UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Ana Carolina Baltazar Zeredo

EFICIÊNCIA DE BIODIGESTORES ANAERÓBIOS MODELO LAGOA

COBERTA NA REMOÇÃO DE VÍRUS ENTÉRICOS EM DEJETOS

SUINÍCOLAS

FLORIANÓPOLIS

2015

Ana Carolina Baltazar Zeredo

EFICIÊNCIA DE BIODIGESTORES ANAERÓBIOS MODELO LAGOA

COBERTA NA REMOÇÃO DE VÍRUS ENTÉRICOS EM DEJETOS

SUINÍCOLAS

Trabalho apresentado ao Curso de

Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Santa Catarina como

requisito para a obtenção do título de

Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientadora: Profª. Drª. Célia Regina Monte

Barardi

Co-orientadora: MsC. Gislaine Fongaro

FLORIANÓPOLIS

2015

À minha família e seus esforços, sem os

quais eu jamais teria alcançado esta

conquista, dedico.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeira e primordialmente a Deus, detentor de minhas

crenças, mas acima de tudo de meu destino. Sem a fé os momentos de tristeza

decresceriam minha determinação, as dificuldades naturais da caminhada

acadêmica se transformariam em obstáculos intransponíveis e limitariam meu

crescimento como profissional e ser humano.

Após, entretanto igualmente importante, agradeço ao apoio integral

recebido de minha família. Obrigada a meu irmão Felipe, com suas palavras

carinhosas, brincadeiras e abraço acolhedor em todos os momentos que

precisei; a meus tios Juliano e Fernanda, que me receberam de braços abertos

em meu primeiro ano em Florianópolis, onde tudo era tão novo e assustador.

Sou grata especialmente a meus pais Elisa e Carlos, que mais que suporte

emocional forneceram a mim suporte financeiro para a concretização deste

sonho.

Agradeço também ao meu namorado Everton, que por vezes acreditou

mais em meu potencial do que eu mesma. Obrigada pelo incentivo e pela

inesgotável paciência com meus momentos de dúvida. Obrigada pela pessoa

iluminada que és, e por quem sou quando estamos juntos.

À minha colega de apartamento e grande amiga Michele, obrigada pela

parceria especialmente no início de nosso curso, paciência e sinceridade para

falar o que tinha de ser dito. Agradeço a oportunidade de carregar para sempre

nossas aventuras, indagações, incertezas e amizade construída acerca de

todos esses fatores.

Aos amigos e amigas, meus mais sinceros e profundos agradecimentos.

Obrigada pelas sábias palavras de coragem e incentivo de sempre, obrigada

também pelos momentos felizes resultantes de nossos encontros. Vocês

trazem sentido a esta jornada mundana.

Dedico agradecimento especial à minha orientadora Célia Barardi e co-

orientadora Gislaine Fongaro. Seus ensinamentos foram preciosos; jamais

esquecerei da disponibilidade a mim dedicada, das palavras doces mas ao

mesmo tempo exigentes e de tudo que aprendi nesses dois anos de LVA.

Vocês serão eternas e inesquecíveis em meu coração.

Obrigada também a minha colega de laboratório e amiga Camila, por ter

acompanhado e auxiliado meus trabalhos sem ter obrigação alguma. Agradeço

por ter me ajudado a adquirir confiança na condução dos meus experimentos,

bem como pelas explicações até mesmo das dúvidas mais simples.

Agradeço por fim, mas não menos necessário, a toda a equipe do

Laboratório de Virologia Aplicada - LVA, que desde meu primeiro dia sempre se

mostrou prestativa para ensinar e repetir o que quer que fosse. Obrigada pela

preocupação nos dias em que não me encontrava tão bem, e por acrescentar

experiências e lições à minha vida. Levarei seus ensinamentos em um lugar

especial de minha mente e coração.

Enfim, obrigada a todos que participaram desta caminhada. Agradeço

com muita sinceridade e amor.

RESUMO

A biodigestão anaeróbia (BA) apresenta-se como uma alternativa de

tratamento de dejetos suinícolas, reduzindo seu potencial de poluir água, solos

e ar, bem como permite a geração de biogás e reciclo do efluente como

biofertilizante agrícola. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar a

eficiência da higienização de dejetos suinícolas através da BA psicrofílica,

usando adenovírus porcino (PAdV), circovírus porcino-2 (PCV-2) e rotavírus A

(RV-A) como biomarcadores. Para isso, amostras brutas (afluente) e

biodigeridas (efluente) provenientes de biodigestores anaeróbios psicrofílicos

foram coletadas sazonalmente durante primavera-verão (novembro-2014 a

janeiro-2015) e outono-inverno (maio a julho de 2014) em Juiz de Fora-MG. As

amostras foram processadas e concentradas para a quantificação das cópias

genômicas (CG) virais provenientes de PAdV, PCV-2 e RV-A por meio de

qPCR. Amostras positivas para PCV-2 foram avaliadas quanto à sua

infecciosidade por meio de cultura celular. PCV-2 e PAdV foram positivos em

100% das amostras (8/8) no período outono-inverno, enquanto RV-A esteve

presente em 87,5% (7/8) das amostras avaliadas. No período primavera-verão,

PCV-2 e RV-A foram positivos em 100% das amostras, enquanto PAdV foi

positivo em 87,5% das amostras. Não foram encontradas diferenças

significativas na quantidade de genomas quantificados por qPCR antes e

depois da BA. Ensaios de infecciosidade mostraram em afluente 5,7 Log10 CG

mL-1 e 6,37 Log10 CG mL-1 provenientes de PCV-2 infecciosos durante outono-

inverno e primavera-verão, respectivamente; Em efluente suinícola, 5,0 Log10

CG mL-1 e 3,86 Log10 CG mL-1 provenientes de PCV-2 infecciosos durante

outono-inverno e primavera-verão, respectivamente. O teste de infecciosidade

mostrou que após a BA durante o período de primavera-verão houve redução

significativa (2,5 Log10) de PCV-2 infecciosos em efluentes suinícolas, no

entanto durante o outono-inverno a redução não foi significativa (0,97 Log10). A

presença de vírus entéricos infecciosos no efluente final aponta para a

necessidade de desinfecção dessa matriz após a BA, visando reciclo seguro

desses efluentes na biofertilização e fertirrigação.

Palavras-chave: higienização, biodigestão anaeróbia, vírus entéricos,

patógenos, efluentes suinícolas, biofertilização.

ABSTRACT

The anaerobic biodigestion (AB) is an alternative used to treat swine raw

manure, reducing its potential to pollute water, soil and air. It also allows the

generation of biogas and the reutilization of the effluent as agricultural fertilizer.

In this context, the present study aimed to evaluate the efficiency of swine

manure higienization during anaerobic biodigestion, using porcine adenovirus

(PAdV), porcine circovirus-2 (PCV-2) and the rotavirus A (RV-A) as

bioindicators and pathogens model. Affluent (raw manure, not processed) and

effluent (biodigested) samples were collected seasonally during spring-summer

(November 2014 and January 2015) and autumn-winter (May to July 2014) in

Juiz de Fora city – MG state. Samples were processed and concentrated and

viral genomic copies (GC) originated from PAdV, PCV-2 and RV-A were

quantified by qPCR or RT-qPCR. PCV-2 and PAdV were positive in 100% of

the samples (8/8), while RV-A was present in 87,5% (7/8) of the samples in the

period of autumn-winter. In the spring-summer analysis, PCV-2 and RV-A were

positive in 100% of the samples while PAdV was in 87,5% of the samples. Not

significant differences were observed in the quantity of genomes quantified by

qPCR before and after the AB. Infectivity assays showed: in affluent 5,7 Log10 CG

mL-1 and 6,37 Log10 CG mL-1 from infectious PCV-2 during autumn-winter and

spring-summer, respectively; In swine effluent, 5,0 Log10 CG mL-1 and 3,86

Log10 CG mL-1 from infeccious PCV-2 during autumn-winter and spring-summer,

respectively. After the AB, during spring-summer infectious PCV-2 reduction

was significant (2,5 Log10) after biodigestion process, although during autumn-

winter this reduction was not significant (0,97 Log10). The presence of infectious

enteric viruses in the final effluent samples highlights the need of disinfection

after AB, aiming a safe reutilization of these effluents for further biofertilization

and fertigation purposes.

