquímicas de animais controle, lesionados por 6-OHDA após o tratamento
de 14 dias com as drogas estudadas.
Procurou-se também relacionar os efeitos neuroprotetores do CV com as
suas propriedades antiinflamatórias, por isso avaliamos o efeito deste produto
natural em modelos de inflamação e nocicepção, pois estudos tem evidenciado a
correlação da neuroinflamação com a fisiopatologia das doenças
neurodegenerativas, particularmente, com a DP (WHITTON, 2007; WILMS et al.,
2007; TANSEY; GOLDBERG, 2010; LU et al., 2010; CUNNINGHAM, 2012).
Estudamos também efeitos da combinação do CV com L-DOPA com o objetivo de
verificar possível efeito sinérgico entre esta associação. Nos modelos de inflamação
e nocicepção, também estudou-se o efeito da associação do CV com as drogas de
referências dos respectivos testes (Indometacina, Dexametasona e Morfina) a fim de
verificou-se possível efeito sinérgico que pudesse contribuir para a redução dos
efeitos colaterais dessas drogas.
216
DISCUSSÃO
Testes Comportamentais
217
10 DISCUSSÃO: TESTES COMPORTAMENTAIS
10.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS COMPORTAMENTAIS
O teste rotacional induzido por apomorfina continua sendo a referência inicial
para determinação da magnitude da perda dos neurônios dopaminérgicos. O
desequilíbrio no conteúdo de dopamina entre os lados esquerdos e direito do
cérebro causa a assimetria rotacional observada, onde o animal apresenta rotações
oriundas do lado cerebral de maior atividade devido á presença de um maior de
neurônios dopaminérgicos viáveis. O agonista dopaminérgico apomorfina induz
rotações contralaterais ao lado lesionado, também porque estimula o lado do corpo
estriado que se encontra desinervado, apresentando uma up regulation dos
receptores D2 (UNGERSTEDT, 1971; DEUMENS; BLOKLAND; PRICKAERTS,
2002). Esse comportamento estereotipado é resultado da intensa perda de
neurônios dopaminérgicos que ocorre no local da lesão (KELLY; IVERSEN, 1975;
CASTALL et al., 1977; AGUIAR et al., 2006; HEUER et al., 2012).
Nossos resultados demonstraram que animais lesionados com a 6-OHDA
exibiram um grande número de rotações contralaterais à lesão (74 vezes a mais do
que o grupo falso-operado), corroborando com resultados de outros trabalhos que
mostraram que lesões extensas promovidas pela 6-OHDA acarretam este tipo de
comportamento esteriotipado (METZ; WHISHAW, 2002; SINGH et al., 2006;
BALUCHNEJADMOJARAD; ROGHANI, 2006; RIZELIO et al., 2010; YU et al., 2010).
O tratamento oral com CV (nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg), EC e EGCG
(na dose de 10 mg/kg), L-DOPA (nas doses de 25 e 50 mg/kg) e associação de CV
25 mg/kg com L-DOPA 25 mg/kg diminuiram de maneira significativa as rotações
contralaterais induzidas por apomorfina. Resultados semelhantes foram obtidos com
a catequina e a EGCG que reverteram também os déficits motores promovidos pela
6-OHDA no teste da apomorfina (TEIXEIRA, 2013; BALUCHNEJADMOJARAD;
ROGHANI, 2006). Então, os tratamentos com o CV e catequinas durante 14 dias
reduziram o número de rotações contralaterais no teste da apomorfina, o que denota
um possível efeito neuroprotetor provavelmente mediado pela preservação dos
níveis de dopamina no corpo estriado, o que foi comprovado pelos resultados dos
níveis estriatais de monoaminas neste mesmo trabalho.
218
A lesão estriatal por 6-OHDA pode ocasionar alterações na atividade
locomotora e coordenação motora dos ratos, esses parâmetros foram avaliados
neste trabalho através dos testes do campo aberto e rota rod (RIZELIO et al., 2010).
No teste do campo aberto, os animais lesionados por 6-OHDA apresentam redução
significativa do número de cruzamentos em comparação com o grupo F.O (falso
operado), sendo tal redução revertida pelo tratamento com CV (50, 100 e 200
mg/kg), EC e EGCG (10 mg/kg), L-DOPA (25 e 50 mg/kg) e com associação de CV
25 com L-DOPA 25 mg/kg.
No teste do rota rod, os animais lesionados por 6-OHDA e tratados com água
destilada (grupo controle 6-OHDA) apresentarem um maior número de quedas e um
menor tempo de permanência na barra giratória em relação ao animais do grupo F.O
corroborando com outros estudos que comprovaram que ratos lesionados por 6-
hidroxidopamina tem prejuízo da coordenação motora (THOMAS TAYRA et al.,
2013; DIDONET et al., 2014). Os tratamentos com CV (25 e 50 mg/kg), EC e EGCG
(10 mg/kg), L-DOPA (25 e 50 mg/kg) e com associação de CV 25 + L-DOPA 25
foram eficazes em reverter estes pârametros.
Estes resultados, mais uma vez, demonstram que o CV e as catequinas
reverteram ás alterações comportamentais resultantes da lesão estriatal por 6-
OHDA. Também observamos que o CV 25 mg/kg potencializou, de forma
significativa, o efeito da L-DOPA 25 mg/kg nos testes do campo aberto, apomorfina
e rota rod. Estudos realizados tanto com extrato do chá verde quanto com a EGCG
in vivo relataram uma potente atividade destas substâncias em prevenir a perda de
dopamina no estriado de camundongos (LEVITES et al., 2001), sendo este um dos
possíveis mecanismos pelo qual estes compostos atuam para produzir melhora da
atividade locomotora e comportamental dos animais.
Em um trabalho realizado por Kumar e Kumar (2009) foi demonstrado que a
EGCG melhorou a atividade locomotora de animais com dano cerebral induzido pelo
ácido-3 nitropropiônico e esta catequina administrada oralmente melhorou a
performance de animais submetidos a lesão induzida por MPTP em testes motores
(LEAVER et al., 2009). Um estudo com extrato de chá preto mostrou que este
composto foi capaz de melhorar a atividade locomotora dos animais que havia sido
prejudicada pela 6-OHDA (CHATURVEDI et al., 2006). Outro trabalho evidenciou
que o tratamento com catequina (10 e 30 mg/kg, i.p) melhorou a atividade motora de
ratos submetidos a DP experimental (TEIXEIRA, 2011), sendo assim, todos estes
219
estudos descritos anteriormente apoiam os nossos resultados que comprovam que o
tratamento com CV, catequinas e com a associação de CV com L-DOPA foram
eficazes em melhorar a atividade locomotora dos ratos lesionados com 6-OHDA.
Os mecanismos pelos quais o CV e as catequinas promovem recuperação
motora dos animais lesionados com 6-OHDA ainda não está totalmente elucidado,
mas alguns trabalhos demonstram que as catequinas melhoram a utilização de
gordura como fonte de energia em animais submetidos a exercício físico, levando a
uma melhor performance motora destes animais (MURASE et al., 2006). Bem como,
o CV e a própria EGCG podem inibir as enzimas COMT e MAO-B (enzimas que
degradam as catecolaminas) in vitro, elevando assim, os níveis de noradrenalina e
dopamina, e aumentando a estimulação do sistema nervoso simpático e
consequentemente o metabolismo basal (BORCHARDT; HUBER, 1975; LU; MENG;
YANG, 2003).
Sabe-se que 30 a 60% dos pacientes parkinsonianos apresentam sintomas
depressivos em alguma fase da doença. Embora considerada reativa a uma
condição que limita a atividade normal, pacientes com DP, constumam ter
depressão mais frequentemente se comparados a pacientes portadores de outras
doenças crônicas e incapacitantes, muitas vezes a depressão se incia-se antes
mesmo do aparecimento dos sintomas clássicos, sendo a complicação
neuropsiquiátrica mais comum na DP (FERRAZ, 2005).
