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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE VEGETAL
ELIENAI CANDIDA E SILVA
Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (BROMELIACEAE) CULTIVADA IN VITRO E EX
VITRO: MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRAESTRUTURA
Goiânia, GO - Brasil
Junho de 2016
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TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZARAS TESES E
DISSERTAÇÕESELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a
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partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Elienai Candida e Silva
E-mail: [email protected]
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Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento: Sigla:
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título: Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro e ex vitro: morfologia,
anatomia e ultraestrutura
Palavras-chave: Aclimatização; Crescimento in situ; Sistema mixotrófico; Vedação do recipiente.
Título em outra língua: Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivated in vitro and ex
vitro: morphology, anatomy and ultrastructure
Palavras-chave em outra língua: Acclimatization. Flasks sealing. In situ development. Mixotrophic system
Área de concentração: Botânica
Data defesa: 31/03/2016
Programa de Pós-Graduação: Biodiversidade Vegetal
Orientador(a): Dra. Dalva Graciano Ribeiro
E-mail: [email protected]
Co-orientador(a):* Dra. Letícia de Almeida Gonçalves
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________________________________________ Data: ____ / ____ / _____
Assinatura do(a) autor(a)
1Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita
justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de
embargo.
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ELIENAI CANDIDA E SILVA
Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (BROMELIACEAE) CULTIVADA IN VITRO E EX
VITRO: MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRAESTRUTURA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Biodiversidade Vegetal do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como
requisito para a obtenção do título de Mestre em
Biodiversidade Vegetal
Orientadora: Profª Drª Dalva Graciano Ribeiro
Co-orientadora: Profª Drª Letícia de Almeida
Gonçalves
Goiânia, GO - Brasil
Junho de 2016
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Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.
CDU 581
Silva, Elienai Candida e Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada invitro e ex vitro: morfologia, anatomia e ultraestrutura [manuscrito] /Elienai Candida e Silva. - 2016. 122 f.
Orientador: Profa. Dra. Dalva Graciano Ribeiro; co-orientadoraDra. Letícia de Almeida Gonçalves. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Institutode Ciências Biológicas (ICB), Programa de Pós-Graduação emBiodiversidade Vegetal, Goiânia, 2016. Bibliografia. Inclui siglas, fotografias, gráfico, tabelas, lista de figuras, lista detabelas.
1. Aclimatização. 2. Crescimento in situ. 3. Sistema mixotrófico. 4.Vedação do recipiente. I. Ribeiro, Dalva Graciano, orient. II. Título.
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Aos meus pais, José Luiz da Silva e Aparecida Cândida da Silva pelo cuidado e apoio
incondicional.
Aos amigos, pela cumplicidade.
À Profª. Drª Letícia de Almeida Gonçalves, cuja dedicação e profissionalismo são exemplos “O
professor [...], nenhum desses passa pelos alunos sem deixar sua marca.” (Paulo Freire)
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AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus acima de tudo, Amigo, Pai e único Senhor. Obrigada por estar comigo em
todos os momentos.
À Universidade Federal de Goiás (UFG), ao Departamento de Botânica e ao Programa de
Pós-graduação em Biodiversidade Vegetal (PPGBV) pela oportunidade de realização deste
mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de estudos; e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás
(FAPEG) pelo auxílio financeiro.
À Drª. Letícia de Almeida Gonçalves, exímia Professora e pesquisadora. Obrigada pelos
conselhos e ensinamentos que foram para além da construção deste trabalho. Obrigada pela
paciência, motivação, amizade, ajuda e por todas as vezes que me tranquilizou quando foi
preciso. Obrigada por me receber, formar e pela oportunidade de grandes aprendizados. A
senhora é meu exemplo! Muito obrigada por tudo!
Ao Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV)
da UFG pelo auxílio técnico e pelas valiosas contribuições na construção deste trabalho.
Agradeço em especial à Msc. Fernanda Fernandes por todo auxílio, você é 10! Obrigada pela
paciência, ensinamentos e por ter me recebido tão bem no LCTV.
À Empresa de Assistência Técnica, Extensão Rural e Pesquisa Agropecuária do Estado
de Goiás (EMATER-GO) e à Profª. Drª. Maurízia de Fátima Carneiro pelo fornecimento das
sementes da espécie em estudo.
Ao Laboratório de Microscopia de Alta Resolução (LabMic/UFG) e ao Centro Regional
para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (Crti/UFG) pelo auxílio técnico. Aos
Professores Dr. Pedro Vale de Azevedo Brito e Drª. Fernanda Cristina Alcantara dos Santos pelo
auxílio na preparação das amostras para análise em microscopia eletrônica de transmissão.
Ao amigo Thársis Gabryel pela disponibilidade e paciência ao me ensinar a realizar as
análises estatísticas. E ao Prof. Dr. Robson Maia Geraldine pelo auxílio nas mesmas.
À Drª. Divina Vilhalva pela amizade e ensinamentos no laboratório de Anatomia Vegetal.
Ao grande amigo Msc. Rodolph Delfino Sartin pelo incentivo, discussões e ensinamentos
que somaram para a construção deste trabalho.
Aos Profs. Dr. Hyrandir Cabral de Melo e Dr. Renê Gonçalves da Silva Carneiro pelas
valiosas contribuições na redação final do trabalho.
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Aos companheiros de turma do PPGBV, em especial ao Alex Cunha pelo auxílio,
amizade e parceria na Anatomia Vegetal; a Alline França e a amiga Francielle Karla por serem
exemplos de força, coragem e determinação.
À turma do Laboratório de Anatomia Vegetal: Denise, Paulo Antônio, Maria Eunice,
Fernanda Alves, Emily e Isabella. Obrigada pela paciência, ensinamentos e pelos momentos de
descontração. Em especial à Nauany Sales, pela amizade, companheirismo e ajuda no laboratório
e no campo. E a Priscila Silva pelos momentos de troca de experiência.
Aos professores Dr. Tomás de Aquino Portes por ceder à imagem do telado presente
neste trabalho; Drª. Maria Helena Rezende e Drª. Moemy Gomes de Morais pelo apoio e
incentivo e; Drª. Dalva Graciano Ribeiro por sua colaboração.
Aos amigos, Msc. Marina Alves; Camila Borges; Marco Antônio; Brucce e Rogério
Coutinho pelo auxílio.
Aos meus pais José Luiz da Silva e Aparecida Cândida da Silva, meus alicerces.
Obrigada pelo apoio em todos os momentos e por me ensinarem os valores da vida e o respeito
ao próximo. E às minhas irmãs Raquel e Sulamita. Família muito amada, minha base e meu
exemplo.
A todos que de alguma maneira contribuíram com este trabalho, muito obrigada!
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RESUMO
Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro e ex vitro:
morfologia, anatomia e ultraestrutura - Plantas desenvolvidas in vitro possuem características
que dificultam sua sobrevivência quando transferidas diretamente da condição in vitro para o
ambiente natural, evidenciando a necessidade de aclimatização. A caracterização estrutural e
fiosiológica de plantas desenvolvidas in vitro e ex vitro são importantes para o aprimoramento
das técnicas e, contribuem com informações sobre a plasticidade fenotípica de plantas
submetidas a diferentes condições ambientais. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os
aspectos morfológicos, anatômicos e ultraestruturais de Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker
cultivada in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio, e aclimatizada. A.
bromeliifolia é de interesse ornamental e, por isso, o Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais
da Universidade Federal de Goiás tem realizado trabalhos visando sua propagação in vitro.
Foram analisadas plantas cultivadas in vitro em tubos de ensaio sob três tipos de vedação: tampa
rígida de polipropileno (TP), filme de policloreto de vinila (FPVC) e tampa rígida de
polipropileno coberta com membrana microporosa (TM). Para efeito de comparação, plantas de
sementes germinadas em telado também foram avaliadas. As plantas aclimatizadas foram
mantidas em casa de vegetação em condições controladas e foram avaliadas após 11 meses.
Plantas coletadas in situ foram utilizadas para efeito de comparação. Entre as plantas
desenvolvidas in vitro, as desenvolvidas em tubos vedados com TM se assemelharam mais
àquelas cultivadas em telado, principalmente quanto à abertura dos estômatos e a ultraestrutura
dos cloroplastos. Nas folhas das plantas aclimatizadas algumas características morfológicas e
anatômicas são diferentes das que ocorrem nas plantas desenvolvidas in situ: as fibras associadas
aos feixes possuem paredes menos espessas e as fibras hipodérmicas, se organizam em menor
número de camadas, além de terem também paredes menos espessas. Além disso, os estômatos
ocorrem menos aprofundados na epiderme nas folhas desenvolvidas na casa de vegetação.
