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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

JUARANA DAL MAS

NANOEMULSÃO CONTENDO EXTRATO DA CASCA DE

Rapanea ferruginea COM ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA TÓPICA

Itajaí (SC)

2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

JUARANA DAL MAS



Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Prof. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva Co-orientadora: Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin

Itajaí (SC)

Março de 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

D15n

Dal Mas, Juarana, 1981-

Nanoemulsão contendo extrato da casca de Rapanea ferruginea

com atividade anti-inflamatória tópica / Juarana Dal Mas, 2015.

167f. ; il., tab. ; fig.; quad.

Anexos

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,

Mestrado em Ciências Farmacêuticas.

“Orientadora : Profª . Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva ”

Bibliografia : p. 153-166

1. Química farmacêutica. 2. Extratos vegetais – Uso terapêutico.

3. Nanoemulsão. 4. Myrsinaceae (Rapanea ferruginea). I. Título.

CDU: 615.32

CDU: 612.78

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me permitir seguir em frente e iluminar

mais esta conquista profissional.

Aos meus pais, Janaina e Wladimir, pelo apoio e incentivo para que eu

alcançasse meus objetivos.

Ao meu irmão Samuel, pelos conselhos e incentivo nos momentos de

insegurança e dúvida.

À minha orientadora e co-orientadora, Ruth M. Lucinda da Silva e Tania M. B.

Bresolin, que com as suas experiências souberam me guiar durante o meu trabalho,

com paciência e competência.

À professora Ângela Malheiros, que forneceu as cascas da R. ferruginea e

também me orientou em algumas dúvidas sobre a planta e seus marcadores, sempre

solícita e paciente.

À professora Márcia M. de Souza, que se dispôs à nos auxiliar, realizando o

primeiro ensaio farmacológico do trabalho.

À professora Kathryn A. B. S. da Silva, que com sua paciência e experiência,

me orientou e auxiliou durante a realização dos ensaios farmacológicos. Agradeço

também a amizade, conselhos e risadas.

Aos professores Angélica Couto, Clóvis Rodrigues e Daisy Netz pelas

sugestões realizadas ao longo do trabalho.

À professora Dra. Joana Lea Meira Silveira que permitiu o acesso ao Centro de

Microscopia Eletrônica na UFPR, para realização da análise morfológica das

amostras. Gostaria de agradecer a todos os técnicos do laboratório que me auxiliaram

na execução das análises.

Às colegas Liliani e Bruna que me auxiliaram na execução do teste de irritação

cutânea. Muito obrigada!

Aos colegas e amigos, Tailyn, Roseni, Adriana, Marcel, Ângela, Fabile, Bruna,

Thamiris, Gislaine, Silmara, Viviane pelas conversas animadas, pelos almoços, pelos

jantares, pelas comemorações, pelos desabafos, pelos conselhos, pelas risadas,

pelos momentos de filosofar sobre a origem de tudo. Espero que consigamos construir

uma amizade cada vez mais sólida. Adoro todos vocês!

À colega e amiga Tailyn Zermiani, por todo auxílio e paciência durante as

análises por CLAE e em desvendar os mistérios da R. ferruginea!

À Helenize Heyse Moreira e Juliano dos Santos da secretaria do Programa de

Mestrado em Ciências Farmacêuticas, por todo auxílio todas as vezes em que

precisei.

Aos colaboradores da UNIVALI, Carla, Núbia, Joel, Viviane e Pedro por todo

auxílio nos laboratórios. Aos auxílios prestados pelos técnicos do Biotério Central da

UNIVALI.

À empresa Gattefossé pela doação dos tensoativos Labrafil® M 1944 CS,

Labrasol® e Capryol® 90, e à empresa Oxiteno pela doação do tensoativo Alkest® CSO

400..

Ao apoio financeiro do CNPQ, CAPES, FAPESC.

Enfim, agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram e me

acompanharam durante a realização deste trabalho. Muito obrigada!

“Sempre permaneça aventureiro.

Por nenhum momento se esqueça

de que a vida pertence aos que investigam.

Ela não pertence ao estático. Ela pertence ao que flui.

Nunca se torne um reservatório, sempre permaneça um rio.”

(OSHO)



Juarana Dal Mas Março/2015

Orientadora: Ruth Meri Lucinda da Silva, Doutora. Co-orientadora: Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.

Número de Páginas: 167.

Nanoemulsões são dispersões com tamanho de gota em escala nanométrica, as quais vêm sendo empregadas como veículo tópico para fármacos com o objetivo de potencializar a atividade farmacológica. Estudos prévios com a casca da Rapanea ferruginea, demonstraram a atividade anti-inflamatória do extrato bruto quando administrado por via oral e endovenosa. O presente estudo teve por objetivo desenvolver uma nanoemulsão contendo extrato da casca de R. ferruginea e avaliar a atividade anti-inflamatória tópica. O extrato mole das cascas de R. ferruginea foi obtido e caracterizado. A partir da seleção do miristato de isopropila como fase oleosa, dos tensoativos Alkest® CSO400 e Span® 80 e da construção de diagramas de fases pseudoternários, foi desenvolvida uma nanoemulsão pelo método de inversão de fases por baixa energia. As nanoemulsões foram inicialmente caracterizadas quanto ao tamanho da fase interna, polidispesibilidade, homogeneidade, morfologia, potencial zeta, pH e comportamento reológico. As análises de teor dos marcadores do extrato (AMA e AMB) por CLAE, estabilidade acelerada, liberação in vitro, permeação cutânea empregando pele de porco em modelo de célula de Franz, irritação cutânea pelo método agarose overlay e ensaio pré-clínico da atividade anti-inflamatória em modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton em camundongos foram realizadas com as nanoemulsões contendo o extrato incorporado na fase oleosa. A obtenção da nanoemulsão foi confirmada pelo tamanho médio da fase interna de 47,88 ± 8,20 nm, com índice de polidispersibilidade de 0,228, potencial zeta de -34,7 ± 1,15 mV e forma esférica das gotículas, observada por microscopia eletrônica de transmissão. O pH foi adequado para aplicação tópica (5,25 ± 0,02) e o teor de AMA e AMB foi de 54,10 ± 0,08 µg/g (103,87%) e 53,03 ± 0,03 µg/g (109,25%) de formulação, respectivamente. O sistema apresentou comportamento pseudoplástico tixotrópico. O estudo de estabilidade acelerada demonstrou a influência do extrato diminuindo a estabilidade da nanoemulsão, havendo a necessidade de futuras adequações na formulação. Os marcadores do extrato apresentaram liberação in vitro mais retardada quando o extrato foi incorporado na nanoemulsão, demonstrando controle na sua cedência para o meio. Os marcadores do extrato não permearam a pele de porco, sendo detectados somente na formulação remanescente. O teste de irritação cutânea in vitro demonstrou grau moderado de irritação. O ensaio farmacológico in vivo evidenciou atividade anti-inflamatória tópica, sendo que a nanoemulsão apresentou um efeito 1,6 vezes superior ao do creme convencional contendo 0,13% do extrato incorporado. O mecanismo de ação anti-inflamatória envolveu a redução da liberação das citocinas TNF e MPO. Este trabalho demonstrou que a nanoemulsão desenvolvida é um veículo adequado à aplicação tópica do extrato de R. ferruginea potencializando a sua atividade anti-inflamatória tópica em modelo animal in vivo, requerendo a necessidade de futuras melhorias farmacotécnicas com o objetivo de melhorar a sua estabilidade e melhor compreensão acerca da permeação cutânea dos compostos ativos. Palavras-chave: Nanoemulsão. Rapanea ferruginea. Anti-inflamatório tópico.

NANOEMULSION CONTAINING STEAM BARK EXTRACT OF Rapanea

ferruginea WITH TOPICAL ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY

Juarana Dal Mas March 2015

Supervisor: Ruth Meri Lucinda da Silva, Dr. Co-supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr.

Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances. Number of Pages: 167.

Nanoemulsions are dispersed systems with droplet size in nanometric scale, that have been used as topical carrier for drugs with the aim of improving the pharmacological activity. Previous studies with the steam bark of the Rapanea ferruginea showed anti-inflammatory activity of the extract when administered orally and intravenously. This study aimed to develop a nanoemulsion containing R. ferruginea steam bark extract, and to evaluate the topical anti-inflammatory activity. The soft extract of stem bark of R. ferruginea was obtained and characterized. After selection of isopropyl myristate as oil phase and the surfactants Span 80 and Alkest® CSO400, and construction of pseudo ternary phase diagrams, the nanoemulsion was developed using the low-energy phase inversion method. The nanoemulsions were characterized initially by droplet size, polydispersity, homogeneity, morphology, zeta potential, pH and rheological behavior. The content analysis of the extract markers (MAA and MAB) by HPLC, accelerated stability, in vitro release, cutaneous permeation using porcine skin by the Franz cell model, skin irritation by the agarose overlay method, and preclinical assay of anti-inflammatory activity using the croton oil-induced ear oedema model were conducted with the nanoemulsions containing the extract incorporated in the oil phase. The nanoemulsion obtained was confirmed by the average droplet size of 47.88 ± 8.20 nm, with a polydispersity index of 0.228, zeta potential of -34.7 ± 1.15 mV, and spherical shape of the droplets, observed by microscopy electronic transmission. The pH was suitable for topical use (5.25 ± 0.02) and the content of the MAA and MAB was 54.10 ± 0.08 µg/g (103.87%) and 53.03 ± 0.03 µg/g (109.25%) of the formulation, respectively. The system showed pseudoplastic and thixotropic rheological behavior. The accelerated stability study shows that the extract decreases the nanoemulsion stability, requiring further adjustments in the formulation. The extract markers showed slower in vitro release when the extract was incorporated in the nanoemulsion, demonstrating control in its diffusion to the medium. The extract markers did not permeate the porcine skin, being detected only in the remaining formulation. The in vitro skin irritation assay showed a moderate degree of irritation. The in vivo pharmacological analysis showed topical anti-inflammatory activity. The nanoemulsion was 1.6 times more efficient than the conventional cream containing 0.13% of the extract. The mechanism of anti-inflammatory activity evolved a reduction in the release of the cytokines TNF and MPO. This work showed that the nanoemulsion developed is a suitable carrier for topical use of R. ferruginea extract, improving its topical anti-inflammatory activity in the animal model. Further technological improvements are needed, to adjust the stability and acquire a better understanding of the skin permeation of the active compounds.

