UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Investigação química e farmacológica de espécies vegetais da região Amazônica contra a Malária

DOMINIQUE FERNANDES DE MOURA DO CARMO

MANAUS – AM Junho/ 2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DOMINIQUE FERNANDES DE MOURA DO CARMO

Investigação química e farmacológica de espécies vegetais da região Amazônica contra a Malária.

Tese apresentada ao programa de pós-graduação em química da Universidade Federal do Amazonas, como um dos requisitos para a obtenção do título de doutor em Ciências - Química. Área de atuação: Química de produtos naturais.

Orientador: Dr. Jefferson Rocha de Andrade e Silva.

Co - Orientadora: Drª Ana Cláudia Fernandes Amaral.

MANAUS – AM Junho / 2014

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese a minha família, em

especial ao meu esposo Eclesiaste

Amazonas do Carmo por ser tão

especial em minha vida.

À minha filha Maria Heloísa, pelo

grande Dom de amor para nossa

família.

Aos meus orientadores prof. Jefferson

Rocha de Andrade Silva e profa. Ana

Cláudia Fernandes Amaral.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Agradeço a Deus, por me colocar numa família iluminada e abençoada, me dar

força sempre quando eu mais preciso e guiar sempre meu caminho para junto

Dele.

Aos meus pais pelo incentivo aos estudos, pelo amor, carinho, por apoiarem as

minhas escolhas, ajudar em tudo que preciso.

As minhas irmãs Danielle e Débora pela alegria da convivência, é maravilhoso

sentir que tenho vocês comigo.

Ao meu amado Eclesiaste, pelas infinitas ajudas diárias, todo este tempo junto

a você não há problema que eu não possa resolver. Obrigada por me incentivar

nas escolhas, apoiar nas decisões, me confortar nos desafios, cuidando e zelando

do nosso amor. Amor da minha vida, obrigada por tudo! É tão saber que temos

tesouros: a nossa filha Maria Heloísa e o nosso segundo filho, Miguel Ângelo, que

está crescendo dentro de mim.

Aos meus amigos: Júnior, Edinilze, Aimêe, Jaqueline, Richardson, Mayane,

Elzalina, Eliana, Renyer e Jean que comemoram comigo hoje mais uma vitória!

É sempre bom lembrar nossos momentos de alegria e convivência diária.

Obrigada pelo carinho e estou muito feliz por que tenho vocês até hoje no meu

caminho e na minha vida.

Ao meu orientador Dr. Jefferson Rocha de Andrade Silva pela confiança em

mim depositada e acima de tudo pelo rigor científico em conduzir a realização

deste trabalho.

À minha co-orientadora Dra. Ana Cláudia Fernandes Amaral pela orientação e

por todos os ensinamentos transferidos.

Ao professor Dr. Virgílio Estólio do Rosário e ao Instituto de Higiene e Medicina

tropical (IHMT) de Lisboa, pelo tempo, espaço, equipamentos e material cedido

para a realização dos ensaios biológicos e o incentivo da equipe para o

desenvolvimento do mesmo. Não poderia deixar de agradecer a Dra Dinora Lopes,

quem esteve ao meu lado para a execução dos ensaios antimaláricos, quem com

todo profissionalismo e paciência conduziu a execução do cronograma de

atividades, possibilitando para que a minha estadia em Portugal fosse a mais

produtiva possível.

À Catarina Alves e Zoraima Neto pelos ensinamentos repassados.

À Dra. Ana Cláudia Fernandes Amaral por ter cedido o laboratório de plantas

medicinais e derivados (Farmanguinhos FIOCRUZ, Rio de Janeiro), para a

utilização do HPLC.

À professora Cinthya Iamille Frithz Brandão de Oliveira, pela oportunidade e

confiança na realização do teste farmacológico, além dos ensinamentos.

Aos professores membros da banca Dr. Marcos Batista, Dr. Igor, Dra. Maria

Lúcia Belém Pinheiro, Dra. Maria de Meneses e Dr. Jefferson Rocha de Andrade

e Silva, pelas valiosas contribuições.

A FAPEAM e a CAPES pelo apoio financeiro.

RESUMO

A malária é uma das mais importantes infecções parasitárias de seres

humanos, devido à alta morbidade e mortalidade. Diversos fármacos foram

descobertos, a partir de plantas medicinais, para atuar contra esta doença, dentre

eles a quinina e artemisinina. Com o objetivo de contribuir com as pesquisas já

realizadas e proporcionar a descoberta de novos compostos antimaláricos, foram

selecionadas duas plantas da região Amazônica: a espécie Ampelozizyphus

amazonicus, conhecida como cerveja de índio, e a espécie Vismia cayennensis,

conhecida como Lacre. A partir de suas partes botânicas, foram preparados os

extratos hexânicos, clorofórmicos, etanólicos e aquosos, os quais foram

submetidos aos testes antimaláricos esquizonticidas hepáticos (frente ao

Plasmodium. berghei) e sanguíneos (frente ao Plasmodium. falciparum). Os

resultados farmacológicos, para a espécie A. amazonicus, indicam que os

extratos clorofórmicos, aquosos das cascas das raízes e cerne do caule exibem

uma atividade antimalárica, in vitro, frente ao P. berghei, com valores de IC50

entre 19,6 e 39,9 µg/mL. O extrato clorofórmico das cascas das raízes foi o mais

ativo frente ao P. falciparum, através dele foi possível isolar e identificar o ácido

betulínico como a substância mais ativa, com valor de IC50 = 2,56 para 3D7 e 3,76

µg/mL para Dd2. A cromatografia líquida de alta eficiência permitiu a quantificação

deste constituinte nos extratos obtidos, sendo possível observar uma correlação

entre a quantidade do ácido betulínico e a atividade antimalárica observada,

assim os extratos que apresentaram o maior conteúdo do triterpeno foram os

mais ativos. Para as amostras de V. cayennensis, o extrato clorofórmico foi o

único ativo com IC50 = 4,65 para 3D7 e 7,26 µg/mL para Dd2. Nos ensaios in vivo,

na fase hepática, foi possível identificar apenas um extrato ativo, o extrato

diclorometano das cascas do caule de A. amazonicus. Dos extratos ativos foram

isolados 12 substâncias, sendo 9 da espécie A. amazonicus e 3 de V.

cayennensis. Neste contexto, a abordagem etnofarmacológica associada ao perfil

químico, se mostram ferramentas úteis e promissoras na busca de novos

fármacos, permitindo contribuir significativamente para o conhecimento científico

do potencial antimalárico da flora amazônica e deste modo, abrir perspectivas

para o desenvolvimento de novos antimaláricos.

ABSTRACT

Malaria is one of the most important parasitic infections of humans due to the

high morbidity and mortality. Several drugs have been discovered, from medicinal

plants, to act against this disease, among them quinine and artemisinin. With the

goal of contributing to the research and to provide the discovery of new

antimalarial compounds, were selected two plants of the Amazon region: the

species Ampelozizyphus amazonicus known as Indian beer and Vismia

cayennensis, known as Lacre. From his botanical parts, were prepared the

hexane, chloroform and ethanolic extracts, which were subject to antimalarial

schizontocidal liver (against Plasmodium. berghei) and erythrocytic (against

Plasmodium. falciparum) tests. The pharmacological results for the specie A.

amazonicus, indicate that chloroform and aqueous extracts of the root bark and

stem displays an antimalarial activity in vitro against P. berghei with IC50 values

between 19.6 and 39.9 µg/mL. The chloroform extract of the root bark was the

most active against P. falciparum, through it was possible to isolate and identifity

the betulinic acid as the substance most active with value of IC50= 2,56 to 3D7 and

3,76 µg/mL to Dd2. The high performance liquid chromatography allowed the

quantification of this constituint in the extracts obtained, being possible to observe

a correlation between the quantity of betulinic acid and antimalarial activity

observed, thus extracts that showed the highest content of the triterpene were the

most active. For samples of V. cayennensis, the chloroform extract was the only

active with IC50 = 4.65 for 3D7 and 7.26 µg / mL for Dd2. An in vivo assay, in the

hepatic phase, was only possible to identify an active extract, the dichloromethane

extract of the stem bark of A. amazonicus. Of the active extracts 12 substances

were isolated, being 9 of the specie A. amazonicus and 3 of V. cayennensis. In

this context, the ethnopharmacological approach associated with the chemical

profile, appear useful and promising tools in the search for new drugs, allowing to

contribute significantly to the scientific knowledge of the antimalarial potential of

the Amazon flora and thus, open perspectives for the development of new

antimalarials

SUMÁRIO

ÍNDICE DE TABELAS ÍNDICE DE ESQUEMAS ÍNDICE DE QUADROS ÍNDICE DE ESPECTROS ÍNDICE DE FIGURAS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO 01 1.1. Família Rhamnaceae 06 1.1.1 Família Rhamnaceae no Brasil 07 1.2 Ampelozizyphus 08 1.3 Ampelozizyphus amazonicus 09 1.3.1 Saponinas 11 1.4 A família Clusiaceae 16 1.5 O gênero Vismia 18 1.6 A espécie Vismia cayennensis 20 1.6.1 Constituintes químicos de V. cayennensis 21 2. OBJETIVOS 24 2.1 OBJETIVO GERAL 24 2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO 24 3. MATERIAIS E MÉTODOS 26 3.1 Coleta e identificação botânica 26 3.2 Solventes e reagentes 26 3.3 Equipamentos 27 3.3.1 Cromatografia líquida acoplado ao espectrômetro de massas (LC-MS) 27 3.3.2 Cromatógrafo com fase gasosa acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM) 28 3.3.3 Espectrômetro de massas 31 3.3.4 Ressonância magnética nuclear 29 3.3.5 Ponto de fusão 29 3.4 Preparação de extratos e fracionamento 29 3.4.1 Obtenção dos extratos de A. amazonicus 29 3.4.2 Obtenção do extrato saponínico 30 3.4.2.1 Fracionamento em XAD-16 31 3.4.3 Obtenção do extrato aquoso 31 3.4.3.1.Método Rodrigues (1989) 31 3.4.3.2 Método quilombola (Oliveira et al, 2011) 32 3.4.3.3 Método Brandão (1991) 32 3.4.4 Fracionamento dos extratos clorofórmicos e diclorometano 32 3.4.4.1 Fracionamento do EDCCAa 33

