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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MAYSA MAGALHÃES VAZ
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA PULPAR HUMANA DIANTE DE DIFERENTES
TÉCNICAS DE CLAREAMENTO
GOIÂNIA
2014
2
MAYSA MAGALHÃES VAZ
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA PULPAR HUMANA DIANTE DE
DIFERENTES TÉCNICAS DE CLAREAMENTO
Pesquisa apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Odontologia da
Faculdade de Odontologia da
Universidade Federal de Goiás para o
exame qualificação.
Linha de Pesquisa: Perspectivas em
odontologia clínica.
Orientador: Lawrence Gonzaga Lopes
Co-orientadora: Aline Carvalho Batista
GOIÂNIA
2014
2014
3
RESUMO
O clareamento dental é a primeira alternativa para a obtenção de dentes
claros. Contudo, sabe-se que o material clareador pode ocasionar danos à
polpa. O objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta pulpar humana diante
de diferentes técnicas de clareamento. Foram utilizados terceiros molares
humanos hígidos e com indicação de exodontia. Os pacientes foram divididos
em 3 grupos: Grupo Controle – não foi realizada nenhuma técnica de
clareamento (n=7); Grupo 01- clareamento caseiro com peróxido de carbamida
15% (n=10); Grupo 02- clareamento profissional com peróxido de hidrogênio
38% (n=12). Os dentes foram extraídos e as polpas removidas e submetidas à
análise microscópica utilizando a técnica de coloração por hematoxilina e
eosina(H&E) e a imunoistoquímica. Na análise microscópica, os grupos foram
avaliados quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, degradação de
colágeno e organização da camada odontoblástica. Pela técnica de
imunoistoquímica, foram identificados: mastócitos, macrófagos e vasos
sanguíneos.
Para os dados da microscopia, foi realizada análise descritiva seguida
da aplicação do teste Qui Quadrado (p<0,05). Foi encontrada diferença
estatística entre os grupos somente no critério: intensidade do infiltrado
inflamatório (p=0,0). Para os critérios degradação de colágeno e organização
da camada odontoblástica, não houve diferença estatística: p=0,194 e p=0,343;
respectivamente.
Os dados obtidos na imunoistoquímica foram submetidos à análise não
paramétrica - Kruskall-Wallis (p<0,05) seguido de Mann Whitney (p<0,05). Em
todas as polpas dos grupos avaliados houve ausência de mastócitos. Os
macrófagos foram encontrados em todos os grupos, apresentando menor
densidade no Grupo Controle e maior no Grupo 02. Quando os grupos foram
comparados entre si, houve diferença estatística entre o grupo 02 e os demais
grupos (grupo controle: p=0,03 e grupo 01: p=0,009). Os grupos controle e
caseiro não apresentaram diferença estatística entre si (p=0,537). Os vasos
sanguíneos apresentaram-se com densidade semelhante entre os três grupos
avaliados (p=0,744). Conclui-se que, o clareamento profissional provoca
4
resposta imunoinflamatória mais intensa quando comparado ao clareamento
caseiro ou à ausência de tratamento.
Palavras-chave: Clareamento dental, polpa dentária, microscopia.
5
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO............................................................................................... 6
1.1-OBJETIVOS.................................................................................................7
1.1.1- OBJETIVO GERAL........................................................................7
1.1.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................8
1.2HIPÓTESE.................................................................................................... 8
2- REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................9
2.1- CLAREAMENTO DENTAL..........................................................................9
2.2- RESPOSTA INFLAMATÓRIA....................................................................11
2.3- ALTERAÇÕES PULPARES PROVENIENTES DO CLAREAMENTO.......14
3-MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................18
3.1- SELEÇÃO DA AMOSTRA..........................................................................18
3.2- ETAPA I- ENSAIO CLÍNICO.......................................................................18
3.3- ETAPA II- ANÁLISES MICROSCÓPICA E IMUNOISTOQUÍMICA........... 23
3- RESULTADOS............................................................................................. 29
4-REFERÊNCIAS............................................................................................. 33
6
1 INTRODUÇÃO
Visto que o sorriso é considerado a mais importante forma de interação
e, atualmente, a odontologia estética tem focado na obtenção de dentes
brancos, o clareamento dental tem sido um tratamento frequentemente
solicitado pelos pacientes na rotina clínica (HATTAB, QUDEIMAT, AL-RIMAWI,
1999; GOKAY et al., 2000; KODONAS , GOGOS E TZIAFA, 2009). Dentre os
procedimentos estéticos, ele é tido como um meio eficaz, conservador e com
alta taxa de sucesso para o que objetiva realizar (DAHL & PALLENSEN, 2003;
LEE et al., 2006; MA et al., 2011) .
Vários métodos e técnicas de clareamento de dentes vitais têm sido
aplicados. De forma geral, as variações das técnicas de clareamento
encontram-se na composição dos agentes clareadores, nas concentrações do
agente clareador, no tempo de aplicação, na forma que o produto encontra-se
disponível, no modo de aplicação e no fato de ser ou não ativado por luz
(GREENWALL, 2001; SULIEMAN et al., 2004). Contudo, a principal diferença
entre as técnicas é a concentração do agente clareador e o tempo de uso
(HAYWOOD E HEYMANN, 1989; GREENWALL, 2001).
No que se refere aos diferentes tipos de clareamento, três técnicas
fundamentais tem seu uso reconhecido: clareamento caseiro supervisionado,
clareamento profissional em consultório e a associação de ambos os métodos
(Heymann, 2005). O clareamento caseiro usa o agente clareador em menor
concentração por um maior período de tempo de aplicação (10-16% de
peróxido de carbamida durante 16 dias). O clareamento profissional usa o
clareador em maiores concentrações (25 a 38% de peróxido de hidrogênio) por
um menor período de tempo (HAYWOOD E HEYMANN,1989 REINHARDT et
al., 1993; LEONARD, 1998; HEYMANN, 2005).