Dentro deste contexto, muitos estudos sugerem que alterações na
neurotransmissão dopaminérgica (CANTELLO et al., 1986), noradrenégica (CHAN-
PALAY; ASAN, 1989) e serotoninérgica (MAYEUX et al., 1984) são as bases
biológicas dos sintomas depressivos associados à doença de Parkinson. Neste
sentido, o teste do nado forçado está freqüentemente associado à alteração do
sistema monoaminérgico. Alguns estudos, como o de Remy et al., 2005, sugere que
a depressão e ansiedade presentes na DP podem estar associadas com uma perda
específica de inervações dopaminérgicas e noradrenérgicas no sistema límbico. De
acordo com Detke, Rickels, Lucki (1995), os inibidores da recaptação de
noradrenalina aumentaram o tempo de escalada, sem alterar o tempo de natação, e
os inibidores da recaptação de serotonina aumentaram o tempo de natação sem
alterar o tempo de escalada. Além disso, Hemby et al. (1997) também descreveram
que os inibidores seletivos da recaptação de dopamina aumentaram o
comportamento de escalada neste teste. Portanto, o tempo de escalada mensurado
220
no teste da natação forçada está associado aos níveis de noradrenalina e dopamina;
o tempo de natação está associado aos níveis de serotonina, enquanto o tempo de
imobilidade está relacionado aos níveis de dopamina, noradrenalina e serotonina.
A lesão estriatal por 6-OHDA é capaz de induzir comportamento depressivo
nos animais verificados pelo teste do nado forçado (TADAIESKY, 2010; MENEZES,
2012). Neste teste verificamos que o tratamento oral com CV (50 mg/kg), com a
associação de CV25 + L-DOPA 25, com EC e EGCG (10 mg/kg) e com L-DOPA (50
mg/kg) foram capazes de reverter, de maneira significativa, os sinais depressivos
induzidos pela lesão estriatal por 6-OHDA ao diminuirem o tempo de imobilidade em
relação aos animais controle lesão. Corroborando com resultados de Wang et al.,
2012 que demonstraram o efeito antidepressivo dos polifenois do CV em
camundongos. Portanto, a administração de CV e catequinas atenuaram o
comportamento depressivo dos animais no teste do nado forçado, o que pode estar
relacionado a modulação dos sistemas monoaminérgicos e a melhora da atividade
locomotora. Assim, demonstramos que o CV, as catequinas e a associação CV+L-
DOPA foram eficazes não só em melhorar os sintomas motores dos animais
lesionados por 6-OHDA, mas também os não motores.
Achados clínicos e experimentais (CALABRESI et al., 2013) apontam o
envolvimento do hipocampo na disfunção cognitiva observada em doentes de
Parkinson. Aproximadamente 40% dos pacientes com DP complicada apresentam
comprometimento cognitivo (PAPAPETROPOULOS et al., 2004; WILLIAMS-GRAY
et al., 2006). Até mesmo pacientes na fase inicial da DP podem apresentar déficits
de memória operacional e espacial, mesmo antes de apresentar problemas motores
(DUBOIS; PILLON, 1997). Isto é evidenciado em alguns pacientes com DP que
apresentam dificuldade com a memória recente, na atenção, concentração e em
atividades que requerem orientação espacial (FERRAZ, 2005). Sabe-se que as
lesões que afetam os gânglios da base, como a DP, podem causar sintomas
cognitivos, comprometendo funções especialmente relacionadas ao córtex frontal.
Além disso, o SNc envia muitas aferências dopaminérgicas para o estriado dorsal,
logo é de se esperar que lesões nesta estrutura provoquem déficits cognitivos em
testes de memória espacial. Assim, dados recentes sugerem interações entre o
sistema dopaminérgico e o hipocampo na plasticidade sináptica, memória e
comportamento. Esta última estrutura está também envolvida na fisiopatologia de
221
outros sintomas não motores como distúrbios do controle de impulsos, anosmia e
fadiga.
Essa memória operacional ou de trabalho pode ser definida como uma
memória de curta duração para estímulos ou localizações espaciais. Há um
armazenamento de uma informação temporária que será utilizada para o
planejamento de uma ação futura (DUDCHENKO, 2004). Vários estudos têm
evidenciado que á lesão estriatal com 6-OHDA promove déficits na memória
espacial dos animais lesionados (CUNHA et al., 2001; MIYOSHI, 2002; CUNHA et
al., GEVAERD et al., 2001; GEVAERD; TAKAHASHI; CUNHA, 2001; TANILA et al.,
1997; SCHNEIDER; KOVELOWSKI, 1990).
Para avaliar a memória espacial dos ratos submetidos á lesão estriatal por 6-
OHDA realizamos o teste do labirinto aquático. Neste teste, observamos que os
animais lesionados demoraram mais tempo para encontrar a plataforma em relação
ao grupo falso-operado, corroborando com estudos anteriores que demostraram que
a 6-OHDA quando injetada na SNc, provoca déficit da memória espacial no teste de
labirinto aquático (FERRO et al., 2005; LINDNER et al., 1999; SAMPAIO, 2014).
Podemos sugerir, também, que esse maior tempo que os animias lesionados
tiveram para encontrar a plataforma pode ser devido a problemas motores e/ou
comportamento rotatório; tigmotaxia e dificuldade em aprender que existe uma
plataforma submersa.
Os tratamentos com CV 50, com a associação de CV25 com L-DOPA 25 e
com EC e EGCG 10 por via oral foram eficazes em reduzir, de maneira significativa,
o tempo de encontro da plataforma no teste do labirinto aquático, mostrando que
essas drogas foram eficazes em reduzir os déficits cognitivos dos ratos lesionados
por 6-OHDA. Os resultados sugeriram ainda que o CV 25 potencializou o efeito da L-
DOPA 25 mg/kg neste teste. Estudos com as catequinas do chá verde em modelos
animais têm mostrado que estas substâncias protegem a memória de déficits
associados ao envelhecimento (UNNO et al., 2007; KISHIDO et al., 2007;
ANDRADE; ASSUNÇÃO, 2012), bem como previnem contra danos associados a
aprendizagem espacial (LI et al., 2009).
Trabalho recente comprovou que as catequinas melhoraram a memória de
ratos ao restaurar o teor de dopamina e noradrenalina no mesencéfalo (TEIXEIRA et
al., 2013). Outro estudo demonstrou que a epicatequina (EC) melhorou a memória
através do aumento da angiogênese no giro dentado do hipocampo (VAN PRAAG et
222
al., 2007). Yoo e cols. (2010) evidenciaram que a administração oral de EGCG
aumentou a proliferação celular, diferenciação de neuroblastos e maturação
neuronal na zona subgranular do giro dentado de camundongos. Enquanto que Lee
e cols. (2009) estudando um modelo de Doença de Alzheimer mostraram que a
EGCG preveniu o dano na memória de animais através da inibição da via ERK/NF-
κB.
Portanto, de acordo com estes trabalhos, são vários os mecanismos possíveis
pelos quais o extrato padronizado do chá-verde e suas catequinas (EC e EGCG)
protegem a memória e auxiliam na melhora do aprendizado dos ratos lesionados
com 6-OHDA.
223
DISCUSSÃO
Efeitos Neuroquímicos do CV e catequinas sobre dopamina e
metabolitos
224
11 DISCUSSÃO: EFEITOS NEUROQUÍMICOS DO CV E CATEQUINAS SOBRE
DOPAMINA E METABOLITOS
11.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS NEUROQUÍMICOS DO CV E CATEQUINAS
SOBRE DOPAMINA E METABOLITOS
Sabe-se que pacientes com DP apresentam uma perda substancial de
dopamina no corpo estriado resultante da destruição de neurônios dopaminérgicos
na substancia negra parte compacta. Tanto estudos bioquímicos quanto os de
diagnóstico por imagem sugerem que uma diminuição de pelo menos 70% nos
níveis de dopamina estriatal ocorre antes do início dos sintomas clínicos do
parkinsonismo progredindo ao longo do tempo (BROOKS, 1998). Estas estimativas
da depleção dopaminérgica, associada à observação de que a maioria dos
neurônios dopaminérgicos são degenerados nos estágios finais da doença, implica
na existência de morte celular substancial ao longo do processo patológico na DP
(COOKSON, 2009).