3.4.4.1.1 Purificação da fração CCFR2 34 3.4.4.1.2 Purificação da fração CCFR6 38 3.4.4.1.3 Purificação da fração CCFR7 40 3.4.4.2 Fracionamento do ECCECAa 41 3.4.4.2.1 Purificação da fração CECFR2 42 3.4.4.2.2 Purificação da fração CECFR4_5 43 3.4.4.2.3 Purificação da fração CECFR6 45 3.4.4.2.4 Análise dos precipitados PECC 48 3.4.4.2.5 Fracionamento PECC 1, PECC 2, PECC3 e PECC 6 48 3.4.4.3 Fracionamento do ECCRAa 49 3.4.4.4 Fracionamento do ECCERAa 51 3.4.4.5 Fracionamento em SPE 51 3.4.4.6 Fracionamento em XAD-16 52 4.5 Obtenção dos extratos de Vismia cayennensis 52 4.5.1 Fracionamento líquido-líquido do extrato etanólico dos frutos 54 4.5.2 Fracionamento do extrato clorofórmico de V. cayennensis (ECFVc) 54 4.5.2.1 Fracionamento do ECFVc 4_5 55 4.5.2.2 Fracionamento do ECFVc 6_8 56 4.5.2.3 Fracionamento do ECFVc 9_12 57 4.5.3 Quantificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 58 4.5.3.1 Preparação dos extratos 58 4.5.3.2 Análise Cromatográfica 59 4.5.3.3 Condições cromatográficas 59 4.5.3.4 Linearidade 59 4.5.3.4.1 Preparação da curva padrão da substância química majoritária 59 4.5.3.4.2 Repetibilidade 60 4.5.3.4.3 Limites de detecção e quantificação 60 4.5.4 Análises de Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (CLAE-EM) 61 4.5.5 Desenvolvimento de método por CLAE/DAD para avaliação do perfil químico de extratos/frações de Vismia cayennensis 62 4.5.5.1 Preparação das amostras 62 4.5.5.2 Condições cromatográficas 62 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 63 5.1 Rendimento dos extratos 63 5.2 Análise estrutural das substâncias isoladas 64 5.2.1 Elucidação estrutural de 6ab 64 5.2.2 Elucidação estrutural de CCRFR2/11-16/16-18 70 5.2.3 Elucidação estrutural de CCFR6/ 24-29 / P 73 5.2.4 Elucidação estrutural de CECFR2/ 4_7 77 5.2.5 Elucidação estrutural de CECFR4_5/ 58_63 78 5.2.6 Elucidação estrutural de Azul/ECCECAa 81 5.2.7 Elucidação estrutural de PECC4 84 5.2.8 Elucidação estrutural de PECC5 87

5.2.9 Elucidação estrutural de CRF1/1_9 90 5.3 Substâncias isoladas de V. cayennensis 92 5.3.1 Elucidação estrutural de ECFVc 4_5/24_25/P 92 5.3.2 Elucidação estrutural de ECFVc 6_8 98 5.3.3 Elucidação estrutural de ECFVc 9_12/9_19P 102 5.4 Avaliação dos extratos polares por LC-MS 106 6. FARMACOLOGIA 114 6.1 Malária 114 6.2 Vetores 118 6.3 Epidemiologia 119 6.3.1 Malária no mundo 119 6.3.2 Malária no Brasil 121 6.4 Tratamento da Malária 122 6.4.1 Quinina e compostos relatados 122 6.4.2 Combinação de antifolato 127 6.4.3 Composto de artemisinina 128 7. MATERIAIS E MÉTODOS 130 7.1 Ensaio de hemólise 130 7.2 Avaliação da sensibilidade do Plasmodium falciparum, em ensaios in vitro na fase eritrocitária. 131 7.3 Índice de seletividade 132 7.4 Ensaios de hepatoxicidade 132 7.5 Avaliação da sensibilidade do P. berghei, em ensaios in vitro na fase hepática 133 7.6 Teste esquizonticida eritrocitário e exoeritrocitário in vivo com P. berghei 134 7.6.1 Ensaio in vivo fase hepática 134 7.6.2 Ensaio in vivo fase hepática II 135 7.6.3 Ensaio in vivo na fase eritrocitária do ciclo de desenvolvimento do Plasmodium berghei – 4 days supressive test 136 7.7 Atividade potencial antimalárica através da inibição da formação de β-hematina 137 7.8 Estudos dos efeitos farmacológicos de extratos de A. amazonicus 141 7.8.1 Animais e considerações de ética 141 7.8.2 Modelos experimentais 141 7.8.3 Teste do efeito de extratos e frações de A. amazonicus em modelo de comportamento geral de camundongos 142 7.8.4 Avaliação da atividade motora utilizando o modelo do Campo Aberto 147 7.8.5 Efeito na atividade hipnosedativa no modelo de sono induzido por pentobarbital 143 7.8.6 Análise estatística 144 8. RESULTADOS E DISCUSSÃO 145 8.1 Teste hemolítico 145 8.2 Análise dos extratos e substâncias isoladas de A. amazonicus frente ao P. berghei e P. falciparum 147

8.2.1 Ensaio de hepatotoxicidade 147 8.2.2 Ensaio de determinação da atividade antimalárica 149 8.2.2.1Ensaios in vitro na fase hepática 149 8.2.3 Ensaios in vitro na fase eritrocitária 153 8.2.3.1Ensaios in vitro com extratos/substâncias de A. amazonicus 153 8.3 Ensaios in vitro com extratos/frações de V. cayennensis 163 8.4 Avaliação da inibição da formação de hemozoína pelos extratos/frações/ substâncias isoladas de A. amazonicus e V. cayennensis 168 8.5 Avaliação da atividade in vivo 173 8.6 Efeito de extratos e substâncias puras isoladas de A. amazonicus em modelo de comportamento geral de camundongos. 178 8.6.1 Efeito na atividade hipnosedativa no modelo de sono induzido por pentobarbital 180 8.6.2 Efeito dos extratos e frações isoladas de Ampelozizyphus amazonicus na atividade motora utilizando o modelo do Campo Aberto 183 9. CONCLUSÕES 190 10. ANEXOS 193 10.1 Preparo dos reagentes 193 10.1.1 Vanilina Sulfúrica (Mattos, 1997) 193 10.1.2 Komarowvsky (Brandão, 1991) 193 10.1.3 NP/PEG (Wagner, 1996) 193 10.1.4 Reagente de Lieberman Burchard (Wagner, 1996) 194 11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 195 12. ESPECTROS 218

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1 – Rendimentos dos extratos brutos de A. amazonicus 63 TABELA 2 – Deslocamentos químicos no RMN 1H e 13 C para 6 ab 5 68 TABELA 3 – Deslocamentos químicos no RMN 1H para CCFR2/11-16/ FR 11-16, em comparação com dados da literatura (Ferreira, 2011) 71 TABELA 4 – Deslocamentos químicos no RMN 13C para CCFR2/11-16/ FR 11-16, em comparação com dados da literatura (Ferreira, 2011) 72 TABELA 5 – Deslocamentos químicos no RMN 1H para CCFR6/24-29/ P 76 TABELA 6 – Deslocamentos químicos no RMN 13C para CECFR2/ 4_7 77 TABELA 7 – Deslocamentos químicos no RMN 1H e 13 C para CECFR4_5/ 58_63,em comparação com dados da literatura (Brandão, 1991) 80 TABELA 8 – Dados de RMN 1H e RMN 13C da cumarina Azul/ECCECAa 83 TABELA 9 – Dados de RMN 1H e RMN 13C da PECC 4 86 TABELA 10 – Deslocamentos químicos no RMN 13C para PECC 5 89 TABELA 11 – Dados de RMN 1H e RMN 13C da CRF1/1_9 91 TABELA 12 – Deslocamentos químicos de RMN de 1H e 13C de ECFVc 4_5/24_25/ P, em CHCl3-d6 (Iinuma et al, 1995) 97 TABELA 13 – Comparação dos dados de RMN de 1H e 13 C de ECFVc 6_8 101 TABELA 14 – Comparação dos dados de RMN 1H e 13C de ECFVc 4_5 104 TABELA 15 – DML (Dose mínima letal) 148 TABELA 16 – Atividade de extratos de A. amazonicus, in vitro, contra as formas hepáticas do Plasmodium berghei . 150 TABELA 17 – Concentração inibitória (IC50) dos extratos de A. amazonicus 156 TABELA 18 – Concentração de ácido betulínico nos extratos de A. amazonicus 162 TABELA 19 – Valores de IC50 de extratos e frações dos frutos de V. cayennensis 165 TABELA 20 – Resultados de Ianálise no ensaio β-hematina 169 TABELA 21 – Relação estatística entre o tempo de latência e o tempo de sono 182

ÍNDICE DE ESQUEMAS

ESQUEMA 1 – Esquema de fracionamento do EDCCAa através da coluna filtrante 33 ESQUEMA 2 – Esquema de fracionamento da fração CCFR2 34 ESQUEMA 3 – Esquema do fracionamento da fração CCFR2/06-6b 35 ESQUEMA 4 – Esquema do fracionamento da fração CCFR2/7_10 36 ESQUEMA 5 – Esquema do fracionamento da fração CCFR2/FR11-16 37 ESQUEMA 6 – Esquema do fracionamento da fração CCFR6 39 ESQUEMA 7 – Esquema do fracionamento da fração CCFR7 40 ESQUEMA 8 – Esquema de fracionamento do ECCECAa através da coluna filtrante 42 ESQUEMA 9 – Esquema do fracionamento da fração CECFR4_5/ 45_47 44 ESQUEMA 10 – Esquema do fracionamento da fração CECFR/6 47 ESQUEMA 11 – Fluxograma do fracionamento e isolamento bioguiado de compostos de V. cayennensis 53 ESQUEMA 12 – Fracionamento do ECFVc 55 ESQUEMA 13 – Fracionamento do ECFVc 4_5 56 ESQUEMA 14 – Fracionamento do ECFVc 9_12 58 ESQUEMA 15 – Esquema de fragmentação da substância 6ab5 65 ESQUEMA 16 – Proposta de fragmentação 5, 6, 7, 8, 2', 3', 4', 5'–octametóxiflavo- na 76 ESQUEMA 17 – Proposta de fragmentação de Azul/ECCECAa 82 ESQUEMA 18 – Proposta de fragmentação de ECFVc 4_5/24_25/P 94