Considerando, contudo, que a maioria das características morfológicas, anatômicas e
ultraestruturais das folhas das plantas aclimatizadas são semelhantes àquelas que ocorrem nas
folhas das plantas desenvolvidas in situ, é possível concluir que o processo de aclimatização e o
ambiente de casa de vegetação não restringiram seu desenvolvimento, resultado que favorece o
estabelecimento destas plantas em condições de ambiente natural.
Palavras-chave: Aclimatização. Crescimento in situ. Sistema mixotrófico. Vedação do
recipiente.
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ABSTRACT
Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivated in vitro and ex vitro:
morphology, anatomy and ultrastructure – In vitro-grown plants have functional
characteristics that difficult their survival when transferred directly from in vitro conditions to
the natural environment, thus needing of acclimatization. Structural and phyisiological
characteristic of the plants grown in vitro and ex vitro are important for technical adjustments
and contribute to further information about the phenotypic plasticity of the plants exposed to
different environmental conditions. Therefore, the aim of this study was to evaluate the
morphology, anatomy and ultrastructure of Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker grown in vitro
under different sealing lids of test tubes, and acclimatized. A. bromeliifolia is on ornamental
species and therefore, the Plant Tissue Culture Laboratory of Universidade Federal de Goiás
(UFG) has accomplished studies aiming to propagation in vitro. Plants cultured in vitro in test
tubes with three sealing lids were analyzed: polypropylene rigid closure (PC), polyvinyl chloride
film (PVC) and PC covered with a microporous membrane (PM). For comparison, plants
germinated from seeds in a screen house were also analyzed. The acclimatized plants were
maintained in a greenhouse under controlled conditions and were evaluated after 11 months. The
in situ-grown plants were used for comparison. Among the in vitro-grown plants, those grown in
tubes sealed with PM are more similar to those grown in screen house, mainly on opening of the
stomata and chloroplasts ultrastructural. In the leaves of acclimatized plants some morphological
and anatomical characteristics are different from those that occur in the leaves of in situ-grown
plants: fibers associated to the vascular bundles have less wall thickness and the hypodermic
fibers are organized into least number of layers in addition, they also less wall thickness.
Moreover, the stomata occurs less depth in the epidermis in the leaves developed in the
greenhouse. However, considering that most morphological, anatomical and ultrastructural
characteristics of the leaves of the acclimatized plants are similar to those that occur in the leaves
of in situ-grown plants, is possible concluded that the acclimatization process and the greenhouse
environmental did not restrict its development, result that favoring the establishment of these
plants in natural environmental.
Keywords: Acclimatization. Flasks sealing. In situ development. Mixotrophic system.
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LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1 - Aechmea bromeliifolia no Parque Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil ............ 23
CAPÍTULO I
Figura 1 - Tipos de vedações dos tubos de ensaio utilizados no cultivo in vitro de Aechmea
bromeliifolia .................................................................................................................................. 51
Figura 2 - Cultivo de Aechmea bromeliifolia sob condições de telado ......................................... 52
Figura 3 - Raízes das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro em tubos
de ensaio vedados com tampa rígida de polipropileno com membrana microporosa (A-B, D) e
em telado (C) ................................................................................................................................ 56
Figura 4 - Secções transversais da região proximal das raízes jovens de Aechmea bromeliifolia
desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-D) evidenciando semelhanças anatômicas ................. 58
Figura 5 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais da região
proximal das raízes jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro .............................. 59
Figura 6 - Média do comprimento da parte aérea (CPA) em centímetros (A) e média do número
de folhas (B) das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado e in vitro,
sob diferentes condições de cultivo ............................................................................................... 61
Figura 7 - Aspecto geral das plantas jovens de Aechmea bromeliifolia cultivadas em telado (A)
com menor crescimento da parte aérea e menor número de folhas, e in vitro (B-D) com maior
crescimento da parte aérea ............................................................................................................. 61
Figura 8 - Secções transversais da região mediana das folhas jovens de Aechmea bromeliifolia
desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-F), mostrando a organização anatômica básica.......... 63
Figura 9 - Vista frontal (A-D, F) e secção transversal (E) da região mediana das folhas jovens de
Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado (A) e in vitro (B-F) .......................................... 64
Figura 10 - Aechmea bromeliifolia desenvolvidas in vitro, evidenciando tricomas de aspecto
glandular distribuídos em fileiras na margem da folha ................................................................. 65
Figura 11 - Secções transversais de folhas jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em
telado (A, E) e in vitro (B-D, F-H) evidenciando feixes vasculares colaterais ............................. 66
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Figura 12 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas
jovens de Aechmea bromeliifolia desenvolvidas em telado (A, E, H, O) e in vitro (B-D, F-G, I-N,
P) .................................................................................................................................................... 68
Figura 13 - Electromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima
clorofiliano de Aechmea bromeliifolia desenvolvida em telado (A-B) e in vitro (C-H),
evidenciando estruturas e organelas típicas das células vegetais .................................................. 72
Figura 14 - Electromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima
clorofiliano de Aechmea bromeliifolia desenvolvida em telado (A-B) e in vitro (C-H),
evidenciando os cloroplastos ......................................................................................................... 74
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CAPÍTULO II
Figura 1 - Aclimatização de Aechmea bromeliifolia ..................................................................... 96
Figura 2 – Local de coleta e aspecto das plantas de Aechmea bromeliifolia crescidas no Parque
Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil ..................................................................................... 97
Figura 3 - Aechmea bromeliifolia aclimatizada (A) e desenvolvida in situ (B) .......................... 100
Figura 4 – Imagens em eletromicrografia de varredura da superfície foliar de Aechmea
bromeliifolia desenvolvidas in situ (A-B) e aclimatizadas (C-D) ............................................... 101
Figura 5 – Secção paradérmica (A) e transversais (B-F) das folhas de Aechmea bromeliifolia
aclimatizadas (A-C, E) e desenvolvidas in situ (D, F) ................................................................ 102
Figura 6 - Superfície foliar da face abaxial de Aechmea bromeliifolia aclimatizada (A, D-E) e
desenvolvida in situ (B-C, F) ....................................................................................................... 103
Figura 7 – Superfície (A-D) e secções transversais (E-F) das folhas de Aechmea bromeliifolia
desenvolvida in situ (A-B, F) e aclimatizada (C-D, E) evidenciando tricomas peltados ............ 105
Figura 8 - Secções longitudinais (A, E) e transversais (B-D) das folhas de Aechmea bromeliifolia
desenvolvidas in situ (A, C-E) e aclimatizada (B) ...................................................................... 107
Figura 9 - Secções transversais das folhas de Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C-D) e
desenvolvidas in situ (B, E-F) ..................................................................................................... 108
Figura 10 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas de
Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C, F, H) e desenvolvidas in situ (B, D-E, G, I) ......... 110
Figura 11 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas secções transversais das folhas de
Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A, C, E, G) e desenvolvidas in situ (B, D, F, H) ............ 111
Figura 12 - Eletromicrografia de transmissão das secções transversais do parênquima clorofiliano
das folhas de Aechmea bromeliifolia aclimatizadas (A-D) e desenvolvidas in situ (E-I),
evidenciando cloroplastos de folhas fixadas no período da manhã (A-C, E-F) e da tarde (D, G-I)
..................................................................................................................................................... 113
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1 - Testes histoquímicos realizados em amostras foliares e radiculares de Aechmea
bromeliifolia cultivada in vitro e em telado. ................................................................................. 53
Tabela 2 - Resultados dos testes histoquímicos realizados nas raízes de Aechmea bromeliifolia
jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio . 59
Tabela 3 – Diâmetro médio e espessura (µm) das raízes de Aechmea bromeliifolia jovem, bem
como de suas principais regiões, desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de
vedação dos tubos de ensaio .......................................................................................................... 60
Tabela 4 – Número de pólos do protoxilema e metaxilema das raízes de Aechmea bromeliifolia
jovem, desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio 60
Tabela 5 – Resultado dos testes histoquímicos das folhas de Aechmea bromeliifolia jovem
desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ............ 67
Tabela 6 – Médias do diâmetro polar (DP), diâmetro equatorial (DE) e relação entre DP e DE
dos estômatos da face abaxial folhas de Aechmea bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e
in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ....................................................... 69
Tabela 7 – Médias do número de estômatos/mm² e índice estomático das folhas de Aechmea
bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos
de ensaio ........................................................................................................................................ 70