Entretanto, enquanto há uma relativa vulnerabilidade de neurônios
dopaminérgicos na substancia negra, nem todas as células dopaminérgicas são
afetadas. Por exemplo, as lesões são menos extensas nos neurônios
dopaminérgicos presentes na área tegmental ventral (ATV) que se projetam para o
núcleo accumbens em comparação com os neurônios dopaminérgicos
nigroestriatais (DICKSON, 2007; HIRSCH, 1994; CHUNG et al., 2005, SURMEIER,
2007). Bem como, nem todos os neurônios afetados na DP são dopaminérgicos,
tornando os sintomas não motores um grave problema para muitos pacientes com
DP, em geral não beneficiados pela terapia com L-DOPA. Recentemente (SAWADA;
OEDA; YAMAMOTO, 2013), mostrou-se que na DP, ocorre degeneração tanto de
terminais noradrenérgicos pós-sinápticos quanto de neurônios dopaminérgicos
mesencefálicos. Outro exemplo de células não dopaminérgicas que também
degeneram na DP são os neurônios colinérgicos no núcleo vagal dorsal. Portanto,
sugere-se o envolvimento de outras regiões cerebrais que não a substancia negra
no desenvolvimento de características clínicas complexas da DP (LANGSTON,
2006, GAI et al., 1992; JELLINGER, 1999).
Importante ressaltar também que a excitotoxicidade glutamatérgica é
responsável pela morte neuronal em várias doenças neurológicas incluindo a DP.
225
Ocorre perda da homeostase para o cálcio na morte celular induzida por glutamato.
Sabe-se que a dopamina modula a sinalização do cálcio mesmo na presença de
concentrações fisiológicas de glutamato. DA é assim capaz de proteger neurônios
da morte induzida por glutamato e de prevenir a desregulação do cálcio em
neurônios corticais, hipocampais e mesencefálicos (VAARMANN et al., 2013).
A despeito das considerações acima, a dosagem de dopamina e seus
metabolitos (HVA e DOPAC) é um importante parâmetro no estudo da doença de
Parkinson, por isso fizemos as determinações dos neurotramissores e de seus
metabolitos no estriado direito e esquerdo dos ratos lesionados com 6-OHDA e dos
falso-operados. O presente estudo mostrou que a injeção estriatal de 6-OHDA
provocou dano neuronal dopaminérgico como indicado pela redução das
concentrações de dopamina, DOPAC e HVA no lado ipsilateral em 82, 84 e 78 %,
respectivamente, quando comparado com lado contralateral do mesmo grupo, bem
como houve redução de dopamina e seus metabólitos também no estriado direito
dos ratos lesionados em comparação com o mesmo lado do grupo falso-operado.
Esses resultados foram consistentes com estudos anteriores que descreveram as
mudanças bioquímicas no estriado degenerado após a injeção intracelular de 6-
OHDA (ZIGMOND; STRIKER,1989; ICHITANI et al., 1994), que levou a diminuição
da função dopaminérgica e os níveis de dopamina e seus metabolitos.
Os tratamentos por via oral com o extrato padronizado do CV (nas doses de
25 ou 50 mg/kg), com as catequinas (EC e EGCG, na dose de 10 mg/kg), com a L-
DOPA 25 mg/kg e com a associação de CV 25 com L-DOPA 25 em ratos lesionados
com 6-OHDA aumentaram os níveis estriatais de dopamina no estriado direito,
indicando um potencial neuroprotetor desses produtos naturais na DP. Portanto,
esses resultados apontam para um efeito benéfico do CV e das catequinas nesta
patologia. Estudos têm mostrado que CV e catequinas aumentam os níveis de
dopamina no estriado através da prevenção da morte dos neurônios dopaminérgicos
e do aumento da taxa de disparos desses neurônios na substância negra em ratos
(LEVITES et al., 2001; JEONG et al. 2007). Evidencias recentes (MIRZA et al., 2013)
mostraram que os efeitos benéficos do chá verde podem ser devido também a
alterações no metabolismo da dopamina e da serotonina.
Portanto, o CV e catequinas produziram efeito neuroprotetor ao reverter ás
mudanças comportamentais e neuroquímicas induzidas por 6-OHDA. Assim sendo,
os possíveis mecanismos de ação deste produto natural e de seus princípios
226
bioativos podem envolver várias vias de sinalização intracelular como a ativação de
proteína quinase C (LEVITES et al., 2003) e da fosfatidilinositol-3-quinase (PI-3
quinase)-Akt (KOH et al., 2003), a inibição via ERK1/2 (LEVITES et al., 2002;.
SCHROETER et al., 2001; SATOH et al., 2000), inibição da MAO-B e COMT (LIN et
al., 2010; KANG et al., 2013) e a inibição das vias pró-apoptóticos e do estresse
oxidativo (CHOI et al., 2001; NG et al., 2012; MANDEL et al., 2004).
Além disso, os polifenóis do CV exercem outras atividades farmacológicas
como a inibição da recaptação de DA, o que pode estar contribuindo diretamente
para o aumento de dopamina e metabolitos evidenciado neste trabalho. Somado a
isto, sabe-se ainda que as catequinas promovem regulação negativa dos genes pró-
apoptóticos, como os que codificam caspases, fator de necrose tumoral e regulação
positiva dos genes anti apoptoticos, como Bcl-2 e Bcl-x (LEVITES et al. 2002). Chao
e cols. (2010) sugeriram que a EGCG aumenta a sobrevivência das células através
da via sinalizadora Akt, uma proteína quinase que é responsável pela inibição da
apoptose e down-regulation das proteínas envolvidas na cascata apoptótica, o que
reduz a morte neuronal dopaminérgica e contribui para o aumento da dopamina no
estriado. Fato confirmado por Al-Amri, Hagras E Mohamed (2013) que evidenciou
que a EGCG aumentou os níveis de dopamina através da preservação da morte
neuronal dopaminérgica.
Todos esses múltiplos alvos celulares regulados pelo CV e/ou catequinas
contribuíram para o aumento de dopamina no estriado, redução do estresse
oxidativo e prevenção da morte celular, contribuindo, assim, para o efeito
neuroprotetor da Camellia sinensis e seus princípios bioativos. Portanto,
considerando-se as opções terapêuticas limitadas na DP, agentes neuroprotetores
estão sendo testados objetivando minimizar a progressão da doença. Assim sendo,
agentes que têm como alvo o estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e
inflamação são candidatos em potencial, dentre estes futuros candidatos estão o CV
e catequinas (SEIDI; POTASHKIN, 2011).
227
DISCUSSÃO
Atividade Antioxidante
228
12 DISCUSSÃO: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
12.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS ANTIOXIDANTES
Reações normais do nosso corpo envolvem a produção de radicais livres,
principalmente de ROS (especies reativas de oxigênio). No entanto, em
determinadas situações a produção descontrolada de ROS pode ameaçar a
homeostase e causar danos nas nossas células; isto ocorre quando os antioxidades
naturais são insuficientes ou quando a produção de radical livre é excessiva. Esse
desequilibrio leva a um processo chamado de estresse oxidativo (EO) (KOPPULA et
al., 2012).
O cérebro é particularmente susceptível ao ataque das ROS, pois as células
nervosas contém lipidios insaturados que são sensíveis a peroxidação lipidica, além
disso, o cérebro não dispõe de grande quantidades de antioxidantes naturais
(FLOYD; CARNEY, 1992). Principalmente, os neurônios dopaminérgicos da
substancia negra pars compacta são sensíveis ao estresse oxidativo devido a serem
ricos em ferro, dopamina e neuromelanina. O dano oxidativo sobre as biomoléculas
neuronais, o aumento do acúmulo de ferro em áreas específicas do cérebro e os
processos inflamatórios com proliferação de microglia reativa são considerados
importantes aspectos patológicos do processo de envelhecimento e de doenças
neurodegenerativas (GERLACH et al., 2003; SELKOE; SCHENK, 2003).
Particularmente na DP, ocorre estresse oxidativo decorrente de vários fatores, como:
disfunção mitocondrial, neuroinflamação, redução dos antioxidantes naturais,
expressão de alfa-sinucleína e metabolismo do ferro (GUTTERIDGE; HALLIWELL,
1989; SCHAPIRA et al., 1989; MCGEER et al., 1988). Portanto, o estresse oxidativo
desempenha importante papel no desenvolvimento da DP e substâncias
antioxidantes podem ter um potencial neuroprotetor.
Por isso, investigamos os efeitos do CV e das catequinas sobre o estresse
oxidativo in vivo e in vitro, a fim de estudarmos o seu efeito na prevenção do dano
oxidativo neuronal. Os resultados deste trabalho demonstraram que a 6-OHDA
promoveu um aumento significativo dos níveis de nitrito, indicador indireto de EO, e
TBARS, um indicador do grau de peroxidação lipídica, no estriado dos ratos.
