UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA ......A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado,...
Transcript of UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA ......A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado,...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
FACULDADE DE FARMÁCIA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Marina Loures Borges
Pesquisa de substâncias antagonistas produzidas por amostras de bactérias
isoladas de sistemas de aquicultura
Juiz de Fora
2016
Marina Loures Borges
Pesquisa de substâncias antagonistas produzidas por amostras de bactérias
isoladas de sistemas de aquicultura
Monografia apresentada ao Programa de
graduação em Farmácia, da Universidade
Federal de Juiz de Fora como requisito
parcial a obtenção do grau de Bacharel
em Farmácia.
Orientador: Professora Doutora Ana Carolina Morais Apolônio
Juiz de Fora
2016
Marina Loures Borges
Pesquisa de substâncias antagonistas produzidas por amostras de bactérias
isoladas de sistemas de aquicultura
Monografia apresentada ao Programa de
graduação em Farmácia, da Universidade
Federal de Juiz de Fora como requisito
parcial a obtenção do grau de Bacharel
em Farmácia.
Aprovada em: ____ de ______ de ______
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Doutora Ana Carolina Morais Apolônio - Orientadora Universidade Federal de Juiz de Fora
_______________________________________
Doutora Vânia Lúcia da Silva Universidade Federal de Juiz de Fora
________________________________________
Doutora Vanessa Cordeiro Dias Laboratório Côrtes Vilela
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, figura de fé que sempre sinto tão presente em
minha vida!
Aos meus pais, Alice e Eduardo, por terem me proporcionado toda a estrutura
necessária para que eu pudesse chegar até aqui.
A minha irmã Amanda, por estar sempre ao meu lado, me apoiando e acreditando
em meu sucesso!
A Carol, por me ensinar cada detalhe com muito carinho! Além de uma orientadora
extraordinária, acredito ter ganhado uma grande amiga!
Agradeço à banca examinadora, Vanessa e Vânia, por tão gentilmente terem
aceitado compartilhar comigo deste passo tão importante em minha profissão.
As meninas do laboratório: Kelly, Izabella, Rafhaela, e Samantha, pelo
companheirismo ao longo desta jornada e por terem sido peças fundamentais na
conclusão deste trabalho.
A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, me dando o suporte
necessário para que eu pudesse chegar até aqui.
Ao laboratório de Microbiologia, por ter me proporcionado a estrutura necessária
para a realização deste trabalho.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui.
Muito obrigada!
RESUMO
Desde 1970, a aquicultura tem mantido um crescimento anual de 8,7% no mundo inteiro.
Porém, doenças infecciosas de origem bacteriana ocasionam perdas no estoque além de
constituírem riscos durante a produção dos peixes. Como forma de controlar o surgimento
dessas doenças, foi introduzido o uso dos antimicrobianos, o que levou ao aparecimento de
microrganismos resistentes. Assim a busca por alternativas ao uso de antimicrobianos na
aqüicultura vem sendo incentivada. Bacteriocinas são proteínas ou peptídeos sintetizados
nos ribossomos das bactérias, que possuem atividade antimicrobiana. Estudos já
demonstram aplicações de bacteriocinas na conservação de peixes. Assim os objetivos
deste trabalho foram avaliar a habilidade antagonista de amostras isoladas de sistemas de
aqüicultura frente a diferentes bactérias reveladoras e a influência da composição do meio
de cultivo na expressão dessas substâncias; selecionar algumas bactérias produtoras para
avaliar a presença de fatores de interferência; extrair e caracterizar parcialmente as
substâncias antagonistas detectadas. Foram analisadas 201 amostras frente às reveladoras
Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila;
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy,
obtendo-se um total de 312 halos de inibição. As amostras de C2I12 e C2I13 foram
selecionadas e testadas frente à Aeromonas hydrophila, não indicando presença de fatores
de interferência (clorofórmio, produção de ácidos e bacteriófago). Extração da substância
antagonista foi feita com sulfato de amônio 50% e a atividade antimicrobiana testada pelo
método de difusão em poços, indicando que a espessura do meio de cultura e o tempo de
incubação do inoculo interferiam na expressão e quantidade da substancia antagonista,
respectivamente. Nos testes de caracterização, ambos os extratos mostraram boa
estabilidade térmica, e a variações de pH. Extrato de C2I12 teve sua atividade preservada
quando exposto à hexano 50% e extrato de C2I13 não apresentou atividade após ser tratado
com solventes orgânicos. Ambos os extratos tiveram sua atividade antimicrobiana reduzida
quando tratados com surfactantes e com proteinase K. A concentração inibitória mínima
encontrada para extrato de C2I12 foi de 0,1558 mg/mL e de 0,2675 mg/mL para extrato de
C2I13, sendo ambos os extratos bacteriostáticos. Os resultados mostram que bactérias
isoladas de sistemas de aqüicultura são capazes de produzir substâncias antagonistas,
ativas principalmente para Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis. A purificação e
caracterização parcial da substancia antagonista de dois isolados selecionados demonstrou
uma substancia ativa para Aeromonas hydrophila sob várias condições. Essas substâncias
antagonistas podem, no futuro, contribuir no controle de doenças infecciosas que acometem
peixes na aqüicultura, diminuindo as perdas econômicas e reduzindo a resistência aos
antimicrobianos. Os resultados também sugerem que as substâncias encontradas são tipo
bacteriocina, o que justifica a necessidade de estudos complementares para purificação e
identificação dessas substâncias.
PALAVRAS-CHAVE: Substâncias antagonistas. Aquicultura. Bacteriocinas. Antimicrobiano.
Aeromonas hydrophila.
ABSTRACT
Since 1970, the aquiculture keep annual growth of 8,7% in all the world. However, infection diseases of bacterial origin cause losses in stock besides constitute risks during the fish production. In order to control the outset of these diseases was introduced the use of antimicrobials, which lead to the emergence of resistant microorganisms. So the search for alternatives to the use of antimicrobials in aquaculture is being encouraged. Bacteriocins are proteins or peptides synthesized in the ribosomes of bacteria, which have antimicrobial activity. Studies have demonstrated the application of bacteriocins in preserving fish. Thus the aims of this study were to evaluate the ability of antagonist strains isolated from aquaculture systems across the different indicator bacteria and the influence of the culture medium composition on the expression of these substances; selecting some producers to evaluate the presence of interfering factors; extract and partially characterize the antagonists substances detected. Were analyzed 201 samples front the indicators: Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila; Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy, obtaining a total of 312 inhibition halos. Strains of C2I12 and C2I13 were selected and tested against Aeromonas hydrophila, indicating no presence of interfering factors (chloroform, acid production and
bacteriophage). Extraction of the antagonist substance was done with 50% ammonium sulfate and the antimicrobial activity tested by the spread-plate method, indicating that the thickness of the culture medium and inoculum incubation time interfered in the expression and amount of antagonist substance, respectively. In characterization tests both extracts showed good thermal and pH variations stability. C2I12 extract had its activity preserved when exposed to hexane 50% and C2I13 extract showed no activity after being treated with organic solvents. Both extracts reduced their antimicrobial activity when treated with surfactants and proteinase K. C2I12 and C2I13 extracts have bacteriostatic activity. The minimum inhibitory concentration found to C2I12 extract was 0.1558 mg / ml and 0.2675 mg / ml to C2I13 extract. The results show that bacteria isolated from aquaculture systems are able to produce antagonist substances active mainly for Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis. Purification and partial characterization of antagonist substance of two selected isolates demonstrated an active substance for Aeromonas hydrophila under various conditions.
These antagonistic substances may in the future contribute to the control of infectious diseases that affect fish in aquaculture, decreasing economic losses and reducing antimicrobial resistance. The results also suggest that the substances found are bacteriocin type, which justifies the need for further studies to purification and identification of such substances. KEYWORDS: antagonistic substances. Aquaculture. Bacteriocins. Antimicrobial. Aeromonas
hydrophila .
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Bactérias produtoras com os melhores resultados frente às reveladoras -p.35 Quadro 2- Quadro 2: Diferença de expressão da atividade antagonista entre os métodos de difusão em poços e sobrecamada para os extratos de C2I12 e C2I13- p.36 Quadro 3-Interferência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 - p.37 Quadro 4- Diferença de tamanho das zonas de inibição dos extratos de C2I12 e C2I13
produzidos após incubação a 37°C por 24 horas, 48 horas e 72 horas - p.38
Quadro 5- Estabilidade do extrato de C2I12 ao tratamento térmico - p.39 Quadro 6- Estabilidade do extrato de C2I13 ao tratamento térmico - p.40 Quadro 7- Estabilidade do extrato de C2I12 e C2I13 a diferentes pH’s ao longo do tempo - p.42 Quadro 8 -Efeito de diferentes solventes orgânicos na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.44
Quadro 9- Influência dos surfactantes na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.45
Quadro 10- Interferência da proteinase K na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.46
Quadro 11- Concentração de proteínas no extrato bruto de C2I12 e C2I13, pelo método de Bradford (1976) - p.47
Quadro 12- Concentração Inibitória Mínima e atividade antibacteriana dos extratos de C2I12 e C2I13 e controle - p.47
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Imagem 1- Bactérias produtoras nos poços do replicador - p. 21 Imagem 2- Bactérias produtoras sendo replicadas - p. 22 Imagem 3- Halos produzidos ao redor das bactérias produtoras - p.33 Imagem 4- Ausência de zona lítica, após teste de bacteriófago - p.36 Imagem 5- Expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 na placa com 0,2 cm de meio e 0,5 cm de meio, respectivamente - p. 37
Imagem 6- Estudo de estabilidade de 15 dias, nas temperaturas de -4°C, 4°C, 25°C e 37°C, para os extratos de C2I12 e C2I13, respectivamente - p.41 Imagem 7- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente - p.42 Imagem 8- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I13, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente - p.43 Imagem 9- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12 e C2I13 , após 24 horas; e controles positivo e negativo, respectivamente - p.43 Imagem 10- Teste do solvente para C2I12 e C2I13, respectivamente, após tratamento com Hexano, Metanol e Acetonitrila nas concentrações de 10% e 50%, após 15 minutos, 30 minutos e uma hora de exposição - p.45
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Preparo do Inóculo - p.24
Figura 2- Precipitação com Sulfato de Amônio 50% - p.25
Figura 3- Método da Sobrecamada - p.26 Figura 4- Método de Difusão em Poços - p.27 Figura 5- Teste de estabilidade a diferentes pH’s - p.29 Figura 6- Processo para dosagem de Proteínas pelo método de Bradford - p.31 Figura 7- Microdiluição em poços - p.32
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Gráfico 1- Porcentagem da atividade antagonista frente às reveladoras testadas - p. 34
Gráfico 2- Porcentagem do número de halos produzidos, por meio de cultura - p.34 Gráfico 3- Curva absorbância X Concentração do padrão de BSA - p.47
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................... 14
2.1 A aquicultura e seus desafios ................................................................ 14
2.2 Resistência aos antimicrobianos ............................................................ 17
2.3 Bacteriocinas ......................................................................................... 18
3 OBJETIVOS ............................................................................................... 20
3.1 Geral ...................................................................................................... 20
3.2 Específicos ............................................................................................ 20
4 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 21
4.1 Obtenção das amostras ......................................................................... 21
4.2 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas .................. 21
4.3 Avaliação da influência do meio de cultivo ............................................. 22
4.4 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância antagônica
detectada ..................................................................................................... 23
4.4.1 Avaliação da interferência do Clorofórmio........................................ 23
4.4.2.Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa ......... 23
4.4.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos .................................. 23
4.5 Obtenção dos extratos brutos protéicos bacterianos (Precipitação com sulfato
de amônio) ................................................................................................... 24
4.5.1 Preparo do Inóculo .......................................................................... 24
4.5.2 Precipitação com Sulfato de Amônio ............................................... 24
4.6 Avaliação da atividade antagonista do extrato ....................................... 25
4.6.1 Difusão em poços x Sobrecamada .................................................. 25
4.6.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista27
4.6.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância
antagonista ............................................................................................... 27
4.7 Caracterização da substância antagonista dos extratos ........................ 28
4.7.1 Estabilidade ao tratamento térmico .................................................. 28
4.7.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH ......................... 28
4.7.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos29
4.7.4 Influência de Surfactantes na atividade antagonista ........................ 30
4.7.5 Suscetibilidade à enzima proteolítica ............................................... 30
4.8 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford ................................... 30
4.9 Determinação da Concentração Inibitória Mínima .................................. 31
5 RESULTADOS ........................................................................................... 33
5.1 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas .................. 33
5.2 Avaliação da influência do meio de cultivo ............................................. 34
5.3 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância antagonista
detectada ..................................................................................................... 35
5.3.1 Interferência do clorofórmio ............................................................. 35
5.3.2 Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa ......... 35
5.3.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos .................................. 36
5.4 Avaliação da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 ........... 36
5.4.1 Difusão em poços X Sobrecamada .................................................. 36
5.4.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista37
5.4.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância
antagonista ............................................................................................... 37
5.5 Manutenção da atividade antagonista dos extratos................................ 38
5.5.1 Estabilidade ao tratamento térmico .................................................. 38
5.5.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH ......................... 41
5.5.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos44
5.5.4 Influência de Surfactantes na atividade antagonista ........................ 45
5.5.5 Suscetibilidade a enzima proteolítica ............................................... 46
5.6 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford ................................... 46
5.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) ........................ 47
6 DISCUSSÃO ............................................................................................... 48
7 CONCLUSÃO ............................................................................................. 55
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................56
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 57
ANEXO ........................................................................................................... 66
13
1 INTRODUÇÃO
Entre os setores responsáveis por produzir alimentos de origem animal, a
aquicultura vem sendo, por muitos anos, o que mais cresce. Segundo a Food and
Agriculture Organization das Nações Unidas (FAO), até 2020 ela será responsável
por metade da alimentação humana proveniente de ambientes aquáticos.
