UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS … · 2018-12-21 · universidade federal de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E

ENGENHARIA DE MATERIAIS (P2CEM)

MÁRIO RODRIGUES PEREIRA DA SILVA

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES DE PHB/PEG/ALG-e/NPsAg E

PHB/ZnO/Ag COM APLICAÇÃO BACTERICIDA

SÃO CRISTÓVÃO, SE - BRASIL

OUTUBRO DE 2018



MÁRIO RODRIGUES PEREIRA DA SILVA

ORIENTADOR: PROF. DR. LUÍS EDUARDO ALMEIDA

CO-ORIENTADOR: DR. GEORGE RICARDO SANTANA ANDRADE

SÃO CRISTÓVÃO, SE - BRASIL

OUTUBRO DE 2018

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S586p

Silva, Mário Rodrigues Pereira da Produção e caracterização de filmes de PHB/PEG/ALG-e/NPsAg e PHB/ZnO/Ag com aplicação bactericida / Mário Rodrigues Pereira da Silva ; orientador Luís Eduardo Almeida. - São Cristóvão, 2018. 127 f.

Dissertação (mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais) – Universidade Federal de Sergipe, 2018.

1. Ciência dos materiais. 2. Curativos. 3. Óxido de zinco. 4. Partículas (Física. química, etc.). 5. Bactericidas. 6. Polímeros – Aditivos I. Almeida, Luís Eduardo orient. II. Título.

CDU 66.017:61

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ii

“Quando não conseguir correr através dos anos, trote. Quando não conseguir trotar, caminhe.

Quando não conseguir caminhar, use uma bengala.

Mas nunca se detenha.”

Madre Teresa de Calcutá

iii

Dedico está dissertação

Ao meu avô Antônio Ferreira Rodrigues pela força e pelo aprendizado, aos meus queridos pais Amaro José da Silva e Leonice Pereira Rodrigues da Silva pelo amor, carinho, apoio e incentivo.

À minha irmã Maryelli Ludmilla Rodrigues da Silva pela atenção, carinho e por ser sempre uma pessoa com quem contar.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço,

• À primeiramente à Deus e ao mestre amado Jesus, pelo sopro divino de vida, o qual me

permite viver diversas experiências e conceder está cercado por pessoas tão especiais e

amorosas. Agradeço toda proteção, amparo, apoio, carinho e pelas lições constantes que

recebo.

• Aos meus queridos pais Amaro José da Silva e Leonice Pereira Rodrigues da Silva pelo amor,

carinho, apoio e incentivo. A minha irmã Maryelli Rodrigues por ser essa pessoa forte e por

todo carinho. À minha namorada Viviane Oliveira (Vivi) por toda compreensão, amor,

carinho e companheirismo. Aos meus avôs e avós, tios e tias, primos e primas em nome toda

a minha família pelo companheirismo e apoio.

• Ao meu Orientador Prof. Dr. Luís Eduardo Almeida por ter acreditado em mim, mesmo eu

sendo de outra área, pela orientação, por compartilhar seus conhecimentos e experiências e

por tornar possível o desenvolvimento deste trabalho.

• Ao meu Co-orientador e amigo Dr. George Ricardo Santana Andrade pelo desenvolvimento

de um trabalho brilhante, por todos os conselhos e aprendizado, por acreditar nesse trabalho,

pela amizade e inestimável contribuição na realização de todas as etapas desse trabalho, como

também pela atenção e preocupação.

• À Professora Dra. Iara de Fátima Gimenez por conceder a utilização de seu laboratório

(QUIBIOM) para o trabalho ser realizado.

• Ao grupo de pesquisa de Biomateriais do P²CEM, aos alunos, funcionários e professores do

departamento de engenharia de materiais - UFS.

• Ao Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano/CNPEM) por disponibilizar sua

estrutura para medidas de MET.

v

• Ao grupo de pesquisa do Laboratório de química de produtos naturais e bioquímica – UFS

pelos ensaios biológicos. Com os responsáveis Professor Dr. Charles dos Santos Estevam,

Professora Dra. Brancilene Araújo Santos, Professor Dr. Samuel Bruno dos Santos e

colaboradoras Karina Oliveira Mota e Anamaria Mendonça Santos.

• Aos meus amigos do programa de pós graduação em ciência e engenharia de materiais

(P²CEM) e laboratório QUIBIOM André Romão (Andrezão), Paulo Henrique (Ph), Keyte

(Dona Keyte), Icaro, Ivos, Givanilson (Grande Giva), Diego (Irmão), Diego (Diego Grandão),

Ricardo (Velhinho Contemporâneo), Thamasia, Genisson, Renato (Galeguinho), Helton

(Helton John), Liliane, Luzia Brito, Vagner (Monge), Cristiane da Cunha, Thamires, Bertilia,

Fernanda Dos Anjos, Leila, Fernanda Simões, Dona Nubia, Thiago Estrela, Jamile (Japa) e

aos alunos de ICs que contribuíram bastante neste trabalho Thiago de Sá, Rafael (Aviãozinho)

e João Vitor.

• À colaboradora Roberta Anjos De Jesus e ao seu orientador Prof Dr Mário Roberto do Grupo

de Catálise e Reatividade Química- UFAL, pelas medidas de FTIR.

• Aos meus amigos em especial Raimundo (Pai), Douglas e Lucas (galego da Parnaíba) por

toda à jornada de convivência diária, companheirismo, amizade e apoio.

• Aos amigos da paz Ana Cristina e Everardo Aguiar por todos esses anos de conselhos,

amizade e iluminação para o meu caminho.

• Ao meu amigo Jean Hilder (Jovem) por ser sempre é essa pessoa solidária e gentil, que

contribuiu bastante com esse meu ciclo de aprendizado, o meu sincero agradecimento.

• Aos meus amigos Prof. Adriano Reis por todos os conselhos, companheirismo e apoio; ao

Carlos Alberto (Carlinhos) por todo o incentivo e amizade e ao meu irmão Moabes por todo

apoio e amizade. Aquele sincero abraço!!!

vi

• Aos meus amigos de graduação e da UFAL e UFS Diego Alex (irmão Alex), Adeilson

(Matemática), Itamar (Matemática), Rodrigo Lucio (meu calouro), Clebio de Almeida

(Clebinho), David Piter (spider), Luciana Melo (Vaqueira) e Aparecida Letícia (CW).

• Ao CNPq, CAPES e FAPITEC por todo o apoio e financiamento.

• À Prefeitura Municipal de Delmiro Gouveia por todo incentivo enquanto funcionário público

da respectiva.

• A todos e todas muito obrigado!!!

vii

RESUMO

Resumo da Dissertação apresentada ao P²CEM/UFS como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais (M.S.c.)



Mário Rodrigues Pereira da Silva

Outubro/2018

Orientador: Prof. Dr. Luís Eduardo Almeida

Co-Orientador: Dr. George Ricardo Santana Andrade

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais

A associação de aditivos poliméricos e nanopartículas (metálicas ou semicondutoras) à matriz de

poli (3-hidroxibutitrato) (PHB) vem se difundido na literatura devido ao potencial de aplicação

na área de engenharia médica, principalmente para confecção de biocurativos. Nesse contexto, o

presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar filmes poliméricos pela técnica de

casting utilizando PHB associado ao polietileno glicol (PEG), alginato esterificado (ALG-e) e

nanopartículas de prata (NPsAg) ou nanoestruturas hierárquicas de óxido de zinco (ZnO)

decoradas com NPsAg (ZnO/Ag). NPsAg/citrato foram produzidas em suspensão aquosa e

adicionadas aos géis poliméricos pela técnica de troca fase. Nanoestruturas de ZnO foram

preparadas pelo método da precipitação na presença de tioureia e, posteriormente, decoradas com

NPsAg por um método de fotorredução. Dados obtidos por MET e pela espectroscopia de

absorção no UV-vis sugerem a presença de NPsAg/citrato aproximadamente esféricas com

diâmetros por volta de 20 nm e banda de plasmon centrada em 410 nm. Por outro lado, quando

as NPsAg são preparadas in situ na superfície do ZnO, a posição da banda de plasmon é

significativamente afetada pela concentração inicial do precursor de íons Ag+. De acordo com

dados de MEV e DRX, as partículas de ZnO apresentam morfologia de flores com estrutura

cristalina tipo wurtzita. Para a amostra preparada com a maior concentração de AgNO3, um pico

adicional em 38,5º sugere que as NPsAg possuem estrutura cúbica de face centrada. Os filmes

contendo PHB/PEG/ALG-e/NPsAg foram caracterizados por MEV e por um ensaio de

permeação a vapor de água (PVA), que sugerem que a presença de PEG aumenta a quantidade e

distribuição de poros ou defeitos e, consequentemente, um aumento no PVA. Análises de TGA

desse material demonstraram uma diminuição da temperatura degradação dos filmes de PHB

contendo os aditivos poliméricos e NPsAg, sugerindo que as NPsAg possuem efeito catalítico.

Os filmes PHB/ZnO e PHB/ZnO/Ag foram caracterizados por UV-vis-NIR, MEV e DRX, os

quais corroboram a associação do PHB e as nanoestruturas adicionadas. Pelo ensaio de PVA

desses filmes, observou-se uma maior permeação nos filmes contendo ZnO ou ZnO/Ag devido

ao aumento de poros ou defeitos na superfície desses filmes. Finalmente, testou-se a atividade

bactericida de todos os filmes preparados neste trabalho contra várias cepas bacterianas,

incluindo Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebisiella pneumoniae,

Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis. Resultados preliminares para estes ensaios

indicaram que o crescimento bacteriano foi inviabilizado na superfície dos filmes contendo

NPsAg, ZnO ou ZnO/Ag. Os dados obtidos até o momento demonstram o potencial dos filmes

com matriz de PHB e suas variações para utilização como biocurativos.

Palavras-chave: Biocurativo, óxido de zinco, nanopartículas de prata, bactericida, matriz

polimérica.

viii

ABSTRACT

Abstract of Dissertation presented to P2CEM/UFS as a partial fulfillment of the requirements

for the degree of master in Materials Science and Engineering (M.Sc.)

PHB/ZnO/Ag AND PHB/PEG/ALG-e/AgNPs BIONANOCOMPOSITE FILMS FOR

ANTIBACTERIAL APPLICATIONS

Mário Rodrigues Pereira da Silva

October 2018

Advisor: Prof. Dr. Luís Eduardo Almeida

Co-advisor: Dr. George Ricardo Santana Andrade

Department: Materials Science and Engineering

In this work, films based on poly(3-hydroxybutyrate) containing polymeric additives, such as

alginate and polyethylene glycol, silver nanoparticles or hierarchical ZnO/Ag hybrid

nanostructures were prepared and tested as bactericidal agents. AgNPs/citrate were produced in

aqueous suspension and added to polymeric gels by the phase exchange technique. Zinc oxide

(ZnO) nanostructures were prepared by a precipitation method in the presence of thiourea and,

subsequently, decorated with AgNPs by a simple photoreduction method. Citrate-stabilized

silver nanoparticles present diameters around 20 nm and plasmon band centered at 410 nm, as

shown by TEM and UV-vis-NIR spectroscopy. On the other hand, when the metal nanoparticles

are prepared in situ on ZnO surface, the plasmon band position is significantly affected by the

initial concentration of silver nitrate. According to MEV and XRD data, ZnO particles show a

flower morphology with a wurtzite crystal structure. For the sample prepared with the highest

concentration of AgNO3, an additional peak at 38.5° suggests that AgNPs have a FCC structure.

The films containing PHB, PEG, ALG-e and AgNPs were characterized by MEV and correlated

with the water-vapor permeability (WVP). The presence of PEG increases the quantity and

distribution of pores or defects, which increases the WVP. Thermal analyzes (TGA) of this

material demonstrated a decrease in the degradation temperature of the PHB films containing the

polymer additives and AgNPs, suggesting a catalytic effect. PHB films with ZnO or ZnO/Ag

were characterized by diffuse UV/vis reflectance spectroscopy, XRD, FTIR-ATR and SEM. The

characterizations corroborate the presence of both PHB and ZnO, with oxide particles well-

dispersed on the polymeric matrix. The PVA assay of these films presented a higher permeation

for the films containing ZnO or ZnO/Ag due to the increase of pores or surface defects of these

films. Finally, the bactericidal activity of the as-prepared films in this work was tested against

various bacterial strains, including Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebisiella

pneumoniae, Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis. Preliminary results for these

assays indicated that bacterial growth was unviable on the surface of films containing AgNPs,

ZnO or ZnO/Ag. The data obtained so far demonstrate the potential of PHB matrix films and

their variations for using as bio-curatives.

Keywords: Bio-curatives, Zinc oxide, Silver nanoparticles, Bactericidal, Polymeric matrix.

ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Modelo esquemático da pele humana sendo regenerada por um curativo. Descrito por

Vuelopharma [41]. ................................................................................................................. 11

Figura 2. Representação da estrutura geral dos PHAs. ............................................................ 13

Figura 3. Representação da estrutura molecular do PHB........................................................ 14

Figura 4. Representação da estrutura molecular do PEG. ........................................................ 16

Figura 5. Representação da estrutura molecular do alginato de sódio. Baseado em Yang et al.

[67]. ....................................................................................................................................... 17

Figura 6. Representação da esterificação do alginato de sódio, pelo método de Fischer, utilizando

como catalizador o ácido sulfúrico [69]. ................................................................................. 18

Figura 7. Abordagens top-down vs bottom-up para design de eletrodo transparente. A) Esquema

mostrando uma típica estratégia top-down via litografia. O fotorresistente é exposto à luz UV

apenas em áreas definidas. O fotorresistente exposto é então removido e o metal ou o óxido de

metal é evaporado na superfície. Na fase final, o fotorresistente é completamente lavado deixando

para trás apenas o material condutor diretamente ligado à superfície do substrato. B). Montagem

tipo bottom-up, aplicando em blocos de construção (moléculas ou nanopartículas) que se

automontam na superfície em uma estrutura definida. Baseado em Jelinek et al. [71]. ............ 20

Figura 8. Modelo representativo do efeito bactericida das NPsAg [11,16,78-80]. ................... 23

Figura 9. Sintetização de filmes pela técnica de casting [12]. ................................................. 30

Figura 10. Ilustração do método de inversão de fase: 1 – Soluções separadas de suspensão aquosa

de NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-e; 2 - Método de inversão de fases com a suspensão

aquosa de NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-e em agitação por 24 horas; 3 – Funil de separação

de fases para a suspensão aquosa com NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-e/NPsAg em por 24

x

horas e 4 - Separação do gel com PHB/PEG/ALG-e/NPsAg para produção do filme. Após a

separação, a fase mais densa foi vertida em uma placa de vidro, para ser formado o filme pela

técnica de casting. As amostras foram nomeadas de acordo com a Tabela 2. .......................... 31

Figura 11. Modelo esquemático da técnica de permeação a vapor d’agua disponibilizado na

norma internacional ASTM E 96/E96 M-05 [89]. ................................................................... 36

Figura 12. Espectro de absorção no UV-vis das NPsAg passivadas com citrato em fase aquosa.

.............................................................................................................................................. 42

Figura 13. Imagem da suspensão NPsAg/citrato em meio aquoso. .......................................... 42

Figura 14. A), B), C) representam às imagens de MET da amostra de NPsAg em meio aquoso, e

os círculos de cor amarela indicam a presença de prismas. D) Gráfico histograma de diâmetro

(nm) das NPsAg da A), B) e C). ............................................................................................. 43

Figura 15. Espectros de FTIR do ALG e ALG-e..................................................................... 45

Figura 16. Espectro de absorbância das suspensões de NPsAg após o método de troca de fase.

.............................................................................................................................................. 48

Figura 17. MEV das amostras da superfície do filme com A) PHB100, B) PHB100Ag, C) PHB90

e D) PHB98. .......................................................................................................................... 50

Figura 18. Demonstração das imagens obtidas pelo MEV para as composições de E) PHB92 e F)

PHB92Ag. ............................................................................................................................. 51

Figura 19. Permeabilidade a vapor de água dos filmes de PHB100(puro), PHB100Ag, PHB98,

PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag. As amostras de filmes

possuem simbologia (*) para maior significância pelo teste ANOVA com (p<0,05) ou variação

de PVA e (#) para nenhuma significância pelo teste ANOVA com (p<0,05) ou variação (PVA).