ÍNDICE DE ESPECTROS

ESPECTRO 1 – Cronograma de íons totais e espectro de massa de 6ab 5 218 ESPECTRO 2 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de 6 ab 5, ampliação das metilas 219 ESPECTRO 3 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de 6 ab 5, ampliação dos hidrogênios olefínicos 219 ESPECTRO 4 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de 6 ab 5, ampliação do hidrogênios carbinólico. 220 ESPECTRO 5 - Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de 6 ab 5, ampliação do multipleto 220 ESPECTRO 6 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) de 6 ab 5 221 ESPECTRO 7 – Mapa de contorno de HMBC (400 MHz, CDCl3) de 6ab 5 221 ESPECTRO 8 – Mapa de contorno de HMBC (400 MHz, CDCl3) de 6ab 5 222 ESPECTRO 9 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de CCFR2/11-16/FR 11-16 223 ESPECTRO 10 – Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) referente aos carbonos da dupla ligação 224 ESPECTRO 11 – Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) referente ao carbono carbinólico da posição 3 224 ESPECTRO 12 – Espectro de massas da substância CCFR6/ 24-29 / P obtido com ionização de eletrospray (ESI) e detecção de íons negativos 225 ESPECTRO 13 – Espectro de massas MS/MS do pico m/z 461 da substância CCFR6/ 24-29 / P 225 ESPECTRO 14 – Espectro de massas MS/MS/MS do pico m/z 313 da substância CCFR6/ 24-29 / P 226 ESPECTRO 15 – Espectro de massas MS6 do pico m/z 242 da substância CCFR6/ 24-29 / P 226 ESPECTRO 16 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de CCFR6/ 24-29/P 227 ESPECTRO 17 – Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de CCFR6/ 24-29/P 227 ESPECTRO 18 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de CECFR2/ 4_7 228 ESPECTRO 19 – Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de CECFR2/ 4_7 229 ESPECTRO 20 – Espectro de massas de CECFR4_5/ 58_63 229 ESPECTRO 21 – Espectro de RMN de 1H de CECFR4_5/ 58_63, em destaque os sinais referentes às metilas 230 ESPECTRO 22 – Espectro de RMN de 1H de CECFR4_5/ 58_63 230 ESPECTRO 23 – Espectro de RMN de 13C de CECFR4_5/ 58_63 231 ESPECTRO 24 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD) de Azul/ECCECAa 231

ESPECTRO 25 – Espectro de RMN 13C (125 MHz, MeOD) de Azul/ECCECAa 232 ESPECTRO 26 – Espectro de massas da substância Azul/ECCECAa 232 ESPECTRO 27 – Espectro de massas da substância PECC 4 233 ESPECTRO 28 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO) de PECC 4 234 ESPECTRO 29 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO) de PECC 4. 234 ESPECTRO 30 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO) de PECC 4. 235 ESPECTRO 31 – Espectro de RMN 13C (125 MHz, DMSO) de PECC 4 235 ESPECTRO 32 – Ampliação do espectro de RMN 13C (125 MHz, DMSO) de PECC 4 236 ESPECTRO 33 – Espectro de massas da substância PECC 5 237 ESPECTRO 34 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 / MeOD ) do PECC 5 238 ESPECTRO 35 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 / MeOD ) do PECC 5 238 ESPECTRO 36 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 / MeOD ) do PECC 5, com ampliação no próton H-3 239 ESPECTRO 37 – Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3 / MeOD ) do PECC 5 240 ESPECTRO 38 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 / MeOD ) de CRF1/1_9, com ampliação na região de 2,3 a 5,4 ppm 241 ESPECTRO 39 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 / MeOD ) de CRF1/1_9, com ampliação na região de 2,3 a 5,4 ppm 242 ESPECTRO 40 – Espectro de DEPT 135 (125 MHz, CDCl3 / MeOD ) de CRF1/1_9 242 ESPECTRO 41 – Espectro de RMN de 13C de ECFVc 4_5/24_25/P 243 ESPECTRO 42 – Espectro de RMN de 1H de ECFVc 4_5/24_25/P, ampliação dos grupos hidroxilas 243 ESPECTRO 43 – Espectro de RMN de 1H de ECFVc 4_5/24_25/P, ampliação do próton enólico H-2 244 ESPECTRO 44 – Espectro de RMN de 1H de ECFVc 4_5/24_25/P, ampliação dos tripletos referente aos prótons olefínicos 244 ESPECTRO 45 – Espectro de RMN de 1H de ECFVc 4_5/24_25/P, ampliação do dupleto e duplo-dupleto referente a prótons metilênicos 245 ESPECTRO 46 – Espectro de RMN HSQC de ECFVc 4_5/24_25/P 246 ESPECTRO 47 – Espectro de RMN HMBC de ECFVc 4_5/24_25/P, correlações do H-2 247 ESPECTRO 48 – Espectro de RMN de 1H de ECFVc 6_8 (CDCl3; 500 MHz) – destaque da região das metilas 248 ESPECTRO 49 – Espectro de RMN de 1H em expansão parcial com sinais de quarteto da substancia ECFVC 6_8 249 ESPECTRO 50 – Espectro de RMN de 1H em expansão parcial com destaque os acoplamentos vicinal e geminal 250 ESPECTRO 51 – Expansão parcial do espectro de RMN de 1H de ECFVc 6_8 – multiplicidade do H – ax 251 ESPECTRO 52 – Espectro de RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) de ECFVc 6_8 252

ESPECTRO 53 – Espectro de DEPT 135 e DEPT 90 (125 MHz, CDCl3) de ECFVc 6_8 253 ESPECTRO 54 – Espectro de RMN de 1H (CDCl3; 400 MHz ) Expandido em 10,03 – 15,77 ppm 254 ESPECTRO 55 – Espectro de RMN de 1 H Expandido (6,97 – 7,16 ppm) de ECFVc 4_5 em CDCl3 255 ESPECTRO 56 – Espectro de RMN de 13C de ECFVc 4_5 (CDCl3; 400 MHz) 256

ÍNDICE DE QUADROS

QUADRO 1 – Divisão e subdivisões da Família Clusiaceae 16

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1 – Fármacos oriundos de plantas medicinais 04 FIGURA 2 – Zizyphus jujuba 08 FIGURA 3 – A. amazonicus na forma de arbusto (I) e cipó (II) 10 FIGURA 4 – Ciclização de oxiesqualeno para vários esqueletos de saponinas

15 FIGURA 5 – A - Parênquima esponjoso com cavidade fenólica, B - Floema com prismas e fenólicos e C – epicarpo e mesocarpo dos frutos 18 FIGURA 6 – A - Folhas e B – Frutos de V. cayennensis 20 FIGURA 7 – Distribuição na região amazônica de V. cayennensis. 21 FIGURA 8 – benzofenonas isoladas das folhas de V. cayennensis 22 FIGURA 9 – Material botânico: A – Folhas; B – Raízes e C – Caule 30 FIGURA 10 – Cromatografia em camada delgada das subfrações obtidas por coluna filtrante do ECCECAa.. 41 FIGURA 11 – Cromatografia em camada delgada da fração CECFR4_5/58_63, tendo como eluente Hex/AcOEt 6:4 e como revelador Vanilina Sulfúrica. 45 FIGURA 12 – Cromatografia em camada delgada da fração VERM, tendo como eluente Hex/AcOEt 6:4 e como revelador Vanilina Sulfúrica 45 FIGURA 13 – Cromatografia em camada delgada dos precipitados obtidos do extrato ECCECAa. 48 FIGURA 14 – Cromatografia em camada delgada da fração PECC 1-19 49 FIGURA 15 – Cromatografia em camada delgada dos precipitados obtidos do extrato clorofórmico das cascas das raízes de A. amazonicus. 50 FIGURA 16 – Cromatografia das frações de 9 a 19, oriundas da fração ECFVc 9_12. 58 FIGURA 17 – Estrutura de 6ab 5 - Lupeol 67 FIGURA 18 – I – Sitosterol; II - Estigmasterol 71 FIGURA 19 – 5, 6, 7, 8, 2', 3', 4', 5' – octametóxiflavona - Agehoustina A 74 FIGURA 20 – Ácido esteárico 78 FIGURA 21 – Ácido 3 β,28 diidroxi-lup-20(29)-eno-27-óico 81 FIGURA 22 – Estrutura da cumarina codificada como Azul/ECCECAa 83 FIGURA 23 – Ácido betulínico 85 FIGURA 24 – Ácido melalêucico 88 FIGURA 25 – Betulina 91 FIGURA 26 – Espectro de massas de primeira ordem, em modo full scan, juntamente com fragmentação em segunda ordem do íon precurso de m/z 459, de ECFVc 4_5/24_25/P avaliado em modo negativo 93 FIGURA 27 – 1,3,8 triidroxi-4,5,7-triisoprenil-7-metil-antrone (harunganol B). Correlações observadas no espectro de HMBC 98 FIGURA 28 – Estrutura da Friedelina 100 FIGURA 29 – Estrutura da substância ECFVc 4_5 - Vismina 103 FIGURA 30 – Cromatogramas e espectros no UV do EECRAa 108

FIGURA 31 – Espectro de massas do EECRAa 109 FIGURA 32 – Cromatogramas e espectros dos extratos etanólicos e aquosos de A. amazonicus 110 FIGURA 33 – Cromatograma de HPLC do extrato CMB 111 FIGURA 34 – Espectros de UV, referente aos picos de 1 a 6, de CMB 112 FIGURA 35 – Espectro de MS/MS de CMB 113 FIGURA 36 – 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-α-L-ramnopiranosil-15α-acetil-

ampelozigenina 113 FIGURA 37 – Ciclo de vida das espécies de Plasmodium 115 FIGURA 38 – A – Oocisto. B – Oocisto com largo número de esporozoítos e C – Esquizonte contendo numerosos merozoítos 116 FIGURA 39 – Hemozoína 117 FIGURA 40 – Anopheles darling 118 FIGURA 41 – A – A. stephensi; B – A. Gambiae 119 FIGURA 42 – Adaptado de WHO (2011) 120 FIGURA 43 – Aréas de risco de transmissão da Malária na América do Sul

121 FIGURA 44 – Estrutura molecular da quinina 126 FIGURA 45 – Estrutura molecular da cloroquina 124 FIGURA 46 – Estrutura molecular da mefloquina 126 FIGURA 47 – Estrutura molecular da lumefantrina 127 FIGURA 48 – Estrutura molecular da artemisinina 129 FIGURA 49 – Labtek’s de 300 µL 134 FIGURA 50 – Esquema representativo do ensaio in vivo da atividade antimalárica da fase eritrocitária do ciclo de vida do parasita 136 FIGURA 51 – Heme livre evidenciando o grupamento carboxila (1) e a formação do grupamento carboxil-propionato (2) que promoverá a dimerização 139 FIGURA 52 – Esquema de formação de cristais de hemozoína a partir de dímeros de β-hematina 140 FIGURA 53 – Esquema do teste do Campo Aberto 143 FIGURA 54 – Esquema do teste tempo de sono Induzido por Pentobarbital

