UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

CARINA SCOLARI GOSCH

Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana: diagnóstico molecular das espécies de Leishmanias

prevalentes nas populações tocantinenses

Goiânia 2017

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CARINA SCOLARI GOSCH

Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana: diagnóstico molecular das espécies de Leishmanias

prevalentes nas populações tocantinenses

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Orientador: Miriam Leandro Dorta

Goiânia 2017

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iv

v

“Viver com propósitos é a

única maneira de viver de verdade.

Todo o resto é apenas existir.”

(Rick Warren)

Dedico essa tese à minha família e amigos, por todo amor e incentivo que

não cabem em palavras...

vi

AGRADECIMENTOS

1.1. Agradecimentos

Para a realização deste trabalho contei com o auxílio e colaboração de muitos.

Expressar toda a minha gratidão aos que contribuíram direta ou indiretamente é uma

tarefa difícil. A vocês que me incentivaram, apoiaram e acreditaram que eu era capaz,

muito obrigado. Em especial:

À Deus e a minha família, que foi e sempre serão à base de minha vida, que me acolhem

nos momentos difíceis, e que incentivam e depositam total confiança em meus sonhos,

apostando neles tanto quanto eu, e que se alegram intensamente com cada pequeno

passo que dou rumo a uma conquista.

À minha querida orientadora e amiga Miriam Leandro Dorta, agradeço-lhe

imensamente a oportunidade de fazer o doutorado com você, afinal, sempre será para

mim um modelo a ser seguido. Admiro-lhe muito, por tudo que és como ser humano e

profissional.

Aos bolsistas do projeto PPSUS/CNPq, Joandson, Deyse, Ray e Bruna pelo prazer de

conhecê-los e conviver com vocês durante este período e pela indispensável

contribuição na organização das amostras, preparo dos materiais utilizados nos

experimento, extração do DNA, levantamento bibliográfico, relatórios, correções,

formatações, análise dos dados..., meus sinceros agradecimentos.

A Cálita Pollyana que se revelou uma grande amiga no decorrer deste trabalho, sou

muito grata a você pelo seu carinho, auxílio nas PCRs e dedicação durante esse período.

Ao meu irmão Marcelo, que gentilmente realizou a confecção dos mapas do artigo e me

acolheu em sua casa durante esse período de idas e vindas para Goiânia.

Às médicas Célia Amorim e Ledice Inácia pela competência e dedicação no

atendimento ao paciente de estudo e principalmente ao Paciente que consentiu o estudo

de suas amostras biológicas para a realização deste trabalho.

À Secretaria Estadual de Saúde do Tocantins (SESAU), à Secretaria Municipal de

Saúde de Porto Nacional, ao Laboratório Central (LACEN-TO) e ao Laboratório de

Endemias de Porto Nacional, representados pelos funcionários Júlio, Zenir Maria,

Delarmano e Marlene, que concederam os dados e materiais para estudo e

desenvolvimento da pesquisa.

vii

Aos Colaboradores Silva Uliana e Adriano Coelho pela realização do seqüenciamento e

identificação molecular da amostra do estudo de caso e ao Sebastião Pinto pela análise

hisptopatológica e imunocitoquímica.

Aos Professores do programa de Doutorado de Medicina Tropical que desempenharam

um papel excepcional na transmissão e formação de conhecimento.

Aos professores José Clecildo, Juliana e Ledice Inácia pela simpatia e serenidade com

que conduziram a qualificação deste trabalho e pelo reconhecimento do meu esforço.

Aos professores Ludmila, Rodrigo, Adriano e Ledice por fazerem parte da banca de

defesa dessa tese e contribuirem com sugestões e correções, a fim de, melhorar este

trabalho.

Aos funcionários do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade

Federal de Goiás, José Clementino, Karine e Natália pelo auxilio prestado.

Aos professores Edwards e Larissa pela correção da ortografia e gramática em

português e inglês.

À Faculdade Presidente Antônio Carlos (FAPAC/PORTO NACIONAL), pela

construção do laboratório de pesquisa e biologia molecular para a realização deste

trabalho, pelo apoio financeiro, pela colaboração de todos os funcionários, pelas

liberações quando precisei me ausentar para cumprir alguma tarefa relacionada ao

doutorado.

Ao PPSUS/CNPq pelo incentivo financeiro dado ao projeto de pesquisa que permitiu o

desenvolvimento das atividades práticas da pesquisa.

Meus Sinceros Agradecimentos

Carina Scolari Gosch

viii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO………………………………………………………..………….. 18

1.1 EPIDEMIOLOGIA……………………………………………………………….. 18

1.2 AGENTE ETIOLÓGICO……………………...…………………………………. 19

1.3 TRANSMISSÃO E CICLO BIOLÓGICO…………………..…..……………….. 20

1.4 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS………………………………………...……….. 21

1.5 DIAGNÓSTICO…………………………………………...…………….……….. 22

1.5.1 Diagnóstico epidemiológico……………………………….….……………….. 22

1.5.2 Diagnóstico clínico……………………………………………………….……. 23

1.5.3 Diagnóstico parasitológico…………….……………………………………… 23

1.5.4 Diagnóstico imunológico…………………….………………………………... 24

1.5.5 Diagnóstico molecular……………………….………………………………... 25

1.6 TRATAMENTO…………………...…………….……………………………….. 28

1.7 MEDIDAS DE PREVENÇÃO E CONTROLE………………………………….. 30

2 JUSTIFICATIVA………………………………………………………………… 32

3 OBJETIVOS……………………………………….……………………………… 34

3.1 OBJETIVO GERAL……………………………………………………………. 34

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………………………………... 34

4 RESULTADOS………………………………………………………………......... 35

4.1 Artigo 1. American tegumentary leishmaniasis: epidemiological and molecular

characterization of the prevalent Leishmania species in the state of Tocantins,Brazil,

2011-2015…………………………………………………………..............................

35

4.2 Artigo 2. Case report: Atypical Leishmaniasis due to coinfection by different

species of Leishmania………………………………………………………………....

35

5 DISCUSSÃO………………………………………………….…………………… 54

6 CONCLUSÕES……………………………………………….…………………… 57

REFERÊNCIAS………………………………………………..……………………. 58

ANEXOS………………………………………………………….………………….. 72

ix

FIGURAS, TABELAS E ANEXOS

Artigo 1

Lista de figuras

Figura 1 Regionalization of health in the state of Tocantins. The state of

Tocantins is divided into eight health regions approved according to

Resolution CIB - TO No. 161/201211, they are, Health Region of

Augustinópolis, Araguaína, Guaraí, Paraíso, Palmas, Porto

Nacional, Gurupi and Dianópolis……………………………………

38

Figura 2 Geographical distribution of the ATL in the state of Tocantins.

Location of municipalities reporting cases of ATL in humans at

SINAN, from 2011 to 2015. Number of municipalities reporting

ATL cases in the years of study: 2011 (81 municipalities), 2012 (84

municipalities), 2013 (85 municipalities), 2014 (96 municipalities),

2015 (86 municipalities)………………………………………….…

39

Figura 3 Incidence of notification of ATL by municipality. The stratification

of municipalities by incidence of reported cases of ATL, period

2011-2015, was performed in the eight health regions that make up

the state of Tocantins, in Brazil…...…………………………………

40

Figura 4 Frequency of ATL notifications per year. The stratification per year

of reported ATL cases, period 2011-2015, was performed in the

eight health regions that make up the state of Tocantins,

Brazil……………………………………………...………………….

40

Figura 5 Representative image of PCR amplified products from the

conserved region of the Leishmania minicircle kDNA before and

after Hae III digestion. In A: PCR amplicons, B: PCR product after

HAE III digestion. In A1 and B1: molecular weight standard of 25

bp; In A2 and B2: L. (V.) braziliensis MHOM / BR / 1975 / M2903,

WHO reference; In A3 and B3: L. (L.) amazonensis IFA / BR /

1967 / PH8, WHO reference; In A4-A10 and B4-B10: Isolate

samples; In A11, negative control of the PCR. Polyacrylamide gel 8

and 15%, respectively, stained by silver..............................................

42

Figura 6 PCR amplified products obtained with oligonucleotides G6PD-

ISVC and G6PD-ISB. In 1: molecular weight standard of 100bp; 2:

Negative Control; 3: L. (V.) braziliensis MHOM / BR / 1975 /

M2903, WHO reference; 4 - 8: Samples. 8% polyacrylamide gel

stained with silver.…………………………………………………...

42

Figura 7 Territorial distribution of Leishmania species in the state of

Tocantins. Positive samples of DME were collected from 32

municipalities distributed homegeneously in the eight health regions

of the state and characterized molecularly by PCR-RFLP and PCR-

x

G6PD techniques……………………………………………….……

43

Lista de Tabelas

Tabela 1 Socio-demographic and epidemiological characteristics of ATL cases

reported to SINAN in the state of Tocantins, Brazil, from 2011 to

2015…………………………………………………………………..

41

Tabela 2 Clinical, diagnostic, therapeutic and evolution of cases of ATL

reported to SINAN in the state of Tocantins, Brazil, from 2011 to

2015……………………………………………………………………

41

Artigo 2

Lista de figuras

Figura 1 Patient with disseminated cutaneous leishmaniasis. (A and B)

Cutaneous lesions after treatment with pentavalent antimonial (15

mg / kg / day for 30 days) and first liposomal amphotericin B (100

mg / day for 7 days); (C and D) Cutaneous lesions during treatment

with amphotericin B deoxycholate (50 mg / day for 12 days and

amphotericin B liposomal 150 mg / day for 25 days); (D and F)

Healing of skin lesions after treatment…………................................

48

Figure 2 Photomicrography of cutaneous lesion. Biopsy fragments were

prepared with HE (A, B, C and D) and IHC (E and F). (A) Skin with

epidermis exhibiting pseudoepitheliomatous hyperplasia, dermis

with severe non-granulomatous chronic inflammatory reaction. (B)

Dermal-epidermal border with rich infiltrate of lymphoid and

plamocyte cells. (C) Vacuolated macrophages containing

amastigotes. (D) Amastigotes forms (arrow). (E and F) Amastigotes

labeled ICH. HE = Hematoxylin-eosin, IHC =

immunocytochemistry, leishmania stained with

brown.…………………………………………………...….………..

49

Anexos

Anexo 1 Concessão dos dados oficiais de notificação pelo Departamento de

Acessoria Técnica das Leishmanioses SVPPS/DVEDVZ/GDVZ da

Secretaria Estadual de Saúde do estado doTocantins (SESAU- TO)

…………................................................................................................

72

Anexo 2 Concessão das lâminas de exame parasitológico direto pelo

Departamento do Controle de Qualidade da LTA do Laboratório

Central de Saúde Pública do estado do Tocantins (LACEN-

TO)………………………………………………………………...…..

73

xi

Anexo 3 Termo de Consetimento Livre e Esclarecido (TCLE)……………...…

74

Anexo 4 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das

Clínicas da Universidade Federal de Goiás –GO sob o número

35963214.6.0000.5078………………………………………………...

75

Anexo 5 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade

FAHESA/ITPAC sob o número 35963214.6.3002.0014………...…...

77

Anexo 6 Aceite para publicação do manuscrito (Artigo 1) na Revista do

Instituto de Medicina Tropical de São Paulo……………………….....