.............................................................................................................................................. 54

xi

Figura 20. Padrões de difração para as amostras dos filmes PHB100(puro), PHB100Ag, PHB98,

PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag. .............................. 55

Figura 21. Curvas Termogravimétrica (TG) dos filmes de PHB100(puro), PHB100Ag,

PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88. ............................................................................................ 59

Figura 22. Curvas Termogravimétrica Derivada (DTG) dos filmes de PHB100(puro),

PHB100Ag, PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88.......................................................................... 60

Figura 23. Espectros de FTIR das amostras de filmes PHB100Ag, PHB92Ag, PHB92, PHB90Ag,

PHB90, PHB88Ag e PHB88 para comparar com a medida do filme PHB puro. ..................... 63

Figura 24. Padrão de difração de raios X de pó do ZnO, do nanocompósito híbrido ZnO Ag 1mL

e ZnO Ag 5mL. ...................................................................................................................... 68

Figura 25. Espectro de absorção no UV-vis-NIR da amostra de ZnO puro e das amostras com

nanocompósitos conjugados de ZnO/Ag 1mL e ZnO/Ag 5mL................................................ 70

Figura 26. Imagens das suspensões aquosas do ZnO puro A) e dos conjugados de ZnO/Ag 1mL

B) e ZnO/Ag 5mL C). ............................................................................................................ 71

Figura 27. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO puro A), B) e C)

e o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO puro D). .................... 72

Figura 28. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO Ag 1 mL A), B),

C) e o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO Ag 1 mL D). ........ 73

Figura 29. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO Ag 5 mL A), B) e

C) o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO Ag 5 mL D). ........... 74

Figura 30. Padrão de difração de raio X dos filmes de PHB100 (puro), PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag

1mL. ...................................................................................................................................... 75

xii

Figura 31. Espectro UV-vis-NIR das amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO, PHB/ZnO Ag 1mL

e PHB/ZnO Ag 5mL .............................................................................................................. 76

Figura 32. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra dos filmes de PHBZnO A)

e o PHBZnO Ag 1mL B)........................................................................................................ 77

Figura 33. Demonstração da imagem obtida por MEV para amostra do filme de PHBZnO Ag

5mL e nos círculos amarelos apresentas as estruturas do ZnO Ag 5 mL. ................................ 78

Figura 34. Gráfico de PVA das amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag 1mL. As

amostras de filmes possuem simbologia (*) para maior significância pelo teste ANOVA com

(p<0,05) ou variação de PVA e (#) para nenhuma significância pelo teste ANOVA com (p<0,05)

ou variação (PVA). ................................................................................................................ 81

xiii

LISTA DE TABELA

Tabela 1. Características físico-químicas do PHB................................................................... 14

Tabela 2. Detalhamento das percentagens em massa dos filmes de PHB. ............................... 32

Tabela 3. Detalhamento das proporções dos filmes ................................................................ 33

Tabela 4. Posição das bandas encontradas pela técnica de FTIR com suas respectivas atribuições

para o ALG. ........................................................................................................................... 46


para o ALG-e. ........................................................................................................................ 46

Tabela 6. Detalhamento da adsorção das NPsAg nas amostras dos géis de PHB100Ag,

PHB98Ag, PHB92Ag, PHB90Ag e PHB88Ag. ...................................................................... 49

Tabela 7. Demonstração dos valores da taxa de permeação de vapor de água (TVA) para as

amostras de PHB100, PHB100Ag, PHB98, PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag,

PHB88 e PHB88Ag e comparando com o TVA alguns curativos comerciais. ......................... 53

Tabela 8. Temperatura de degradação térmica das amostras de PHB100(puro), PHB100Ag,

PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88. ............................................................................................ 60


para o PHB puro. ................................................................................................................... 64

Tabela 10. Índice de cristalinidade (IC) das amostras de filmes de PHB100, PHB100Ag, PHB98,

PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag. .............................. 64

Tabela 11. Demonstração dos valores da taxa de permeação de vapor de água (TVA) das amostras

de PHB, PHBZnO e PHBZnO Ag 1 mL e o (TVA) de alguns curativos comerciais................ 80

xiv

LISTA DE SIGLAS, NOMENCLATURAS E ABREVIATURAS

AC Ácido caféico

ALG Alginato de sódio

ALG-e Alginato esterificado

CFC Cúbica de face centrada

CuO Óxido de cobre (II)

DRX Difração de raios X

eV Elétron-volt

FDA Food e Drug Administration

FTIR Espectroscopia Vibracional na região do Infravermelho com

Transformada de Fourier

GE Grau de esterificação

MET Microscopia Eletrônica de Transmissão

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

NPsAg Nanopartículas de prata

NPsAu Nanopartículas de ouro

PAG(PHB)% Porcentagem de NPsAg que adsorveu nos géis poliméricos de PHB

PEG Polietilenoglicol

PEO Poli(etileno óxido)

PHAs Polihidroxialconoatos

PHB Poli(3-hidroxibutirato)

PHBV Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)

PLA Poli(ácido láctico)

PP Polipropileno

PVA Permeação a vapor de água

ROS Do inglês reactive oxygen species (com tradução literal, espécies

oxigenadas reativas)

Td Taxa de degradação máxima

Tg Temperatura transição vítrea

TGA Análise termogravimétrica

Tm Temperatura de fusão

xv

TSB Caldo tripticase soja

Tonset Temperatura perda de massa

TVA Taxa de transmissão de vapor d’água

UV-vis Espectroscopia de absorção no UV-visível

UV-vis-NIR Espectroscopia de absorção no UV-visível-infravermelho próximo

ZnO Óxido de zinco

xvi

SUMÁRIO

RESUMO ............................................................................................................................ VII

ABSTRACT ...................................................................................................................... VIII

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ................................................................................................ IX

LISTA DE TABELA ......................................................................................................... XIII

LISTA DE SIGLAS, NOMENCLATURAS E ABREVIATURAS ................................. XIV

CAPÍTULO I...........................................................................................................................1

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................2

CAPÍTULO II .........................................................................................................................7

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................8

2.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 8

2.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 8

CAPÍTULO III........................................................................................................................9

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 10

3.1 Curativo para ferimentos ....................................................................................... 10

3.2 Biomateriais ............................................................................................................ 11

3.3 Materiais poliméricos aplicados na engenharia tecidual ...................................... 12

3.3.1 Poli (3-hidroxibutirato) – PHB ...................................................................................... 12

3.3.2 Polietileno glicol (PEG) como plastificante ................................................................... 15

3.3.3 Alginato de Sódio parcialmente esterificado – ALG-e .............................................. 16

3.4 Nanomateriais: síntese, propriedades e aplicações ....................................................... 19

xvii

CAPÍTULO IV ...................................................................................................................... 26

4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ....................................................................... 27

4.1 Materiais ................................................................................................................. 27

4.2 Esterificação do Alginato de sódio com o n-Butanol. ............................................ 28

4.3 Produção de NPsAg pelo método do citrato e borohidreto. .................................. 29

4.4 Produção de filmes de PHB/PEG/ALG-e com NPsAg. ......................................... 29

4.5 Síntese de nanoestruturas baseadas em ZnO e ZnO/Ag ............................................... 32

4.6 Produção de Filmes com PHB/ZnO e PHB/ZnOAg ...................................................... 33

4.7 Caracterização físico-químico........................................................................................ 34

4.7.1 Espectroscopia de Absorção no UV-vis ......................................................................... 34

4.7.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................................................................ 34

4.7.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ............................................................. 35

4.7.4 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) ....................... 35

4.7.5 Difração de raios X (DRX) ............................................................................................ 35

4.7.6 Permeação a vapor de água PVA .................................................................................. 36

4.7.7 Análise Termogravimétrica (TGA) ................................................................................ 37

4.8 Teste in vitro com bactérias ............................................................................................ 38

4.8.1 Screening de Atividade Antimicrobiana ......................................................................... 38

4.8.2 Teste de difusão em ágar ............................................................................................... 38

4.9 Análise estatística ........................................................................................................... 38

CAPÍTULO V ....................................................................................................................... 39

SUBCAPÍTULO I ................................................................................................................. 40

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES DE PHB/PEG/ALG-e COM E SEM

NPsAg E TESTE DE INIBIÇÃO BACTERIANA IN VITRO ............................................... 40

xviii

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 41

5.1 Subcapítulo I - PHB/PEG/ALG-e/NPsAg...................................................................... 41

5.1.1 Caracterização das NPsAg ............................................................................................ 41

5.1.2 Esterificação do ALG .................................................................................................... 44

5.1.3 Análise da síntese e adsorção de NPsAg no gel de PHB/PEG/ALG-e por espectroscopia de

absorção na região do UV-vis. ............................................................................................... 47

5.1.4 Avaliação morfológica através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .......... 49

5.1.5 Permeação a vapor de água (PVA)................................................................................ 51

5.1.6 Difração de raio X (DRX) ............................................................................................. 55

5.1.7 Transições térmicas....................................................................................................... 56

5.1.8 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier FTIR (ATR) ............... 61

5.1.9 Aplicação in vitro (teste bacteriano) .............................................................................. 64

CAPÍTULO V ....................................................................................................................... 66

SUBCAPÍTULO II................................................................................................................ 66

RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 66

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES COM BASE EM PHB COM E SEM

ASSOCIANDO CONJUGAÇÕES ZnO/Ag E COM O ESTUDO DE INIBIÇÃO

BACTERIANA IN VITRO ..................................................................................................... 66

5.2 Subcapítulo II -PHB/ZnO/Ag ........................................................................................ 67

5.2.1 Caracterização do pó de ZnO/Ag .................................................................................. 67

5.2.2 Caracterização de PHB/ZnO/Ag ................................................................................... 74

5.2.3 Aplicação in vitro (teste bacteriano) .............................................................................. 81

CAPÍTULO VI ...................................................................................................................... 83

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 84

xix

CAPÍTULO VII .................................................................................................................... 85

7. TRABALHOS FUTUROS ................................................................................................ 86

CAPÍTULO VIII ................................................................................................................... 87

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 88

1

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

2

1. INTRODUÇÃO

O maior órgão do corpo humano é a pele, cujas principais funções são manter a temperatura

do corpo e protegê-la contra fatores externos, a exemplo de doenças infecciosas. Por conta de

sua exposição, a pele está sujeita a diversos tipos de lesões, como cortes, traumas, necroses e

queimaduras. Essas lesões podem evoluir rapidamente, caso o indivíduo seja portador de

determinadas doenças. Exemplos desse quadro são os portadores de diabetes, nos quais um

simples ferimento pode evoluir para uma úlcera de difícil tratamento, que por sua vez pode

ocasionar a amputação do membro ou, em casos mais extremos, a morte do indivíduo [1–3].

Quando ocorre a perda do tecido epitelial, o processo de recuperação da lesão torna-se mais

difícil, uma vez que a exposição da derme a deixa vulnerável a ação de bactérias patogênicas,

tornando-se necessária a utilização de curativos de pele que protejam a área lesionada e

apresentem características favoráveis à regeneração da epiderme, tais como boa fixação ao local

lesionado, flexibilidade, atoxicidade, porosidade, facilidade da remoção sem agravamento do

ferimento, minimização da saída de fluidos do organismo humano e, em alguns casos, a liberação

controlada de fármacos [1,4,5].

Apesar de eficientes, os curativos convencionais nem sempre apresentam as características

citadas anteriormente, pois além de serem de difícil remoção quando sua permanência se torna

relativamente longa, podendo provocar a reabertura do ferimento, eles apresentam outras

limitações por serem, em grande parte, de origem sintética, o que pode liberar resíduos nocivos

ao local de tratamento, causando rejeição por parte do organismo. Ademais, tais curativos

apresentam alto risco de contaminação por agentes patogênicos, tanto ao organismo onde são

aplicados, quanto ao ambiente onde serão descartados [6,7]. Devido a tais situações, estudos

buscam o desenvolvimento de curativos com alta biocompatibilidade [8,9] que sejam

reabsorvíveis pelo organismo, eliminando assim a necessidade de remoção e, consequentemente,

3

a geração de resíduos hospitalares que, como já dito, implicam em risco ambiental e têm alto

custo de descarte [10].

A engenharia tecidual é uma área da ciência relativamente recente que tem como um dos

seus objetivos o desenvolvimento de biomateriais com as características citadas anteriormente.

Dentre os biomateriais estudados para produção de curativos, destacam-se os biopolímeros, uma

vez que muitos deles contemplam as exigências necessárias para tal finalidade, a exemplo de: (1)

aptidão às diversas topografias do corpo humano, como em articulações; (2) superfícies porosas,

importante para a transição de nutrientes, CO2, O2 e vapor d’água, a qual mantem o ambiente

úmido e temperatura adequada; (3) compatibilidade com tecido epitelial, para facilitar uma

proliferação celular sem ocasionar danos na ferida; e (4) ação bactericida e fungicida, prevenindo

contra possíveis infecções ao organismo [11,12].

Neste contexto, um biopolímero bastante difundido na literatura é o PHB, o qual apresenta

aplicações em diversas áreas, a exemplo da ambiental, farmacêutica e médica [13]. Este material

polimérico é sintetizado por fermentação bacteriana e possui propriedade reológica de um

termoplástico altamente cristalino, portanto bastante quebradiço, além de ser biodegradável e

biocompatível [14]. A alta cristalinidade do PHB é consequência de sua estereorregularidade e

alta pureza, provenientes de sua produção. A sua composição é semelhante aos outros polímeros

originados de fontes não renováveis, como os provenientes do petróleo. Deste modo, o PHB se

destaca por ser biodegradável no meio ambiente. Entretanto, a fragilidade do PHB limita sua

aplicação na indústria, na medicina e na área farmacêutica. Para ampliar a utilização do PHB,

são necessárias diferentes estratégias para superar essas desvantagens, fazendo-se necessária a

indução da amorfização em sua estrutura, introduzindo aditivos, cargas ou mistura com outros

polímeros biodegradáveis [4,15]. O polímero PHB, além de ser bem difundido na literatura por

diversos estudos, é aprovado para que seja utilizado em diversas aplicações médicas nos EUA

pela Food and Drug Admisnistration (FDA) e outros órgãos reguladores em outros países [16].

4

O PEG possui características plastificantes, sendo utilizado em alguns estudos da

literatura para melhoria das propriedades mecânicas de biopolímeros [17 -20], tais como o PHB

[21,22]. Este plastificante de origem sintética apresenta entre suas características o fato de ter

biocompatibilidade, ser hidrofílico e biodegradável [13], além de possuir boa solubilidade em

solventes orgânicos e baixa toxicidade, o que tem motivado sua aplicação em dispositivos

médicos e farmacêuticos [23]. A homogeneização do PEG com o PHB resulta em aumento na

proliferação celular, o que indica uma melhoria em sua compatibilidade [24]. Além das vantagens

acima citadas, a literatura relata a utilização de PHB/PEG como dispositivo de liberação de

fármacos, podendo facilitar a regeneração de tecidos no organismo humano [25].

No contexto dos biocurativos baseados em ligas poliméricas, a adição de alginato de sódio

(ALG) com a finalidade de auxiliar no processo de cicatrização tem se mostrado promissora. O

ALG possui propriedade hidrofílica, auxiliando na desidratação de feridas do tecido epitelial

através da formação do hidrogel, o qual facilita o processo de absorção do exsudado do local

lesionado devido aos íons sódio, e favorecendo a restauração do tecido epitelial [26]. O ALG

apresenta dentre suas vantagens a biodegradabilidade, além de ser biocompatível e utilizado

como veículo na liberação controlada de fármacos com aplicação contra agentes patogênicos,

prevenindo sua proliferação [27]. Porém, devido sua natureza extremamente hidrofílica, o ALG

possui baixa compatibilidade com o filme de PHB, que é hidrofóbico. Uma solução para

aumentar a afinidade entre estes polímeros é a esterificação parcial do ALG com os álcoois de

cadeias variadas, o que confere um caráter anfifílico ao material, possibilitando uma melhor

homogeneização com a matriz de PHB [12].