144 FIGURA 55 – Deformações da membrana celular, indicando a atividade hemolítica das saponinas 146 FIGURA 56 – Placa de Ágar sangue com halo de hemólise 147 FIGURA 57 – Cromatografia em camada delgada (CCD) de frações pré-purificadas 152 FIGURA 58 – Cromatograma e espectro de UV do ácido betulínico detectado em 210 nm 160 FIGURA 59 – Cromatograma dos extratos de A.amazonicus obtido por CLAE-DAD 161 FIGURA 60 – Cromatograma dos extratos EACRAa obtido por CLAE-DAD

162 FIGURA 61 – Cromatografia em camada delgada de sílica de fase normal, das frações oriundas da cromatografia em coluna (CC) do ECFVc 164 FIGURA 62 – Cromatograma do extrato clorofórmico dos frutos de V. cayennensis 166

FIGURA 63 – Cromatograma e espectros de UV de: A – ECFVc 4_5 e B – ECFVc 6_8 168 FIGURA 64 – Estrutura do heme (hemina) 170 FIGURA 65 – Estrutura da hemozoína 171 FIGURA 66 – Ensaio in vivo Fase Hepática 174 FIGURA 67 – Ensaio in vivo Fase Hepática II 175 FIGURA 68 – Ensaio in vivo Fase Eritrocitária 176 FIGURA 69 – Tempo médio de sobrevivência dos camundongos 176 FIGURA 70 – Efeito de diferentes frações de Ampelozizyphus amazonicus Ducke, na concentração de 50 mg/kg, no tempo de latência do sono no modelo de sono induzido por pentobarbital em camundongos 181 FIGURA 71 – Efeito de diferentes frações de Ampelozizyphus amazonicus Ducke, na concentração de 50 mg/kg, no tempo total de sono induzido por pentobarbital em camundongos 182 FIGURA 72 – Efeito de frações isoladas de Ampelozizyphus amazonicus Ducke no comportamento animal de camundongos no modelo do Campo Aberto: movimentação na caixa 185 FIGURA 73 – Efeito de frações isoladas de Ampelozizyphus amazonicus Ducke no comportamento animal de camundongos no modelo do Campo Aberto: números de cruzamentos na caixa 185 FIGURA 74 – Efeito de frações isoladas de Ampelozizyphus amazonicus Ducke no comportamento animal de camundongos no modelo do Campo Aberto: números de vezes que o animal levanta o corpo na caixa 186 FIGURA 75 – Efeito de frações isoladas de Ampelozizyphus amazonicus Ducke no comportamento animal de camundongos no modelo do Campo Aberto: números de vezes que o animal limpa/coça o focinho na caixa 187 FIGURA 76 – Tempo, em segundos, do comportamento exploratório ou parado dos camundongos (n=6) 188

LISTA DE ABREVIATURAS

AcOet – Acetato de etila

CCD – Cromatografia em camada delgada

CC – Cromatografia em Coluna.

CDCl3 – Clorofórmio

HPLC – High performance liquid cromatography CLAE – Cromatografia líquida de

alta eficiência

DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO – DimetilSulfóxido

CH2Cl2 – Diclorometano

MeOD – Metanol deuterado

Hex – Hexano.

HMBC – Coerência heteronuclear em ligações múltiplas

COSY – Correlation Spectroscopy

MeOH - Metanol

CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa

Rf – Fator de retenção

RMN 13C – Ressonância Magnética Nuclear de carbono – 13

RMN 1H – Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio

UV – Ultravioleta

p.f – Ponto de Fusão

IV – Infravermelho.

APCI – ionização química a pressão atmosférica

s – simpleto

t – tripleto

d – dupleto

dd – duplo-dupleto

m – multipleto

ESI-MS – Electrospray Ionization Mass Spectrometry

MS – Mass Spectrometry

m/z – Mass/ charge ratio

Da – Dalton

1

1. INTRODUÇÃO Os produtos naturais tem servido a humanidade como fontes de agentes

terapêuticos desde os primórdios da história. Diferentes culturas, tem se

beneficiado das plantas por suas propriedades medicinais, fomentando a

estes grupos o mais alto nível de conhecimento sobre os benefícios e

malefícios das plantas no tratamento e na cura de doenças (Tangjang et al,

2011). Estes conhecimentos populares são fontes promissoras para o

isolamento de substâncias com atividade biológica, que são indispensáveis

na medicina moderna.

As plantas superiores se caracterizam por sua habilidade em produzir

uma vasta variedade de metabólicos, com diferente complexidade tanto

química quanto biológica, e isto têm servido como modelos para o

desenvolvimento de fármacos (Ballabh et al, 2008). Elas são utilizadas para

curar ou pelo menos atenuar o impacto, de várias enfermidades, como por

exemplo, o câncer (Manosroi et al, 2012), AIDS (Gambari et al, 2006),

malária (Tsabang et al, 2012), tripanossomíase (Abdelrahman et al, 2011)

ou a leishmaniose (Kala-azar et al, 2009).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 4

bilhões de pessoas que vivem nos países em desenvolvimento confiam no

poder de cura das plantas e por esta razão as utilizam com frequência

(Kadir et al, 2012). Este dado evidencia que as plantas medicinais

constituem a “espinha dorsal” da medicina tradicional, por conseguinte,

para este segmento da população mundial, que geralmente não podem

arcar com os custos dos medicamentos, existe a necessidade de estudar

estas plantas para regular sua segurança, eficácia e para desenvolver

produtos farmacêuticos normalizados.

Diferentes sistemas de medicina tradicional são conhecidos, por

exemplo, a medicina tradicional da China (Liu et al, 2012), a Ayuverdica da

Índia ou a Unani e Unani-Tibb do Paquistão (WHO, 2001). Estes sistemas

baseiam-se em uma teoria, uma educação formal e uma história

documentada por escrito que são periodicamente revisados baseando-se

na experiência e no pensamento contemporâneo (Touwaide et al, 2013).

http://ascidatabase.com/author.php?author=Samia%20Hussein&last=Abdelrahman

2

Por outro lado, os sistemas terapêuticos usados na África têm-se mantido

mais informal e menos organizado e baseado principalmente em tradições

orais (Fakim et al, 2006). Apesar das diferenças entre estas culturas todas

tem um aspecto em comum: considerar o homem como parte da natureza

e a necessidade em se manter uma relação harmoniosa com ela para

conservar uma boa saúde (WHO, 2001).

Muitos investigadores em diferentes partes do mundo estão ativamente

envolvidos em recorrer à informação disponível na medicina tradicional. A

seleção baseada em seus usos tradicionais é, sem dúvida, o critério mais

popular, entre os pesquisadores, na investigação de plantas e na busca de

substâncias ativas (Newman, 2008). Este interesse pelo estudo sistemático

de medicamentos indígenas e plantas medicinais associadas ressurgiu nos

anos 70 e este fenômeno mundial foi encorajado pela OMS, estimulada por

sua vez pelo impacto da “experiência chinesa” (Liu, 2012).

A investigação está justificada e tem um objetivo específico. No entanto,

ao usar este método devemos ter em conta que o uso da medicina

tradicional não necessariamente deve coincidir com o conceito da medicina

moderna, de modo que o extrato selecionado não deve ser estudado

somente pela atividade pretendida pelos agentes da cura, mas por uma

gama mais ampla de modelos biológicos.

Desta forma, o estudo da rosa pervinca, Catharanthus roseus, de

Madagascar, popularmente usada para tratar a diabetes (Srinivas et al,

2003) rendeu os alcaloides, vincristina e vinblastina, com potente atividade

tumoral. Foi com este sentido de explorar o desconhecido, com a

inspiração em descobrir novas substâncias bioativas, que atualmente

existem informações incomensuráveis sobre constituintes oriundos de

plantas e suas respectivas atividades biológicas, dentre estes, podemos

citar o curare, relaxante muscular (Hostettmann et al, 2003), a quinina

(oriunda de espécies de Cinchona) para a Malária (Achan et al, 2011),

reserpina de Rauwolfia serpentina para hipertensão (Frohlich et al, 1994) e

digoxina de Digitalis para doenças cardíacas (Storstein et al, 1977). Outras

substâncias, de origem natural, também são dignas de destaque, a

3

salicilina, precursora do ácido acetilsalicílico (1), atropina (2), artemisinina (3), colchicina (4), efedrina (5), morfina (6), fisostigmina (7), pilocarpina (8), quinidina (9), taxol (10), tubocurarine (11) e vincristine (12) (Hostettmann et al, 2003) (Figura 1), exerceram uma ação farmacológica potente e atualmente produzem efeitos imediatos, mas sua origem terapêutica é

muito estreita, razão pelo qual ainda necessitam de investigações

científicas rigorosas (Licciardi et al, 2011).

A organização mundial de saúde (OMS), considerando as plantas

medicinais como importantes instrumentos da assistência farmacêutica,

através de vários comunicados e resoluções, expressa sua posição a

respeito da necessidade de valorizar a sua utilização no âmbito sanitário ao

observar que 70% a 90% da população, nos países em vias de

desenvolvimento, dependem delas no que se refere à atenção primária à

saúde (WHO, 2011).

A descoberta de novas substâncias proporciona à comunidade científica

atual, intrepidez para a perpetuidade das pesquisas neste ramo. Assim, por

exemplo, uma enfermidade como a malária, que é a maior doença

parasitária em áreas tropicais atingindo regiões como a África Oriental, Sul

da Ásia e America do sul (Kaur et al, 2009), é tratada por fármacos que se

originaram de plantas medicinais ou resultaram de suas modificações. O

tratamento mais específico teve início com o uso empírico do pó das

cascas de Cinchona calisaya e Cinchona succiruba. Dois químicos

franceses isolaram a quinina, principal alcaloide das cascas de Cinchona,

como mencionado anteriormente (Achan et al, 2011).

4

Figura 1. Fármacos oriundos de plantas medicinais.