Diversos artigos reportam que a lesão nigroestriatal induzida por 6-OHDA causa
aumento nos níveis de nitrito (SINGH et al., 2006; GUO et al., 2007) e aumento da
229
peroxidação lipídica (AHMAD et al., 2005; GUO et al., 2007; KABUTO; TADA;
KOHNO, 2007; KHAN et al., 2010; NOBRE JUNIOR et al., 2003) pela indução da
produção de peróxido de hidrogênio e espécies reativas do oxigênio, como radical
hidroxil, e também pela inibição do complexo I mitocondrial.
Os tratamentos com extrato padronizado do CV na dose de 50 mg/kg e com a
associação de CV 25 com L-DOPA 25 foram efetivos em diminuir os níveis de
TBARS e nitrito, assim como as catequinas (EC e EGCG, nas doses 10 mg/kg).
Nossos resultados corroboram com outros trabalhos que mostraram que o CV e
catequinas diminuem o estresse oxidativo através da redução do conteúdo de
nitrato/nitrito e da peroxidação lipídica (NOBRE-UNIOR et al., 2003; GUO et al.,
2007). Recentemente, também foi comprovado que as catequinas esterificadas,
como EGCG e EC, possuem maior capacidade antioxidante, e que outros
compostos presentes no CV também podem contribuir para o seu efeito antioxidante
(ZHAO et al., 2014).
As catequinas possuem na sua estrutura um grupo hidroxila altamente reativo
que fica oxidado pela doação de elétrons, desta forma estabiliza o radical livre,
transformando-o em uma molécula menos reativa (WEINREB et al., 2009). A EGCG,
a principal catequina presente no chá verde, tem sido extensamente estudada por
suas já conhecidas propriedades antioxidantes e pela sua atividade como quelante
de metais (WEINREB et al., 2009). Na realidade, a atividade antioxidante das
catequinas do chá-verde está associada ao número de grupos hidroxila, as que
possuem de 3 a 6 grupos de hidroxila na sua estrutura química tem melhor efeito
antioxidante, por isso a epigalocatequina 3-galato (EGCG) parece ter melhor efeito
antioxidante. Portanto, a atividade antioxidante do chá-verde é dependente da sua
composição química, principalmente do teor de catequinas, sabe-se que teores
elevados destes polifenois são encontrados nas folhas verdes da Camellia sinensis
(LEE et al., 2014).
Estudos mostraram que a EGCG elevou a atividade de duas enzimas
metabolizadoras de ROS, a superóxido dismutase (SOD) e catalase, no estriado de
ratos submetidos á lesão estriatal (LEVITES et al., 2001; KOMATSU; HIRAMATSU,
2000). Atualmente, várias drogas, como curcumina e ácido valproico, tem
demonstrado diminuir as lesões associadas á injeção intracerebral de 6-OHDA
através da redução do TBARS e nitrito (LOPES, 2012; XIMENES, 2012).
230
As catequinas (como EGCG) têm propriedades antioxidantes decorrentes da
eliminação de radicais livres, de sua propriedade quelante sobre metais e da sua
capacidade de aumentar a atividade antioxidante de enzimas, tais como a
superóxido dismutase e catalase, que resulta na atenuação do estresse oxidativo
(WEINREB et al., 2009).
Além desses ensaios que avaliaram a atividade antioxidante do CV in vivo,
realizamos também estudo in vitro para verificar o potencial antioxidante de C.
sinensis em neutrófilo humano estimulado por PMA através de Quimioluminescência
(QL). A quimioluminescência é um importante método para estudar a produção de
ROS, em tempo real, por fagócitos ativados. Para amplificar a quimioluminescência
produzida por fagócitos durante a explosão oxidativa são utilizadas sondas
quimioluminescentes, como o luminol e lucigenina que diferem com relação a sua
sensibilidade resultante de diferentes mecanismos moleculares que levam à
emissão de luz (KOPPRASCH; PIETZCH; GRAESSLER, 2003). O luminol é capaz
de reagir com uma variedade de agentes oxidantes, em uma reação onde ele é
oxidado a um íon aminoftalato eletronicamente excitado, que retorna a um estado
basal emitindo fóton (ALLEN; LOOSE, 1976). Ainda não existe um consenso a
respeito de quais espécies oxidativas reagem com o luminol, mas sabe-se que ele
detecta diversos tipos de ROS, embora haja maior sensibilidade para aquelas
envolvidas no sistema MPO-H2O2 (DAHLGREN; STENDAHL, 1983).
Nos ensaios de quimioluminescência dependente de luminol (QLlum), o CV
em diferentes concentrações (0,1 - 100 µg/mL) exibiu atividade modulatória do
metabolismo oxidativo dos neutrófilos bastante expressiva, comprovando o efeito
antioxidante do CV agora em testes in vitro que pode estar relacionado a modulação
do sistema MPO-H2O2. Estes resultados foram semelhantes aos encontrados por
Yen et al. (2013) que confirmaram o efeito protetor do extrato aquoso do chá verde
sobre o estresse oxidativo in vitro através da inibição da geração de ROS e da
formação de MDA.
231
DISCUSSÃO
Análise Histológica e Imunohistoquímica
232
13 DISCUSSÃO: ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA
Sabemos que o modelo de DP induzida por 6-OHDA promove não só
alterações motoras, mas também déficits de memória e aprendizado associados á
diminuição de células dopaminérgicas na substancia negra e redução de neurônios
no estriado e no hipocampo (SAMPAIO, 2014). O hipocampo é particularmente
vulnerável a lesão estriatal por 6-OHDA. Além disso, pacientes com DP em fases
mais avançadas da doença podem apresentar déficits cognitivos relacionados pelo
menos em parte a disfunção hipocampal. Por isso, resolvemos avaliar os possíveis
efeitos do CV em estruturas hipocampais através de técnicas histológicas e
imunohistoquímicas.
O termo hipocampo é comumente utilizado para descrever conjuntamente
duas regiões interligadas: o giro denteado e o hipocampo propriamente dito (“Corno
de Amon”: CA). Ambos possuem uma organização interna, sendo as células
piramidais do CA divididas nos setores CA-1, CA-2 e CA-3. Os axônios das células
granulares (“fibras musgosas”) projetam-se para as células piramidais da região de
CA3, que por sua vez emitem fibras para a região de CA1, constituindo a chamada
“via colateral de Schaffer”. De CA1, as fibras projetam-se para o complexo subicular
e então para as camadas profundas do córtex entorrinal (CE). O circuito CE-GD-
CA3-CA1 é tradicionalmente denominado “via tri-sináptica” e utiliza o glutamato
como principal neurotransmissor.
Por meio de estudos histológicos utilizando a coloração de Nissl mostramos
que o CV, EGCG e associação de CV25+L-DOPA protegeram o hipocampo (áreas
CA-1 e CA-3) dos danos neuronais observados após a injeção intraestriatal
unilateral de 6-OHDA. Evidenciando o potencial do CV e das catequinas de reduzir
as lesões neuronais no hipocampo e as alterações não-motoras provocadas por
estas lesões.
Uma anormalidade neuroquímica consistente na DP é a degeneração de
neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta, levando à redução
dos níveis estriatais de DA. Como a Tirosina hidroxilase (TH) catalisa a formação da
ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), etapa limitante na biossíntese da DA, a DP
pode ser considerada uma síndrome deficitária de TH do corpo estriado.
Considerando-se que a TH é a enzima limitante para a biossíntese de DA, esta tem
um papel fundamental no desenvolvimento da DP. Acredita-se que a DA, regulada
233
pela atividade da TH, interage com a proteína alfa-sinucleína, resultando em
agregados intracelulares conhecidos como corpos de Lewy e levando, em última
análise, à morte celular por apoptose (NAKASHIMA et al., 2013). Estudos
evidenciaram que ocorre diminuição de TH no cérebro de pacientes com doença de
Parkinson.