Embora a aquicultura venha crescendo de forma considerável, um fator de
grande importância impede que esse crescimento seja ainda maior. As doenças
infecciosas de origem bacteriana podem ocasionar perdas no estoque além de
constituírem riscos durante a produção dos peixes e para a saúde humana. Como
forma de controlar o surgimento dessas doenças, o uso dos antimicrobianos foi
introduzido, o que tem resultado em um aumento da pressão seletiva nas
populações bacterianas. Diante disso, uma das maiores preocupações atuais
consiste no fato dessa pressão seletiva exacerbada na aquicultura poder gerar
impactos para a medicina humana, levando a um aumento do número de infecções
ou causando infecções mais severas, que podem muitas vezes ter o tratamento
dificultado. Dessa forma, o uso de antimicrobianos em animais deve ser controlado
ou até mesmo evitado para que não seja gerada resistência aos medicamentos por
parte dos microrganismos.
Justifica-se então, a busca por alternativas viáveis que levem à diminuição
do uso de antimicrobianos na aquicultura e que, consequentemente, tenha-se uma
diminuição da resistência. Uma alternativa que vem sendo muito empregada é o
biocontrole, que consiste no controle de microrganismos utilizando microrganismos.
Entre as formas de biocontrole, algumas vêm sendo mais estudadas, como o uso de
probióticos, vacinas, imunoestimulantes e as bacteriocinas.
As bacteriocinas são peptídeos ou proteínas produzidas pelas próprias
bactérias, que possuem ação antimicrobiana. Essas substâncias são produzidas
tanto por microrganismos Gram positivos, quanto por microrganismos Gram
negativos, e vários autores vêm confirmando a ação antagonista desses peptídeos.
Assim, este trabalho buscou avaliar a produção de potenciais substâncias
antagonistas tipo bacteriocina em isolados bacterianos de sistemas de sistemas de
aqüicultura.
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A aquicultura e seus desafios
Aquicultura consiste em criar organismos aquáticos como peixes, moluscos
crustáceos e plantas aquáticas em um espaço confinado que possua condições
controladas. Dessa forma, os animais cultivados estão protegidos de condições
desfavoráveis ao seu crescimento, como por exemplo, fatores ambientais, a falta de
alimentação ou a presença de predadores (EMBRAPA, SD; BARROSO, 2007).
Desde 1970, a aquicultura tem mantido um crescimento anual de 8,7% no
mundo inteiro, sendo o setor de produção de alimentos de origem animal que mais
cresce (ALY, 2009). Porém, a estocagem de grandes quantidades de animais e a
intensa manipulação dos mesmos favorece o aparecimento de doenças infecciosas,
o que constitui o maior fator de impedimento para que o crescimento da aquicultura
seja ainda maior, gerando um prejuízo de cerca de dois bilhões de dólares por ano
(BALCÁZAR, 2006; SILVA, 2009; SACCHETIN, 2010; DEFOIRDT, 2011). Dentre as
doenças que infectam os peixes, as de origem bacteriana são as que causam maior
impacto, principalmente devido à taxa elevada de mortalidade, bem como o grande
gasto financeiro necessário com a prevenção e o controle dessas doenças
(SACCHETIN, 2010). Normalmente elas são causadas por microrganismos Gram
negativos das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e Vibrionaceae, que
levam principalmente a formação de úlceras e septicemias (ALY,2009). Alguns
gêneros bacterianos são responsáveis por grandes perdas econômicas, como é o
caso de Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Edwardsiella,
Streptococcus e Enterococcus (SILVA, 2009).
Assim a indústria buscou estratégias para minimizar esses impactos, e os
antimicrobianos passaram a ser utilizados na aquicultura como forma de controlar o
surgimento de doenças bacterianas (BALCÁZAR, 2006). Porém, o emprego destas
substâncias acaba sendo empírica, devido à dificuldade existente de se determinar
doses individuais de antimicrobianos para espécies aquáticas que são cultivadas em
grandes densidades (RESENDE et al.,2016). Essa prática, porém, tem ocasionado
o aparecimento de microrganismos resistentes a diferentes tipos de antimicrobianos,
o que é um grande problema, considerando que muitos desses fármacos também
são utilizados para tratar doenças humanas (SILVA, 2009; SACCHETIN, 2010;
DEFOIRDT, 2011). Outro ponto importante a ser considerado é que alguns desses
15
microrganismos que facultativamente causam doenças nos peixes podem ser
transmitidos aos seres humanos. Além disso, a própria resistência poder ser
transmitida a microrganismos que acometem o homem, através da transferência
horizontal de genes, como já foi evidenciado para o Vibrio cholerae (ALY, 2009;
DEFOIRT, 2011). Assim, o uso de antimicrobianos na aquicultura deve ser
restringido ou até mesmo evitado. Para isso são necessárias outras formas de
controle de microrganismos (CYRINO et al., 2010).
O biocontrole nada mais é que o controle de microrganismos por
microrganismos. Ele vem sendo muito utilizado em vários ramos, e na aquicultura
está se mostrando viável como alternativa ao uso de antimicrobianos (JÚNIOR,
2000). Algumas formas de biocontrole podem ser citadas como, por exemplo, o uso
de probióticos, prebióticos, imunoestimulantes e vacinas.
Probióticos são microrganismos vivos, que quando consumidos em
quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro
(FAO/WHO,2001). Diferentemente dos animais terrestres, os organismos aquáticos
possuem uma microbiota facilmente modificada por alterações de temperatura e
salinidade. Essa alteração também pode ser rapidamente feita pela comida, ou por
microrganismos que venham na água (GATESOUPE, 1999). Assim, os probióticos
podem ser usados na aquicultura de duas maneiras: adicionando os microrganismos
nos tanques de piscicultura, de forma a transformar a microbiota ambiental,
diminuindo a presença de microrganismos causadores de doenças infecciosas; ou
ser adicionada às rações, modificando a microbiota intestinal dos peixes através dos
mecanismos de competição (REZENDE 2009; CYRINO et al., 2010).
Os prebióticos muitas vezes são confundidos com os probióticos, porém
constituem conceitos diferentes. Prebióticos são ingredientes adicionados à
alimentação, que não são digeridos no trato gástrico. Eles afetam o hospedeiro por
estimularem o crescimento seletivo de um número limitado de bactérias, ou ativarem
o metabolismo de bactérias que, no cólon, são benéficas para a saúde do
hospedeiro (GATESOUPE, 1999; CYRINO, 2010; SILVA, 2012). Segundo SILVA
(2012), alguns exemplos de prebióticos seriam: glicose, frutose, galactose, manose,
pentoses, ribose, xilose e arabinose, sendo que a frutose e a manose são os dois
componentes mais importantes dos grupos de prebióticos utilizados nos dias de
hoje.
16
Atualmente, o interesse em utilizar imunoestimulantes na piscicultura vem
aumentando, principalmente nas fases iniciais da vida dos peixes, em que eles estão
mais propensos a adquirirem doenças. Essa prática aumenta o bem-estar do animal,
principalmente em sistemas intensivos de produção (AGOSTINHO, 2010).
Imunoestimulante é qualquer produto que seja capaz de estimular o sistema
imunológico, aumentando a atividade das células fagocitárias, e a produção de
anticorpos. Elas diminuem o estresse devido ao manejo dos peixes, e
consequentemente diminuem as perdas econômicas devido às doenças infecciosas.
Como exemplos de imunoestimulantes podem ser citados os extratos de plantas e
de animais, ou até mesmo fatores nutricionais (TAVECHIO, 2009).
O desenvolvimento de novas vacinas e o aprimoramento das técnicas de
vacinação tem contribuído consideravelmente para a diminuição das mortes de
peixes, causadas por doenças infecciosas (LONGHI, 2012). Ao se estimular a
imunização dos peixes através da vacinação, diminui-se a necessidade do uso de
antimicrobianos (SACCHETIN, 2010). A vacinação dos peixes pode ser feita por três
métodos: via oral, por imersão, ou via intraperitoneal.
A vacinação oral consiste no método mais fácil de entrega do antígeno ao
hospedeiro, uma vez que ela é feita através da alimentação (SOMMERSET, 2005).
Esse método é considerado ideal, por ser de fácil administração, por não precisar
manipular os peixes, além de ser barato (HEPPELL, 2000). Porém, alguns estudos
já demonstraram que esse método não é tão eficiente devido à destruição de parte
dos antígenos pelo trato gastrointestinal do hospedeiro, sendo menos eficaz que a
vacinação por via intraperitoneal ou imersão. Além disso, não é possível estimar a
dose consumida por cada animal (SOMMERSET, 2005; HEPPELL, 2000).
Na vacinação por imersão, os peixes são colocados em contato com uma
solução concentrada de vacina (HEPPELL, 2000). Embora seja menos eficaz que o
método intraperitoneal, a vacinação por imersão traz a vantagem de ser mais barata
e prática, podendo ser aplicada até em espécies de pequeno porte; além disso, ela
diminui a manipulação dos peixes, evitando estresse e não necessita de mão de
obra qualificada para sua execução (LONGHI, 2012; HEPPELL, 2000).
Embora necessite de manipulação dos peixes, a vacinação injetável é a que
apresenta melhores efeitos de imunização (HEPPEL, 2000). Além disso, tem-se a
17
vantagem de todos os peixes serem vacinados e com a dose correta. A quantidade
de vacina utilizada também é baixa quando comparado com outros métodos de
vacinação (SOMMERSET, 2005). Porém, este método possui como desvantagens o
fato de possuir difícil aplicação, causando estresse aos peixes, além de necessitar
de mão de obra qualificada (LONGHI, 2012).
2.2 Resistência aos antimicrobianos
Os antimicrobianos são compostos produzidos de forma natural ou sintética,
que são capazes de matar ou inibir o crescimento de microrganismos, como fungos
e bactérias. Quando eles causam a morte do microrganismo, são classificados como
bactericidas, e quando apenas inibem seu crescimento, são chamados
bacteriostáticos (GUIMARÃES, 2010).
O primeiro antibiótico, a penincilina, foi descoberto em 1928 por Alexander
Fleming e constituiu um dos maiores marcos da história da ciência. Após a sua
produção a nível industrial, nos anos 40, o número de mortes devido a doenças
infecciosas diminuiu drasticamente em todo o mundo, o que levou a busca e a
descoberta de novos antimicrobianos, principalmente durante a segunda guerra
mundial (PEREIRA,2005; GUIMARÃES, 2010). Além das vantagens terapêuticas na
medicina humana, a descoberta dos antimicrobianos também trouxe vantagens
significativas para a veterinária, reduzindo também a morte de animais devido a
doenças infecciosas (MOTA, 2005).