N+ CH3CH3

OCH3

OH

O CH3

N+CH3

CH3

OH

O

O CH3

H

11

NH

N

OH

EtH

MeOOC

N

ONCH3

H(O)CH

EtOH OC(O)Me

MeOOC

12

NHCH3

OH

CH3

5

OH

O

OH

N

H

CH3

6

N

N

CH3

CH3H

CH3ONH

O

CH3

7

N

O

O

O

CH3O

O

CH3

O

O

O

CH3CH3

CH3

10

COOH

O

O CH3

1 2

OO

O

CH3

O

O

HCH3

H

H

CH3

3

O

N

N

CH3

O CH3

8

N

CH2

OH

OCH3

9

OO

OO

O

NH

O

4

Figura 1. Fármacos oriundos de plantas medicinais

5

A quinina é a substância mais ativa contra os sintomas da malária,

administrada com uma composição química definida. Esta descoberta

marcou uma etapa essencial na utilização de infusões ou extratos de

Cinchona. Outra substância de origem natural foi a artemisinina, isolada da

Artemisia annua, esta planta foi usada na medicina tradicional chinesa

como remédio para resfriado e febre a mais de 2000 anos, sua atividade

antimalárica foi relatada em 1956 (Vaishnav et al, 2010). Atualmente

destaca-se dos outros antimaláricos pela sua potente atividade antimalárica,

ação rápida e toxicidade reduzida. Os derivados semi-sintéticos dessa

substância vem sendo usada de maneira crescente (Donno et al, 2012).

Embora eles sejam efetivos contra P. falciparum resistentes à cloroquina, o

tratamento combinado com outra droga é recomendado, a fim de se evitar o

desenvolvimento de resistência. Infelizmente já existem indícios de cepas

resistentes ao tratamento baseado na terapia com artemisinina e derivados

no oeste do Camboja (Dondorp et al, 2009).

Embora muitos esforços, para a descoberta de substâncias ativas contra

malária, não tenham fornecido a erradicação da doença no mundo, os

estudos realizados até o momento nos concederam alguns benefícios para

o alívio dos sintomas, tais como a dor, a febre e a redução da anemia

(Donno et al, 2012). Resultados como estes incentivam a continuação das

pesquisas com os produtos naturais, além disso, formas resistentes de P.

falciparum aos atuais medicamentos estão aumentando em todo o mundo

(Weis et al, 2006). Portanto, a abordagem etnofarmacológica pode ser o

método mais eficiente para a seleção de plantas medicinais e consequente

obtenção de substâncias ativas.

Apesar de toda contribuição oriunda do uso das plantas medicinais, seu

potencial é ainda pouco explorado, pois há pouco tempo que estas se

tornaram objeto de estudo científico (Barros et al, 2008). Estima-se que,

das 250.000 a 500.000 espécies de plantas existentes, apenas 1 fração

tem sido investigada cientificamente pela sua atividade biológica (Ngo et al,

2013).

6

A partir dessas considerações e motivados pela necessidade de mais e

melhores fármacos contra uma doença negligenciada foram selecionadas

duas espécies vegetais da Amazônia, Ampelozizyphus amazonicus e

Vismia cayennensis, com o objetivo de avaliar seus constituintes químicos

e o potencial de cada uma como agente antimalárico.

1.1. Família Rhamnaceae

A família Rhamnaceae possui cerca de 55 gêneros e 900 espécies de

distribuição cosmopolita e hábito muito variado. Inclui desde árvores e

arbustos, com frequência xerófilos, até trepadeiras lenhosas e raras ervas

(Gotelli et al, 2011). São distribuídas nas regiões temperadas, subtropicais

e tropicais de todo o mundo, na América do Sul possui ampla distribuição

na Amazônia brasileira, venezuelana, colombiana e peruana, expandindo-

se até o Equador (Lima et al, 2000). Apesar de muito heterogênea, cabe

salientar que a família constitui um grupo monofilético, como demonstrado

em estudo com sequências de DNA (Richardson et al, 2000). Quanto ao

aspecto taxonômico, o mesmo autor salienta a necessidade de uma nova

classificação supragenérica, que leve em consideração dados moleculares,

juntamente com características morfológicas das espécies.

As Rhamnaceaes apresentam folhas simples, pecioladas e de tamanho

variado (ocasionalmente muito reduzidas ou ausentes), alternas,

subopostas ou opostas, de bordo inteiro ou serreado, trinérveas ou

peninérvias, glabras ou pilosas, com ou sem estípulas (às vezes

interpeciolares ou transformadas em espinhos) e, por vezes, providas de

glândulas dispersas no limbo ou dispostas nas extremidades de cada dente

(Lima, 2006). As flores, em geral, diminutas, pentâmeras e simétricas,

podem ser pediceladas ou sésseis, bissexuais ou, menos frequentes,

unissexuais, e com tubo de forma variável, por muitas vezes reduzido

(Lima, 2006). Os frutos das Rhamnaceae são caracterizados como drupas,

representam uma seqüência evolutiva de cápsulas e drupas sincárpicas

para esquizocarpos (sensu stricto) (Lima, 2006), levando em consideração

7

o caráter do mesocarpo carnoso e comestível (Lima et al, 2000). Muitas

espécies da família tem importância medicinal.

Destacam-se nesse sentido, Discaria americana, ceanothus spp, Colletia

spinosissima e C. paradoxa são usadas no combate à febre (Giacomelli et

al, 2004); Hovenia dulcis, para asma; Rhamuns catharticus, R. purshiana,

R. pumila e R. alpina, como laxantes (popularmente conhecidas como

cáscara-sagrada); Discaria americana, Scutia buxifolia, Retanilla ephedra,

R. obcordata, Rhamnus inebrians e Ceanothus spp. (Silva et al, 2014),

como tônicos; e Scutia buxifolia por suas propriedades digitalóides,

diuréticas e hipotensivas.

As Rhamanaceaes são ricas em antraquinonas, alcaloides, saponinas e

triterpenos pentacíclicos (Brandão,1991).

1.1.1. Família Rhamnaceae no Brasil

No Brasil, as espécies vegetais da família Rhamnaceae têm ampla

distribuição, ocorrendo desde o norte até o sul do país (Gotelli et al, 2012),

com 20 espécies (sete endêmicas) incluídas em oito gêneros: Alvimiantha,

Colubrina, Crumenaria, Gouania, Reissekia, Rhamnidium, Rhamnus e

Ziziphus (Lima et al, 2006). Espécies do gênero Ziziphus são bastante

estudadas devido a sua popularidade, como por exemplo, a Z. joazeiro,

típica de sertões nordestinos onde apresenta grande valor econômico e

ecológico. A planta conserva-se verde o ano inteiro e seus frutos são

comestíveis, sendo ricos em vitamina C (Diogenes et al, 2010). Muitas

outras espécies de Ziziphus apresentam frutos comestíveis, como Z. jujuba

a Z. mauritiana, sendo, inclusive, cultivadas em escala comercial (Yi-ling et

al, 1982). Ziziphus jujuba (Figura 2) é uma planta nativa da China e muito comum na China e Coréia do sul (Zhao et al, 2006) com distribuição nas

regiões tropicais e subtropicais da Ásia e América. Seus frutos são

utilizados no tratamento de úlceras, doenças pulmonares e febre, as

sementes são hipnóticas, narcóticas, sedativas, tônicas e utilizadas contra

dores de estômago. Dos estudos farmacológicos já realizados, foram

8

encontrados nos extratos das sementes, folhas e dos frutos, atividades

ansiolíticas, sedativas, hepatoprotetor, capacidade significativa de redução

de peso e anti-cancer (Chowdari, 2010).

O gênero Ampelozizyphus pertencia ao Ziziphus, devido à semelhança

dos frutos quando imaturos (Ducke et al, 1935). Entretanto, três anos mais

tarde, quando os frutos maduros foram encontrados e analisados

identificou-se uma semelhança com plantas das famílias Rutaceae e

Euphorbiaceae e, atualmente, após um extenso estudo sobre a filogenia da

Rhamnaceae, as espécies foram organizadas em três grupos e 11 tribos

(Richardson et al, 2000). Baseado nestes estudos foi estabelecido uma

nova tribo, Ampelozizipheae, unicamente com o gênero Ampelozizyphus

(Meier et al, 2008), o qual merece destaque por ser utilizada no tratamento

de sintomas da malária e como antídoto contra veneno de cobras na região

Amazônica (Krettli et al, 2001; Rosas et al, 2007; Diniz, 2009).

1.2. Ampelozizyphus Este gênero é considerado monotípico em Rhamnaceae (Meier et al,

2008), sendo endêmico da região amazônica (Meier et al, 2008; Lima,

2006). Como já mencionado Ampelozizyphus foi inicialmente incluído na

tribo Zizypheae por Ducke, 1935. Posteriormente, Suessenguth (1953)

transferiu para o gênero Rhamneae e atualmente é incluso uma nova tribo

Figura 2. Ziziphus jujuba. Fonte: portalsaofrancisco.com.br

9

nesta família, a tribo Ampelozizypheae, para melhor posicionar este gênero

(Lima, 2006). Sobre as espécies deste gênero, apenas a Ampelozizyphus

amazonicus estava associada. No entanto, após uma exploração na

cordilheira costeira da Venezuela, uma segunda espécie foi descoberta, a

Ampelozizyphus guaquirensis (Meier et al, 2008).

1.3. Ampelozizyphus amazonicus

Ampelozizyphus amazonicus Ducke é endêmica da América do sul, com

distribuição na Amazônia brasileira, venezuelana, colombiana e peruana,

também encontrada na Guiana, Suriname e Guiana francesa (Meier et al,

2008). No Brasil é encontrada nos estados do Amazonas, Pará e Roraima,

sendo encontrada em florestas de terra firme (Amaral et al, 2008). Floresce

de outubro a dezembro e frutifica de novembro a fevereiro (Lima, 2006). A.

amazonicus distingue-se da única outra espécie do gênero, A.

guaquirensis, por seu hábito arborescente (trepador), inflorescência e a

presença de nectários nas bases das lâminas foliares (Meier et al, 2008). A

planta, quando jovem, assume a forma de um pequeno arbusto e com o

passar do tempo transforma-se em cipó alastrando-se sobre outras árvores

(Figura 3) (Santos et al, 2005). Nas regiões onde é encontrada, a espécie é conhecida como “cerveja de

índio” ou “saracura-mirá” (Rosas et al, 2007), mas também podemos

encontrar outros nomes vulgares, como “saracura-muirá, cerveja-do-mato,

cervejeira, cervejinha e curupira-mirá”. As denominações de cerveja à

planta faz alusão à espuma abundante e de sabor amargo que é formada

quando as cascas ou raízes são agitadas em água (Oliveira et al, 2011).

Esta bebida aquosa possui uma metodologia de preparação, a qual é muito

difundida entre os índios e os povos ribeirinhos. Seus efeitos medicinais

são estimulante, energético e provoca resistência física e mental (Santos et

al, 2005). O infuso de suas raízes é usado popularmente no tratamento

contra picada de cobra e na prevenção da malária (Brandão, 1991).

10

Figura 3. A. amazonicus na forma de arbusto (I) e cipó (II).

Fonte: Fotos de Corrêa, 2007.