Keywords: Nanoemulsion. Rapanea ferruginea. Topical Anti-inflammatory.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Aspecto visual de uma nanoemulsão O/A e a estrutura das gotas........... 34

Figura 2 - Representação esquemática demonstrando o método de emulsificação por

baixa energia, em que a quantidade de água adicionada à emulsão A/O é

aumentada progressivamente até que a inversão de fase ocorra e a emulsão O/A

seja formada. .................................................................................................................. 37

Figura 3 - Esquema demonstrando as diferentes formas de desestabilização de uma

nanoemulsão. ................................................................................................................. 42

Figura 4 - Foto da árvore Rapanea ferruginea................................................................ 46

Figura 5 - Estruturas químicas dos ácidos mirsinoicos A, B e C. ................................ 47

Figura 6 - Foto demonstrativa da montagem da célula de Franz com nanoemulsão.

........................................................................................................................................... 79

Figura 7 - Foto demonstrativa do detalhe do sistema das células de difusão de Franz

fechado e da coleta das amostras. ............................................................................. 79

Figura 8 - Perfil cromatográfico da solução extrativa e do extrato mole das cascas de

R. ferruginea por CCD................................................................................................... 91

Figura 9 - Perfis cromatográficos por CLAE dos padrões de ácidos mirsinoicos A (a)

e B (b); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB................................................. 92

Figura 10 - Perfil cromatográfico por CLAE da solução extrativa das cascas de R.

ferruginea. ....................................................................................................................... 92

Figura 11 - Perfil cromatográfico por CLAE do extrato mole das cascas de R.

ferruginea. ....................................................................................................................... 93

Figura 12 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R.

ferruginea em diferentes óleos: (1) e (2) Poly: triglicérides de ácido cáprico e

caprílico (TCC); (3) e (4) MI: miristato isopropila; (5) e (6) Cap 90: Capryol 90; (7)

e (8) CeV: Cetiol V; (9) e (10) Ce868: Cetiol 868. .................................................... 95


ferruginea com óleo miristato de isopropila com diferentes tensoativos: (1) e (2)

óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO

400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11) e (12) óleo +

Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90. ............................................................... 97


ferruginea com o óleo triglicérides cáprico caprílico com diferentes tensoativos: (1)

e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest®

CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11) e (12) óleo

+ Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90. ............................................................ 97

Figura 15 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das

nanoemulsões de miristato de isopropila, Capryol 90 e Alkest CSO 400, usando

métodos diferentes: titulação e ponto a ponto......................................................... 101


nanoemulsões de miristato de isopropila, Alkest CSO 400 e Span 80, usando

métodos diferentes: titulação e ponto a ponto......................................................... 103


nanoemulsões de miristato de isopropila, Capryol 90 e Tween 80, usando métodos

diferentes: titulação e ponto a ponto. ........................................................................ 105

Figura 18 - Gráficos representativos da distribuição do tamanho da fase interna da

nanoemulsão sem extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B), com seus

respectivos gráficos de taxa de correlação correspondentes (A1 e B1). ............ 119

Figura 19 - Micrografias eletrônicas obtidas após coloração negativa da nanoemulsão

sem extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B). Aumento de 15.000x........ 120

Figura 20 - Perfil de viscosidade da nanoemulsão veículo (imagem à esquerda) e da

nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole das cascas de R. ferruginea

(imagem à direita)......................................................................................................... 121

Figura 21 - Perfis cromatográficos por CLAE do extrato mole de R. ferruginea, da

nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole de R. ferruginea e da nanoemulsão

veículo, em 270 nm. ..................................................................................................... 122

Figura 22 - Fotografia demonstrando o aspecto visual das nanoemulsões branco e

com extrato após o término do estudo de estabilidade acelerada, expostas a

temperatura ambiente e a 40 °C. ............................................................................... 125

Figura 23 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato

(NE branco) durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero, e após

exposição a temperatura ambiente nos tempos 30, 90 e 180 dias...................... 126

Figura 24 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato

(NE branco) durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero e após

exposição a temperatura de 40 °C nos tempos 30, 90 e 180 dias. ..................... 127

Figura 25 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro

para as nanoemulsões e cremes contendo extrato de R. ferruginea.................. 132

Figura 26 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro

para o extrato mole da casca de R. ferruginea a 0,25% em DMSO.................... 132

Figura 27 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do extrato mole

de R. ferruginea 0,13% em propilenoglicol. n= 6 células. ..................................... 134

Figura 28 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB da nanoemulsão

com 0,13% de extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células. ................................. 135

Figura 29 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do creme com

0,13% de extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células. .......................................... 135

Figura 30 - Efeito dos cremes contendo extrato mole de R. ferruginea (RF 0,25%,

0,5% e 1,0%) e AMB (0,5% e 0,1%) administrados topicamente sobre edema de

orelha induzido pelo óleo de cróton. ......................................................................... 142

Figura 31 - Efeito das nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R. ferruginea

e dexametasona administrados topicamente sobre edema de orelha induzido por

óleo de cróton. O edema de orelha foi mensurado após 6 h da indução com óleo

de cróton. ....................................................................................................................... 143

Figura 32 - Fotomicrografias dos cortes histológicos das orelhas dos camundongos,

corados em hematoxilina-eosina (HE), 6 horas após a indução do edema com óleo

de cróton 2,5% (4x e 10x). (A) naive, (B) controle negativo, (C) controle positivo

tratado com dexametasona 0,1%, (D) tratamento com veículo-creme, (E)

tratamento com creme 0,13% extrato de R. ferruginea, (F) tratamento com veículo-

nanoemulsão, (G) tratamento com nanoemulsão 0,13% extrato de R. ferruginea.

As setas indicam a presença de infiltrado celular e as barras vermelhas indicam a

espessura dérmica....................................................................................................... 146

Figura 33 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R.

ferruginea sobre a atividade da mieloperoxidase no sobrenadante de

homogeneizados das orelhas tratadas com óleo de cróton 2,5%. A atividade da

MPO foi mensurada após 6 h da indução pelo óleo de cróton............................. 148

Figura 34 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R.

ferruginea sobre a inibição da quimiocina derivada de queratinócitos (KC) induzida

por óleo de cróton 2,5% em orelhas de camundongos. ........................................ 149

Figura 35 - Efeito da nanoemulsão e do creme contendo 0,13% de extrato de R.

ferruginea sobre a produção de IL-1β e TNF, induzida por óleo de cróton 2,5% em

orelhas de camundongos. ........................................................................................... 150

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Teor de marcadores AMA e AMB nas soluções extrativas das cascas de R.

ferruginea. ....................................................................................................................... 89

Tabela 2 - Resultados das análises realizadas nos derivados vegetais das cascas da

R. ferruginea. .................................................................................................................. 90

Tabela 3 - Valores de transmitância e absorbância da mistura de óleo e extrato mole

de R. ferruginea no teste de solubilidade................................................................... 95

Tabela 4 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de

solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em miristato de isopropila e

diferentes tensoativos.................................................................................................... 98

Tabela 5 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de

solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em triglicérides de ácido cáprico e

caprílico e diferentes tensoativos. ............................................................................... 99

Tabela 6 - Formulações e características dos sistemas nanoemulsionados

selecionados para o estudo de estabilidade preliminar. ........................................ 107

Tabela 7 - Resultados das análises no tempo inicial (ti) e final (tf) das nanoemulsões

sem extrato submetidas aoestudo de estabilidade preliminar.............................. 108

Tabela 8 - Resultados do estudo de estabilidade preliminar para as amostras com e

sem extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, com e sem

Sepigel®. ........................................................................................................................ 113

Tabela 9 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as

formulações com o extrato de R. ferruginea incorporado na fase aquosa (linhas

em cinza) e na fase oleosa com diferentes concentrações de propilenoglicol (linhas

em branco). ................................................................................................................... 114

Tabela 10 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as

nanoemulsões com 0,25% e 0,13% de extrato de R. ferruginea, incorporados na

fase oleosa (linhas cinzas) e na fase aquosa (linhas brancas). ........................... 116

Tabela 11 - Análise da constante de Ostwald-de-Waele (K) e do índice de

comportamento de fluxo (n) para a nanoemulsão veículo e para a nanoemulsão

com extrato de R. ferruginea. ..................................................................................... 121

Tabela 12 – Resultado do estudo de estabilidade acelerada das nanoemulsões nas

temperaturas ambiente e 40 ºC. ................................................................................ 124

Tabela 13 - Análise dos dados obtidos com o ensaio de liberação in vitro do AMB e

AMA a partir do extrato mole em propilenoglicol, do creme e da nanoemulsão

contendo extrato. .......................................................................................................... 138

Tabela 14 - Resultados do estudo de permeação cutânea para a nanoemulsão e

creme contendo extrato de R. ferruginea e para o extrato de R. ferruginea em

propilenoglicol, em modelo de célula de Franz, usando pele de porco. ............. 139

Tabela 15 - Porcentagem de inibição e média da espessura do edema de orelha

induzido pelo óleo de cróton 2,5% nos grupos tratados com as nanoemulsões e

cremes contendo extrato mole de R. ferruginea. .................................................... 144

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Condições cromatográficas para análise dos derivados vegetais de R.

ferruginea por CLAE. ..................................................................................................... 68

Quadro 2 - Combinações de tensoativos e suas respectivas proporções empregadas

no desenvolvimento das nanoemulsões. ................................................................... 70

Quadro 3 - Formulações dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o estudo

de estabilidade preliminar. ............................................................................................ 71

Quadro 4 - Composição do creme convencional utilizado nos ensaios farmacológicos,

liberação in vitro e permeação cutânea in vitro......................................................... 73

Quadro 5 - Composição das nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea

e com e sem Sepigel® testadas no estudo de estabilidade preliminar.................. 74

Quadro 6 - Composição da nanoemulsão selecionada para incorporação do extrato

mole de R. ferruginea. ................................................................................................... 75

Quadro 7 - Grau de reatividade para teste de difusão em ágar................................... 78