O mecanismo de clareamento é pouco compreendido (SULIEMAN et
al.,2005). Sabe-se que os radicais provenientes da decomposição do peróxido
de hidrogênio agem sobre a estrutura dental (FEINMAN; MADRAY;
7
YARBOROUGH, 1991; ZANTNER et al., 2007; EIMAR et al., 2012). Estudos
tem mostrado que parece haver uma oxidação dos componentes orgânicos dos
tecidos dentários, provocando as alterações observadas clinicamente
(RAGGAIN & JONHSTON, 2001; EIMAR et al., 2011; EIMAR et al., 2012).
A sensibilidade dolorosa é o efeito adverso mais frequente do
clareamento dental (BONAFÉ et al., 2013). Esse efeito, provavelmente, ocorre
em resposta à difusão do peróxido de hidrogênio para as estruturas mais
próximas da polpa dental, sendo capaz de provocar uma resposta inflamatória
(COOPER et al.; 1992, COSTA et al., 2010). O baixo peso molecular do
peróxido de hidrogênio permite sua difusão para as estruturas dentais com
consequente obtenção do seu objetivo clareador, porém, ao mesmo tempo
promove uma resposta inflamatória e é capaz de danificar as células da polpa
(COHEN, 1979; ROBERTSON, MELFI; 1980; BENETTI et al., 2004,
CAVIEDES-BUCHELI et al., 2008; COSTA et al., 2010). O poder de penetração
do peróxido de hidrogênio é diferente entre os diversos produtos, dependendo
da concentração e tempo de aplicação, agravando-se na presença de
restaurações (GOKAY et al. , 2004;CAMARGO et al., 2007).
1.1-Objetivos
1.1.1- Objetivo Geral
Avaliar a resposta inflamatória e imunológica, bem como o dano tecidual,
de polpas humanas de dentes permanentes frente a diferentes técnicas de
clareamento.
8
1.1.2- Objetivos Específicos
Investigar as alterações microscópicas (intensidade do infiltrado
inflamatório, degradação do colágeno e organização da camada
odontoblástica) da polpa dentária frente às diferentes técnicas de clareamento
dental.
Identificar e quantificar vasos sanguíneos, macrófagos e
mastócitos nas polpas analisadas para caracterizar a resposta inflamatória.
1.2- Hipótese
Para este estudo, considera-se como hipótese nula que nenhuma
técnica de clareamento produz alterações microscópicas no tecido pulpar.
9
2 CONCEITOS GERAIS E REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Clareamento Dental
O clareamento dental tem sido utilizado há mais de cem anos. O
primeiro relato de clareamento de dentes vitais ocorreu em 1868, realizado por
Latimer, com uso do acido oxálico (COSTA & HUCK, 2006; JOINER,2006). O
peróxido de hidrogênio começou efetivamente a ser utilizado no inicio do
Século XX. Utilizava-se compressas de algodão embebidas em solução de
peróxido de hidrogênio 30% (COSTA & HUCK, 2006). Em 1989, Haywood e
Heyman introduziram a técnica do clareamento caseiro (HAYWOOD &
HEYMAN, 1989; JOINER, 2006).
As técnicas de clareamento caseiro e profissional são largamente
utilizadas na atualidade. O clareamento pela técnica caseira utiliza produtos
com concentrações baixas, entre 10% a 16% de peróxido de carbamida
(HAYWOOD & HEYMANN, 1989; REINHARDT et al., 1993; LEONARD, 1998).
No entanto, na técnica de consultório são utilizadas concentrações mais altas,
variando de 30% a 38% de peróxido de hidrogênio em poucas aplicações
(ROSENSTIEL et al., 1991; GÖKAY, et al, 2000; ZEKONIS et al., 2003;
AUSCHILL et al., 2005).
Alguns estudos questionam a maior eficiência de uma técnica quando
comparada à outra. Moghadam et al. (2013) realizaram um ensaio clínico
randomizado para avaliar a alteração de cor, durabilidade e sensibilidade
produzidas pelo clareamento caseiro com peróxido de carbamida a 15% e
profissional com peróxido de hidrogênio a 38%. O estudo concluiu que ambas
as técnicas apresentaram mesma sensibilidade e variação total da cor. O
dentes submetidos a clareamento profissional, porém, tiveram uma regressão
de cor mais rápida imediatamente após o tratamento. Contudo, em 6 meses foi
realizada nova avaliação e não houve diferença entre as tonalidades dos
dentes para as duas técnicas.
Referente ao clareamento profissional, a utilização da luz durante o
tratamento é um aspecto bastante discutido. He et al. (2012) realizaram uma
metanálise com o objetivo de avaliar a influência da luz sobre a eficácia do
10
clareamento profissional de dentes vitalizados e a sensibilidade dentária a ela
relacionada. Foram selecionados os ensaios clínicos randomizados (ECR) que
compararam o clareamento com e sem uso de luz. Onze estudos foram
incluídos na meta-análise. Os resultados mostraram que o clareamento ativado
por luz apresenta melhores resultados imediatos quando são usadas baixas
concentrações de peróxido de hidrogênio (15-20% HP). Quando altas
concentrações do agente clareador foram usadas (25-35% HP) não houve
diferença imediata ou a curto prazo quando se usa ou não a fotoativação. No
entanto, o sistema fotoativado produz maior ocorrência de sensibilidade para
todos os casos, o que alerta para o cuidado no seu uso.