Em 1993, alguns pesquisadores tiveram contato direto com essa planta

nos arredores de São Gabriel da Cachoeira/AM – Rio Negro. Após longa

caminhada pela mata, por meio da orientação de dois indígenas do grupo

tukano, a planta foi coletada e, em seguida, preparada a mistura da

entrecasca das raízes e caule na água. Porções dessa bebida foram

ingeridas por todos, que a partir daquele momento passaram a sentir-se

restabelecidos do cansaço, da fatiga e da fome (Santos et al, 2005). Esta

propriedade energética observada está ligada, também, na utilização pelos

doentes com malária, visto objetivar não a cura propriamente dita, mas o

restabelecimento da energia (Santos et al, 2005).

O método para preparar a bebida é, essencialmente, agitar as cascas ou

raízes em água, no entanto são encontradas algumas diferenças na forma

de preparo. O método descrito por Rodrigues (1989), por exemplo, o caule

é levemente raspado e as cascas são batidas em água por 5 minutos.

Desta forma a bebida esta pronta para consumo; pelas comunidades

quilombolas a agitação deve durar pelo menos dez minutos e a espuma

formada pela agitação deve ser desprezada por sete vezes. Alguns

comunitários afirmam que a espuma pode provocar mal estar, tontura e

enjoo (Oliveira et al, 2011).

Com o intuito de comprovar as propriedades atribuídas à A. amazonicus,

principalmente no que diz respeito a sua ação profilática e no tratamento da

malária (Rosas et al, 2007), alguns estudos sobre sua farmacologia foram

I II

11

realizados. Krettli e colaboradores (2001) mostraram que o extrato bruto

das raízes de A. amazonicus é ativo contra os esporozoítas (forma

infectante do agente etiológico da malária, encontrados nas glândulas

salivares do mosquito vetor) do P. gallinaceum e/ou contra os protozoários

que se encontram nos estágios iniciais do ciclo de vida do parasita. O

extrato etanólico de A. amazonicus reduziu o parasitismo tecidual em

galinhas inoculadas com o protozoário. Posteriormente, Andrade-Neto e

colaboradores (2008) mostraram que culturas de esporozoítos do P.

berghei após tratamento com extrato etanólico de A. amazonicus na

concentração de 100 µg/mL, reduz significativamente o número de

esquizonte em relação ao controle. Este resultado somado com o teste in

vivo, onde camundongos tratados com altas doses do extrato etanólico não

foram infectados após inoculação com esporozoítos, corroboram para o

uso da “cerveja de índio” como um remédio profilático para malária. Dos

estudos realizados frente ao P. falciparum, na fase sanguínea, com

extratos provenientes de A. amazonicus, nenhuma atividade foi encontrada

(Corrêia, 2007; Krettli et al, 2001), corroborando que a planta é eficaz na

fase inicial da doença e não no tratamento.

Considerando que o uso dessa planta está sempre associado ao bem-

estar e depuração do corpo é importante abordar os constituintes químicos

identificados na espécie. Investigações químicas realizadas anteriormente

descrevem a presença de saponinas e triterpenos em A. amazonicus. Das

raízes já foram isoladas saponinas triterpênicas bem como outros

triterpenóides como lupeol, ácido betulínico, betulina, ácido melaleucico e

ácido dihidroxilup-20(29)-en-28ß – oico. Essas últimas 5 substâncias

também são encontradas em outras plantas (Brandão, 1991; Rosas et al.,

2007).

1.3.1. Saponinas

As saponinas são sintetizadas por várias plantas, possuem uma

estrutura anfipática formada por resíduos hidrofílicos de açúcares ligados a

12

uma aglicona hidrofóbica. Apresentam esse nome devido ao fato de

formarem espuma abundante quando agitados com água (do latim sapo=

sabão) (Vincken et al, 2007) e esta propriedade resulta da diminuição da

tensão superficial do líquido. O chá preparado com A. amazonicus forma

espuma em abundância devido à presença dessas substâncias.

As saponinas triterpênicas fazem parte da família dos terpenos que é a

maior família de substâncias naturais sendo constituída por mais de 40.000

moléculas diferentes. Em geral, os terpenóides tem como precursor o ácido

mevalônico que é formado a partir da Acetil-Coenzima A (CoA). A Acetil-

CoA é formada pela ativação da molécula de ácido acético, através de

esterificação, pelo grupo tiol da molécula de CoA. O ácido mevalônico é

ativado por fosforilação seguida por eliminação descarboxilativa, para gerar

o pirofosfato de 3-isopentila (IPP). A isomerização deste último a

pirofosfato de 2-isopentila (DMAPP) resulta numa molécula que pode

ionizar-se facilmente e adicionar- se a cinco sucessivas unidades de IPP,

gerando uma molécula triterpênica de 2,3 epoxi-esqualeno (Aharoni et al.,

2005).

Esse processo de biossíntese do 2,3 oxiesqualeno é comum aos

animais, fungos, algas e plantas superiores. No entanto, após sua

formação, as rotas biossintéticas entre os organismos citados divergem

bastante. Os vegetais são capazes de ciclizar o 2,3-oxiesqualeno, que se

encontra em uma conformação cadeira-cadeira-cadeira, gerando

especificamente as agliconas de saponinas tetracíclicas do tipo damarano

(Bruneton. 1999). Saponinas do tipo damarano tem recebido muita atenção

de cientistas do mundo inteiro, especialmente pesquisadores chineses e

japoneses, devido suas estruturas únicas e várias atividades biológicas.

Investigações anteriores demonstraram que estes tipos de substâncias

possuem numerosos efeitos biológicos, tais como, potente adjuvante em

células, anti-tumor, anti-diabete, hepatoprotetor, antiinflamatório e efeitos

antioxidantes (Ky et al, 2010). Uma série de rearranjos de hidreto e

grupamento metila no carbocátion damarenila levam ao carbocátion C8

tirucalenila, e todas saponinas que derivam deste carbocátion são

13

classificadas como saponinas do tipo tirucalano. O anel de 5 membros ao

lado do carbocátion damarenila pode expandir pelo rearranjo da ligação

C16-C17, ou pelo rearranjo da ligação C13-C-17. O rearranjo da ligação

C16-C17 leva ao carbocátion tetracíclico bacharenila e pode ser seguido

por reações com a ligação dupla C24-C25 para formar o carbocátion

pentacíclico lupenila C25. Todas saponinas que derivam destes

carbocátions são classificadas como saponinas do tipo lupano (Vincken et

al, 2007). O carbocátion lupenila pode ser rearranjado, mas primeiro ao

carbocátion C18 germanicenila, e então através de uma série de rearranjos

de hidretos para o carbocátion C13 oleanila. Todas saponinas derivadas

deste carbocátion olenila são classificados como saponinas do tipo

oleanano. O rearranjo do grupo metil α, no carbocátion germanicenila,

produz o carbocátion C20 taraxasterenila, que pode ser desprotonado para

produzir saponinas do tipo taraxasterano. O rearranjo do grupo metila no

carbocátion germanicenila, seguido de vários rearranjos de hidretos,

finalmente produz carbocátion C13, que pode ser desprotonado para

formar saponinas do tipo ursano. O esqueleto ursano é, também,

conhecido como esqueleto α-amirina.

O rearranjo da ligação C13-C17 no carbocátion C20 damarenila leva ao

carbocátion C17, que pode ser ciclizado pelas reações com a ligação dupla

no lado da cadeia para formar o carbocátion C25 pentacíclico hopenila.

Todas as saponinas derivadas deste carbocátion são classificadas como

saponinas do tipo hopano. Da ciclização inicial da conformação cadeira-

barco-cadeira do oxiesqueleno, um carbocátion C20 tetracíclico protosteril

é obtido, que sofre uma série de rearranjos de hidreto e grupamento metila,

formando um intermediário carbocátion C9 lanosterila. Este carbocátion

pode sofrer rearranjos do grupo metila e um hidreto para formar o

carbocátion C5 cucurbitanila. Todas saponinas derivadas deste carbocátion

são classificados como saponinas do tipo cucurbitano. O carbocátion

lanosterila pode sofrer desprotonação do grupo metila C19 levando a

formação do anel ciclopropano como é encontrado em cicloartenol

(Vincken et al, 2007). Todas saponinas derivadas de cicloartenol são

14

classificadas como saponinas do tipo cicloartano. A desprotonação do

carbocátion lanosterila produz lanosterol e todas saponinas derivadas de

lanosterol são classificadas como saponinas do tipo lanostano. O lanosterol

pode sofrer desmetilação e isomerização da ligação dupla, levando ao

colesterol. As saponinas derivadas deste esqueleto são classificadas como

saponinas do tipo esteróide (Figura 4). Em geral, as saponinas apresentam atividade antimicrobiana, inseticida,

moluscicida e a atividade hemolítica, sendo esta a mais comum. A

capacidade de produzir hemólise faz parte do sistema de proteção do

vegetal contra ataques de predadores (insetos, vírus, fungos e bactérias),

e, esta atividade está ligada a muitas das atividades antibacteriana,

antifúngica e espermicida apresentada por uma variedade de plantas

(Lacaille-Dubois & Wagner, 1996).

Além das atividades antibacteriana e antifúngica, as saponinas

triterpênicas apresentam atividades contra outros micro-organismos como

vírus (Chakraborty et al, 2002) e protozoários como Leishmania infantum

(Germonprez et al., 2005). Além disso, essas substâncias tem sido

testados como adjuvantes em vacinas contra o HIV-1, citomegalovírus e

Toxoplasma gondii (Yang et al, 2005).

15

Rearranjo C13- C17

O

8

13

14

16

17

20

H

H

OH

+25

24

8 1

1

1

1

2

H

H

OH

H

+ 9 8

14

13 17 16

20

H

H

OH

H

+

8

9

19 13

16

17 24

25

13 17

24

25

OHH

H +

OHH

H

+

OHH

H

+

5 8

9 25

19

25

OH

HH

+

H

OH

+H

OH H

+

oxiesqualeno

Ciclização via conformação cadeira-

cadeira - cadeira

Ciclização via conformação cadeira-

barco - cadeira

Carbocátion damarenil Carbocátion tirucalanil Carbocátion protosteril

Damarano

Tirucalanos

Carbocátion bacarenil Carbocátion lanosteril

Carbocátion lupenil Carbocátion

Carbocátion

Lupanos Hopanos

Cucurbitanos

Carbocátion

Carbocátion oleanil Cicloartenol Lanostero

Oleananos

Cicloartano Lanostanos

19

20

19

20

13

19

OH

H+

OH H

H+

OH H

H+

H

OH H OH H

OHH

H

H

OH

H

H

+

Carbocátion taraxasterenil Carbocátion ursanil

Colesterol

Taraxasterano

Ursanos Esteróides

Figura 4. Ciclização de oxiesqualeno para vários esqueletos de saponinas (Vincken et al, 2007).