Desde a descoberta da penicilina, novos medicamentos contra bactérias
Gram positivas e contra Gram negativas foram introduzidos no mercado. Porém,
entre os anos de 1980 e 2000, a descoberta de novos antimicrobianos reduziu
consideravelmente (GUIMARÃES, 2010). Paralelamente a essa diminuição, o uso
abusivo e inapropriado desses medicamentos em detrimento de medidas
preventivas favoreceu o desenvolvimento de microrganismos resistentes, que se
disseminaram por todas as regiões do planeta (MEIRELES, 2008).
O uso indiscriminado dos antimicrobianos age selecionando microrganismos
resistentes a essas drogas (SANTOS, 2004). Esta resistência pode constituir um
mecanismo intrínseco de uma determinada bactéria, ocorrendo mutação espontânea
e recombinação de genes, com a formação de microrganismos resistentes; ou
podem ser uma característica adquirida através da alteração do DNA bacteriano por
18
transferência, por exemplo, de plasmídeos entre bactérias de uma mesma espécie,
ou de espécies diferentes (ANVISA, 2016; MOTA, 2005).
Em 2004 já eram relatados, casos de resistência descritos. Muitas infecções
causadas, por exemplo, por Staphylococcus aureus, Enterococcus e Mycobacterium
tuberculosis não podiam ser tratadas com os antimicrobianos existentes,
representando uma ameaça para a humanidade (SANTOS, 2004).
Dessa forma, medidas de prevenção e de uso racional de medicamentos
vêem sendo implementadas em todo o mundo. No Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), em outubro de 2010, com o objetivo de diminuir a
exposição da população e, consequentemente, combater à resistência, publicou
medidas regulatórias ao uso dos antibacterianos (NOVARETTI, AQUINO E
PISCOPO, 2014). Assim, o uso de antimicrobianos em animais também deve ser
controlado ou até mesmo evitado para que não sejam geradas resistência aos
medicamentos por parte dos microrganismos (HEUER et al, 2009).
2.3 Bacteriocinas
Ao longo do crescimento in vitro, a maioria das células bacterianas produz
compostos antagonistas, ou seja, capazes de inibir o seu próprio crescimento, ou o
crescimento de outras bactérias (SCHULTZ et al, 2003,). Essas substâncias são
produzidas como forma de competição por espaço e por recursos, podendo ter efeito
bacteriostático ou bactericida. Podemos citar, por exemplo, a produção de enzimas
bacteriolíticas, ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, substâncias antibióticas e
as chamadas bacteriocinas (YANG 2014; OGAKI, FURLANETO e MAIA (2015).
Bacteriocinas são proteínas ou peptídeos sintetizados nos ribossomos das
bactérias, que possuem atividade antimicrobiana, podendo ter origem cromossomal
ou plasmidial (ROSA, 2002; GARCIA, 2010; BARBOSA et al, 2011).
Os primeiros registros mostram que o estudo das bacteriocinas iniciou-se em
1925 através de pepitídeos produzidos por Escherichia coli, as chamadas colicinas
(ROSA, 2002; GARCIA, 2010, BAUCIUNAS, 2013). Hoje inúmeras bacteriocinas já
são conhecidas, e sabe-se que elas são produzidas tanto por microrganismos Gram
positivos, como por microrganismos Gram negativos (BARBOSA et al, 2011).
Os microrganismos produtores dessas substâncias desenvolveram um
mecanismo de imunidade, de forma que produzem ao mesmo tempo a bacteriocina
19
e uma proteína. Esta proteína produzida lhes confere imunidade, agindo como
antagonista da ação da bacteriocina (ROSA, 2002; BARBOSA et al 2011;
BAUCIUNAS, 2013; YANG 2014). Nos microrganismos alvo, normalmente essas
substâncias agem desestabilizando a membrana citoplasmática, levando ao
surgimento de poros que causam a morte celular. Devido a esse mecanismo,
bactérias Gram negativas acabam sendo mais resistentes à ação das bacteriocinas
(ROSA, 2002; GARCIA, 2010; BARBOSA et al 2011) uma vez que possuem
membrana externa, impermeável a grande maioria das bacteriocinas (FERREIRA,
2005).
O potencial de uma bacteriocina pode ser previsto por algumas
características, como sua estabilidade à diferentes pH’s e temperaturas, e/ou pelo
seu espectro de ação. Até o momento, a única bacteriocina com utilização permitida
na conservação de alimentos é a Nisina. Porém, o interesse por essas substâncias
vem aumentando, principalmente por se acreditar que elas poderiam ser utilizadas
na indústria de alimentos quando se considera a “segurança” que essas substâncias
antagonistas conferem (SCHULZ, 2003; BARBOSA et al, 2011).
20
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a produção de substâncias antagonistas tipo bacteriocina por
amostras de bactérias isoladas de sistemas de aquicultura.
3.2 Específicos
Avaliar a habilidade antagonista das amostras isoladas de sistemas de
aquicultura frente a diferentes bactérias reveladoras de grande
importância para a piscicultura e para a saúde humana;
Avaliar a influência da composição do meio de cultivo na expressão da
produção de substâncias antagonistas pelas amostras em estudo;
Selecionar as bactéias produtoras capazes de inibir o crescimento de um
maior número de reveladoras;
Avaliar fatores de interferência que poderiam influenciar na expressão da
atividade antagonista;
Extrair substâncias antagonistas das amostras selecionadas;
Caracterizar parcialmente a substância antagonista detectada.
21
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção das amostras
Neste estudo foram utilizadas amostras previamente isoladas de sistemas
de aqüicultura (localizados na cidade de Leopoldina, Minas Gerais, Brasil) e
amostras de referência, pertencentes à coleção de culturas do laboratório de
Fisiologia e Genética Molecular Bacteriana. Estas amostras são mantidas
congeladas à -20°C em SkinMilk.
4.2 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas
Foram realizados testes para avaliar a produção de substâncias
antagonistas, frente a seis espécies bacterianas, chamadas reveladoras, por meio
do método da sobrecamada. As espécies reveladoras foram escolhidas de acordo
com a sua importância para a piscicultura e para a saúde humana, sendo elas:
Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila;
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy
(CFP/IAL1472). Para esse teste, 100 µL de culturas de 24h em caldo BHI
(Laboratório KASVI) de cada uma das produtoras foram pipetados, em diferentes
poços do replicador de Steers. Dessa forma, foi possível analisar 32 amostras de
bactérias produtoras por vez, conforme mostrado na imagem 1.
Imagem 1: Bactérias produtoras nos poços do replicador.
Fonte: Os autores, 2015
As amostras produtoras foram então replicadas para placas de Petri
contendo o meio de cultura teste, conforme é mostrado pela imagem 2. As placas
devidamente identificadas foram então incubadas em estufa a 37°C, durante um
22
período de 24 horas, após o qual foi observado o crescimento das bactérias
produtoras.
Imagem 2: Bactérias produtoras sendo replicadas.
Fonte: Os autores, 2015.
Em seguida, procedeu-se a morte das bactérias produtoras por meio da
exposição ao vapor de clorofórmio: 0,5 mL de clorofórmio foi depositado na tampa
das placas de Petri, deixando as mesmas fechadas por 30 minutos e em seguida,
abertas por mais 30 minutos, para a evaporação do clorofórmio residual. Após a
morte das bactérias produtoras, colocou-se a sobrecamada contendo as bactérias
reveladoras: a cada 4 mL de meio BHI semi-sólido fundido, foi adicionado 20 µL da
bactéria reveladora, previamente crescida em caldo BHI (Laboratório KASVI) por
24h; o mesmo era homogeneizado e vertido sobre a placa de Petri contendo as
produtoras anteriormente mortas. As placas eram então incubadas em estufa a 37°C
por mais 24 horas.
No quarto dia de testes, as placas foram retiradas da estufa e foi avaliada a
existência de halo de inibição de crescimento da reveladora. Os halos detectados
eram medidos e as amostras produtoras positivas para o antagonismo armazenadas
à -20°C, no meio SkinMilk, para realização dos testes posteriores.
4.3 Avaliação da influência do meio de cultivo
Os testes da avaliação da atividade antagonista foram realizados em três
meios de cultura diferentes: ágar BHI (Laboratório KASVI), ágar Mueller Hinton
(Laboratório KASVI) e ágar Nutritivo (Laboratório KASVI), utilizando-se metodologia
descrita no item anterior.
23
4.4 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância
antagonista detectada
Para a avaliação dos fatores de interferência foram selecionadas as
amostras bacterianas C2I12 e C2I13 como produtoras e Aeromas hydrophila como
reveladora. Para a realização dos testes foi utilizado o meio Nutritivo (Laboratório
KASVI).
4.4.1.Avaliação da interferência do Clorofórmio
Após o crescimento das amostras produtoras, placas contendo Ágar nutritivo
(Laboratório KASVI) foram reveladas pelo método da sobrecamada, sem que as
mesmas fossem anteriormente mortas pelo vapor de clorofórmio.
4.4.2.Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa
Para analisar a interferência de ácidos graxos de cadeia longa na expressão
da atividade antagonista das amostras produtoras, utilizou-se o método descrito por
APOLÔNIO (2007). Foram replicados 5 µL de cultura de 24 horas da reveladora
para duas placas de Petri, a primeira contendo ágar nutritivo e a segunda ágar
nutritivo com 1% de amido. As placas foram incubadas por 24 horas a 37°C. No dia
seguinte, as placas foram reveladas com 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório
KASVI) contendo 20 µL de cultura de 24 horas da reveladora Aeromonas hydrophila
e incubadas à 37°C por 24 horas. A interferência dos ácidos graxos de cadeia longa
foi analisada através da presença ou ausência de halos na placa contendo amido
1%.
4.4.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos
A avaliação do antagonismo por bacteriófagos foi realizada segundo método
adaptado de APOLONIO et al (2007). As amostras produtoras foram replicadas no
Ágar nutritivo, e incubadas em estufa a 37°C por 24 horas. Após esse período, as
placas foram reveladas utilizando-se 4 mL de BHI (Laboratório KASVI) contendo 20
µL de Aeromonas hydrophila e re-incubadas a 37°C por mais 24 horas. Cubos de
0,5 cm³ dos halos de inibição foram então retirados assepticamente, com o auxilio
de uma alça bacteriológica, macerados e colocados em 500 µL de BHI caldo
(Laboratório KASVI). A solução foi então centrifugada à 3600g por cinco minutos e o
sobrenadante totalmente adicionado em 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório
KASVI) fundido contendo 20 µL da amostra reveladora, o qual foi vertido sobre uma
placa de Petri contendo Ágar Nutritivo (Laboratório KASVI). Após incubação a 37°C
24
por 24 horas, avaliou-se a presença de zonas líticas que indicariam a presença dos
bacteriófagos.
4.5. Obtenção dos extratos brutos protéicos bacterianos (Precipitação com
sulfato de amônio)
4.5.1Preparo do Inóculo
Partindo-se da cultura congelada, o pré-inóculo foi preparado adicionando-se
50 µL da amostra produtora em 10 mL de BHI caldo seguido de incubação à 37ºC
por 24 horas. O inóculo foi então preparado: acertou-se 20 mL de BHI caldo
(Laboratório KASVI) para a escala 0,5 McFarland utilizando-se o pré-inóculo e
verteu-se o mesmo em 180 mL de BHI caldo (Laboratório KASVI). O inoculo foi
então incubado a 37ºC, por 24 horas. Foram preparados inóculos de C2I12 e C2I13. O
processo está esquematizado na figura 1.
Figura 1: Preparo do Inóculo
Fonte: Os autores, 2016.