79

Anexo 7

Confirmação da submissão do manuscrito (Artigo 2) ao American

Journal of Tropical Medicine and Hygiene………………………….......

80

xii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

ACL do inglês American Cutaneous Leishmaniasis

ATL do inglês American Tegumentary Leishmaniasis

BA Bahia

BR Brasil

ºC Graus Celcius

Ceme Centro municipal de especialidades médicas

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CIB Comissão Intergestora Bipartite

cm Centímetros

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico

DNA Ácido Desoxirribonucléico

dNTP’s Desoxirribonucleotídeos trifosfato

dUTP Deoxyrudine trifosfato

DVEDVZ Diretoria de Vigilância Epidemiológica das Doenças

Vetoriais e Zoonoses

ELISA Ensaio Imunoenzimático (do inglês Enzyme Linked

Immuno Sorbent Assay)

EPD Exame Parasitológico Direto

FAHESA Faculdade de Ciências Humanas, Econômicas e da Saúde

de Araguaína

FAPAC-PORTO Faculdade Presidente Antônio Carlos - Porto Nacional

FAPT Fundação de Amparo à Pesquisa do estado do Tocantins

g Gramas

GDVZ Gerência de Doenças Vetoriais e Zoonozes

G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase

GO Goiás

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (do inglês Human

Immunodeficiency Vírus)

HCl Ácido clorídrico

IDRM Intradermorreação de Montenegro

IgG Imunoglobulina G

xiii

IPTSP Instituto de Patologia Tropical de Saúde Pública

IRT Tipagem da Região Intergênica

ITS Espaçadores Transcritos Internos (do inglês Internal

Transcribed Spacers)

ITS1 Espaçadores Transcritos Internos 1 (do inglês Internal

Transcribed Spacers 1)

Kb Quilobase

KCl Cloreto de potássio

kDNA Ácido Desoxirribonucleico do Cinetoplasto (do inglês

Kinetoplast Deoxyribonucleic Acid )

Kg Quilogramas

Km2 Quilômetros quadrados

LACEN-TO Laboratório Central de Saúde Pública do estado do

Tocantins

LD Leishmaniose Cutânea Disseminada

LCD Leishmaniose Cutânea Difusa

LC Leishmaniose Cutânea Localizada

LCM Leishmaniose Cutâneo-mucosa

L. (L.) amazonensis Leishmania (Leishmania) amazonensis

LM Leishmaniose Mucosa

LSU Subunidade Larga do Ribossomo (do inglês Large

Subunit )

LTA Leishmaniose Tegumentar Americana

LV Leishmaniose Visceral

L. (V.) braziliensis Leishmania (Viannia)braziliensis

L. (V.) guyanensis Leishmania (Viannia) guyanensis

L (V.) panamensis Leishmania (Viannia) panamensis

L. flaviscutellata Lutzomya flaviscutellata

L. whitmani Lutzomya whitmani

M Molar

MA Maranhão

mg Miligramas

MgCl2 Cloreto de magnésio

mL Mililitros

xiv

mm Milímetros

mM Milimolar

MT Mato Grosso

NNN Novy e Neal modificado por Nicolle

N° Número

OMS Organização mundial da saúde

OPAS Organização Pan-Americana de Saúde

PA Pará

PAS Ácido periódico-Schiff (do inglês Periodic

acid-Schiff)

pb Pares de bases

PBS Tampão fosfato/salina

PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês Polymerase

Chain Reaction)

PCR-RFLP Associação entre a técnica Reação em Cadeia da

Polimerase e a técnica Polimorfismo de Comprimento dos

Fragmentos de Restrição

pH Potencial hidrogeniônico

PI Piauí

PPSUS Programa Pesquisa para o SUS

rDNA Ácido Desoxirribonucléico Ribossomal

RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta

RFLP Polimorfismo de Comprimento dos Fragmentos de

Restrição (do inglês Restriction Fragment Length

Polymorphism)

SAE Serviço de Atenção Especializada

Sb+5 Antimoniato Pentavalente

SESAU-TO Secretaria Estadual de Saúde do estado do Tocantins

SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação

sp. Espécie

spp. Espécies

SP São Paulo

SSU Subunidade Menor do Ribossomo (do inglês Small

Subunit)

xv

SVPPS Superintendência de Vigilância, Proteção e Promoção da

Saúde

T.a. Temperatura ambiente

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TO Tocantins

U Unidade

UFG Universidade Federal de Goiás

V Volts

WHO do inglês World Health Organization

v/v Volume/Volume

µl Microlitros

µM Micromolar

xvi

RESUMO

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecto parasitária

causada por protozoários do gênero Leishmania spp. e está entre as dez endemias

mundiais emergentes. Faz parte da lista de doenças infecto parasitárias mais prevalentes

no planeta, sendo então considerada um problema de saúde pública que permeia

consequências desde o âmbito psicossocial até o nível econômico do indivíduo

adoecido. Pode apresentar variadas manifestações clínicas, devido a resposta

imunológica do hospedeiro e a virulência da espécie do parasito envolvido. Considera-

se uma doença de fácil diagnóstico quando há presença das manifestações clássicas,

entretanto, apresentações clínicas incomuns ou atípicas tornam o diagnóstico mais

complexo. Dessa forma, este estudo teve como objetivos determinar o perfil

epidemiológico da LTA e identificar a espécie de Leishmania prevalente, no estado do

Tocantins, além de acompanhar, estudar e relatar um caso atípico de LTA atendido no

Serviço de Atenção Especializada (SAE) de Porto Nacional – TO, Brasil. O estudo

epidemiológico foi desenvolvido por meio da análise retrospectiva e descritiva dos

casos de LTA com base nos dados notificados no Sistema de Informação de Agravos de

Notificação (SINAN), período de 2011 a 2015. Aplicou-se técnicas moleculares de

reação em cadeia da polimerase (PCR-RFLP e PCR-G6PD) para caracterização

molecular das espécies de Leishmania, utilizando DNA de 271 amostras de lâminas

positivas de exame parasitológico direto do raspado da lesão de pacientes oriundos de

diversos municípios das oitos regiões de saúde do estado do Tocantins. A apresentação

do relato de caso atípico, incluiu em seu contexto metodologias laboratoriais para

diagnóstico como: exame parasitológico direto (EPD), intradermorreação de

Montenegro (IDRM), reação de imunofluorescência indireta (RIFI), análise

histopatológica e imunocitoquímica, PCR-RFLP; PCR-G6PD; PCR-ITS e

Sequenciamento Gênico. Os resultados demonstraram que, o estado do Tocantins

notificou um total de 1434 casos autóctones de LTA ao SINAN, no período de 2011 a

2015, com aumento progressivo do número de municípios com registros de casos,

caracterizando uma expansão territorial da doença no estado. A maior incidência nos

casos notificados ocorreram em homens, com idade superior a 60 anos, moradores de

êzonas rurais. A maior frequencia dos casos está correlacionada a indivíduos pardos de

baixa escolaridade. A forma clínica de LTA mais evidenciada foi a cutânea e o

antimonial pentavalente foi a droga mais utilizada para o tratamento. A espécie

prevalente no estado foi a Leishmania (V.) braziliensis. Em relação ao estudo de caso,

foi verificado, que o paciente apresentava forma atípica de leishmaniose disseminada.

As características clínicas, histopatológicas e imunológicas apresentavam um padrão

ambíguo, que dificultaram o diagnóstico e a conduta terapêutica. A identificação do

agente etiológico revelou infecção mista por L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis.

Esses resultados revelam que a caracterização epidemiológica e molecular da espécie de

Leishmania sp em âmbito regional é fundamental para traçar condutas de controle e

prevenção, minimizando o número de casos e os quadros de resistência ao tratamento,

recidivas e evolução para as formas graves da doença, que repercutem na qualidade de

vida do paciente.

Palavras-chave: Leishmaniose. PCR. Tocantins. Epidemiologia.

xvii

ABSTRACT

American Cutaneous Leishmaniasis (LTA) is a parasitic infectious disease caused by

protozoa of the genus Leishmania spp. and is among the ten emerging world endemics.

It is part of the list of the most prevalent parasitic infectious diseases on the planet, and

is considered a public health problem that permeates consequences from the

psychosocial scope to the economic level of the sick person. It can present varied

clinical manifestations, due to the host's immune response and the virulence of the

parasite species involved. However, uncommon or atypical clinical presentations make

the diagnosis more complex. Thus, the objective of this study was to determine the

epidemiological profile of LTA and to identify the prevalent Leishmania species in the

State of Tocantins, in addition to monitoring, studying and reporting an atypical ATL

case treated at the Specialized Attention Service (SAE) in Porto National - TO, Brazil.

The epidemiological study was developed through a retrospective and descriptive

analysis of the cases of ATL based on the data reported in the SINAN, from 2011 to

2015. Molecular techniques of polymerase chain reaction (PCR-RFLP and PCR-G6PD)

for molecular characterization of the Leishmania species, using DNA from 271 positive

sample samples from direct parasitological examination of the lesion scraping of

patients from several municipalities of the eight health regions of the state of Tocantins.

The presentation of the atypical case report included in its context laboratory

methodologies for diagnosis such as: direct parasitological examination (EPD),

Montenegro intradermal reaction (IDRM), indirect immunofluorescence reaction

(IFAT), histopathological and immunocytochemical analysis, PCR-RFLP; PCR-G6PD;

PCR-ITS and Gene Sequencing. The results showed that the state of Tocantins reported

a total of 1434 autochthonous cases of LTA to SINAN in the period 2011 to 2015, with

a progressive increase in the number of municipalities with case records, characterizing

a territorial expansion of the disease in the state. The highest incidence in the reported

cases occurred in men, aged over 60 years, living in rural areas. The highest frequency

of cases is correlated to low schooling brown individuals. The clinical form of LTA

more evidenced was cutaneous and pentavalent antimonial was the drug most used for

the treatment. The species prevalent in the state was Leishmania (V.) braziliensis.

Regarding the case study, it was verified that the patient presented an atypical form of

disseminated leishmaniasis. The clinical, histopathological and immunological

characteristics presented an ambiguous pattern, which hindered the diagnosis and the

therapeutic conduct. The identification of the etiological agent revealed mixed infection

by L. (L.) amazonensis and L. (V.) guyanensis. These results show that the

epidemiological and molecular characterization of the Leishmania sp species at the

regional level is fundamental for establishing control and prevention behaviors,

minimizing the number of cases and the resistance to treatment, recurrence and

evolution for the severe forms of the disease, which have repercussions on the patient's

quality of life.

Key-words: Leishmaniasis. PCR. Tocantins. Epidemiology.

18

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1 EPIDEMIOLOGIA

As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias comuns em regiões tropicais e

subtropicais. São causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidos aos hospedeiros

mamíferos pela picada de um inseto vetor dos gêneros Phlebotomus ou Lutzomyia, sendo a

segunda espécie encontrada no Brasil. A maioria das infecções ocorre como zoonoses entre

animais silvestres, principalmente roedores, sendo o homem considerado um hospedeiro acidental

no ciclo de transmissão (ASHFORD, 2000; GONTIJO & CARVALHO, 2003; DESJEUX, 2004).