Na literatura, destaca-se a utilização dos polímeros PHB e o ALG em associação com

compostos inorgânicos, tais como as nanopartículas de prata (NPsAg) e óxido de zinco (ZnO)

para aplicação de regeneração de feridas e queimaduras crônicas. Estes componentes conferem

as propriedades de combate a fungos e bactérias ao composto orgânico [11,28]. O ZnO é um

5

material amplamente estudado, por causa do seu bandgap largo de 3,37 eV e uma elevada energia

de ligação de éxciton de 60 meV. Deste modo, permite ao ZnO diversas aplicações em pigmentos,

aditivos de borracha, sensores de gás, etc. [29,30]. Este material possui funções em estabilidade

química, propriedades elétricas e piezoeléctricas. Entretanto, diversas funções do ZnO são

restringidas em decorrência da rápida taxa de recombinação de pares elétron-buraco e a sua

absorção na região ultravioleta [31].

Uma solução para este problema do ZnO seria sua dopagem, catiônica ou aniônica, ou a

associação com nanopartículas de metais nobres [28,31,32]. Neste contexto, nanoestruturas

híbridas de compósitos inorgânicos, tais como os óxidos metálicos, vêm sendo estudadas por

várias décadas com a finalidade de otimizar suas características para aplicação comercial em

diversas áreas, a exemplo da aplicação com absorção dos raios ultravioletas e conversão em

energia solar [33,34], optoeletrônica, detecção química e biológica, remediação ambiental e

catálise [31,35]. Tais características das nanopartículas metálicas vêm de suas habilidades em

aumentar o campo de incidência local e a densidade de estados na interface semicondutor-metal.

A conjugação resulta na formação de pares de portadores de cargas geradas pelo efeito da

ressonância de plasmon de superfície (SPR, Surface Plasmon Resonance), no aumento da

eficiência de separação de portadores de carga e extensão da absorção de luz para a região visível

[31]. Desta maneira, a conjugação do ZnO com NPsAg amplia a eficiência fotocatalítica, para

utilização em degradação de corantes orgânicos [32], e como agente bactericida. A colaboração

das NPsAg com o processo de ação bactericida do ZnO amplia a eficiência de produção de

espécies oxigenadas reativas (ROS, reactive oxygen species) e, dessa maneira, estimula a lesão

celular ou a própria morte das células, na qual é promovida a lixiviação de íons Ag+ e sua adesão

direta na superfície das células, resultando em variações na permeabilidade da membrana [31].

A proposta deste trabalho é desenvolver e caracterizar filmes de PHB formulados com

quantidades diferentes de PEG e ALG-e conjugados com NPsAg e ZnO/Ag, sendo aplicados

6

como agentes bacterianos. Os resultados e discussão foram divididos em duas partes, na primeira

parte são apresentados os resultados de síntese e caraterização de filmes PHB/PEG/ALG-

e/NPsAg e na segunda parte os resultados sobre a síntese e caracterização dos filmes baseados

em PHB associados com o híbrido ZnO/Ag.

7

CAPÍTULO II

OBJETIVOS

8

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo geral desse trabalho é sintetizar e caracterizar filmes com base em

PHB/PEG/ALG-e/NPsAg e PHB/ZnO/Ag com aplicação bacteriana.

2.2 Objetivos Específicos

− Modificar o ALG com o n-butanol e caracterizar físico-quimicamente.

− Preparar NPsAg com de borohidreto e citrato em meio aquoso.

− Transferir NPsAg em suspensão aquosa para o gel de PHB através da transferência de

fases.

− Preparar nanoestruturas de ZnO pela precipitação em solução aquosa na presença da

tioureia.

− Preparar híbridos ZnO/Ag pela fotorredução.

− Produzir filmes baseados em PHB/ALG-e/PEG/NPsAg e PHB/ZnO/Ag por casting.

− Caracterizar as amostras produzidas por espectroscopia no UV-vis, FTIR, MEV, MET,

DRX e PVA.

− Testar in vitro o material produzido frente à inibição bacteriana.

9

CAPÍTULO III

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

10

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Curativo para ferimentos

Os tratamentos convencionais de lesões na epiderme são realizados normalmente com os

curativos de origem sintética, que necessitam ser substituídos ao menos a cada 24 horas. Além

de apresentarem limitações como rejeição, podem ocasionar um risco de contaminação por

agentes patogênicos, tanto no organismo, quanto no ambiente onde serão descartados. Também,

são de difícil remoção quando sua permanência se torna relativamente longa, podendo provocar

a reabertura do ferimento [36]. Uma das demandas mais críticas quando se trata de curativos

hospitalares é o caso de queimaduras, pois estas deixam o tecido atingido extremante vulnerável

às contaminações por micro-organismos patogênicos, recomendando-se assim que a área

queimada não fique exposta. Dessa forma, o recobrimento de tecidos queimados requer atenção,

uma vez que não se pode recobrir diretamente a ferida com materiais convencionais (gases,

ataduras, algodão) sob pena destes aderirem à pele durante o processo de cicatrização. Neste

contexto, são utilizados géis ou pomadas para que criem uma interface entre o tecido queimado

e o material que o recobre, porém, tais pomadas mantêm a região úmida, limitando o processo

de cicatrização [37].

Assim, estudos buscam o desenvolvimento de curativos com alta biocompatibilidade que

sejam reabsorvíveis pelo organismo, eliminando assim a necessidade de remoção e,

consequentemente, a geração de resíduos hospitalares que, como já dito, implicam em risco

ambiental e têm alto custo de descarte. A engenharia tecidual é uma área da ciência relativamente

recente que busca exatamente o desenvolvimento de biomateriais com as características citadas

anteriormente [38]. Os biomateriais, como são chamados, podem ter composição de origem

cerâmica, metálica, polimérica ou compósita, com utilização temporária ou permanente no corpo

humano [39].

11

No contexto de curativos de pele, esse biomaterial deve propiciar a regeneração do tecido

para: evitar cicatrizes; permitir o transporte e troca de gases como vapor d’água, CO2, O2 e

nutrientes; compatibilidade celular para uma adesão na superfície do material, manutenção de

umidade e temperatura, além da própria camada de revestimento para evitar a exposição ao meio

externo; flexibilidade para adaptação à topografia do corpo humano; além de combater as

infecções por fungos e bactérias [36,40]. Os estudos de materiais com essas propriedades vêm se

difundindo na literatura para o tratamento de feridas crônicas e queimaduras de diversos tipos

[11]. Na Figura 1, pode-se observar uma imagem esquemática de um curativo de pele realizando

a regeneração tecidual da parte lesionada.

Figura 1. Modelo esquemático da pele humana sendo regenerada por um curativo. Descrito por

Vuelopharma [41].

3.2 Biomateriais

Com o aumento da expectativa de vida média da humanidade, intensificou-se o

número de estudos que atendam as necessidades do ser humano. Pensando dessa forma,

a medicina tem avançado em pesquisa e desenvolvimento de biomateriais para atender a

12

demanda em dispositivos como os curativos de pele humana e o panorama de produção

e inovão desses biomateriais gera um aumento significativo na qualidade de vida das

pessoas [42,43]. Biomaterial pode ser definido como qualquer material de origem natural ou

artificial que tenha compatibilidade com o corpo humano para uso temporário ou permanente,

exceto as drogas ou fármacos [44]. O biomaterial pode ser adicionado ou substituído para o

tratamento de órgãos, tecidos ou alguma função no organismo humano, que vai ter desígnio de

conservar a qualidade de vida do ser humano [44,45]. Os biomateriais têm características, além

da biocompatibilidade já citada, de não liberarem substâncias tóxicas, produzindo um nível

mínimo de rejeição pelo corpo humano. Dentre os biomateriais comumente utilizado na

medicina, os biopolímeros se destacam por apresentar, em sua grande maioria, compatibilidade

com o corpo humano [46].

Como citado anteriormente, os biomateriais podem ter origem polimérica. De maneira

geral, os polímeros são compostos que contêm em sua estrutura hidrogênio, carbono e outros

elementos não metálicos, com características de flexibilidade e baixa densidade. Os polímeros

têm origem sintética ou natural. Como exemplo, os biopolímeros podem ser obtidos de animais

e plantas, sendo encontrados na forma de proteínas, enzimas, amido e celulose. Inicialmente,

uma variedade desses biopolímeros foi introduzida como plásticos, elastômeros e fibras. Logo

em seguida, passou-se a aplicar esse material como biomateriais na área médica [47].

3.3 Materiais poliméricos aplicados na engenharia tecidual

3.3.1 Poli (3-hidroxibutirato) – PHB

O PHB é derivado da família dos PHAs (polihidroxialconoatos), que representam uma

classe polimérica de origem natural, biodegradável e produzidos por bactérias [48]. A Figura 2.

representa a estrutura geral do PHA, que é composta por monômeros condensados em ligações

13

éster. Os PHAs possuem propriedades semelhantes à dos plásticos convencionais derivados de

petróleo [49].

Figura 2. Representação da estrutura geral dos PHAs.

Em 1925, o Francês Maurice Lemoigne descreveu os primeiros dados científicos sobre o

PHB produzido por bactérias. Já nos anos de 1990, na Alemanha, foi desenvolvido e lançado

para o público um shampoo com embalagem biodegradável com base em PHB [50]. No Brasil,

a produção industrial foi realizada pela empresa Biocycle, no interior de São Paulo, através de

bactérias Cupriavidus necator utilizando cana de açúcar [51,52].

As pesquisas sobre PHB são bastante difundidas devido sua origem renovável e por se

tratar de um poliéster termoplástico altamente biodegradável e com propriedade hidrofóbica. Este

material contém uma fração cristalina de quase 80%, e a sua estrutura química se assemelha a

outros polímeros que são derivados do petróleo, sendo um material com características

ambientais ideais. Porém, a sua alta cristalinidade limita o uso do polímero em diversas

aplicações por ter propriedades mecânicas de um material rígido e quebradiço. Além disso,

devido sua biocompatibilidade, novas aplicações são realizadas principalmente na área médica e

farmacêutica com utilização em suturas, pinos, ligaduras, curativos e implantes médicos [53]. A

Figura 3 apresenta estrutura molecular do PHB [4].

14

Figura 3. Representação da estrutura molecular do PHB.

A literatura apresenta o PHB como uma alternativa promissora aos materiais poliméricos

de origem não renovável, sendo similar às características físicas e mecânicas do polipropileno

(PP), um dos materiais poliméricos mais difundidos no planeta [53–55]. Com característica

termoplástica, apresenta como propriedade mecânica principal a rigidez e fragilidade. A

temperatura de fusão (Tm) está entre 170-180 °C e a temperatura de transição vítrea (Tg) entre 0-

5 °C. O polímero PHB degrada através de cisão de cadeias aleatórias na ligação éster. Além

disso, o PHB apresenta uma temperatura de cristalização correspondente à temperatura ambiente,

o que faz aumentar o grau cristalino ao passar do tempo, resultando em um material frágil. A

Tabela 1 apresenta algumas propriedades físicas do PHB, tais como grau cristalino, Tm e Tg

[15,23,56,57].

Tabela 1. Características físico-químicas do PHB.

PHB Dados

Temperatura de fusão de (Tm) 170-180 °C

Temperatura de transição vítrea (Tg) 0-5 °C

Grau cristalinidade 60-80%

Fonte: Ublekov et al. [15] e Conti et al. [56].

15

Com a finalidade de diminuir a fragilidade e aumentar a flexibilidade do polímero PHB, a

literatura tem demonstrado a inserção de vários plastificantes na composição de materiais à base

deste polímero [48]. Este plastificantes reduzem a temperatura de transição vítrea e de fusão do

PHB fazendo com que o material originado seja mais flexível em relação PHB puro. Outros

benefícios seriam o auxílio à biodegradação do material, para que a entrada de enzimas de

degradação seja facilitada, e uma maior eficiência em liberação controlada de fármacos, por

exemplo [23,56,58,59].

O PHB apresenta aplicações na engenharia tecidual e aplicações diversas na medicina,

incluindo suturas, design de veículo de liberação controlada de fármacos, curativos, guias

nervosas absorvíveis, arcabouços para regeneração de ossos e nervos, cardiovasculares e suporte

cartilaginosos [60,61]. Por exemplo, Tănase e colaboradores [62] reportaram a síntese de

amostras baseadas em PHB/celulose e demonstram que a utilização das fibras propiciou um uma

melhoria nas propriedades físico-mecânicas do PHB, sendo este material adequado para a

indústria de embalagens.

3.3.2 Polietileno glicol (PEG) como plastificante

Plastificantes são aditivos aplicados em polímeros com a finalidade de otimizar a

elasticidade e processamento da matriz polimérica, modificando características do material,

como temperatura de fusão, temperatura de transição vítrea, o grau de cristalinidade e

propriedades mecânicas. Para que a interação ocorra de forma eficiente é necessário que haja

uma compatibilidade entre os materiais poliméricos e proporção que estabeleça o ponto de

flexibilidade desejada [63]. Uma estratégia utilizada para melhoria de propriedades mecânicas

do PHB é a utilização do PEG como aditivo plastificante. Este polímero de origem sintética é

bastante difundido por ser biodegradável [59], não tóxico, biocompatível com o organismo

16

humano e de excelente compatibilidade com diversos polímeros. A sua interação direta com os

esferolitos induz melhorias na viscosidade e flexibilidade da matriz, deixando-a mais amorfa

[12,13,64]. A Figura 4 apresenta a representação da estrutura molecular do poliéter PEG.

Figura 4. Representação da estrutura molecular do PEG.

A utilização do PEG é bastante recorrente em pesquisas no campo da engenharia tecidual,

principalmente para o design de curativos de pele humana, devido sua eficiência para desidratar

o ferimento e conseguir a diminuição da infecção, auxiliando na cicatrização [65,66]. Por ser um

plastificante, seu uso é proposto para a confecção de materiais flexíveis que serão utilizados em

locais de articulação, como joelho ou cotovelo auxiliando no processo curativo [13,64].

3.3.3 Alginato de Sódio parcialmente esterificado – ALG-e

O polímero ALG é originado através de algas marrons e algumas espécies de bactérias. A

composição química desse material é baseada em hidrocolóides de ácido poliurônico lineares,

podendo ser no formato de ligações glicosídicas do tipo β entre os ácidos β-D- manurônico (M)

e α-L-gulurônico (G), ao longo de uma cadeia linear, com íons Na+. Na Figura 5, tem-se a

representação da estrutura molecular do alginato de sódio. Este polímero tem características de

agentes espessantes, estabilizantes e emulsionantes, sendo bastante utilizado na indústria química

e alimentícia [50,67,68].

17

Figura 5. Representação da estrutura molecular do alginato de sódio. Baseado em Yang et al.

[67].

Por ser um biopolímero, o ALG vem sendo investigado para aplicações na área médica por

causa de sua biocompatibilidade, não toxicidade, baixo custo de produção, e eficiência em

restauração de tecidos do organismo humano [11] e carreador de fármacos [27]. Quanto à

confecção de curativos de pele, a potencialidade do uso de ALG em materiais para o tratamento

de queimaduras de pele ou pacientes com feridas crônicas se dá devido à sua propriedade de

formar hidrogel com facilidade, o qual pode originar materiais com características macias,

flexíveis e escorregadias deixando a pele lesionada com condições ideais para regeneração.

Adicionalmente, os íons de sódio interagem com o exsudado da pele através de uma troca iônica

favorecendo o ambiente para recuperação do tecido epitelial [11,68].

O ALG apresenta características hidrofílicas, portanto, para garantir uma interação

eficiente entre o ALG com outros materiais poliméricos hidrofóbicos, como o PHB, uma das

estratégias é fazer a esterificação parcial desse polímero. Desse modo, após o processo de

esterificação, o ALG poderá homogeneizar em solvente orgânico, como clorofórmio, e em bases

poliméricas, como o PHB. Os grupos hidroxílicos e carboxílicos livres na estrutura do ALG

dificultam esse processo de solubilização em solventes orgânicos apolares ou fracamente polares

e, com isso, ocorrendo o processo de esterificação nos grupos carboxílicos, a hidrofobicidade

18

deve aumentar melhorando a compatibilidade com solventes orgânicos e polímeros como o PHB.