LISTA DE ABREVIATURAS

AA – Ácido Araquidônico

AAPH – 2,2’ – azobis (2-amidinopropano) dicloridrato

ABTS+ - 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico

AFM – Atomic Force Microscopy

AMA – Ácido mirsinoico A

AMB – Ácido mirsinoico B

AMC – Ácido mirsinoico C

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

COX-2 – Ciclooxigenase 2

DLS – Dynamic Light Scattering ou Espalhamento Dinâmico de Luz

DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s médium

DMSO - Dimetilsulfóxido

DPPH – 2,2 difenil-1-picrilhidrazil

EHL – Equilíbrio Hidrófilo-lipófilo

ELISA – Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay

ESEM – Environmental Scanning Eletron Microscopy

FDA – Food and Drug Administration

GRAS – Generally Recognized as Safe

HE – Hematoxilina-eosina

HELA – Adenocarcinoma de colo de útero

HPLC – High-performance Liquid Chromatography

HRP – Horseradish peroxidase

IFN – Interferon

IFN-γ – Interferon γ

IL-1 – Interleucina 1

IL-1α – Interleucina 1α

IL-1β – Interleucina 1β



K562 – Leucemia mieloide/eritroleucemia Ph+

KC – Quimiocina derivada dos queratinócitos

L929 – Linhagem de fibroblastos murino

MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão

MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura

MFA – Microscopia de Força Atômica

MIP-2 – Proteína inflamatória dos macrófagos-2

MPO - Mieloperoxidase

NF-kB – Fator de Transcrição Nuclear kB

NK – Células Natural Killer

NO – Óxido Nítrico

OECD – Organization for Economic Co-operation and Development

OMS – Organização Mundial da Saúde

ORAC – Oxygen Radical Absorbance Capacity

PAF – Fator de Ativação Plaquetária

PBS – Tampão salina fosfato

PFA - Paraformaldeído

PDI – Índice de Polidispersibilidade

PIC – Phase Inversion Composition Methods ou Método de Inversão por

Composição

PIT – Phase Inversion Temperature Methods ou Método de Inversão por

Temperatura

PMSF – Phenylmethanesulfonylfluoride

PTFE - Politetrafluoretileno

ROS – Espécies Reativas de Oxigênio

SEM – Scanning Eletron Microscopy

TCC – Triglicérides de ácido cáprico e caprílico

TEM – Transmission Eletron Microscopy

TNF – Fator de Necrose Tumoral

TPA – 12-O-tetradecanoilforbol acetato

TSEM – Transmission Scanning Eletron Microscopy

UV - Ultravioleta

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 27

2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29

2.1 Objetivo Geral....................................................................................... 29

2.2 Objetivos Específicos: ......................................................................... 29

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 31

3.1 Nanoemulsões...................................................................................... 31

3.1.1 Desenvolvimento de Nanoemulsões ................................................................... 35

3.1.2 Caracterização das Nanoemulsões ..................................................................... 37

3.1.3 Estabilidade de Nanoemulsões ............................................................................ 41

3.2 Plantas Medicinais de Uso Tópico ...................................................... 43

3.3 Rapanea ferruginea Mez. (Myrsinaceae) ............................................. 45

3.4 Resposta Inflamatória .......................................................................... 50

3.4.1 Inflamação cutânea .................................................................................................. 54

3.4.2 Tratamento da Inflamação cutânea...................................................................... 56

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 61

4.1 Material ................................................................................................. 61

4.2 Análise das cascas pulverizadas de R. ferruginea ............................. 65

4.3 Obtenção e caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.

ferruginea ................................................................................................... 65

4.3.1 Obtenção ..................................................................................................................... 65

4.3.2 Caracterização ........................................................................................................... 66

4.4 Estudos de pré-formulação das nanoemulsões ................................. 68

4.4.1 Determinação da solubilidade do extrato .......................................................... 68

4.4.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato ...................................... 69

4.5 Desenvolvimento das nanoemulsões ................................................. 69

4.5.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário ......................................... 69

4.5.2 Estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica das

nanoemulsões sem extrato .............................................................................................. 71

4.5.3 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo

extrato .................................................................................................................................... 72

4.6 Caracterização das nanoemulsões ...................................................... 75

4.6.1 Aspecto visual e estabilidade física .................................................................... 75

4.6.2 Análise morfológica ................................................................................................. 76

4.6.3 Análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta ...................... 76

4.6.4 Comportamento reológico...................................................................................... 76

4.6.5 Quantificação dos marcadores da R. ferruginea por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência (CLAE) .................................................................................................. 76

4.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão............................ 77

4.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R.

ferruginea ................................................................................................... 77

4.9 Análise de liberação in vitro da nanoemulsão contendo extrato da R.

ferruginea ................................................................................................... 78

4.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo

extrato de R. ferruginea ............................................................................. 80

4.11 Ensaios farmacológicos da atividade anti-inflamatória .................... 82

4.11.1 Animais ...................................................................................................................... 82

4.11.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo da R. ferruginea e do AMB

incorporados em creme convencional e nanoemulsão ........................................... 83

4.11.3 Dosagem de citocinas em pele inflamada tratada com creme e

nanoemulsões contendo R. ferruginea......................................................................... 84

4.11.4 Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO) em pele inflamada

tratada com creme e nanoemulsões contendo R. ferruginea................................. 85

4.11.5 Análise histológica em pele inflamada tratada com creme e nanoemulsões

contendo R. ferruginea ...................................................................................................... 86

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 87

5.1 Material vegetal..................................................................................... 87

5.1.1 Determinação de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido ...................... 87

5.1.2 Perda por dessecação ............................................................................................. 87

5.2 Obtenção e Caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.

ferruginea ................................................................................................... 88

5.3 Estudos de pré-formulação .................................................................. 93

5.3.1 Determinação da solubilidade do extrato .......................................................... 93

5.3.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato mole............................ 99

5.4 Desenvolvimento das nanoemulsões ................................................100

5.4.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário ....................................... 100


nanoemulsões ................................................................................................................... 107

5.5 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo

extrato de R. ferruginea .................................................................................................. 111

5.6 Caracterização das nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea ...... 117

5.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão ..........................122

5.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R.

ferruginea ..................................................................................................131


ferruginea ..................................................................................................133

5.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo

extrato de R. ferruginea ............................................................................139

5.11 Ensaios farmacológicos ...................................................................141

6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 151

REFERÊNCIAS................................................................................................................... 153

ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS – CEUA-

UNIVALI ............................................................................................................................... 167

27

1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de novos veículos emulsionados para carrear ativos para

aplicação tópica, visando solucionar problemas de biodisponibilidade ou ainda de

estabilidade, é uma constante na indústria farmacêutica. Sistemas nanoestruturados,

como lipossomas, microemulsões, nanoemulsões, nanopartículas lipídicas e

poliméricas, são exemplos de carreadores para a liberação de ativos na pele, com o

objetivo de modificar os perfis de liberação, permeação ou oclusão da pele

(STRÖHER; ARMIJO; RAFFIN, 2010).

As formulações lipossomadas apresentam certas limitações de aplicação,

quanto à capacidade de incorporação do fármaco e à estabilidade. Já as

microemulsões, exibem baixa capacidade relativa de concentração de ativos para a

alta concentração de tensoativos, o que tem sido geralmente reconhecido como

indutor de irritações cutâneas. Recentemente, por apresentarem vantagens como

controle do tamanho da fase interna da emulsão, menor concentração de tensoativos

e capacidade de dissolução de fármacos lipofílicos, as nanoemulsões têm sido muito

estudadas como veículos para fármacos para diferentes vias de administração

(endovenosa, tópica, oral ou ocular) e aplicações terapêuticas (ZHOU et al., 2010).

A nanoemulsão se apresenta como uma emulsão transparente ou translúcida

(TADROS et al., 2004) com tamanho de gota em escala nanométrica. Como as

emulsões convencionais, as nanoemulsões, estão termodinamicamente em estado de

não equilíbrio, no entanto, a cinética de desestabilização das nanoemulsões é lenta,

aproximadamente meses, sendo consideradas cineticamente estáveis (ANTON;

VANDAMME, 2011). Isto se deve ao tamanho reduzido das gotas que confere

estabilidade frente à sedimentação ou cremeação, além de prevenir a floculação e a

coalescência (ANTON; VANDAMME, 2011; SOLANS; SOLÈ, 2012).

As características físico-químicas das nanoemulsões irão depender do

tamanho da gota, viscosidade, densidade, inversão de fase, turbidez, índice de

refração, sendo estas características mensuradas por várias técnicas, tais como:

espectrofotômetro de luz dispersa, potencial Zeta, microscopia de transmissão

eletrônica, concentração do fármaco, medida da viscosidade, entre outras (THAKUR

et al., 2012).

28

Considerando as inúmeras aplicabilidades das nanoemulsões e suas

vantagens, diversos estudos investigam a incorporação de ativos para aplicação

tópica (ALAM et al., 2013; ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011; BIDONE et al., 2014;

FERNÁNDEZ-CAMPOS et al., 2013; HARWANSH et al., 2011; KHURANA; JAIN;

BEDI, 2013; MÜLLER, 2013; PATHAN; SETTY, 2011; QUINTÃO et al., 2013;

SAKEENA et al., 2010; SANDIG et al., 2013; SHAKEEL et al., 2010; ZHOU et al.,

2010). Várias espécies vegetais têm sido estudadas como fonte de novos fármacos e

seus extratos incorporados em sistemas nanométricos com o objetivo de aumentar

seu potencial terapêutico (ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011; BIDONE et al., 2014;

FASOLO, 2007; HARWANSH et al., 2011; LIANG et al., 2012; OLIVEIRA, 2008;

QUINTÃO et al., 2013; SAKULKU et al., 2009; WANG et al., 2008), havendo pouca

literatura quanto à incorporação de extratos vegetais em nanoemulsões para uso

tópico.

A Rapanea ferruginea é uma espécie vegetal da família Mirsinaceae, conhecida

popularmente como capororoca. Em algumas espécies foram isolados compostos

chamados ácidos mirsinoicos A, B e C (BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998; FRONZA;

GIURADELLI, 2009; HIROTA et al., 2002; JANUÁRIO et al., 1992). Estudos realizados

por pesquisadores no Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da

Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI), isolaram o ácido mirsinoico B (AMB) do

extrato clorofórmico das cascas de R. ferruginea (TURMINA, 2005) e o ácido

mirsinoico A (AMA) do extrato etanólico dos frutos da R. ferruginea. Os extratos mole

e seco da R. ferruginea apresentaram ação antinociceptiva, via oral e intraperitoneal,

em dor de origem inflamatória, assim como o composto isolado AMB que apresentou

ação anti-hipernociceptiva em modelos animais de dor persistente de origem

inflamatória (ANTONIALLI et al., 2012). Estudos também demonstram a ação anti-

inflamatória tópica do AMA e AMB em edema de orelha induzido por TPA (DONG et

al., 1999; HIROTA et al., 2002). Não havendo estudos a respeito da ação anti -

inflamatória tópica do extrato das cascas de R. ferruginea.