Para qualquer técnica de clareamento, o mecanismo pelo qual os dentes
são clareados é o mesmo, porém ele ainda não foi perfeitamente explicado
(KAWAMOTO & TSUJIMOTO, 2004; EIMAR et al.,2012). Há duvidas se os
radicais de peróxido clareiam os dentes por desproteinização,
desmineralização ou oxidação dos tecidos dentários. Contudo, acredita-se
fortemente que os radicais hidroxila (OH-), produto da decomposição do
peróxido de hidrogênio (H2O2) agem sobre os componentes orgânicos da
dentina e pigmentos, levando ao clareamento. (EIMAR et al., 2012)
Kawamoto e Tsujimoto (2004) avaliaram o efeito do radical hidroxila
(OH-) e do peróxido de hidrogênio (H2O2) no clareamento dental. Observaram
que a dentina intertubular e peritubular foram dissolvidos com o uso de
concentrações elevadas de peróxido de hidrogênio, mas a hidroxiapatita não foi
influenciada. Notou-se ainda, que quando prolina e alanina, foram adicionados
de H2O2, a geração de OH- diminuiu, mas não houve nenhuma alteração
quando a glicina foi adicionada. Do mesmo modo, a prolina foi degradada
completamente pelo peróxido de hidrogênio, a estrutura da alanina mudou
pouco, e glicina não foi afetada pelo mesmo. Sugere-se que H2O2 e OH- não
influenciam o tecido inorgânico da dentina, mas atacam o componente orgânico
da dentina (proteínas). Esses fatos sugerem que OH- tem o papel fundamental
no clareamento dental com H2O2.
Ainda sobre o mecanismo de clareamento, Eimar et al. (2012) realizaram
um estudo com o objetivo de avaliar o mecanismo de clareamento dental e
determinar quais dos componentes químicos do esmalte são afetados pelo
clareamento. Foram utilizados sessenta dentes hígidos coletados de pacientes
11
adultos, divididos em seis grupos (n=10). Os grupos1, 2, 3 e 4 foram tratados
durante 4 dias nas seguintes soluções: desproteinizadora com NaOH (Grupo
1), desmineralizadora com EDTA (Grupo 2), oxidante com H2O2 (Grupo 3) e
conservados em água destilada (controle/Grupo 04). Para os grupos 5 e 6, os
dentes foram pré-tratados, respectivamente, com soluções desproteinizantes
ou desmineralizadoras por 4 dias, depois lavados com água destilada e
deionizada e imersos em solução oxidante por mais 4 dias. Os resultados
apontaram para aumento da luminosidade nos casos de desproteinização
(4,8±2,7º), diminuição da luminosidade em casos de desmineralização
(8,5±5,6) e aumento da luminosidade para os dentes oxidados (19,9±6,5). A
oxidação de dentes desproteinizados não influencia na alteração da
luminosidade, mas a oxidação dos dentes desmineralizados resultou em
aumento na luminosidade (10,7± 5,8). O estudo concluiu que o peróxido de
hidrogênio não induziu alterações significativas na proporção dos componentes
orgânicos e inorgânicos do esmalte e tem sua ação clareadora por oxidação da
matriz orgânica.
2.2- Resposta Inflamatória
A inflamação é uma resposta de defesa inata do organismo frente a uma
injúria aos tecidos, que pode ser físico, químico ou biológico, caracterizada por
fenômenos vasculares que resultam no acúmulo de fluidos (exsudato
inflamatório), células e moléculas no tecido conjuntivo extravascular
(BERGENHOLTZ, 1990; ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR;
ABBAS & FAUSTO, 2005; LOPES & SIQUEIRA JR, 2010).
A inflamação tem a finalidade de reparar o tecido, porém, quando não
controlada, pode levar à morte tecidual. O reparo ou necrose são diretamente
influenciados pela intensidade e frequência do agente agressor, bem como
pelas condições anátomo-clínicas do dente afetado. (SELTZER & BENDER,
1979)
12
O processo inflamatório na polpa não difere de outros tecidos. Com
exceção de que ela está em uma situação de baixa complacência criada pela
dentina e esmalte (PEREZ & SILVA, 1997). Essa característica propicia ao
tecido pulpar apresentar diferentes mecanismos de controle, principalmente da
homeostase, após início do processo inflamatório, quando comparado aos
demais tecidos conjuntivos (GOLDBERG et al., 2008). O esmalte e dentina
também protegem-na de agentes agressores externos (LUISI, BARBACHAN &
CHIES, 2004) Na polpa, os primeiros eventos inflamatórios frente à entrada de
um agente agressor são a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular,
formação de exsudato inflamatório e liberação de mediadores químicos. Neste
contexto, a principal substância responsável pelos fenômenos vásculo-
exsudativos da resposta inflamatória inicial é a histamina (BERGENHOLTZ,
1990). Essa substância é secretada principalmente pelos mastócitos
(DOCKRILL, 1961; HOLZER, 1988; MAGGI, 1991; WALSH; DAVIS &
SAVAGE, 1995) que são estimulados por proteínas de baixo peso molecular
(proteínas do sistema complemento), as quais extravasam dos vasos
sangüíneos capilares que apresentam pequena contração de suas células
endoteliais (WALSH; DAVIS & SAVAGE, 1995).
Os mastócitos são células residentes no tecido conjuntivo, localizados
principalmente próximos de vasos sangüíneos e feixes nervosos, e apresentam
grânulos citoplasmáticos contendo várias substâncias biologicamente ativas,
como a histamina e metabólitos do ácido aracdônico (WALSH; DAVIS &
SAVAGE, 1995; JONTELL et al., 1998; RODINI; BATISTA & LARA, 2004;
FREITAS et al.,2007).