Tabela 8 – Espessura média das folhas, do mesofilo, parênquima aquífero (PA) e parênquima
clorofiliano (PC) das folhas de Aechmea bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro,
sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio ..................................................................... 70
Tabela 9 – Média da altura das células epidérmicas (µm) das folhas de Aechmea bromeliifolia
jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de ensaio . 71
Tabela 10 – Área (µm2) dos cloroplastos presentes no parênquima clorofiliano de Aechmea
bromeliifolia jovem desenvolvidas em telado e in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos
de ensaio ........................................................................................................................................ 71
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CAPÍTULO II
Tabela 1 – Testes histoquímicos realizados em amostras foliares de Aechmea bromeliifolia
aclimatizadas e desenvolvidas in situ ............................................................................................ 98
Tabela 2 – Resultado dos testes histoquímicos realizados nas folhas de Aechmea bromeliifolia
aclimatizadas e desenvolvidas in situ .......................................................................................... 109
Tabela 3 – Área (µm2) dos cloroplastos presentes no parênquima clorofiliano das folhas de
Aechmea bromeliifolia aclimatizadas desenvolvidas in situ ....................................................... 114
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LISTA DE SIGLAS
ABA – Ácido abscísico (do inglês abscisic acid)
CAM - Metabolismo ácido das Crassulaceae (do inglês crassulacean acid metabolism)
Crti - Centro Regional para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação
DE – Diâmetro equatorial dos estômatos
DP – Diâmetro polar dos estômatos
E – Número de células epidérmicas por unidade de área (do inglês epidermis)
EMATER-GO - Empresa de Assistência Técnica, Extensão Rural e Pesquisa Agropecuária do
Estado de Goiás
FAA – Formaldeído, ácido acético glacial, álcool
FPVC – Filme de policloreto de vinila
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
LabMic – Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução
LCTV – Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais
MS – Meio de cultura básico criado por Murashige e Skoog
MET – Microscópio eletrônico de transmissão
MEV – Microscópio eletrônico de varredura
PAR – Radiação fotossinteticamente ativa (do inglês photosynthetically active radiation)
PESD – Parque Estadual da Serra Dourada
PET – Politereftalato de etileno transparente
PPFD – Densidade de fluxo de fótons fotossinteticos (do inglês photosynthetic photon flux
density)
PTFE – Politetrafluoroetileno
S – Número de estômatos por unidade de área (do inglês stomata)
SI – Índice estomático (do inglês stomata index)
TM – Tampa rígida de polipropileno com membrana microporosa
TP – Tampa rígida de polipropileno
UFG – Universidade Federal de Goiás
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 19
2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................... 21
3 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 21
3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................ 21
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 21
4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 22
4.1 BROMELIACEAE .............................................................................................................. 22
4.1.1 Aechemea bromeliifolia (Rudge) Baker ..................................................................... 22
4.2 O AMBIENTE IN VITRO NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS ............................ 24
4.3 MORFOLOGIA E ANATOMIA DE PLANTAS DESENVOLVIDAS IN VITRO ............ 26
4.3.1 Influência do sistema de vedação dos recipientes ..................................................... 31
4.4 CARACTERÍSTICAS ULTRAESTRUTURAIS DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN
VITRO ........................................................................................................................................ 34
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 36
CAPÍTULO 1: MORFOLOGIA E ANATOMIA DE Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker
(BROMELIACEAE) E ULTRAESTRUTURA DO SEU PARÊNQUIMA
CLOROFILIANO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO IN VITRO ............... 45
RESUMO ...................................................................................................................................... 46
ABSTRACT ................................................................................................................................. 47
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 48
2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 50
2.1 PLANTA MATRIZ ............................................................................................................. 50
2.2 GERMINAÇÃO .................................................................................................................. 50
2.2.1 Descontaminação das sementes .................................................................................. 50
2.2.2 Germinação in vitro ..................................................................................................... 50
2.2.3 Germinação em telado ................................................................................................ 52
2.2.4 Análises anatômicas e ultraestruturais ...................................................................... 52
2.2.5 Análises quantitativas ................................................................................................. 54
3 RESULTADOS ......................................................................................................................... 56
3.1 MORFOLOGIA E ANATOMIA RADICULAR ................................................................ 56
3.2 MORFOLOGIA E ANATOMIA FOLIAR ......................................................................... 60
3.3 ULTRAESTRUTURA DAS CÉLULAS DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO ............ 71
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4 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 75
4.1 MORFOLOGIA FOLIAR E RADICULAR ........................................................................ 75
4.2 ANATOMIA RADICULAR ............................................................................................... 76
4.3 ANATOMIA FOLIAR ........................................................................................................ 77
4.4 ULTRAESTRUTURA DAS CÉLULAS DO PARÊNQUIMA CLOROFILIANO ............ 79
5 CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 82
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFRICAS ................................................................................ 83
CAPÍTULO 2: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E ANATÔMICA DAS FOLHAS
E ULTRAESTRUTURA DOS CLOROPLASTOS DE Aechmea bromeliifolia (Rudge)
Baker (BROMELIACEAE) APÓS PROCESSO DE ACLIMATIZAÇÃO ........................... 90
RESUMO . .................................................................................................................................... 91
ABSTRACT ................................................................................................................................. 92
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 93
2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 95
2.1 OBTENÇÃO DAS PLANTAS ACLIMATIZADAS .......................................................... 95
2.2 OBTENÇÃO DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN SITU ........................................... 96
2.3 ANÁLISES MORFOLÓGICAS, ANATÔMICAS E ULTRAESTRUTURAIS ................ 97
3 RESULTADOS ....................................................................................................................... 100
3.1 MORFOLOGIA FOLIAR ................................................................................................. 100
3.2 ANATOMIA FOLIAR ...................................................................................................... 101
3.3 ULTRAESTRUTURA DOS CLOROPLASTOS .............................................................. 112
4 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 115
5 CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 118
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 119
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19
1 INTRODUÇÃO GERAL
Bromeliaceae inclui cerca de 60 gêneros e 3.000 espécies (SOUZA & LORENZI, 2012)
distribuídas nas regiões tropicais e temperadas das Américas, com exceção de uma espécie de
Ptcairnia que ocorre na África tropical (JACQUES-FÉLIX, 2000). A família representa um
grupo fortemente sustentado como monofilético dentro do clado de Poales, ordem que constitui
um grupo irmão do restante das monocotiledôneas (APG III, 2009). É tradicionalmente dividida
em três subfamílias: Pitcairnioideae, Bromelioideae e Tillandsioideae. Entretanto, estudos em
sistemática filogenética suportam Tillandsioideae e Bromelioideae como subfamílias
monofiléticas e Pitcairnioideae como um agrupamento parafilético (GIVINISH et al., 2007).
Reúne plantas herbáceas, onde grande parte é epífita, mas também podem ser terrestres ou
rupículas, ocorrendo em ambientes xéricos e mésicos (BENZING et al., 1976). Muitas espécies
apresentam folhas organizadas em espiral, formando uma roseta que acumula água.
Anatomicamente, possuem tecidos aquíferos, células epidérmicas com corpos silicosos e
superfície foliar coberta por tricomas peltados capazes de absorver água (JUDD et al., 2009;
SOUZA & LORENZI, 2012).
As bromélias contribuem como mantenedoras da biodiversidade. O acúmulo de água e
nutrientes nas folhas distribuídas em roseta possibilita, por exemplo, o abrigo e o
desenvolvimento de animais, especialmente invertebrados (BENZING, 2000; FAVRETTO et al.,
2011). Segundo Aoyama et al. (2012), manter as espécies de bromélias em seu ambiente natural
significa não somente preservá-las, como também conservar a diversidade local. Além disso, são
utilizadas comercialmente, como plantas ornamentais, fonte de alimentos e como produtoras de
fibras (JUDD et al., 2009; SILVEIRA et al., 2009; NEGRELLE et al., 2012; LEONEL et al.,
2014).
Considerando a importância para os projetos paisagísticos, as bromélias são muito
cultivadas e utilizadas em decorações de interiores. Por possuírem inflorescências, em geral
muito vistosas pelo colorido das flores, seu extrativismo vem se intensificado nos últimos anos, o
que coloca em risco algumas espécies com maior grau de ameaça (RODRIGUES et al., 2007;
NEGRELLE et al., 2012). Neste contexto, a técnica de cultivo in vitro tem sido utilizada na
produção de várias bromélias ornamentais, sendo considerada estratégia importante na
preservação das espécies nativas. Essa técnica possibilita o fornecimento de maior quantidade de
plantas ao mercado, diminuindo a procura por exemplares de ambientes naturais (TAMAKI et
al., 2011).