A forma clássica de se realizar essa esterificação é pelo método de Fischer. A Figura 6 apresenta

a reação de esterificação do ALG, no qual os grupos carboxílicos reagem com um álcool (no

exemplo, butanol-1), gerando grupos éster no ALG, com liberação de água. A reação ocorre

utilizando um ácido mineral forte (ácido sulfúrico) como catalisador [69].

Figura 6. Representação da esterificação do alginato de sódio, pelo método de Fischer,

utilizando como catalizador o ácido sulfúrico [69].

O trabalho desenvolvido por Lopes et al. [12] demonstrou a preparação de filmes com

matriz de PHB, adicionando PEG como plastificante e ALG-e para dar característica hidrofílicas

ao PHB. O polímero PHB não apresenta absorção de água significativa, este fato o desfavorece

enquanto biomaterial para aplicação como curativo em pele humana. Uma solução para esse

problema é adição de ALG na composição do material. Entretanto, o ALG é solúvel em água e

pouco solúvel em solventes orgânicos. Dessa forma, para a incorporação do ALG com o PHB

em clorofórmio é necessária uma etapa de esterificação parcial nos grupos carboxílicos livres,

inserindo grupos alquila. Assim, o processo de esterificação parcial do ALG pode aumentar a

compatibilidade entre os dois polímeros, sem prejuízo de suas propriedades gelificantes. Dessa

forma, é possível preparar membranas de PHB/PEG/ALG-e com carácter mais hidrofílico, não

19

tóxicas, biocompatíveis e biodegradável. Na produção desse filme polimérico é utilizada a

técnica de casting, que utiliza um processo com secagem por evaporação de solvente.

3.4 Nanomateriais: síntese, propriedades e aplicações

A nanociência se dedica ao estudo de materiais com dimensões reduzidas na escala

nanométrica (1-100 nm) [70]. Estes materiais, conhecidos como nanomateriais, podem ser

fabricados por duas abordagens distintas: bottom-up e top-down. A abordagem bottom-up (de

baixo para cima) é baseada na síntese de estruturas orgânicas, inorgânicas ou híbridas, de modo

que a construção das estruturas ocorre átomo por átomo, molécula por molécula. Por outro lado,

a abordagem top-down aplica métodos físicos, tais como a moagem mecânica ou a ablação a

laser, para a fabricação de nanoestruturas [71-73].

Amplamente utilizados, os métodos top-down são difundidos em aplicações industriais. A

construção de modelos pode ser alcançada pela aplicação de métodos variados de litografia,

incluindo o feixe de elétrons, fotolitografia dentre outros. Embora os métodos top-down possam

superar as desvantagens como flexibilidade e custo do material, a preparação é geralmente

complexa, compreendendo processos em várias etapas e custo alto [71-73]. Por exemplo, a

Figura 7 apresenta duas abordagens distintas (top-down vs bottom-up) para design de um eletrodo

transparente. Na Figura 7A), pode-se observar um esquema mostrando uma estratégia típica top-

down via litografia, onde um material fotorresistente é exposto à luz UV apenas em áreas

definidas. O material fotorresistente exposto é então removido e o metal ou o óxido de metal é

evaporado na superfície. Na fase final, o material fotorresistente é completamente lavado

deixando para trás apenas o material condutor diretamente ligado à superfície do substrato [71].

20

Figura 7. Abordagens top-down vs bottom-up para design de eletrodo transparente. A)

Esquema mostrando uma típica estratégia top-down via litografia. O fotorresistente é exposto à

luz UV apenas em áreas definidas. O fotorresistente exposto é então removido e o metal ou o

óxido de metal é evaporado na superfície. Na fase final, o fotorresistente é completamente

lavado deixando para trás apenas o material condutor diretamente ligado à superfície do

substrato. B). Montagem tipo bottom-up, aplicando em blocos de construção (moléculas ou

nanopartículas) que se automontam na superfície em uma estrutura definida. Baseado em

Jelinek et al. [71].

Por outro lado, as técnicas que utilizam a abordagem bottom-up surgiram nos últimos

anos como uma alternativa promissora aos métodos top-down. Conforme ilustrado na Figura 7(B,

os processos dependem da automontagem para gerar estruturas padronizadas. Em essência,

usando processos espontâneos de reorganização, envolvendo átomos, moléculas e partículas,

como força motriz para a formação de estruturas padronizadas, os esquemas bottom-up geraram

uma infinidade de padrões bi e tridimensionais. De fato, os processos bottom-up exibem menos

21

etapas e menor complexidade em comparação aos processos top-down. Além disso, tecnologias

bottom-up podem ser implementadas em conjunto com substratos variados, morfologias

superficiais e reagentes químicos. A variedade disponível destes blocos de construção pode ser

explorada para se adaptar às propriedades micro e macroscópicas almejadas, abrindo vastas

oportunidades para aplicações práticas [71,73]. A Figura 7 B) apresenta uma representação de

uma montagem do tipo bottom-up, aplicando blocos de construção (moléculas ou nanopartículas)

que se automontam na superfície em uma estrutura definida [71].

Embora já existam vários tipos de nanomateriais, espera-se que uma variedade de novas

formas aparecerá no futuro. No entanto, com base na sua construção, os nanomateriais são

atualmente classificados como os baseados em carbono, em metais, semicondutores, em

dendrímeros e compósitos. Os nanomateriais de interesse na área biológica são baseados em

metais e semicondutores, incluindo os pontos quânticos, as NPs (nanopartículas) como a de Au

(ouro) e Ag (prata), estas últimas, atraentes por suas propriedades antibacterianas como será

discutido no tópico a seguir e óxidos metálicos (por exemplo, dióxido de titânio, óxido de zinco

e óxido de ferro). Pontos quânticos são semicondutores fluorescentes, variando de 2 a 10 nm, e

são caracterizados por um espectro de absorção amplo e espectros de emissão intensos, os quais

têm relação direta com o tamanho das partículas [71,74].

A nanociência vem desenvolvendo estudos com alguns metais como Ag, Au, Fe, Zn e Ti

[75,76]. Essas nanopartículas metálicas possuem propriedades ópticas e elétricas devido a um

fenômeno de superfície denominado “ressonância de plasmon”. Um plasmon pode ser

determinado pela excitação dos elétrons livres em um metal, possibilitando estabelecer espectro

de banda plasmônica por espectroscopia na região UV-visível [31].

Dentre os nanomateriais, as NPsAg apresentam destaque para aplicações diversas na

indústria, na área de biomateriais, de alimentos, tratamento de águas residuais, biossólidos e com

22

imensa aplicação na medicina por ter propriedade bactericida [77]. A atividade bactericidana área

médica é bem difundida em utilizar NPsAg em membranas poliméricas por ampla aplicação

contra micro-organismos, como vírus, fungos, bactéria gram-positivas e gram-negativas. Esses

mesmos micro-organismos são responsáveis por infecções hospitalares. Entre os fatores que

justificam a eficiência da prata, pode-se destacar a liberação de íons Ag+, os quais podem aderir

e penetrar a parede celular da bactéria e dificultar a aglutinação das bactérias na superfície de

algum material, com formação de radicais livre. Essa interação inibe a replicação do DNA

bacteriano e, portanto, implica na morte do micro-organismo [11,16,78–80]. A Figura 8

demonstra a aderência e liberação dos íons prata pela membrana polimérica na bactéria,

resultando na morte da mesma.

Para facilitar a aplicação como agentes bactericidas e fungicidas, as NPsAg podem ser

inseridas em uma membrana polimérica. O fato das nanopartículas possuírem elétrons livres, faz

com que elas consigam combater bactérias por mecanismos diversos. A presença da banda de

ressonância plasmônica é uma característica que comprova a existência de nanopartículas

metálicas, sendo esta observável na região do visível pela técnica de espectroscopia de absorção

na região do UV-vis. Por exemplo, nanopartículas esféricas com tamanhos variando entre 1 e 20

nm apresentam uma banda da ressonância de plasmon em torno de 420 nm [81,82].

Alternativamente, as NPsAg podem ser associadas a óxidos metálicos, tais como o TiO2

ou ZnO, para aumentar a atividade bactericida destes semicondutores. O mecanismo de ação

antimicrobiana neste caso tem sido atribuído ao aumento na formação de radicais oxigenados em

solução. A indução de estresse oxidativo pode ser devido a 1) geração de espécies reativas do

oxigênio (ROS) que interage com proteínas, DNA e lipídios do micro-organismo causando a

morte e 2) desorganização da membrana devido ao acúmulo das nanopartículas na membrana

bacteriana e também a sua internalização celular; liberação de íons Zn2+, no caso do ZnO, que se

ligam à membrana dos micro-organismos [83]. De maneira geral, a existência de NPsAg na

23

superfície do semicondutor, como, por exemplo o ZnO, favorece a formação das barreiras de

Schottky na interface metal-semicondutor. Portanto, por causa do nível de energia da banda de

condução de ZnO ser maior do que o nível de Fermi ZnO/Ag, as NPsAg podem atuar como uma

armadilha de elétrons, melhorando a segregação de portadores de carga, prevenindo a

recombinação. Nos passos seguintes, elétrons e buracos podem produzir as espécies oxigenadas

reativas (ROS) que causam degradação na membrana bacteriana [31,83].

Figura 8. Modelo representativo do efeito bactericida das NPsAg [11,16,78-80].

Segundo a NORMA ASTM E-2180 [84], a quantidade adequada para organismo humano

de NPsAg, seria de 120 µg NPsAg. O uso de prata em baixas concentrações possibilita melhorias

na adesão do material e menor contaminação do usuário.

24

Shao e colaboradores [85] sintetizaram NPsAg utilizando ALG e ácido ascórbico como

agentes redutores e estabilizantes. As NPsAg apresentaram uma forte atividade de inibição do

crescimento das bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, demonstrando seu potencial

como material de embalagem de alimentos. Em outro estudo, Montaser e colaboradores [11]

adicionaram NPsAg e o fármaco nicotinamida na matriz de ALG para liberação controlada, com

o objetivo do tratamento de infecções, feridas crônicas e queimaduras de variados graus. O

material obteve sucesso para aplicação in vitro com bactérias gram-positivas e gram-negativas,

in vivo em regeneração de ferimentos crônicos de queimaduras em ratos diabéticos e como

carreador de fármacos, com uma liberação controlada. Em outro trabalho desenvolvido por

Ignatova e colaboradores [25], foi produzido PHB/PEG contendo compostos fenólicos naturais

do ácido caféico (AC). Os materiais nanofibrosos contendo AC foram eficazes na supressão do

crescimento da bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e da bactéria Gram-negativa

Escherichia coli. Outro aspecto apresentado foi a sua boa citotoxicidade contra células tumorais

cervicais do organismo humano, através da liberação controlada do AC, possibilitando aplicações

de curativos bacterianos e o tratamento local de tumores cervicais.

Pelos resultados obtidos por Andrade e colaboradores [31], os quais sintetizaram

micropartículas de ZnO, com o formato de estrelas, decoradas com NPsAg, para aplicação em

fotocatálise e como agente bacteriano. As partículas híbridas de ZnO/Ag mostraram eficiência a

4 tipos de bactérias: a Gram-positiva Staphylococcus aureus (ATCC 43300, ATCC 25923 e

ATCC 33591) e bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). O trabalho

desenvolvido por Oualid e colaboradores [28] conseguiu sintetizar o material mesoporoso

ZnO/Ag no ALG de sódio, utilizando uma rota síntese por meio de alginato de sódio. As NPsAg

apresentaram morfologia aproximadamente esférica com tamanhos médios entre 40 a 50 nm.

Este trabalho demonstrou que polímero ALG tem afinidade para homogeneização ZnO/Ag em

matriz polimérica.

25

Lu e colaboradores [86] desenvolveram um biocurativo de pele com matriz polimérica

(quitosana) utilizando a conjugação do material de ZnO/Ag, por causa de sua característica de

baixa citotoxicidade e bactericida. Os resultados obtidos com a amostra de quitosana/ZnO/Ag

sugerem uma facilitação do processo de cicatrização do ferimento de pele. Neste trabalho, foram

realizadas aplicações em in vitro com bactérias e obtiveram alta eficiência contra bactérias

resistentes a medicamento. As aplicações in vivo mostraram que o processo de cicatrização tem

uma maior eficiência em relação às alternativas convencionais, como gaze e pomada ou a

quitosana pura. Deste modo, a conjugação de ZnO, Ag e biopolímeros propicia a formação de

um material promissor para tratamento de feridas de pele.

26

CAPÍTULO IV

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

27

4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

O presente trabalho foi dividido em duas partes:

Na primeira parte foi realizada a síntese de NPsAg pelo método do borohidreto e citrato,

esterificação do ALG de sódio com o n-Butanol e a preparação de filmes com PHB/PEG/ALG-

e/NPsAg em variadas proporções. Tais filmes foram caracterizados físico-quimicamente.

Posteriormente teste in vitro com bactérias foram realizados.

Na segunda parte do trabalho foi desenvolvido a síntese de ZnO pelo método de estabilização

de tioureia com a conjugação de NPsAg. Logo após foram produzidos filmes com PHB/ZnO/Ag

e caracterizado físico-quimicamente. Estes filmes também foram caracterizados

fisicoquimicamente para depois, ser executado teste in vitro com bactérias.

4.1 Materiais

O PHB empregado neste trabalho foi fornecido pela PHB Industrial S/A (São Paulo, Brasil)

(lote L: FE 150) com nome comercial de Biocycle® na forma de um granulado (MW=528.265 g

.mol-1., índice de poli dispersão = 2, HV= 4%, pureza= 99,57%, densidade= 1,23 g/cm3).

Clorofórmio (Panreac, 99,98% de pureza), Álcool n-Butílico (Neon), alginato de sódio

(Dinâmica [C6H7O6Na]n), PEG1500 (Synth) [OH-(CH2CH2O]34-H], borohidreto de sódio e

(Vetec), citrato de sódio (Sigma), acetato de zinco (ACROS Organics), tioureia (ACROS

Organics) e nitrato de prata (Sigma). Utilizou-se água ultrapura para a preparação das

nanopartículas.

28

4.2 Esterificação do Alginato de sódio com o n-Butanol.

A esterificação do ALG foi realizada de acordo com o método proposto por Broderick et

al. [70], metodologia esta reportada em trabalho prévio do grupo (Lopes et al. [12]). Em um

experimento típico, foi realizada uma mistura de álcool n-butanol (185 mL) com 5 g de ALG (na

proporção em massa de 30:1). Logo após, foi adicionado o ácido sulfúrico em quantidade de

(1mL) na solução. Esta mistura foi mantida sob agitação magnética à temperatura de 50ºC por 6

horas. Posteriormente, foi deixada em temperatura ambiente por 3 dias para etapa de secagem,

resultando no ALG parcialmente esterificado chamado de ALG-e [12,69].

Em seguida, foi utilizada a metodologia de Broderick et al. [69], para determinar a

proporção de esterificação do ALG-e. Resumidamente, uma massa de 0,5 g do produto foi

solubilizada em 50 mL de uma solução com 75% de etanol/água. Logo após a solução foi

homogeneizada em banho-maria sob agitação a 50ºC durante 30 minutos. Depois, foram

adicionados 40 mL de uma solução de NaOH (0,5 mol L-1) à solução do alginato esterificado e

o sistema foi agitado por mais 15 minutos a 100°C. A solução resultante foi resfriada até a

temperatura ambiente e titulada com uma solução padrão de HCl 0,5 mol L-1. O grau de

esterificação GE (%) foi calculado de acordo com a Equação 1.

%𝐺𝐸 =(𝑉𝑜−𝑉𝑝)𝑥𝑀𝐻𝐶𝑙𝑥73

𝑚 (1)

Onde Vo representa o volume de HCl utilizado na titulação da solução NaOH (branco),

Vp o volume de HCl gasto na titulação da amostra do polímero saponificado, MHCl é a molaridade

do HCl, 73 é a massa molar do íon butílico e m representa a massa da amostra em gramas.