Considerando o efeito antinociceptivo de origem inflamatória dos extratos da

casca de R. ferruginea e o potencial das nanoemulsões como veículos para uso

tópico, no presente estudo foi realizado o desenvolvimento de nanoemulsão contendo

o extrato mole de R. ferruginea e avaliada a atividade anti-inflamatória tópica in vivo.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver nanoemulsão contendo extrato mole da casca de Rapanea

ferruginea e avaliar a atividade anti-inflamatória tópica em modelo farmacológico in

vivo.

2.2 Objetivos Específicos:

Preparar e caracterizar quali e quantitativamente o extrato mole da casca

de Rapanea ferruginea;

Desenvolver a nanoemulsão contendo o extrato mole da casca de Rapanea

ferruginea;

Caracterizar a nanoemulsão com e sem extrato quanto aos aspectos físicos

e físico-químicos;

Avaliar in vitro a liberação e a permeação cutânea dos marcadores químicos

do extrato incorporados na nanoemulsão;

Avaliar a irritação cutânea da formulação usando modelo celular in vitro;

Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica da nanoemulsão e do creme

contendo extrato da casca de R. ferruginea através do modelo de edema

de orelha em camundongos, análise histológica dos tecidos inflamados e

quantificação das citocinas (TNF, IL-1β, KC e MPO) nos tecidos inflamados.

31

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Nanoemulsões

A nanotecnologia tem desempenhado importante papel no desenvolvimento de

novas alternativas para potencializar a ação de fármacos já presentes no mercado ou

inovadores. A possibilidade que a nanotecnologia oferece de manipular fármacos e

outros materiais em escala nanométrica pode alterar suas propriedades básicas e sua

bioatividade. No caso dos veículos para fármacos, as características que podem ser

manipuladas são a solubilidade, aumento da área superficial, controle de liberação e

direcionamento para o sítio de ação (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012). Isso é de

grande aplicabilidade para o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos, já que

os extratos vegetais e fitoconstituintes apesar de demonstrarem grande potencial in

vitro, possuem pouca ou nenhuma ação in vivo, devido à pobre solubilidade lipídica

ou tamanho molecular impróprio ou ambos e, portanto são menos absorvidas e

biodisponíveis (KESARWANI; GUPTA, 2013).

A efetividade de qualquer medicamento fitoterápico depende da liberação de

uma quantidade efetiva dos seus compostos ativos. Os extratos vegetais, em que

existem vários componentes que favorecem sua ação sinérgica, os quais, em sua

maioria, são solúveis em água, característica que reduz a biodisponibilidade dos

extratos, podem ser incorporados em diferentes sistemas de liberação que aumentam

o seu fluxo de liberação, assim como a capacidade de atravessar membranas

biológicas ricas em lipídeos, melhorando a biodisponibilidade (KESARWANI; GUPTA,

2013).

Como sistemas nanométricos empregados para melhorar a biodisponibilidade

dos derivados vegetais podem ser citados os lipossomas, as microesferas, as

nanopartículas, as transferossomas, os etossomas, as nanoemulsões e as

microemulsões. Os sistemas de liberação baseado em fosfolipídeos, como os

lipossomas, tem sido promissor para a efetividade e eficácia de plantas medicinais

(KESARWANI; GUPTA, 2013). Na literatura são encontradas poucas referências às

nanoemulsões como veículo para a incorporação de extratos vegetais.

Os sistemas nanométricos possuem grande aplicabilidade quando se quer

administrar medicamentos por via tópica. Embora a pele seja uma excelente via para

32

administração de medicamentos com ação tópica, local ou sistêmica, esta constitui

uma importante barreira que dificulta a penetração de ativos, já que muitos não

apresentam características que facilitam a sua penetração na pele (ESCOBAR-

CHÁVEZ et al., 2012).

As nanoemulsões são emulsões com tamanho das gotas da fase

dispersa em escala nanométrica, encontrando-se na literatura variações entre 20, 100,

200, 300 nm e até acima de 500 nm, sendo estabelecido como critério a propriedade

óptica e a aplicação, sendo as nanoemulsões do tipo óleo em água (O/A) mais

estudadas que as nanoemulsões água em óleo (A/O) (SOLANS; SOLÈ, 2012).

As nanoemulsões têm recebido enorme atenção nos últimos anos para

aplicação em produtos de cuidados pessoais assim como veículo para administração

de vacinas, antibióticos, anticonvulsivantes, anti-hipertensivos, anti-inflamatórios,

cosméticos e preparações tópicas, podendo ser administrada por diferentes vias

(GUGLIELMINI, 2008; GUTIÉRREZ et al., 2008; THAKUR et al., 2012). Extensas

pesquisas têm surgido para o desenvolvimento, caracterização e aplicação de

nanoemulsões já que são consideradas excelentes veículos para dissolução e

transporte de ativos hidrofóbicos e/ou hidrofílicos, derivados vegetais e fitofármacos,

proteinas e peptídeos (LU; QI; WU, 2012).

O aumento do interesse na escolha das nanoemulsões como veículo na área

farmacêutica se deve as suas vantagens como (SOLANS et al., 2005; TADROS et al.,

2004; THAKUR et al., 2012):

- possuem estabilidade frente a sedimentação ou cremeação, floculação e

coalescência;

- não são tóxicas nem irritantes quando comparadas às microemulsões,

possibilitando a administração de fármacos por diferentes vias;

- podem veicular fármacos hidrofílicos e lipofílicos;

- como o tamanho das gotas é na escala nanométrica, a sua grande área

interfacial aumenta a taxa de absorção ou permeação e reduz a variabilidade,

aumentando a biodisponibilidade dos fármacos;

- são adequadas para uso humano e animal;

- protegem os fármacos da hidrólise e oxidação devido a sua encapsulação em

gotas de óleo e pode também mascarar o sabor no caso da administração oral;

- aumentam a permeação de ativos através da pele;

33

- o aspecto transparente, a fluidez e a ausência de pegajosidade fornecem às

nanoemulsões características sensoriais mais agradáveis para aplicação em

cosméticos;

- empregam, relativamente, baixa concentração de tensoativos;

- podem ser aplicadas como substitutas para lipossomas, os quais são muito

mais instáveis.

Na literatura o termo nanoemulsão pode aparecer referenciado como

miniemulsões, emulsões ultrafinas, emulsões submicrométricas, etc. O termo

nanoemulsão é preferível pois dá uma ideia de tamanho de nanoescala para as gotas,

embora provoque erros de interpretação com o termo microemulsão (SOLANS et al.,

2005). Os dois sistemas, nanoemulsão e microemulsão, são basicamente diferentes

em termos de estabilidade termodinâmica. As microemulsões apresentam-se como

um sistema termodinamicamente estável, já as nanoemulsões são instáveis

termodinamicamente, porém estáveis cineticamente pois sua cinética de

desestabilização é lenta, em torno de meses. As gotículas das microemulsões são

fortemente afetadas, se rompendo mediante mudanças na temperatura e/ou diluições,

enquanto as gotas das nanoemulsões se mantém estáveis nestas condições. Estas

diferenças trazem consequências para as aplicações de um ou outro sistema, já que

variando a via de administração poderão ocorrer mudanças termodinâmicas que

interferem na estabilidade do sistema escolhido (ANTON; VANDAMME, 2011).

Outro ponto que deve ser observado na diferenciação entre nanoemulsão e

microemulsão é a ordem de adição dos componentes durante a sua formação. Na

formulação de uma nanoemulsão esta ordem é muito importante, já que a mesma é

formada somente se os tensoativos são misturados primeiro com a fase oleosa. Se

eles forem misturados primeiramente com a água antes da adição da fase oleosa, irá

formar somente uma macroemulsão. Já as microemulsões independem da ordem de

adição dos componentes, após o período de equilíbrio (ANTON; VANDAMME, 2011).

Visualmente a nanoemulsão apresenta-se com aspecto transparente ou

translúcido, devido a característica do tamanho das gotas, conforme observado na

Figura 1 (SOLANS et al., 2005). Burguera e Burguera (2012) relatam aspecto

transparente com tamanho de gota entre 50 e 200 nm e translúcido ou turvo com

tamanho de gota acima de 500 nm, sendo este aspecto visual dependente do raio da

gota e da diferença no índice de refração entre as gotas e a fase contínua .

34

Contradizendo estes dados, diversos autores relatam que gotículas com tamanho

acima de 100 nm apresentam coloração branca perdendo a transparência (KLANG et

al., 2012), confirmado em diversos trabalhos que demonstram aspecto leitoso com

gotas de tamanho variando entre 200 e 220 nm (SCHALBART; KAWAJI; FUMOTO,

2010), entre 150 e 212 nm (KELMANN et al., 2007) e entre 112 e 196 nm (ARAÚJO

et al., 2011) e com aspecto transparente ou translúcido com tamanho de gota abaixo

de 30 nm (MCCLEMENTS, 2012), azulada e transparente com tamanho de gota de

aproximadamente 20 nm (PENG et al., 2010; SANDIG et al., 2013).

Figura 1 - Aspecto visual de uma nanoemulsão O/A e a estrutura das gotas.

Fonte: Gutiérrez et al., 2008.

Segundo a definição de sistemas nanométricos da Agência Européia de

Medicamentos (EMA – European Medicines Agency), estes deverão estar na faixa

próximo de 0,2 nm até em torno de 100 nm (EMA, 2006). Já de acordo com as

recomendações da Comissão Européia (EU Commission), um nanomaterial deve

possuir pelo menos um dos seguintes critérios: uma ou mais das dimensões externas

das partículas deverão estar na faixa entre 1-100 nm para mais que 1% do número de

partículas; suas estruturas superficiais ou internas deverão ter suas dimensões na

faixa de tamanho entre 1 e 100 nm; ou ter uma área superficial específica por volume

maior que 60 m²/cm³, excluindo materiais que possuem partículas menores que 1 nm

(MIHRANYAN; FERRAZ; STROMME, 2012). Considerando também que o aspecto

visual de uma nanoemulsão é transparente ou translúcido e, os trabalhos que

35

demonstram que o tamanho de gotículas maior que 100 nm caracteriza uma

nanoemulsão leitosa (MASON et al., 2006; MCCLEMENTS, 2012; SANDIG et al.,

2013; SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET; L'ALLORET, 2004), o tamanho das gotas

de uma nanoemulsão terá que ser menor que 100 nm.