Keywords: higienization, anaerobic biodigestion, enteric viruses, pathogens,

swine wastewater, biofertilization

LISTA DE ABREVIATURAS

ANDA Associação Nacional para Difusão de Adubos

ATCC American Type Culture Collection

BA Biodigestão Anaeróbia

cDNA DNA Complementar

CG/mL Cópias Genômicas por Mililitro

CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente

DNA Ácido Desoxirribonucleico

dNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura

FATMA Fundação do Meio Ambiente

GEE Gases de Efeito Estufa

HAdV Adenovirus Humano

HAdV-2 Adenovírus Humano Tipo 2

ICC-et-RT-qPCR Ensaio de Cultura Celular Integrada à RT-qPCR

Precedida por Tratamento Enzimático

mRNA RNA Mensageiro

OCDE Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico

OMS Organização Mundial da Saúde

PAdV Adenovírus porcino

PBS Tampão Salina Fosfato

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

PCV-2 Circovírus Porcino Tipo 2

PEG Polietilenoglicol

PSA Penicilina - Sulfato de Estreptomicina - Anfotericina

qPCR PCR em Tempo Real

RH Retenção Hidráulica

RNA Ácido Ribonucleico

RT Transcrição Reversa

RV-A Rotavírus Tipo A

SFB Soro Fetal Bovino

ST Sólidos Totais

UV Ultra-Violeta

SUMÁRIO DAS FIGURAS

Figura 1. Etapas da biodigestão anaeróbia. ..................................................... 16

Figura 2. Biodigestor anaeróbio em funcionamento, modelo lagoa coberta (A), e

sua representação esquemática (B). ................................................................ 18

Figura 3. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de

adenovírus........................................................................................................ 23

Figura 4. Suspensão viral de PCV-2 (A) – sorotipo não identificado - e suíno

acometido por circovirose (B). .......................................................................... 23

Figura 5. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de rotavírus:

as setas apontam partículas de camada dupla; os demais vírus contêm camada

tripla. A barra representa 100 nm. .................................................................... 25

Figura 6. Biodigestores anaeróbios semicontínuos de escala laboratorial,

unidade Embrapa Gado de Leite, Minas Gerais. .............................................. 28

Figura 7. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa

em Log10, obtida durante o período outono-inverno em afluente (a) e efluente

(b). .................................................................................................................... 36

Figura 8. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa

Log10, obtida durante o período primavera-verão em amostras de afluente (a) e

efluente (b). ...................................................................................................... 38

Figura 9. Distribuição da população viral avaliada durante primavera-verão e

outono-inverno. ................................................................................................ 40

Figura 10. Cópias genômicas (CG) totais (por qPCR) e detectadas a partir de

PCV-2 infecciosos (por ICC-et-RT-qPCR) presentes durante o outono-inverno

(a) e a primavera-verão (b). .............................................................................. 41

SUMÁRIO DAS TABELAS

Tabela 1. Avaliação de parâmetros físico-químicos das amostragens (n = 8 por

período). ........................................................................................................... 35

Tabela 2. Médias globais de cópias genômicas por mL (CG/mL), desvio padrão

e redução de carga viral pós-BA. ..................................................................... 39

SUMÁRIO DOS QUADROS

Quadro 1. Protocolos adotados, respectivas sondas e iniciadores utilizados

para qPCR........................................................................................................ 31

SUMÁRIO GERAL

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 144

1.1 Suinocultura ............................................................................................. 144

1.2 Biodigestão Anaeróbia e Reciclo de Efluentes Suinícolas ......................... 15

1.2.1 Tipos de Biodigestores Anaeróbios ......................................................... 17

1.2.2 Reciclo de Efluentes na Agricultura ......................................................... 19

1.3 Biomarcadores Virais para Monitoramento de Seguridade Sanitária de

Biofertilizantes Suinícolas ................................................................................ 21

2. OBJETIVOS ................................................................................................. 27

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 27

2.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 27

3. METODOLOGIA .......................................................................................... 28

3.1 Amostragens .............................................................................................. 28

3.2 Parâmetros Físico-Químicos das Amostras ............................................... 29

3.3 Análises Virais ............................................................................................ 29

3.3.1 Eluição, Concentração e Clarificação de Amostras ................................. 29

3.3.2 Extração de Material Genético ................................................................ 29

3.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR) ................... 30

3.4 Controle Interno de Recuperação e Detecção Viral ................................. 322

3.5 Ensaio de Infecciosidade de PCV-2 ......................................................... 322

3.6 Análises Estatísticas .................................................................................. 34

4. RESULTADOS ........................................................................................... 355

4.1 Parâmetros Físico-Químicos .................................................................... 355

4.2 Ensaio de Recuperação Viral ................................................................... 355

4.3 Análise de Vírus Entéricos em Afluente e Efluente .................................. 355

4.4 População Viral Circulante em Dejetos Suínos .......................................... 39

4.5 Estudo de Infecciosidade de PCV-2 ........................................................... 40

5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 42

6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 49

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 50

14

1. INTRODUÇÃO

1.1 Suinocultura

A suinocultura destaca-se como uma importante atividade a níveis

nacional e mundial, especialmente devido à movimentação da economia e ao

valor nutricional da carne suína, que possui todos os aminoácidos essenciais,

como leucina, lisina e valina, além de elevados percentuais de ferro, zinco,

potássio e de vitaminas do complexo B (MAGNONI & PIMENTEL, 2007; ABPA,

2015).

A expansão da suinocultura no Brasil ao longo das décadas ancora-se

em três fatores principais: (a) introdução de novas tecnologias no sistema de

produção; (b) aumento do consumo interno e (c) conquista do mercado

internacional. Atualmente, o país figura entre os dez maiores produtores

mundiais de carne suína. No ano de 2013, o efetivo nacional de suínos foi

superior a 36 milhões de cabeças. Somente a região Sul deteve 48,8% da

produção nacional, tendo o estado de Santa Catarina participado

aproximadamente com 17% do efetivo total, o que representou mais de seis

milhões de cabeças; por sua vez, a região Sudeste conta com o segundo maior

rebanho do país (SUINOCULTURA INDUSTRIAL, 2013; ABPA, 2015).

Entretanto, o desenvolvimento da atividade levou ao aumento da

geração de dejetos, o que gera impactos ambientais negativos, caracterizando

este setor agropecuário como um grande poluidor de solos, ar e águas. Estima-

se que os suínos produzam diariamente uma quantidade de excretas

equivalente a quatro vezes ao produzido pelos humanos, sendo que cada

animal excreta 4,9 a 8,5% de seu peso vivo diariamente. Os dejetos se

caracterizam por uma mistura de fezes e urina, restos de ração, águas vazadas

dos bebedouros, águas utilizadas para higienizar as instalações e por vezes

águas oriundas das chuvas, que podem adentrar nas calhas. O volume final

produzido é variável, pois depende de um conjunto de fatores como

composição da alimentação, técnicas de manejo e estado psicológico dos

animais (HENN, 2005; OLIVEIRA, 2006; KUNZ et al., 2009; HACK, 2011).

15

Observa-se na literatura que o conhecimento acerca dos aspectos

químicos, físicos e microbiológicos de dejetos suinícolas e biodigestores vêm

crescendo a cada ano. Como consequência, devido ao crescente aumento da

população de suínos no Brasil, é imprescindível adotar técnicas de manejo,

estocagem, tratamento, uso e disposição correta dos dejetos dentro dos

sistemas de produção, objetivando a manutenção da qualidade ambiental, a

reutilização segura dos resíduos em outros sistemas agrícolas e maior

rentabilidade na produção (DE MOTES et al., 2004; KUNZ et al., 2010;

VIANCELLI et al., 2012; FONGARO et al., 2014; MARTHALER et al., 2014;

SAADY & MASSÉ, 2015).

1.2 Biodigestão Anaeróbia e Reciclo de Efluentes Suinícolas

O reciclo de dejetos suinícolas para fins de biofertilização dos solos

resultante do manejo dos resíduos gerados pela prática da suinocultura

apresenta-se como alternativa de baixo custo, viável e que pode substituir

parcial ou totalmente a adubação dos solos por fertilizantes químicos. Um dos

processos de tratamento que visa o reciclo de dejetos é a biodigestão

anaeróbia (BA), responsável por estabilizá-los parcialmente (BASTOS &

MARA, 1992; SCHERER, 2003).

A BA é um processo onde bactérias e arqueas (micro-organismos

procariotos) decompõem a matéria orgânica, na ausência de oxigênio gasoso,

gerando os gases metano (CH4) e dióxido de carbono (CO2). Neste sistema

são decompostos e tratados resíduos orgânicos provenientes de práticas

agrícolas, indústrias, municípios e demais atividades humanas e é gerado o

biogás, utilizado na geração de energia, sendo que os efluentes tratados

possuem potencial biofertilizante (ALMEIDA, 2008; ORRICO JR, ORRICO &

LUCAS JR, 2010; REIS, 2012; RIZZONI et al., 2012).

A decomposição de matéria orgânica por BA inclui as fases de hidrólise,

acidogênese, acetogênese e metanogênse, estando sujeita às condições

específicas de temperatura, pH e tempo de retenção hidráulica (RH) da

biomassa no sistema, bem como varia de acordo com a constituição do

substrato e concentração de nitrogênio. Durante a hidrólise, compostos

16

orgânicos complexos – proteínas, lipídios e carboidratos - são hidrolisados e

reduzidos a compostos mais simples - aminoácidos, ácidos graxos e açúcares,

pela ação de bactérias fermentativas hidrolíticas. Na acidogênese, os produtos

resultantes da hidrólise são metabolizados em hidrogênio (H2), dióxido de

carbono (CO2), amônia ionizada (NH4+), ácidos graxos voláteis (ácido acético,

propiônico e butírico), sais e alcoóis; nesta etapa atuam bactérias

acidogênicas, que podem ser anaeróbias obrigatórias ou facultativas. Durante a

acetogênese, os produtos oriundos da fase anterior são metabolizados e há

produção de ácido acético e H2, precursores da formação de metano; atuam

nesta etapa bactérias acetogênicas. A metanogênese, última fase da BA, é

caracterizada pela produção de metano (CH4) a partir da redução de ácido

acético e de CO2 por micro-organismos procariotos conhecidos como arqueas,

que são metanogênicos e anaeróbios (WOESE et al., 1978; BELLI FILHO,

1995; CARON et al., 2009). Nesta fase também será encontrado o efluente

biodigerido. A Figura 1 resume as etapas descritas.