-
20
O sistema de propagação in vitro apresenta vantagens se comparado aos métodos
tradicionais, tais como redução dos espaços requeridos na multiplicação de mudas; as plantas se
desenvolvem em um ambiente asséptico; possibilidade de ajustar fatores que influenciam o
desenvolvimento das plantas (nutrientes, reguladores de crescimento, luz e temperatura) e
produção contínua de plantas ao longo do ano, independente das mudanças de estações
(GEORGE & DEBERGH, 2008). Nos últimos anos, essa técnica tem sido amplamente utilizada
para várias espécies vegetais, como em bromélias, muitas das quais são nativas do Brasil, de
valor ornamental e consideradas como vulneráveis a ameaçadas de extinção por diversos autores
(ARRABAL et al., 2002; RECH FILHO et al., 2005; ALVES et al., 2006; SILVEIRA et al.,
2009; AOYAMA et al., 2012; SANTA-ROSA et al., 2013; DAL VESCO et al., 2014).
Plantas crescidas in vitro desenvolvem-se em um ambiente asséptico, sob baixa
intensidade luminosa, em condições nutricionais que permitem crescimento heterotrófico e alto
nível de umidade (HAZARIKA, 2003). Esses fatores contribuem, geralmente, para induzir
características fenotípicas que dificultam a sobrevivência da planta, quando transferida
diretamente da condição in vitro para o campo ou casa de vegetação, evidenciando a necessidade
de aclimatização para a condição ex vitro na maioria das vezes (HAZARIKA, 2003, 2006;
CHANDRA et al., 2010). No processo de aclimatização, as plantas desenvolvidas in vitro são
transferidas, de forma gradual, para um ambiente com as condições climáticas próximas às
naturais. Desse modo, busca-se minimizar o estresse que pode danificar as plantas ou levá-las à
morte (SILVA et al., 1995).
Alterações anatômicas e fisiológicas são as principais causas da baixa taxa de
sobrevivência de plantas desenvolvidas in vitro após transferência para condição ex vitro.
Alterações na forma, no funcionamento e na frequência dos estômatos e a ocorrência de cutícula
delgadas nas plantas in vitro conferem, por exemplo, alta condutância estomática e alta taxa de
transpiração (SÁEZ et al., 2012a). Além disso, a ultraestrutura celular também pode ser alterada
durante o desenvolvimento das plantas na condição in vitro (SALLANON et al., 1993; SÁEZ et
al., 2012a; MOYO et al., 2012; KAPCHINA-TOTEVA et al., 2014). Por esse motivo, estudos
que buscam identificar as alterações estruturais e funcionais de plantas cultivadas in vitro
possibilitam a compreensão dos processos celulares envolvidos no desenvolvimento das mesmas
e, consequentemente, fornecem subsídios para o aprimoramento da técnica.
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21
2 JUSTIFICATIVA
Aechmea bromeliifolia (Rudge) Baker possui potencial ornamental e, por isso, o
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Goiás (ICB/UFG) tem realizado trabalhos visando sua propagação in vitro.
Entretanto, os tipos de recipientes utilizados nos processos da cultura de tecidos vegetais, bem
como a forma de vedação dos mesmos, criam ambientes que influenciam o crescimento e
desenvolvimento das plantas e, consequentemente, o processo de aclimatização. Visando
contribuir com informações sobre o desenvolvimento das plantas na cultura de tecidos, o
presente trabalho avaliou características relacionadas ao desenvolvimento de plantas jovens de A.
bromeliifolia sob diferentes condições in vitro, bem como de plantas aclimatizadas. Além disso,
os resultados ampliam a compreensão da plasticidade fenotípica de plantas submetidas a
diferentes condições ambientais e fornecem informações que podem subsidiar o processo de
reintrodução em ambiente natural.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar aspectos morfológicos, anatômicos e ultraestruturais de Aechmea bromeliifolia
(Rudge) Baker (Bromeliaceae) cultivada in vitro, sob diferentes tipos de vedação dos tubos de
ensaio, bem como de plantas aclimatizadas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar a morfologia e anatomia da raiz e das folhas de plantas jovens desenvolvidas in
vitro se comapradas às desenvolvidas em telado;
Avaliar a influencia de diferentes materiais utilizados para vedação de tubos de ensaio sobre
características morfológicas e anatômicas da folha e da raiz das plantas desenvolvidas in vitro;
bem como sobre a ultraestrutura do parênquima clorofiliano, com ênfase nos cloroplastos;
Avaliar a morfologia e anatomia foliar das plantas aclimatizadas, se comparadas às
desenvolvidas in situ;
-
22
Caracterizar a ultraestrutura dos cloroplastos presentes nas folhas das plantas aclimatizadas e
das plantas desenvolvidas in situ.
4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 BROMELIACEAE
A família compreende aproximadamente 60 gêneros e 3.000 espécies (SOUZA &
LORENZI, 2012), sendo que no Brasil ocorrem 44 gêneros e 1343 espécies (FORZZA et al.,
2016). Bromeliaceae é diversamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais, estendendo-
se da Virgínia na América do Norte à Patagônia na América do Sul (SMITH & TILL, 1998),
com exceção de Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms & Mildbraed que ocorre no oeste da
África tropical (JACQUES-FÉLIX, 2000). A família representa um grupo fortemente sustentado
como monofilético dentro do clado de Poales, ordem que constitui um grupo irmão do restante
das monocotiledôneas (APG III, 2009). É tradicionalmente dividida em três subfamílias:
Pitcairnioideae, Bromelioideae e Tillandsioideae. Estudos em sistemática filogenética suportam
Tillandsioideae e Bromelioideae como subfamílias monofiléticas e Pitcairnioideae como um
agrupamento parafilético (GIVINISH et al., 2007). Givinish et al. (2007) propõem as seguintes
subfamílias para Bromeliaceae: Tillandsioideae, Bromelioideae, Brocchinioideae,
Lindmanioideae, Hechtioideae, Puyoideae, Navioideae e Pitcairnioideae.
Bromélias são plantas herbáceas com folhas espiraladas formando uma roseta, com
bainha na base da lâmina foliar. A coloração verde nas folhas pode ser ornamentada por
antocianinas e tricomas peltados. O caule geralmente é ereto e curto. Em Pitcairnioideae
terrestres não ocorre rosetas formando tanques, com exceção de uma espécie de Brocchinia, em
Tillandsioideae e Bromelioideae a formação de tanques de vários tipos são comuns (SMITH &
TILL, 1998). Estes tanques possibilitam o desenvolvimento de animais que podem ser de
restritos a ocasional a esses microhabitats, como o Crustaceae Elpidium bromeliarum Müller e o
Anuro Syncope antenori Walker (SMITH & TILL, 1998).
4.1.1 Aechemea bromeliifolia (Rudge) Baker
Pertencente a Bromelioideae (Bromeliaceae), Aechmea bromeliifolia (Figura 1A-D) se
distribui em praticamente todos os estados brasileiros. Ocorre em diferentes tipos de vegetação,
como campo rupestre, cerrado latu sensu, floresta ciliar ou de galeria, floresta estacional
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semidecidual e floresta ombrófila (FORZZA et al., 2016). São terrestres, epífitas ou rupícolas e
atingem aproximadamente 44-85 cm de altura (LUIZ-SANTOS & WANDERLEY, 2012).
Possui folhas coriáceas, lepidotas, alternas espiraladas, formando roseta tubular com lâminas
lanceoladas e serreadas. A lâmina é esverdeada em ambas as faces e a margem é espinescente
(Figura 1A). A inflorescência, em espiga estrobiliforme (Figura 1B), é vistosa. O escapo é ereto
ou semi-ereto, branco lanoso, com brácteas alternas, lanceoladas, vistosas e róseas (Figura 1C).
As flores são sésseis, sépalas e pétalas verdes ou amarelo-esverdeadas (LUIZ-SANTOS &
WANDERLEY, 2012; KOCH et al., 2013).
Figura 1 - Aechmea bromeliifolia no Parque Estadual da Serra Dourada, Goiás, Brasil. A - Aspecto geral das
plantas crescidas em afloramentos rochosos e em forófitos; B - Detalhe da inflorescência estrobiliforme; C - Detalhe
do escapo com brácteas róseas; D - Folhas espiraladas promovendo o acúmulo de água. Fonte: própria autora.
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24
Aechmea bromeliifolia é distribuída em diversos países da América Central, no noroeste
da América do Sul e de Norte a Sul do Brasil. Foi observada floração em março, agosto e
setembro no estado de Minas Gerais, Brasil (LUIZ-SANTOS & WANDERLEY 2012). Koch et
al. (2013), relataram floração e frutificação nos meses de agosto e novembro em uma área de
conservação da Amazônia brasileira. Assim como a maioria das espécies de Bromelioideae
(CRYAN et al., 2004), A. bromeliifolia possui metabolismo ácido das Crassulaceae (CAM, do
inglês crassulacean acid metabolism) (GRIFFITHS & SMITH, 1983; SCARANO et al., 2002).