4.5.2 Precipitação com Sulfato de Amônio
A realização da precipitação com sulfato de amônio foi feita de acordo
com o método descrito por OLIVEIRA (2004), com adaptações. Os 200 mL de
inóculo foram então centrifugados a 8000 g, por 20 minutos, 4°C, para que as
células fossem precipitadas. Em seguida, o sobrenadante foi separado e
colocado em banho de gelo. Adicionou-se então 62,6 g (50%) de NH3SO4
(laboratório Dinâmica). Agitou-se suavemente com a ajuda de um bastão de
vidro, até que todo o sulfato de amônio tivesse sido solubilizado. A extração
prosseguiu com uma segunda centrifugação a 8000 g, por 20 minutos, 4°C, para
25
que as proteínas fossem precipitadas. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido em 2 mL de água destilada esterilizada, obtendo-se o extrato
bruto 50%. Foi produzido extrato bruto de C2I12 e C2I13. Foi realizada a análise de
um controle negativo com solução de sulfato de amônio 50% para analisar se
havia ou não interferência do mesmo. A figura 2 representa o processo de
extração.
Figura 2: Precipitação com Sulfato de Amônio 50%.
Fonte: Os autores, 2016
4.6 Avaliação da atividade antagonista do extrato
4.6.1 Difusão em poços x Sobrecamada
Este teste foi realizado com o intuito de se determinar qual era o melhor
método de difusão dos extratos através do meio de cultura. Dessa forma, dois testes
foram feitos concomitantemente para que os resultados pudessem ser comparados:
difusão em poços e sobrecamada:
26
Sobrecamada: Uma cultura de 24 horas da reveladora em BHI caldo
(Laboratório KASVI) foi acertada para a escala de 0,5 McFarland e 20 µL da
reveladora foram inoculados em 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório KASVI)
fundido. Em seguida, os 4 mL de BHI semi-sólido foram vertidos sob uma placa de
Ágar Nutritivo (Laboratório KASVI). Foram então pipetados para a placa, 10 µL do
extrato bruto e de sua diluição seriada na base 2 (até 1:64) em água esterilizada. A
placa foi incubada por 24 horas, a 37°C.
Difusão em Poços: Uma cultura de 24 horas da reveladora em BHI caldo
(Laboratório KASVI) foi acertada para a escala de 0,5 McFarland. Com a ajuda de
um Swab, a mesma foi espalhada na superfície de uma placa de Petri contendo ágar
nutritivo. Em seguida, os poços foram feitos com a ponta de um canudo esterilizado.
Em cada um dos poços foi colocado 10 µL do extrato bruto e de suas diluições
seriadas na base 2 (até 1:64) em água esterilizada. A placa foi incubada por 24
horas, a 37°C.
No dia seguinte, comparou-se a formação das zonas de inibição nos dois
métodos utilizados. As figuras 3 e 4 representam os métodos descritos acima.
Figura 3: Método sobrecamada.
Fonte: Os autores, 2016.
27
Figura 4: Método de difusão em poços.
Fonte: Os autores, 2016.
4.6.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista
Utilizando-se a técnica de difusão em poços descrita no item anterior, a
influência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista foi
verificada: 20 µL dos extratos bruto e de suas diluições seriadas em base 2 (até
1:128) em água destilada esterilizada foram inoculados nos poços de duas placas
contendo ágar nutritivo: a primeira contendo 0,2 cm de espessura de meio, e a
segunda contendo 0,5 cm. Ambas foram incubadas a 37°C por 24 horas, e as zonas
de inibição comparadas.
4.6.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância
antagonista
Com a finalidade de se saber em quanto tempo as bactérias testadas
atingiam seu ponto máximo de produção das substâncias antagonistas analisadas,
foram preparados três inóculos de cada bactéria produtora. Os mesmos foram
incubados a 37°C, e procedeu-se extração de cada um deles com sulfato de amônio
50% após tempos diferentes de incubação: 24 horas, 48 horas e 72 horas. No final
do último dia, os extratos tiveram sua atividade testada frente à Aeromonas
hydrophila através da técnica de difusão em poços. O tamanho das zonas de
inibição produzidas foi avaliado em uma mesma placa de Petri, sabendo-se assim
qual era o tempo necessário de incubação para que se tivesse uma melhor
produção da substância antagonista.
28
4.7. Caracterização da substância antagonista dos extratos
Os extratos obtidos foram testados quanto à sua estabilidade frente ao
tratamento térmico, variações de pH, enzima proteolítica, solvente orgânico, e
surfactantes com o objetivo de parcialmente caracterizar a substância
antimicrobiana, estimando sua natureza química.
4.7.1 Estabilidade ao tratamento térmico
Alíquotas dos extratos foram incubadas por 15 minutos, 30 minutos, 1 hora,
1 hora e meia, 2 horas, 24 horas, 48 horas, 8 dias, 15 dias e 22 dias, nas
temperaturas de -4°C, 0°C, 25°C e 37°C. Utilizando-se a técnica de difusão em
poços, 20 µL dos extratos bruto e de suas diluições seriadas em base 2 (até 1:128)
em água destilada esterilizada, foram colocados em cada um dos poços, e a placa
foi incubada por 24 horas, à 37°C, para que a permanência ou ausência das zonas
de inibição pudessem ser observadas, e a estabilidade dos extratos ao tratamento
térmico ao longo do tempo pudesse ser analisada.
4.7.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH
Em 11 tubos de ensaio esterilizados, foram colocados 5 mL de tampão
Britton Robinson e em seguida os pH’s foram acertados de 2 a 12 com o auxilio de
NaOH 1M (laboratório Nuclear) e HCl 5N (laboratório Gehaka), de modo que cada
tubo possuísse um pH diferente. Em seguida, foram passados 70 µL do conteúdo de
cada tubo para diferentes tubos de microcentrífuga e foram adicionados 70 µL do
extrato em cada um deles. Os tubos de microcentrífuga foram incubados a 4°C.
Após os tempos de 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, uma hora e meia e 24 horas, a
atividade dos extratos brutos foram testadas pelo método de difusão em poços,
frente à reveladora Aeromonas hydrophila. Após 24 horas de incubação a 37°C,
verificou-se a presença ou ausência de zonas de inibição, que indicaram a
estabilidade dos extratos aos diferentes pH’s. A cada teste, foi utilizado um controle
negativo (extrato diluído em água esterilizada 1:1) para comparação da atividade do
extrato. A figura 5 ilustra o processo.
29
Figura 5: Teste de estabilidade a diferentes pH’s.
Fonte: Os autores, 2016.
4.7.3. Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos
O efeito dos solventes orgânicos foi analisado segundo método adaptado de
APOlÔNIO (2007). Foram preparadas soluções a 10% e a 50% de metanol, hexano
(laboratório Vetec) e acetonitrila (laboratório Panreac). Em seguida, as soluções
foram transferidas para tubos de microcentrífuga e o extrato foi acrescentado, na
proporção 1:1. Os tubos de microcentrífuga foram então incubados a 4°C e a
atividade antagonista do extrato bruto, foi testada frente Aeromonas hydrophila pelo
método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução solvente-extrato
bruto em cada um dos poços, após 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 1 hora e meia de
incubação. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Como forma de
comparação dos resultados, também foi feito um controle positivo, extrato diluído em
água esterilizada na proporção 1:1, e controles negativos, solventes diluídos em
água esterilizada na proporção de 1:1.
30
4.7.4. Influência de Surfactantes na atividade antagonista
Conforme descrito por Elayaraja (2014) foram preparadas soluções a 1% de
uréia (laboratório Promega), SDS (laboratório Promega) e tween 80 (laboratório
Promega). Em diferentes tubos de microcentrífuga, foram feitas diluições dos
surfactantes com o extrato, em uma proporção de 1:1. Os mesmos foram incubados
a 37°C, e testados, frente à Aeromonas hydrophila, após 30 minutos e uma hora
pelo método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução surfactante-
extrato, em cada um dos poços. As placas então foram incubadas por 24 horas, a
37°C, e a presença ou ausência de zonas de inibição indicava a influência dos
surfactantes na atividade antagonista dos extratos. Foi feito um controle positivo,
extrato diluído em água esterilizada na proporção 1:1 e controles negativos,
surfactantes diluídos em água esterilizada na proporção de 1:1.
4.7.5 Suscetibilidade à enzima proteolítica
Para o teste de suscetibilidade a ação de enzima proteolítica, utilizou-se um
tubo de microcentrífuga para que o extrato fosse diluído na proporção de 1:1 em
uma solução de proteinase K (laboratório Promega) 1mg/mL. Em seguida, o tubo de
microcentrífuga foi incubado a 37°C e a atividade antagonista da solução extrato-
proteinase K frente à Aeromonas hydrophila foi testada após 15 minutos, 30
minutos, uma hora, e uma hora e meia. A suscetibilidade á proteinase K foi então
testada pelo método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução extrato-
proteína K, em cada um dos poços. As placas foram então incubadas por 24 horas a
37°C, e a presença ou ausência de zonas de inibição, indicava a ação da enzima
proteolítica na atividade antagonista dos extratos. Foi feito um controle positivo,
extrato diluído em água esterilizada na proporção 1:1, e um controle negativo,
proteinase K diluída em água esterilizada na proporção de 1:1 (APOLÔNIO, 2007).
4.8 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford
Para a dosagem das proteínas dos extratos, foi utilizado o método de
Bradford (1976), que consiste em um método colorimétrico no qual o corante
(Cromassie Blue G-250) se liga as proteínas do extrato, permitindo sua
quantificação. Para a realização do experimento, foi utilizada uma placa de 96
poços. Na primeira coluna, foi preparado o branco da reação, onde foi pipetada água
e o Reagente de Bradford. O padrão da reação foi preparado utilizando-se uma
31
solução estoque de Bovine Serum Albumin (BSA) 1mg/mL (laboratório Promega), de
forma que os poços da segunda coluna continham o padrão, em duplicata, nas
seguintes concentrações: 0,25mg/mL; 0,50mg/mL; 0,75mg/mL e 1,00 mg/mL. Na
terceira coluna, foi colocado o extrato bruto e suas diluições seriadas na base 2 para
reagir com o Reagente de Bradford. Os reagentes foram pipetados para a placa na
seguinte ordem: água, extrato, BSA e reagente de Bradford. A placa foi então
deixada em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente, e a leitura foi feita
utilizando espectofotômetro, no comprimento de onda de 596 nm. A figura 6
representa o processo.
Figura 6: Processo para dosagem de Proteínas pelo método de Bradford.
Fonte: Os autores, 2016. *Todos os valores correspondem à unidade µL.
4.9. Determinação da Concentração Inibitória Mínima
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) consiste na menor concentração de
uma droga, capaz de inibir o crescimento de um microrganismo, após incubação por
32
24 horas. Este teste foi realizado com o intuito de comparar a capacidade dos
extratos em inibir o crescimento da reveladora Aeromonas hydrophila, com a de um
antimicrobiano (Ampicilina 1mg/mL). Para isso, foi utilizada a técnica de
microdiluição em poços, tendo o Mueller Hinton como meio de cultura, como é
mostrado pela figura 7. Em seguida, a placa foi incubada a 37°C, por 24 horas. No
dia seguinte a leitura foi feita analisando-se qual a menor concentração de extrato
capaz de inibir o crescimento da bactéria reveladora.
Figura 7: Microdiluição em poços.
Fonte: Os autores, 2016. Os volumes correspondem à µL.
33
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas
No presente trabalho foram avaliadas 201 amostras bacterianas isoladas de
sistemas de aquicultura, frente a seis espécies bacterianas reveladoras e em três
meios de cultura diferentes, totalizando 3618 testes, dos quais 312 foram positivos
para a inibição do crescimento das reveladoras. A imagem 3 ilustra os halos de
inibição de crescimento obtidos pelo método da sobrecamada.
Imagem 3: Halos produzidos ao redor das bactérias produtoras.
Fonte: Os autores, 2015.
Todas as espécies bacterianas utilizadas como reveladoras foram inibidas,
em algum momento, pelas amostras produtoras avaliadas. A reveladora inibida por
um maior número de amostras produtoras foi a espécie Staphylococcus aureus,
sendo responsável por 28,81% dos resultados positivos obtidos. Por outro lado,
Aeromonas hydrophila foi a espécie que se mostrou mais resistente, ou seja, que
teve seu crescimento inibido por um menor número de bactérias produtoras,
totalizando 2,72% dos resultados positivos.
O gráfico1 mostra a atividade antagonista das amostras produtoras frente às
amostras reveladoras e expressa em porcentagem, os resultados positivos (número
de halos de inibição encontrados para cada uma das reveladoras).