Figura 1. Etapas da biodigestão anaeróbia.

Fonte: Caron et al. (2009) - adaptado

Portanto, a BA pode reduzir significativamente o potencial poluidor de

produtos gerados por atividades como a suinocultura ao permitir a ciclagem de

17

material orgânico devido a vários fatores como temperatura, pH, umidade e

variação na composição química da matriz original de abastecimento do

biodigestor, o que implica em menor contaminação dos solos, do ar e das

águas, agregando valor não só à economia, mas também à sustentabilidade

(MANYI-LOH et al., 2013).

No Brasil, alguns dispositivos legais indicam e regulamentam o uso de

efluentes originários da produção animal. A resolução no 357/2005 do

Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) prevê padrões de

lançamento de efluentes em corpos d’água. Por sua vez, a resolução

no 375/2006 que reformula a resolução nº 357/2005 regulamenta a aplicação

de lodo humano em solos. Embora a suinocultura esteja contemplada na Lei

9.605/98 - Lei de Crimes Ambientais - por ser atividade de alto potencial

poluidor, atualmente a legislação brasileira é pouco específica no que tange à

regulamentação do uso e reuso de efluentes gerados por este exercício

(ZANELLA et al., 2006). A instrução normativa nº 11/2009 estabelecida pela

Fundação do Meio Ambiente (FATMA) determina que a quantidade máxima de

dejetos suinícolas aplicados em lavouras seja de 50m³/ha/ano, seguindo

recomendações de adubação embasadas em laudo de análise de solo.

O controle e fiscalização ambiental são necessários para remodelar as

práticas e procedimentos adotados pelas diversas vertentes da agropecuária,

de modo que os impactos ambientais resultantes das mesmas sejam

minimizados, buscando-se o bem estar da comunidade e a consequente

melhora na qualidade de vida (ZANIN, BAGATINI & PESSATTO, 2010).

1.2.1 Tipos de Biodigestores Anaeróbios

O biodigestor é o reator responsável por realizar a BA, fornecendo

condições ótimas para o desempenho de micro-organismos anaeróbios

metanogênicos. Apresenta um compartimento onde é depositado o material

orgânico a ser decomposto, sendo basicamente constituído por um tanque de

digestão e um gasômetro. Cada modelo de biodigestor deve se adequar às

competências da propriedade em que será empregado, como a necessidade

de biogás e as cargas de resíduos requeridas. Além disso, sua localização

18

deve vislumbrar a facilidade de distribuição do biogás pela propriedade a fim de

diminuir custos de armazenamento e transporte (DEGANUTTI et al., 2002;

OLIVEIRA, 2004).

Para tanto, existem biodigestores que atuam de forma descontínua (ou

por batelada) e contínua / semi-contínua. Os que atuam em batelada operam

com quantidade determinada de dejetos, de modo que uma carga é inserida no

biodigestor, que é fechado por completo e somente é reaberto após a produção

de biogás, onde há a retirada do biodigestato para que se inicie um novo ciclo.

Em biodigestores de produção contínua / semi-contínua, mais comuns no

Brasil, os dejetos a serem digeridos são colocados concomitantemente ao seu

recolhimento, não havendo a necessidade de abertura do equipamento, ou

podem ser abastecidos com pequenas cargas de dejeto, diárias ou semanais

(DEGANUTTI et al., 2002). O modelo lagoa coberta é o mais comumente

empregado no Brasil (Figura 2).

Figura 2. Biodigestor anaeróbio em funcionamento, modelo lagoa coberta (A),

e sua representação esquemática (B).

Fonte: Fongaro et al. (2014) -

adaptado.

Os biodigestores anaeróbios também diferem em seu sistema

operacional em relação à temperatura empregada. Dessa maneira, os micro-

organismos presentes podem atuar por psicrofilia (ótimo de crescimento e

metabolismo ocorre em temperatura ambiente não controlada, entre 15 e

20ºC), mesofilia (ótimo de crescimento e metabolismo ocorre entre 30ºC e

19

40ºC) ou termofilia (ótimo de crescimento e metabolismo ocorre entre 45 e

60ºC). O aumento de temperatura permite que as reações biológicas

aconteçam mais rapidamente, embora não influenciem na produção de biogás

(MORITA, 1975; FULFORD, 1998; MIRANDA et al., 2006).

Após a passagem pelo biodigestor os dejetos brutos (afluentes) são

chamados de efluentes, os quais apresentam características nutricionais para

serem reciclados na agricultura na forma de biofertilização e fertirrigação. A

matéria orgânica, ao ser digerida, sofre aumento na concentração de nitrogênio

e de outros nutrientes, valorizando suas propriedades para reciclo agrícola

(MEDEIROS et al., 2003).

Em síntese, a biodigestão anaeróbia emerge como opção promissora

para a reciclagem da matéria orgânica e controle de maus odores resultantes

desta operação. Assim, a implantação e uso de biodigestores permite reutilizar

os dejetos de tal maneira que os mesmos possam ser convertidos em recursos

viáveis para contribuir com o desenvolvimento econômico e social (ZANIN,

BAGATINI & PESSATTO, 2010).

1.2.2 Reciclo de Efluentes na Agricultura

A agricultura mundial deverá ampliar em 80% a produção de alimentos

até 2050 para suprir as necessidades da população, que deve atingir a marca

de 9,7 bilhões de pessoas segundo relatório elaborado pela Organização para

Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) juntamente com a

Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO).

Estimativas da FAO também apontam que até 2030 haverá aumento do

consumo mundial em relação ao que é produzido atualmente, de 47% de carne

suína, 55% de carne de frango e 34% de carne bovina, além de alimentos

como açúcar, milho, arroz e soja. Especialmente para a agricultura brasileira, o

desafio reside em aumentar a produção conciliando sustentabilidade ambiental

(especialmente qualidade do solo e da água), decréscimo da pobreza e

desigualdade social.

20

Nesse contexto, o Brasil apresenta expressivo potencial para contribuir

com a produção alimentar para o planeta. De todo o território nacional, cerca

de 340 milhões de hectares são agricultáveis; deste valor, cerca de 172

milhões de hectares correspondem a áreas de pastagem. Entretanto, o país

requer anualmente grandes quantidades de fertilizantes para a produção

agrícola, demanda esta que exige capital e tempo despendido para aplicação.

Somente em 2014, as entregas de fertilizantes ao consumidor final no país

representaram 32 milhões de toneladas, caracterizando aumento de 9,7% em

relação ao ano anterior. O Brasil, segundo maior produtor de alimentos em

volume, é também reconhecido devido ao emprego de inovações tecnológicas

e de produtividade (GUAZZELLI, RUPP & VENTURINI, 2012; ANDA, 2014).

Segundo a Associação Nacional de Difusores de Adubo (ANDA), a

utilização de fertilizantes cresce 4,6% a cada ano. Fertilizantes químicos, além

do alto custo, alteram as condições ambientais em razão de suas propriedades

e devido ao uso excessivo. Neste âmbito, a aplicação de biofertilizantes

(provenientes de matéria orgânica) emergiu como uma alternativa consistente

para esta questão, disponibilizando uma nova perspectiva de produção

agrícola, de maneira que os resíduos gerados por exercícios agroindustriais

sejam aproveitados e o impacto ambiental minimizado. Os biofertilizantes

podem substituir os fertilizantes químicos e os mesclados, sendo produzidos a

partir de qualquer matéria orgânica fresca oriunda da agricultura ou da indústria

(MEDEIROS, WANDERLEY & WANDERLEY, 2003; GUAZZELLI, RUPP &

VENTURINI, 2012).

Um importante aspecto do biofertilizante é que este age como protetor

para a planta. Enquanto agrotóxicos e adubos minerais solúveis (em especial

os nitrogenados) tem ação tóxica - após adsorção pela planta conseguem

alterar a fisiologia vegetal, diminuindo a proteossíntese e acarretando no

acúmulo de aminoácidos e açúcares, compostos de fácil utilização por parte de

diversas pragas - o biofertilizante tem em sua composição componentes como

boro, magnésio, zinco, enxofre e nitrogênio, além de aminoácidos, vitaminas e

hormônios vegetais. A transformação de dejetos de suínos através da

biodigestão merece reconhecimento devido aos aspectos sanitários, de

21

reciclagem de nutrientes e à capacidade de geração de energia renovável

(MEDEIROS et al., 2003; MEDEIROS, WANDERLEY & WANDERLEY, 2003;

KONZEN, 2005; GUAZZELLI, RUPP & VENTURINI, 2012).

1.3 Biomarcadores Virais para Monitoramento de Seguridade Sanitária de

Biofertilizantes Suinícolas

Ampla é a gama de micro-organismos que ofertam riscos à saúde

humana e animal, destacando-se parasitas, bactérias e vírus. Estudos

epidemiológicos acerca de doenças enzoóticas, ou seja, doenças de ocorrência

estável em um rebanho ou determinada região, ainda são deficientes, embora

sejam indispensáveis para que seja mantido o controle sobre as enfermidades

que acometem suínos e consequentemente não interfira na cadeia produtiva

(ZANELLA & MORES, 2005; BILOTTA & KUNZ, 2013; VIANCELLI et al., 2013;

FONGARO et al., 2014).