Através da analise imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (T.H)
mostramos que o grupo lesionado por 6-OHDA apresentou uma drástica redução no
número de células TH-positivas (80%), no estriado direito, e essa alteração foi
revertida pelo tratamento com CV 25 e CV 25 associado com L-DOPA. Nossos
resultados corroboram com aqueles estudos que recente mostraram que o
tratamento com EGCG, a principal catequina presente no CV, foi capaz de aumentar
a densidade de TH nos neurônios (AL-AMRI; HAGRAS; MOHAMED, 2013). Li e
cols. (2006) mostraram também que o pré-tratamento com EGCG atenuou a perda
de T.H. em neurônios dopaminérgicos, o que pode estar relacionado a diminuição da
morte neuronal dopaminérgica, e inibiu a ativação da microglia em um modelo de DP
induzido por MPTP em células mesensefálicas.
Na Figura 79 abaixo podemos ver a representação esquemática de como a
ativação da microglia por toxinas, como 6-OHDA e MPTP, pode induzir a morte
neuronal. Estas toxinas promovem um aumento na expressão de COX-2, iNOS,
NADPH e citocinas (TNF-α e IL-1β). Bem como induzem a produção de ROS e PG’s
e a ativação do NF-kB que irá promover a morte neuronal dopaminérgica através da
indução da apoptose, dano no DNA e peroxidação lipídica (LITTELJOHN et al.,
2011). Portanto, na fisiopatologia da DP estão envolvidos várias enzimas, como
iNOS e COX-2, por isso resolvemos avaliar a expressão de COX-2 no estriado e
iNOS no hipocampo de ratos submetidos a lesão estriatal por 6-OHDA através da
técnica de imunohistoquímica. Discutiremos esses resultados a seguir.
234
Figura 79 - Visão geral de como toxinas como a 6-OHDA e MPTP provocam a neurodegeneração na doença de Parkinson modelos animais
Fonte: Litteljohn et al. (2011).
235
Atualmente, existem três isoformas de NOS já identificadas: a endotelial
(eNOS), a neuronal (nNOS) e a forma induzível (iNOS). A neurodegeneração tem
sido relacionada com a superexpressão de iNOS na SNpc tanto em estudos post-
mortem como em modelos animais de DP (IRAVANI et al., 2002). Em circunstancias
patológicas, a produção de NO é mediada pela ativação da iNOS, que não está
presente em cérebros saudáveis. Uma vez induzida, a iNOS produz níveis altos e
sustentados de NO que leva a neurotoxicidade via produção de radicais livres
(peroxinitrito) (LI et al., 2012). Na realidade, tanto o TNF-α quanto o NF-κB, este
último através da ativação de micróglia, estimulam a produção de óxido nítrico (NO)
via ativação da iNOS, o que aumenta o estresse oxidativo, exercendo efeitos
prejudiciais sobre as proteínas e o DNA celular (HALD; LOTHARIUS, 2005).
Portanto, está claro o envolvimento da NOS e do NO na fisiopatologia da DP,
pois estudos tem mostrado que os inibidores da NOS (principalmente iNOS)
produzem neuroproteção em um modelo animal de DP induzido por MPTP e devem
ser considerados em estudos futuros como uma ferramenta em potencial para
interromper ou atenuar a progressão do processo neurodegenerativo subjacente à
DP (PACHECO, 2006; GUO et al., 2007).
Dentro deste contexto, resolvemos avaliar a expressão de iNOS no
hipocampo (nas áreas CA-1, CA-3 e GD) de ratos submetidos a lesão estriatal com
6-OHDA e tratados com CV25 e EGCG através da imunohistoquímca. Observamos
que a lesão estriatal por 6-OHDA promoveu um aumento de 24, 129 e 10 vezes,
respectivamente, na imunomarcação para a para iNOS nas áreas CA-1, CA-3 e GD
do hipocampo de animais lesionados em relação aos animais falso-operados. Os
tratamentos com o CV 25 e EGCG foram efetivos em reduzir esta marcação para
iNOS nestas áreas dos animais lesionados. Portanto, nossos resultados corroboram
com outros trabalhos que mostraram que o CV e EGCG reduziram a expressão de
iNOS na substancia negra e outras regiões cerebrais de animais que foram
submetidos a lesão estriatal induzida por MPTP (CHOI et al., 2012; KIM et al., 2010;
GUO et al., 2007). Também foi demonstrado que o extrato do chá verde inibiu a
expressão de iNOS em linhagem de células epiteliais humanas (TEDESHI et al.,
2004). Além disso, EGCG e EC reduziram significativamente a produção de NO a
partir das três isoformas de NOS, incluindo iNOS (WANG et al., 2013). Portanto, as
propriedades anti-inflamatórias e anti-oxidantes do CV são certamente justificadas
pela inibição de enzimas pró-inflamatórias como a COX-2 e iNOS.
236
Somado a isso, sabe-se que a inibição da expressão de iNOS pode reduzir as
discinesias induzida por L-DOPA (PADOVAN-NETO et al., 2009), portanto drogas
como o CV/EGCG que inibem a expressão de iNOS podem auxiliar na redução dos
efeitos colaterais da L-DOPA, logo, o CV pode não só potencializar o efeito da L-
DOPA, conforme confirmado neste trabalho, como também reduzir seus efeitos
colaterais.
Outra enzima importante na neuroinflamação da DP é a ciclooxigenase
(COX) que catalisa a síntese de prostanóides, uma grande família de metabolitos do
ácido araquidônico que compreendem prostaglandinas, prostaciclina, e
tromboxanos. A COX existe em isoformas constitutivas e induzíveis. A COX-2 é a
isoforma induzível, rapidamente expressa em vários tipos de células em resposta a
fatores de crescimento, citocinas e moléculas pró-inflamatórias. Esta enzima no
cérebro tem sido associada a atividades pró-inflamatórias que se acredita serem
fundamentais para os processos de várias doenças neurodegenerativas, como a DP
(MINGHETTI, 2014).
A expressão de COX-2 é particularmente aumentada em neurônios durante
as fases iniciais de processos neurodegenerativos (HOOZEMANS et al., 2005).
Classicamente, a ativação de ciclooxigenases e produção de prostaglandinas são
consideradas patológicas, promovendo, direta ou indiretamente, lesão neuronal (SUI
et al., 2009). Hald e Lotharius (2005) mostraram que a COX-2 está presente em
níveis drasticamente aumentados no cérebro de pacientes com Parkinson. Esta
enzima atua como catalisadora da oxidação da dopamina para dopamina-quinona
na presença de H2O2 in vitro o que contribui para a agregação de α-sinucleina (SUI
et al., 2009).
Nossos resultados confirmaram esses achados, demonstramos um aumento
de quatro vezes na expressão de COX-2 no estriado direito de animais submetidos á
lesão estriatal por 6-OHDA em comparação ao mesmo lado do grupo falso operado.
Observou-se também uma diminuição significativa na imunomarcação para COX-2
no estriado direito dos animais tratados com o CV 25, EGCG 10 e com a associação
de CV + L-DOPA. Alguns estudos já mostraram que o chá verde e suas catequinas
diminuíram a expressão de COX-2, no entanto, a maior parte deles foi realizado em
células cancerígenas humanas (SHIMUZU et al., 2005; HUSSAIN et al., 2005; PENG
et al., 2006; LIU et al., 2013). Portanto, a diminuição da expressão de COX-2 pode
contribuir para neuroproteção, pois foi evidenciado que a redução da COX-2 reduziu
237
os efeitos deletérios de MPTP na via nigroestriatal (TEISSMANN; SCHULZ, 2004),
bem como, impediu a formação de espécies oxidantes, dopamina-quinona,
implicada na patogênese de DP (TEISSMANN et al., 2004; TEISSMAN et al., 2003).
Em todos os experimentos realizados neste trabalho demonstramos que o CV
potencializou o efeito da L-DOPA, o que pode ser devido a inibição da metilação da
L-DOPA através do bloqueio da COMT, bem como o CV também pode contribuir o
para o efeito terapêutico da L-DOPA, pois este produto natural tem múltiplas ações
neuroprotetoras, como a atividade antiinflamatória, antioxidante e antiapoptótica.
Estudos já demonstraram atividade sinérgica da associação de EGCG com
rasagilina (inibidor MAO-B), em que ambas as drogas contribuem de forma sinérgica
para a restauração dos níveis de dopamina e dos neurônios no estriado
(REZNICHENKO et al., 2010; LIN et al., 2010). A associação de memantina
(antagonista dos receptores NMDA do glutamato) com polifenois do CV também
demonstrou efeito neuroprotetor contra a excitoxicidade em cérebro de ratos (CHEN
et al., 2008). Dentro deste contexto, percebemos que o CV e catequinas possuem
atividade inibitória sobre duas enzimas importantes no metabolismo dopaminérgico:
MAO e COMT, mas como a inibição destas enzimas pode auxiliar/potencializar o
efeito da terapia com L-DOPA?