29

4.3 Produção de NPsAg pelo método do citrato e borohidreto.

Para a produção das NPsAg passivadas com citrato, utilizou-se uma modificação do

método do citrato utilizado por Tejamaya et al. [87]. Para esta síntese, foram preparadas soluções

aquosas de citrato de sódio (0,31 mM), nitrato de prata (0,25 mM) e borohidreto de sódio (0,25

mM). Os volumes de 100 mL da solução de nitrato de prata e 100 mL de citrato de sódio foram

misturados em um balão de fundo redondo e foram agitados vigorosamente. Na sequência, um

volume de 6 mL da solução de borohidreto de sódio foi adicionado a esta mistura sendo esta

agitada lentamente durante 10 minutos por agitação magnética. Finalmente, a mistura foi

aquecida gradualmente até a ebulição em um banho de silicone líquido durante 90 minutos,

resultando em suspensão de NPsAg em meio aquoso.

4.4 Produção de filmes de PHB/PEG/ALG-e com NPsAg.

A síntese proposta foi baseada na metodologia descrita por Lopes et al. [12]. Um gel

polimérico foi preparado utilizando massas conhecidas de PHB, PEG e ALG-e em 50 mL de

clorofórmio. Para a homogeneização, a mistura foi aquecida a 80ºC sob refluxo e agitação branda

por 24 horas. Em seguida, foi separado 50 % do gel polimérico e aplicado na técnica casting sem

as NPsAg para formação do filme polimérico. A Figura 9 exibe a técnica casting, demonstrando

gel polimérico vertido em uma placa de vidro e exposto a atmosfera por evaporação do solvente

e solidificação do filme.

30

Figura 9. Sintetização de filmes pela técnica de casting [12].

Em seguida, foi utilizada uma metodologia proposta por Manivel e Anandan [88] para a

incorporação de NPsAg no gel polimérico, o qual é baseado no método de troca de fases. Em um

experimento típico, foi misturado um gel de PHB/PEG/ALG-e em clorofórmio a uma suspensão

aquosa de NPsAg/citrato, em uma proporção de 1:1 (v/v), sob agitação vigorosa por 24 horas.

Em seguida, as fases foram separadas com auxílio de um funil de decantação por 24 horas. A

Figura 10 exibe o esquema da separação de fases.

31

Figura 10. Ilustração do método de inversão de fase: 1 – Soluções separadas de suspensão

aquosa de NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-e; 2 - Método de inversão de fases com a

suspensão aquosa de NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-e em agitação por 24 horas; 3 – Funil

de separação de fases para a suspensão aquosa com NPsAg e o gel com PHB/PEG/ALG-

e/NPsAg em por 24 horas e 4 - Separação do gel com PHB/PEG/ALG-e/NPsAg para produção

do filme. Após a separação, a fase mais densa foi vertida em uma placa de vidro, para ser

formado o filme pela técnica de casting. As amostras foram nomeadas de acordo com a Tabela

2.

32

Tabela 2. Detalhamento das percentagens em massa dos filmes de PHB.

Amostra PHB PEG ALG-e NPsAg

PHB100 100% - - -

PHB100Ag 100% - - Com

PHB98 98,8% - 1,22% -

PHB98Ag 98,8% - 1,22% Com

PHB92 92,7% 6,11% 1,22% -

PHB92Ag 92,7% 6,11% 1,22% Com

PHB90 90% 10% - -

PHB90Ag 90% 10% - Com

PHB88 88,6% 10,22% 1,22% -

PHB88Ag 88,6% 10,22% 1,22% Com

4.5 Síntese de nanoestruturas baseadas em ZnO e ZnO/Ag

Para a síntese de nanoestruturas baseadas em ZnO, foi utilizado um procedimento

reportado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa com algumas modificações [31]. Em um

experimento típico, foram misturadas alíquotas de 25 mL de uma solução aquosa de acetato de

zinco (n = 2 mmol), 25 mL de uma solução aquosa de tioureia (n = 6 mmol) e 30 mL de água

ultrapura. Após 10 min sob agitação constante, o pH da mistura foi ajustado para valor de 12,0

com a adição 10 mL de uma solução aquosa de NaOH (1 mol.L-1). A solução foi deixada sob

agitação constante por mais 30 min e o precipitado foi centrifugado e lavado com água ultrapura

3 vezes. O sólido branco obtido foi seco em estufa a 45°C por 24 h. Logo depois, as

nanoestruturas híbridas baseadas em ZnO decoradas com NPsAg foram preparadas pelo método

da fotorredução. Inicialmente, foram utilizadas 1,0 e 5,0 mL de uma solução aquosa de AgNO3

com concentração de 20 mmol/L que foi diluída com 20 mL de água ultrapura, sendo

posteriormente gentilmente gotejada em uma suspensão aquosa (60 mL) de ZnO (2,0 mg/mL)

sob agitação magnética constante por 24 horas com incidência de luz ambiente. Finalmente, as

33

amostras foram lavadas duas vezes com água ultrapura através de centrifugação a 1500 rpm

durante 5 minutos e foram secas em estufa à vácuo e aquecida em 45°C durante 12h. As amostras

assim preparadas foram nomeadas de ZnO/Ag 1mL e ZnO/Ag 5mL. Como controle, o mesmo

procedimento foi realizado utilizando ZnO puro.

4.6 Produção de Filmes com PHB/ZnO e PHB/ZnOAg

A síntese proposta foi adaptada da metodologia descrita por Lopes et al. [12]. Em um

experimento típico, um gel polimérico foi preparado utilizando as seguintes proporções em

massa: (1) 100% PHB, (2) 90% PHB + 10% ZnO, (3) 90% PHB + 10% ZnOAg1mL e (4) 90%

PHB + 10% ZnOAg5mL em 50mL de clorofórmio. Para a homogeneização, a mistura foi

aquecida a 80ºC sob refluxo e agitação branda por 24 horas. Depois, os géis com 50mL foram

vertidos em uma placa de vidro e pela técnica de casting, os filmes foram formados. As amostras

foram nomeadas de acordo com a Tabela 3.

Tabela 3. Detalhamento das proporções dos filmes

Amostras dos filmes Proporções em massa

PHB PHB (100%)

PHB/ZnO PHB (90 %) ZnO (10%)

PHB/ZnO Ag1mL PHB (90 %) ZnO Ag1mL (10%)

PHB/ZnO Ag5mL PHB (90 %) ZnO Ag5mL (10%)

34

4.7 Caracterização físico-químico

4.7.1 Espectroscopia de Absorção no UV-vis

Os espectros de absorção das amostras em suspensão aquosa foram medidos em um

espectrofotômetro da Perkin Elmer modelo Lambda 45, utilizando cubetas de quartzo. Para as

medidas de amostras no estado sólido, fez-se uso de um espectrofotômetro da Ocean Optics

HR2000 equipado com uma fibra óptica e uma esfera integradora em modo de reflectância difusa.

As medidas foram realizadas na região de 300-600 nm. Os espectros foram medidos à

temperatura ambiente.

Após o procedimento de troca de fases, avaliou-se, qualitativamente, a adsorção de NPsAg

no gel polimérico através da Espectroscopia de Absorção na região do UV-vis, comparando-se a

absorbância antes e após da troca de fases. Deste modo, a porcentagem de adsorção de NPsAg

nos géis com PHB foi calculada com base na Equação 02, onde PAG(PHB)% é a porcentagem

de NPsAg que adsorveu nos géis, A(Inicial) representa a intensidade de absorbância antes da

troca de fases e A(Final) depois do processo de troca.

𝑃𝐴𝐺(𝑃𝐻𝐵)% = (𝐴 (𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)− 𝐴 (𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙)

𝐴(𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)𝑋100) (2)

4.7.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Os filmes produzidos foram metalizados com uma fina camada de ouro (NUPEG-UFS) e,

logo após, foram caracterizados quanto à sua morfologia em um microscópio eletrônico de

varredura (MEV) da marca Jeol, modelo JSM 6390LV/LGS localizado no Departamento de

Ciência e Engenharia de Materiais-UFS.

35

4.7.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

As imagens de MET foram adquiridas usando um microscópio da JEOL modelo 2100

operado em uma voltagem de 200 kV. As amostras para transmissão foram preparadas através

do gotejamento de uma suspensão aquosa das amostras em uma tela de cobre recoberta por duas

camadas: uma de polímero condutor (formva) e uma camada de carbono. O solvente foi

evaporado em uma estufa a 50°C. As medidas foram realizadas no Laboratório Nacional de

Nanotecnologia (LNNano-CNPEM).

4.7.4 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)

As análises de FTIR foram realizadas para avaliar possíveis interações da matriz de PHB

e os aditivos ALG-e e PEG, bem como para determinar se o processo de esterificação do ALG

foi bem-sucedida. As amostras foram analisadas em espectrômetro com Transformada de Fourier

na região do Infravermelho (FTIR) da Nicolet modelo iS-10, utilizando um atenuador de

refletância total (ATR). A resolução do equipamento foi de 4 cm-1, sendo feitas 32 varreduras na

faixa de 2000 – 700 cm-1. Para os pós de ALG e ALG-e foi utilizado o método da pastilha de

KBr, onde pastilhas de KBr contendo entre 1 – 2% em massa de ALG ou ALG-e foram

produzidas e analisadas.

4.7.5 Difração de raios X (DRX)

Os experimentos foram conduzidos em um difratômetro Shimadzu LabX XRD-6000,

operando em modo de varredura, com radiação CuKα (λ = 1,54056 Å) e filtro de níquel com

voltagem de 40 kV e corrente de 40 mA. Para os filmes poliméricos a velocidade de varredura

foi 2º/min e 2θ de 10 - 35º com um passo de 0,02 e para os pós produzidos 2θ de 5 a 70°.

36

4.7.6 Permeação a vapor de água PVA

A técnica permeação a vapor de água foi utilizada para medir a hidrofilicidade da amostra,

pelo método gravimétrico estático baseado na norma internacional ASTM E 96/E96 M-05[26]

descrito por Ning et al. [33] com modificações. Este método consiste em medidas da massa de

cloreto de cálcio de 3,5 g ± 0,1, dentro de recipientes selados hermeticamente com os filmes

preparados e acondicionado em dessecador contendo solução saturada de cloreto de sódio, para

promover umidade relativa. A Figura 11, mostra a representação do experimento com o medidor

de umidade do ar e temperatura, entrada de vapores, a impermeabilização ao redor de béquer

com os filmes de PHB e a utilização do cloreto de cálcio para absorção de vapores e

consequentemente o seu ganho de massa.

Figura 11. Modelo esquemático da técnica de permeação a vapor d’agua disponibilizado na

norma internacional ASTM E 96/E96 M-05 [89].

37

De acordo com a metodologia, foi determinado o grau de absorção da amostra estudada

pelo aumento de massa do cloreto de cálcio. Foram feitas pesagens durante 7 dias a cada 24

horas. Foi aplicada a Equação 3, para calcular a taxa de transmissão de vapor d’água (TVA).

𝑻𝑽𝑨 =∆𝒎

∆𝒕⁄

𝑨 3

Sendo A a área do filme exposta (m²), Δm (variação da massa em gramas) e Δt (a variação

do tempo em dias). A Equação 4 foi utilizada para calcular a permeação de vapor d’agua corrigida

pela área (TVA). O coeficiente de permeabilidade ao vapor d’água (PVA) foi calculado

utilizando a 1ª Lei de Fick.

𝑷𝑽𝑨 =𝑻𝑽𝑨

𝑺(𝑹𝟏−𝑹𝟐)∗ 𝒙 4

Sendo S a pressão de saturação do vapor d’água (Pa), na temperatura que foi executada o

teste, R1, é a umidade relativa do dessecador (60% ± 1), R2 a umidade relativa dentro da célula

do sistema (0%) e x para espessura do filme em metros (m).

4.7.7 Análise Termogravimétrica (TGA)

As análises de TG foram executadas para avaliar a influência dos aditivos, ALG-e e PEG,

na estabilidade térmica dos filmes de PHB. As análises termogravimétricas foram conduzidas em

um Analisador Térmico Simultâneo TGA/DTA, NETZSCH STA 449 F1 Jupiter, em atmosfera

de nitrogênio com fluxo de 100 mL/min, de 25 a 550°C com taxa de aquecimento de 10ºC/min.

38

4.8 Teste in vitro com bactérias

4.8.1 Screening de Atividade Antimicrobiana

Testes de suscetibilidade microbiana pelo método de difusão em ágar Mueller-Hinton

(CLSI, 2005) foram realizados em triplicata para cada micro-organismo, em ambas etapas, para

cepas padrões de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Klebisiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228.

4.8.2 Teste de difusão em ágar

Foram realizados testes com a avaliação pelo método de Bauer et al. [94] modificado.

Culturas Overnight (à 35 ºC ±2) em 5 mL de caldo tripticase soja (TSB) foram ajustadas para

padrão 0,5 de Mac Farland, 100 µL foram inoculados em placas de Petri contendo 4 mm de Ágar

Muller-Hinton (pH 7,2-7,4) previamente solidificado e semeado usando alça de Drigalsky.

Subsequentemente, discos das membranas com 1 cm2 foram postos sobre a superfície do

meio contendo os micro-organismos. Os constituintes das membranas foram controle negativo

(CLSI) [92]. Como controle positivo foram utilizados os antimicrobianos gentamicina 10µg/mL

- 120µg/mL com atividade conhecida para cepas padrão ATCC.

A atividade antimicrobiana foi avaliada pela presença de crescimento bactéria na região

onde foram colocadas as membranas.

4.9 Análise estatística

Todos os resultados foram coletados em triplicata e expressos com média ± desvio

padrão. A significância dos dados foi avaliada pelo teste de variância (ANOVA) com

significância de 95%.

39

CAPÍTULO V

RESULTADOS E DISCUSSÃO

40

CAPÍTULO V


SUBCAPÍTULO I

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES DE PHB/PEG/ALG-e COM E SEM

NPsAg E TESTE DE INIBIÇÃO BACTERIANA IN VITRO

41

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Subcapítulo I - PHB/PEG/ALG-e/NPsAg

5.1.1 Caracterização das NPsAg

Durante a síntese das nanopartículas, a coloração da solução inicial (incolor) muda

progressivamente para amarelo (ver Figura 13), indicando a formação das nanopartículas. A

caracterização desta amostra foi realizada por medidas da absorção na região do UV-vis e

análises de MET. Os espectros de absorbância na região do UV-vis foram adquiridos no intervalo

compreendido entre 300 e 600 nm. No espectro apresentado na Figura 12, é observada uma banda

centrada em 411 nm, a qual corresponde à banda de ressonância de plasmon das NPsAg. De

acordo com a literatura, absorções desta natureza entre 410 - 450 nm são atribuídas às

nanopartículas com morfologia esférica, devido a sua característica estreita e uma banda única

no espectro de UV-vis (ver Figura 12) [82,93,94].

42

400 500 600

0,1

0,2

0,3A

bso

rbâ

ncia

(nm)

(411 nm)

Figura 12. Espectro de absorção no UV-vis das NPsAg passivadas com citrato em fase

aquosa.

Figura 13. Imagem da suspensão NPsAg/citrato em meio aquoso.

Para melhor entendimento da morfologia, foram realizados ensaios de MET. Observando

as Figuras 14A), B) e C), pode-se sugerir que as partículas obtidas têm um predomínio da

morfologia aproximadamente esférica. No entanto, é possível também observar a presença de

partículas com morfologias anisotrópicas, tais como prismas, como indicado por círculos de cor

43

amarela na Figura 13. Segundo a literatura, a presença de nanoprismas de prata é comum para

este tipo de síntese e ocorre devido a processos de coalescência de partículas esféricas menores

facilitada por um excesso do agente redutor [95]. Com base nas imagens de MET, é possível

fazer uma estimativa mais precisa dos diâmetros médios das partículas. Como observado no

histograma presente na Figura 14 D), os diâmetros médios das partículas estão na ordem de 19,93

+ 8,38 nm, o que permite afirmar que as partículas obtidas são de pequena dimensão,

características favoráveis para aplicações como materiais bacterianos [82,94].

Figura 14. A), B), C) representam às imagens de MET da amostra de NPsAg em meio aquoso,

e os círculos de cor amarela indicam a presença de prismas. D) Gráfico histograma de diâmetro

(nm) das NPsAg da A), B) e C).