Embora os mastócitos estejam presentes em todos os tecidos
conjuntivos do organismo, inclusive da cavidade bucal, ainda existe muita
controvérsia quanto à presença dessas células em polpas normais e
inflamadas (FREITAS et al., 2007). Freitas et al. (2007) avaliaram a presença
de mastócitos, através da técnica de imunoistoquímica, em 40 amostras de
tecido pulpar humano de dentes permanentes em diferentes situações clínicas:
dentes não irrompidos, parcialmente irrompidos e sem cárie dentária,
irrompidos e sem cárie dentária, irrompidos com cárie rasa de dentina e dentes
com pulpite hiperplásica (pólipo pulpar) e verificaram que essas células
13
estavam ausentes em todas as polpas sem exposição e presentes apenas nas
pulpites hiperplásicas. Assim, os autores sugeriram que os mastócitos não
contribuem, através da liberação de histamina, para a resposta inflamatória
vascular inicial da polpa dentária. Esses resultados estão em concordância
com o estudo de Dockrill (1961) que detectou a presença dessa célula somente
em pólipos pulpares.
A inflamação é dividida em padrões agudo e crônico. A inflamação
aguda tem uma duração relativamente curta, de minutos ou algumas horas e
suas principais características são a exsudação de líquido e de proteínas
plasmáticas (edema) e a infiltração de leucócitos, predominantemente de
neutrófilos. Essas células são as primeiras a migrarem para o local da
agressão, pois respondem mais rapidamente aos fatores de quimiotaxia
(ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR; ABBAS & FAUSTO, 2005).
A inflamação crônica, por sua vez, tem uma duração maior e associa-se,
em termos histológicos, com a infiltração especialmente de macrófagos para o
local da agressão e com a proliferação de vasos sanguíneos (ABBAS;
LICHTMAN & POBER, 2000; KUMAR; ABBAS & FAUSTO, 2005).
Os macrófagos são células mononucleares que derivam de um
precursor comum da medula óssea, os monócitos. A meia-vida dos monócitos
sanguíneos é de cerca de um dia, enquanto que a duração média dos
macrófagos teciduais é de vários meses. (JONTELL et al., 1998). Essas células
possuem importante capacidade de fagocitar e destruir o agente agressor, pois
sintetizam diversas substâncias biologicamente ativas como enzimas
microbicidas e espécies oxigênio reativas (H2O2 e NO) (JONTELL et al., 1998;
ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000). Além disto, os macrófagos estão
envolvidos no processo de reparo da polpa por induzir neovascularização e
proliferação de fibroblastos, devido a síntese de fatores de crescimento como o
fator de crescimento fibroblástico básico e o fator de crescimento endotelial
(JONTELL et al., 1998; ABBAS; LICHTMAN & POBER, 2000).
O tecido pulpar possui uma matriz extracelular composta em grande
parte por proteínas colagenosas: colágeno tipo I, seguido de colágeno tipo III e
14
tipo V (GOLDBERG & LASFARGUES, 1995). Os macrófagos, juntamente com
células epiteliais, endoteliais e fibroblastos, são responsáveis pela produção de
citocinas que controlarão a atividade das colagenases. As colagenases são
responsáveis pela degradação do colágeno. No processo inflamatório, a
degradação do colágeno se inicia precocemente e é muito ativa, sendo um
importante indicador da progressão da inflamação pulpar (WISITHPHROM,
MURRAY & WINDSOR, 2006; CAMPOS, BORGES-BRANCO & GROTH,
2007). São conhecidos quatro tipos de colagenases: as séricas (elastases,
catepsina C e proteinase neutra) e as metaloproteinases (CAMPOS, BRANCO
& GROTH, 2007).
No que se refere à organização do tecido pulpar, sabe-se que a polpa
dental é um tecido conjuntivo frouxo composto de odontoblastos na sua zona
periférica, seguidos de uma zona praticamente acelular (basal ou acelular de
WEIL), uma zona rica em células e uma região central rica em vasos e nervos.
(TEN CATE, 2001; HARGREAVIS & GOODIS, 2002).
A camada odontoblástica é constituida pelos corpos celulares dos
odontoblastos que ficam sob a pré-dentina (HERMOZA & NOVOA, 2005).
Abaixo desta camada, encontra-se a zona acelular de Weil que contem fibras
nervosas amielínicas, capilares sanguíneos e processos citoplasmáticos dos
fibroblastos (MUNFORD & BJORN, 1962). Abaixo da zona acelular, encontra-
se a zona celular. A zona celular é povoada por fibroblastos, células
mesenquimais indiferenciadas, macrófagos e linfócitos. Finalmente, na região
central da polpa, encontra-se uma área constituída por vasos sanguíneos e
nervos imersos em um tecido conjuntivo rico em fibroblastos e células
ectomesenquimais indiferenciadas (MUNFORD & BJORN, 1962).
2.3- Alterações pulpares provenientes do clareamento
O efeito adverso mais comum após a realização do clareamento dentário
de dentes vitais é a sensibilidade dolorosa. Esta dor ou desconforto pós-
15
operatório pode ser resultante da difusão, através do esmalte e dentina, do
peróxido de hidrogênio (H2O2) ou de outros componentes tóxicos liberados pela
decomposição do gel clareador (CAMARGO et al., 2007).
Apesar de não se conhecer exatamente os mecanismos pelos quais os
dentes são clareados, sabe-se que o baixo peso molecular do H2O2 não só
favorece sua difusão através do esmalte e dentina, permitindo a obtenção de
dentes mais claros, mas também pode ocasionar danos a polpa (COHEN,
1979; ROBERTSON & MELFI; 1980; BENETTI et al., 2004).