Sabemos que na ingestão oral de L-DOPA sozinha a maior parte dela é
metabolizada perifericamente através da descarboxilação, com isso, menos de 1%
chega ao SNC, por isso se adiciona um inibidor periférico da descarboxilase
(benserazida ou carbidopa), como foi o caso deste trabalho, em que utilizamos a
associação de L-DOPA com benserazida, para que ocorra aumento da
biodisponibilidade central da L-DOPA. Com isso, o metabolismo da L-DOPA é
desviado para a COMT que a converte em 3-O-metildopa (ANDRADE; FERRAZ,
1997; TETRUD; LANGSTON, 1989). Esse desvio metabólico acaba por fazer uma
produção considerável de 3-O-metildopa, especula-se que este metabolito seja um
dos responsáveis pelas flutuações motoras observadas em usuários de L-DOPA
(RECHES; FAHN, 1982), sendo uma dos importantes efeitos colaterais deste
fármaco. Por isso, como o CV/catequinas bloqueiam a COMT central e periférica
(KANG et al., 2013), estes produtos naturais podem promover um aumento da
biodisponibilidade central e redução dos efeitos colaterais da L-DOPA, além de
aumentarem os níveis de dopamina no estriado.
238
Já a MAO é uma enzima que catalisa uma reação de deaminação oxidativa,
ou seja, ela é responsável pelo metabolismo das monoaminas. Birkmeyer e cols, em
1975, tratando pacientes com DP com L-DOPA e selegilina (inibidor de MAO-B)
puderam demonstrar um aumento do efeito da L-DOPA e diminuição das flutuações
motoras causadas por este medicamento. A dopamina ao ser metabolizada pela
MAO-B gera a formação de peróxido de hidrogênio, que em condições normais é
neutralizado por antioxidantes endógenos (SOD, catalase), mas em situações em
que estes estejam deficientes (como é o caso de pacientes com DP), o peróxido de
hidrogênio pode formar radicais hidroxilas combinando-se com íons ferro, este
mecanismo pode gerar lesão oxidativa neuronal a partir de um turnover de
dopamina, durante o tratamento com L-DOPA (ANDRADE; FERRAZ, 1997). Então o
uso associado de CV/catequinas com L-DOPA poderia evitar esta lesão, ao bloquear
o metabolismo oxidativo da dopamina via MAO-B.
Apesar dos benefícios evidenciados da associação dos CV/catequinas com
drogas de referência no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a L-
DOPA, mais estudos pré-clínicos e clínicos são necessários para melhor
compreender os mecanismos de ação envolvidos neste efeito e segurança desta
associação.
Outro achado relevante deste trabalho foi evidenciar o efeito neuroprotetor do
CV em doses baixas (25 e 50 mg/kg) e em modelo in vivo de DP, já que muitos
trabalhos mostraram este mesmo efeito in vitro e com doses maiores (LEVITES et
al., 2002; 2003; CHEN, 2013). Com doses menores de CV teremos menos efeitos
colaterais, portanto, este produto natural e seus princípios bioativos devem ser
considerados em estudos futuros como ferramentas em potencial para interromper
ou atenuar a progressão do processo neurodegenerativo subjacente à DP.
239
DISCUSSÃO
Atividade Antiinflamatória e Antinociceptiva
240
14 DISCUSSÃO: ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
14.1 CV E CATEQUINAS: EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIO E ANTINOCICEPTIVO
A participação da inflamação na fisiopatologia da doença de Parkinson tem
sido confirmada por diversos autores. Tem sido reportado que a expressão de COX-
2 é induzida especificamente em neurônios dopaminérgicos presentes na SNc. Este
fato já foi verificado em mesencéfalos especialmente no modelo animal induzido por
MPTP durante a destruição da via nigroestriatal (TEISSMANN et al., 2003). Outras
evidências da importância do papel da COX-2 na mediação da neurodegeneração
dopaminérgica nigroestriatal são referentes ao uso de inibidores da COX-2, que por
sua vez apresentam efeito neuroprotetor (KURKOWSKA-JASTRZEBSKA et al.,
2002). Além disso, também ocorre um aumento na ativação da microglia no SNc e
estriado de pacientes portadores da doença de Parkinson idiopática, o que contribui
para a neuroinflamação (MCGEER; MCGEER, 1998).
Muitos estudos epidemiológicos indicam que a utilização prolongada de
AINEs está associada a um risco menor de DP por mecanismos dependentes e
independentes da inibição da COX (MOORE et al., 2010). De acordo com Chen et
al. (2003), o uso prolongado de antiinflamatórios não esteroidais em humanos foi
capaz de reduzir em aproximadamente 45% o risco de desenvolvimento da Doença
de Parkinson e este resultado foi corroborado por outros antiinflamatórios utilizados
em modelos animais de parkinsonismo. De fato, Feng et al. (2002) demonstraram
que a depleção da isoforma COX-2 resultou na neuroproteção contra administração
de MPTP, bem como Teissmann et al. (2003) mostrou que esta neuroproteção
contra o MPTP estaria associada não somente à redução da ativação da microglia,
mas também ao bloqueio da oxidação dopaminérgica mediada pela COX-2.
Estudo recente comprovou que o tratamento crônico com ácido salicilico no
modelo de Parkinson induzido por rotenona atenuou os níveis de mediadores
inflamatórios, reduziu a expressão de COX-2 e iNOS, além de suprimir os níveis do
fator de transcrição NK-kB e de citocinas pro-inflamatórias como o TNF-α (THAKUR;
NEHRU, 2013). Neste contexto, vários candidatos a agentes neuroprotetores, como
a curcumina e o ácido valproico, tem demonstrado ação neuroprotetora decorrente
de suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes que podem leva-los a terem
241
um potencial terapêutico na doença de Parkinson (TIZABI et al., 2014; XIMENES,
2012).
É importante salientar que mesmo os AINEs apresentando efeitos benéficos
sobre a progressão da doença e sendo, portanto uma ferramenta de intervenção
neuroprotetora, a utilização a longo prazo destes agentes não é viável. Isso deve-se
ao fato de que esta classe de fármacos apresenta efeitos colaterais potencialmente
perigosos a longo prazo, sobretudo, sobre o trato gastrointestinal e função renal,
sendo portanto necessária a contínua busca por agentes antiinflamatórios que
causem menos efeitos colaterais.
Considerando esta questão, avaliamos o potencial antiinflamatório e
antinociceptivo da Camellia sinensis (Chá-verde), usando os testes do edema de
pata induzido por carragenina e dextrano (modelos de inflamação) e teste do
Hargreaves, das contorções por ácido acético, da placa quente e da formalina
(modelos de nocicepção), também fizemos associações do CV com as drogas de
referências para avaliar a ocorrência de efeito sinérgico.
A carragenina é um polissacarídeo sulfatado extraído a partir de algas
marinhas e que tem sido vastamente utilizado em testes animais para a indução de
inflamação sendo muito útil no “screening” de novas drogas antiinflamatórias
(SRIVASTAVA; KUMAR, 2013). É sabido que a injeção intraplantar de carragenina
induz resposta inflamatória, caracterizada por aumento tempo-dependente no
edema de pata, infiltração de neutrófilos e níveis aumentados de nitrito/nitrato e
PGE2 no exsudato (SALVEMINI et al., 1996). Estes autores observaram que o
edema foi máximo, em torno da 6a. hora, e permaneceu elevado por 10 horas após
a administração de carragenina. Sugeriram que o NO produzido pela enzima NOS
está envolvida no desenvolvimento da inflamação e presente, pouco tempo depois
da administração da carragenina, e também que o NO (produzido via iNOS) está
envolvido na manutenção da resposta inflamatória. Além disso, a injeção intraplantar
de carragenina aumenta os níveis de TNF-alfa, IL-1beta, IL-6, entre outras
substâncias, na pata inflamada (LORAM et al., 2007).