44

5.1.2 Esterificação do ALG

Neste trabalho, a esterificação do ALG teve como finalidade aumentar a interação entre

este biopolímero com a matriz de PHB. Este último, apresenta natureza hidrofóbica enquanto

que o ALG apresenta característica hidrofílica pela existência de grupos hidroxílicos e

carboxílicos [12]. A metodologia utilizada para esterificação do ALG foi baseada por um método

descrito por Fischer [69], o qual consiste na substituição de grupos carboxílicos livres por grupos

alquila, deixando o ALG com característica hidrofóbica. Desse modo, a esterificação parcial do

ALG não modifica a propriedade do mesmo formar hidrogel, o que é muito bom para estabilizar

as NPsAg e ainda, mantem certa quantidade de íons sódio em sua estrutura, os quais possuem

eficiência para cicatrização de feridas na pele humana [11]. O ALG-e foi caracterizado por FTIR

e o grau de esterificação determinado através de uma metodologia titulométrica [69].

Os espectros de FTIR (método das pastilhas de KBr) do ALG antes e após o processo de

esterificação são apresentados na Figura 15 e o resumo das principais bandas de absorção estão

apresentados nas Tabelas 4 e 5. Como o método utilizado foi o da pastilha de KBr, não podemos

comparar efetivamente as intensidades das bandas, mas pode-se fazer algumas inferências. Por

exemplo, as bandas centradas em 944 e 892 cm-1 do ALG nativo são provenientes dos resíduos

de ácidos gulurônico e manurônico (estiramento C-O), respectivamente. Estas bandas aparecem

bem reduzidas no ALG-e, sugerindo que o processo de esterificação também envolve os grupos

funcionais destes resíduos. Para o ALG, as bandas centradas em 1033 cm-1, 1416 cm-1 e 1606

cm-1 são provenientes de vibrações de grupos C-O de álcool, deformações simétricas e

simétrico de grupos carboxila COO-, respectivamente [12,69].

Ainda na Figura 15, pode-se observar que o espectro de ALG-e apresenta uma banda em

1735 cm-1, característica de carbonila de éster e outra banda em 1138 cm-1, a qual pode ser

45

atribuída à deformação axial da ligação éster C-O. Estes dados demonstram que a esterificação

do ALG foi bem-sucedida [12,68,69].

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

Ab

sorb

ân

cia

(nm)

ALG

ALG-e

16061416

1033

944

892

10311735

943 890

1138

Figura 15. Espectros de FTIR do ALG e ALG-e.

46


para o ALG.

Número de onda (cm-1)

Atribuições Obtido nesta

pesquisa Broderick et al. [70] Lopes et al. [12]

Estiramento simétrico do

COO- (grupos carboxilatos) 1606 1612 1604

Estiramento assimétrico do

COO- (grupos carboxilatos) 1416 1420 1413

Estiramento C-O-C

(Grupo éter) 1033 1025 1027

Resíduos de ácidos

gulurônico e manurônico

982 942,9 960

944 891 940


para o ALG-e.


Atribuições Obtido nesta

pesquisa Broderick et al. [70] Lopes et al. [12]

Éster (estiramento C-O) 1735 1736 1736

Deformação axial da ligação

éster C-O 1138 1134 1138

O grau de esterificação foi mensurado a partir de titulação e os valores obtidos aplicando-

se a Equação 01 foi de 39,3 ± 3,6 %. Estes resultados corroboram com resultados anteriores

obtidos pelo grupo de pesquisa onde a mesma metodologia foi utilizada (37 ± 0,5 %) [12].

Segundo Broderick et al. [69], a esterificação é um método simples pelo qual os grupos alquilo

47

são ligados às moléculas dos polímeros. Este método modificou o alginato nativo, aumentando

sua hidrofobicidade pela adição de grupos butilo e sem alterar suas características gelificantes.

5.1.3 Análise da síntese e adsorção de NPsAg no gel de PHB/PEG/ALG-e por espectroscopia de

absorção na região do UV-vis.

Com o objetivo de transferir as NPsAg para o meio orgânico (gel polimérico/clorofórmio),

aplicou-se o método de troca de fases. Através deste método, espera-se que as NPsAg passivadas

com citrato, em meio aquoso, interajam com os grupos funcionais do ALG-e, que tem como

função auxiliar na estabilização e evitar a aglomeração das NPsAg na matriz de PHB [11,16].

Após o tempo em contato, a suspensão aquosa com NPsAg foi removida da mistura com

o gel polimérico através de um funil de separação e o sobrenadante analisado pela técnica de

espectroscopia de absorção no UV-vis. A Figura 16 apresenta os espectros de UV-vis para as

soluções após contato com os géis PHB100Ag, PHB98Ag, PHB92Ag, PHB90Ag e PHB88Ag.

Pode-se observar que o perfil das bandas das amostras permanece inalterado, ou seja, os espectros

não apresentaram deslocamento da banda o que sugere que as partículas não se aglomeram.

Entretanto, foi observada uma diminuição na intensidade de absorbância, sugerindo uma

diminuição na concentração das nanopartículas e, consequentemente, uma possível transferência

destas partículas para a fase orgânica. Adicionalmente, outro indício que NPsAg adsorveram nos

filmes foi a mudança na coloração do gel polimérico, a qual ficou com um tom levemente

semelhante à solução coloidal.

Na Tabela 6 são apresentados os valores estimados de PAG(PHB)% (percentagem de

NPsAg adsorvidas nas membranas) conforme cálculo feito pela equação 2. A solução coloidal

que ficou em contato com o gel com composição PHB100 apresentou um grau de adsorção menor

em relação aos demais géis, estimado em 35,8%. O gel que contém PHB98Ag teve um valor

48

estimado de maior adsorção, com 60,4%, o qual justifica o uso de PEG e o ALG-e. Alguns

trabalhos na literatura indicam que a adição de aditivos poliméricos à matriz polimérica do PHB

auxilia a adsorção e estabilização das NPsAg e também na liberação controlada de fármacos

[16,96,97].

400 500 600

0,1

0,2

0,3

Ab

so

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

PHB90 Ag

NPsAg

PHB 100 Ag

PHB 98 Ag

PHB 92 Ag

PHB 88 Ag

Figura 16. Espectro de absorbância das suspensões de NPsAg após o método de troca de fase.

49

Tabela 6. Detalhamento da adsorção das NPsAg nas amostras dos géis de PHB100Ag,

PHB98Ag, PHB92Ag, PHB90Ag e PHB88Ag.

Material Intensidade de

Absorbância das NPsAg PAG (PHB)%

NPsAg (inicial)

0,3249 -

PHB98Ag 0,1286 60,4%

PHB90Ag 0,149 45,86%

PHB88Ag 0,1618 54,1%

PHB92Ag 0,1978 39,1%

PHB100Ag 0,2085 35,8%

5.1.4 Avaliação morfológica através da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Foi realizado um estudo da morfologia superficial dos filmes através do MEV para

estabelecer padrões de interstícios ou espaços vazios, os quais serão comparados com as medidas

de permeação a vapor de água. A Figura 17 apresenta imagens de MEV das superfícies dos filmes

de PHB com as seguintes composições PHB100, PHB100Ag, PHB98 e PHB90. A Figura 17A)

demonstra a morfologia do PHB100 com alguns poros em sua superfície. Pode-se constatar que

é semelhante à morfologia do PHB100Ag (ver Figura 17B)). Resultados de MEV reportados

anteriormente por nosso grupo de pesquisa [12] comparando imagens de MEV transversais dos

filmes de PHB com superficiais, constatou a presença de poros superficiais os quais não se

prologam na seção transversal das amostras. Para David e colaboradores [98], os poros

superficiais podem se tratar de defeitos ou vazios inerentes ao processo de casting e secagem dos

filmes, originados pela saída do solvente volátil.

A Figura 17C) apresenta imagens de MEV para a amostra com a composição de PHB90

(com PEG 10%). Pode-se observar que esta amostra apresentou maiores defeitos na morfologia

50

superficial em comparação as outras amostras. A Figura 17D) exibe a imagem da amostra de

𝑃𝐻𝐵98 e demonstra que a presença do ALG-e proporcionou uma redução do número destes

interstícios ou vazios em sua superfície em comparação com as demais amostras. Uma possível

explicação para a membrana PHB90 apresentar maior grau de defeitos pode estar relacionado a

uma cinética mais rápida de evaporação quando não há a presença do ALG-e nos filmes,

ocasionando uma saída mais rápida do solvente.

.

Figura 17. MEV das amostras da superfície do filme com A) PHB100, B) PHB100Ag, C)

PHB90 e D) PHB98.

Por fim, as Figura 18E) e F) apresentam imagens de MEV para as amostras PHB92 e

PHB92Ag, as quais apresentam PEG e ALG-e como componentes. Pode-se observar que as

51

amostras apresentam similaridades, o que indica que a eventual presença das nanopartículas não

afetou a morfologia da superfície destes filmes.

Figura 18. Demonstração das imagens obtidas pelo MEV para as composições de E) PHB92 e

F) PHB92Ag.

5.1.5 Permeação a vapor de água (PVA)

Para que os curativos de pele humana tenham uma eficiência na regeneração tecidual, é

necessário que apresentem uma superfície que facilite a troca de gases, como vapor d’água, CO2,

O2 e a troca de nutrientes, compatibilidade celular para uma adesão na superfície do material,

manutenção de umidade e temperatura [36,40]. Como apresentado no item anterior, os filmes

preparados apresentam vazios distribuídos em toda a sua estrutura que podem propiciar alguns

destes critérios. A troca de vapores e gases pode ser facilmente estudada utilizando a norma

ASTM E 96/E96 M-05[89], a qual avalia a permeação de vapores de água pela variação da massa

de um dado adsorvente higroscópico, no caso, cloreto de cálcio. Utilizando-se as equações 3 e 4

foi possível avaliar o grau de permeação ao vapor d’água dos filmes produzidos.

52

A Figura 19 apresenta um gráfico de barras expressando os valores de PVA para as

amostras dos filmes produzidos. A qual apresenta os resultados referente ao teste de variância

ANOVA com (p <0,05), deste modo, apresenta (*) para maior grau de significância e (#) para

nenhuma significância. O teste de variância ANOVA relaciona a amostra do filme de PHB100

com as demais amostras. Os filmes com as amostras PHB88 e PHB92 demonstraram maiores

variações de permeações e significância, as amostras que contém NPsAg obtiveram uma menor

significância com PHB90Ag e PHB92Ag. As amostras que demonstraram nenhuma significância

foram PHB88Ag, PHB98Ag e PHBAg.

Os dados obtidos sugerem que a adição de compostos plastificantes introduz na matriz do

filme caraterística de maior permeação de vapores de água. Os resultados exibidos pela

caracterização por MEV nas Figuras 17C), 18E) e 18F), as quais possuem adição de PEG na

matriz de filme de PHB, evidenciam uma maior quantidade de vazios, defeitos ou interstícios na

superfície das amostras de filmes. Assim, o plastificante PEG apresentou uma eficiência no

aumento da permeação de vapores em filmes em comparação com a amostra de PHB puro, o que

justificaria a utilização de PEG. Segundo Lopes et al. [12], a presença de PEG (6%) e ALG-e

(3%) propicia um aumento na taxa de permeação de vapores na matriz de filme de PHB. Este

mesmo trabalho reportou que adição do ALG-e e o PEG não influenciou no resultado de

permeação em relação ao filme com PHB puro (p <0,05).

Para as medidas de PVA na Figura 19 com amostras PHB98Ag, PHB92Ag, PHB90Ag e

PHB88Ag ocorreu uma diminuição na permeação de vapores. Entre as amostras com NPsAg, a

que apresentou maiores valores PVA foi PHB92Ag com maior quantidade de PEG nos filmes.

Segundo a literatura, a presença de NPsAg pode dificultar a passagem de vapores pela membrana,

sugerindo a presença das NPsAg nos interstícios ou vazios das amostras de filmes [99,100].

53

No trabalho desenvolvido por Wu et al. [101], foi analisado a taxa de transmissão de vapor

de água (TVA), em amostras de curativos comerciais, apresentado na Tabela 7. A qual foi

comparado com os resultados das amostras de filmes com matriz de PHB. Na Tabela 7, são

apresentados os valores para TVA dos filmes produzidos. É interessante destacar que os filmes

contendo NPsAg (PHB92Ag e PHB88Ag) apresentam, dentro da margem de erro, uma TVA

compatível com o curativo comercial à base de hidrogel da Bard (item 2 da Tabela 7). Isto

significa dizer que, mesmo as NPsAg diminuindo a TVA dos filmes similares sem as

nanopartículas (PHB92 e PHB88), a taxa de transmissão de vapor d’água destes filmes dopados

com NPsAg ainda permanece em níveis aceitáveis para aplicação prática de biocurativos.

Tabela 7. Demonstração dos valores da taxa de permeação de vapor de água (TVA) para as

amostras de PHB100, PHB100Ag, PHB98, PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag,

PHB88 e PHB88Ag e comparando com o TVA alguns curativos comerciais.

TVA (gm-2d-1) 24h (n=3) Wu [95] TVA (gm-2d-1) 24h (n=6)

PHB 18,8±10,4 1) Hidrocolóide

Dermiflex Johnson &

Johnson

76 ± 5 PHBAg 46,0±3,2

PHB98 58,3±6,6

PHB98Ag 25,8±7,1 2) Hidrogel Bard 50±19

PHB92 64,1±2,7

PHB92Ag 47,0±9,7 3) Hidrocolóide

Duoderm Convatec

Ltd

120±19 PHB90 53,1±5,6

PHB90Ag 17,3 ±2,4

PHB88 80,2±14,6

PHB88Ag 36,7±6,3

54

Figura 19. Permeabilidade a vapor de água dos filmes de PHB100(puro), PHB100Ag, PHB98,

PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag. As amostras de filmes

possuem simbologia (*) para maior significância pelo teste ANOVA com (p<0,05) ou variação

de PVA e (#) para nenhuma significância pelo teste ANOVA com (p<0,05) ou variação (PVA).

0

1E-11

2E-11

3E-11

4E-11

5E-11

6E-11

7E-11

8E-11

9E-11

1E-10

PHB92AgPHB88Ag PHB88 PHB92 PHB98 PHB98Ag PHB90 PHB90Ag PHBAg PHB

PV

A (

g.m

-1.d

ia-1

.Pa-

1)

Amostras

*

#

*

*

* *

*

*

*

*

#

#

*

*

55

5.1.6 Difração de raio X (DRX)

A difratometria de raios X foi utilizada com a finalidade de determinar possíveis

alterações na estrutura cristalina do PHB após inserção do ALG-e, PEG e NPsAg nesta matriz

polimérica. Os padrão de difração do filme de PHB puro apresenta picos largos centrados em

(2) 13,95º, 16,84º, 20,5º, 22,7º, 25,9º, 27,7º e 30,9º (ver Figura 20), os quais são atribuídos aos

planos (020), (110), (021), (111), (121), (040) e (002), respectivamente [102].

10 20 30 40

PHB puro

PHB 88Ag

PHB 88

PHB 90Ag

PHB 90

PHB 92Ag

PHB 92

PHB 98Ag

PHB 98

Inte

nsid

ade (

u.a

.)

2

PHB Ag

13,95 16,84 20,5 22,725,9 30,9

27,7

Figura 20. Padrões de difração para as amostras dos filmes PHB100(puro), PHB100Ag,

PHB98, PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag.

Ao inserir o PEG e ALG-e na matriz de PHB, os padrões de difração apresentam

similaridade ao filme de PHB puro [12], sugerindo que, aparentemente, a presença destes aditivos

não altera de forma significativa o padrão de cristalização dos filmes de PHB. O aparente

56

aumento de intensidade quando se analisa os filmes de PHB com NPsAg provavelmente é um

efeito de concentração, uma vez que pela técnica de troca de fases a mistura ficava sob agitação

por 24h e decantação por mais 24h o que poderia gerar evaporação do solvente com consequente

aumento de contração. Vale ressaltar também, que o PHB apresenta um halo centrado em torno

de 2 = 37,5º o que dificulta a visualização do pico largo de difração de maior intensidade das

nanopartículas de prata que é em torno de 2 = 38º [103]. Por esta razão, não foi feito o DRX

das amostras contendo prata para graus maiores, uma vez que, se o pico largo de maior

intensidade não aparece, os demais também não apareceriam.