Camargo et al. (2007) compararam a presença de peróxido de
hidrogênio na câmara pulpar de dentes humanos e bovinos submetidos ao
clareamento. Os grupos foram divididos segundo a origem do dente (humana
ou bovina) e subdivididos segundo a presença de material restaurador
(ausência de restauração, resina composta, cimento de ionômero de vidro e
cimento de ionômero de vidro modificado por resina). O estudo concluiu que
independente da presença de restauração, todos os dentes apresentaram
peróxido de hidrogênio na câmara pulpar, os dentes humanos apresentaram
concentração de H2O2 mais alta e a penetração de peróxido de hidrogênio
depende do material restaurador, sendo mais alta em cimentos de ionômero de
vidro modificados por resina.
A concentração e o tempo de aplicação dos agentes clareadores sobre
os dentes são capazes de interferir diretamente na penetração dos mesmos até
a polpa e, consequentemente, na citotoxidade desses (SACONO et al., 2010).
Considerando as possíveis variações de concentração do agente
clareador e tempo de contato do mesmo com o dente, Soares et al. (2014)
realizaram um estudo experimental para avaliar a eficácia de tratamento
clareador e toxicidade dos protocolos clareadores em células pulpares. O
estudo utilizou discos de esmalte/dentina adaptados em dispositivos sobre
poços com cultura de células odontoblásticas humanas (MDPC-23) ou células
pulpares humanas (HDPCs). Para os grupos, variou-se a concentração de
Peróxido de Hidrogênio (35% e 17,5%) e o tempo de aplicação (3x15min; 1x15
min e 1x5 min). O grupo controle não recebeu qualquer técnica de
clareamento. A viabilidade celular e a morfologia foram avaliados
imediatamente e 72h após o clareamento. Conclui-se que a redução do tempo
de clareamento para 5 min, quando o Peróxido de Hidrogênio a 35% foi
16
utilizado ou a redução da concentração para 17,5% com qualquer intervalo de
tempo é capaz de produzir alterações graduais na cor do dente e reduzir a
toxicidade das células da polpa.
Sacono et al. (2010) avaliaram a citotoxidade de diferentes agentes
clareadores empregados em diferentes técnicas. Sessenta discos de
esmalte/dentina foram adaptados sobre câmaras pulpares artificiais, com
cultura de células odontoblástica (MDPC 23) e divididos em 6 grupos (n=10).
Foi utilizado peróxido de hidrogênio a 20% (clareamento caseiro) e 38%
(clareamento profissional), com aplicações de 45 minutos para clareamento
caseiro e 10 minutos para o profissional, variando o número de aplicações
entre os grupos (1-2 para o caseiro e 1-3 para o profissional). Ambas as
técnicas produziram efeito citotóxico acentuado para as células MDPC-23.
Na polpa, os primeiros eventos inflamatórios frente à entrada de um
agente agressor são a vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular,
formação de exsudato inflamatório e liberação de mediadores químicos.
Cintra et al. (2013) investigaram o efeito do número de sessões de
clareamento no tecido pulpar de ratos. Foram utilizados 50 animais, divididos
em 5 grupos (n=10) divididos de acordo com o numero de sessões (1-5). Após
a realização da técnica de clareamento, os animais foram mortos e as polpas
avaliadas microscopicamente. Todos os cortes de polpa dentária mostraram
significativas mudanças induzidas pelo clareamento. Depois de uma sessão,
foram observados tecidos necróticos nos cornos pulpares e alterações
inflamatórias subjacentes. A extensão e a intensidade dessas mudanças
aumentaram com o número de sessões. Após cinco sessões, a mudanças
incluíram áreas de necrose no tecido pulpar envolvendo o segundo terço da
polpa radicular e inflamação intensa no terço apical.
Costa et al. (2010) avaliaram e compararam a resposta de incisivos e
premolares após o clareamento. Para todos os grupos experimentais foi
realizado clareamento profissional com peróxido de hidrogênio a 38% durante
45 min. Não foi realizado clareamento no grupo controle. Os dentes foram
extraídos dois dias após o clareamento e processados para avaliação
histológica. Nessa avaliação, foram considerados: resposta inflamatória celular,
desorganização da camada odontoblástica e formação de dentina reacional. Os
resultados mostraram que houve alterações pulpares somente nos incisivos,
17
sendo que foi notada uma grande zona de necrose de coagulação na polpa
coronária dos mesmos, enquanto a polpa radicular mostrou alterações
inflamatórias leves. Nos pré-molares não foram observadas alterações, bem
como no grupo controle.
18
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Seleção da amostra
O presente estudo foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa, foi
realizado o ensaio clínico que gerou as amostras pulpares para as análises
histológica e imunoistoquímica. O ensaio clínico foi realizado previamente,
durante a execução da pesquisa de Pós-Doutorado da Doutora Paula de
Carvalho Cardoso. Para este trabalho, foram avaliadas somente as alterações
microscópicas provocadas pelas técnicas de clareamento. O delineamento
deste ensaio clínico cego de grupos paralelos encontra-se apresentado a
seguir.
3.2- ETAPA I- ENSAIO CLÍNICO
Aspectos éticos
Este estudo experimental in vivo foi submetido ao Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Goiás, de acordo com a
Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional do Ministério da Saúde e aprovado
com protocolo nº 281/11
Os pacientes selecionados para o estudo receberam orientações
individuais por meio de uma apresentação no computador em Power Point
sobre a pesquisa pelo pesquisador responsável.
Anteriormente, foi feita a obtenção do consentimento dos pacientes para
sua participação na pesquisa através da assinatura de um termo de
19
consentimento livre esclarecido (TCLE). Os pacientes foram informados que
todos os materiais e dados coletados foram utilizados exclusivamente para os
fins de pesquisa.