A Organização Mundial de Saúde (WHO, 2012) relata que 98 países no mundo

apresentam transmissão endêmica das leishmanioses e afirmam que esse número pode ser maior

devido à existência de subnotificação da doença em vários países. Estima-se que, anualmente, 1,5

– 2 milhões de indivíduos sejam acometidos, e que 1 – 1,5 milhão de casos correspondem à forma

tegumentar da doença (WHO, 2008). O Brasil está entre os 10 países que, somados, respondem

juntamente por aproximadamente 70 a 75% dos casos de leishmaniose cutânea no mundo. As

leishmanioses são, portanto, um problema de saúde pública mundial, pois, além da elevada

incidência, são doenças negligenciadas pelos programas de controle de doenças infecciosas

tropicais (ALVAR et al., 2012; WHO, 2012; VON STEBUT, 2015).

Nas Américas, a Leishmaniose Tegumentar (LTA) está presente em 18 países. No ano

de 2012 foram registrados 52.919 casos, dos quais 44,9% (23.793) estavam concentrados no

Brasil. Do total de casos, 89,5% correspondem à forma cutânea e 4,2% à forma mucosa ou

mucocutânea. Em relação ao perfil social, 71,4% são do sexo masculino e 72,1% ocorrem na faixa

etária de 10 a 50 anos. O critério utilizado para o diagnóstico da maioria dos casos de LTA

reportados foi o laboratorial (72,7%). O relatório aponta ainda que os casos que evoluíram ao

óbito, só foram registrados no Brasil (OPAS, 2014).

Apesar das falhas na notificação compulsória de LTA no Brasil, entre 1991 e 2010,

houve uma média anual de 27.374 casos registrados e observou-se uma expansão geográfica da

doença, visto que, no ano 2003 foi confirmada a autoctonia de casos de LTA em todas as unidades

federadas do país. As regiões Norte, Nordeste e Centro Oeste do Brasil são as que apresentam os

maiores números de casos notificados de LTA com 46,08%, 26,56% e 15,14% em relação ao total

de casos notificados no ano de 2015, respectivamente (BRASIL, 2016).

No estado de Tocantins a taxa de incidência de LTA em 2012 foi de 31,18 casos por

100.000 habitantes, bem acima da taxa nacional de 11,86 casos por 100.000 habitantes (BRASIL,

19

2012). A região central do estado, onde se localizam as regionais de saúde dos municípios de

Palmas, Paraíso, Guaraí e Porto Nacional concentraram o maior número de casos notificados,

sendo estes, responsáveis aproximadamente por 60% dos casos registrados em 2015 no estado

(BRASIL, 2015).

1.2 AGENTE ETIOLÓGICO

Os protozoários do gênero Leishmania pertencem ao Sub-reino Protozoa, Filo

Sarcomastigophora, Ordem Kinetoplastida e Família Trypanosomatidae (LAINSON & SHAW,

1987). São protozoários digenéticos (heteroxenos) que tem o seu ciclo biológico desenvolvido em

dois hospedeiros, um vertebrado e um invertebrado. Esses parasitos caracterizam-se por apresentar

duas formas evolutivas distintas: uma forma amastigota, que é tipicamente ovóide ou esférica, sem

flagelo livre, encontrada no citoplasma dos macrófagos dos hospedeiros vertebrados; e uma forma

promastigota, que apresenta um flagelo livre e é encontrada no trato digestivo do hospedeiro

invertebrado e também pode ser observada em meio de cultura (ASHFORD, 2000; GONTIJO &

CARVALHO, 2003).

No Brasil foram identificadas sete espécies de Leishmanias, responsáveis pela LTA,

classificadas pelo modelo taxonômico proposto por Lainson e Shaw (1987), nos subgêneros

Viannia e Leishmania. São elas: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia)

guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia)

shawii, Leishmania (Viannia) lindenbergi e Leishmania (Leishmania) amazonensis (BRASIL,

2010a).

As espécies L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis são as mais amplamente

distribuídas no Brasil, sendo causadoras de formas graves da doença (GRIMALDI JÚNIOR,

DAVID, MCMAHON-PRATT, 1987; BRASIL, 2010a).

A Leishmania (V.) braziliensis é transmitida por diferentes espécies de flebotomíneos,

como Lutzomyia whitmani, Lutzomyia wellcomei, Lutzomyia complexa e Lutzomyia intermedia,

dentre outras. Apresenta ampla distribuição geográfica, sendo encontrada na maioria dos países da

América Latina. No homem, causa lesões conhecidas como “ferida brava”, “úlcera de Bauru”,

“nariz de anta”, etc. O curso da infecção geralmente é irregular e crônico. É caracterizada por

associar-se a manifestações cutâneas e mucosas da LTA, e de grande interesse médico, pois é a

espécie mais amplamente distribuída pelo país (LAINSON & SHAW, 1987; BRASIL, 2010a).

Leishmania (L.) amazonensis é responsável no homem pela leishmaniose cutânea

localizada e por uma forma de difícil tratamento conhecida por leishmaniose cutânea difusa. Seus

20

reservatórios são roedores e marsupiais. E os principais vetores são Lutzomyia flaviscutellata e

Lutzomyia olmeca. É importante considerar este parasito, também, como potencial causador de

leishmaniose visceral atípica, mesmo nos casos em que o exame microscópico e teste sorológico

sejam negativos (ALEIXO et al., 2006; BRASIL, 2010a).

1.3 TRANSMISSÃO E CICLO BIOLÓGICO

A transmissão das Leishmania ssp. aos hospedeiros mamíferos susceptíveis ocorre

pela picada do inseto vetor, pertencente à ordem Diptera, família Psychodidae, sub-família

Phlebotominae, gênero Lutzomyia ssp., conhecido popularmente como “mosquito palha”. O vetor

adquire o parasito ao picar os reservatórios contaminados, cujos principais são o homem,

marsupiais, roedores, preguiça, tamanduá, cão e equinos. Vivem em média 40 dias, apresentam

hábitos principalmente noturnos, e são encontrados em regiões tropicais e subtropicais, mas

ocorrem em qualquer lugar no mundo onde as temperaturas não caem abaixo de 10°C. Sob

ampliação são facilmente distinguidos de outros mosquitos pelos seus olhos proeminentes

(HERWALDT, 2008; ROQUE & JANSEN, 2014; VON STEBUT, 2015).

O ciclo biológico das Leishmania spp. é do tipo heteroxênico. Seus hospedeiros

vertebrados podem ser: roedores, canídeos, marsupiais, edentados, rocionídeos, ungulados

primitivos e primatas. O ser humano é considerado um hospedeiro acidental no ciclo da

Leishmaniose. Os hospedeiros invertebrados são fêmeas de insetos hematófagos conhecidos como

flebotomíneos (ROQUE & JANSEN, 2014; VON STEBUT, 2015).

No hospedeiro vertebrado o ciclo biológico inicia-se quando a fêmea do flebotomíneo,

previamente infectada, realiza o repasto sanguíneo inoculando os parasitos. Em poucos minutos,

as formas promastigotas são fagocitadas pelos macrófagos da pele (histiócitos), e no interior

destas células sofrem transformações assumindo a forma intracelular de amastigota, que inicia o

processo de multiplicação por divisão binária. As formas amastigotas são altamente especializadas

e adaptadas para resistir à ação do fagolisossoma celular. A infecção é mantida pelo rompimento

da célula infectada, causada pela intensa multiplicação desses parasitos, e, consequente fagocitose

das amastigotas livres por outros fagócitos ou pela divisão das células infectadas, compartilhando

seus parasitos entre as células filhas. Após algumas semanas, o acúmulo de células inflamatórias

(macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células T) levam à formação de inflamação

granulomatosa característica (CECILIO et al., 2014).

No hospedeiro invertebrado o ciclo ocorre quando as fêmeas dos flebotomíneos,

durante a sua alimentação sanguínea, ingerem as células parasitadas encontradas na pele ou no

21

sangue periférico. No tubo digestivo dos insetos, a forma amastigota modifica-se e assume a

forma promastigota, que se multiplica por divisão binária e depois migra para a probóscida,

podendo ser transmitida ao vertebrado no próximo repasto sanguíneo (LAINSON et al., 1986;

LAINSON & SHAW, 1987; VON STEBUT, 2015).

Os parasitos, tanto nas formas promastigotas quanto amastigotas, induzem respostas

imunes nos hospedeiros e, juntos, os fatores dos parasitos e do hospedeiro determinam as

manifestações clínicas da LTA. Pode ocorrer infecção assintomática (FOLLADOR et al., 2002),

mas em geral, as manifestações clínicas são variadas e incluem desde uma lesão cutânea que, em

geral, é ulcerada, mas pode ser nodular; lesões múltiplas disseminadas com diferentes

características clínicas (papulares, ulceradas, verrucosas, acnóides, crostosas, impetigóides,

ectimatóides); até o envolvimento das mucosas oral e nasofaríngea, com destruição tecidual

(PASSOS et al., 2001; CASTRO et al., 2002; GUERRA et al., 2003; GOTO & LINDOSO, 2012).

1.4 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

As diferentes formas clínicas subdividem a LTA em leishmaniose cutânea localizada

(LC), leishmaniose cutânea disseminada (LD), leishmaniose cutânea difusa (LCD), leishmaniose

cutâneo-mucosa (LCM) e leishmaniose mucosa (LM).

A LC pode ser causada pelas sete diferentes espécies de Leishmania presentes no

Brasil (NAIFF et al., 1991; SILVEIRA et al., 2002; TOJAL DA SILVA et al., 2006; BRITO et al.,

2009), porém a espécie de Leishmania mais prevalente no país é L. (V.) braziliensis (BRITO et al.,

2012). No local da picada do inseto, surge uma pápula ou nódulo eritematoso que evolui para

úlcera com bordas elevadas e pode ser precedida ou acompanhada de aumento de um gânglio

regional. No nordeste do Brasil, a LC causada por L. (V.) braziliensis é constantemente

acompanhada por extensa linfoadenopatia (HARMS et al., 2005). A LC pode apresentar de uma a

10 lesões, geralmente ulceradas ou úlcero-crostosas, em áreas descobertas do corpo. Pode haver

cura espontânea ou após tratamento ou, ainda, haver evolução para outras formas clínicas da LTA

(GOTO & LINDOSO, 2012). Uma destas formas é a recidiva cútis, que tem sido associada às

espécies L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis, e caracterizada por uma lesão que apresenta

cicatrização no centro, mas nas bordas há infiltração e ulceração. Nestas lesões, os parasitos

dificilmente são encontrados (BRASIL, 2006; GOTO & LINDOSO, 2012).

A LD inicia-se com lesão única, geralmente nas extremidades, após ocorre a

disseminação via linfática ou hematopoética que caracterizará a disseminação da doença. As

múltiplas lesões são observadas em diferentes partes do corpo e podem apresentar variados

22

aspectos clínicos (papulares e acneiformes são as mais frequentes; nodulares, crostosas, ulceradas

ou verrucosas também podem aparecer). O envolvimento das mucosas oral e nasofaríngea é

frequente. Pode ser detectada a presença dos parasitos nas lesões, tendo sido relatados casos com

grande número de parasitos nos macrófagos. A LD é associada às espécies L. (V.) braziliensis e L.

(L.) amazonensis no Brasil, e com L. (V.) guyanensis na Guiana Francesa (CARVALHO et al.,

1994; TURETZ et al., 2002; COUPPIÉ et al., 2004; de OLIVEIRA CAMERA et al., 2006;

SOUSA et al., 2006; VIEIRA-GONÇALVES et al., 2008; MACHADO et al., 2011).