5.1.7 Transições térmicas

A caraterização por TGA teve a finalidade de mensurar a estabilidade térmica dos filmes

baseados em PHB através da perda de massa nas amostras. Deste modo, a Figura 21 apresenta os

perfis térmicos da perda de massa em função da temperatura e os valores de Tonset e Td são

apresentados na Tabela 8.

Segundo a literatura, a degradação térmica do PHB é observada entre 250 – 300 ºC

formando produtos de degradação que consistem em oligômeros de baixa massa molecular e

ácido crotônico [12,83]. Deste modo, o filme preparado apenas com PHB apresenta uma Td em

293ºC referente à temperatura de degradação em única etapa. A degradação do PHB ocorre pela

cisão aleatória na ligação de éster em temperaturas acima de 200ºC, resultando em uma

diminuição da massa molar polimérica [104-106].

As amostras que contêm os aditivos PEG, ALG-e e NPsAg apresentaram temperaturas Td

menores em comparação ao filme com PHB puro. De acordo com a literatura, o ALG possui

temperatura de Tonset aproximado de 220°C a 300°C, atribuídas à decomposição de alginato [107-

57

109], demonstrando ter uma menor estabilidade em relação a matriz de PHB. As amostras com

PEG apresentam dois eventos de perda de massa: o 1º pico em torno de 290ºC e o 2º pico em

torno de 390ºC, o qual é evidenciado na amostra que contem PHB puro. O PEG 1500 utilizado e

segundo a literatura, possui uma decomposição térmica em torno de 350ºC e na temperatura de

450°C foi completamente degradado [110].

Foi estudado o comportamento térmico após a inserção das NPsAg na matriz de PHB.

Como pode ser observado na Figura 21, a temperatura Tonset nas amostras de filmes com

PHB100Ag, PHB92Ag e PHB88Ag, as quais possuem NPsAg, diminuiu a em relação ao PHB

puro. Este comportamento, no entanto, não é amplamente reportado na literatura e, até onde

sabemos, não foi encontrado no contexto do PHB. Alguns autores, como Rinaldi et al. [97] e

Ramos et al. [107], sugerem que a presença das NPsAg em matrizes poliméricas, como o PLA

(ácido polilático) e o PLGA (poli(ácido lático-co-ácido glicólico)), possibilita um aumento na

condutividade térmica do material, o que poderia acelerar o processo de degradação da matriz

polimérica. Entretanto, não acreditamos nesta hipótese, uma vez que um simples aumento na

condutividade térmica, advindo da presença das nanopartículas metálicas, iria acelerar (em

questão de tempo) o processo de degradação sem que houvesse mudança na temperatura de

degradação do polímero.

É importante destacar que a degradação térmica de um polímero é geralmente descrita,

de maneira simplificada, pela geração de radicais livres que atuam via reações em cadeia em

níveis intermoleculares e intramoleculares, seguido de uma etapa de terminação. Esta série de

etapas sugere que vários processos cinéticos e termodinâmicos estão envolvidos. Neste contexto,

Lee e colaboradores mostraram o efeito de nanopartículas de paládio na estabilidade térmica de

polímeros, como a poliamida (PA) e o polietileno tereftalato (PET) [111]. Segundo estudos

cinéticos da degradação térmica, a diminuição da temperatura de degradação destes polímeros

na presença da nanopartícula metálica pode ser explicada pela redução na energia de ativação do

58

processo, cujo efeito é maior que a diminuição do fator pré-exponencial. Ou seja, para este

sistema, o estudo cinético sugere que as nanopartículas de Pd têm um papel catalítico na

degradação térmica de PA e do PET. Neste mesmo contexto, Volkova e colaboradores

demonstraram que a degradação acelerada de filmes nanocompósitos baseados em

policarbonato/NPsAg se deva ao efeito catalítico das nanopartículas e que a diminuição da

energia de ativação tem relação direta com o tamanho e forma das NPsAg [112].

Desta forma, embora ainda aberto à discussão, acreditamos que a presença das NPsAg

nos filmes de PHB e PHB/PEG/ALG-e apresenta um papel catalítico decisivo para a diminuição

da temperatura de degradação dos nanocompósitos poliméricos. Entretanto, novas medidas de

TGA, juntamente com medidas de DSC, serão realizadas para todas amostras com finalidade de

avaliarmos a estabilidade térmica dos filmes preparados neste trabalho.

A Figura 21 demonstra as curvas termogravimétrica (TG) e a Figura 22 Curvas

Termogravimétrica Derivada (DTG) dos filmes de PHB100(puro), PHB100Ag, PHB92Ag,

PHB88Ag e PHB88.

59

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Pe

rda

de

ma

ssa

(%

)

Temperatura

PHB

PHB Ag

PHB92Ag

PHB88

PHB88Ag

Figura 21. Curvas Termogravimétrica (TG) dos filmes de PHB100(puro), PHB100Ag,

PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88.

60

50 100 150 200 250 300 350 400 450

De

riva

da

da

pe

rda

de

ma

ssa (

%)

PHB88Ag

PHB88

PHB92Ag

PHBAg

Temperatura

PHB

Figura 22. Curvas Termogravimétrica Derivada (DTG) dos filmes de PHB100(puro),

PHB100Ag, PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88.

Tabela 8. Temperatura de degradação térmica das amostras de PHB100(puro), PHB100Ag,

PHB92Ag, PHB88Ag e PHB88.

PHB puro PHB100Ag PHB92Ag PHB88 PHB88Ag

(𝑇𝑜𝑛𝑠𝑒𝑡) PHB Cº 270 211 212 210 211

(𝑇𝑑) 1º pico Cº 293 249 249 251 230

(𝑇𝑑) 2º pico Cº - 386 390 395 384

61

5.1.8 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier FTIR (ATR)

As medidas realizadas pela técnica de FTIR (ATR) foram conduzidas para caracterizar a

presença de grupos funcionais relativos aos filmes de PHB após adição ALG-e, PEG e NPsAg.

Foi estabelecida uma faixa de medida para o comprimento de onda de 2000-800 𝑐𝑚−1 para

análise de FTIR, na qual os principais grupos funcionais do PHB podem ser encontrados. Os

espectros de FTIR dos filmes são apresentados na Figura 23.

Nos espectros de infravermelho das amostras dos filmes com matriz em PHB, pode-se

observar uma banda centrada em 1721 cm-1, a qual é característica da deformação axial do grupo

C=O de éster [113]. Outras bandas relacionadas ao PHB são encontradas em 1278 e 1129 cm-1,

as quais são provenientes das deformações axiais do grupo éster C-O-C [114]. Para o PHB

destaca-se outra banda centrada em 1055 cm-1, a qual é proveniente do estiramento no grupo C-

O [115], outras bandas centradas entre 1458 e 1378 cm-1 são associadas às deformações angulares

assimétrica e simétrica do grupo CH3 [62,116], respectivamente, e uma banda em 979 cm-1

relativa a deformação axial da ligação C-C [62].

A Figura 23 também apresenta os espectros de FTIR das amostras dos filmes PHB100,

PHB100Ag, PHB98, PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88Ag e PHB88.

Para facilitar a observação dos resultados, as posições de cada banda e as atribuições dos grupos

funcionais foram adicionados na Tabela 9. De acordo com dados reportados por Lopes et al. [12],

os espectros de FTIR para filmes com composições semelhantes aos produzidos no presente

trabalho apresentam predominância das bandas PHB puro. O qual em seus resultados apresenta

bandas centradas em 1721, 1278 e 979 cm-1 provenientes de suas regiões cristalinas, porém, em

seus resultados as bandas centradas em 1459 e 1278 cm-1 são características de regiões amorfas

do polímero PHB. Desse modo, assim como observado por Lopes et al. [12], as intensidades das

62

bandas das regiões cristalina e amorfa diminuem com a inserção do ALG-e à matriz de PHB.

Porém, a adição de PEG e PEG/ALG-e aumenta a intensidade das bandas das duas regiões.

O índice de cristalinidade de PHB (IC) pode ser calculado através da proporção das

bandas sensíveis à cristalinidade (centradas em 1180, 1227 ou 1278 cm-1) e a banda insensível a

cristalinidade (centrada em 1380 cm-1) [117]. Desse modo, o cálculo de IC foi realizado

calculando-se a razão entre a intensidade das bandas 1180 e 1380 cm-1 e apresentado na Tabela

10. Observa-se na Tabela 10 que os valores são muito próximos uns dos outros com uma leve

tendência de aumento com os filmes que contém NPsAg. Este índice não pode ser encarado como

um dado absoluto de cristalinidade do PHB nos filmes, uma vez que a técnica adequada para

determina-la é a de DSC. No entanto, o índice pode ser utilizado de maneira comparativa.

63

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800

9791055

1101

112911801225127813781458PHB88Ag

PHB90Ag

PHB90

PHB92Ag

PHB98Ag

PHB88

PHB92

PHB100Ag

PHB

Tra

nsm

itância

(%

)

Número de onda ( cm-1

)

PHB92Ag

1721

Figura 23. Espectros de FTIR das amostras de filmes PHB100Ag, PHB92Ag, PHB92,

PHB90Ag, PHB90, PHB88Ag e PHB88 para comparar com a medida do filme PHB puro.

64


para o PHB puro.


Atribuições

Obtido neste

trabalho

Lopes et al. [12]

Carofiglio et al.

[115]

Deformações axiais do grupo éster C=O 1721 1721 1726

Deformações axiais do grupo éster

C-O-C

1278 e 1129. 1278-1130 -

Estiramento do grupo C-O 1055 1055 1050

Deformações angulares assimétrica e

simétrica do grupo CH3

1458 e 1378 1459 e 1380 -

Deformação axial da ligação C-C 979 978 -

Fonte: Lopes et al. [12] e Carofiglio et al. [115].

Tabela 10. Índice de cristalinidade (IC) das amostras de filmes de PHB100, PHB100Ag, PHB98,

PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88 e PHB88Ag.

PHB100 PHB98 PHB92 PHB90 PHB88

IC 0,76

0,74

0,77

0,76

0,74

PHB100Ag PHB98Ag PHB92Ag PHB90Ag PHB88Ag

IC 0,77

0,75

0,77

0,77

0,75

5.1.9 Aplicação in vitro (teste bacteriano)

Os ensaios de difusão em disco de ágar foram realizados com as amostras de filme de

PHB100(puro), PHB100Ag, PHB98, PHB98Ag, PHB92, PHB92Ag, PHB90, PHB90Ag, PHB88

e PHB88Ag. Os resultados preliminares revelaram que o crescimento dos micro-organismos não

se deu na superfície dos filmes que continham NPsAg. Ou seja, a presença das nanopartículas

proporcionou uma inibição bacteriostática na superfície dos filmes para os micro-organismos de

65

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebisiella

pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus epidermidis ATCC

12228 [86]. Tal resultado sugere a presença de prata nos filmes de PHB.

Este resultado apresenta correlação com outros reportados anteriormente na literatura, a

exemplo do trabalho de Slepicka et al. [16] que demonstra que amostra de filme com

PHB/NPsAg obteve uma maior eficiência com bactérias Gram-negativas (E. coli) e Gram-

positivas (S. epidermidis) que são frequentemente envolvidas em infecções hospitalares.

66

CAPÍTULO V

SUBCAPÍTULO II


PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FILMES COM BASE EM PHB COM E SEM

ASSOCIANDO CONJUGAÇÕES ZnO/Ag E COM O ESTUDO DE INIBIÇÃO

BACTERIANA IN VITRO

67

5.2 Subcapítulo II -PHB/ZnO/Ag

Nesta segunda etapa do trabalho, foram sintetizadas nanoestruturas hierárquicas de óxido

de zinco (ZnO) decoradas com nanopartículas de prata (NPsAg) e conjugadas à matriz de PHB.

O ZnO foi preparado pelo método da precipitação utilizando uma solução aquosa de acetato de

zinco e tioureia e conjugadas à matriz de PHB. Foram caracterizados por difração de raios X de

pó (DRX), espectroscopia de absorção no UV-visível (UV-vis), espectroscopia vibracional na

região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e permeação a vapor de água PVA.

E aplicação com teste bacteriano a fim de avaliar melhorias trazidas com a incorporação da prata

na superfície do ZnO.

5.2.1 Caracterização do pó de ZnO/Ag

O ZnO decorado com NPsAg foi analisado por DRX e a Figura 24 mostra os perfis de

difração das amostras analisadas. Pode-se observar a presença de picos centralizados em 32,18º,

34,79 º, 36,61 º, 47,88º, 56,93º, 63,29º, 66,64 º, 68,27 º e 69,37 º os quais são associados aos

planos (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) e (201) que correspondem a fase do

ZnO tipo Wurtzita (JCPDF ficha no. 36-1451) (ver Figura 24). Por outro lado, a amostra ZnO/Ag

5 mL, que apresenta maior concentração de nitrato de prata, 20 µmolL-1, possui um pico adicional

em 38,57º (ver Figura 24), o qual foi atribuído ao plano (111) de prata com estrutura cúbica de

face centrada (CFC) (JCPDF ficha no. 04-0783). Este pico adicional (* Ag) é atribuído às NPsAg

por ser largo e de baixa intensidade, características inerentes aos cristais de prata com tamanhos

reduzidos [31,119,120].

68

30 40 50 60 70

(201)

(112)

(200)

(103)

*Ag

(110)(102)

(101)

(002)

ZnO Ag5mL

ZnO

Inte

nsid

ade (

u.

a.)

2

ZnO Ag1mL

*

(100)

Figura 24. Padrão de difração de raios X de pó do ZnO, do nanocompósito híbrido ZnO Ag

1mL e ZnO Ag 5mL.

As propriedades ópticas dos conjugados de ZnO e ZnO/Ag foram analisadas pelas medidas

espectroscópicas no UV-vis-NIR no modo de reflectância difusa (ver Figura 25). O espectro de

UV-vis-NIR da amostra de ZnO (puro) é apresentado na Figura 25, os quais foram sintetizados

ZnO puro e ZnO/Ag em variadas concentrações de prata. Neste trabalho, o ZnO apresentou uma

banda no espectro de UV-vis-NIR em torno de 385 nm. Segundo a literatura, bandas em torno

380 nm correspondem aos nanocristais de ZnO, proporcional ao intervalo de banda óptica

(bandgap) em torno de 3,30 eV [9,31,121].

Já os espectros das amostras contendo NPsAg, ZnO/Ag 1mL e ZnO/Ag 5mL,

demonstrados na Figura 25, revelam que aconteceu uma sobreposição parcial da banda do ZnO

com a banda referentes à Ressonância de Plasmon (SRP). As amostras ZnO/Ag 1mL e ZnO/Ag

69

5mL apresentam bandas centradas em 427 e 480 nm, respectivamente, as quais são referentes à

ressonância de plasmon das nanopartículas de prata. A posição desta banda tem relação direta

com os diâmetros médios das partículas. Dessa forma, deslocamentos da banda de plasmon para

maiores comprimentos de onda, significam aumento do tamanho das partículas. Ou seja, o

aumento da concentração de nitrato de prata atua no aumento das partículas [121].

A amostra de ZnO puro em suspensão aquosa possui a cor branca, como demonstrado na

Figura 26 A). Por outro lado, as amostras com acréscimo de prata que possuem variações de cor

amarelo com ZnO/Ag 1mL (ver Figura 26 B)) e um tom de cor mais escuro para ZnO/Ag 5mL,

como apresentado na Figura 26 C). A cor das suspensões de NPsAg tem relação direta com a

forma e tamanho das nanopartículas, a qual variam de amarelada clara para diâmetros menores e

cores mais escuros para tamanhos maiores [31,121]. No trabalho desenvolvido por Zhang et al.

[121], foram sintetizados ZnO puro e ZnO/Ag em variadas concentrações de prata, para aplicação

fotocatalítica. Neste trabalho, o ZnO obteve uma banda no espectro de UV-vis-NIR em torno de

365 nm e as demais amostras com conjugações de ZnO/Ag em torno de 430-520 nm.