Os suínos podem ser reservatórios naturais, e por vezes assintomáticos,

de patógenos entéricos virais (como o vírus da hepatite E e os rotavírus A e C)

e bacterianos (como Salmonella spp.). Sua saúde é dependente das condições

que os circundam, como alimentação, água, instalações e manejo. As doenças

que costumam manifestar-se nestes animais estão reunidas em dois grupos

principais: (a) epizoóticas – ocasionadas por agentes específicos e de alta

contagiosidade e taxas de morbidade e mortalidade; (b) multifatoriais – onde

um ou mais agentes infecciosos exercem sua patogenia em rebanhos,

ocasionando as conhecidas “doenças de rebanho”. Permanecem de forma

enzoótica nos rebanhos, ou seja, não apresentam mortalidade elevada, mas

impactam significativamente a economia por modificar a produtividade dos

animais. As enfermidades predominantes em rebanhos de suínos costumam se

manifestar quando os mesmos são mantidos em condições que levam à

imunossupressão (devido a fatores como estresse, confinamento, uso

indiscriminado de antibióticos, dentre outros) resultando em alta morbidade,

nem sempre correlacionada com mortalidade, resistência desenvolvida pelos

patógenos, redução de desempenho dos animais e aumento nos custos de

produção (ZANELLA & MORES, 2005; BAPTISTA et al., 2010).

22

Dentre os patógenos potencialmente presentes em dejetos suinícolas

destacam-se os vírus entéricos. Estes agentes podem estar no trato

gastrointestinal de humanos e animais, sendo introduzidos no ambiente depois

de eliminados em altas concentrações, especialmente por via fecal, além do

despejo de dejetos não tratados ou tratados de forma ineficiente,

permanecendo infecciosos e estáveis por períodos prolongados. Os vírus

entéricos são importantes devido a sua alta estabilidade em condições

ambientais adversas de pH, radiação ultravioleta (UV), salinidade e

temperaturas elevadas, condições essas que são muito desfavoráveis ou até

letais para outros microrganismos (FONG & LIPP, 2005; GRIFFIN, PLUMMER

& LONG, 2008).

Embora não se multipliquem no ambiente por serem parasitas

intracelulares obrigatórios, os patógenos virais podem perdurar por meses em

matrizes ambientais, mantendo sua viabilidade e capacidade de infecção,

sendo os vírus entéricos comumente identificados ao longo de todas as

estações do ano (TAVARES, CARDOSO & DE BRITO, 2005).

Os adenovírus porcinos (PAdV), circovírus porcinos-2 (PCV-2) e os

rotavírus-A (RV-A) são vírus que atendem às condições de estabilidade

anteriormente reportadas, sendo assim indicados como biomarcadores da

seguridade sanitária de águas residuárias e de efluentes suinícolas (HUNDESA

et al., 2006; VIANCELLI et al., 2011; FONGARO et al., 2014).

Os adenovírus (Figura 3) são vírus icosaédricos de 90 nm de diâmetro,

pertencentes à família Adenoviridae, não apresentam envelope e têm como

material genético DNA de dupla fita contendo aproximadamente 36.000 pares

de base. Existem 56 sorotipos, classificados em sete espécies (A-G), que

possibilitam a infecção de muitas espécies, incluindo humanos, bovinos e

suínos. Os adenovírus porcinos (PAdV) podem causar doenças neurológicas

em suínos, sendo abundantes nesta população e muito prevalentes e estáveis

em material fecal. Essas características fazem do PAdV um importante

biomarcador de contaminação ambiental e no controle de desinfecção

23

(HUNDESA et al., 2006; VIANCELLI et al., 2011; FIELDS, 2013; FONGARO,

2014).

Figura 3. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de

adenovírus.

Fonte: Fields (2013) - adaptado.

Os circovírus pertencem à família Circoviridae, subdividida nos gêneros

Circovirus e Gyrovirus, e estão distribuídos em pelo menos 11 espécies. Os

membros do gênero Circovirus são pequenos, não-envelopados, icosaédricos e

de tamanho aproximado entre 15 e 20 nm. Seu genoma é DNA de fita simples

circular. Os PCV-2 são eliminados em altas concentrações por via fecal ou por

secreção nasal em suínos. Causam a circovirose suína, doença endêmica da

suinocultura tecnificada, ao contrário de PCV-1 que não apresenta

patogenicidade. A mortalidade pode atingir até 35% da população

contaminada. Atualmente, é a doença que causa maior impacto econômico na

suinocultura brasileira. Por ser uma doença imunossupressora, deixa os suínos

mais vulneráveis a outros agentes patológicos que causam doenças

respiratórias e entéricas (TISCHER et al., 1982; ZANELLA & MORES, 2005;

FIELDS, 2013). A Figura 4 apresenta suspensão viral de circovírus porcino (A)

e um suíno acometido por circovirose (B).

Figura 4. Suspensão viral de PCV-2 (A) – sorotipo não identificado - e suíno

acometido por circovirose (B).

24

Fonte: Look For Diagnosis (A) e Fields (2013) (B) - adaptado.

Os rotavírus (Figura 5) estão contemplados no gênero Rotavirus, dentro

da família Reoviridae. Apresentam simetria icosaédrica, diâmetro de 100 nm,

RNA de dupla fita segmentado com aproximadamente 18.500 pares de base e

não contêm envelope. Compõem sete grupos distintos de A a G e podem

apresentar camada simples, dupla ou tripla. Os rotavírus são importantes

patógenos entéricos zoonóticos, acometendo humanos e animais. Estima-se

que os rotavírus do grupo A sejam os principais responsáveis pelas doenças

diarreicas que acometem animais e humanos (menores de 5 anos), atingindo

anualmente um milhão de crianças em países em desenvolvimento; no que se

refere a animais de produção, enterites associadas aos rotavírus constituem

um grave problema principalmente para leitões e bezerros. Os tipos A, B, C, E

e H são descritos na literatura como frequentemente detectados em suínos,

implicando diretamente na saúde pública humana e animal (SAIF & JIANG,

1994; ALFIERI et al., 1996; MARTELLA et al., 2010; FIELDS, 2013;

MARTHALER, 2014).

25

Figura 5. Diagrama esquemático (A) e microscopia eletrônica (B) de rotavírus:

as setas apontam partículas de camada dupla; os demais vírus contêm camada

tripla. A barra representa 100 nm.

Fonte: Fields (2013) - adaptado.

Dos patógenos entéricos mais comumente pesquisados, as bactérias

são as mais vulneráveis à inativação, seguidas pelos protozoários e só então

pelos ovos de áscaris e vírus entéricos, o que faz desses últimos excelentes

biomarcadores da eficiência dos processos de higienização e desinfecção de

diferentes matrizes biológicas e ambientais (FONG & LIPP, 2005).

Desenvolver estudos que melhor investiguem a atual condição sanitária

das granjas suinícolas é fundamental não só devido à questão sanitária - que

reflete na saúde populacional -, mas também pelo aspecto comercial frente à

alta distribuição, comercialização e consumo desta fonte proteica (ZANELLA &

MORES, 2005). Nesse contexto, o presente Trabalho de Conclusão de Curso

foi concebido para avaliar a presença e a persistência de PCV-2, PAdV e RV-A

em afluentes (dejetos brutos) e efluentes (dejetos pós BA psicrofílica) da

suinocultura na região Sudeste brasileira, estando inserido no projeto nacional

BiogasFert - Tecnologias para Produção e Uso de Biogás e Fertilizantes a

partir do Tratamento de Dejetos Animais no Âmbito do Plano ABC, decorrente

da parceria entre diferentes unidades da Embrapa no Brasil e a Fundação

Parque Tecnológico ITAIPU com universidades brasileiras federais e estaduais,

26

sendo cada universidade responsável por um aspecto do projeto. Iniciado em

setembro de 2012 e com duração prevista para 36 meses, o projeto está

interligado a programas em vigência na Embrapa, como as redes FertBrasil,

que investiga processos que podem contribuir para a maior eficiência e para a

inserção de novos nutrientes na agricultura nacional, e PECUS, que estuda os

GEE e o balanço de carbono em sistemas de produção na agropecuária. O

Projeto BiogasFert, cuja linha temática é o tratamento de dejetos animais,

ancora-se na necessidade de o agronegócio passar por avaliações constantes

principalmente no que diz respeito à execução de práticas interligadas ao meio

ambiente, descobrindo alternativas que resultem em tratamentos efetivos para

produção e uso dos biofertilizantes e biogás gerados, no intuito de promover a

expansão de forma sustentável dos sistemas de produção agropecuários.

Assim, almeja desenvolver e produzir práticas renovadoras, além de aprimorar

outras existentes, para otimizar o uso dos biofertilizantes orgânicos e

organominerais. Pretende também atuar na mitigação dos GEE, bem como traz

alternativas tecnológicas novas no que tange à produção e uso de biogás.

27

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a carga de vírus entéricos em dejetos suinícolas submetidos à

BA por psicrofilia nos períodos de outono-inverno e primavera-verão de 2014/

início de 2015, usando PAdV, PCV-2 e RV-A como biomarcadores.

2.2 Objetivos Específicos

Investigar a flutuação da população viral entérica durante as estações

avaliadas em 2014/ início de 2015 em afluentes sunícolas submetidos à

BA na região Sudeste do Brasil e comparar com a região Sul;

Avaliar a infecciosidade de PCV-2 em amostras tratadas em BA em

condições psicrofílicas.