Por outro lado, o edema de pata induzido por dextrano é mediado,
principalmente, por histamina e serotonina liberadas de mastócitos, o que resulta em
alterações vasculares intensas como vasodilatação e aumento de permeabilidade
(LO; ALMIDA; BEAVEN, 1982).
242
Observamos, através da mensuração do volume da pata utilizando o
pletismógrafo, que a injeção intraplantar de carragenina/dextrano provocou
extravasamento de plasma e inflamação caracterizado pelo aumento de líquido no
tecido conjuntivo da pata do animal, e os tratamentos com as diferentes doses de
CV diminuíram significantemente o edema induzido por carragenina e dextrano em,
praticamente, todos os tempos observados. Evidenciamos que o CV antagonizou as
respostas inflamatórias induzidas tanto por carragenina quanto por dextrano,
possivelmente diminuindo a liberação de histamina e serotonina de mastócitos e
reduzindo a liberação de prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias,
especialmente o TNF-alfa. As associações de CV 10 com Indometacina ou
Dexametasona 2 mg/kg também foram eficazes em reduzir o edema de pata
induzido por carragenina e dextrano, respectivamente, demonstrando o efeito
sinérgico entre as associações.
A doença de Parkinson é uma afecção essencialmente motora. Entretanto, é
comum o aparecimento de dores musculares em várias regiões do corpo. As áreas
mais afetadas são os ombros, braços, membros inferiores e região lombar. Muitas
vezes o sintoma que mais incomoda é uma sensação de fadiga muscular que piora
em determinadas posições. A explicação mais comum leva em conta a ação do
tremor e da rigidez que resultam em aumento da atividade muscular. Por outro lado,
essas sensações dolorosas podem ocorrer mesmo quando os sintomas motores são
mínimos, o que sugere a existência de outros mecanismos envolvidos. Em alguns
casos, sensações dolorosas podem se manifestar meses antes do aparecimento dos
primeiros sintomas.
Estudos têm mostrado que a injeção unilateral e intra-estriatal de 6-
hidroxidopamina (6-OHDA) aumenta as respostas nociceptivas à estimulação
química e térmica da pata traseira dos animais lesionados. Estes dados fornecem
evidência adicional que o sistema dopaminérgico nigro-estriatal desempenha um
papel importante na modulação da informação nociceptiva (CHUDLER; LU, 2008).
Por isso, resolvemos avaliar o efeito antinociceptivo do extrato padronizado do CV,
bem como verificar o efeito da associação do CV com as drogas de referências dos
respectivos testes (Morfina e Indometacina).
Um dos testes mais utilizados para avaliação do efeito antinociceptivo de
drogas é o teste da formalina, esta induz comportamento doloroso bifásico, a fase I,
fásica e rápida, ocorre estimulação direta dos nociceptores e a fase II, fase tônica e
243
prolongada, em que o estímulo doloroso é inflamatório. Na fase inicial do teste da
formalina, quimioreceptores são ativados nos terminais nervosos periféricos de
aferentes primários, evocando assim a liberação de citocinas pró-inflamatórias que
levam à dor neurogênica (EISENBERG; VOS; STRASSMAN, 1993). A fase tardia do
teste é o resultado da sensibilização de neurônios dorsais da medula ou da
inflamação induzida pela hiperatividade de nociceptores aferentes ou, ainda, da
combinação desses dois fenômenos (GORDON et al., 1997).
Neste teste, embora o CV nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg, tenham inibido as
duas fases do teste, seus efeitos foram maiores na 2ª. fase (inflamatória) e não
houve diferença significativa entre as doses de CV. O controle positivo do teste, a
morfina (4 e 7,5 mg/kg), e a associação de CV 10 com morfina de 2 e 4 mg/kg
também foram eficazes em reduzir o tempo de lambedura da pata nas duas fases do
teste de forma significativa (p<0,05).
A Naloxona (antagonista opioide) foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo
da morfina, de maneira significativa, na 2ª. fase do teste, demonstrando um
envolvimento parcial dos receptores opioides no efeito antinociceptivo do chá-verde,
e este efeito pode estar relacionado também a redução do processo inflamatório.
Pois sabemos que a primeira fase do teste da formalina é sensível a drogas que
interagem com o sistema opióide, como a morfina, e a segunda fase é inibida por
anti-inflamatórios não esteróidais (AINES). Sendo assim, drogas de ação central
(opióides) são capazes de inibir ambas as fases, enquanto que drogas que atuam
perifericamente agem somente inibindo a segunda fase (ROSLAND et al., 1990). O
CV reduziu a nocicepção nas duas fases, no entanto, a naloxona só foi capaz de
reverter o efeito antinociceptivo na segunda fase, o que evidencia que este produto
natural tem ação central ativando os receptores opioides, mas também tem ação
periférica reduzindo o processo inflamatório. Resultados semelhantes foram
observados por Arzi et al. (2013) que demonstraram que o extrato do chá-verde
iraniano reduziu o comportamento nociceptivo na 1ª e 2ª fase do teste da formalina e
que a naloxona reverteu este efeito antinociceptivo.
Outro estudo mostrou que o extrato do CV produziu efeito antinociceptivo ao
reduzir as sensações e reflexos dolorosos em um modelo animal de neuropatia
periférica (RENNO et al., 2006). Pesquisa recente comprovou que o tratamento
agudo e crônico com a epicatequina produziu efeito antinociceptivo no teste da
formalina em ratos diabéticos e este efeito parece estar relacionado a ativação dos
244
receptores 5-HT1A e 5-HT1B, a modulação do canal K+/AMPc dependente e da via
NO/GMPc (QUIÑONEZ-BASTIDAS et al., 2013).
No teste da formalina demonstramos que o CV 10 potencializou, de forma
significativa, o efeito antinociceptivo da morfina representando uma possível
alternativa terapêutica para redução da dose de morfina e, consequentemente, dos
seus efeitos colaterais; no entanto, mais estudos são necessários para comprovar
este efeito e elucidar mecanismos de ação envolvidos.
No teste de Hargreaves o comportamento nociceptivo é avaliado como a
sensibilidade ao calor (nocicepção térmica), determinada pela latência de retirada da
pata do raio de luz após a administração intraplantar de carragenina na pata traseira
de ratos. Verificamos que os animais que tiveram carragenina injetada na pata e
foram tratados com CV 10 tiveram diminuição da hiperalgesia nos tempos 180 e 240
min após aplicação da mesma, aumentando o limiar de resposta ao estímulo
térmico. Neste teste, a associação de CV 10 com Indometacina 2mg/kg produziram
efeito sinérgico. O efeito de hiperalgesia pode ser responsabilidade (embora não
única) da liberação central e periférica de prostaglandinas em resposta a lesão
tecidual, sugerindo que o extrato do chá-verde pode agir inibindo a COX-2, o que
explica sua ação antiinflamatória e analgésica.
Evidências mostraram que o estímulo inflamatório ou injúria tecidual
estimulam a liberação de citocinas, que apresentam papel essencial na dor
inflamatória. Assim, citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-alfa e IL-1β, reduzem o
limiar nociceptivo para a dor mecânica ou térmica, após aplicação intraplantar
(CUNHA et al., 1992; FERREIRA et al., 1988; VERRI et al., 2006). Além disso,
trabalho recente propôs que a inibição da NOS modula a hiperalgesia térmica
inflamatória, através da regulação da expressão de citocinas (CHEN et al., 2010). A
própria EGCG mostrou atenuar a dor neuropática de ratos através da redução da
expressão de nNOS e dos efeitos pró nociceptivos do NO (CHOI et al., 2012).
No teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, que se
baseia na aplicação de um estímulo químico de alta intensidade (ácido acético)
produzindo uma resposta nociceptiva de curta duração, o CV de 10, 25 e 50 mg/kg e
a Indometacina 2 e 10 mg/kg reduziram, de forma significativa, o número de
contorções abdominais, e o CV 10 potencializou significativamente o efeito
antinociceptivo da Indometacina de 2 mg/kg. Já no teste da nocicepção térmica na
placa quente, o tratamento com CV (nas doses de 25 e 50 mg/kg) e a morfina de 4
245
mg/kg aumentou a latência de retirada das patas dos animais, assim como o
tratamento com a associação de CV 10 com morfina 2 mg/kg, em que o CV foi eficaz
em potencializar o efeito antinociceptivo da morfina.