Foram incluídos no estudo:
Voluntários de ambos os gêneros, na faixa etária entre 17 e
30 anos;
Pacientes com índice gengival do voluntário menor ou igual
a 1 (Tabela 1), segundo a classificação sugerida por Loe (1967);
Dentes terceiros molares hígidos, livres de trincas e
fraturas, extraídos por motivos ortodônticos. Os dentes foram extraídos,
por indicação prévia de exodontia.
Tabela 1- Classificação clínica dos tecidos gengivais.
Grau Índice gengival
0 Gengiva normal, sem evidência de inflamação
1 Suave inflamação; leve mudança de cor, leve edema, sem
evidência de ulceração
2 Moderada inflamação; vermelhidão, edema, superfície brilhante,
suave ulceração
3 Severa inflamação; vermelhidão acentuada, edema, superfície
brilhante, ulceração, tendência a sangramento espontâneo
Os fatores de exclusão foram:
gravidez e lactação;
presença de manchamento causado por tetraciclina
ou fluorose;
presença de tratamento endodôntico;
20
presença de resina composta nos terceiros molares;
dentes com lesões cariosas, patologias periapicais,
dilacerações radiculares ou qualquer outra patologia que
impedisse o experimento ou a extração do dente.
Divisão dos grupos
Os dentes foram selecionados aleatoriamente e divididos em grupos
(Tabela 2).
Tabela 2: Divisão do grupos
Grupos Técnica de Clareamento
Grupo Controle (n=07) Sem ação de agentes
clareadores
Grupo 01 (n=10) Clareamento Caseiro
Grupo 02 (n=12) Clareamento Profissional
Clareamento dental caseiro
Inicialmente, foi realizada a moldagem da arcada superior com Jeltrate
Plus (Caulk Division, Dentsply) e o vazamento do molde com gesso-pedra
(Vigodent). Após a obtenção do modelo, foi realizado um alívio dos braquets
com pasta pesada da silicona de condensação Oranwash- Zetaplus
21
(ZHERMACK s.p.a.) e, em seguida, obtida a placa de clareamento a partir de
máquina de formação a vácuo. A placa em seguida foi recortada, deixando um
excedente de plástico tanto por vestibular como por palatal.
Na próxima sessão clínica, foi realizado o teste para verificar o
assentamento da placa: 1) boa adaptação de maneira geral; 2) áreas de
interferência na região dos dentes; 3) áreas de interferência e/ou pressão sobre
o tecido gengival; 4) áreas desconfortáveis durante os movimentos de lábio,
bochechas e língua e 5) interferências oclusais significativas.
As instruções sobre modo e tempo de aplicação do agente clareador
(Opalescence® PF 15%, Ultradent Products) (2hs diária durante 16 dias) foram
entregues ao paciente por escrito.
Durante o procedimento clareador nos molares, os pacientes foram
acompanhados de forma direta, sendo monitorados em 1 (uma) visita semanal
durante o clareamento caseiro.
Clareamento dental profissional
Inicialmente, foi inserido afastador de bochecha de plástico autoportante.
Em seguida, o dente foi seco e a gengiva protegida com resina
fotopolimerizável OpalDam (Ultradent). A resina OpalDam foi dispensada em
uma faixa com 4 a 6 mm por 1,5 a 2 mm de espessura sobre a gengiva. Após a
aplicação da barreira de resina, foi realizada a polimerização durante 20
segundos.
Após isolamento, iniciou-se a aplicação do Opalescence Boost,
Ultradent. Para ativação do agente clareador, o profissional pressionou com os
polegares o material da seringa vermelha para a seringa transparente. Desta
forma, o ativador misturou-se com o agente de clareamento de forma rápida,
promovendo o rompimento da membrana interna do êmbolo que permitiu a
mistura. A ação foi invertida e misturada por no mínimo de 25 vezes
22
rapidamente. Em seguida, a seringa transparente foi retirada e descartada.
Uma ponta Micro 20g FX foi posicionada na seringa vermelha e, então, aplicou-
se o Opalescence Boost sobre a vestibular da estrutura dental com 0,5 a
1,0mm de espessura.
O Opalescence Boost foi aplicado por três vezes, sendo que cada
aplicação teve duração de 15 minutos, totalizando 45 minutos de contato do
produto com os dentes. Para a maior eficácia o agente clareador foi agitado a
cada 5 minutos. Antes do enxaguamento, o Opalescence Boost foi retirado dos
dentes utilizando apenas aspiração cirúrgica.
Três sessões de clareamento dental foram realizadas, respeitando
intervalos de 3 dias de uma sessão para outra.
As etapas de seleção, avaliação clínica e radiográfica e realização da
parte experimental (Avaliação da sensibilidade e mensuração da cor inicial e
clareamento) foram executadas nos ambulatórios da Faculdade de Odontologia
da Universidade Federal de Goiás.
Os pacientes que se submeteram ao clareamento profissional, foram
monitorados durante o procedimento clínico, sendo que os cuidados
necessários foram dados durante a inserção da barreira para proteção gengival
e, também, durante a inserção do material clareador. Tais cuidados como: uso
de óculos para proteção dos olhos, entrega das instruções de uso do agente
clareador, prova da placa de clareamento e uso de lubrificante para proteção
dos lábios do paciente minimiza a possibilidade de problemas inerentes ao
agente clareador.
Extração dos dentes
Os dentes foram extraídos 7 dias após o término do clareamento. As
exodontias foram realizadas sob anestesia local, empregando fórceps. Os
23
fórceps tiveram como ponto de apoio o terço cervical dos molares. A extração
aconteceu de forma menos traumática possível.