28

3. METODOLOGIA

3.1 Amostragens

As amostras analisadas neste trabalho foram provenientes de distintas

unidades de criação de suínos em fase de engorda, da raça x, em Juiz de

Fora, Minas Gerais. Os dejetos foram recolhidos e encaminhados para

biodigestores situados na unidade Embrapa Gado de Leite, no mesmo

município. Com uma área total de 1.429,875 km², Juiz de Fora está a sudeste

do estado, com altitude máxima de 1.104 metros e mínima de 467 metros. Sua

latitude é de 21º 41' 20" ao Sul, enquanto a longitude é de 43º 20' 40" a Oeste

(PREFEITURA DE JUIZ DE FORA, 2006).

As amostras de dejeto suinícola bruto e tratado (afluente e efluente,

respectivamente) foram coletadas durante os períodos outono-inverno, entre os

meses de maio e julho e primavera-verão entre os meses de novembro e

janeiro em 2014/ início de 2015, a partir de biodigestores anaeróbios

semicontínuos que atuaram em condição de psicrofilia (temperatura

ambiente/não controlada).

Os ensaios de BA foram realizados utilizando-se quatro biodigestores

semicontínuos de escala laboratorial, com capacidade para armazenar 60 litros

de dejetos cada um e foram submetidos à RH por 60 dias. Os biodigestores

eram alimentados semanalmente com 2 litros de dejetos para posterior coleta.

Figura 6. Biodigestores anaeróbios semicontínuos de escala laboratorial,

unidade Embrapa Gado de Leite, Minas Gerais.

29

3.2 Parâmetros Físico-Químicos das Amostras

Afluentes e efluentes de biodigestores anaeróbios psicrofílicos foram

avaliados quanto a temperatura amostral, pH, teor de sólidos totais (ST) e

nitrogênio amoniacal total (NAT). Todas as análises físico-químicas foram

realizadas de acordo com APHA (2012), no laboratorio de físico-química da

Embrapa Gado de Leite e foram gentilmente fornecidas para comporem os

demais dados gerados.

3.3 Análises Virais

3.3.1 Eluição, Concentração e Clarificação de Amostras

A eluição das amostras foi realizada de acordo com o protocolo descrito

e estabelecido no Laboratório de Virologia Aplicada por Schlindwein et al.

(2010) e Viancelli et al. (2012). Utilizou-se 20 mL de cada amostra, a seguir foi

acrescentado 200 µL de cloreto de alumínio (AlCl3) [0,05 M] como agente

precipitador de partículas e o pH foi ajustado para 3,5 com ácido clorídrico

(HCl) [1M]. Em sequência, as misturas foram homogeneizadas em gangorra

durante 30 minutos, seguidas de centrifugação sob as condições 2500 g a 4ºC

durante 15 min. Ao final desta etapa houve a formação de precipitado, que foi

ressuspenso em 10 mL de tampão glicina em pH 9, agitado novamente por

mais 30 min e centrifugado a 8000g também por 30 min a 4ºC. O sobrenadante

de cada amostra foi coletado e a concentração das partículas virais foi feita

através da adição de 8% do volume final de cada amostra de Polietilenoglicol

6000 (PEG 6000) e em seguida clarificada adicionando-se 1/5 do volume final

da amostra de clorofórmio, para posteriormente ser centrifugado a 1500g a 4ºC

por 2 min. Ao final do procedimento, um volume aproximado de 4 mL por

amostra foi obtido, distribuído em alíquotas e refrigerado a -20°C para análises

posteriores.

3.3.2 Extração de Material Genético

Os concentrados virais foram submetidos à extração dos ácidos

nucleicos totais utilizando kit comercial de extração Invitek RTP DNA/RNA Mini-

vírus, seguindo recomendações do fabricante. Ao final do procedimento, as

colunas de sílica contendo o material genético isolado foram eluídas em

30

tampão de eluição (pH 7,5) pré-aquecido por meio de centrifugação a 12500g

por 1min para então ser armazenado à -20ºC para análises futuras.

3.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR)

A reação em cadeia de polimerase (PCR) é adotada em estudos

distintos de detecção de marcadores virais de contaminação de origem

humana ou animal, como adenovírus humano (HAdV) e adenovírus porcino

(PAdV). A PCR é muito executada especialmente devido à sua sensibilidade,

sendo que a PCR em Tempo Real (qPCR) permite não só a detecção da

sequência buscada como também a quantificação do material genético em

amostras ambientais e biológicas (HUNDESA et al., 2009).

Para detectar e quantificar as cópias genômicas virais de PAdV adotou-

se o protocolo descrito por Hundesa et al. (2009). Os iniciadores e a sonda

reconhecem um fragmento de 68 pb do gene hexon de PAdV e foram

desenhados especificamente para amplificar este fragmento de PAdV.

Para PCV-2 o protocolo empregado foi estabelecido por Opriessnig et al.

(2003). Não dá informações esclarecedoras sobre iniciadores e sondas,

apenas cita que os mesmos foram desenhados usando determinado sotfware

seguindo recomendações do fabricante.

Para mensurar as cópias genômicas presentes em RV-A o protocolo

utilizado foi descrito por Zeng et al. (2008). A cepa de referência para a

determinação de seus iniciadores e sonda foi a X81436ST3, através do gene

NSP3, com 1049 pb.

Todas as sondas e iniciadores específicos estão descritos no Quadro 1.

31

Quadro 1. Protocolos adotados, respectivas sondas e iniciadores utilizados para qPCR.

Vírus Protocolo Nome Sequência

PCV-2 Opriessnig et al. (2003)

Iniciador Direto 5’TGGCCCGCAGTATTCTGAATT3’

Iniciador Reverso

5’CAGCTGGGACAGCAGTTGAG3’

Sonda de hidrólise

5’6FAM-CCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATG-

TAMRA-3’

PAdV Hundesa et al. (2009)

Iniciador Direto 5’AACGGCCGCTACTGCAAG3’

Iniciador Reverso

5’AGCAGGCTCTTGAGG3’

Sonda de hidrólise

5’FAM-CACATCCAGGTGCCGC-TAMRA3’

RV-A Zeng et al. (2008)

Iniciador Direto 5’ACCATCTUUCACRTRACCCTCTATGAG3’

Iniciador Reverso

5’GGTCACATAACGCCCCTATAGC3’

Sonda de hidrólise

5’VIC-AGTTAAAAGCTAACACTAACACTGTCAAA-

MGB3’

Legenda: FAM= Fluoróforo; TAMRA= Sequestrador; VIC= Fluoróforo; MGB= Sequestrador.

Para detecção de RV-A, por se tratar de um vírus de genoma RNA, o

material foi previamente submetido à reação de transcrição reversa (RT) para

síntese do DNA complementar (cDNA).

A qPCR foi procedida utilizando o Kit Taqman Universal PCR Master Mix

(Applied Biosystems). Esse kit contém os principais reativos prescritos para

que a PCR ocorra (dNTPs, enzima Taq DNA polimerase, co-fatores

enzimáticos e condições salinas adequadas), sendo adicionados sondas e

iniciadores descritos anteriormente no Quadro 1.

As reações foram realizadas em placas de 96 cavidades em

equipamento StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Todas as amostras foram analisadas em duplicata, na presença de controles

negativos (sem adição do ácido nucleico) e utilizando curva padrão –

32

fragmentos de DNA/cDNA clonados em plasmídeo - com as sequências-alvo

dos vírus analisados, disponíveis no Laboratório de Virologia Aplicada.

3.4 Controle Interno de Recuperação e Detecção Viral

Como controle interno e para determinar a eficiência de recuperação

viral foi utilizado o Adenovírus Humano-2 (HAdV-2). HAdV-2 é um vírus de

tropismo respiratório e foi propagado em cultivo celular, em células A549

derivadas de carcinoma de pulmão humano e permissivas à maioria dos

adenovírus humanos.

Afluente e efluente suinícolas, conhecidamente negativos para HAdV-2,

foram inoculados com 8,0x108 CG/mL-1 de HAdV-2, concentrados e clarificados,

bem como submetidos à extração de ácidos nucleicos conforme descrito

anteriormente no item 3.3.2.

As titulações e recuperações virais foram determinadas por meio de

qPCR, através do Kit Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)

utilizando iniciadores, sondas e condições de reação previamente descritas por

Hernroth et al. (2002), onde as sequências foram: AdV Direto 5’-C(AT)T ACA

TGC ACA TC(GT) C(CG)G G-3’; AdV Reverso: 5’-C(AG)C GGG C(GA)A

A(CT)T GCA CCA G-3’ e AdV Sondas Ad:ACDEF [5’-(6FAM) CCG GGC TCA

GGT ACT CCG AGG CGT CCT (TAMRA)-3’] e Ad:B [5’-(6FAM) CCG GAC

TCA GGT ACT CCG AAG CAT CCT (TAMRA)-3’].

3.5 Ensaio de Infecciosidade de PCV-2

Com o objetivo de demonstrar a infecciosidade viral, realizou-se ensaio

de cultura celular integrada (ICC) à RT-qPCR precedida por tratamento

enzimático (et), técnica denominada ICC-et-RT-qPCR, de acordo com Fongaro

et al. (2013), para quantificar PCV-2 infecciosos originalmente presentes nas

amostras de afluente e efluente suínos provenientes do processo de BA. Os

ensaios foram realizados em réplica e em duplicatas.

Para isso, foi elaborado um pool amostral com 1000 µL de cada uma

das 4 amostragens previamente eluídas, concentradas e clarificadas, de

acordo com o descrito no item 3.3.1, totalizando 4000 µL por período (outono-

33

inverno e primavera-verão). Desse pool, 400 µL foram utilizados para os

ensaios.