O tamanho dos nanosistemas também podem caracterízá-los

toxicologicamente. Baseado no tamanho dos sistemas nanométricos e a sua

biodegradabilidade, Keck e Müller (2013) propõem um sistema de classificação,

dividindo estes sistemas em quatro classes. Nanosistemas com tamanho acima de

100 nm e pouco abaixo de 1000 nm, biodegradáveis, pertencem à classe I, indicando

nenhum ou menor risco toxicológico. Alguns podendo ser considerados sem nenhum

risco em princípio, pois podem possuir baixo risco ao provocar efeitos adversos

quando interagem com o sistema imune. À classe II pertencem os nanosistemas com

tamanho maior que 100 nm, porém não-biodegradáveis. Nanosistemas com tamanho

menor que 100 nm biodegradáveis, fazem parte da classe III. Sistemas pertencentes

a classe II e III possuem médio risco toxicológico. Já sistemas com alto risco

toxicológico, estão classificados na classe IV, com tamanho menor que 100 nm,

podendo acessar todas as células, e não são biodegradáveis (KECK; MÜLLER, 2013).

De acordo com esta proposta de classificação, nanoemulsões com tamanho da fase

interna menor que 100 nm possuindo componentes biodegradáveis, são consideradas

de médio risco toxicológico, pertencendo a classe III de risco.

3.1.1 Desenvolvimento de Nanoemulsões

A composição básica das nanoemulsões utiliza óleo, tensoativo e fase aquosa

(THAKUR et al., 2012), sendo a concentração do tensoativo menor do que o

necessário para a formulação de microemulsões (cerca de 20-25% de tensoativo), ou

seja, 5-10% de tensoativo para uma nanoemulsão (TADROS et al., 2004; THAKUR et

al., 2012; ZHOU et al., 2010).

Existem dois métodos principais que podem ser usados para a formação de

uma nanoemulsão, métodos que empregam baixa energia e métodos de alta energia.

Os métodos de alta energia são comumentes empregados para a geração de

nanoemulsões. Eles empregam equipamentos como agitadores com alto poder de

cisalhamento, homogeneizadores de alta pressão e métodos de sonicação, para a

geração de pequeníssimas gotículas, no entanto, o alto custo devido a grande

36

quantidade de energia necessária para a formação das nanogotículas, tornam estes

métodos não atrativos (SOLANS; SOLÈ, 2012).

No método de baixa energia há formação espontânea de gotículas minúsculas

em misturas de tensoativo-óleo-água quando as condições da formulação ou do

ambiente são alteradas, ou por mudança da composição ou alteração de temperatura,

isto é, inversão de fase e métodos de emulsificação espontânea (MCCLEMENTS,

2012). A grande vantagem do método de baixa energia é que não exige fornecimento

de energia, ou seja, as propriedades fisico-químicas intrínsecas dos componentes

geram pequenas gotículas, sendo apenas necessário uma simples agitação (ANTON;

VANDAMME, 2011; SOLANS; SOLÈ, 2012).

Em um estudo com três modelos de sistema ternário, água/tensoativo não

iônico/óleo, Anton e Vandamme (2009) indicaram que os métodos de baixa energia

seguem um simples mecanismo universal controlado pelo rápido deslocamento dos

tensoativos do óleo para a fase aquosa, dando origem a nano-emulsificação

espontânea. Isto é, a porção hidrofílica do tensoativo contido na fase oleosa é

rapidamente dissolvida na porção aquosa, em temperatura ambiente, ocasionando a

ruptura do óleo em nanogotículas, as quais são estabilizadas pelos tensoativos. O

tamanho das gotas formadas é dependente da relação de peso óleo/tensoativo

(ANTON; VANDAMME, 2011).

A inversão de fase pode ser causada por mudanças na temperatura ou na

composição. O método de inversão por temperatura (PIT – Phase Inversion

Temperature Methods) é útil na preparação de nanoemulsão usando tensoativos não

iônicos polietoxilados, sensíveis a alteração de temperatura que induz a mudanças na

hidratação das cadeias polietoxiladas alterando a curvatura do tensoativo (SOLAN;

SOLÈ, 2012). As cadeias polietoxiladas tornam-se desidratadas com o aumento da

temperatura, tornando-se mais lipofílico, invertendo a fase da nanoemulsão O/A para

A/O. Neste método o tamanho das gotas e a tensão interfacial tendem ao mínimo (LU;

QI; WU, 2012). No método de inversão por mudanças na composição (PIC – Phase

Inversion Composition Methods), a transição de fase é induzida por mudanças na

composição durante a emulsificação, em temperatura constante. O método consiste

na adição progressiva de um dos componentes (água) sobre a mistura dos outros

componentes (óleo-tensoativo) e se aplica para utilização de outros tensoativos além

daqueles do tipo etoxilado. Inicialmente, quando a água é adicionada

progressivamente à fase oleosa, geralmente é uma microemulsão A/O; com o

37

aumento da proporção de água, o grau de hidratação das cadeias polietoxiladas do

tensoativo aumenta progressivamente, alterando a curvatura espontânea do

tensoativo de negativa para zero, equilibrando as propriedades hidrofílicas-lipofílicas

do tensoativo (Figura 2). É um método considerado com grande potencial para a

produção industrial, por ser de fácil execução, além de possibilitar o emprego de

substâncias sensíveis à temperatura (SOLANS; SOLÈ, 2012).

Figura 2 - Representação esquemática demonstrando o método de emulsificação por baixa energia, em que a quantidade de água adicionada à emulsão A/O é aumentada progressivamente até que a inversão de fase ocorra e a emulsão O/A seja formada.

Fonte: Mcclements e Rao, 2011.

3.1.2 Caracterização das Nanoemulsões

Para a caracterização das nanoemulsões são utilizadas diversas técnicas em

que são avaliadas a aparência visual, pH, tamanho de partícula, carga da superfície

da partícula, estabilidade química dos excipientes usados e localização do fármaco

veiculado no sistema (KLANG et al., 2012).

As nanoemulsões podem ser caracterizadas pela especificidade molecular dos

constituintes, quantidade destes constituintes, e os tamanhos das estruturas de gotas

após a formação da emulsão por agitação (MASON et al., 2006). Métodos

espectrométricos são normalmente usados para monitorar a distribuição do tamanho

38

das gotas das nanoemulsões, dando informação sobre o tamanho de gota da

população em tamanho nanométrico (BURGUERA; BURGUERA, 2012).

O tamanho e a distribuição de tamanho das gotas são frequentemente

analisados para caracterizar a estabilidade das nanoemulsões. Estes parâmetros

podem ser determinados pela técnica de espalhamento dinâmico da luz (dynamic light

scattering – DLS) ou também denominado espectroscopia de correlação de fótons.

Como resultado, obtém-se a média do tamanho das gotas e o índice de

polidispersibilidade (PDI). A distribuição do tamanho das gotas representa a

homogeneidade do sistema nanoemulsionado, sendo um pequeno PDI, inferior a 0,2,

indicativo de uma distribuição estreita no tamanho das gotículas e maior estabilidade

(KLANG et al., 2012).

Na análise por DLS, a dinâmica numa dispersão, como o movimento browniano

das moléculas, provoca alterações na intensidade da difusão da luz com o tempo da

análise, sendo que estas alterações aumentam com a diminuição do tamanho das

gotas pelo fato de haver maior movimento browniano. Assim uma correlação entre as

diferentes intensidades é possível em curtos intervalos de tempo. Com isso esta

técnica traz algumas particularidades para uma análise completa, exigindo a forma

esférica da gota em análise, diluição suficiente da amostra e grande diferença no

índice de refração entre as fases (MÜLLER-GOYMANN, 2004). Estas particularidades

trazem algumas limitações para a técnica, de acordo com Klang et al. (2012), como:

- falha no reconhecimento de pequenas concentrações de grandes gotículas

presentes em nanoemulsões, assim como a não detecção de outros

agregados de tensoativos (vesículas lipossomais e estruturas lamelares);

- variações na forma das gotas em análise não são inteiramente representadas;

- podem ocorrer problemas de desestabilização do sistema como floculação ou

a aparência de grandes agregados, em função da necessidade da diluição do

sistema para suficiente transparência necessária à precisa determinação do

tamanho das gotículas.

As análises por microscopia eletrônica também são empregadas para estudar

o tamanho das gotículas, além de identificar características morfológicas, como a

estrutura interna. As técnicas de microscopia eletrônica comumente utilizadas na

caracterização de nanoemulsões são microscopia eletrônica de transmissão – MET

(transmission eletron microscopy - TEM), microscopia eletrônica de varredura – MEV

39

(scanning eletron microscopy - SEM) e microscopia de força atômica - MFA (atomic

force microscopy - AFM) (KLANG et al., 2012). Pode-se, também, associar mais de

uma técnica, como usar a MEV com um detector de transmisão de elétrons,

microscopia eletrônica de varredura e transmissão (transmission scanning eletron

microscopy - TSEM), assim como MET equipado com uma unidade de scanner

(KLANG; VALENTA; MATSKO, 2013).

Na MEV a imagem é formada ponto a ponto pelo escaneamento de uma

emissão de elétrons concentrados sobre uma amostra sólida. A grande vantagem

desta técnica é a profundidade do foco combinada ao método de formação da

imagem, projetando áreas sombreadas e áreas recuadas mais escuras, tornando a

imagem melhor interpretada pelo olho humano. As desvantagens são o tempo de

exposição da amostra à emissão de elétrons para a geração da imagem, o que pode

levar a danos, falta de detalhes internos da amostra e resolução limitada (KLANG et

al., 2012; KLANG; VALENTA; MATSKO, 2013). O preparo das amostras consiste na

secagem ou desidratação, podendo empregar álcool e congelamento, além do

revestimento com partículas de ouro. Uma alternativa para análise de nanoveículos

hidratados usando MEV é a microscopia eletrônica de varredura ambiental –

MEVambiental (environmental scanning eletron microscopy, ESEM). Esta técnica se

baseia no uso de um sistema a vácuo graduado de múltiplas aberturas, mantendo a

pressão em torno de 5000 Pa. As amostras podem ser vistas sob vapor de água ou

outros gases auxiliares. Porém a resolução não é suficiente para visualizar estruturas

em nanoescalas (KLANG et al., 2012).