Aechmea bromeliifolia pode ser utilizada como espécie de valor ornamental e cultivada
em decorações de interiores. Além disso, pode ser inserida em forófitos em florestas no processo
de restauração, promovendo o enriquecimento de matas com essa forma de vida (DUARTE &
GANDOLFI, 2013). Devido a sua estrutura foliar organizada em espiral, verdadeiros tanques são
formados, capazes de acumular água (Figura 1D) e abrigar diversos organismos, como
Turbellaria spp., Nematoda spp., Oligochaeta spp., Crustracea (incluindo Elpidium sp.), Insecta,
Arachnida (LOPEZ et al., 1998) e uma espécie de anura (OLIVEIRA & ROCHA, 2015).
Aechmea bromeliifolia é polinizada principalmente por beija-flores e ocasionalmente por abelhas
(SANTANA & MACHADO, 2010). Segundo esses autores, bromélias ornitófilas são
importantes para a manutenção da fauna de beija-flores, o que beneficia diretamente outras
espécies de plantas que utilizam essas aves como vetores de pólen.
4.2 O AMBIENTE IN VITRO NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
O termo in vitro é derivado do latim “em vidro” e, na cultura de tecidos vegetais, se
refere ao explante que se desenvolve no interior de um recipiente fechado, em meio nutritivo
artificial, asséptico, sob condições controladas de temperatura e luz artificial (AITKEN-
CHRISTIE et al., 1995). Usualmente os recipientes utilizados são de vidro ou plásticos claros,
suscetíveis à entrada de luz (KOZAI & KUBOTA, 2005a).
O ambiente in vitro refere-se ao microclima, atmosfera, rizosfera que envolve o explante
no interior do recipiente de cultivo. O termo microambiente também é empregado como
sinônimo de ambiente in vitro, entretanto com ênfase na dimensão física (KOZAI & SMITH,
1995). O crescimento e desenvolvimento de plantas cultivadas in vitro estão intimamente
acoplados a esse microambiente. O potencial máximo na taxa de crescimento e desenvolvimento
do vegetal é determinado geneticamente, contudo, essas taxas são limitadas pelo microambiente
que o envolve (FUJIWARA & KOZAI, 1995).
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25
Na cultura de tecidos vegetais as plantas podem desenvolver-se em sistemas
heterotróficos, fotomixotróficos ou autotróficos (KOZAI, 1991a). No sistema heterotrófico, a
fonte de carbono pode ser proveniente unicamente da sacarose (fonte exógena), o explante se
desenvolve no interior de um recipiente hermeticamente fechado e em baixa densidade de fluxo
de fótons fotossintéticos (PPFD, do inglês photosynthetic photon flux density). No sistema
fotomixotrófico a sacarose também está presente no meio de cultura, contudo as plantas também
utilizam os carboidratos obtidos por meio da fotossíntese (fonte endógena) podendo ser
promovida pelo aumento da PPFD e da concentração de CO2 no ambiente in vitro. No sistema
fotoautotrófico, embora continue ocorrendo aumento da PPFD e da concentração de CO2 no
interior do recipiente, não se adiciona sacarose ou outro carboidrato ao meio de cultura. Sendo
assim, a única fonte de carbono é proveniente da fotossíntese (KOZAI & KUBOTA, 2005a). O
sistema mixotrófico difere do fotoautotrófico pela utilização de baixa PPFD.
O ambiente in vitro, no sistema heterotrófico (conhecido também como sistema de
cultivo in vitro convencional) a PPFD é baxa; a umidade relativa é alta; a temperatura é amena e
constante; a concentração de CO2 no período luminoso é baixa e no escuro é alta; e a
concentração de etileno é alta. Além disso, a sacarose está presente no meio de cultura, além de
micro e macronutrientes (KOZAI & SMITH, 1995).
A radiação compreendida entre 400 e 700 nm é chamada radiação fotossinteticamente
ativa (PAR, do inglês photosynthetically active radiation). Em pesquisas sobre fotossíntese,
quando PAR é expressa sobre uma base quântica, é adotada a denominação PPFD (KOZAI,
1991a). A luz é responsável pelas reações fotoquímicas nas plantas, como fotossíntese e
fotomorfogênese (germinação, enraizamento, iniciação de gemas, alongamento de caules, etc.).
A micropropagação convencional é feita em baixo PPFD, aproximadamente 30-80 µmol m-2 s-1,
quando comparada a outras formas de micropropagação, como a fotoautotrófica ou no ambiente
ex vitro (AFREEN, 2005).
A temperatura do ar na sala de crescimento é, relativamente, constante, em torno de 20-
25 ºC durante o dia (FUJIWARA & KOZAI, 1995), podendo variar de 1-2 ºC no interior do
recipiente. No período noturno, a temperatura do ar no interior do recipiente é quase a mesma
que na sala de crescimento (KOZAI & KUBOTA, 2005b).
Com o desenvolvimento da planta, substâncias gasosas como etileno e vapor de água
podem ser acumulados na atmosfera do recipiente. Os principais fatores que estão relacionados à
acumulação dos gases são a quantidade do material vegetal, o tipo de vedação do recipiente, os
componentes do meio de cultura e o clima da sala de crescimento (temperatura, ventilação e
intensidade luminosa) (BUDDENDORF-JOOSTEN & WOLTERING, 1994). Na
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micropropagação convencional, utilizando recipientes como tubos de ensaio, o movimento de ar
no seu interior é restrito e pode provocar difusão limitada de CO2, diminuindo seu fluxo para o
interior da planta e, consequentemente, a taxa fotossintética líquida. Durante o fotoperíodo
ocorre baixa concentração de CO2 no interior do recipiente de cultura, já no período noturno, há
uma alta taxa de respiração vegetal, causando aumento na concentração de CO2 (KOZAI &
KUBOTA, 2005b).
O etileno (C2H4) é um fitormônio produzido pelos vegetais e pode acumular em
recipientes totalmente vedados utilizados na cultura de tecidos convencional (KOZAI &
KUBOTA, 2005b). Segundo Buddendorf-Joosten & Woltering (1994) baixas concentrações de
etileno no sistema in vitro, podem ser necessárias para o processo de organogênense. Em altas
concentrações esse gás pode, entretanto, ter um efeito negativo no crescimento e
desenvolvimento da planta e induzir a senescência foliar. De Proft et al. (1985) observaram, por
exemplo, crescimento reduzido e baixo conteúdo de clorofila a em resposta ao acúmulo de
etileno em recipientes, hermeticamente fechados, durante o crescimento in vitro de Magnolia
soulangeana Soul. (Magnoliaceae).
Como o meio de cultura utilizado no cultivo in vitro possui água, a umidade relativa no
interior dos recipientes é muito alta (CHEN, 2004). Somado a isso, a vedação utilizada dificulta
as trocas gasosas com o meio externo, contribuindo para a sua elevação. Esse alto nível de vapor
de água ou umidade (aproximadamente 100%) pode causar anormalidades nos tecidos vegetais,
como baixo desenvolvimento da cutícula e mau funcionamento dos estômatos (JOHANSSON et
al., 1992). Além disso, a taxa de transpiração da planta nessas condições é geralmente baixa,
podendo afetar negativamente o processo de absorção de água e translocação de nutrientes
(KOZAI, 1991b). Segundo Jeong et al. (1995) a baixa taxa de transpiração in vitro é resultado do
pequeno gradiente de umidade entre os espaços intercelulares da folha e a atmosfera saturada do
recipiente de cultivo.
4.3 MORFOLOGIA E ANATOMIA DE PLANTAS DESENVOLVIDAS IN VITRO
O crescimento e o desenvolvimento vegetal não são influenciados apenas pelo seu
material genético, mas também pelas condições biológicas e pelos fatores externos as quais estão
expostos (TING & GIACOMELLI, 1992). Neste contexto, características morfológicas,
anatômicas e fisiológicas de plantas cultivadas in vitro podem ser consideravelmente afetadas,
podendo apresentar características como: reduzida formação de cera epicuticular, tecidos com
menor complexidade estrutural (parênquima paliçádico e esponjoso, e sistema vascular), mau
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27
funcionamento dos estômatos, baixo conteúdo de clorofilas, baixa taxa fotossintética e baixa
porcentagem de matéria seca (plantas mais suculentas) (KOZAI & SMITH, 1995).
Plantas em crescimento in vitro são, geralmente, muito delicadas, com ausência, ou
desenvolvimento reduzido, de estruturas que as tornam vulneráveis quando expostas ao ambiente
natural (HAZARIKA, 2006). Entretanto, suas raízes e sua parte área podem ficar mais
alongadas. Aoyama et al. (2012) observaram, por exemplo, ao compararem as plantas de
Alcantarea imperialis (Carrière) Harms (Bromeliaceae) desenvolvida in vitro e ex vitro, maior
crescimento tanto da parte aérea como das raízes nas plantas in vitro, mesmo com a germinação
das sementes ocorrendo simultaneamente. Segundo esses autores, isso ocorre, provavelmente,
em função da presença de sacarose no meio de cultura da planta em desenvolvimento in vitro.