Inicialmente, células ST (originárias de testículo suíno, ATCC CRL-

17460), foram cultivadas e propagadas em meio RPMI (Gibco BRL)

suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB), 1% de antibióticos e

antifúngicos (PSA - penicilina G 100U/mL; sulfato de estreptomicina 100µg/mL

e anfotericina B 0,25µg/mL) e mantidas a 37ºC sob 5% de CO2.

Posteriormente ao período de 24h de incubação, as células foram

cultivadas em placas de 24 cavidades, em densidade de 3,0x105 células/ mL. A

monocamada celular foi inoculada com 100 µL do pool amostral tratado com

2% de antibióticos e antifúngico em diluição não citotóxica (1:60) e incubada

por 1h à 37ºC sob atmosfera de 5% de CO2 para que ocorresse a adsorção

viral. Os inóculos foram aspirados e a monocamada celular lavada por três

vezes com tampão salina fosfato 1x (PBS 1x). Após, 1mL de meio RPMI 1x foi

adicionado em cada cavidade, que foi reincubada nas mesmas condições por

24h. Como controle de qualidade do teste foi utilizada uma quantidade

conhecida de PCV-2 infecciosos como controle positivo e PCV-2 inativados por

1h a 99ºC e 30 min sob radiação ultra-violeta como controle negativo, de

acordo com Fongaro et al. (2013).

Após este período, o sobrenadante celular foi removido e a

monocamada celular foi lavada novamente com PBS 1x, por duas vezes. A

extração do material genético foi realizada como descrito previamente no item

3.3.2. A seguir, o material genético extraído foi tratado com 1U de DNase I

(Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante para eliminar

possível contaminação com DNA presente na amostra, oriundo de vírus não

infecciosos. Os RNAs presentes foram submetidos à transcrição reversa (RT)

com hexanucleotídeos (iniciadores randômicos), para obtenção do cDNA.

Imediatamente após o processo descrito, a reação de qPCR foi realizada como

descrito por Opriessnig et al. (2003) para quantificação do número de CG totais

provenientes de mRNA viral, indicando e quantificando os vírus infecciosos que

estavam em processo de replicação.

34

3.6 Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism

5.0 Statistical. Para avaliar a diferença entre os grupos utilizaram-se os testes

One-Way de variância (ANOVA), com 95% de confiança, seguido do teste

Bonferroni's Multiple Comparison para avaliar potencialmente as diferenças

entre os grupos. Quando necessário, testes de correlação foram realizados

através do Pearson Correlation. Os valores considerados significativos foram

os que apresentaram p≤0,05.

35

4. RESULTADOS

4.1 Parâmetros Físico-Químicos

A Tabela 1 apresenta os resultados dos parâmetros físico-químicos para

as amostras de afluente e efluente avaliadas. As diferenças entre os valores do

outono-inverno e da primavera-verão foram estatisticamente significativas

segundo o teste qual o teste aplicado aqui? (p≤0,05).

Tabela 1. Avaliação de parâmetros físico-químicos das amostragens (n = 8 por período).

Parâmetros Afluente Efluente

Primavera-Verão Outono-Inverno Primavera-Verão Outono-Inverno

Temperatura amostral (ºC)

24,0±2,8 16,0±3,3 25,0±1,8 17,0±2,1

pH 6,7±0,1 6,8±0,4 6,5±0,2 6,6±0,2

ST (g/L) 68±2,1 43±3,1 35±3,2 45±3,2

NAT (mg/L) 1454,8±72,07 624,0±97,2 1738,7±195,2 896,2±87,7

Legenda: ST – sólidos totais; NAT – nitrogênio amoniacal total.

4.2 Ensaio de Recuperação Viral

A recuperação média de vírus entéricos mensurada por qPCR, adotando

HAdV-2 como modelo, pelo método de concentração viral utilizando eluição e

clarificação a partir de afluente e efluente de suínos foi de 32,0%.

4.3 Análise de Vírus Entéricos em Afluente e Efluente

Um total de dezesseis amostras foram avaliadas quanto a presença e

quantificação de PAdV, PCV2 e RV-A, sendo oito amostras por período (quatro

amostras de afluente e quatro de efluente).

Os resultados mostraram que PCV-2 esteve presente em 100% (16/16)

das amostras avaliadas e que destas amostras 94% (15/16) continham

genomas de PAdV e RV-A. Segregando estes dados por período, durante o

outono-inverno a positividade apresentada nas amostras foi de 100% (8/8) para

PCV-2 e PAdV e 87,5% (7/8) para RV-A; durante a primavera verão, PCV-2 e

RV-A foram detectados em 100% (8/8) das amostras e PAdV foi detectado em

87,5% (7/8) dessas.

Os resultados de quantificação em CG virais demonstraram que durante

o outono-inverno as amostras de afluente apresentaram as seguintes médias,

36

expressas na Figura 7(a), em CG/mL (Log10) por unidade de biodigestor

anaeróbio avaliado:

PCV-2 7,68; 7,61; 6,45 e 7,00;

PAdV 4,85; 4,72; 4,43 e 5,02;

RV-A não houve detecção; 4,82; 4,30 e 3,37.

Para amostras de efluente referentes ao mesmo período, as médias

apresentadas por unidade de biodigestor, expressas na Figura 7(b), foram em

CG/mL (Log10):

PCV-2 5,91; 6,62; 6,14 e 6,16;

PAdV 4,19; 4,67; 4,71 e 4,67;

RV-A 3,06; 3,17; 3,64 e 2,95.

Lembra da versão anterior? Estava escrito “biodigestor 1, biodigestor 2..” para

cada um dos vírus e para cada uma das estações, fazendo com que a palavra

fosse repetida muitas vezes. Então, como não dava de fazer tabela porque há

o gráfico a seguir, deixei apenas os valores de cada biodigestor.

Figura 7. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa

em Log10, obtida durante o período outono-inverno em afluente (a) e efluente

(b).

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

0

2

4

6

8

10PCV-2 PAdV RV-A

a)Afluente

CG

/mL

(L

og

10)

Biodigestor

37

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

0

2

4

6

8

10PCV-2 PAdV RV-A

b)Efluente

Biodigestor

CG

/mL

(L

og

10)

Durante o período primavera-verão as médias em amostras de afluente,

expressas na Figura 8(a), foram em CG/mL (Log10):

PCV-2 5,1; 7,6; 7,9 e 6,3;

PAdV 6,9; 8,8; 8,7 e 8,0;

RV-A 9,0; 8,2; 6,8 e 8,1.

No entanto, as médias para amostras de efluente, expressas na Figura

8(b), foram em CG/mL (Log10):

PCV-2 7,1; 5,3; 7,1 e 6,0;

PAdV 6,8; não houve detecção; 6,0 e 9,0;

RV-A biodigestor 1 – 7,9; biodigestor 2 – 7,9; biodigestor 3 – 7,7 e

biodigestor 4 – 5,4.

38

Figura 8. Quantificação genômica (CG/mL) de PCV-2, PAdV e RV-A, expressa

Log10, obtida durante o período primavera-verão em amostras de afluente (a) e

efluente (b).

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

0

2

4

6

8

10 PCV-2 PAdV RV-A

a) Afluente

CG

/mL

(L

og

10)

Biodigestor

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

0

2

4

6

8

10 PCV-2 PAdV RV-A

b) Efluente

CG

/mL

(L

og

10)

Biodigestor

Considerando os valores de vírus entéricos em amostras de afluente e

efluente de biodigestores anaeróbios, foram calculadas as médias globais por

período e a redução da carga viral após BA, referentes aos períodos outono-

inverno e primavera-verão. Durante o outono-inverno as reduções de PCV-2,

PAdV e RV-A foram, em Log10, 1,11, 0,20 e 1,17, respectivamente. Em relação

39

ao período primavera-verão, as reduções de PCV-2, PAdV e RV-A foram 0,70,

1,20 e 0,80, respectivamente (Tabela 2).

Tabela 2. Médias globais de cópias genômicas por mL (CG/mL), desvio padrão e redução de

carga viral pós-BA.

Amostra CG Média Geral/mL ± Desvio Padrão (Log10)

Outono-Inverno PCV-2 PAdV RV-A Afluente 7,40 ± 0,50 4,81 ± 0,21 4,47 ± 0,60 Efluente 6,29 ± 0,25 4,60 ± 0,21 3,30 ± 0,26

Primavera-Verão Afluente 7,50 ± 1,10 8,50 ± 0,76 8,50 ± 0,77 Efluente 6,80 ± 0,75 7,30 ± 1,25 7,70 ± 1,04

Redução (Log10) Outono-Inverno 1,11 0,20 1,17 Primavera-Verão 0,70 1,20 0,80

As reduções virais encontradas não foram estatisticamente significativas

(ANOVA, p≤0,05).

4.4 População Viral Circulante em Dejetos Suínos

A população viral representada por PCV-2, PAdV e RV-A nos dejetos

excretados pelos suínos (afluente da BA) foi quantificada em 16,68 Log10

(CG/mL) durante o outono-inverno e 24,50 Log10 (CG/mL) durante a primavera-

verão). Desse valor global, no período outono-inverno, os vírus representaram

em relação à população total:

PCV-2: 44,36% (7,40 Log10)

PAdV: 28,84% (4,81 Log10)

RV-A: 26,80% (4,47 Log10).