Em outra forma clínica de leishmaniose cutânea, a LCD, ocorrem múltiplas lesões

infiltradas, verrucosas, papulares, nodulares, que, em geral, não ulceram. Esta é uma forma clínica

rara em que não há resposta imune celular específica para antígenos de Leishmania sp. As lesões

são ricas em parasitos, os quais pertencem à espécie L. (L.) amazonensis, no Brasil (CONVIT et

al., 1993; PEREIRA et al., 2009).

As lesões cutâneas podem apresentar cura clínica ou evoluírem também para a forma

mucosa, conhecida como leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM). Porém, também aparecem lesões

mucosas em pacientes sem evidências de leishmaniose cutânea anteriormente, sendo então, a

forma clínica designada simplesmente leishmaniose mucosa (LM). Nas formas LCM e LM, há um

escasso número de parasitos nos macrófagos e observa-se acometimento das mucosas oral, nasal,

faríngea e laríngea, com predomínio de lesões na mucosa nasal, havendo ulceração e perfuração

do septo nasal. As lesões podem causar desfiguração facial, disfagia e disfonia (AMATO et al.,

2009; DINIZ; COSTA; GONÇALVES, 2011; GOTO & LINDOSO, 2012). A LM é

principalmente causada pela espécie L. (V.) braziliensis no Brasil, porém, na região Amazônica

(Amazonas, Pará, Acre e Rondônia), esta forma clínica é também associada a L. (V.) guyanensis

(BEDOYA-PACHECO et al., 2011; GUERRA et al., 2011).

1.5 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da LTA abrange aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais, em

geral, é necessária uma associação entre esses elementos para se confirmar os casos de

leishmaniose (FURTADO, 1987; BRASIL, 2010a).

1.5.1 Diagnóstico epidemiológico

O diagnóstico epidemiológico busca averiguar: a existência de casos de LTA na

região; se o paciente é oriundo de área endêmica (seja por viagem de lazer ou trabalho ou

23

residência anterior); existência de cães ou equinos nas proximidades, com lesões; inserção em

áreas florestais. Nas lesões cutâneas, os dados epidemiológicos referidos são recentes (em média

dois meses); no caso de lesão mucosa é essencial buscar também a história pregressa de ulceração

de pele de longa duração, além da existência de cicatriz e utilização de medicamentos para

tratamento de leishmaniose (BRASIL, 2010a).

1.5.2 Diagnóstico clínico

O diagnóstico clínico é realizado pelo profissional médico, através das características

das lesões encontradas na anamnese e exame físico do paciente. Na anamnese deve-se explorar,

por exemplo, local onde vive o paciente, profissão, presença de outros indivíduos com lesões

similares, presença de animais domésticos ou no ambiente peridomiciliar. Há divergência quanto

às formas de manifestação, dependendo de fatores ligados à espécie e cepas do parasito, hábitos do

vetor, fatores ligados à resposta imune do hospedeiro e de fatores resultantes da interação parasito-

hospedeiro, assim, o diagnóstico clínico não é suficiente (MEDEIROS; NASCIMENTO;

HINRICHSEN, 2009).

O diagnóstico diferencial de LTA tem focos diferentes conforme o local de

apresentação das lesões. Para a forma cutânea realiza-se o diagnóstico diferencial com: úlceras

(traumáticas, vasculares), paracoccidioidomicose, esporotricose, cromomicose, neoplasias

cutâneas, sífilis e tuberculose cutânea. Na forma mucosa tem-se como diagnóstico diferencial:

hanseníase virchowiana, paracoccidioidomicose, sífilis terciária e neoplasias (MEDEIROS,

NASCIMENTO, HINRICHSEN, 2009; GOMES et al., 2014).

1.5.3 Diagnóstico parasitológico

Apesar dos aspectos clínicos e epidemiológicos, a demonstração do parasito é

elemento chave para o diagnóstico definitivo (GONTIJO & CARVALHO, 2003).

A demonstração do parasito é feita por meio de exames direto e indireto. O exame

parasitológico direto (EPD) é o procedimento de primeira escolha por ser mais rápido, de menor

custo e de fácil execução. A probabilidade de encontro do parasito é inversamente proporcional ao

tempo de evolução da lesão cutânea, sendo rara após um ano. Nos casos de infecção por L. (V.)

braziliensis, a probabilidade está em torno de 100% nos dois primeiros meses de evolução, 75%

aos seis meses e 20% acima dos 12 meses (FURTADO, 1980; GONTIJO & CARVALHO, 2003).

No EPD tem-se a visualização das formas amastigotas em esfregaço de raspado da

24

borda da lesão ou em imprint, que é feito por sobreposição do fragmento da biópsia em lâminas de

vidro, em que após coloração com Giemsa realiza-se a pesquisa da forma amastigota (GONTIJO,

1997; MARTINS, 2013; GOMES et al., 2014).

O exame parasitológico indireto consiste no isolamento do parasito por meio do

cultivo in vitro ou inoculação do material coletado da lesão em animais de laboratório. A

realização dos métodos parasitológicos são de suma importância, pois permitem a posterior

identificação da espécie de Leishmania, entretanto, o exame direto possui baixa sensibilidade após

longos períodos de infecção e o indireto pode apresentar problemas como: a demora em se obter

os resultados, a possibilidade de contaminação da cultura e dificuldades no crescimento do

parasito (GONTIJO & CARVALHO, 2003).

A biópsia, quando conservada em formol a 10%, possibilita a pesquisa direta de

antígeno de Leishmania por meio de técnicas de imunocitoquímica e pesquisa de amastigotas

coradas com hematoxilina-eosina (GONTIJO, 1997).

No método indireto, a visualização do parasito ocorre somente após o isolamento das

Leishmanias por meio da inoculação de fragmento de biópsia nas patas posteriores e focinho de

animais de laboratório, de preferência hamsters (Mesocricetus auratus). Além do longo tempo

necessário para a evolução da lesão no modelo animal (2 a 9 meses, em média), a eficácia do

isolamento apresenta grande variação conforme a espécie de Leishmania (BRASIL, 2010a;

GOMES et al., 2014). Os fragmentos de biópsias também podem ser inoculados em meios de

cultura. O meio de cultura mais empregado é o ágar-sangue de Novy e Neal modificado por

Nicolle (meio NNN). Esse procedimento, contudo, exige aparato laboratorial e pessoal treinado,

muitas vezes não disponível nos serviços de saúde, o que o torna inadequado para inquérito

epidemiológico de larga escala (GONTIJO & CARVALHO, 2003; GOMES et al., 2014).

1.5.4 Diagnóstico imunológico

Dentre os exames imunológicos, os testes sorológicos e a intradermorreação de

Montenegro (IDRM) são os mais utilizados (VIDIGAL et al., 2008).

A IDRM fundamenta-se na visualização da resposta de hipersensibilidade celular

tardia, sendo definida como positiva nos casos com enduração igual ou superior a 5 mm de

diâmetro aos antígenos de Leishmania, inoculados por via intradérmica. A resposta é normalmente

positiva em lesões cutâneas ou mucocutâneas, como também, em pacientes de leishmaniose

visceral curada (STEVEN, 1996; GOMES et al., 2014), no entanto, tem a limitação de tornar-se

positiva entre 3 e 6 semanas após o início da infecção ou doença, além de apresentar-se positiva

25

também em 10 a 20% dos pacientes que vivem em áras endêmicas. Tem valor apenas para auxilar

no diagnóstico, pois a resposta geralmente persiste positiva após o tratamento e cura do paciente

com cicatrização da lesão cutânea tratada ou resolvida espontaneamente (BRASIL, 2010a). O teste

é regularmente negativo em casos de leishmaniose cutânea difusa (LAINSON et al., 1994).

Os testes sorológicos têm sido empregados, com considerável importância, no

diagnóstico e em inquéritos epidemiológicos. A análise de anticorpos anti-Leishmania permite

avaliar o curso evolutivo da infecção, e fornece dados sobre as características de sua resposta

imune. Variados perfis e níveis de imunoglobulinas específicas à Leishmania têm sido detectados

em paciente com LTA, parecendo refletir não só a carga parasitária, mas também a espécie

envolvida, o tempo de infecção e fatores intrínsecos do próprio hospedeiro (GUTIERREZ et al.,

1991). Dentre os métodos sorológicos, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é a mais

utilizada. Trata-se de uma técnica sensível, porém com possibilidade de reações cruzadas

especialmente com a doença de Chagas e leishmaniose visceral. Sabe-se que a positividade desse

teste está vinculada ao tempo de evolução da doença. Há presença de títulos elevados de IgG em

pacientes com mais de uma lesão, pois nesse caso existe uma maior antigenicidade induzida pelo

maior número de parasitos. Quando trata-se de uma lesão de surgimento recente (um a seis meses

de evolução) é frequente a ocorrência de negatividade sorológica. Após o tratamento e a cura da

doença ocorre redução dos títulos ou até mesmo seu desaparecimento em alguns meses (COSTA

et al., 2009; BRASIL, 2010a; GOMES et al., 2014). Habitualmente negativa na forma cutânea

difusa, sua sensibilidade foi estimada em 71% nas formas cutâneas e 100% na forma mucosa

(GONTIJO & CARVALHO, 2003).

1.5.5 Diagnóstico molecular

As Leishmanias apresentam poucas diferenças morfológicas, mas estas diferenças têm

sido utilizadas em diferentes classificações, aliadas a critérios extrínsecos do parasito, como

manifestações clínicas, distribuição geográfica e uma variedade de critérios biológicos, porém,

devido a grande diversidade, esses métodos apresentam falhas. Com o advento da biologia

molecular e da utilização de suas técnicas nos estudos de epidemiologia genética e filogenia,

muitos conhecimentos estão sendo gerados, contribuindo para o estabelecimento das relações inter

e intraespecíficas das diferentes espécies de parasitos. Diversos estudos sobre a evolução e

variabilidade genética em Leishmania vêm sendo realizados e diferentes metodologias

moleculares têm sido empregadas na caracterização mais precisa destes parasitos (LIMA, 2010).

As Leishmanias apresentam poucas diferenças morfológicas, mas estas têm sido

26

utilizadas em diferentes classificações, aliadas a critérios extrínsecos do parasito, como

manifestações clínicas, distribuição geográfica e uma variedade de critérios biológicos, porém,

devido a grande diversidade, esses métodos apresentam falhas. Com o advento da biologia

molecular e da utilização de suas técnicas nos estudos de epidemiologia genética e filogenia,

muitos conhecimentos estão sendo gerados, contribuindo para o estabelecimento das relações inter

e intraespecíficas das diferentes espécies de parasitos. Diversos estudos sobre a evolução e

variabilidade genética em Leishmania vêm sendo realizados e diferentes metodologias

moleculares têm sido empregadas na caracterização mais precisa destes parasitos (LIMA, 2010).

Diversas sequências alvos e diferentes protocolos de PCR foram descritos para a

detecção de DNA de Leishmania. Os alvos de ampliação mais frequentes são: o DNA minicírculo

do cinetoplasto (kDNA) (LOPEZ et al., 1993; MARY et al., 2004), o RNA subunidade ribossomal

(SSUrDNA) (ULIANA et al., 1991; ULIANA et al., 1994;) gene da desidrogenase de glicose-6-

fosfato (g6dp) (CASTILHO; SHAW; FLOETER-WINTER, 2003) e o gene hsp70 (da SILVA et

al., 2010; FRAGA et al., 2010; MONTALVO et al., 2010).