16

1.4. A família Clusiaceae Plantas da família Clusiaceae, como todas as outras famílias, são fontes

ricas de metabólicos secundários com atividades biológicas. As maiores

classes de metabólicos secundários que têm sido isolados dessas plantas

são: xantonas (Hay et al, 2004), cumarinas (Lavaud et al, 2012) e

benzofenonas (Marti et al, 2009).

A família Clusiaceae ou Guttifferae (nomina conservandum), pertence à

ordem Theales, subclasse Dilleniidae, classe Magnoliopsida e divisão

Magnoliophyta (Cronquist, 1981); sendo dividida em seis subfamílias:

Kielmeyeroideae, Calophytiloideae, Hypericoideae, Clusioideae,

Moronoboideae e Lorotemonoideae (Quadro 1) (Silva, 2010). As plantas são compostas por árvores, subarbustos e poucas ervas, constituída aproximadamente por 40 gêneros e 1200 espécies, as quais são,

principalmente, distribuídas nas regiões tropicais (Marti et al, 2009).

Quadro 1. Divisão e subdivisões da Família Clusiaceae (Fonte: Silva, 2010).

Subfamília Tribo Gênero Número de espécies

Kielmeyeroideae

Kielmeyereae Kielmeyara 20

Mahuera 8

Caraipeae

Caraipa 20

Haploclathra 4

Bonnetiaceae

Bonnetia 18

Archytaceae 2

Calophytiloideae Calophylleae

Calophyllum 110

Mesua 40

Manea 50

Clusioideae Clusieae Clusia 145

17

Tomovita 60

Garcinieae

Allanblackia 8

Garcinia 200

Penphalanium 7

Moronoboideae

Rheedia 45

Moronobea 7

Pentadesma 4

Platonia 2

Symphonia 20

Lorostemonoideae Lorostemon 3

Hypericoideae

Cratoxyleae Cratoxylum 6

Hypericaceae Hypericum 400

Vismieae

Harungana 1

Psorospermum 40

Vismia 35

A presença de látex é uma característica comum das Clusiaceae e suas

plantas são caracterizadas por possuírem folhas opostas ou alternas,

sendo elas simples, sem estípulas e com várias nervuras secundárias

delgadas. Raramente encontram-se flores solitárias. As inflorescências são

vistosas, compostas por flores geralmente assimétricas, contendo de 2 a 5

sépalas distintas e 4 ou 5 pétalas persistentes, andróginas ou

unissexuadas. Os frutos podem ser cápsula, quando secos e baga ou

drupa, quando carnosos (Cronquist, 1981). Na família são encontradas,

com grande frequência, células secretoras de substâncias fenólicas

dispersas, geralmente produzindo proantocianidinas e armazenando vários

tipos de xantonas. Em trabalho realizado por Moura e colaboradores (2008)

18

sobre as características morfológicas das folhas, cascas e frutos de Vismia

cayennesis foi observado à presença de um parênquima esponjoso

compacto com cavidade fenólica no limbo foliar (Figura 5-A); células quadrangulares e parênquima cortical desenvolvido contendo idioblastos

fenólicos cristalíferos presente nas cascas (Figura 5-B) e nos frutos, ao longo do mesocarpo amiláceo com numerosos ductos secretores e feixes

vasculares (Figura 5-C). Neste trabalho foi possível comprovar a existência de substâncias fenólicas em diferentes partes da planta.

1.5. O gênero Vismia

O gênero Vismia é pertencente à família Clusiaceae, subfamília

Hypericodeae e tribo Vismieae (Santos et al, 2000), compreendendo 52

espécies e com ampla distribuição nas Américas Central e Sul. As

antraquinonas são metabólitos típicos que constituem esse gênero

(Miraglia et al, 1981), e a ocorrência de antraquinonas preniladas é limitado

apenas a três gêneros da família Clusiaceae: Vismia, Hurungana e

Psorospermum (Delle monache, 1985). Há ainda outros componentes

também encontrados nesse gênero, tais como vários triterpenóides,

diantraquinonas, benzofenonas e lignanas (Nagen e De Oliveira, 1997).

Figura 5. A - Parênquima esponjoso com cavidade fenólica, B - Floema com prismas e fenólicos e C – epicarpo e mesocarpo dos frutos (Moura et al, 2008).

A B C

19

Medicinalmente, algumas espécies de Vismia são apreciadas por seu

látex alaranjado, que é usado por tribos existentes em toda bacia

amazônica para o tratamento de herpes, fungo e feridas, além do uso do

látex para a pintura do corpo (Miliken, 1999). O exsudato também é

empregado na medicina popular como antireumático, em tumores e contra

úlceras crônicas (Reys et al, 2004).

Uma espécie bastante estudada deste gênero é a Vismia latifólia,

popularmente conhecida como pau-de-sangue, Lacre, Lacre-vermelho. A

casca desta planta é utilizada na medicina popular como tônico e febrífugo.

Outro derivado desta planta é sua resina que é utilizada como tinta para

pinturas artísticas em tela. Prévios estudos fitoquímicos de V. latifólia

revelaram a predominância de derivados xantônicos (Santos et al, 2000).

Outra espécie com bastante citação na literatura é a V. guianeensis,

encontrada comumente nas capoeiras, não tendo sido vista em abundância

nas matas (Almeida, 1993). É encontrada como arbustro ou árvore

pequena nas Américas do sudoeste do México até o Brasil (Monacelli et al,

1999). No nosso país há ampla distribuição nas regiões do Norte e

Nordeste (Almeida, 1993), sendo utilizada pela aplicação de seu látex

(resina amarelo-avermelhado denominada goma-lacre ou goma-guta) e da

infusão das folhas, no combate das afecções dermatológicas denominadas

“impinges” causadas por fungos, além de outras aplicações, como

purgativo. O decocto e a infusão das suas folhas mais as cascas são

utilizados para reumatismo, como tônico e febrífugo (Almeida, 1993).

Em Vismia guianensis muitos metabólicos secundários já foram

identificados na sua constituição: sitosterol, vismiona H (Botta et al, 1986),

quinonas (Gonzales et al, 1980; Delle monache et al, 1985), diantronas

(Politi et al, 2004), antraquinonas (Bilia et al, 2000; Politi et al, 2004) e

xantonas (Botta et al, 1986; Bilia et al, 2000). Seo e colaboradores (2000)

conseguiram isolar da fração clorofórmica das raízes de V. guianeensis

cinco benzofenonas denominadas de vismiaguianonas e duas

benzocumarinas chamadas de vismiaguianis. No mesmo trabalho os

autores isolaram, a partir de extratos de raízes, cinco benzofenonas

20

(vismiaguiononas A, B,C, D e E) e duas benzocumarinas (vismiaguianinas

A e B). Monache e colaboradores (1980) identificaram na composição

química dos frutos de V. guianeensis dois antranoides prenilados (γ-hidróxi-

ferruginina A e γ,γ-dihidroxi-ferruginina A). Posteriormente, foi observada a

atividade antioxidante de compostos fenólicos presentes nos extratos dos

frutos de V. guianeensis, os antranoides prenilados ferruginina A, γ-

hidroxiferruginina e da antraquinona vismiona A (Álvarez et al, 2008).

1.6. A espécie Vismia cayennensis V. cayennensis, vulgarmente conhecida como “árvore-da-febre, goma-

lacre, pau-de-lacre, lacre-branco e Pichirina”, é uma árvore de pequeno

porte, de 6 a 7 metros de altura; galhos lisos; folhas em forma de lâminas

de 8-13 cm de comprimento e 3 a 7 cm de largura, meio elíptica ou oblonga

- elíptica para lanceoladas ou ovais ou oblonceoladas; frutos de 10-15 mm

de comprimento (Corrêa, 1984) (Figura 6). Figura 6 – A - Folhas e B – Frutos de V. cayennensis.

Fonte: www.mobot.org/mobot/research/ven-guayana/clusiaceae/vismia. Habitam as capoeiras e áreas de regeneração natural da Região

Amazônica (Figura 7), com distribuição na América tropical, América do Norte, oeste da América do Sul e na África (Miraglia et al, 1981). Também

são habitantes das bordas de florestas, savanas, terras baixas de árvores

com folhas semipermanentes, espalhadas pelo Amazonas, Colômbia,

A B

21

Guiana, Suriname, Goiana Francesa e Nordeste do Brasil (Mourão et al,

2001).

Figura 7 – Distribuição na região amazônica de V. cayennensis.

Fonte: www.discoverlife.org/20/m?kind=Vismia+cayennensis

A espécie V. cayennesis é utilizada, popularmente, como antireumática,

para tratar infecções fúngicas que afetam a boca de crianças e baixar

febres (Miliken e Albert, 1999). Segundo Miliken e Colaboradores (1999) os

povos Yanomami do Amazonas, utilizam esta espécie para combater

infecções de pele e no tratamento de lesões devidas a leishmaniose do tipo

cutânea. O látex é friccionado nas bordas da lesão cutânea, obtendo-se a

cicatrização da ferida.

1.6.1. Constituintes químicos de V. cayennensis

Sobre a química de V. cayennensis os estudos ainda são limitados,

dentre eles podemos mencionar estudo com as cascas, onde foram

isolados a antraquinona fisciona (1,8-dihidroxi-3-metil-6-metoxi-

antraquinona), sitosterol, lupeol, fridelina, ácido betulínico e fridelan - 3β –ol

http://www.discoverlife.org/20/m?kind=Vismia+cayennensis

22

(Miraglia et al, 1981), dos frutos já foram isolados e identificados o ácido

crisofânico, isocariofileno, β – selineno, trans – α – farneseno, vismiona A,

vismiona B, ferruginina e γ – γ`- diidroxiferruginina A (Pinheiro et al., 1984).

Também é relatado um estudo bastante relevante sobre as folhas, onde

descreve o isolamento, pela primeira vez, de benzofenonas, denominadas

como vismiafenonas D-G (Figura 8) (Fuller et al, 1999). As vismiafenonas D – G foram avaliadas quanto sua atividade anti – HIV

e somente a vismiafenona D exibiu atividade inibitória.

OH

OHO

OH OCH3

O

Vismiafenona G

OH

OHO

OH O

Vismiafenona E

OH

OHO

OCH3 O

OH

OHO

OH

CH3 CH3

OCH3

CH3

CH3

Vismiafenona D Vismiafenona F

Figura 8 – benzofenonas isoladas das folhas de V. cayennensis.