Para o período primavera-verão, os patógenos virais representaram em relação

à população total circulante:

PCV-2: 30,60% (7,50 Log10)

PAdV: 34,70% (8,50 Log10)

RV-A: 34,70% (8,50 Log10).

Os resultados estão demonstrados graficamente na Figura 9.

40

0 10 20 30 40 50

PCV-2

PAdV

RV-A Outono-Inverno

Primavera-Verão

Distribuição Sazonal (%)

Figura 9. Distribuição da população viral avaliada durante primavera-verão e

outono-inverno.

O estudo de correlação (Pearson) mostrou que a população de RV-A e

PAdV esteve correlacionada positivamente ao longo das estações do ano

(r2=0,89).

4.5 Estudo de Infecciosidade de PCV-2

Amostras positivas em qPCR para PCV-2 foram submetidas ao teste de

infecciosidade viral usando cultura celular, já que dos vírus aqui avaliados este

é o único cultivável in vitro a partir de amostras ambientais.

Em amostras de afluente, PCV-2 infecciosos foram detectados nos

seguintes valores: a) 5,73 Log10 (GC/mL) durante período de outono-inverno; b)

6,37 Log10 (GC/mL) durante período de primavera-verão. Em amostras de

efluente (pós BA), PCV-2 infecciosos foram detectados nos valores de: a) 5,00

Log10 (GC/mL) durante período de outono-inverno; b) 3,86 Log10 (GC/mL)

durante período de primavera-verão. A Figura 10 apresenta estes resultados,

organizados por período, comparando os valores de vírus totais (quantificados

por qPCR) e vírus infecciosos (quantificados por ICC-et-RT-qPCR).

41

Figura 10. Cópias genômicas (CG) totais (por qPCR) e detectadas a partir de

PCV-2 infecciosos (por ICC-et-RT-qPCR) presentes durante o outono-inverno

(a) e a primavera-verão (b).

Aflu

ente

Eflu

ente

0

2

4

6

8

10PCV-2 Totais

PCV-2 Infecciosos

a) Outono-Inverno

CG

/mL

(L

og

10)

Aflu

ente

Eflu

ente

0

2

4

6

8

10PCV-2 Totais

PCV-2 Infecciosos

b) Primavera-Verão

CG

/mL

(L

og

10)

A redução de PCV-2 infecciosos após BA foi calculada. Assim, a BA

durante outono-inverno reduziu estes patógenos em 0,97 Log10, o equivalente a

87,30%; durante a primavera-verão, BA reduziu PCV-2 em 2,5 Log10, o

equivalente a aproximadamente 99,5%, sendo esta última considerada

estatisticamente significativa (ANOVA, p≤0,05).

42

5. DISCUSSÃO

A expansão de atividades que geram alto teor de resíduos, como

sistemas de produção animal, intensificaram as indagações acerca de práticas

que envolvem o saneamento rural a nível nacional e mundial. Nas três últimas

décadas, o comércio mundial de suínos cresceu consideravelmente. O

desenvolvimento desta indústria correlaciona-se diretamente com impactos na

qualidade ambiental, principalmente devido à quantidade de matéria orgânica

retida nos dejetos, além da presença de nutrientes e do risco aumentado de

disseminação de patógenos, inclusive os relacionados às zoonoses, como aqui

reportado (BILOTTA & KUNZ, 2013; MONINI et al., 2015).

O uso de biodigestores anaeróbios se tornou uma alternativa para o

tratamento de dejetos suinícolas no Brasil, visando a produção de biogás e a

reutilização dos efluentes biodigeridos - ou biodigestato (dejetos após a BA) -

como biofertilizante agropecuário, podendo recuperar áreas rurais danificadas

e diminuindo a dependência por adubação química do solo, o que

proporcionaria o menor desgaste do mesmo, sendo viável economicamente.

Porém, se descartados sem tratamento adequado, os dejetos suinícolas podem

colocar em risco a saúde humana, animal e ambiental (BILOTTA & KUNZ,

2013; FONGARO et al., 2014).

No presente estudo, dejetos suinícolas foram processados em

biodigestores anaeróbios psicrofílicos. Afluente e efluente foram avaliados

durante primavera-verão e outono-inverno quanto a parâmetros físico-químicos

e microbiológicos, utilizando PAdV, PCV-2 e RV-A como modelos de

patógenos entéricos.

O monitoramento das propriedades físico-químicas mostrou diferenças

significativas (p≥0,05) nas amostras antes e após o tratamento dos dejetos. As

concentrações em efluentes foram superiores às de dejeto bruto, resultado

ancorado por Wiesmann et al. (2007), o qual verificou a degradação de

nitrogênio orgânico e amonificação de estruturas complexas como proteínas

presentes nas partículas virais. O equilíbrio de NH4+ e NH3 influenciou

diretamente as oscilações de concentração NAT durante outono-inverno e

43

primavera-verão, sendo estas oscilações diretamente proporcionais à

temperatura e pH (TCHOBANOGLOUS et al., 2003).

Em relação às propriedades microbiológicas, os vírus entéricos foram

utilizados como biomarcadores de eficiência de tratamento de dejetos

suinícolas devido à sua resistência e prevalência em matrizes ambientais.

Biomarcadores, segundo Peakall (1994), são agentes que apresentam

resposta biológica mediante a um tratamento, podendo-se representar uma

gama de outros marcadores.

Os RV-A destacam-se como patógenos zoonóticos comumente

envolvidos no quadro diarreico agudo grave em crianças e suínos jovens, tanto

em países emergentes quanto em desenvolvidos, sendo considerado o

principal vírus causador de mortes por diarreias (CABALLERO et al., 2004;

COSTA et al., 2004; TONIETTI et al., 2013; MONINI et al., 2015).

Os PCV-2 são considerados de interesse econômico na suinocultura,

devido às síndromes por ele causadas, destacando-se o Tremor Congênito

Suíno (TCS), que afeta animais recém-nascidos, e a Síndrome Definhante

Multissistêmica de Suínos Desmamados (SDMSD). PCV-2 têm sido

investigados em seu aspecto zoonótico por duas razões principais: amplitude

genotípica e detecção de anticorpos contra circovírus em humanos. A

circovirose suína potencializa perdas econômicas à suinocultura mundial e

nacional; além das perdas diretas causadas pela morte dos animais, a doença

determina prejuízos em função da conversão alimentar diminuída, sensibilidade

dos animais para infecções secundárias e associação do vírus com demais

patógenos. PCV-2 é um modelo de biomarcador especialmente interessante

por ser cultivável in vitro e isolado a partir de amostras ambientais. Porém, tem

algumas desvantagens, devido ao fato de não produzir efeito citopático visível

(FRANÇA et al., 2005; FONGARO et al., 2014).

Já os adenovírus são capazes de infectar a maioria dos vertebrados.

Causam, dentre outras enfermidades, gastroenterites e infecções respiratórias,

embora normalmente não produzam patologias clínicas severas. A constante

presença de PAdV em amostras fecais suinícolas, sua distribuição uniforme

sazonalmente e ao redor do globo e estabilidade diante da ampla gama de

44

condições adversas para outros patógenos fazem destes vírus indicadores

adequados de contaminação ambiental (DE MOTES et al., 2004; FONG &

LIPP, 2005).

A recuperação viral das amostras semeadas com HAdV-2,

concentradas, submetidas à extração de ácidos nucleicos e à reação de qPCR

foi de 32%, sugerindo que todos os resultados obtidos no presente trabalho

referem-se à 32% dos genomas virais presentes nas amostras ambientais e

que a técnica teve sucesso em concentrar os vírus originalmente presentes nas

mesmas. Este procedimento visou o controle dos mecanismos de

concentração, extração do material genético e detecção por PCR quantitativo

aqui conduzidos, sendo sua determinação possível através da mensuração da

quantidade de vírus adicionado previamente ao procedimento e a quantidade

final recuperada.

No presente trabalho, PAdV foi detectado em 94% das amostras (15/16),

corroborando resultado de De Motes et al. (2004) na Catalunha (Espanha), que

analisou amostras provenientes de vários sistemas de criação e produção de

suínos. Quanto a prevalência de RV-A, 94% das amostras (15/16) continham

genomas desse vírus, indicando sua excreção nos dejetos de suínos e sua

possível persistência no efluente biodigerido. Marthaler et al. (2014) avaliaram

a presença de RV-A, RV-B e RV-C em amostras coletadas no México, EUA e

Canadá, destacando a prevalência de rotavírus totais em 6.251 das 7.508

(83%) das amostras avaliadas. Quando PCV-2 foi avaliado, 100% das

amostras (16/16) apresentaram genoma deste vírus. Fongaro et al. (2014),

Viancelli et al. (2012) e Garcia et al. (2012) também detectaram o genoma

deste patógeno entérico em amostras de efluentes suínos tratados em

biodigestor anaeróbio psicrofílico na região Sul do Brasil.

Este estudo foi o primeiro conduzido em granjas de criação de suínos no

Sudeste brasileiro. Os resultados apontaram, mesmo com pequeno número

amostral, que há excreção intermitente de PAdV, PCV-2 e RV-A, salientando a

necessidade de integração das pesquisas existentes e a condução de novos

trabalhos semelhantes a este nas distintas regiões do país, para que seja

traçado o perfil de prevalência destes patógenos de acordo com as condições

45

regionais de criação e sazonalidade. Como a atividade é exercida em todas as

regiões brasileiras, a investigação dos referidos patógenos deve ser estendida

às mesmas, visto que implicam em seguridade humana e animal (BOSCH,

1998; GARCIA et al., 2012; FONGARO et al., 2013; TONIETTI et al., 2013;

AHMED, 2015; VIANCELLI et al, 2015).