Em um estudo sobre o efeito do CV na hiperalgesia térmica induzida por
lipopolissacarídeos (LPS) em camundongos, o chá-verde potencializou o efeito
antinociceptivo da nimesulida e do rofecoxib, e este efeito parece estar relacionado a
capacidade do CV de inibir a COX-2 (KAUR et al., 2005). A epicatequina, uma das
catequinas presentes no CV, apresentou atividade antinociceptiva no modelo da
nocicepção química induzida pelo glutamato, o que pode estar relacionado a
ativação de receptores opioides, de canais de K+/ATP dependentes, receptores
adrenérgicos (receptores α2), colinérgicos (muscarínicos) e serotoninérgicos (5-HT1A
e 2A) (LOPES et al., 2012). Logo, podemos sugerir que o efeito antinociceptivo do CV
é decorrente da ativação de receptores opioides e da redução do processo
inflamatório, no entanto, também pode haver o envolvimento de canal K+/ATP
dependente, da via NO/GMPc, de receptores serotoninérgicos, adrenérgicos e
muscarínicos neste mecanismo.
É importante relatar que realizamos, também, o teste de campo aberto para
avaliar se o extrato padronizado do chá-verde não causaria efeito inespecífico nos
ratos que prejudicasse a avaliação da resposta nociceptiva (sedação, prejuízo da
coordenação motora). Neste teste, o CV não alterou o número de cruzamentos dos
animais em relação aos animais que receberam apenas água destilada, portanto, o
extrato padronizado do CV não causou efeito sedativo nem prejuízos da
coordenação motora, não prejudicando a avaliação da atividade antinociceptiva feita
neste trabalho.
Portanto, sabendo que é comum o aparecimento de dores em várias partes
do corpo de pacientes com DP, o efeito antinociceptivo do CV comprovado neste
trabalho aponta-nos para mais um benefício deste produto natural.
246
DISCUSSÃO
Considerações Finais
247
15 DISCUSSÃO: CONSIDERAÇÕES FINAIS
O chá verde é considerado o quarto suplemento dietético mais usado, nos
EUA, e estudos de farmacocinética clínica e toxicológicos em animais indicam que o
consumo do extrato do chá verde com estômago vazio pode conduzir a efeitos
adversos, como a hepatotoxicidade, portanto, a presença de alimento pode reduzir
esse efeito tóxico (SARMA et al., 2008). Outro estudo (CHOW et al., 2003) concluiu
que é seguro para indivíduos saudáveis consumir polifenóis do chá-verde em
quantidades equivalentes a 8 a 16 xícaras de CV duas vezes ao dia durante 4
semanas. Estes autores também demonstraram que há um aumento superior a 60%
na disponibilidade sistêmica de EGCG após a administração crônica de polifenois do
chá verde com uma dose diária elevada de 800 mg.
É importante relatar que utilizamos doses baixas do extrato padronizado do
chá verde e de suas catequinas, epicatequina e epicatequina-3-galato, neste
trabalho, o que minimiza os seus efeitos colaterais. Além disso, considerando a
elevada taxa de consumo do chá verde em todo o mundo e seus efeitos benéficos
perante vários problemas de saúde, incluindo doenças neurodegenerativas, como
DP, estudos translacionais devem ser estimulados a fim de melhor compreender os
mecanismos de ação neuroprotetores do CV e de princípios bioativos. Neste
sentido, acreditamos que os efeitos anti-inflamatórias e anti-oxidantes desses
produtos naturais são, certamente, importantes para o seu efeito neuroprotetor,
tornando-as substâncias promissoras a serem investigados para a prevenção ou
tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson.
248
CONCLUSÃO
249
16 CONCLUSÃO
A análise dos resultados apresentados nesta pesquisa nos permitiu concluir
que:
a) o extrato padronizado do CV, a associação de CV + L-DOPA e as
catequinas (EC e EGCG) protegeram os animais dos danos motores
induzidos pela 6-OHDA;
b) os animais submetidos á lesão estriatal por 6-OHDA apresentarem
comportamento depressivo verificado no teste do nado forçado, o que foi
revertido pelo tratamento com CV (50 mg/kg); pela associação CV 25+L-
DOPA e catequinas (EC e EGCG);
c) a 6-OHDA promoveu déficit de memória espacial verificada no teste do
labirinto aquático e o CV (50 mg/kg), a associação CV 25+L-DOPA e as
catequinas (EC e EGCG) reverteram este déficit ao aumentar o tempo de
encontro da plataforma no respectivo teste;
d) ocorreu aumento do estresse oxidativo induzido pela injeção estriatal de
6-OHDA no estriado dos ratos que foi revertido pelo tratamento com CV
(50 mg/kg), a associação CV 25+L-DOPA e as catequinas (EC e EGCG);
e) o CV em diferentes concentrações (0,1 -100 µg/ml) reduziu a produção de
oxidantes por neutrófilos humanos estimulados por PMA, demonstrando o
efeito antioxidante do CV também in vitro;
f) a neurotoxina 6-OHDA promoveu depleção de dopamina e de seus
metabólitos DOPAC e HVA no estriado direito dos animais lesionados, o
que foi revertido pelo CV, pela associação CV 25+L-DOPA e pela EGCG;
g) a morte dos neurônios dopaminérgicos induzida por 6-OHDA foi
evidenciada pela diminuição da imunoreatividade para tirosina hidroxilase
(TH) no estriado direito. O tratamento com CV e com a associação CV
25+L-DOPA foi capaz de aumentar a imunomarcação para TH reduzindo
a neurodegeneração dopaminérgica;
h) a lesão estriatal por 6-OHDA promoveu destruição de neurônios no
hipocampo verificados através da coloração de Nissl, e o CV (25 e 50
mg/kg), a associação CV 25+L-DOPA e a EGCG atenuaram essas
alterações morfológicas neuronais;
250
i) a injeção intraestriatal de 6-OHDA promoveu neuroinflamação confirmada
pelo aumento da imunoreatividade para COX-2 e iNOS no estriado direito
e hipocampo dos ratos lesionados, respectivamente. E o tratamento com
CV (25 mg/kg) e com a associação CV 25+L-DOPA foi capaz de reduzir a
imunomarcação para COX-2 no estriado direito, já o tratamento com CV
(25 mg/kg) e EGCG diminuíram a imunomarcação para iNOS no
hipocampo (áreas CA-1, CA-3 e GD);
j) verificamos que a associação do CV com L-DOPA apresentou efeitos
sinérgicos, recuperando significativamente as alterações
comportamentais, neuroquímicas e imunohistoquimicas induzidas por 6-
OHDA;
k) o CV (25 e 50 mg/kg) e a associação de CV 10 + Indometacina 2 mg/kg
apresentarem efeito anti-inflamatório ao reduzir o edema de pata induzido
por carragenina na maioria dos tempos de observação. E o CV10
potencializou o efeito anti-inflamatório da Indo 2 neste teste;
l) O CV (25 e 50 mg/kg) e a associação de CV 10 + Dexametasona 2 mg/kg
apresentarem efeito anti-inflamatório ao reduzir o edema de pata induzido
por dextrano na maioria dos tempos de observação. E o CV10
potencializou o efeito anti-inflamatório da Dexa 2 neste teste;
m) o CV apresentou efeito antinociceptivo nos testes das contorções por
ácido acético, formalina, placa quente e Hargreaves. A associação do CV
10 mg/kg com Morfina ou Indometacina em doses baixas (2 mg/kg)
apresentou efeito sinérgico;
n) a naloxona reverteu o efeito do CV 10 na 2ª fase do teste da formalina,
evidenciando o envolvimento parcial dos receptores opioides no
mecanismo de ação antinociceptivo do CV.
Concluímos que o extrato padronizado do CV e seus princípios bioativos (EC
e EGCG) apresentaram efeito neuroprotetor no modelo de DP induzida por 6-OHDA
em ratos, o que pode ser atribuído a suas ações antioxidantes e anti-inflamatórias
(Figura 80). Portanto, estas substâncias devem ser consideradas em estudos futuros
como ferramentas em potencial para interromper ou atenuar a progressão do
processo neurodegenerativo subjacente à DP.
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Figura 80 - Mecanismos neuroprotetores do extrato padronizado do chá-verde e de seus princípios bioativos (EC e EGCG) confirmados neste trabalho
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ANEXO – Artigo aceito para publicação
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