34
Gráfico1: Porcentagem da atividade antagonista frente às reveladoras testadas.
Fonte: Os autores, 2015.
5.2 Avaliação da influência do meio de cultivo
A partir dos testes realizados, observou-se que o aparecimento de halos de
inibição ocorreu com mais freqüência quando as bactérias produtoras eram
replicadas em meio BHI, seguido do meio Mueller Hinton. O gráfico 2 faz uma
comparação entre o número de halos de inibição encontrados em cada um dos
meios testados.
Gráfico 2: Porcentagem do número de halos produzidos, por meio de cultura.
Fonte: Os autores, 2015.
0 5 10 15 20 25 30 35
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Pseudomonas aeruginosa
Edwardsiella tarda
Salmonella tiphy
Aeromonas hydrophila
%
BHI45%
Ágar Mueller Hinton
29%
Ágar Nutritivo26%
0%
35
No final da avaliação inicial, foram selecionadas as duas amostras
produtoras que apresentaram halos de inibição para um maior número de
reveladoras, estando incluída a espécie Aeromonas hydrophila. Esta última, além da
grande importância para a aquicultura, mostrou se como a espécie testada mais
resistente, e a descoberta de uma substância antagonista para esta espécie seria
interessante. As amostras selecionadas, isoladas de intestino de tilápias, estão
representadas no quadro 1.
Quadro 1: Bactérias produtoras com os melhores resultados frente às
reveladoras. Produtora Característica Espécie
C2I12 Bacilo Gram + Não identificada C2I13 Bacilo Gram + Não identificada
Fonte: Os autores, 2015.
5.3 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância
antagonista detectada
5.3.1 Interferência do clorofórmio
Esse teste foi realizado com a finalidade de se analisar a interferência do
vapor de clorofórmio na atividade antagonista encontrada. Assim, foi possível
observar que o aparecimento dos halos de inibição não ocorreu devido à retenção
de clorofórmio pelas bactérias produtoras, uma vez que o antagonismo também
ocorreu nas placas reveladas sem o uso do solvente. Dessa forma, pode-se dizer
que alguma substância produzida durante o crescimento bacteriano é a responsável
por inibir o crescimento das bactérias reveladoras.
5.3.2. Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa
Foi necessário determinar se as substâncias produzidas pelas bactérias
escolhidas eram ou não um ácido graxo de cadeia longa, uma vez que a presença
do mesmo poderia ser a causa do aparecimento dos halos de inibição. Dessa forma
foi possível observar que a substância pesquisada não era um ácido graxo de
cadeia longa, uma vez que houve a permanência dos halos de inibição na placa
contendo 1% de amido, para ambas as bactérias.
36
5.3.3.Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos
O teste do antagonismo por bacteriófagos realizado para as produtoras C2I12
e C2I13 frente à reveladora Aeromonas hydrophila mostrou que a produção de halos
de inibição não se deve à presença de bacteriófagos, uma vez que após as placas
serem incubadas, não houve o aparecimento de zonas líticas, como indica a imagem
4.
Imagem 4: Ausência de zona lítica, após teste de bacteriófago.
Fonte: Os autores, 2015.
5.4 Avaliação da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13
5.4. Difusão em poços X Sobrecamada
Os resultados abaixo indicam que para as duas produtoras escolhidas, o
método de difusão em poços se mostrou mais eficiente na exibição da ação
antagonista.
Quadro 2: Diferença de expressão da atividade antagonista entre os métodos de difusão em poços e sobrecamada para os extratos de C2I12 e C2I13
C2I12 Difusão
em poços Sobrecamada C2I13
Difusão
em poços Sobrecamada
Bruto + + Bruto + -
1:1 + + 1:1 + -
1:2 + + 1:2 + -
1:4 + - 1:4 + -
1:8 + - 1:8 + -
1:16 - - 1:16 + -
1:32 - - 1:32 - -
1:64 - - 1:64 - -
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (presença de atividade antagonista); - (ausência de atividade antagonista)
37
5.4.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista Os resultados observados na avaliação da influência da espessura do meio
de cultura na atividade antagonista estão expressos no quadro 3. A imagem 5
demonstra os resultados encontrados.
Quadro 3: Interferência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13.
C2I12 0,2 cm
de meio
0,5 cm
de meio C2I13
0,2 cm
de meio
0,5 cm
de meio
Bruto + - Bruto + -
1:1 + - 1:1 + -
1:2 + - 1:2 + -
1:4 +* - 1:4 + -
1:8 - - 1:8 - -
1:16 - - 1:16 - -
1:32 - - 1:32 - -
1:64 - - 1:64 - -
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista) +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).
Imagem 5: Expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 na placa com 0,2 cm de meio e 0,5 cm de meio, respectivamente
Fonte: Os autores, 2016
5.4.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância antagonista
Os resultados observados na avaliação da interferência do tempo de
incubação na produção da substância antagonista estão expressos no quadro 4.
38
Quadro 4: Diferença de tamanho das zonas de inibição dos extratos de C2I12 e C2I13 produzidos após incubação a 37°C por 24 horas, 48 horas e 72 horas.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista) +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).
5.5 Manutenção da atividade antagonista dos extratos
5.5.1. Estabilidade ao tratamento térmico
O estudo de estabilidade foi realizado durante 22 dias para ambos os
extratos, para as temperaturas de -4°C (temperatura de congelamento dos extratos),
4°C, 25°C (temperatura ambiente) e 37°C. Os resultados apresentados nos quadros
8 e 9, mostram que ambos os extratos se mantém ativos (extrato bruto) por pelo
menos 22 dias, nas temperaturas de congelamento, 4°C e ambiente. Os quadros 5 e
6 indicam os resultados e a imagem 6 ilustra o teste de estabilidade térmica dos
extratos.
39
Quadro 5:Estabilidade do extrato de C2I12 ao tratamento térmico.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista) +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).
40
Quadro 6: Estabilidade do extrato de C2I13 ao tratamento térmico.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista) +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).
41
Imagem 6: Estudo de estabilidade de 15 dias, nas temperaturas de -4°C, 4°C, 25°C e 37°C, para os extratos de C2I12 e C2I13, respectivamente.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: da direita para esquerda, Bruto; 1:1; 1:2; 1:4; 1:8. De baixo para cima, -4°C; 4°C, 25°C, 37°C.
5.5.2. Estabilidade dos extratos frente a variações de pH
Os resultados encontrados mostram que o extrato de C2I12 é mais
estável aos diferentes pH’s, quando comparado com o extrato de C2I13. O
extrato de C2I12 mostrou-se estável por pelo menos uma hora e meia, quando
exposto à todas as faixas de pH testadas.
O extrato de C2I13 apresentou-se pouco estável à exposição à diferentes
pH’s, o que é evidenciado pela perda de atividade antagonista nos primeiros 30
minutos, mostrando-se estável em pH’s próximos de 5. Embora algumas faixas
de pH tenham apresentado atividade antagonista residual, pode-se considerar
que em 24 horas de exposição, o mesmo não possui atividade antagonista
significativa. Os resultados estão representados no quadro 7 e as imagens 7, 8
e 9 ilustram os resultados.
42
Quadro 7: Estabilidade do extrato de C2I12 e C2I13 a diferentes pH’s ao longo do tempo.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista); +* (atividade antagonista fraca); +** (atividade antagonista muito fraca) - (ausência de atividade antagonista).
Imagem 7: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente.
Fonte: Os autores, 2016.
43
Imagem 8: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I13, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente.
Fonte: Os autores, 2016.
Imagem 9: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12 e C2I13 , após 24 horas; e controles positivo e negativo, respectivamente.
Fonte: Os autores, 2016.
44
5.5.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos
Após a realização dos testes, foi possível observar que o extrato de C2I12 é
capaz de se manter ativo por pelo menos uma hora e meia, quando em contato com
hexano a 50%. Já para o extrato de C2I13, nenhum dos solventes orgânicos
utilizados mostrou-se adequado para ser utilizado como carreador da substância
antagonista, uma vez que para todos eles pode-se observar uma redução da
atividade antagonista ao longo do tempo de exposição. Em todos os testes foram
utilizados controles positivos, para que a atividade antagonista pudesse ser
comparada, e controles negativos, o que possibilitou perceber que a atividade
antagonista não era desencadeada pelos solventes orgânicos. Os resultados estão
expressos no quadro 8, e ilustrados pela imagem 10.
Quadro 8: Efeito de diferentes solventes orgânicos na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista); +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).
45
Imagem 10: Teste do solvente para C2I12 e C2I13, respectivamente, após tratamento com Hexano, Metanol e Acetonitrila nas concentrações de 10% e 50%, após 15
minutos, 30 minutos e uma hora de exposição.
Fonte: Os autores, 2016.
5.5.4. Influência de Surfactantes na atividade antagonista
Os controles positivos foram utilizados a fim de comparação entre a
atividade antagonista do extrato com e sem o tratamento com os surfactantes
utilizados. Além disso, controles negativos compostos pelos próprios surfactantes
foram utilizados com a finalidade de se perceber se os mesmos poderiam estar
interferindo na apresentação da atividade antagonista, e os resultados mostraram
que os mesmos são inertes. O quadro 9 ilustra os resultados.
Quadro 9: Influência dos surfactantes na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.
Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (presença de atividade antagonista); +** (atividade antagonista muito fraca) - (ausência de atividade antagonista)
46
5.5.5. Susceptibilidade a enzima proteolítica
Após o tratamento dos extratos com a solução de proteinase K 1mg/mL,
pode-se observar (quadro 10) uma redução do tamanho das zonas de inibição em
ambos os extratos, quando comparadas com o controle positivo.
Quadro 10: Interferência da proteinase K na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.
Fonte: Os autores, 2016.
5.6 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford
Após calcular a absorbância do padrão, cujas concentrações eram
conhecidas, foi possível a construção de uma curva padrão de BSA e,
consequentemente, a determinação de uma equação da reta, a partir da qual era
possível se estabelecer a concentração de proteínas de cada um dos extratos
brutos. A curva padrão é mostrada pelo gráfico 3, e as concentrações de proteínas
em cada extrato estão indicadas no quadro 11.
47
Gráfico 3: Curva absorbância X Concentração do padrão de BSA.
Fonte: Os autores, 2016.
Quadro 11: Concentração de proteínas no extrato bruto de C2I12 e C2I13, pelo método de Bradford (1976).
Extrato Concentração (mg/mL)
C2I12 1,87
C2I13 3,21
Fonte: Os autores, 2016.
5.7 Determinação da concentração inibitória Mínima (MIC):
Após a realização do teste, observou-se que o controle positivo (ampicilina)
foi capaz de inibir o crescimento microbiano até quando em uma concentração de
0,0833 mg/mL. Os controles negativos não apresentaram crescimento perceptível. O
quadro 19 indica os resultados de CIM encontrados, e o tipo de atividade
antibacteriana encontrada.
Quadro 12: Concentração Inibitória Mínima e atividade antibacteriana dos extratos de C2I12 e C2I13 e controle.
CIM (mg/mL) Efeito
C2I12 ≤ 0,1558 Bacteriostático
C2I13 ≤ 0,2675 Bacteriostático
Ampicilina ≤ 0,0833 Bactericida
Fonte: Os autores, 2016.
48
4 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos indicaram que a maior parte dos halos de inibição
foram encontrados para a espécie Staphylococcus aureus. Este é um dado
importante quando se pensa que atualmente tem-se observado a propagação do
Staphylococcus aureus resistente à meticilina para o mundo todo, e que este fato
tem se tornado um problema de saúde publica mundial devido aos escassos
recursos para o tratamento das infecções causadas por esse tipo de microrganismo
(LUNA et al 2010).
Os resultados encontrados também indicaram substâncias capazes de inibir
o crescimento de Enterococcus faecalis, espécie frequentemente apontada como
causadora de doenças nos peixes, assim como indica o estudo realizado por
Khafagy et al (2009), que mostrou que 31% das infecções encontradas na espécie
Tilapia zilli eram causadas por Enterococcus faecalis.