3.3- ETAPA II- ANÁLISES MICROSCÓPICA E IMUNOISTOQUÍMICA
Preparação dos dentes para avaliação da resposta pulpar
Remoção das polpas
Imediatamente após a extração, os dentes foram seccionados no terço
apical da raiz com ponta diamantada n. 2136 (KG Sorensen, Barueri, Brasil)
acoplada a alta rotação sob abundante refrigeração, para permitir a penetração
da solução fixadora. Em seguida, foram etiquetados e armazenados em frascos
individuais contendo solução de formalina a 10% tamponada em tampão
fosfato pH 7,2 (Formaldeído em solução 37% PA ACS, Merck) onde
permaneceu por três dias. Em seguida, as polpas foram removidas com auxílio
de lima Hedstrom (Maillefer, Dentsply) no sentido anti-horário.
Fixação das polpas
As polpas foram armazenadas na formalina a 10% tamponada em
tampão fosfato pH 7,2 (Formaldeído em solução 37% PA ACS, Merck) onde
permaneceram em média por 10 dias.
Processamento, inclusão e corte dos espécimes
24
As peças foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol a
70%, 90% e 100%, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina (Merck KGaA,
Damstadt, Alemanha). As polpas foram seccionadas com auxílio de um
micrótomo (Leica – Jung RM2045 – Leica Instruments Gmbh D-6907 –
Alemanha). Os cortes foram montados em número de 3 a 4 cortes por lâmina,
as quais foram adequadamente codificadas e numeradas.
Coloração das lâminas
Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E). A técnica de
H&E foi realizada para avaliação das características microscópicas gerais (a
serem descritas posteriormente). Após coloração, a avaliação dos possíveis
artefatos de técnica foi realizada, comparando os espécimes dos grupos
experimentais (G1 e G2) com o do grupo controle (caracterizado por dente não
submetido ao agente clareador).
Análise descritiva
A interpretação dos cortes teciduais corados pela técnica de H&E foi
realizada com a utilização de microscópico trinocular (Axiostar Plus-Carl Zeiss)
e possibilitaram o estudo das possíveis alterações morfológicas e dos
processos inflamatórios gerais nas polpas dentárias. A resposta pulpar foi
determinada a partir dos seguintes critérios: (1) Intensidade do infiltrado
inflamatório; (2) Degradação do colágeno e (3) Organização do tecido pulpar
adjacente ao clareamento dental.
Alterações microscópicas gerais
25
Para analisar as alterações microscópicas gerais, foram consideradas
tanto a polpa coronária quanto radicular e um total de 10 campos
microscópicos representativos, utilizando uma objetiva de 40x, foi investigado:
Foram considerados:
a) Intensidade do infiltrado inflamatório, graduada em:
Escores
0 Nenhuma ou poucas células inflamatórias presentes
no tecido pulpar, caracterizando polpa normal
1 Discreto infiltrado inflamatório (quando a maioria dos
campos (>7) apresentava menos de 35% do espaço do
preenchido por células inflamatórias)
2 Severo infiltrado inflamatório (quando a maioria dos
campos (>7) apresentava mais de 35% do espaço do
preenchido por células inflamatórias)
b) Degradação do colágeno
Escores
0 Colágeno preservado
1 Discreta degradação do colágeno (quando a maioria dos
campos (>7) apresentava menos de 35% do espaço com
colágeno degradado.
2 Severa degradação do colágeno (quando a maioria dos
campos (>7) apresentava mais de 35% do espaço do com
colágeno degradado.
26
c) Organização do tecido pulpar
Escores
0 Tecido Normal
1 Desorganização da camada odontoblástica, porém
com tecido pulpar adjacente sadio
2 Tecido pulpar com desorganização total
3 Necrose pulpar
Técnica de Imunoistoquímica e análise quantitativa
A realização da técnica de imunoistoquímica teve como parâmetro a
metodologia descrita por Bruno et al.(2010).
As polpas viáveis foram submetidas à técnica de Imunoistoquímica para
identificação de células imune-inflamatórias e angiogênese. Cortes seriados de
3,0mm de espessura também foram obtidos de cada bloco, mediante a
utilização de um micrótomo (Leica–RM2155), estendidos sobre lâminas de
vidro silanizadas (DAKO, S3003, Glostrup-Denmark) e submetidos à Técnica
de Imunoistoquímica, utilizando o método da imunoperoxidase e/ou do
polimero, preconizada no protocolo técnico do Laboratório de Patologia Bucal
da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás (FO/UFG). As
proteínas identificadas foram: triptase (mastócito), CD68 (macrófagos) e CD31
(vasos sanguíneos).
Os cortes sobre as lâminas foram desparafinizados e hidratados por
meio de banhos consecutivos em xilol, álcool absoluto, álcool etílico 95% e em
solução salina tamponada (PBS) com pH de 7.2. O bloqueio da peroxidase
endógena foi realizada com peróxido de hidrogênio (Merck) a 3% em PBS, por
40 minutos. Após lavagens (no mínimo 3) com PBS, as lâminas foram
27
mergulhadas em tampão Citrato com pH de 6.0 (SIGMA, P4809, Saint Louis –
USA), aquecido a uma temperatura de 95oC, com auxílio de Banho Maria
Digital (DeLeo) para exposição dos seguintes antígenos: triptase, CD68 e
CD31 por 20 minutos.