70

300 600 900

(480 nm)

(427 nm)

ZnO/Ag 5mL

ZnO/Ag 1mL

Ab

so

rbâ

ncia

(nm)

ZnO(385 nm)

Figura 25. Espectro de absorção no UV-vis-NIR da amostra de ZnO puro e das amostras

com nanocompósitos conjugados de ZnO/Ag 1mL e ZnO/Ag 5mL.

71

Figura 26. Imagens das suspensões aquosas do ZnO puro A) e dos conjugados de ZnO/Ag

1mL B) e ZnO/Ag 5mL C).

Foram realizadas análises da morfologia superficial por MEV, nas quais foi possível

mensurar o tamanho médio das partículas nas amostras de ZnO puro, ZnO 1mL e ZnO 5mL. É

descrito na literatura que o ZnO apresenta morfologias variadas , incluindo flores, cilindros,

cubos, placas e estrelas [31], o que é resultado da natureza polar da rede hexagonal Wurtzita

combinada com diferentes condições de síntese. Como descrito na Metodologia (Item 5.2), a

preparação das partículas de ZnO foi realizada por uma modificação em uma metodologia

desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa e reportada anteriormente na literatura [31,122]. A

metodologia original propiciava a formação de estruturas de ZnO com a morfologia de estrelas.

Entretanto, a simples modificação na concentração dos reagentes de partida (10 vezes superior

ao reportado pelo nosso grupo) propiciou a formação de ZnO com morfologia de flores, como

demonstrado pela análise de MEV (ver Figuras 27 A), B) e C)). O histograma com os diâmetros

médios, apresentado na Figura 27 D), exibe partículas com tamanhos na ordem de 1,4±0,6µm.

72

Figura 27. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO puro A), B) e C)

e o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO puro D).

As medidas de MEV para os conjugados de ZnO com nanopartículas de prata, ZnOAg

1mL e 5mL são apresentadas nas Figuras 28 A), B) e C) e Figuras 29 A), B) e C). Pode-se

observar que a morfologia de flores é preservada após a etapa de fotorredução. Na Figura 28 D)

é apresentado o histograma com os tamanhos médios das partículas ZnO Ag 1mL, o qual

apresentou diâmetro médio de 1,7±0,6µm. Por outro lado, a amostra ZnO Ag 5mL (ver Figura

29 D)) apresenta diâmetro de partícula na ordem de 2,4±0,4µm demonstrando um aumento de

tamanho das partículas respectivas. É válido comentar que as aproximações alcançadas pelo

equipamento utilizado neste estudo não são suficientes para a visualização das NPsAg. Desta

73

forma, análises de MET serão realizadas para obtermos maiores detalhes sobre características

morfológicas das NPsAg.

Figura 28. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO Ag 1 mL A), B),

C) e o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO Ag 1 mL D).

74

Figura 29. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra de ZnO Ag 5 mL A), B)

e C) o gráfico histograma para o tamanho do diâmetro das partículas ZnO Ag 5 mL D).

5.2.2 Caracterização de PHB/ZnO/Ag

As medidas de DRX foram realizadas para avaliar as fases cristalográficas presentes nos

filmes baseados em ZnO e ZnO/Ag associados na matriz de PHB. Os planos do PHB puro são

observados nos filmes contendo ZnO, ZnO Ag 1ml e ZnO Ag 5 mL com os seus respectivos

valores de 13,95º (020); 16,84º (110); 20,5º (021); 22,7º (111); 25,9º (121) e 27,7º (040) e 30,9º

(002) (ver Figura 30) [124,125]. Adicionalmente, são encontrados picos largos centrados em

31,74º (100), 34,38º (002) e 36,22º (101) para a amostra PHB/ZnO, 32,16º (100), 34,84º (002) e

36,65º (101) para a amostra PHB/ZnO Ag 1ml e 32,05º (100), 34,7º (002) e 36,5º (101) para a

amostra PHB/ZnO Ag 5ml, as quais são equivalentes a fase do ZnO tipo Wurtzita (JCPDF ficha

75

no. 36-1451). Este resultado sugere a presença das fases de PHB e ZnO nos filmes preparados

no presente trabalho. A ausência de picos referentes à fase cúbica das NPsAg tem relação com a

concentração relativamente baixa desta fase e pela intensidade baixa que este tipo de estrutura

(nanopartículas) geralmente apresenta [31,119].

15 20 25 30 35 40

PHB

PHB/ZnO

PHB/ZnO Ag 1 mL

Inte

nsid

ad

e (

u.a

)

2

PHB/ZnO Ag 5mL

13,95 16,8420,5

22,725,9 30,9

27,7

36,5

34,7

32,05

36,734,732,11

34,8236,6432,14

Figura 30. Padrão de difração de raio X dos filmes de PHB100 (puro), PHB/ZnO e PHB/ZnO

Ag 1mL.

As medidas de UV-vis-NIR foram realizadas nas amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO,

PHB/ZnO Ag 1 mL e PHB/ZnO Ag 5 mL demonstrado na Figura 31. O filme de PHB puro

apresenta uma banda centrada 418 nm. Entretanto, a amostra de filme PHB/ZnO demonstra a

presença de uma banda larga centrada em 370 nm, a qual seria uma sobreposição de banda

pertencente ao ZnO e do PHB. Segundo a literatura, o ZnO apresenta uma banda em torno de

380 nm [29,121].

76

Nas amostras de PHB/ZnO Ag 1 mL e PHB/ZnO Ag 5 mL os espectros de UV-vis-NIR

apresentaram bandas centradas 452,12 nm para filme de PHB/ZnO Ag 1 mL e 487,57 nm para o

filme de PHB/ZnO Ag 5 mL, como observado na Figura 31, confirmando a presença das

nanopartículas nos filmes preparados.

200 400 600 800 1000 1200

487,57 nm

452,12 nm

417,87 nm

PHB/ZnO Ag 5mL

PHB/ZnO Ag 1mL

PHB/ZnO

Ab

so

rbâ

ncia

(nm)

PHB

370,02 nm

Figura 31. Espectro UV-vis-NIR das amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO, PHB/ZnO Ag

1mL e PHB/ZnO Ag 5mL

Na Figura 32 A) para a amostra de PHBZnO e B) PHBZnO Ag 1mL, apresentam as

caracterizações por MEV. Foi observada nas amostras uma dispersão de interstícios ou vazios na

superfície, as quais apresentam um comportamento semelhante na morfologia para a PHBZnO e

PHBZnO Ag 1mL. Entretanto as amostras PHBZnO (ver Figura 32 A)) e PHBZnO Ag 1mL (ver

77

Figura 32 B)) apresentam um aumento de defeitos ou vazios em relação análise morfológica

superficial de MEV com PHB puro na Figura 17 A).

Figura 32. Demonstração das imagens obtidas por MEV para amostra dos filmes de PHBZnO

A) e o PHBZnO Ag 1mL B).

Na Figura 33, pode-se observar as imagens de MEV para os filmes com composição

PHBZnO Ag 5 mL, a qual apresenta em sua superfície defeitos ou vacâncias. Adicionalmente,

algumas estruturas de ZnO Ag 5 mL distribuídas de forma aleatória podem ser observadas. O

trabalho reportado por Diez-Pascual [83], o qual desenvolveu filmes de PHB impregnados com

ZnO (com quantidade de 1 e 8% de ZnO em relação ao peso do filme da amostra com PHBv)

apresenta resultados de MEV semelhantes aos obtidos neste presente trabalho, com uma

dispersão aleatória do ZnO na superfície dos filmes de PHB.

78

Figura 33. Demonstração da imagem obtida por MEV para amostra do filme de PHBZnO Ag

5mL e nos círculos amarelos apresentas as estruturas do ZnO Ag 5 mL.

O controle da permeabilidade ao vapor de água em filmes para aplicações biomédicas é

essencial, como comentado anteriormente. Nesse contexto se faz necessário que um curativo de

pele tenha propriedade de permeação de vapores de água, o que facilita a regeneração da pele

humana [36,40].

O teste de permeabilidade ao vapor de água foi realizado utilizando o método estático

adaptado da norma internacional ASTM E 96 / E96 M-0536, onde o ganho de massa de cada

sistema foi monitorado através de medições de massa a cada 24 h durante 7 dias [89]. Os

resultados de PVA apresentados teve objetivo de investigar a influência das amostras de ZnO e

ZnO Ag 1mL na matriz PHB. A Figura 34 demonstra o PVA das amostras de filmes de PHB,

PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag 1mL. As amostras com aditivos de ZnO e ZnO Ag 1mL obtiveram

79

uma maior permeação de vapor de água em relação ao filme de PHB puro. Os resultados dos

filmes com PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag 1mL tiveram variação significativa no teste ANOVA (p

<0,05), em relação ao filme de PHB puro, sugerindo maior permeação dos aditivos ZnO e ZnO

Ag 1 mL na variação (ver Figura 32). Entretanto, a presença da Ag na amostra PHBZnO Ag 1

mL diminui a permeação em relação ao filme com PHBZnO.

No resultado de MEV apresentado na Figura 32, as amostras PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag

1mL apresentaram maiores interstícios ou vazios em relação ao PHB puro na amostra de MEV

(demonstrado na Figura 17A)), o que sugere uma facilitação em permeação de vapores de água.

A Tabela 11 apresenta os valores da taxa de permeação de vapor de água (TVA) das

amostras de filmes de PHB, PHBZnO e PHBZnO Ag 1mL. Os quais foram comparados com

TVA de alguns curativos comerciais do trabalho estabelecido por Wu et al. [101]. As amostras

PHBZnO e PHBZnO Ag 1mL estabelecem valores de TVA semelhantes as amostras 1), 2) e 3)

da pesquisa de Wu et al. (ver Tabela 11 ).

No trabalho desenvolvido por Shankar et al. [125], nanopartículas de óxido de zinco (NPs

de ZnO) foram sintetizadas utilizando cloreto de zinco e NaOH e foram incorporados para

preparar filmes compósitos de PLA (poli (lactídeo) ou poli (ácido láctico))/NPsZnO. Neste

trabalho, a taxa de permeação de água para o PLA/NPsZnO foi menor em relação ao filme de

PLA puro. Entretanto, Marra et al. [126] obteve um aumento da taxa de permeação de água com

a inserção das NPsZnO. Tal efeito diferente na taxa de permeação de água de filmes poliméricos

contendo NPsZnO pode ser atribuído a vários fatores, incluindo o tipo de polímero,

compatibilidade entre a matriz polimérica e as nanocargas e a concentração de carga.

80

Tabela 11. Demonstração dos valores da taxa de permeação de vapor de água (TVA) das

amostras de PHB, PHBZnO e PHBZnO Ag 1 mL e o (TVA) de alguns curativos comerciais.

TVA (gm-2d-1) 24h (n=3) Wu [101]

TVA (gm-2d-1)

24h (n=6)

PHB 18,8±10,3 1) Hidrocolóide

Dermiflex Johnson &

Johnson

76 ± 5 PHBZnO 91,7±0,4

PHBZnO

Ag1mL 85,9±0,8

2) Hidrogel Bard

50±19

3) Hidrocolóide

Duoderm Convatec

Ltd

120±19

81

Figura 34. Gráfico de PVA das amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag 1mL.

As amostras de filmes possuem simbologia (*) para maior significância pelo teste ANOVA

com (p<0,05) ou variação de PVA e (#) para nenhuma significância pelo teste ANOVA com

(p<0,05) ou variação (PVA).

5.2.3 Aplicação in vitro (teste bacteriano)

Segundo os resultados do teste de difusão em disco de ágar, os quais foram aplicados nas

amostras de filmes de PHB, PHB/ZnO, PHB/ZnO Ag 1mL e PHB/ZnO Ag 5mL, o crescimento

dos micro-organismos aplicados Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853, Klebisiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922 e

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 foi inviabilizado nas amostras contendo ZnO e Ag. Os

resultados permitem sugerir duas afirmações: a primeira que é que fica comprovada a presença

0

2E-11

4E-11

6E-11

8E-11

1E-10

1,2E-10

1,4E-10

PHB PHB/ZnO Ag 1mL PHB/ZnO

PV

A (

g.m

-1.d

ia-1

.Pa-

1)

Amostras

*

*

*

*

*

*

82

de ZnO e Ag nos filmes de PHB, e a segunda é que este material é promissor para aplicações

biomédicas, visto que o mesmo é capaz de inibir da proliferação de bactérias

E segundo Díez-Pascual [83], o ZnO exibe ação biocida significativa para Staphylococcus

Aureus, com espectro de atividades antibacterianas em bactérias gram-positivos e gram-

negativas, incluindo Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis, Bacillus

subtilis, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis. Além disso, essas nanoflores são

consideradas “não-tóxicas” e consideradas pela Food e Drug Admisnistration (FDA) como

compostos geralmente reconhecidos como seguros (GRAS), e tem sido demonstraram que não

induzem nenhum dano ao DNA humano.

Abdalkarim e colaboradores [105] demonstraram que o PHBV puro não demonstra

atividade antimicrobiana. Entretanto, a associação deste polímero com nanopartículas de ZnO

propiciou a formação de um halo de inibição, indicativo de atividade bactericida. Finalmente,

Andrade e colaboradores [31] desenvolveram nano estrelas de ZnO decoradas com

nanopartículas de Ag. A atividade bactericida do ZnO puro e dos híbridos ZnO/Ag foi testada

para os micro-organismos Gram-positivo bactéria Staphylococcus aureus (ATCC 43300, ATCC

25923 e ATCC 33591) e Gram-negativa bactéria Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), o

que evidenciou um aumento significativo para esta propriedade após a adição das nanopartículas

de prata. Como comentado anteriormente, a atividade bactericida para híbridos

semicondutor/metal pode estar associada com o aumento de radicais oxigenados ou com a

lixiviação de íons Ag+.

83

CAPÍTULO VI

CONCLUSÕES

84

6. CONCLUSÕES

No presente estudo foram produzidos e caracterizados filmes de PHB/PEG/ALG-

e/NPsAg e PHB/ZnO/Ag com aplicação bactericida Diante dos resultados obtidos foi possível

concluir que a produção dos filmes baseados em PHB com aditivos poliméricos (PEG e ALG-e)

e nanopartículas (NPsAg ou ZnO/Ag) foi satisfatória, atingindo os objetivos almejados com

relação a uniformidade e reprodutibilidade. O procedimento de esterificação do ALG foi eficaz

e teve um rendimento aceitável em torno de 40%, o que garantiu que o alginato se tornasse mais

compatível com a matriz de PHB sem perder suas características gelificantes.

A produção das NPsAg em suspensão aquosa pelo método de borohidreto e citrato foi

eficiente, e tal comprovação foi obtida por análises de espectroscopia de absorção no UV-vis e

MET. O uso de aditivos como PEG e ALG-e melhoraram a homogeneização das NPsAg/citrato

pelo método de troca de fases. A produção de ZnO e ZnO/Ag demonstrou-se adequada, e tal

constatação foi feita por análises de UV-vis-NIR e DRX.

A taxa de permeação a vapor de água dos filmes produzidos foi condizente com materiais

convencionais produzidos de forma sintética. Os filmes contendo NPsAg, ZnO e ZnO/Ag

apresentaram inibição microbiana em sua superfície, evidenciando seu potencial antimicrobiano.

Os dados obtidos até o momento demonstram o potencial dos filmes produzidos como possível

aplicação para curativo de pele.

85

CAPÍTULO VII

TRABALHOS FUTUROS

86

7. TRABALHOS FUTUROS

− Adicionar PEG na membrana com PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag.

− Adição de uma variação de PEG 15% na matriz com PHB.

− Análise de ensaios mecânicos de tração para os filmes de PHB.

− Análise de FTIR para as amostras de ZnO, ZnO Ag, PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag

− Análise térmica das amostras de ZnO, ZnO Ag, filmes com PHB/PEG/ALG-e/NPsAg,

PHB/ZnO e PHB/ZnO Ag.

− Análise de MET para amostras ZnO e ZnO Ag.

− Testes biológicos com avaliação in vivo para os filmes de PHB e variações para propostos

curativos de pele.

87

CAPÍTULO VIII

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

88

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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