Em estudo sobre a morfologia de Murraya paniculata (Jack) Linn. (Rutaceae) desenvolvida in
vitro e in vivo, Taha & Haron (2008) observaram diferenças na textura foliar. Na condição in
vitro as folhas apresentaram-se membranosas e na condição in vivo apresentaram-se coriáceas.
Johansson et al. (1992) verificaram consistência flácida das folhas de Rosa sp. (Rosaceae)
cultivada in vitro.
A epiderme está presente nos órgãos em estrutura primária e possui vários tipos celulares,
constituindo-se um tecido complexo. Segundo Dickison (2000), o aumento na espessura das
paredes das células epidérmicas pode participar na proteção dos tecidos contra a radiação solar
intensa, e também pode contribuir para a redução da perda excessiva de água. Células
epidérmicas com paredes menos espessas foram observadas nas plantas de Rosa sp.
desenvolvidas in vitro (JOHANSSON et al., 1992) e Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Sm.
(Bromeliaceae) (TAVARES et al., 2015). A cutícula, que reveste a parede externa das células
epidérmicas, protege contra a transpiração excessiva das plantas e forma uma barreira física
contra a ação de patógenos (RIEDERER, 2006; YEATS & ROSE, 2013). Plantas provenientes
do cultivo in vitro possuem, geralmente, cutícula pouco desenvolvida. Essa característica está
relacionada, provavelmente, ao alto nível de umidade no recipiente de cultivo e pode resultar em
plantas que, quando transferidas para o ambiente ex vitro, perdem mais água para a atmosfera
(JOHANSSON et al., 1992). Johansson et al. (1992) observaram cutícula delgada (0,04 µm) nas
superfícies adaxial e abaxial da lâmina foliar de Rosa sp. cultivada in vitro, enquanto nos
indivíduos aclimatizados, e na planta matriz, a cutícula (em ambas as superfícies) foi mais
espessa (aproximadamente 0,3 µm e 0,4 µm respectivamente). Abbade et al. (2009) observaram
ausência de cutícula nas faces adaxial e abaxial da epiderme foliar de Tabebuia roseoalba (Ridl.)
Sandwith (Bignoniaceae) cultivada in vitro e Sáez et al. (2012a) praticamente não observaram
deposição de cera epicuticular em Castanea sativa Mill. (Fagaceae) desenvolvida in vitro.
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Resultados similares foram observados em Dianthus caryophyllus L. (Caryophyllaceae)
(MAJADA et al., 2001), Fragaria x ananassa Duch. (morangueiro cv. Vila Nova) (Rosaceae)
(CALVETE et al., 2002), Ananas comosus (L.) Merr. cv. Pérola (Bromeliaceae) (BARBOSA et
al., 2006), Cymbidium sp. (Orchidaceae) (MAYER et al., 2008) e Musa sp. (bananeira cv.
Preciosa) (Musaceae) (COSTA et al., 2009b).
Os estômatos nas plantas cultivadas in vitro podem se alterar, quando comparados aos
que ocorrem nas plantas crescidas em campo ou casa de vegetação. Estas variações incluem o
formato das células-guarda, os diâmetros polar e equatorial, a abertura do ostíolo, a densidade
(número de estômatos por unidade de área foliar) e o índice estomático. O formato dos estômatos
é um indicativo da sua funcionalidade. Estômatos com aspectos elípticos são capazes de
responder aos estímulos, enquanto estômatos circulares podem ser incapazes de se fechar
completamente, mantendo a porcentagem de perda de água, em alto nível (SHA VALLI KHAN
et al., 1999). A abertura estomática pode ser controlada por diversos mecanismos que operam
para manter um equilíbrio entre a entrada de CO2 e a restrição à perda excessiva de água na
forma de vapor (SCHULZE & HALL, 1982). Nas folhas de Rosa sp. cultivada in vitro os
estômatos possuem formato esférico, enquanto nas plantas crescidas em ambiente natural, eles
possuem formato elipsóide (JOHANSSON et al., 1992). Resultados similares foram observados
em Malus pumila Mill. (Rosaceae) (BLANKE & BELCHER, 1989) Tectona grandis L.
(Lamiaceae) (JUNIOR & SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009), Castanea sativa (SÁEZ et al.,
2012a) e Ficus carica L. cv. “Roxo de Valinhos” (Moraceae) (CHIRINÉA et al., 2012).
A anormalidade mais importante observada em muitas pesquisas relacionadas à
micropropagação convencional é a não funcionalidade dos estômatos (AFREEN, 2005),
Estômatos de folhas de plantas desenvolvidas in vitro não se fecharam imediatamente quando
expostas a baixa umidade relativa, à presença de ácido abcísico (ABA, do inglês abscisic acid)
(WARDLE & SHORT, 1983) e quando expostas ao escuro (WARDLE & SHORT, 1983;
SALLANON et al. 1993). Os estômatos, de formato circular, das folhas de Prunus cerasus L.
(Rosaceae) desenvolvidas in vitro e expostas a baixa umidade relativa (45%), por exemplo,
levaram cerca de 20 min para se fecharem, enquanto os estômatos de folhas crescidas durante
aclimatização e expostas à mesma umidade relativa ficaram com aspecto elíptico e se fecharam
instantaneamente. Esse resultado demonstra uma adaptação de plantas desenvolvidas in vitro
para novas condições ambientais (MARÍN et al., 1988).
Os ostíolos dos estômatos de plantas desenvolvidas in vitro apresentam frequentemente,
maiores aberturas quando comparados às plantas desenvolvidas em campo ou casa de vegetação
(BLANKE & BELCHER, 1989; JOHANSSON et al., 1992; SÁEZ et al., 2012a). De acordo
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29
com Johansson et al. (1992), a elevada umidade relativa no interior do recipiente de cultivo
induz a abertura estomática. Estômatos com ostíolo visualmente maior em plantas in vitro foi
relatado em folhas de Cymbidium sp. (MAYER et al., 2008) e em Tectona grandis (JUNIOR &
SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009). Além disso, plantas in vitro são deficientes em ABA
(CHANDRA et al., 2010), fitormônio que induz o fechamento dos estômatos inibindo a
transpiração excessiva foliar (MITTELHEUSER & VAN STEVENINCK, 1969).
A densidade estomática entre plantas desenvolvidas in vitro, comparadas às plantas
desenvolvidas em casa de vegetação ou no campo, pode variar. Abbade et al. (2009) observaram
que o número de estômatos por área, nas folhas de Tabebuia roseoalba in vitro foi
significativamente maior que nas plantas provenientes do campo. Maior densidade estomática
em plantas desenvolvidas in vitro também foi observada em Rosa sp. em detrimento à planta
matriz (JOHANSSON et al., 1992), em Musa sp. (bananeira cv. Preciosa) comparada a
diferentes estágios de aclimatização (COSTA et al., 2009b) e em Castanea sativa comparada à
planta desenvolvida em viveiro (SÁEZ et al., 2012a). O aumento na densidade estomática em
plantas cultivadas in vitro é provocado, provavelmente, pela alta umidade e temperatura amena
(ABBADE et al., 2009). Segundo Fráguas (2003) os numerosos estômatos abertos podem
facilitar as trocas gasosas e aumentar a eficiência fotossintética no ambiente in vitro. Costa et al.
(2009a) observaram que a redução na densidade estomática em resposta a aclimatização pode
ocorrer, provavelmente, em decorrência do aumento do crescimento das células epidérmicas e
demais tecidos foliares.
Menor densidade estomática em plantas cultivadas in vitro foi observada em Ananas
comosus (L.) Merr. cv. IAC “Gomo-de-mel” (Bromeliaceae) comparado à planta aclimatizada
em pleno sol (BATAGIN et al., 2009) e Ficus carica comparado a espécie crescida no campo
(CHIRINÉA et al., 2012). Batagin et al. (2009) atribuíram esse resultado, à condição
heterotrófica, de umidade e luz controlada do recipiente de cultivo in vitro.
Outra característica que deve ser considerada é a formação, in vitro, de estômatos
proporcionalmente maiores. As plantas de Tabebuia roseoalba cultivadas in vitro possuem
estômatos com maiores dimensões em comparação com estômatos da planta desenvolvida no
campo (ABBADE et al., 2009). O mesmo foi encontrado em Tectona grandis, segundo Junior &
Scherwinski-Pereira (2009), isso ocorre devido à falta de controle no mecanismo de abertura e
fechamento estomático, pois na planta desenvolvida em casa de vegetação, os estômatos
possuíram menores dimensões, controlando a perda de água.