Outra espécie que chama a atenção dos aquicultores é Pseudomonas
aeruginosa, uma vez que, segundo Thomas et al (2014), perdas econômicas
consideráveis estão sendo causadas no cultivo, por exemplo, de peixes da espécie
Oreochromis mossambicus devido a infecções causadas por Pseudomonas
aeruginosa. Os resultados do nosso estudo apontaram que 17,93% das bactérias
foram capazes de inibir também o crescimento desse microrganismo.
Outras espécies de importância em aquicultura e para a saúde humana,
como Edwardsiella tarda; Aeromonas hydrophila e Salmonella tiphy também foram
testadas e apresentaram resultados consideráveis.
Há muito tempo vários estudos vem indicando a espécie Aeromonas
hydrophila como causadora da morte de inúmeros peixes em aqüicultura, como
mostrado por SHOTTS (1972). Já em 1984, Cipriano et al indicava esta espécie
como sendo a mais comum em habitat de água doce, além se ser a responsável por
causar doenças graves em peixes selvagens. Ainda nos dias de hoje, Aeromonas
hydrophila é citada como sendo capaz de causar septicemias extremamente
virulentas em peixes (PLUMB, 2010). Além disso, espécies de Aeromonas
hydrophila isoladas de peixes já se mostraram resistentes a antimicrobianos
potentes como Meticilina, Rifamicina, Bacitracina e Novobiocina, sendo
49
consideradas espécies de alto risco (VIVEKANANDHAN, 2002). Estudos realizados
por RESENDE (2011) confirmaram a presença de bactérias resistentes à
antimicrobianos no ambiente aquático. Dessa forma, o presente estudo mostrou que
algumas bactérias, como C2I12 e C2I13 isoladas de aquicultura, além de serem
capazes de inibir as outras espécies-problema já citadas, também eram capazes de
inibir Aeromonas hydrophila. Diante do exposto, este foi um fator predeterminante
para a escolha destas amostras para a realização dos estudos de fatores de
interferência, extração e caracterização parcial das substâncias antagonistas.
Os enormes prejuízos que as infecções vêm causando em sistemas de
cultivo de peixes, tem aumentado o emprego de antimicrobianos. Com isso, o
aumento de microganismos resistentes tem incentivado a busca por alternativas, de
forma que novos tratamentos sejam propostos. Nesse sentido, tem-se aumentado a
busca pelas bacteriocinas (CAVALCANTE et al 2012). O presente estudo indicou a
presença de substâncias antagonistas para Aeromonas hydrophila em ambos os
extratos testados. A atividade das substâncias antagonistas encontradas é
independente à presença de fagos, ácidos ou devido ao clorofórmio. Além de
possuírem boa estabilidade térmica e a variações de pH, são parcialmente sensíveis
a ação de proteinase K, o que demonstra elevada possibilidade de se tratar de
substâncias tipo bacteriocina.
A avaliação da atividade da substância antagonista pode ser influenciada
pelo método utilizado. A atividade da substância antagonista produzida por ambas
as amostras testadas é melhor visualizada quando a técnica de difusão em poços é
utilizada, embora para o extrato de C2I12 seja possível observar atividade, ainda que
menor, também no método da sobrecamada. Estudos realizados por ALVES et al
(2008) para avaliar a atividade antimicrobiana de extratos da planta Miconia
rubiginosa (Melastomataceae) frente à seis cepas de bactérias, demonstraram
resultados semelhantes, e acredita-se que o motivo seja a maior possibilidade de
contato entre as substâncias antagonistas presentes no extrato e os microrganismos
testados. Essa dificuldade de difusão dos extratos pelo meio de cultura pode estar
relacionada à hidrossolubilidade e à massa molecular das substâncias antagonistas
analisadas (ALVES et al 2008)
50
Assim, com base nos resultados apresentados, podemos comparar as duas
substâncias antagonistas produzidas, chegando a duas hipóteses: uma vez que os
meios de cultura utilizados eram de base aquosa, pode-se inferir que provavelmente
C2I12 possui uma característica de hidrofilicidade maior que C2I13, ou que possui
massa molecular menor que esta última, uma vez que a substância antagonista
produzida por C2I12 foi capaz de inibir o crescimento da cepa reveladora em ambos
os métodos testados.
Além do método utilizado na avaliação da atividade antagonista, também foi
possível observar que a espessura do meio de cultura era capaz de interferir na
expressão da atividade antagonista dos extratos, uma vez que ele pode interferir na
permeabilidade dos extratos em questão. Os meios de cultura de 0,2 cm de
espessura possibilitavam a visualização de zonas de inibição até diluições de 1:4 do
extrato em água esterilizada para ambos os extratos, e que quando a espessura do
meio era aumentada para 0,5 cm, já não era possível observar o aparecimento de
zonas de inibição. Dessa forma, os meios de cultura utilizados para os testes
seguintes, possuíram espessura de 0,2 cm. OSTROSKY et al (2008) possui teoria
semelhante ao demonstrado pelo presente estudo, ao considerar que o volume de
meio de cultura transferido para a placa de petri interfere na produção dos halos de
inibição, e que uma solução para aumentá-los, seria exatamente a diminuição da
espessura do meio.
Muitos são os fatores que podem interferir na produção das bacteriocinas.
Além do meio de cultivo, outro fator importante é o tempo de incubação, que deve
ser determinado empiricamente (BONINI, 2005; ZORZI, 2010). Assim, objetivando-
se determinar qual o melhor tempo de incubação para a produção das substâncias
antagonistas de C2I12 e C2I13, foi realizado um último teste antes se iniciar a
caracterização propriamente dita dos extratos. Para as duas amostras teste o melhor
tempo de incubação é 48 horas, sendo o extrato de C2I12 ativo até a diluição 1:64 e o
de C2I13 até 1:32. Estudos realizados por BAGI (1992) onde foram analisadas as
melhores condições para produção de bacteriocinas pelos gêneros Erwinia,
Pseudomonas e Xanthomonas, evidenciaram que tempos maiores de incubação
tendem a possibilitar uma melhor produção de bacteriocinas.
51
O interesse na aplicação de bacteriocinas na indústria vem aumentando
devido à sua capacidade de bioconservação de alimentos. O potencial de uma
bacteriocina para este tipo de aplicação depende, entre outros fatores, de suas
características de estabilidade ao tratamento térmico e às variações de pH
(SCHULZ, 2003; BENITEZ, 2010). Estudos realizados utilizando extratos brutos de
bacteriocinas produzidas por Lactobacillus plantarum na conservação dos peixes
tirapitinga e tambaqui provenientes da aqüicultura, demonstraram melhores
indicadores físico-quimicos e sensoriais dos mesmos (MAHECHA, 2008).
Ambos os extratos obtidos a partir de nossas amostras produtoras tiveram
sua atividade parcialmente diminuída quando expostos à temperatura de 60°C por
15 minutos, semelhante ao encontrado por MARTINS (2003) para bacteriocina
produzida por Leuconostoc mesenteroides, isolada de peito de frango, que teve sua
atividade diminuída pela metade quando tratada a 60°C por 10 minutos. As outras
temperaturas testadas neste trabalho mostraram-se estáveis por pelo menos 22
dias, havendo pequenas perdas de atividade ao longo do tempo. Uma exceção foi
observada quando os extratos foram tratados com temperatura de 37°C, na qual
ambos os extratos perderam atividade após 15 dias. Foi possível perceber que o
extrato de C2I13 é mais estável às variações de temperatura do que o extrato de
C2I12, uma vez que após 15 dias exposto às condições de temperatura citadas, o
mesmo ainda se mostrou capaz de inibir o crescimento da bactéria reveladora até
diluições 1:2 em água esterilizada para todas as temperaturas testadas, diferente de
C2I12, que com 48 horas já demonstrava atividade antagonista diminuída para as
temperaturas de 4°C e 37°C. Algumas classes de bacteriocinas são consideradas
termoestáveis (SCHULZ, 2003; NASCIMENTO, 2008). Muitos autores já vêm
demonstrando que muitas delas são capazes de resistir a elevadas temperaturas,
como mostrado por LIMA (2002), onde bacteriocinas produzidas por Zymomonas
mobilis se mostraram estáveis por até 15 minutos quando expostas à temperaturas
de 80°C. Estudos relatados por LOUREIRO (2015) mostraram que a bacteriocina
ST44AM permaneceu estável mesmo após ser submetida a temperaturas de 25, 30,
45, 60 e 100°C, durante 120 minutos. Assim como nos testes anteriores, alguns
interferentes podem ser citados, como, por exemplo, a espessura do meio de
cultura, a quantidade de reveladora utilizada, o método utilizado e até mesmo a
acuidade visual dos operadores que fizeram as leituras (presença ou ausência de
52
zonas de inibição), o que justifica o fato de resultados negativos serem, em alguns
casos, seguidos de resultados positivos, para o mesmo extrato, na mesma
temperatura, em dias diferentes.
O presente estudo também demonstrou que as substâncias antagonistas
detectadas possuíam grande estabilidade quando expostas a variações de pH. Após
serem expostas a valores de pH entre 2 e 12, pode-se observar que C2I12
demonstrou resultados melhores para um possível uso em alimentos, uma vez que
foi estável a praticamente todos os valores de pH analisados, por 24 horas,
demonstrando perda quase insignificante de atividade. Já C2I13, mostrou-se mais
susceptível aos efeitos gerados pelas variações no pH, ficando mais estável em uma
faixa entre 4 e 6. BRONBERG et al (2006), apresentou resultado semelhante ao
encontrado nesse estudo para C2I12 ao demonstrar que uma bacteriocina isolada de
Lactococcus lactis ssp. hordniae CTC 484 apresentou-se estável numa faixa de pH
entre 2 e 10. Em outro estudo realizado por LISBOA (2006), uma bacteriocina
produzida por uma espécie de Bacillus, mostrou-se estável quando em pH ácido ou
alcalino, semelhante ao que foi demonstrado neste estudo para a substância
antagonista produzida por C2I13. MARTINS (2003) mostrou resultado semelhante ao
analisar a estabilidade a variações de pH de seis bacteriocinas produzidas por
bactérias láticas, demonstrando que todas foram estáveis a pH 4, e que a
bacteriocina produzida pelo Lactobacillus sake 1, foi capaz de se manter estável por
uma faixa de pH de 2-10, após 24 horas à 10°C.
Neste trabalho, foram utilizados solventes orgânicos comuns em técnicas de
separação, como HPLC (High Performance Liquid Chromatography) . O objetivo
deste teste era identificar, dentre os solventes e concentrações testadas, qual era o
melhor meio para que os extratos fossem carreados, de forma que no futuro, a
purificação possa ser feita, além de inferir se a substância antagonista possuía ou
não, partes lipídicas em sua estrutura. Os resultados apresentados mostraram que o
extrato de C2I12 permanece ativo por pelo menos uma hora e meia, quando em
contato com hexano a 50%, tendo este solvente apresentado os melhores
resultados. Embora os outros solventes também tenham apresentado um resultado
positivo, pode-se observar uma diminuição da atividade antagonista do extrato. Para
o extrato de C2I13, nenhum dos solventes orgânicos utilizados mostrou-se adequado
para ser utilizado como carreador da substância antagonista, uma vez que para
53
todos eles pode-se observar uma redução da atividade antagonista ao longo do
tempo de exposição. OLIVEIRA (2004), em estudo semelhante, mostrou que a
atividade antimicrobiana de um peptídeo isolado de Bacillus licheniformis P40, teve
sua atividade preservada quando em contato com solventes orgânicos após duas
horas de exposição, só tendo sua atividade afetada pelo butanol.
Os surfactantes são substâncias capazes de agir na interface entre duas
fases, tais como água e óleo, e são caracterizadas por possuírem uma região
hidrofílica (polar) e outra hidrofóbica (apolar) (DAVANÇO, 2007). O objetivo deste
experimento foi observar se as substâncias antagonistas eram estáveis à ação
dessas substâncias e, consequentemente, obter informações sobre a natureza
química da mesma. Os resultados apresentados mostraram que o extrato de C2I12
teve sua atividade antagonista reduzida quando tratada por pelo menos uma hora,
para todos os surfactantes utilizados. Já para o extrato de C2I13 apresentou perda
considerável quando tratado com uréia e tween 80, por uma hora, e quando tratado
com SDS, a atividade antagonista foi totalmente perdida logo nos primeiros 30
minutos de tratamento. Pode-se inferir que ambas as substâncias possuem em sua
estrutura, uma parte lipídica, que foi emulsificada pelos surfactantes, fazendo com
que as substâncias antagonistas perdessem, ou tivessem sua ação reduzida. Dessa
forma, os resultados apresentados estão de acordo com os encontrados por
Elayaraja et al (2014), onde bacteriocinas tiveram sua atividade reduzida, quando
tratadas com os mesmos surfactantes utilizados neste experimento.