Após serem lavadas com PBS, as lâminas foram incubadas com soro
albumina bovina (BSA) por 20 minutos, a fim de se obter o bloqueio das
ligações protéicas inespecíficas. Em seguida, as lâminas foram secas e
incubadas com os anticorpos primários por 18 horas, e mantidas na
temperatura de 4oC. Todas as diluições foram realizadas utilizando PBS
associado a soro albumina bovina (PBS-BSA) a 1,0%. Após o período de 18
horas, lavagens consecutivas foram realizadas para posterior incubação com
os anticorpos biotinilados anti-IgG de coelho/camundongo/cabra por 30
minutos, à temperatura de 22 a 25 0C, seguido pela incubação da streptavidina
marcada com peroxidase por 30 minutos, à temperatura ambiente (kit DAKO
LSAB+, Peroxidase- Universal- K0690) e/ou com anticorpos marcados com
polimero (kit DAKO Advanced HRP).
Posterior às lavagens consecutivas com PBS-BSA a 1,0%, realizou-se a
revelação da reação utilizando o substrato 3.3’- Diaminobenzidina (Liquid DAB
+ Substrate Chromogen System) (DAKO K3468). A revelação foi feita, por 2 a 3
minutos, à temperatura ambiente e protegida da luz. A reação foi interrompida
com água destilada e as lâminas contra-coradas com hematoxilina de Mayer,
por 5 minutos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas com água
destilada por duas vezes, as lâminas foram desidratadas com álcoois (95% e
100% GL), passadas em xilol (3 vezes) e montadas com solução de resina não
aquosa (Entellan-Mikroskopie-Merck).
Os controles negativos das reações foram realizados pela da
substituição dos anticorpos primários por PBS-BSA 1%, bem como por soro
normal de coelho (DAKO, X0903-1, Glostrup-Denmark) ou de camundongo
(DAKO, X0910-1, Glostrup-Denmark), descartando assim possíveis falsos
positivos.
A análise morfométrica foi realizada utilizando microscópio óptico
contendo um retículo de integração em rede quadrada (CARL ZEISS,
Germany) acoplado na objetiva de 40x. A área do retículo no aumento de 40x
28
corresponde a 0,0961mm2. Para cada amostra, foram analisados 10 campos
microscópicos alternados, com área total de 0,961mm2.
.
Analise estatística
Para os dados obtidos na análise microscópica, foi realizada análise
descritiva seguida da aplicação do teste Qui Quadrado (p<0,05). Para os
valores obtidos referentes à quantificação de células realizadas na técnica de
imunoistoquímica, foi aplicado o teste de Kuskall Wallis seguido de Mann
Whitney (p<0,05).
29
4 RESULTADOS
No que se refere à intensidade do infiltrado inflamatório (Figura 1), a
análise descritiva apontou que no grupo controle (n=7), no qual não foi
realizado clareamento, nenhum infiltrado inflamatório foi encontrado em 100%
das polpas. No grupo 1 (n=10), no qual foi realizada a técnica de clareamento
caseiro, foi encontrado presença de discreto infiltrado inflamatório em 20% das
amostras, nas demais não foi observada a presença de células inflamatórias.
No grupo 2 (n=12), no qual os pacientes foram submetidos ao clareamento
profissional, 25% das amostras não apresentaram a presença de infiltrado
inflamatório. Neste grupo, discreto infiltrado foi encontrado em 67% das
lâminas analisadas, enquanto 8% das lâminas apresentou severo infiltrado
inflamatório.
Quando os grupos foram comparados no quesito Infiltrado Inflamatório,
o teste estatístico Qui Quadrado foi aplicado e houve diferença estatística entre
os grupos (p= 0,01).
Para avaliação do tecido pulpar, com relação a desorganização das
polpas (Figura 2), observou-se que: no Grupo Controle, 71% das polpas
apresentaram nenhuma evidência de desorganização e 29% encontraram-se
com a camada odontoblástica desorganizada. No Grupo 01, 40% das polpas
apresentaram tecido normal, 50% desorganização da camada odontoblástica e
10% apresentaram desorganização total do tecido pulpar. No grupo Grupo 02,
17% das polpas mantiveram a normalidade do tecido pulpar, 50%
apresentaram desorganização da camada odontoblástica e 33% mostraram
tecido pulpar totalmente desorganizado. Não foi observada necrose pulpar em
nenhuma polpa analisada de quaisquer grupos.
Quando os dados foram submetidos à análise estatística, não houve
diferença estatisticamente significante (p=0,343).
Para analisar os dados referentes à análise microscópica da degradação
do colágeno (Figura 02), foram consideradas a preservação ou degradação de
colágeno. O grupo controle (n=7) mostrou colágeno preservado em 86% das
30
polpas e degradado em 14% delas. O grupo 01 (n=10) apresentou preservação
do colágeno em 78% dos casos e degradação em 22%. Já no grupo 02 (n=12),
o colágeno esteve preservado em 42% das amostras e degradado em 58%.
Para comparar os grupos quanto à degradação do colágeno, o teste Qui
Quadrado foi aplicado e nenhuma diferença estatística entre os grupos foi
encontrada (p=0,194).
Na técnica de Imunoistoquímica, mastócitos , macrófagos (Figura 3) e
vasos sanguíneos (Figura 4) foram quantificados.
Em todas as polpas dos grupos avaliados foi observada ausência de
mastócitos.
Os macrófagos foram encontrados em todos os grupos. A menor
densidade destas células foi encontrada nas polpas do Grupo Controle e maior
nas polpas do Grupo 02. Quando comparados os grupos entre si, houve
diferença estatística entre o grupo submetido ao clareamento profissional e os
grupos controle (p=0,03) e caseiro (p=0,009). Os grupos controle e caseiro não
apresentaram diferenças estatísticas entre si (p=0,537).
Os vasos sanguíneos (CD 31+) apresentaram-se com densidade
semelhante entre os três grupos avaliados. Não houve diferença estatística
entre os grupos (p=0,744).
31
32
33
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