Entre as ferramentas moleculares mais empregadas está a técnica da reação em cadeia

da polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) que é utilizada na identificação de gênero e

espécie (YANG & ROTHMAN, 2004). A PCR possui alta sensibilidade, mas devido à

complexidade de sua padronização, necessidade de treinamento técnico especializado e por ser

uma técnica onerosa é pouco empregada rotineiramente como método diagnóstico (GONTIJO,

1997). A técnica da PCR descrita por Saiki et al. (1985) consiste na síntese enzimática in vitro de

sequências específicas de DNA utilizando primers (ou iniciadores), por meio de uma série de

ciclos de amplificação dependentes de temperaturas específicas, que é subdividida, basicamente,

em três fases: (1) desnaturação das fitas de DNA; (2) anelamento dos primers; (3) extensão da

região flanqueada pelos primers. Este processo permite obter um acúmulo exponencial da

sequência de DNA alvo selecionada pelos iniciadores gerando ao final do processo milhões de

cópias idênticas desse fragmento (GARIBYAN & AVASHIA, 2013; MARTINS, 2013;

RAHMAN et al., 2013).

A ordem Kinetoplastida caracteriza-se por apresentar além do DNA nuclear, um

cinetoplasto rico em DNA, o kDNA. Esta organela localiza-se adjacente à base do flagelo,

perpendicularmente ao maior eixo do microrganismo. Consiste em uma rede de DNA circular que

pode ser dividida em dois grupos: maxicírculos e minicírculos de kDNA (SIMPSOM, 1987).

Os maxicírculos são moléculas grandes com cerca de 20-35 kb, composto por vários

genes que codificam moléculas estruturais da mitocôndria. São extremamente homogêneos entre

os diferentes grupos que compõem a ordem Kinetoplastida (cerca de 20-50 cópias por

27

cinetoplasto). Os minicírculos têm função pouco esclarecida. São compostos de moléculas

menores (0,5-1,5 kb) que se apresentam em grande quantidade (10.000 unidades por cinetoplasto)

e com sequências heterogêneas entre os grupos, o que permite sua utilização para diferenciar

classes, gêneros ou espécies (SIMPSOM, 1987; DAS et al., 2006).

No caso do gênero Leishmania, cada minicírculo de kDNA é composto por uma

molécula de DNA circular de 0,75-1 kb de comprimento, apresentando uma região conservada de

aproximadamente 200 pb. O restante da molécula apresenta sequências altamente variáveis que

são alvo de estudo de sequências específicas para caracterização de subgênero e espécie

(BARKER e BUTCHER, 1983; SATOW et al., 2013).

Os subgêneros e as espécies de Leishmania podem ser identificados mediante

associação entre a PCR e a técnica RFLP (Polimorfismo de Sequência dos Fragmentos de

Restrição, do inglês, Restriction Fragment Length Polymorphism), conhecida como PCR-RFLP.

Esse método utiliza a amplificação de um fragmento específico do kDNA e a sua subsequente

restrição com endonucleases (enzimas de restrição) capazes de reconhecer e clivar regiões

específicas (sítios de restrição) da sequência de DNA molde, gerando perfis de restrição

(JACKSON et al., 1984). Inicialmente são utilizados iniciadores para amplificação da região

conservada dos minicírculos de kDNA de Leishmania, gerando fragmentos de 120 pares de base

(pb) para espécies pertencentes ao subgênero Leishmania (Viannia) e 116 pb para Leishmania

(Leishmania) amazonensis (PASSOS et al., 1996; VOLPINI et al., 2004).

Os fragmentos gerados após amplificação são digeridos utilizando enzimas de

restrição. Apenas as espécies do subgênero Viannia apresentam sítios de restrição para a enzima

Hae III, que cliva o DNA em fragmentos com 80 e 40 pb. A enzima AVA I, específica para a

espécie L. (L.) amazonensis, cliva o DNA em fragmentos com 38 e 78 pb. Diferentes autores

demonstram a positividade de utilizar a PCR-RFLP para distinguir espécies de Leishmania

(VOLPINI et al., 2004; MARLOW et al., 2013).

O genoma de eucariotas contém várias cópias de DNA ribossomal (rDNA), em

diversos cromossomos, constituídos de várias subunidades. Em Leishmania, as regiões SSU e

LSU (subunidade menor e maior do ribossomo, respectivamente) são conservadas, mas as regiões

ITS (Internal Transcribed Spacers) ou espaçadores transcritos internos do DNA têm alto nível de

variação intra e interespecífica, sendo útil no estudo de genética populacional, por meio da técnica

IRT (Tipagem da região intergênica). A maioria das espécies de Leishmania de importância

médica foi distinguida pelo ITS1 com elevada sensibilidade em amostras de biópsias

(SCHONIAN et al., 2003; CUERVO et al., 2004; ROTUREAU et al., 2006; GRAÇA et al., 2012).

Assim, a PCR-RFLP e ITS associadas permitem uma caracterização das diferentes espécies do

28

subgênero Viannia, que englobam as principais espécies prevalentes no Brasil. O sequenciamento

do amplicon gerado na SSUrDNA PCR também possibilita a identificação de L. (L.) amazonensis,

segunda espécie de maior importância no Brasil, e responsável por três formas clínicas distintas da

LTA, inclusive a LCD (de LIMA, 2010).

Outra metodologia importante no diagnóstico das espécies de Leishmania é a

identificação da enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), uma enzima que atua na via das

pentoses, cujos produtos são vitais para o organismo humano. Leishmanias apresentam uma

isoforma de G6PD, possibilitando assim, por meio de sequências localizadas no locus desta

enzima, diferenciar os organismos pertencentes ao subgênero L. (Viannia), e ainda mediante a

isoforma G6PD-7 identificar a espécie L. (V.) braziliensis (CUPOLILLO; GRIMALDI JÚNIOR;

MOMEN, 1994; BARRETT, 1997; CUPOLILLO; GRIMALDI JÚNIOR; MOMEN, 1997).

Tem se mostrado importante também no diagnóstico das espécies de Leishmania o

gene hsp, pois codifica proteínas classificadas como choque térmico as quais realizam função

relevante no dobramento, montagem, localização intracelular, secreção, regulação, estabilização e

degradação de outras proteínas. A proteína de choque térmico HSP70 apresenta 70 kDa e tem

papel de destaque como molécula chaperona no transporte e dobramento de proteínas. Diante

disso, devido a suas características, o gene hsp70 tem sido utilizado em ensaios moleculares como

ferramenta para tipagem de espécies de Leishmanias em nível mundial, mostrando-se útil

principalmente na diferenciação de espécies do subgênero Viannia (GARCIA et al., 2004; YANG

& ROTHMAN , 2004; VRIES; REEDIJK; SCHALLIG, 2015).

Ademais, o gene alvo hsp70 apresenta algumas vantagens em relação a outros genes

pelo fato de possuir repetições in tanden e poucas variações, sendo capaz de discriminar todas as

espécies de importância de Leishmania de ambos os subgêneros (FOLGUEIRA & REQUENA,

2007; MONTALVO et al., 2012; ODIWUOR et al., 2012).

1.6 TRATAMENTO

O tratamento da LTA é um desafio para os profissionais da saúde, porque as drogas

disponíveis apresentam elevada toxicidade e sérios efeitos adversos. A recidiva, a falha terapêutica

em pacientes imunodeprimidos e a resistência ao tratamento são fatores que motivam a busca de

uma droga ideal (LIMA et al., 2007; PIMENTEL et al., 2011). Apesar disso, a droga de primeira

escolha para o tratamento de todas as formas clínicas desta doença mesmo em casos de co-

infecção Leishmania – HIV é ainda o antimonial pentavalente. Além desse fármaco, o Ministério

da Saúde recomenda os medicamentos Anfotericina B (na apresentação desoxicolato e lipossomal)

29

e Pentamidina, como drogas de segunda escolha para o tratamento da LTA (BRASIL, 2010b;

BLUM et al., 2014; ARONSON et al., 2017).

A identificação da espécie de Leishmania associada às manifestações clínicas é

importante para a definição do melhor esquema terapêutico, uma vez que as espécies diferem

quanto à sensibilidade aos fármacos. Como observado em estudos que mostram o tratamento da

LTA em sua forma cutânea localizada causada por diferentes espécies do subgênero Viannia, tanto

no Peru quanto no Brasil, têm apresentado resultados controversos. No Peru, o fracasso da terapia

com antimonial pentavalente é mais associado à espécie L. (V.) braziliensis (AREVALO et al.,

2007), enquanto no Brasil, está mais associado a L. (V.) guyanensis (ROMERO et al., 2001),

sugerindo diferenças intrínsecas dos parasitos de diferentes regiões geográficas, bem como das

respostas dos hospedeiros, influenciando na eficácia do tratamento.

O antimoniato de N-metil glucamina apresenta-se em frasco de 5 mL (1 ampola),

correspondente a 405 mg de Sb+5, ou seja, cada 1 mL contém 81 mg de Sb+5. Para cada forma

clínica tem-se um esquema terapêutico preconizado. Nas formas cutâneas, a dose é de 10 a 20

mg/Sb+5/kg/dia; sugere-se 15 mg/Sb+5/kg/dia durante 20 dias seguidos, intramuscular ou

endovenoso. Se não houver cicatrização completa até três meses após o tratamento, o esquema

deverá ser repetido com duração de 30 dias. Se não tiver sucesso, utiliza-se a droga de 2ª escolha:

Anfotericina B ou Isotionato de Pentamidina. Na forma difusa, a dose é de 20 mg/Sb+5/kg/dia

durante 20 dias seguidos. As formas mucosas apresentam maior possibilidade de recidiva, assim,

terapia máxima é recomendado sendo usado, a dose de 20 mg/Sb+5/kg/dia durante 30 dias

consecutivos. Se não houver cicatrização após três meses do término do tratamento, deve ser

repetido o esquema apenas uma vez. Se não tiver resposta, deve utilizar uma das drogas de 2ª

escolha (BRASIL, 2010b).

Além da cardiotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, o antimoniato

pentavalente possui como efeitos colaterais: fadiga, dores pelo corpo, trombocitopenia,

leucopenia, pancreatite, artralgia, mialgia, anorexia, náuseas, vômitos e cefaleia (OLIVEIRA et

al., 2011; PACE, 2014).

A Anfotericina B clássica é efetiva na forma mucosa de leishmaniose, mas muito

tóxica e também passível de recidiva. Seu uso é limitado por suas reações adversas, incluindo

anafilaxia, trombocitopenia, dor generalizada, convulsões, calafrio, febre, flebite, anemia,

anorexia, diminuição da função tubular renal e hipocalemia em um terço dos pacientes. A dose

inicial da Anfotericina B é de 0,5 mg/kg/dia, aumentando gradativamente até 1 mg/kg/dia. A dose

máxima diária de 50 mg por aplicação, até a dose total de 1,0 a 1,5 g para LC e de 2,5 a 3,0 g para

LM ou LCM (BRASIL, 2010b).