A MET é análoga à microscopia óptica, porém não utiliza a luz para visualizar

a amostra e, sim, emissão de elétrons. Esta técnica emprega o vácuo e a imagem

obtida é resultado da interação da amostra com os elétrons, ou seja, dispersão de

elétrons. A resolução na MET é proporcional à aceleração da voltagem dos elétrons,

sendo que para sistemas coloidais são usadas voltagens entre 80 e 200 kV, e

resolução entre 0,3 e 1,0 nm. Na análise de nanoemulsões, o preparo da amostra

através do congelamento é mais adequado para a obtenção das imagens. Porém, se

este método não está disponível, a técnica convencional empregando um contraste

negativo pode ser uma opção (KLANG et al., 2012).

A técnica de contraste negativo é frequentemente empregada para obter

imagens de sistemas coloidais por MET, em que se pode visualizar o tamanho, a

forma e a estrutura interna da amostra (KLANG et al., 2012). São usados como

40

agentes de contraste sais de metais pesados como tungstênio, molibdênio ou urânio,

sendo que para nanoemulsões são frequentemente usados ácido fosfotúngstico ou

suas soluções salinas ou acetato de uranila (ARAÚJO et al., 2011; BALI; ALI; ALI,

2010; DESAI; VYAS; AMIJI, 2008; GANTA; AMIJI, 2009; HATANAKA et al., 2010;

KLANG et al., 2012; PATHAN; SETTY, 2011). Os metais pesados como constraste

não devem interferir na secagem da amostra e formarem uma fina camada

transparente e resistente aos danos da emissão de elétrons, ou seja, além de criarem

um contraste, criam um suporte físico protetor para a amostra.

Para a preparação da amostra, uma gota de nanoemulsão é colocada sobre

uma grade de cobre revestida com carbono, em que é rapidamente adsorvida e,

posteriormente, a solução aquosa do sal de metal pesado é aplicada para contrastar.

A amostra é então secada e observada por MET a temperatura ambiente. A forte

dispersão dos íons metálicos formam um escudo amorfo que envolve as gotas de óleo

fracamente dispersas para melhorar o contraste na microscopia eletrônica, assim um

grande contraste é visto nas imagens por MET, ou seja, as gotículas claras contrastam

com o fundo mais escuro (KLANG et al., 2012).

Na análise de nanoemulsões, os fatores que podem afetar a integridade

estrutural da amostra são os mesmos tanto para MEV quanto para MET. Ambas as

técnicas empregam etapas de secagem e fixação que afetam a estrutura e a

morfologia, provocam encolhimento e agregação dos componentes do sistema,

devendo-se, portanto, ter cuidado ao interpretar as imagens obtidas. Na MET o uso

do vácuo pode provocar a evaporação dos componentes hidratados da nanoemulsão.

O emprego de metais pesados como contraste pode levar a uma aparência seletiva

da amostra dependendo do alcance ou reação deles com a amostra para ser

detectado, podendo algumas partes do sistema ficarem invisíveis. O contraste

aumentado na interface das gotas de óleo está relacionado a afinidade do agente

contrastante com os componentes interfaciais. Deve-se otimizar a melhor técnica para

o uso do contraste, como tipo e quantidade (KLANG et al., 2012).

Estas técnicas podem resultar em imagens de um sistema alterado que não

tem semelhança alguma com o sistema realmente formado. Em análises com MET

em temperatura ambiente, a qualidade das imagens obtidas depende da eficácia do

tensoativo em estabilizar as gotas de óleo. Destaca-se que o uso do congelamento na

preparação de amostras para as técnicas MET e MEV (crio-MET e crio-MEV)

proporciona uma visualização exata da morfologia das gotículas de óleo. O tratamento

41

criogênico de nanoemulsões antes da análise por MEV e MET resulta no estudo do

seu estado morfológico inicial e imagens livres de artefatos (KLANG et al., 2012).

Outras avaliações que podem ser realizadas para as nanoemulsões são

potencial zeta, para mensurar a carga da superfície, e comportamento reológico

(THAKUR et al., 2012). O potencial zeta está relacionado à estabilidade das

dispersões coloidais, indicando a força de repulsão entre as partículas adjacentes

igualmente carregadas. Um alto potencial zeta confere estabilidade quando o tamanho

das gotículas é pequeno, indicando que o sistema será resistente à agregação das

partículas. O valor alto para potencial zeta pode ser alto no sentido positivo (+30 mV)

e negativo (-30 mV). Valores negativos para potencial zeta indicam que a formulação

está negativamente carregada (BALI; ALI; ALI, 2010). Uma emulsão alcança o

máximo de estabilidade quando o potencial zeta é maior que ± 30 mV (ARAÚJO et al.,

2011).

Vários fatores como tamanho médio, estrutura das gotículas,

polidispersibilidade e viscosidade de cada fase da emulsão afetam sua estabilidade e

propriedades, e os efeitos provocados por estes fatores são estudados pela reologia

(EL-DIN et al., 2013; GILBERT et al., 2013). As emulsões e nanoemulsões podem

variar em sua consistência de aspecto fluido para aspecto semissólido, exigindo

medições sob várias deformações (ou tensões), sendo três diferentes medidas

reológicas aplicadas: agitação em estado estacionário, estresse constante

(deformação) e dinâmico (oscilatório). É muito importante realizar estas medições em

função da temperatura para obter informações sobre a estabilidade física e

consistência do produto. Estas medições reológicas empregadas para predizer a

estabilidade de emulsões, relacionam-se com o estudo de estabilidade a longo prazo

(6-12 meses) (TADROS, 2004). As propriedades do filme interfacial também podem

ser estudadas a partir da reologia do filme interfacial, tais como a sua viscosidade e

elasticidade. Estes estudos resultam em um entendimento sobre os vários processos

de quebra ou separação de fases em emulsões (TADROS, 1994).

3.1.3 Estabilidade de Nanoemulsões

Embora o tamanho pequeno das gotículas em uma nanoemulsão a torne

resistente a desestabilização física, a perda de estabilidade das nanoemulsões pode

ocorrer de muitas maneiras (figura 3), como separação gravitacional

42

(cremeação/sedimentação), floculação, coalescência e maturação de Ostwald

(MCCLEMENTS, 2012; WOOSTER; GOLDING; SANGUANSRI, 2008) sendo

facilmente visível qualquer indício de instabilidade por serem transparentes

(SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET; L'ALLORET, 2004).

Figura 3 - Esquema demonstrando as diferentes formas de desestabilização de uma nanoemulsão.

Fonte: McClements e Rao, 2011.

As nanoemulsões podem perder a transparência com o tempo, devido ao

aumento do tamanho da gota. Esta alteração pode estar relacionada com a

preparação não adequada do sistema na análise de distribuição das gotas, e se não

for estabilizada quanto à maturação de Ostwald, sendo este talvez o problema de

instabilidade mais sério nas nanoemulsões (TADROS et al., 2004).

A taxa de maturação de Ostwald se dá pela coalescência das gotas, com

aumento no tamanho das nanogotículas como consequência da difusão molecular do

óleo entre as gotículas através da fase contínua, levando a sua desestabilização com

consequente sedimentação das mesmas (AMANI et al., 2010; WOOSTER; GOLDING;

SANGUANSRI, 2008). A maturação de Ostwald segue o efeito de Kevin, em que

emulsões com pequenas gotas tem maior solubilidade local do óleo que gotas

grandes, devido à diferença nas pressões de Laplace provocada pela quebra do

tamanho das gotículas pela intensa agitação durante o processo de formação da

nanoemulsão (WOOSTER; GOLDING; SANGUANSRI, 2008). Esta desestabilização

é proporcional à solubilidade do óleo na fase aquosa em emulsões O/A (SOLANS et

43

al., 2005). A adição de um segundo óleo ao sistema que tenha baixa solubilidade na

fase aquosa (TADROS et al., 2004) e/ou o uso de um segundo tensoativo com o

mesmo tamanho de cadeia alquil e maior grau de etoxilação que o primeiro

(IZQUIERDO et al., 2005) podem ser soluções para a prevenção da maturação de

Ostwald.

Para a determinação da estabilidade das nanoemulsões leva-se em conta

alguns fatores como a carga de superfície das gotículas (potencial Zeta), estrutura

molecular dos tensoativos, proporção dos componentes hidrofílicos e lipofílicos,

proporção de tensoativos e proporção na combinação dos mesmos, e estrutura

molecular do óleo (AMANI et al., 2010). Em estudos para verificação de fatores que

influenciam na estabilidade e que controlam o tamanho das gotículas em uma

nanoemulsão contendo budesonida, triglicerídeos de cadeia média como óleo,

polissorbato 80 como tensoativo e etanol como co-tensoativo, foi constatado que a

energia total empregada durante a formação do sistema é um fator dominante no

controle do tamanho das gotículas finais em uma nanoemulsão e a concentração do

álcool controla o crescimento do tamanho das gotículas, neste sistema desenvolvido

(AMANI et al., 2008; AMANI et al., 2010).

A nanoemulsão inicial deve apresentar tamanho pequeno de gotículas, o que

irá assegurar uma longa estabilidade cinética. Controlando a distribuição do tamanho

das gotas e adicionando estabilizadores na formulação, como tensoativos,

modificadores reológicos, ou retardatores de maturação de Ostwald, aumenta-se a

estabilidade cinética das nanoemulsões (MCCLEMENTS, 2012).

3.2 Plantas Medicinais de Uso Tópico

O uso de plantas para tratamento de doenças é milenar e teve origem na Índia

e China. Segundo estimativa da OMS, o mercado mundial de medicamentos

fitoterápicos e produtos naturais vale 62 bilhões de dólares e vai chegar aos 5 trilhões

em 2050, com crescimento de cerca de 7% ao ano (PINTO, 2013).

No Brasil, país com maior biodiversidade do planeta, tem-se importante

conhecimento tradicional sobre o uso de plantas medicinais e potencial para

pesquisas para o desenvolvimento de tecnologias e terapêuticas adequadas para o

seu uso. Por meio da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,

aprovada pelo Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, o governo brasileiro

44

estabeleceu as diretrizes para atuar na área de plantas medicinais e fitoterápicos

(BRASIL, 2006).