Após o tratamento dos extratos com a solução de proteinase K 1mg/mL,
pode-se observar (quadros 16 e 17) uma redução do tamanho das zonas de inibição
em ambos os extratos, quando comparadas com o controle positivo. No extrato de
C2I12 houve uma redução de 50% da atividade inibitória após uma hora de exposição
enzima. Já para o extrato de C2I13, houve uma diminuição 66,7% na atividade
antagonista. Esse resultado pode ser comprovado pela estabilidade térmica
demonstrada por ambos os extratos, o que indica que a perda de atividade foi em
decorrência a ação enzimática, e não a exposição à temperatura de 37°C. Estudos
realizados por MARTINS (2003) mostraram que as substâncias antimicrobianas
produzidas por seis cepas de bactérias láticas, perderam totalmente atividade
quando tratadas com preteinase k 10mg/mL. Estudo semelhante realizado por
OLIVEIRA (2004), demonstrou que um peptídeo antimicrobiano produzido por
54
Bacillus licheniformis P40 quando tratado com proteinase k 2mg/mL teve sua
atividade praticamente toda preservada, e que quando o mesmo peptídeo era
tratado com a enzima em concentração de 10mg/mL, a atividade antimicrobiana era
inativada. Dessa forma, pode-se sugerir que os extratos de C2I12 e C2I13
provavelmente seriam totalmente inativados, caso fossem tratados com proteinase k
em uma maior concentração.
Pode-se calcular a concentração dos extratos brutos de C2I12 e C2I13 a partir
das absorbâncias encontradas para os mesmos, de forma que o extrato bruto de
C2I12 apresentou uma concentração de 1,87 mg/mL de proteínas e o extrato bruto de
C2I13 3,21 mg/mL. É importante ressaltar que as concentrações são referentes a
extratos produzidos nas condições de precipitação utilizadas (200 mL de caldo,
incubado por 24 horas a 35°C, ressuspendido em 2 mL de água destilada
esterilizada). Porém ainda são necessários mais estudos e o emprego de técnicas
de purificação para que a proteína responsável pela atividade antagonista possa ser
quantificada e melhor caracterizada.
O extrato de C2I12 mostrou-se capaz de inibir o crescimento de Aeromonas
hydrophila até valores menores ou iguais a 0,1558 mg/mL de extrato, não sendo
capaz de inibir o crescimento nas concentrações inferiores testadas. Já para o
extrato de C2I13, a menor concentração testada capaz de inibir o crescimento
microbiano foi de 0,2675 mg/ mL. Ambos os extratos demostraram atividade
bacteriostática. SCHOBITZ (2006) em estudo realizado com substâncias tipo
bacteriocina produzida por Carnobacterium piscicola, indicou resultado semelhante
ao do presente estudo, onde a mesma possuía efeito bacteriostárico sobre L.
monocytogenes.
55
5 CONCLUSÃO
Isolados bacterianos de sistemas de aquicultura produzem substancias
antagonista para algumas espécies de importância na aquicultura e em seres
humanos.
O estudo dos fatores de interferência indicaram que o efeito antagonista
observado não possuía relação com o uso do clorofórmio, com a produção de ácidos
e nem com a presença de bacteriófagos.
A espessura do meio de cultura é capaz de interferir no antagonismo dos
extratos.
A substância antagonista é produzida em maior quantidade quando o inóculo
é incubado por 48 horas e que o melhor método para avaliação do mesmo é a
difusão em poços.
Os extratos possuem boa estabilidade térmica, sendo o extrato de C2I13 mais
estável que o extrato de C2I12, sendo capaz de inibir o crescimento microbiano até
diluições 1:2 até 15 dias, incubado nas temperaturas testadas. Ambos os extratos
mostraram-se estáveis às variações de pH, sendo o extrato de C2I12 estável a uma
faixa de pH entre 2 a 12. Quando expostos a diferentes solventes orgânicos, o
extrato de C2I12 se mostrou estável à ação de hexano 50%, enquanto o extrato de
C2I13 não apresentou estabilidade significativa aos solventes orgânicos testados. Na
presença dos surfactantes testados, os extratos de C2I12 e C2I13 apresentaram
redução de suas atividades antimicrobianas. Ambos os extratos demonstraram
diminuição da atividade antagonista quando tratados com proteinase K 1mg/mL.
O extrato analisado de C2I12 possui 1,87 mg/mL de conteúdo protéico,
enquanto que extrato de C2I13, 3,21 mg/mL. A MIC de C2I12 para a reveladora
testada foi 0,1558 mg/mL, e para C2I13 0,2675 mg/mL. Ambos os extratos
demonstraram ação bacteriostática.
56
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O surgimento de linhagens bacterianas resistentes vem incentivando a
busca por alternativas ao uso dos antimicrobianos. O estudo das bacteriocinas vem
sendo muito estimulado, principalmente na área de alimentos. Estudos já indicam
seu uso em potencial na conservação de peixes, e como probióticos. Nosso estudo
mostra que bactérias isoladas de sistemas de aquicultura produzem substâncias
antagonistas, ativas principalmente Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis.
Além disso, os extratos das amostras selecionadas inibiram o crescimento de
Aeromonas hydrophila, sob diversas condições. Assim, as substâncias antagonistas
encontradas podem, no futuro, vir a contribuir para uma redução no número de
doenças infecciosas que acometem peixes provenientes da aquicultura, auxiliando
na diminuição das perdas econômicas geradas pela elevada mortalidade dos
animais alem de auxiliarem na redução de microrganismos resistentes,
considerando a necessidade de uma menor exposição aos antimicrobianos. Os
resultados encontrados neste trabalho vão ao encontro dos resultados encontrados
com diversos estudos relacionados à detecção e caracterização de bacteriocinas.
Assim é possível concluir que as substâncias antimicrobianas detectadas no
presente estudo possuem características normalmente encontradas em substâncias
antimicrobianas tipo bacteriocina, o que justifica que estudos complementares de
purificação e identificação sejam realizados.
57
REFERÊNCIAS
AGOSTINHO, L. M.. Própolis no desempenho produtivo de juvenis de pacucriados em tanque rede e arraçoados com baixa e altafrequência alimentar. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP, 2010. ALVES, E.G.; VINHOLIS, A.H.C.; CASEMIRO, L.A.; FURTADO, N.A.J.C; SILVA, M.L.A; CUNHA, H.R.; MARTINS, C.H.G. Estudo comparativo de técnicas de screening para avaliação da atividade antibacteriana de extratos brutos de espécies vegetais e de substâncias puras. Quimica Nova. v. 31, n. 5, p.1224-1229, Franca, 2008.
ALY, S. Probiotics and aquaculture. Cab Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources, [s.l.], v. 4, n. 074, p.1-16, 1 fev. 2009.
ANVISA. Mecanismos de resistência bacteriana aos antimicrobianos. 2016. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3/mecanismos.htm>. Acesso em: 26 jun. 2016.
APOLÔNIO, A.c.m. et al. Purification and partial characterization of a bacteriocin produced by Eikenella corrodens. J Appl Microbiol, [s.l.], v. 104, n. 2, p.1-12, 8 out. 2007. Wiley-Blackwell. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03565.x.
BALCAZAR, J et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology, [s.l.], v. 114, n. 3-4, p.173-186, 31 maio 2006. BALCIUNAS, Eduardo Marcos et al. Novel biotechnological applications of bacteriocins: A review. Food Control, [s.l.], v. 32, n. 1, p.134-142, jul. 2013.
BAQUERO, F.; MARTÍNEZ, J. L.; CANTÓN, R. 2008. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Current Opinion in Biotechnology, 19: 260-265. BARBOSA, Flávio Henrique Ferreira et al. Produção de substâncias envolvidas no fenômeno de antagonismo bacteriano.Revista de Biologia e CiÊncias da Terra, Sergipe, v. 11, n. 1, p.1-10, 2011.
BARROSO, Gilberto Fonseca; POERSCH, Luís Henrique da Silva; CAVALLI, Ronaldo Olivera. Sistemas de cultivos aqüícolas na zona costeira do Brasil: recursos,
tecnologias, aspectos ambientais e sócio-econômicos Organizadores Gilberto Fonseca Barroso Luís Henrique da Silva Poersch Ronaldo Olivera Cavalli Rio de Janeiro Museu Nacional 2007. 26. ed. Rio de Janeiro: Museu Nacional, p. 316, 2007 BALCIUNAS, Eduardo Marcos et al. Novel biotechnological applications of bacteriocins: A review. Food Control, [s.l.], v. 32, n. 1, p.134-142, jul. 2013. BENITEZ, Lisianne Brittes. Caracterização de peptídeos antimicrobianos de Bacillus amyloliquefaciens com atividade antibacteriana, antifúngica e amebicida. F. 170, tese (doutorado) – Microbiologia Agrícola, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegra, 2010.
BIAGI, C.M.R.;. DE AZEVEDO, J.L. Detecção de bacteriocinas produzidas por bactérias fitopatogênicas dos gêneros erwinia, pseudomonas e xanthomona. Scientia Agricola. V. 49, n. 1, p.1-8, 1992.
58
BONINI, Marcel. PRODUÇÃO E SENSIBILIDADE DE ISOLADOS DE Xanthomonas axonopodis PV. citri A BACTERIOCINAS. F.50, dissertação (mestrado) – Agronomia,
Universidade Federal Paulista, Botucatu, 2005.
BRADFORD, Mario M.. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, Geórgia, n. 72, p.248-254, 1976.
BRANDELLI,A. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from the Brazilian Atlantic forest. Internetional Microbiology, v. 9, p. 111-118, 2006. BROMBERG, R.; MORENO, I.; DELBONI, R.R; CINTRA, H.C. Características da bacteriocina produzida por lactococcus lactis ssp. hordniae CTC 484 e seu efeito sobre listeria monocytogenes em carne bovina. Tecnologia. Alimentar, v. 26, n. 1, p. 135-144, Campinas, 2006 CAVALCANTE, M. P. Investigação de substância tipo bacteriocinas em amostras não humanas e ambiental. Trabalho de Conclusão de Curso, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande Do Norte, 2012.
CIPRIANO, R.C. Aeromonas hydrophila and motile aeromonad septicemias of fish. US Fish & Wildlife Publications. Lincon, p.1-24,1984.
CYRINO, José Eurico Possebon et al. A piscicultura e o ambiente: o uso de alimentos ambientalmente corretos em piscicultura.Revista Brasileira de Zootecnia, Piracicaba, v.
39, p.68-87, 2010. DAVANÇO, T., TANADA-PALMU, P., GROSSO, C. Filmes compostos de gelatina, triacetina, ácido esteárico ou capróico: efeito do pH e da adição de surfactantes sobre a funcionalidade dos filmes. Tecnologia. Alimentar, Campinas, v. 27, n. 2, p. 408-416, Campinas 2007. DEFOIRDT, Tom; SORGELOOS, Patrick; BOSSIER, Peter. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion In Microbiology, [s.l.], v. 14, n. 3, p.251-258, jun. 2011. ELAYARAJA, Sivaramasamy et al. Production, purification and characterization of bacteriocin from Lactobacillus murinus AU06 and its broad antibacterial spectrum. Asian Pacific Journal Of Tropical Biomedicine, [s.l.], v. 4, p.305-311, maio 2014.
EMBRAPA. . Pesca e Aquicultura. Disponível em: <https://www.embrapa.br/tema-pesca-e-aquicultura/nota-tecnica>. Acesso em: 28 jun. 2016. FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. 2009.The State of World Fisheries and Aquaculture 2008. Fisheries and Aquaculture Department. Rome. FAO/WHO. Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food. Córdoba, Argentina: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organisation; 2001. p.1-34. FERREIRA, Alessandra Einsfeld. Estudo de bacteriocinas produzidas por espécies de enterococcus. 2005. 126 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biologia, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2005.