30

A vantagem do uso da Anfotericina B Lipossomal fundamenta-se no fato dos

lipossomas serem fagocitados pelos macrófagos, sítio da infecção intracelular, interagindo

diretamente com o ergosterol do parasito e reagindo menos com o colesterol da célula do

hospedeiro, aumentando a eficácia da droga e sua tolerabilidade e assim reduzindo efeitos

colaterais, inclusive em pacientes sem resposta terapêutica aos antimoniais pentavalentes. No

entanto, seu uso é limitado pelo alto custo e administração endovenosa (SAMPAIO et al., 1971;

OLIVEIRA et al., 2011; BLUM et al., 2014; PACE, 2014;).

Existem outras drogas utilizadas no tratamento da leishmaniose, como: fluconazol,

cetoconazol, itraconazol, dapsona, alopurinol, pentamidina, pentoxifilina e sulfato de aminosidine.

Contudo, muitas não possuem resultados clínicos consistentes e suficientes para seu emprego

rotineiro (OLIVEIRA et al., 2011; BLUM et al., 2014; PACE, 2014; ARONSON et al., 2017).

1.7 MEDIDAS DE PREVENÇÃO E CONTROLE

Medidas relacionadas à prevenção e controle da LTA devem ser trabalhadas de forma

abrangente e estão fundamentadas em cinco pilares básicos: vigilância epidemiológica, atuação na

cadeia de transmissão, medidas administrativas, medidas relacionadas à educação e, mais

recentemente, o controle vacinal (BASANO & CAMARGO, 2004).

A vigilância epidemiológica da doença atua na caracterização de sua distribuição nas

diferentes regiões do país e permite um delineamento do perfil clínico e epidemiológico da LTA.

Deve ser embasada nas particularidades de cada localidade e direcionada para o diagnóstico

precoce e tratamento adequado dos casos (BASANO & CAMARGO, 2004; BRASIL, 2010a). A

atuação na cadeia de transmissão da LTA pode ser trabalhada por meio de estudos de vigilância

entomológica, que acrescentam informações úteis sobre as principais espécies de vetores

envolvidas no ciclo da doença e na determinação de zonas de risco para transmissão (BRASIL,

2010a). Além disso, existem as orientações dirigidas especificamente para o controle de vetores

como, por exemplo, o controle químico (uso de inseticidas no âmbito da proteção coletiva) e

limpeza de terrenos e ambientes peridomiciliares com o intuito de reduzir a reprodução dos

mosquitos (PIRAJÁ & LUCHEIS, 2014).

O pilar administrativo para o controle da doença está entrelaçado à estruturação da

rede de atenção à saúde, associada com permanente capacitação das equipes de saúde estaduais e

municipais. Isso é necessário, pois, um sistema de saúde devidamente estruturado, com planos de

ação e programações contínuas bem estabelecidas soma pontos positivos para otimizar o controle

da leishmaniose (GOMES & NEVES, 1998). Em relação à educação em saúde é necessário que

31

atitudes de prevenção e controle da doença sejam incorporadas na rotina da população, na forma

de atividades de conscientização sobre a doença e seus mecanismos de transmissão. Aliado a isso,

trazem resultados positivos a distribuição de repelentes, telas/mosquiteiros, otimização das

condições de trabalho, moradia e infra-estrutura da população, sem deixar de lado aquela que

reside em zona rural (BATISTA et al., 2014).

Tentativas de imunização de LTA demonstram, ao longo do tempo, que a

administração de parasitos seria capaz de induzir uma proteção imunológica na população. Este

fato instiga os pesquisadores na realização de estudos para o desenvolvimento de uma vacina

efetiva no controle e combate da LTA, essas pesquisas avaliam a eficácia de vacinas de primeira e

segunda geração (de LUCA, 1999; SALAY et al., 2007; KESHAVARZ et al., 2008).

As vacinas de primeira geração utilizam em sua formulação parasitos mortos ou

atenuados, entretanto as diferentes metodologias utilizadas na produção deste tipo de vacina

podem alterar a eficácia das mesmas, havendo ainda a necessidade de padronização dos métodos

de produção (de LUCA et al., 1999). Já as vacinas de segunda geração utilizam antígenos

imunogênicos conservados entre as espécies nas diversas fases do ciclo evolutivo das leishmanias,

sendo empregados mais comumente proteínas recombinantes, subunidades proteicas e

subunidades de DNA do protozoário. Antígenos de Leishmania indutores de resposta imune com

padrão Th1 em associação a adjuvantes são alvos de investigação para a formulação das vacinas

de segunda geração e mostram resultados promissores no campo da imunização

(KHAMESIPOUR et al., 2006; MATOS 2016).

32

2 JUSTIFICATIVA

A Leishmaniose Tegumentar apresenta formas clínicas distintas em sua etiologia,

epidemiologia, transmissão e distribuição geográfica. Durante o curso da infecção, cada fase é

desencadeada por interações de grupos distintos de moléculas do parasito com elementos

específicos da resposta imune (BALDWIN et al., 2003). Graus diferentes de virulência do parasito

podem ser apresentados por fenótipos distintos de Leishmania, resultando em espectros de

manifestações clínicas que variam de assintomáticas a fatais. Além de elementos relacionados ao

parasito, fatores genéticos e imunológicos do hospedeiro, associados a fatores ambientais regulam

a interação parasito - hospedeiro (CHANG et al., 2003). Portanto, é de grande importância para o

controle da LTA no Brasil, identificar quais são as principais espécies de Leishmania envolvidas

na infecção das populações Tocantinenses, pois a grande variabilidade genética observada tanto

nos indivíduos infectados quanto nos agentes etiológicos, dificulta a comparação de resultados

clínicos e de pesquisas científicas obtidos em outras regiões do país. O Tocantins está localizado

na região Norte do Brasil, é um estado de grande extensão territorial que faz divisa com outros

seis estados da federação brasileira (MA, PI, PA, BA, MT e GO) de diferentes regiões (Norte,

Centro-oeste e Nordeste) que apresentam predominância variada de espécies causadoras da

doença.

Assim, para se obter uma ideia mais correta do perfil da doença nas diferentes regiões

do Brasil, torna-se imprescindível a caracterização dos parasitos associada com o estudo

epidemiológico da doença no estado do Tocantins, visto que, não existe nenhum registro científico

até o momento que elucide essas questões.

O Ministério da Saúde do Brasil alterou as recomendações gerais sobre o manejo

terapêutico da LTA, anteriormente empregado, para a adequação do tratamento levando, agora,

em consideração tanto a forma clínica como a espécie de Leishmania infectante. No entanto, ainda

não existe na rotina dos serviços de saúde o acesso a exames que possibilitem elucidar a espécie

de Leishmania causadora de uma determinada infecção, dessa forma, a terapêutica deverá ser

baseada nas evidências pré-existentes sobre a circulação do parasito no possível local de infecção

da doença (BRASIL, 2017).

Assim sendo, está indicado, como primeira linha de tratamento para a LCL causada

por L.(V.) braziliensis o animoniato de N-metil glucamina ou anfotericina B lipossomal (nas

contra-indicações à meglumina). Já a LCL causada por L. guyanensis a recomendação é o uso do

isetionato de pentamidina ou anfotericina lipossomal (reservada para as contra-indicações de uso

da pentamidina) (BRASIL, 2017).

33

É fato que o tratamento inadequado tem uma relação altamente significativa com a

ocorrência de evolução da forma cutânea para a forma mucosa ou recidiva da doença, reforçando a

necessidade de identificação da espécie de Leishmania prevalente nas populações tocantinenesis e

ter conhecimento do perfil epidemiológico da doença no estado do Tocantins.

34

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Realizar a caracterização epidemiológica e molecular dos casos autóctones de LTA

notificados no estado do Tocantins no período de 2011 a 2015.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar os casos de LTA ocorridos no período de 2011 a 2015 no estado do Tocantins

registrados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN);

Descrever o perfil clínico-epidemiológico, diagnóstico e terapêutico dos pacientes com

LTA no estado do Tocantins;

Identificar a espécie de Leishmania prevalente nas populações tocantinenses mediante

técnicas moleculares;

Relatar a ocorrência de um caso atípico de LTA atendido no Serviço de Atenção

Especializada (SAE) de Porto Nacional - TO.

35

4 RESULTADOS

4.1 ARTIGO 1

American tegumentary leishmaniasis: epidemiological and molecular characterization

of the prevalent Leishmania species in the state of Tocantins, Brazil, 2011-2015

Autores: Carina Scolari Gosch, Cálita Pollyanna Marques, Bruna Silva Resende, Joandson dos

Santos Souza, Ray Ameida da Silva Rocha, Deyse Sabrinne Souza Lopes, Marcelo

Scolari Gosch, Fátima Ribeiro Dias, Miriam Leandro Dorta

Artigo publicado na Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. Aceite para

publicação do manuscrito está apresentado no Anexo 6.

4.2 ARTIGO 2

Case report: Atypical Leishmaniasis due to coinfection by different species of

Leishmania

Autores: Carina Scolari Gosch, Bruna Silva Resende, Calita Pollyanna Marques, Sebastião Alves

Pinto, Adriano Cappellazzo Coelho, Sílvia Reni Bortolin Uliana, Célia Bastos

Amorim, Ledice Inácia Araújo Pereira, Fátima Ribeiro-Dias, Miriam Leandro Dorta

Submetido ao American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. Confirmação da

submissão do manuscrito está apresentada no Anexo 7.

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Artigo 1

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Artigo 2

CASE REPORT: ATYPICAL LEISHMANIASIS DUE TO COINFECTION BY DIFFERENT SPECIES OF Leishmania

Carina S. Gosch1, Bruna S. Resende1, Célia B. Amorim2, Cálita P. Marques3, Ledice I. A.

Pereira4, Sebastião A. Pinto5, Silvia R. B. Uliana6, Adriano C. Coelho7, Fátima Ribeiro-Dias3, Miriam L. Dorta3

1Faculdade Presidente Antônio Carlos-Porto Nacional, TO, Brasil; 2Serviço de Atenção Especializada de Porto Nacional, TO, Brasil, 3Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, GO, Brasil; 4Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad, GO, Brasil; 5Instituto Goiano de Oncologia e Hematologia, GO, Brasil; 6Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, SP, Brasil; 7Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasil. ABSTRACT The disseminated form of Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is a serious and rare disease, being diagnosed in 2% of the cutaneous cases registered per year in Brazil. The main characteristic is the appearance of multiple pleomorphic lesions on the cutaneous surface. A 68 - year - old male from the rural area of Tocantins, Brazil, presented atypical disseminated leishmaniasis. The clinical course and histopathological and immunological findings presented a mixed pattern that hindered diagnosis and therapeutic management. Molecular typing revealed a mixed infection with L. (V.) guyanensis and L. (L.) amazonensis. Molecular identification of the agents responsible for ACL is important for adequate therapeutic planning, minimizing the possibility of sequels that impact the quality of life of the patient. Key-words: Tocantins. Disseminated Leishmaniasis. Co-infection. INTRODUCTION

Disseminated leishmaniasis is considered a severe and rare form, occurring in approximately 2% of the cutaneous cases diagnosed per year in Brazil. This form of presentation is characterized by the appearance of multiple papular lesions and acneiform appearance that affect several body segments, frequently involving the face and the trunk1. There has been an increase in the number of atypical clinical manifestations of ACL reported in several scientific studies2; 3; 4; 5; 6, justifying the publication of this clinical report that presents an atypical form of disseminated leishmaniasis in individuals with mixed infection by different species of Leishmania. CASE REPORT

Patient L.D.O., male, 68 years old, caucasian, retired, from Ponte Alta - Tocantins/Brazil. He sought medical assistance because of the acneiform lesion in the lower left limb that progressed with the appearance of multiple pleomorphic lesions ranging from ulcerated, nodular and vegetative lesions. Direct parasitological examination of lesion scaling was positive for Leishmania sp. He was treated with pentavalent antimonial (15 mg Sb+5/kg/day) for 30 days, without response. The clinical picture deteriorated with lesions increasing in number and size, and spreading to the face, upper limb and abdomen. The case was then classified as disseminated leishmaniasis. Treatment with 100 mg/day liposomal amphotericin B (AmBisome; Giléad - United) was initiated and given for 7 days.Three months after treatment, lesions on lower limb had healed but other lesions showed signs of secondary infection (Figure 1A and B).