O uso de plantas medicinais pela população tem aumentado na busca por

terapias alternativas. Nos EUA estima-se que 50% da população utilize alguma forma

de medicina alternativa, e muitos desses sem informar ao seu médico

(BEDI;SHENEFELT, 2002). Na Alemanha, país onde se consome metade dos

extratos vegetais comercializados na Europa, a auto-medicação com esta classe de

medicamentos é muito comum também, embora 70% dos clínicos gerais alemães

prescrevem ervas licenciadas (VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). Esta busca

pela medicina alternativa vem de alguma falha da medicina tradicional ou porque os

efeitos adversos são pouco percebidos pelos usuários quando os produtos são

naturais (BEDI; SHENEFELT, 2002).

Produtos a base de plantas são frequentemente usados na composição de

produtos de uso tópico, na Alemanha 15% das plantas medicinais utilizadas pela

população são para tratar doenças de pele (VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005).

Plantas usadas na área da dermatologia vem sendo testadas e pesquisadas,

demonstrando significativa evidência científica para tratamento de patologias como

psoríase, acne, dermatite atópica e outros problemas dermatológicos. No entanto, são

poucos os dados científicos de estudos clínicos sobre o uso de plantas para

tratamento dermatológico , pois o seu uso é grandemente baseado no conhecimento

tradicional (BEDI; SHENEFELT, 2002; PINTO, 2013; REUTER; MERFORT;

SCHEMPP, 2010).

As plantas indicadas no tratamento de doenças cutâneas podem ter atividades

antioxidante, anti-inflamatória, antibacteriana, antifúngica, anti-histamínica,

estimulante da imunidade e fotoprotetora, além de reduzirem inflamação e prurido,

acelerar a cicatrização de feridas, fortalecer os cabelos e agir como promotores

antitumorais. Apesar do grande uso popular de plantas medicinais, existem

numerosos casos de potenciais efeitos adversos em particular reações adversas

cutâneas como dermatite alérgica de contato, dermatite de contato irritante, reações

de fototoxicidade e urticária de contato (CORAZZA et al., 2009). Medicamentos à base

de plantas geralmente contém diversos compostos ativos farmacologicamente

exigindo um teste de eficácia muito mais complexo do que para medicamentos que

empregam drogas sintéticas. Uma proposta para avaliação destes medicamentos é

considerar o extrato da planta como um princípio ativo, no entanto, o extrato deve

45

estar suficientemente caracterizado. Esta caracterização é frequentemente realizada

através da padronização do extrato através de um dos seus componentes chave, que

pode ser a substância farmacologicamente ativa ou, quando não conhecida, um

marcador desta substância. A padronização, no entanto, traz como incoveniente a

consideração somente de uma ou duas substâncias, ficando os diversos outros

componentes em segundo plano, e isto pode influenciar na eficácia e segurança do

fitoterápico (ERNST, 2005). Isso demonstra a importância de mais pesquisas

empregando plantas medicinais com o objetivo de evidenciar cientificamente suas

propriedades terapêuticas e sua segurança.

3.3 Rapanea ferruginea Mez. (Myrsinaceae)

A planta Rapanea ferruginea é uma das espécies da família Myrsinaceae,

conhecida popularmente como canela-azeitona, capororoca, azeitona-do-mato,

camará, capororocaçu, capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim

(BACCARIN, 2010; PASCOTTO, 2007). R. ferruginea é uma espécie pantropical,

encontrada no Brasil especialmente nas regiões litorâneas, como Bahia, Espírito

Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul e Santa

Catarina (COSTA, 2011). É uma árvore de porte médio com 6-12 m de altura e tronco

de 30-40 cm de diâmetro (FRONZA; GIURADELLI, 2009), apresenta frutos pequenos

3-5 mm de diâmetro, globosos e de cor negro-arroxeadas quando estão maduros

servindo de alimento para aves (PASCOTTO, 2007). As folhas são simples,

alternadas no caule (FREITAS; CARRIJO, 2008), a casca externa é áspera de cor

cinzento-rosada com a parte interna vermelha (LORENZI, 1992).

Na medicina popular as folhas e as cascas da R. ferruginea são preparadas na

forma de chás e indicada como diurética, no combate a doenças do trato urinário,

pruridos, eczemas, erupções, urticária, reumatismo e doenças do fígado, no

tratamento de processos inflamatórios e dolorosos, estes dois últimos confirmados por

estudos biológicos (ANTONIALLI et al., 2012; CECHINEL FILHO et al., 2013; HESS

et al., 2010).

46

Figura 4 - Foto da árvore Rapanea ferruginea.

Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.

Existem aproximadamente 100 espécies da família Myrsinaceae, que

apresentam ácidos terpeno-p-hidroxibenzoicos e triterpenoides (HARDEN, 1990).

Todas as espécies de Rapanea possuem como princípios ativos os derivados dos

ácidos benzoico prenilados, os ácidos mirsinoicos. Há relatos de três espécies

estudadas no Brasil, R. umbellata, R. lancifolia, R. guyanensis, das quais foram

isolados os compostos ácidos mirsinoicos A (AMA), B (AMB) e C (AMC), figura 5

(HIROTA et al., 2002; JANUÁRIO et al., 1992), além de outros metabólitos

secundários, como as benzoquinonas, entre elas a bis-(2,5-diidroxi-4-undecil-3,6-

benzoquinona) (FRONZA; GIURADELLI, 2009). Ácidos benzoicos prenilados foram

isolados também da espécie R. myricoides Schltdl. (Myrsinaceae), incluindo o AMB

(BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998).

47

Figura 5 - Estruturas químicas dos ácidos mirsinoicos A, B e C.

Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.

Em estudos fitoquímicos das cascas da R. ferruginea foram isolados os ácidos

benzoicos prenilados AMA, AMB e AMC (FRONZA; GIURADELLI, 2009).

O AMB é um ácido benzoico prenilado de nome químico 5-carboxi-7-(3”, 3”-

dimetilalil)-2-(1-hidroxi-1, 5 dimetilex-4-enil) 2,3-dihidrobenzeno-furano encontrado em

grandes concentrações nos extratos da raiz e cascas de R. ferruginea (BACCARIN,

2010; SILVA, 2013; TESTONI, 2004) e que pode ser quantificado por técnica

cromatográfica líquida de alta eficiência (CLAE) (BACCARIN et al., 2011).

Demonstrou-se que o AMB isolado da R. ferruginea apresenta efeito

antinociceptivo tanto em relação à dor induzida quimicamente quanto por estímulo

térmico, além da ação na reversão de processos hiperalgésicos (HESS, 2006), em

modelos de hiperalgesia em animais com neuropatia diabética (GALVAN, 2007) e em

modelos animais de dor persistente de origem inflamatória neuropática (ANTONIALLI,

2009; ANTONIALLI et al., 2012). Também evidenciou-se a ação anti-hiperglicemiante

do AMB em animais diabéticos induzidos com aloxano (MATTOS, 2006), atividade

antitumoral em Tumor Ascítico de Ehrlich (TESTONI, 2004) e ação anticolinesterásica

(FILIPPIN, 2010). Esta última, inferior ao efeito do AMA em todos os tecidos cerebrais

em ratos (FILIPPIN, 2010). Constatou-se sua atividade antileishmaniose (CECHINEL

FILHO et al., 2013) e, juntamente com o AMA, apresentou atividade antibacteriana

48

contra bactérias gram-positivas (CRUZ et al., 2013). O AMB isolado a partir do extrato

etanólico das cascas de R. ferruginea, apresentou citotoxicidade frente às linhagens

K562 (33,38 ± 5,28 µg/mL) e NALM6 (44,77 ± 33,32 µg/mL) (TOMIO, 2011).

Trabalhos realizados com o AMB isolado da espécie Myrsine seguinii,

demonstraram atividade inibidora da produção de sulfeto de hidrogênio por patógenos

periodontais in vitro e metilmercaptano envolvidos em problemas de halitose (ITO;

NARISE; SHIMURA, 2008; ITO et al., 2010). Em extratos metanólicos desta mesma

espécie, foram isolados os ácidos mirsinoicos A, B, C e F, os quais apresentaram

atividade anti-inflamatória pela supressão do edema de orelha em ratos induzidos por

TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato). A porcentagem de inibição do edema para

a dose de 1,4 µmol aplicado topicamente foi de 65% para o AMA, 83% para o AMB,

68% para o AMC e na dose de 0,56 µmol, 77% para o ácido mirsinoico F (HIROTA et

al., 2002).

O AMA isolado a partir do extrato etanólico dos frutos da R. ferruginea, segundo

estudos realizados por Gazoni (2009), apresenta atividade anticolinesterásica in vitro

através de ensaio bioautográfico em placas cromatográficas e em tecido cerebral de

ratos (FILIPPIN, 2010), sendo estes resultados comprovados em estudo in vivo com

melhora da cognição em modelo animal (COSTA, 2011). O AMA, do extrato etanólico

das cascas da R. ferruginea, foi citotóxico frente à linhagem K562 (170,13 ± 32,67

µg/mL) (TOMIO, 2011).

Estudo realizado para confirmar se o efeito anti-inflamatório do AMA suprime a

proliferação celular usando o modelo do edema de orelha em ratos induzido por TPA,

demonstrou, in vitro, que o AMA é um inibidor seletivo da DNA polimerase em

mamíferos, sendo seu efeito maior frente a polimerase β em comparação com a

polimerase α. In vivo, uma solução metanólica do AMA a 500 µg/40 µL, apresentou

65% de efeito inibitório sobre a inflamação induzida em orelhas de ratos, com forte

ação inibitória sobre ambas as polimerases. Este estudo demonstrou que os efeitos

inibitórios sobre as polimerases mostram relação com a supressão do efeito

inflamatório induzido pelo TPA (MIZUSHINA et al., 2000). A aplicação de 500 µg de

AMA isolado de um extrato metanólico de folhas e caules de Myrsine seguinii,

topicamente em orelhas de ratos, também resultou em 65% de efeito inibitório à

inflamação induzida pelo TPA, em estudo realizado por Dong et al. (1999). Esta

atividade anti-inflamatória foi semelhante a do ácido glicirrízico (77% de efeito

inibitório), já a aspirina com 1% de efeito inibitório demonstrou menor atividade

49

inibitória que o AMA, mesmo sendo também um derivado do ácido hidroxibenzoico

como o AMA. Provavelmente este efeito deve-se as porções lipofílicas dos terpenos

as quais podem influenciar na maior atividade anti-inflamatória observada para o AMA

(DONG et al., 1999).