Estômatos levemente projetados acima das demais células epidérmicas foram observados
em folhas de Cymbidium sp. desenvolvidas in vitro. Na planta matriz, entretanto, os estômatos
-
30
ocorrem abaixo do nível das demais células epidérmicas (MAYER et al., 2008). Resultado
semelhante foi observado nas folhas de Liquidambar styraciflua L. (atualmente, Altingiaceae)
desenvolvida in vitro, quando comparadas às folhas das plantas aclimatizadas e desenvolvidas no
campo. Nestas últimas condiçõesos os estômatos encontram-se no mesmo nível das demais
células epidérmicas (WETZSTEIN & SOMMER, 1982). Segundo Mayer et al. (2008), esses
resultados estão relacionados, provavelmente, à alta umidade relativa do ambiente in vitro.
As plantas desenvolvidas in vitro possuem, geralmente, folhas com pouca diferenciação.
Fidelis et al. (2000) não observaram, por exemplo, distinção dos parênquimas paliçádico e
esponjoso na lâmina foliar de Brosimum gaudichaudii Trécul (mama-cadela) (Moraceae)
proveniente do cultivo in vitro. Nas plantas crescidas em casa de vegetação o mesofilo possuiu,
entretanto, uma camada de células do parênquima paliçádico, e duas camadas de células do
parênquima lacunoso. Taha & Haron (2008) observaram apenas uma camada de células do
parênquima paliçádico nas folhas de Murraya paniculata desenvolvidas in vitro, ao invés de
duas encontradas na espécie in vivo. Dentre outras espécies cultivadas in vitro em que o
parênquima paliçádico apresentou menos camadas de células estão Ficus carica (CHIRINÉA et
al., 2012) e Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) (RODRIGUES et al., 2014). Em Tabebuia
serratifolia (Vahl) G. Nicholson (Bignoniaceae) desenvolvida in vitro e em viveiro, Dousseau et
al. (2008) observaram apenas uma camada de células paliçádicas nas folhas. Entretanto, nas
plantas provenientes do cultivo in vitro essas células apresentaram formato cônico com espaços
intercelulares maiores, ao invés de apresentarem formato alongado com células justapostas,
como no crescimento em viveiro. Não se observou alteração no número de camadas de células
do parênquima paliçádico em Cocos nucifera L. (Arecaceae) cultivada in vitro e em condição
autotrófica (casa de vegetação). Entretanto, enquanto na condição in vitro as células do
parênquima paliçádico apresentaram formato irregular e com diferentes tamanhos, na condição
autotrófica essas foram bem organizadas (SANTANA et al., 2010).
Plantas cultivadas in vitro possuem o mesofilo com, geralmente, alta proporção de
espaços intercelulares (WETZSTEIN & SOMMER, 1982; JOHANSSON et al., 1992;
APÓSTOLO et al., 2005; CHIRINÉA et al., 2012) e redução dos parênquimas paliçádico e
esponjoso (CALVETE et al., 2002; CHIRINÉA et al., 2012). Além disso, possuem redução na
espessura da lâmina foliar (WETZSTEIN & SOMMER, 1982; JOHANSSON et al., 1992;
FIDELIS et al., 2000; JUNIOR & SCHERWINSKI-PEREIRA, 2009; ABBADE et al., 2009;
CHIRINÉA et al., 2012). O fator que está relacionado com essas modificações é, provavelmente,
a luminosidade. Trabalhos evidenciam a influência da maior intensidade luminosa sobre a
expansão das células do mesofilo (VOLTAN et al., 1992; HANBA et al., 2002), da lâmina foliar
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e redução dos espaços intercelulares (FERNANDES et al., 2014). Sendo assim, plantas
desenvolvidas in vitro podem apresentar mesofilo pouco desenvolvido se comparado ao das
plantas que se desenvolvem no campo ou casa de vegetação, pois no ambiente in vitro, a
intensidade luminosa é baixa. Em Castanea sativa cultivada in vitro foi observada interação
significativa entre as plantas expostas a maior luminosidade e recipientes com vedação que
permitem maior aeração. Indivíduos que cresceram em recipientes ventilados e expostos a PPFD
de 150 µmol m-2 s-1, obtiveram maior produção de biomassa, maior capacidade fotossintética e
maior capacidade de controle na perda de água, comparado a indivíduos que cresceram em
recipientes com menor ventilação sob PPFD de 50 µmol m-2 s-1 (SÁEZ et al., 2012b).
O conjunto xilema-floema forma um sistema vascular contínuo através dos órgãos
vegetativos e reprodutivos das plantas vasculares (ESAU, 1974). O xilema é responsável pelo
transporte de água e solutos, armazenamento de nutrientes e suporte mecânico, enquanto o
floema é o principal tecido de condução de matérias orgânicas e inorgânicas em solução
(COSTA et al., 2012; MACHADO & CARMELLO-GUERREIRO, 2012). Feixes vasculares em
folhas de Cynara scolymus L. (Asteraceae) cultivada in vitro apresentaram desenvolvimento
limitado, evidenciando poucos elementos condutores e ausência de fibras. Nos estágios
avançados de aclimatização, esses se mostraram bem desenvolvidos, com numerosos elementos
condutores e presença de fibras (APÓSTOLO et al., 2005). A lâmina foliar de Musa sp.
(bananeira cv. Japira) possuiu menor espessura da nervura central no desenvolvimento in vitro,
tornando-se maior e mais diferenciada em resposta à aclimatização (COSTA et al., 2009a).
Cattleya jenmanii Rolfe Y. e Cattleya lueddemanniana Rchb.F. (Orchidaceae) desenvolvidas in
vitro, apresentaram feixes vasculares com bainha esclerenquimática constituída por fibras com
paredes pouco espessas, enquanto as plantas dessas mesmas espécies cultivadas em orquidário,
possuíram fibras com paredes mais espessadas (TORRES & SANABRIA, 2011).
4.3.1 Influência do sistema de vedação dos recipientes
O tipo de vedação dos recipientes para o cultivo in vitro pode influenciar no crescimento
das plantas (PRAKASH et al. 2004). No cultivo in vitro convencional, além da presença de
sacarose no meio de cultura, os recipientes utilizados são bem vedados para que possa prevenir a
entrada de microrganismos (KOZAI & KUBOTA, 2005b). Os recipientes, quando
completamente vedados, fazem com que o ar no interior do frasco fique saturado com vapor de
água, além de favorecerem o aumento da concentração interna de etileno e CO2 (JEONG et al.,
1995). Além disso, segundo Biddington (1992), a acumulação de etileno na cultura de tecidos
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vegetais é consequência do método (recipientes totalmente vedados) e pode constituir um
contaminante indesejável. De forma contrária, vedações que permitem maiores trocas gasosas
favorecem o desenvolvimento das plantas (DE PROFT et al., 1985).
Diferentes tipos de vedações para os recipientes podem ser utilizados. Estes incluem
tampões de algodão não absorvente, tampões de espuma de poliuretano, papel de alumínio,
tampa de aço inoxidável, tampa de polipropileno, filme PVC (policloreto de vinil) e goma de
silicone (PRAKASH et al., 2004). Neste contexto, têm-se avaliado a influencia do tipo de
vedação dos recipientes utilizados no cultivo in vitro sobre características relacionadas ao
desenvolvimento e metabolismo das plantas. Estudos recentes evidenciam que vedações que
permitem melhores trocas gasosas proporcionam melhores resultados. Saldanha et al. (2012)
estudaram, por exemplo, a utilização de tampa rígida de polipropileno sem e com furos de 10
mm de diâmetro cobertos com fita microporosa e fita veda-rosca (PTFE). Segundos esses
autores, o crescimento de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen (Amaranthaceae) foi favorecido
na condição em que houve maiores trocas gasosas. O comprimento foliar de Annona glabra L.
(Annonaceae) cultivada in vitro também foi significativamente influenciado pelo tipo de vedação
dos recipientes. Santana et al. (2011) observaram maior comprimento foliar nas plantas crescidas
em tubo de ensaio vedado com tampão de algodão e tampa plástica sem película de PVC, em
detrimento da tampa plástica envolvida com película de PVC. Nessa última condição de cultivo
foi observada significativa perda foliar. Resultados similares foram observados em
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var. cebil (Griseb) Altschul (Fabaceae), onde os
tratamentos com tampa plástica sem filme de PVC e o tratamento com tampão de algodão
obtiveram aumento da massa seca das folhas e raízes em comparação com o fechamento com
filme de PVC. A vedação com tampa plástica sem filme de PVC proporcionou maior número de
folhas por microplanta, e na vedação com tampão de algodão as plantas ficaram com folhas
maiores e mais expandidas. Além disso, a taxa de abscisão das folhas, desta última vedação, foi
menor e houve aumento do comprimento e da quantidade das raízes (NEPOMUCENO et al.,
2009).