Based on clinical observations and treatment outcome, the following exams were performed: excisional biopsy of a lesion present in the lower limb for histopathological analysis, immunocytochemistry and molecular typing of the Leishmania species; blood collection for the evaluation of the humoral immune response by indirect immunofluorescence (IFI) and serologies for HIV and viral hepatitis; Montenegro skin test for the evaluation of the cellular immune response.

Histopathological examination revealed acanthous epidermis exhibiting pseudoepitheliomatous hyperplasia with severe non-granulomatous chronic lymphoplasmacytic inflammatory reaction, compromising superficial and deep dermis (Figure 2A and B). Macrophages with a clear cytoplasm pattern containing phagocytic vacuoles that have spherical

48

structures morphologically compatible with amastigote forms of Leishmania sp. were observed. (Figure 2C and D).

Immunocytochemical analysis with specific anti-Leishmania antibodies was positive, confirming the presence and abundance of Leishmania sp. in the lesion (Figure 2E and F). The IFI presented 1/320 titre and the Montenegro skin test was negative after 72 hours. Serologies for HIV and viral hepatitis were negative.

The DNA of excisional biopsy was extracted and the polymerase chain reaction was performed with specific fragment digestion using restriction enzymes HAE III and AVA I (PCR-RFLP, VOLPINI et al.7), resulting in Leishmania (Viannia).

Alternatively, the DNA obtained from the biopsy was also used for the amplification of the ribosomal RNA coding region (ITS1, 5.8S and ITS2).8 The PCR product was sequenced.9 Sequence analysis indicated that some had a 99.9% genetic identity with the reference strain Leishmania (Leishmania) amazonensis M2269, while others had 99.8% genetic identity with the reference strain Leishmania (Viannia) guyanensis M4147. The results obtained indicate, therefore, the presence of mixed infection by L. (L.) amazonensis and L. (V.) guyanensis.

A new course of treatment with amphotericin B (50 mg/day) was performed for 12 days (Figure. 1C), being interrupted due to adverse effects such as acute renal dysfunction (serum creatinine 2.3 mg/dL) and pulmonary thromboembolism. The medication was changed to liposomal amphotericin B (AmBisome; Giléad - United) at a dose of 150 mg/day for 25 days.

Lesions healed completely (Figure 1D and E) however, residual lymphedeme in the left ankle remained, disabling the routine activities of the patient.

Eighteen months after the first evaluation of humoral and anti-Leishmania cellular immune responses, the exams were repeated and serology by the IFI technique showed a decrease in circulating antibody titers to 1/80 and the Montenegro skin test remained negative.

Figure 1. Patient with disseminated cutaneous leishmaniasis. (A and B) Cutaneous lesions after treatment with pentavalent antimonial (15 mg / kg / day for 30 days) and first liposomal amphotericin B (100 mg / day for 7 days); (C and D) Cutaneous lesions during treatment with amphotericin B deoxycholate (50 mg / day for 12 days and amphotericin B liposomal 150 mg / day for 25 days); (D and F) Healing of skin lesions after treatment.

49

Figure 2. Photomicrography of cutaneous lesion. Biopsy fragments were prepared with HE (A, B, C and D) and IHC (E and F). (A) Skin with epidermis exhibiting pseudoepitheliomatous hyperplasia, dermis with severe non-granulomatous chronic inflammatory reaction. (B) Dermal-epidermal border with rich infiltrate of lymphoid and plamocyte cells. (C) Vacuolated macrophages containing amastigotes. (D) Amastigotes forms (arrow). (E and F) Amastigotes labeled ICH. HE = Hematoxylin-eosin, IHC = immunocytochemistry, leishmania stained with brown.

DISCUSSION

Different species of Leishmania of the Viannia subgenus L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) panamensis and the species L. (L.) amazonensis were already recognized as etiological agent of disseminated leishmaniasis.10; 11; 12; 13 However, there are differences in the clinical, therapeutic, histopathological and immunological characteristics of the disseminated leishmaniasis caused by the species belonging to the subgenus Viannia when compared to those caused by the species L. (L.) amazonensis.10; 11

Disseminated leishmaniasis caused by species belonging to the subgenus Viannia, in general, are characterized by the presence of multiple (10-700) pleomorphic skin lesions (acneiform, papular and ulcerated) in different anatomical regions, appearing simultaneously or secondary to one or more several primary lesions, after a short time. There may be involvement of mucous membranes. There is presence of cellular immune response to Leishmania antigen (positive Montenegro skin test) and low titers of circulating antibodies. Histologically, the exudative reaction, lymphoplasmocytic, with few parasitized macrophages, predominates in areas

50

of necrosis associated or not with epithelioid granuloma. Good therapeutic response to pentavalent antimonials and other drugs of choice for the treatment of ACL.10; 13; 14; 15; 16; 17; 18

When disseminated leishmaniasis is caused by L. (L.) amazonensis, a reduced number of primary lesions (1-3) with an erythematous infiltrated plaque appearance are observed. The spread to other anatomical sites is late, taking on average 6 to 12 months, producing few metastatic lesions. There is no mucosal involvement. The cellular immune response is deficient or absent (negative Montenegro skin test), and may or may not have serum conversion at the end of treatment. Elevated circulating antibody titers are observed. Histologically there is a predominance of vacuolated, richly parasitized macrophages and rare epithelioid cell groups. Therapeutic resistance, requiring a prolonged period of treatment, but healing is obtained.10; 11; 19; 20; 21

The present study reports a case of atypical disseminated leishmaniasis due to a mixed infection with L. (V.) guyanensis and L. (L.) amazonensis, resulting in an ambiguous clinical, therapeutic, histopathological and immunological picture that made diagnosis and therapy difficult.

The clinical characteristics of the patient, pleomorphic lesions in the form of ulcerative and ulcer-vegetative nodules, and the rapid spread to adjacent areas are consistent with the disseminated form caused by Leishmania (Viannia). Thus, it was expected that the disease would be resolved with the use of pentavalent antimonial, since this group of Leishmania normally responds well to treatment.10; 14; 18; 22 However, there was progression of the disease and dissemination to other anatomical regions. SILVEIRA et al.21 verified that the cases of disseminated leishmaniasis by L. (L.) amazonenesis require a treatment regimen with pentavalent antimonial with twice the total dose used for L. (Viannia), and sometimes several cycles are necessary, justifying the initial therapeutic failure.

GUIMARÃES23 suggested that amphotericin B should be considered the drug of choice for all patients diagnosed with atypical forms of ACL. Our patient made use of liposomal amphotericin B for 7 days, with partial healing of the lesions. A therapeutic regimen with amphotericin B deoxycholate was required for 12 days, followed by liposomal amphotericin B for another 25 days.

The therapeutic failure observed in this case may be due to the fact that infections caused by L. (V.) guyanensis induce less intense cellular and humoral immune response than L. (V.) braziliensis, even though the appearance of ulcers is clinically similar, explaining the greater number of parasites in the lesions and the higher therapeutic failure for this species.24 In addition, L. (L.) amazonensis presents a high capacity to block specific cellular immune responses to Leishmania antigens, making it difficult to control infection.25; 26; 27

Histopathological and immunocytochemical analysis revealed a mixed profile of inflammatory response. A large number of macrophages with amastigote forms were observed, with 1 to 3 parasites per infected cell, sheltered in large parasitophorous vacuoles, compatible with L. (L.) amazonensis infection.28; 29 In addition, a large non-granulomatous inflammatory response with lymphoplasmacytic infiltrate and epithelial cells in the superficial and deep dermis was observed, similar to that reported by COUPPIÉ et al.12 in a patient with a disseminated form caused by L. (V.) guyanensis.

The IFI technique is a useful method for the diagnosis, control of clinical cure and analysis of the efficacy of theadopted therapeutic regimen.30 In patients with disseminated leishmaniasis caused by L. (V.) braziliensis, low to moderate levels (mean 640) of anti-Leishmania IgG were observed by CHAGAS et al.19; 20, in contrast, cases of disseminated leishmaniasis by L. (L.) amazonensis presented high levels of these antibodies (mean titre 5,120), indicating a lower activation of the CD4+/Th1 immune response in these patients. In our findings, the immune response also presented amixed pattern, since low antibody titers were detected during disease (1/320) and decreased after clinical resolution (1/80). However, the cellular immune response to Leishmania antigen remained negative, even after different therapeutic regimens and clinical cure, similar to that observed by CARVALHO et al.10 in cases of disseminated leishmaniasis by L. (L.) amazonensis.

During the DNA sequencing of the of the clones, a ratio of 6:1 was observed, corresponding to L. (L.) amazonensis and L. (V.) guyanensis respectively.This difference in Leishmania concentration confirms the increased resistance of L. (L.) amazonensis to the therapies employed, since the sample was collected after treatment with pentavalent antimonial and liposomal amphotericin B for 7 days. Thus, it is explained that all the parasitophores vacuoles observed had large dimensions. Thus, in atypical cases, more detailed molecular investigation may be required.

51

According to RAJA et al.31, the appearance of unusual clinical lesions of leishmaniasis is attributed to a depressed host immune response, comorbidities, pregnancy, or involvement of an atypical parasite strain in the lesions. In this case, the co-infection L. (L.) amazonensis and L. (V.) guyanensis influenced the natural course of disease evolution, resulting in mixed clinical, therapeutic, histopathological and immunological characteristics of the different patterns of disseminated leishmaniasis.

The molecular identification of Leishmania species is of great importance for the establishment of adequate therapeutic planning to avoid that the lesions evolve and impact on the quality of life of the patient.