59
GARCÍA, Pilar et al. Food biopreservation: promising strategies using bacteriocins, bacteriophages and endolysins. Trends In Food Science & Technology, [s.l.], v. 21, n. 8,
p.373-382, ago. 2010
GATESOUPE, F.J..The use of probiotics in aquaculture. Rev. Elsevier.v.180; p. 147-165. Plouzané, França, 1999.
GILLOR, O.; ETZION, A.; RILEY, M.A. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics. 2008. Appl Microbiol Biotechnol. December ; 81(4): 591–606. GUIMARÃES, Denise Oliveira; MOMESSO, Luciano da Silva; PUPO, Mônica Tallarico. ANTIBIÓTICOS: IMPORTÂNCIA TERAPÊUTICA E PERSPECTIVAS PARA A DESCOBERTA E DESENVOLVIMENTO DE NOVOS AGENTES. Química Nova, Ribeirão Preto, v. 33, n. 3, p.667-679, 2010.
HAMADA S. and OOSHIMA T. Production and properties of bacteriocins (mutacins) from Streptococcus mutans. Archs. Oral Biol. v. 20, p. 641-8. 1975.
HEPPELL, J.; DAVIS, H. L..Application of DNV vaccine technologi to aquaculture. Rev. Elsevier. v.43; p.29-43. Ottawa, Canadá, 2000. HEUER, O. E.; KRUSE, H.; GRAVE, K.; COLLIGNON, P.; KARUNASAGAR, I.; ANGULO, F. J. 2009. Human health consequences of use of antimicrobial agents in aquaculture, Clinical Infectious Diseases, 49: 1248-1253. RESENDE, Juliana Alves. Bactérias de interesse clínico humano em sistemas de aquicultura: ocorrência, identificação, susceptibilidade a drogas e metais tóxicos e perfil plamidial. 2011. 153 f. Tese (Doutorado) - Curso de Farmácia, Microbiologia, Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2011. JUNIOR, A.G.; SANTOS; A.F.; AUER, C.G.. Perspectivas do uso do controle biológico contra doenças florestais. Rev. Floresta. v. 30; n. 12; p. 155-165. Colombo, 2000.
KHAFAGY, A.A.R et al. Isolation of Enterococcus faecalis from tilapia in lake temsah in
Ismailia governorate. SCVMJ, IVX(2), 2009. LIMA, Gláucia Manoella de Souza. Ocorrência de bacteriocinas e caracterização molecular de linhagens de zymomonas mobilis. 85 f, dissertação (mestrado) –
Microbiologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2002.
LISBOA, M.P.; BONATTO, D.; BIZANI,D. HENRIQUES, J.A.P.; LISTERIA MONOCYTOGENES ON VACUUM PACKAGED SALMON LONGHI, E.; GIORDANO, L.G.P.; MULLER, E.E.. Avaliação da eficácia de vacina autóctone de Streptococcusagalactiae inativado aplicada por banho de imersão em tilápia do Nino (Oreochromisniloticus). Seminário de Ciências Agrárias. v. 33; supl.2; p. 3191-3200. Londrina, 2012.
LONGHI, Elaine; PRETTO-GIORDANO, Lucienne Garcia; MÜLLER, Ernst Eckehardt. Avaliação da eficácia de vacina autóctone de Streptococcus agalactiae inativado aplicada por banho de imersão em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 33, n. 6, p.1-10, 2012. LOUREIRO, Daniela Sofia Pinto . Estudos da bacteriocina produzida por Lactobacillus plantarum B391 para potencial utilização na Indústria. F. 73, dissertação (mestrado) – Gestão da Qualidade e Segurança alimentar, Instituto Politécnico de Yiana do Castelo, [S.I], 2015.
60
LUNA, Carlos M et al . Tratamento de Staphylococcus aureus resistente à meticilina na América Latina. Braz J InfectDis, Salvador , v. 14, supl. 2, p. 119-127, Dec. 2010.
MAHECHA, Hector Suarez. Utilização de bacteriocinas produzidas por lactobacillus plantarum lpbm10 na qualidade e vida útil de filetes do hibrido DE PIRAPITINGA (Piaractus brachypomus) x TAMBAQUI (Colosoma macropomum), embalados a vácuo sob
resfriamento. F.107, tese (doutorado) – Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2008. MARTINS, E.C. P.; SANTAROSA, P. R.; FREITAS, F.Z. Caracterização preliminar de bacteriocinas produzidas por seis cepas de bactérias láticas isoladas de produtos cárneos embalados a vácuo. Tecnologia de Alimentos. V.23, n. 2, p.195-199, Campinas, 2003. MEIRELES, Marlise Aparecida de Oliveira Martins. Uso de antimicrobianos e resistência bacteriana: Aspéctos socioeconômicos e comportamentais e seu impacto clínico e ecológico. Monografia (Especialização em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG,2008.
MOTA, Rinaldo Aparecido et al. Utilização indiscriminada de antimicrobianos e sua contribuição a multirresitência bacteriana.Brazilian Journal Of Veterinary Research And Animal Science, São Paulo, v. 42, n. 6, p.465-470, 2005.
NAKAMURA T., SUGINAKA Y., OBATA T., OBATA N., YAMAZAKI N. Bacteriocin-like activities of human dental plaque flora against oral anaerobic microorganisms. Bull. Tokyo dent. Coll., v. 18, p. 217-229. 1977. NASCIMENTO, M.S. Bacteriocinas em alimentos: uma revisão. Braz. J. Food Technol. v. 11, n. 2, p. 120-127, Jardim Chapadão. 2008. NOVARETTI, Marcia Cristina Zago; AQUINO, Simone; PISCOPO, Marcos Roberto. CONTROLE DE VENDAS DE ANTIBIÓTICOS NO BRASIL: ANÁLISE DO EFEITO DOS ATOS REGULATÓRIOS NO USO ABUSIVO PELOS CONSUMIDORES. Revista Acadêmica São Marcos, Alvorada, n. 2, p.25-39, 2014.
OGAKI, Mayara Baptistucci; FURLANETO, Márcia Cristina; MAIA, Luciana Furlaneto. Revisão: Aspectos gerais das bacteriocinas. Braz. J. Food Technol., [s.l.], v. 18, n. 4, p.267-276, dez. 2015.
OLIVEIRA, Florencia Cladera. Produção, caracterização, purificação parcial e aplicação de um peptídeo antimicrobiano produzido por Bacillus licheniformes P40. 2004. 134 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Engenharia de Alimentos, Univeridade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2004.
OSTROSKY, E.A.; MIZUMOTO, M.K.; LIMA, M.E.L.; KANEKO, T.M.; NISHIKAWA, S.O.; FREITAS, B.R. Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana e determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) de plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.18, n.2, p.301-307, 2008.
PEREIRA, Ana Leonor; PITA, João Rui. ALEXANDER FLEMING (1881-1955): Da descoberta da penicilina (1928) ao Prémio Nobel (1945). Revista da Faculdade de Letras, Coimbra, v. 6, n. 3, p.129-151, 2006.
PLUMB, J.A.; HANSON, L.A. Health Maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes. Wiley-Blackwell, v.3, p 312, 2010.
REEVES P. The bacteriocins. Bacteriol. Rev., v. 29, p. 24-45. 1965.
61
RESENDE, E.K.. Pesquisa em rede em aquicultura: bases tecnológicas para o desenvolvimento sustentável da aquicultura no Brasil. Rev. Brasileira de Zootecnia. v. 38;
p. 52-57. Corumbá, 2009.
RESENDE, Juliana Alves. Bactérias de interesse clínico humano em sistemas de aquicultura: ocorrência, identificação, susceptibilidade a drogas e metais tóxicos e perfil plamidial. 2011. 124 f. Tese (Doutorado) - Curso de Farmácia, Microbiologia,
Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, 2011.
RESENDE, Juliana et al. Antibiotic resistance in potentially bacteriocinogenic probiotic bacteria in aquaculture environments.Aquaculture Research, Juiz de For a, p.1-7, abr. 2016. RILEY M.A. and WERTZ J.E. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary perspectives. Biochimie, v. 84, p. 357-364. 2002b. RILEY M.A. and WERTZ J.E. Bacteriocins: evolution, ecology, and application. Annu. Rev. Microbiol., v. 56, p. 117-37. 2002a. ROSA, Cláudia Moreno; FRANCO, Bernadette D.g.m.. BACTERIOCINAS DE BACTÉRIAS LÁCTICAS. Conscientiae Saúde,Uninove, v. 1, p.9-15, 2002.
SACCHETIN, Priscila Soares Costa; MORAES, Ângela Maria. Produção de micropartículas de alginato contendo flavobacterium columnare inativada pelo método de emulsão para vacinação de peixes por via oral.Química Nova, Lavras, v. 33, n. 2, p.263-268, jan. 2010.
SANTOS, Neusa de Queiroz. A RESISTÊNCIA BACTERIANA NO CONTEXTO DA INFECÇÃO HOSPITALAR. Texto & Contexto, Florianópolis, v. 6, p.64-70, 2004.
SCHÖBITZ, R.P;. BÓRQUEZ, P.A; COSTA, M.E; CIAMPI, L.R; BRITO, C.S. Bacteriocin like substance production by carnobacterium piscicola in a continuous system with three culture broths. study of antagonism against. Brazilian Journal of Microbiology, v.37, p.52-57, Chile, 2006. SCHULZ, Denys et al. Bacteriocinas: MECANISMO DE AÇÃO E USO NA CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS. Alimentos e Nutrição Araraquara, Araraquara, v. 14, n. 2, p.229-235, 2003.
SERRANO, P. H. 2005. Responsible use of antibiotics in aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper, 469. Rome, FAO. 97p. SHOTTS E. B.;GAINES, J.; MARTIN, L.; PRESTWOOD , A.K.. Aeromonas-Induced Deaths Among Fish and Reptiles in an Eutrophic Inland Lake. Journal of the a.1erican veterinary medical association. {S.I.], p. 603-607, v. 161, 1972. SILVA, Bruno C. et al. Hematological and immunological responses of Nile tilapia after polyvalent vaccine administration by different routes. Pesquisa Veterinária Brasileira, Santa Catarina, v. 11, n. 29, p.874-880, nov. 2009. SILVA, L.E.S.; GALÍCIO, G. S.. Alimentação de peixes em piscicultura intensiva. Enciclopédia Biosfera. v.8; n.15; p. 49-62, Goiânia, 2012.
SOMMERSET,I.; KROSSOY, B.; BIERING,E.; FROST, P.. Vaccines for fish in aquaculture. Rev. Expert. v.4; n.1; p. 89-101. 2005.
62
TAVECHIO, W.L.G.; GUIDELLI, G.; PORTZ, L..Alternativas para a prevenção e o controle de patógenos em piscicultura. Boletim do Instituto da Pesca. v.35; p. 335-341, São Paulo,
2009. THOMAS, J. et al. Pathogenecity of Pseudomonas aeruginosa in Oreochromis mossambicus and treatment using lime oil nanoemulsionColloids. Surf. B: Biointerfaces, 116 (2014), pp. 372–377.
VIVEKANANDHAN, G.; SAVITHAMANI, K.; HATHA, A.A.M , LAKSHMANAPERUMALSAMY, P. Antibiotic resistance of Aeromonas hydrophila isolated from marketed fish and prawn of South India. [S.I.], v. 76, p. 165-168, 2002 WANNMACHER, Lenita. Uso indiscriminado de antibióticos e resistência microbiana: Uma guerra perdida? Issn 1810-0791,Brasília, v. 1, n. 4, p.1-6, mar. 2004. YANG, Shih-chun et al. Antibacterial activities of bacteriocins: application in foods and pharmaceuticals. Front. Microbiol., [s.l.], v. 5, p.1-10, 26 maio 2014.
ZORZI, Pablo. Detecção da produção de bacteriocinas utilizando linhagens de bactérias isoladas em cédulas de dinheiro corrente na cidade de Chapecó/SC. F. 33, monografia – Farmácia, Universidade Comunitária da Região de Chapecó, Chapecó, 2010.
63
ANEXO