23

Apesar da espécie em destaque não ser mencionada para a prevenção

ou tratamento da malária em seu uso popular, ela foi escolhida para estudo

químico e avaliação antimalárica pelo histórico que a família e o gênero nos

oferecem: eles são uma rica fonte de compostos fenólicos com um vasto

espectro de atividades biológicas. Además, a espécie V. guineensis,

encontrada no oeste da África, é citada na medicina popular para o

tratamento da malária (Menan et al, 2006), e um antranóide prenilado,

identificado como vismiona H, isolado de suas raízes mostrou-se ser um

potente antimalárico, com IC50 de 0,088 µg/mL quando avaliado frente as

formas eritrocitárias de P. falciparum. Neste trabalho sugere-se a

importância de um grupo funcional –OR na posição C3 (François et al,

1999). Adicionalmente, algumas substâncias isoladas de outras espécies

da família Clusiaceae, apresentam comprovada atividade antimalárica (Hay

et al, 2004; Marti et al, 2009; François et al, 1999).

Foi neste sentido que a espécie V. cayennensis foi escolhida, desta

forma a pretensão na descoberta de novos compostos antimaláricos é pela

primeira vez sugerida, portanto, os resultados obtidos foram inéditos. Os

estudos sobre identificação e isolamento dos compostos presentes em V.

cayennensis ainda são escassos, consequentemente, o estudo fitoquímico

atrelado ao estudo biológico é de grande valia para a comunidade científica

e para a população.

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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliação química e biológica das folhas, do caule, das raízes de

Ampelozizyphus amazonicus (Rhamnaceae) e frutos de Vismia

cayennensis (Clusiaceae), visando o aprimoramento do conhecimento

químico das espécies e verificação de suas propriedades medicinais

relacionados à malária e à sua ação estimulante e energética.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a atividade hemolítica direta dos extratos de A. amazonicus

sobre eritrócitos humanos;

• Realizar ensaios preliminares para a avaliação do potencial

antimalárico dos extratos obtidos;

• Fracionar o (s) extrato (s) ativo (s) de A. amazonicus e V.

cayennensis;

• Purificar e caracterizar os compostos químicos presentes nos extratos

bioativos das duas espécies botânicas;

• Avaliar a toxicidade aguda a as propriedades ansiolíticas dos extratos

de A. amazonicus em camundongos;

• Avaliar os efeitos farmacológicos na atividade motora, no modelo

campo aberto além da avaliação das atividades hipnóticas e sedativas, em

modelo de sono induzido por pentobarbital.

• Avaliar a citotoxicidade de extratos, frações e substâncias isoladas,

frente às células hepáticas HepG2;

• Realizar ensaios in vitro para estudo da atividade antimalárica durante

o ciclo hepático, utilizando Plasmodium berghei ANKA, e na fase de

desenvolvimento eritrocitário, utilizando Plasmodium falciparum ANKA;

• Realizar ensaios esquizonticidas eritrocitário e exoeritrocitário in vivo

em camundongos BALB/c infectados com P. berghei;

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• Avaliar a inibição in vitro de β-hematina pelos extratos, frações e

substâncias isoladas.

• Desenvolver o método para avaliar o perfil cromatográfico de extratos

de A. amazonicus e V. cayennensis.

• Quantificar o (s) componente (s) majoritário (s) nos extratos apolares

de A. amazonicus.

• Desenvolver metodologias analíticas, por CLAE acoplado ao

espectrômetro de massas, nos extratos polares de A. amazonicus.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Coleta e identificação botânica

Ampelozizyphus amazonicus foi coletada na fazenda experimental da

UFAM, situada no km 38 da estrada Manaus, BR 174 – Presidente

Figueiredo em Abril/2008. Uma exsicata correspondente à espécie

encontra – se depositada no herbário botânico do INPA sob número

191532.

Vismia cayennensis foi coletada na Reserva Florestal Ducke, km 26,

Manaus, AM 010 – Itacoatiara em Fevereiro/2008, a exsicata

correspondente à espécie encontra–se no herbário do INPA sob o número

18448.

3.2. Solventes e reagentes

Os solventes e os reagentes foram procedentes das marcas – Tedia ou

Merck grau HPLC e P.A. A água utilizada nos experimentos foi água Mili–

Q.

Os fracionamentos cromatográficos em coluna (CC) foram realizados em

colunas de vidro, utilizando gel de sílica 60 (70–230 mesh ou 230-400

mesh, Merck), Sephadex LH-20, sílica C-18 ou resina de poliestireno

amberlite XAD – 16 (Sigma) como fases estacionárias, conforme a

natureza da amostra. As dimensões da coluna variaram de acordo com a

quantidade de material empregado. As eluições foram feitas com solventes

orgânicos destilados, puros ou misturas de solventes combinados em

ordem crescente de polaridade.

A avaliação dos perfis cromatográficos das frações obtidas nos

processos de fracionamento foi realizada por cromatografia em camada

delgada (CCD). Para as cromatografias analíticas foram utilizadas

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cromatofolhas de alumínio 20x20 cm recobertas com gel de sílica GF 254

com 0,2 mm de espessura da marca Merck®.

A detecção das substâncias sobre CCD ocorreu pela visualização sob

luz visível e ultravioleta (UV) em comprimentos de onda de 254 e 365 nm,

seguida pela aplicação de agentes de revelação, por exemplo, vanilina

sulfúrica, NP/PEG ou Komarowvsky.

3.3. Equipamentos

3.3.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado ao

espectrômetro de massas (CLAE-DAD-EM)

As análises de CLAE – DAD – EM foram realizadas na Central Analítica

– CBA.

O equipamento utilizado nas análises por CLAE foi o modelo HPLC

Shimadzu LC-20, equipado com bomba de material inerte e com detectores

DAD e ECD e HPLC Shimadzu LC 20, na região de 190 – 600 nm. Foi

utilizado uma coluna C18 (Luna), 5 µ, tamanho 4,6 mm x 15 cm

(Phenomenex), o aparelho também é equipado com injetor automático e

forno de coluna e acoplado a um espectrômetro de massa Bruker

microTOF Q-II (Brucker Daltonic), ajustado para os seguintes parâmetros

de operação: temperatura do gás de secagem a 200º C, fluxo de 4 mL/

mim, nitrogênio como gás nebulizador à pressão de 0,4 Bar e voltagem do

capilar de 4500 V. As análises foram realizadas no modo negativo e a

aquisição do espectro foi realizada no modo full scan de 0 a 120 Da.

Os solventes, metanol ou acetonitrila, utilizados nas diferentes análises

por CLAE, foram de alta qualidade – grau CLAE – TEDIA.

A água foi obtida por destilação em sistema Mili-Q e os solventes foram

filtrados em filtro 0,45 µm (marca Milipore) antes da utilização.

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3.3.2. Cromatógrafo com fase gasosa acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM)

As amostras foram analisadas em um cromatógrafo a gás Agilent

Technologies 6896 N equipado com injetor split/splitness, acoplado a um

espectrômetro de massas por impacto de elétrons, a 70eV, com detector

de quadrupolo seletivo de massas AGILENT 5973 e banco de dados de

espectroteca Wiley 7n (40.000 registros) do Instituto de Tecnologia em

Fármacos de Manguinhos – far-manguinhos (FIOCRUZ) Rio de Janeiro.

Todas as análises foram efetuadas em coluna HP-5 MS (5% difenil e 95%

demetil polisiloxano) com dimensões de 30 m X 25 mm X 0,25 µm; gás de

arraste : Helio 1mL/min; e razão de split 1:20.

3.3.3. Espectrômetro de Massas

As análises foram realizadas no espectrômetro de massas pertencente à

Central Analítica- UFAM.

Os espectros de massas foram adquiridos usando um espectrômetro

íon trap LCQ Fleet (Thermo Scientific) equipado com uma fonte de

eletronspray operando no modo positivo ou modo negativo. A temperatura

de vaporização foi de 250ºC, o fluxo de “sheath gás” 30 L h-1, gás auxiliar 5

Pa, corrente de descarga 3 µA e fluxo de 50 µL min -1.

A administração das amostras foi feita por infusão direta através de

bomba de fluxo controlado. As amostras foram preparadas em solução de

metanol grau HPLC, tendo suas concentrações ajustadas para 50 ppm.

Fez-se necessário adicionar gotas de ácido acético glacial para auxiliar a

análise tandem. Para os experimentos MS/MS/MS, a taxa de fluxo de gás,

a energia de colisão, e entrada de células foram ajustadas para otimizar o

sinal de cada amostra e o máximo de informação sobre a estrutura do íon

de interesse.

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3.3.4. Ressonância Magnética Nuclear

As análises foram realizadas na Central Analítica da Fiocruz- RJ. Os

espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) foram

registrados em espectrômetros Brucker AC – 400 (400 MHz para 1H e 100

MHz para 13C), utilizando DMSO – d6, MeOD ou CDCl3 como solventes e

TMS (δ = 0,0 ppm) como referência interna. A interpretação dos dados foi

realizada com o auxílio da técnica DEPT 135 e DEPT 90 e confirmados por

dados espectroscópicos de correlação bidimensional HMBC e HSQC.

3.3.5. Ponto de fusão

Os pontos de fusão das substâncias foram obtidos em aparelhos

eletrônicos da marca Toledo FP 62, no qual a faixa de aquecimento é

programada pelo operador e o aparelho confirma no display a temperatura

de fusão da amostra, juntamente com um aviso sonoro. Foi utilizado taxa

de aquecimento de 5ºC/min.

3.4. Preparação dos extratos e fracionamento

3.4.1. Obtenção dos extratos de A. amazonicus

As raízes, os caule e as folhas foram lavados, posteriormente secos em

estufa com circulação de ar em temperatura de 40ºC, por dois dias.

Posteriormente, fez-se a separação das cascas das raízes do seu cerne e

o procedimento foi igualmente realizado para o caule (Figura 9). Todos os materiais botânicos foram triturados em moinho de facas, e os

materiais em pó obtidos foram submetidos à extração, por agitação

mecânica, com diferentes solventes orgânicos em ordem crescente de

eluição (hexano, clorofórmio/diclorometano, etanol e água), na proporção

de 1:10 por 8 horas. Após este período os extratos obtidos foram filtrados e

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os resíduos vegetais foram novamente extraídos com o mesmo solvente

por 8 horas. Este processo foi repetido até o esgotamento da extração.

Após a filtração, os solventes foram removidos sob pressão reduzida

em um evaporador rotativo na temperatura média de 45ºC. Os extratos

secos resultantes foram armazenados em vidro âmbar.

3.4.