FINANCING This study was funded by the research project "Epidemiology of American Cutaneous Leishmaniasis: molecular diagnosis of leishmaniasis species incident to the population of Tocantins", funded by CNPq, in the FAPT / PPSUS Notice No. 01/2014, coordinated by Prof. Dr. Miriam Leandro Dorta, headquartered at the Faculdade Presidente Antônio Carlos - Porto Nacional (FAPAC / ITPAC-PORTO). RESUMO A leishmaniose disseminada (LD) é uma doença grave e rara, sendo diagnostica em 2% dos casos cutâneos registrados por ano no Brasil. A principal característica é o surgimento de múltiplas lesões pleomórficas na superfície cutânea. Homem de 68 anos, procedente da zona rural do Tocantins apresentou LD atípica devido à infecção mista de L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis. As características clínicas, histopatológicas, imunológicas e evolução da doença apresentaram padrão misto que dificultou o diagnóstico e a conduta terapêutica. A identificação molecular dos agentes responsáveis pela LTA é importante para um planejamento terapêutico adequado, minimizando a possibilidade de seqüelas que impactam na qualidade de vida do paciente. Palavras-chave: Tocantins. Leishmaniose Disseminada. Infecção Mista. CO-AUTHOR CONTACT INFORMATION Bruna Silva Resende. Faculty President Antônio Carlos-Porto Nacional, TO, Brazil. bruna_s.resende@hotmail.com

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22- Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasília: Ministério da Saúde; 2010. Available at: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_vigilancia_leishmaniose_tegumentar_americana.pdf. Accessed March 20, 2017. 23- Guimarães LH, Machado PRL, Lago EL. Morgan DJ, Schriefer A, Bacellar O, Carvalho EM, 2009. Atypical manifestations of tegumentary leishmaniasis in a transmission area of Leishmania braziliensis in the state of Bahia, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg 103: 712-715. 24- Matta NE, Nogueira RS, Franco AM, de Souza SI, Mattos MS, Oliveira-Neto MP, Coutinho SG, Leon LL, Da-Cruz AM, 2009. Leishmania (Viannia) guyanensis induces low immunologic responsiveness in leishmaniasis patients from an endemic area of the Brazillian Amazon Highland. Am J Trop Med Hyg 80: 339-344. 25- Barral A, Costa JML, Bittencourt AL, Barral-Neto M, Carvalho EM, 1995. Polar and subpolar diffuse cutaneous leishmaniasis in Brazil: clinical an immunopathologic aspects. Int J Dermatolol 34: 474-479. 26- Barral A, Barral-Netto M, 2009. Aspectos imunológicos da leishmaniose cutânea difusa (LCD). Gaz Méd Bahia 79: 35-39. 27- Scott P, Novais, FO, 2016. Cutaneous leishmaniasis: immune responses in protection and pathogenesis. Nature 16: 581-592. 28- Barbieri CL, Brown K, Rabinovitch M, 1985. Depletion of secondary lysosomes in mouse macrophages infected with Leishmania mexicana amazonensis: a cytochemical study. Z Parasitenkd. 71: 159-68. 29- Veras PS, de Chastellier C, Moreau MF, Villiers V, Thibon M, Mattei D, Rabinovitch M, 1994. Fusion between large phagocytic vesicles: targeting of yeast and other particulates to phagolysosomes that shelter the bacterium Coxiella burnetii or the protozoan Leishmania amazonensis in Chinese hamster ovary cells. Journal of cell science 107: 3065-76. 30- Souza WJS, Coutinho SG, Marzochi MCA, Toledo LM, Gottlieb MV, 1982. Utilização da reação de imunofluorescência indireta no acompanhamento da terapêutica da leishmaniose tegumentar americana. Mem Inst Oswaldo Cruz77: 247-253. 31- Raja KM, Khan AA, Hameed A, Rahman SB., 1998. Unusual clinical variants of cutaneous leishmaniasis in Pakistan. Br J Dermatolol 139: 111-113.

54

5 DISCUSSÃO

A importância da leishmaniose tegumentar no contexto da saúde pública

vem aumentando devido à modificação de suas características epidemiológicas

(ANDRADE et al., 2012; ROCHA et al., 2015). No passado, era considerada uma

zoonose essencialmente silvestre, no entanto, esse quadro vem mudando devido às

alterações socioeconômicas do país, tendo sido, observado nas últimas décadas um

aumento no registro de casos na zona rural e até mesmo no ambiente urbano, peri e

intradomiciliar (BATISTA et al., 2014). No estado do Tocantins, a maior incidência

dos casos registrados de LTA ocorreu na zona rural, sendo os homens os mais

acometidos pela doença.

Rocha et al. (2015) referem que, o percentual de homens acometidos pela

LTA é maior, por se exporem com mais frequência ao ambiente extradomiciliar devido

a atividades laborais e/ou lazer, principalmente as realizadas em locais próximos a

matas, o principal habitat do inseto vetor da LTA.

A forma clínica predominantemente de LTA no estado do Tocantins foi

cutânea (94,5%), semelhante aos estudos realizados por Rocha et al. (2015), Xavier,

Mendes, Rossi-Barbosa (2016) e Cruz (2016) nos estados de Alagoas, Minas Gerais e

Ceará.

Apesar de várias espécies de Leishmania estarem envolvidas na manutenção

da LTA no país, a L. (V.) braziliensis é a espécie predominante como agente etiológico

(MARTINS; ALEXANDRINO; GUIMARÃES, 2010). Esse perfil epidemiológico foi

observado no estado do Tocantins, 90% das amostras foram identificadas com L. (V.)

braziliensis e apenas 8% como L. (L.) amazonensis. Andrade Filho et al. (2001)

registraram que, no estado do Tocantins há presença dos vetores Lutzomya whitmani e

L. flaviscutellata, principais agentes transmissores dessas espécies, respectivamente.

Mas, sabe-se que o L. flaviscutellata é um flebotomíneo de hábitos noturnos e pouco

antropofílico. Portanto, a infecção humana por L. (L.) amazonensis não é comum em

áreas de colonização antiga ou modificadas pela ação da agricultura ou pecuária, sendo

geralmente adquirida pelos indivíduos que penetram na mata fechada, principalmente

no crepúsculo ou noite (LAINSON & SHAW, 1974; SILVA et al., 1981; BRASIL,

2010ª). Situação favorável ao paciente L. D. O. Que reside em uma chácara no

município de Ponte Alta – TO, Brasil, exercendo atividade profissional ligada à

pecuária e agricultura.

55

O presente estudo relata um caso, dentre os notificados como forma cutânea

no estado do Tocantins, que apresenta uma manifestação atípica de LD devido à

infecção mista por L. (L.) amazonensis e L. (V.) guyanensis.

A L. (L.) amazonensis está envolvida no desenvolvimento da forma cutânea

localizada ou disseminada e cutânea difusa. A forma disseminada da LTA é considerada

uma forma grave e rara, que ocorre em aproximadamente 2% dos casos cutâneos

diagnosticados por ano no Brasil (BRASIL, 2009), a maior frequência está relacionada a

homens que desempenham atividade profissional com maior probabilidade de exposição

aos vetores (LAINSON, 1983; CARVALHO et al., 1994; COSTA, 2005; BRASIL,

2009).

A L. (V.) guyanensis tem epidemiologia aparentemente limitada à região

Norte do Brasil e assim como outras espécies do subgênero Viannia está relacionada às

formas cutâneas localizadas e disseminada da LTA, (LAINSON & SHAW, 1978;

LAINSON, 1981; COUPPIÉ et al., 2004; BRASIL, 2010ª). Não havia registro, até o

momento, de casos de LTA causados por essa espécie no estado do Tocantins.

A princípio, a LD pode ser clinicamente confundida com a LCD, entretanto,

apresentam características clínicas, laboratoriais, terapêuticas e evoluções distintas. As

características da LD dependem da espécie de Leishmania envolvida na infecção.

Quando as espécies fazem parte do subgênero Viannia, observam-se

múltiplas lesões pleomórficas em diferentes regiões anatômicas, em curto período. A

resposta imunológica celular ao antígeno de Leishmania é preservada (IDRM positivo),

histologicamente há escassez de leishmanias, intensa inflamação crônica granulomatosa

com infiltrado linfoplasmocitário, células gigantes e epiteliais, e boa resposta

terapêutica aos antimoniais pentavalentes e demais drogas de escolha para o tratamento

da LTA (COSTA et al., 1986; CARVALHO et al., 1994; FERREIRA et al., 2016;

HASHIGUCHI et al., 2016; SOUSA; POMPEU; PEARSON, 2016; , MEMBRIVE et

al., 2017).

A LD causada pela espécie L. (L.) amazonensis apresenta aspectos

diferentes daquela causada pela L. (V.) braziliensis: disseminação lenta e tardia; número

menor de lesões metastáticas geralmente localizadas nas extremidades; sem

acometimento de mucosas; IDRM inicialmente negativa; resposta ao tratamento lenta,

sendo necessários esquemas mais prolongados (CARVALHO et al., 1994; CHAGAS;

CORRÊA; SILVEIRA, 1999, 2001; SILVEIRA; LAINSON; CORBETT, 2004, 2005;

REITHINGER et al., 2007).

56

A infecção mista por essas duas espécies promoveu um padrão ambíguo nas

características de LD, resultando num perfil atípico da doença. Sendo observadas

manifestações clínicas, (forma de lesão, número de lesões e rápida disseminação),

baixos títulos de anticorpos, intensa resposta inflamatória com infiltrado

linfohistoplasmáticos e células epiteliais, típico da infecção causada por L. (V.)

guyanensis e ausência de resposta imune celular específica aos antígenos de

Leishmania, riqueza parasitária nas lesões, resistência aos diferentes esquemas

terapêuticos empregados, semelhante às infecções causadas por L. (L.) amazonensis.

Essas características mistas dificultaram o diagnóstico e o emprego de uma conduta

terapêutica mais apropriada, tendo como consequência longo tempo de doença e

sequelas que comprometeram a qualidade de vida do paciente.

Assim, o diagnóstico molecular é de grande importância para a definição do

agente etiológico responsável pela doença, principalmente nos casos atípicos de LTA.

57

6 CONCLUSÕES

Dentro do período de estudo, 2011 a 2015, identificaram-se 1434 casos de LTA

autóctones notificados junto ao SINAN no estado do Tocantins.

O perfil clínico epidemiológico revelou que houve maior incidência dos casos

em homens com idade acima de 60 anos, residentes em zona rural, com etnia

mista e baixa escolaridade. Houve predominância da forma clínica cutânea, com

diagnóstico realizado principalmente na modalidade laboratorial. Verificou-se

ainda boa resposta terapêutica com uso de antimoniato pentavalente.

Nas 271 amostras de DNA extraídas de lâminas positivas de exame

parasitológico direto, oriundas dos 32 municípios situados nas 8 regiões de

saúde do estado do Tocantins, a Leishmania (Viannia) braziliensis foi a espécie

mais prevalente estando presente em 252 amostras (92%).

A identificação molecular da espécie de Leishmania mostrou-se uma condição

importante para o sucesso do tratamento dos casos atípicos, como o do relato de

infecção mista por L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis.

Esses achados apontam a importância de se conhecer a epidemiologia da doença

e as espécies de leishmanias prevalentes no Tocantins a fim de facilitar a

elaboração de um planejamento terapêutico adequado a essa população,

evitando-se recidivas e/ou evolução das lesões causando impactos na qualidade

de vida do paciente.

58

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72

ANEXOS Anexo 1 – Concessão dos dados oficiais de notificação pelo departamento de Assessoria Técnica das Leishmanioses SVPPS/DVEDVZ/GDVZ da Secretaria Estadual de Saúde do Tocantins (SESAU-TO).

73

Anexo 2 – Concessão das lâminas de exame parasitológico direto pelo departamento de controle de qualidade da LTA do Laboratório Central de Saúde Pública do Tocantins (LACEN-TO).

74

Anexo 3 – Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)

75

Anexo 4 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás-GO sob o n° 35963214.6.0000.5078

76

77

Anexo 5 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade FAHESA/ITPAC sob o n° 35963214.6.3002.0014

78

79

Anexo 6 – Aceite para publicação do manuscrito (Artigo 1) na Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.

80

Anexo 7 – Confirmação da submissão do manuscrito (Artigo 2) ao American Journal of Tropical Medicine and Hygiene.