A vedação que permite melhores trocas gasosas entre o meio externo e o interior dos
recipientes diminui o acúmulo de gases e aumenta o fluxo transpiratório, aumentando a
probabilidade de as plantas sobreviverem quando transferidas para o ambiente ex vitro, uma vez
que nessas condições elas apresentam melhor controle transpiratório (NEPOMUCENO et al.,
2009). Em Herreria salsaparrilha Mart. (Herreriaceae), Gonçalves et al. (2008) observaram uma
elevação do filme de PVC sobre os recipientes, resultado da acumulação de O2 (oxigênio) no
interior dos recipientes. Já em amostras vedadas com tampa rígida de polipropileno (com e sem
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filtro), a concentração de O2 não diferiu da concentração do ambiente externo ao recipiente de
cultivo. Segundo esses mesmos autores, os recipientes vedados com tampa rígida não ficam
hermeticamente vedados, facilitando as trocas gasosas.
Características anatômicas e fisiológicas também podem ser influenciadas pelo tipo de
vedação dos recipientes. Majada et al. (2001) estudaram o efeito da taxa de ventilação (VR, do
inglês ventilation rates) dos recipientes de cultivo vedados com folha de alumínio, sem e com
filtro, e plástico transparente com filtro sobre a densidade estomática em Dianthus caryophyllus.
Segundo os mesmos autores, o aumento da taxa de ventilação promoveu maior deposição de cera
cuticular e diminuição da densidade estomática. Além disso, o grau de fechamento estomático
foi menor nas plantas crescidas em recipientes hermeticamente fechados, após serem expostas a
baixa humidade relativa. Nas plantas crescidas em recipientes mais ventilados ocorreu o
contrário. É importante ressaltar que segundo Majada et al. (1997) a taxa de ventilação no
interior dos frascos vedados com folha de alumínio, sem e com filtro menor, plástico
transparente com filtro e com folha de alumínio com filtro maior é respectivamente, 0,11; 0,21;
0,68 e 0,86 h-1 (air changes per h) (Tabela 1), e que a PPFD no interior dos recipientes vedados
com plástico transparente com filtro é significativamente maior (Tabela 1).
Tabela 1 – Tipo de vedação e características do interior dos frascos de cultivo (PPFD – densidade de fluxo de fótons
fotossintéticos 2 e 5 cm a partir da base do recipiente). Fonte: Majada et al. (1997, modificado).
Tipo de vedação Taxa de
ventilação (h-1)
PPFD (2 cm) PPFD (5 cm)
Alúminio sem filtro 0,11 17 a 9,5 a
Alumínio com filtro menor 0,21 12 a 6 b
Plástico com filtro 0,68 29 b 33 c
Alumínio com filtro maior 0,86 10 a 5,5 b
Nota: Letras diferentes na coluna indicam diferenças significativas para α = ≤ 0,05.
Em Castanea sativa, a densidade estomática não diferiu significativamente nas plantas
cultivadas in vitro em recipientes vedados com e sem membrana porosa, mas em recipientes
mais ventilados exibiram estômatos com menor abertura e com formato elíptico. O interior dos
recipientes exibiu a mesma PPFD (50 µmol m-2 S-1) (SÁEZ et al., 2012b). Já em Solanum
tuberosum L. cv. Sandy (Solanaceae), a densidade estomática foi menor nas folhas
desenvolvidas em recipientes com mais ventilação (tampa de polipropileno com membrana
microporosa). Além disso, os estômatos ficaram elípticos, com ostíolos apresentando menor
abertura. Nas folhas desenvolvidas em recipientes não ventilados (tampa de polipropileno sem
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membrana microporosa) a densidade estomática foi maior e os estômatos ficaram mais esféricos
e com maior abertura do poro. A lâmina foliar exibiu ainda mesofilo formado por células de
formatos irregulares, grandes espaços intercelulares e sistema vascular pouco desenvolvido.
Comparativamente, em recipientes com mais ventilação, a lâmina foliar ficou mais espessa, com
mesofilo diferenciado e poucos espaços intercelulares (MOHAMED & ALSADON, 2010).
4.4 CARACTERÍSTICAS ULTRAESTRUTURAIS DAS PLANTAS DESENVOLVIDAS IN
VITRO
A ultraestrutura de algumas organelas pode ser influenciada pela condição in vitro,
quando comparada a de plantas crescidas em casa de vegetação ou em ambiente natural.
Segundo Wetzstein & Sommer (1982) mudanças no metabolismo celular ocorrem,
provavelmente, associadas às alterações no citoplasma e no desenvolvimento de organelas,
durante transição do desenvolvimento heterotrófico paro o autotrófico.
Em Liquidambar styraciflua as folhas das plantas desenvolvidas no campo e as folhas das
plantas aclimatizadas possuem as células do mesofilo com ampla área citoplasmática, contendo
mitocôndria, dictiossomos, cloroplastos, pequenos vacúolos e considerável quantidade de
retículo endoplasmático e ribossomos. Nas folhas desenvolvidas in vitro, também foram
observadas essas organelas, contudo, menos numerosas. O vacúolo apresentou-se proeminente
com citoplasma reduzido e restrito a área parietal da célula (WETZSTEIN & SOMMER, 1982).
Os cloroplastos de Lamium album L. (Lamiaceae) desenvolvida in situ (habitat natural)
possuem tilacóides e grana bem estruturados, enquanto nas folhas das plantas desenvolvidas in
vitro, os cloroplastos são arredondados, com sistema interno de membranas de aspecto ondulado.
Esses cloroplastos possuem também estroma com grandes áreas sem tilacóides, lamelas do
estroma parcialmente fragmentadas e ausência de grãos de amido (KAPCHINA-TOTEVA et al.,
2014), o que pode estar associado à baixa taxa fotossintética. De acordo com Hazarika (2006)
plantas cultivadas in vitro possuem baixo desenvolvimento do aparato fotossintético. Outros
autores, entretanto, relataram a presença de grãos de amido nos cloroplastos de Rosa multiflora
L. cv. Montse (Rosaceae) cultivada in vitro, observando aumento em número e tamanho dos
grãos de amido com o aumento do nível de sacarose em 1%, 3% e 5% no meio de cultura
(CAPELLADES et al., 1991). Na ultraestrutura foliar de Liquidambar styraciflua desenvolvida
in vitro os cloroplastos apresentaram formato achatado e ausência de grãos de amido (LEE et al.,
1985).
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Os cloroplastos de Castanea sativa propagada em viveiro possuem o dobro do tamanho
dos cloroplastos das plantas cultivadas in vitro. Não foi possível distinguir claramente a
delimitação do grana nos cloroplastos desenvolvidos in vitro, enquanto em folhas de viveiro os
cloroplastos possuem grana facilmente delimitado (SÁEZ et al., 2012a). Foram observados
resultados similares para o tamanho dos cloroplastos em Jatropha curcas cultivada in vitro, onde
a menor área dos cloroplastos pode indicar senescência precoce das folhas. O vacúolo, o núcleo e
mitocôndrias ficaram ultraestrutualmente semelhantes (RODRIGUES et al., 2014).
Plastoglóbulos são corpos lipídicos encontrados em diferentes frequências e tamanhos em
todos os plastídios (AUSTIN et al., 2006; LICHTENTHALER, 2013). Nos cloroplastos são
acoplados aos tilacóides e constituem um subcompartimento que contém enzimas envolvidas na
biossíntese e metabolismo de lipídios. Podem conter clorofilas, carotenóides, plastoquinonas e
vitamina E, que atuam na proteção do aparato fotossintético contra radicais livres. O seu
aumento em número tem sido relatado em resposta ao estresse oxidativo e durante a senescência
(AUSTIN et al., 2006). Os plastoglóbulos são frequentemente observados na microscopia
eletrônica de transmissão como corpúsculos elétron densos, mas também podem ser observados
como corpúsculos elétron translúcidos. Esse último sendo mais comum em folhas de plantas
expostas a alta radiação luminosa (LICHTENTHALER, 2013). Em Castanea sativa na condição
in vitro houve baixa ocorrência de plastoglóbulos nos cloroplastos e, segundo Sáez et al.
(2012a), esse fato está associado, provavelmente, à baixa capacidade dessas plantas, de prevenir
danos oxidativos na membrana dos cloroplastos. Entretanto, Capellades et al. (1991)
encontraram grande quantidade de plastoglóbulos em Rosa multiflora cv. Montse desenvolvida
in vitro e estes foram associados à presença de clorose nas plantas.
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