De fato, dejetos suinícolas são relatados por apresentarem níveis

consideráveis de microrganismos, como PAdV, PCV-2 e RV-A. Vírus cujo

material genético é o DNA, como PCV-2 e PAdV podem apresentar maior

resistência no ambiente se comparados aos vírus de genoma RNA, como o

RV-A; no caso do RV-A, cabe relembrar que por ser zoonótico afeta, além de

suínos e humanos, bovinos jovens (DE MOTES et al., 2004; HUNDESA et al.,

2006; ESTES & KAPIKIAN, 2007; HUNDESA et al., 2009; VIANCELLI et al.,

2013).

No presente trabalho, durante o outono-inverno, PCV-2 e RV-A atingiram

1 log de redução, enquanto para PAdV o valor de redução foi inferior a 1 log.

Em contraste, durante a primavera-verão apenas PAdV atingiu 1 log de

redução, e PCV-2 e RV-A apresentaram valor abaixo de 1. Apesar de haver

redução da concentração viral, esta não atingiu o esperado para tratamentos

considerados eficientes (99,9%), segundo o recomendado pela

Regulamentação da União Europeia, EC Nº1774/2002.

Amostras de afluente monitoradas durante o outono-inverno mostraram

que PCV-2 foi da população viral total a mais frequente, seguida por PAdV e

RV-A. Esta prevalência foi observada por Fongaro et al. (2014) e Viancelli et al.

(2013) em avaliação para os mesmos vírus no Sul do Brasil, o que demonstra a

prevalência deste patógeno em criações de suínos no efetivo nacional. Em

contrapartida, durante a primavera-verão, da população total viral avaliada

PCV-2 foi a menos frequente, sendo as populações de PAdV e RV-A as mais

representativas. Os resultados sugerem que PCV-2 foi mais sensível ao

aumento da temperatura que PAdV e RV-A, considerando seus genomas

mensurados por qPCR ou RT-qPCR.

Embora a qPCR e RT-qPCR forneçam o número de genomas virais

presente em amostras, por si só não diferenciam partículas virais infecciosas

46

das não infecciosas, já que são amplificados todos os segmentos de DNA/RNA

provenientes de vírus íntegros e não íntegros, o que pode implicar em

avaliações inverídicas de infecciosidade. Assim, se o objetivo for avaliar a

infecciosidade viral, ensaios que integrem cultura celular e técnicas

moleculares são recomendáveis, sendo que o método de ICC-et-RT-qPCR e

suas variações contemplam tal objetivo (KO et al., 2003; HAMZA et al., 2011;

FONGARO et al., 2013; FONGARO et al., 2014).

Nesse sentido, foi investigada a infecciosidade de PCV-2 provenientes

de afluentes e efluentes suinícolas através de ICC-et-RT-qPCR. O modelo

PCV-2 foi adotado por ser dos vírus avaliados o mais frequentemente

detectado e por ser cultivável in vitro. Os resultados indicaram que a BA

durante o outono-inverno reduziu PCV-2 em menos de 90% (0,97 Log10), e no

período primavera-verão a redução foi estatisticamente significativa (>99%,

2,50 Log10).

Explica-se que no período de primavera-verão, são atingidas

temperaturas ambientais favoráveis à BA (superiores a 24ºC), melhorando

assim sua eficiência. Isto impactou a inativação viral, favorecendo a

higienização do dejeto durante a produção de biogás e biofertilizante. A

temperatura está intimamente relacionada à inativação de patógenos,

especialmente os entéricos virais, que em geral apresentam sensibilidade

semelhante para mudanças térmicas. Em temperaturas mais baixas, a

concentração viral costuma ser detectada em níveis elevados. A inativação

viral não se deve somente ao efeito térmico, mas também ao efeito exercido

pela matriz, sendo que estes costumam apresentar-se correlacionados (WEN

et al., 2004; BERTRAND et al., 2012).

Em adição, a temperatura ambiental é variável de acordo com a estação

vigente e a região de origem das amostragens. O aumento térmico pode

desnaturar proteínas estruturais e modificar a atividade de algumas enzimas,

além de degradar os ácidos nucleicos dos vírus; entretanto, quando

submetidos a tratamentos com temperaturas inferiores, vírus com genoma de

DNA, como é o caso de PCV-2, costumam apresentar menor degradação de

47

seu material genético, e por consequência sua infecciosidade viral é mantida

(TULADHAR et al., 2012; CARRATALÀ, et al., 2013).

O decréscimo observado na infecciosidade de PCV-2 também pode ser

decorrente de sua capacidade de agrupamento com outras partículas virais e

de suas propriedades, tais como ponto isoelétrico e carga iônica, ou das

características da própria matriz - a qual contém sólidos em que os vírus

podem se agregar - como pH e teor de matéria orgânica. A agregação viral

aumenta o tamanho das estruturas e inibe a adsorção celular, o que pode gerar

falsos resultados positivos de redução. Entender o comportamento das

partículas virais em relação à agregação ou adsorção é necessário para

elucidar alguns dos processos envolvidos na disseminação e infecciosidade

viral. Assim, as análises das propriedades de superfície dos vírus têm sido

cada vez mais difundidas (DIKA et al., 2011).

De maneira geral, suínos são considerados reservatórios biológicos de

patógenos zoonóticos, que podem ser excretados intermitentemente nos seus

dejetos. Conforme define a OMS (2002), zoonoses são enfermidades

infecciosas transmissíveis de forma natural de animais para o homem ou vice-

versa. Em locais de produção intensiva, onde os animais estão concentrados, a

transmissão pode ser favorecida.

Cardoso (2009) divide as zoonoses que envolvem suínos em seu ciclo

de transmissão em dois grupos: a) zoonoses transmitidas por alimentos e b)

zoonoses transmitidas especialmente por contato direto. Ambas têm impacto

deletério perante o consumidor, podendo resultar em prejuízo substancial para

a cadeia produtiva como um todo. Portanto, os animais de produção intensiva

devem ser o centro de medidas de controle que visam bloquear infecções

zoonóticas em humanos (VASCONCELLOS, 2001).

Assim, é importante entender e aplicar os conceitos de biosseguridade

animal e biossegurança humana, que envolvem um conjunto de medidas

integradas capazes de controlar e reduzir a ocorrência de doenças –

zoonóticas ou não- em uma população. A biosseguridade, particularmente,

inclui isolamento, profilaxia e cuidados sanitários dos rebanhos de modo a

evitar o contágio e difusão por patógenos, sejam eles vírus, bactérias, fungos

48

ou parasitas, que impactam na cadeia produtiva e na saúde humana

(VASCONCELLOS, 2001; PORKWORLD, 2013).

A alta prevalência de PCV-2, PAdV e RV-A em amostras de efluente

suíno mostra que os sistemas de BA, nas condições estudadas, não obtiveram

sucesso em eliminar os patógenos entéricos virais durante todo o ano, mesmo

com as mudanças de temperaturas.

Considerando os resultados aqui obtidos, o efluente biodigerido em

biodigestores anaeróbios psicrofílicos devem ser higienizados (pós-tratados).

Alternativamente essa higienização poderá ser realizada por meio de

estocagem em esterqueiras, lagoas sequenciais, emprego de calagem, uso de

biocidas como amônia não-ionizada e outros (EMMOTH et al., 2011;

BERTRAND et al., 2012; FONGARO et al., 2014; MAGRI et al., 2015).

Cabe ressaltar que a necessidade de tratamentos adicionais à BA

psicrofílica não exclui sua importância, visto que o processo diminui a

disposição indevida de dejetos gerados não só pela suinocultura como também

por outras práticas, como bovinocultura e avicultura, bem como é apto para

produção de energia limpa e renovável (biogás), permitindo o reciclo de

nutrientes na agricultura para produção alimentícia (biofertilizante), o que faz da

biodigestão prática economicamente viável e sustentável (MEDEIROS,

WANDERLEY & WANDERLEY, 2003; BILOTTA & KUNZ, 2013).

É recomendável, portanto, estudos epidemiológicos e levantamento das

condições de criação de suínos não somente na região Sudeste, mas em todo

o território nacional, bem como o melhoramento do processo de BA e pós-

tratamento do efluente final nas granjas de todo o país, sendo o PCV-2 um

biomarcador para inferir a redução de patógenos antes do reciclo agrícola. Em

adição, órgãos competentes devem considerar os estudos regionais e

nacionais e compilar a programas de gestão de dejetos animais, visando

práticas aplicáveis e reciclo agropecuário, de modo que a produtibilidade seja

potencializada, sustentável e segura.

49

6. CONCLUSÕES

A higienização de dejetos suinícolas por meio de BA em condição

psicrofílica, no Sudeste do Brasil, apresentou maior potencial durante o período

de primavera-verão. Porém, por si só, o tempo de 60 dias de RH não foi

considerado suficiente para reduzir no mínimo 99,9% dos patógenos presentes,

adotando PAdV, PCV-2 e RV-A como biomarcadores. Recomenda-se que para

fins de reciclo agrícola haja o pós-tratamento do efluente produzido nessas

condições visando qualidade ambiental, o que implica em melhoria na saúde

humana e animal.

50

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