Baccarin (2010) desenvolveu e padronizou o extrato seco de R. ferruginea por

spray drying, empregando cascas secas da planta, as quais foram caracterizadas

através de métodos farmacopeicos. Definiu-se como melhor condição de extração das

cascas, solução hidroalcoólica 90 °GL por um período de 2 h por maceração dinâmica

(aproximadamente 300 rpm), pois resultou em maior quantidade de resíduo seco

(BACCARIN et al., 2014). Para a obtenção do extrato seco por spray dryer as

melhores condições encontradas foram teor de sólidos de 5%, com 30% de Aerosil®,

um fluxo de alimentação de 4 mL/min e temperatura de entrada de 170 °C. Ainda

neste estudo, avaliou-se a atividade antinociceptiva dos extratos mole e seco por via

oral e intraperitoneal usando como fármaco de referência a indometacina. Constatou-

se que as maiores doses aplicadas dos dois extratos resultaram em melhor inibição

de resposta dolorosa envolvida na dor inflamatória do que na dor neurogênica, sendo

esta resposta maior na administração oral. Outro dado importante, deste estudo, é

que o resultado do estudo farmacológico foi maior no lote de extrato seco que não

obteve maior concentração de AMB, sugerindo sinergia entre os componentes do

extrato (BACCARIN, 2010). Estudo realizado por Tomio (2011) evidenciou atividade

citotóxica do extrato etanólico das cascas da R. ferruginea frente às células HELA

(28,30 ± 13,09 µg/mL), L929 (56,04 ± 14,24 µg/mL), K562 (mais que 100 µg/mL) e

NALM-6 (98,90 ± 0,00 µg/mL).

Barretta (2011) analisou a atividade antioxidante dos extratos etanólico e

clorofórmico das cascas, galhos, folhas e frutos da R. ferruginea. Neste trabalho o

extrato clorofórmico da casca e dos frutos, o extrato etanólico dos galhos e os

compostos isolados AMA e AMB da R. ferruginea, apresentaram maior atividade

antioxidante pelo método antioxidante direto, ORAC (Oxygen Radical Absorbance

Capacity, ou capacidade de absorção do radical oxigênio), assemelhando-se ao

controle positivo Trolox®. Os extratos etanólicos dos frutos e casca na concentração

de 10 µg/mL, apresentaram atividade antioxidante superior aos demais extratos

avaliados quanto à capacidade de sequestrar os radicais livres DPPH e ABTS+. Neste

estudo ainda observou-se maior conteúdo de compostos fenólicos no extrato etanólico

das cascas (43,74%) e nos frutos (33,63%), os quais demonstraram ainda relação

50

direta com a porcentagem da atividade antioxidante nos métodos DPPH e ABTS+, foi

concluído também que todos os extratos obtidos foram capazes de quelar o metal

ferro, tendo proteção adicional contra o estresse oxidativo. A avaliação da

citotoxicidade dos extratos etanólico de frutos e folhas demonstrou ausência de

toxicidade nas concentrações de 0,01, 1 e 10 µg/mL, apresentando redução da

viabilidade celular somente a 100 µg/mL. O AMA apresentou possível efeito citotóxico

na concentração de 10 µg/mL. Os extratos etanólico dos frutos e folhas e o composto

AMA demonstraram ação protetora contra a formação de espécies reativas na

avaliação da atividade citoprotetora contra o agente estressor AAPH. O extrato dos

frutos em concentrações inferiores a 100 µg/mL apresentou maior proteção gênica

que os demais extratos avaliados, na análise da atividade antigenotóxica.

Com base nos dados da atividade anti-inflamatória dos ácidos mirsinoicos por

via tópica e ação antinociceptiva de origem inflamatória do extrato mole da R.

ferruginea por via oral, convém investigar a ação do extrato mole da casca da R.

ferruginea veiculado em nanoemulsão, quanto à atividade de supressão da inflamação

tópica induzida in vivo, a fim de verificar se há atividade tópica anti-inflamatória do

extrato e se a nanoemulsão favorece a absorção dos marcadores na pele,

potencializando sua ação.

3.4 Resposta Inflamatória

A inflamação é uma resposta patofisiológica dos tecidos frente a uma agressão

que leva ao acúmulo local de fluídos e células, tendo como principal objetivo a

resolução da infecção ou reparação ao dano tecidual e estabelecimento do estado de

homeostasia (BARTON, 2008; SOSA et al., 2002). Mesmo sendo um meio de defesa

do organismo, a inflamação pode induzir, manter ou agravar muitas doenças devido a

sua complexidade e o envolvimento de mediadores inflamatórios (SOSA et al., 2002).

Quanto ao tempo de duração, a inflamação pode ser dividida em duas

categorias, aguda e crônica. A inflamação aguda é relativamente de curta duração,

caracterizando-se por vasodilatação, exudação plasmática e migração de células

primariamente realizada por neutrófilos, sendo estas fases parte da resposta imune

inata. A inflamação crônica, por sua vez, é caracterizada por um tempo de resolução

prolongado e até mesmo sem resolução, onde a inflamação está ativa e a destruição

e a reparação tecidual ocorrem simultaneamente, apresentando histologicamente

51

infiltração de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) e fibrose

tecidual (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

A vasodilatação, como um aspecto clássico da inflamação aguda, caracteriza -

se clinicamente por vermelhidão e calor no local da lesão, e facilita a liberação local

de mediadores solúveis e células inflamatórias, sendo mediada primeiramente pelo

óxido nítrico (NO) e prostaglandinas vasodilatadoras. A vasodilatação envolve,

inicialmente, arteríolas seguido pelo surgimento de novos microvasos. A formação de

edema, como outro clássico sinal de inflamação, é causada por alterações nas

funções de barreira dos pequenos vasos sanguíneos, aumentando a permeabilidade

dos capilares a um fluido rico em proteínas e água como consequência da ação de

histaminas, bradicinina, leucotrienos, componentes do sistema complemento,

substância P e fator de ativação plaquetária (PAF) (SHERWOOD; TOLIVER-KINSK Y,

2004).

Os eventos da vasodilatação e edema são acompanhados pela marginação,

adesão e migração leucocitária, sendo os neutrófilos os primeiros e mais abundantes

leucócitos a serem liberados no local da inflamação (SHERWOOD; TOLIVER-

KINSKY, 2004). O extravasamento leucocitário é controlado por proteínas que incluem

moléculas de adesão, proteases, citocinas e quimiocinas. Para garantir a migração

adequada dos leucócitos aos locais de inflamação, existem mecanismos que

controlam este movimento como a regulação das quimiocinas ou expressão dos

genes dos receptores das quimiocinas. Estes mecanismos regulatórios podem

aumentar ou diminuir a resposta inflamatória em relação a função e disponibilidade

das quimiocinas (MORTIER; DAMME; PROOST, 2012). Durante a migração, os

leucócitos podem encontrar, em sequência ou simultaneamente, várias quimiocinas.

O extravasamento leucocitário é influenciado, também, pela cooperação entre as

quimiocinas e as citocinas, que levam ao acúmulo e ativação dos leucócitos nos locais

da inflamação (GOUWYA et al., 2012).

As quimiocinas fazem parte de uma família de citocinas quimiotáticas

indispensáveis no tráfego de leucócitos, guiando-os ou retirando-os do local da

inflamação e coordenando a recirculação de linfócitos, além de influenciar na

sobrevivência dos leucócitos e funções como degranulação. Estas citocinas

quimiotáticas são induzíveis, portanto expressas em resposta a infecção, lesão

tecidual ou estresse. Estruturalmente as quimiocinas são divididas em 4 subgrupos

(CXC, CC, CX3C e C), em função da localização dos resíduos de cisteína NH2-

52

terminal (MORTIER; DAMME; PROOST, 2012). As quimiocinas murinas, quimiocina

derivada dos queratinócitos (KC) e proteína inflamatória dos macrófagos 2 (MIP-2),

são as maiores quimioatraentes responsáveis por recrutarem neutrófilos (FILIPPO et

al., 2008) e estão relacionadas com a interleucina-8 (IL-8) de humanos e a CINC-

1/CXCL-1 de ratos (PIRES, 2009).

Citocinas são polipeptídeos produzidos por vários tipos de células que regulam

as respostas imunes e inflamatórias (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). As

citocinas são multifuncionais e o bloqueio de uma única citocina terá efeitos limitantes

sobre a resposta inflamatória global. As citocinas atuam como indutoras e reguladoras

do crescimento, divisão e diferenciação celular, como estimulantes da migração

celular e controladoras da função celular e da interação entre a expressão de

moléculas de adesão e receptoras de citocinas (CORSINI; GALLI, 2000). Exemplos

clássicos de citocinas são o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1 (IL-1),

ambas induzem a febre, estimulam a produção de proteínas de fase aguda pelo fígado

e promovem a ativação de células endoteliais (SHERWOOD; TOLIVER-KINSK Y,

2004). A expressão da IL-1 é regulada a nível transcricional pelo NF-κB, que também

é responsável pela expressão da TNF (FELDMEYER et al., 2010). Além disso, TNF e

IL-1β atuam sinergicamente no aumento do rolamento leucocitário durante a infiltração

celular (ZHANG et al., 2001).

O TNF é liberado primeiramente por macrófagos presentes no sítio da lesão e

modula uma variedade de eventos imunológicos e metabólicos. No local da infecção

ou inflamação, o TNF inicia uma resposta imune que ativa mecanismos de defesa

antimicrobiano e, após a erradicação da infecção, ele repara o tecido. Esta citocina

atua como um potente ativador de neutrófilos e fagócitos mononucleares, servindo

também como um fator de crescimento para fibroblastos e angiogênico

(SHERWWOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). O TNF é um regulador importante das

moléculas de adesão e quimiocinas, que juntas coordenam a resposta inflamatória.

Embora o TNF seja um potente indutor da infiltração de neutrófilos, ele é um fraco

quimioatraente e o seu efeito sobre o tráfego de leucócitos no tecido, parece ser

dependente da indução e secreção de quimiocinas. Estudos demonstram que o TNF

regula a expressão de MIP-2 e KC na pele e pulmões (ZHANG et al., 2001). No

entanto, a liberação sistêmica de TNF pode ativar uma cascata destrutiva de eventos

que pode resultar em dano tecidual, disfunção do orgão afetado e morte

(SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

53

IL-1β é uma citocina altamente inflamatória, secretada por macrófagos,

monócitos e células dendriticas, linfócitos B e células natural killer (NK) (JOOSTEN;

NETEA; DINARELLO, 2013). Esta citocina estimula a expressão de ciclo-oxigenase-

2 (COX-2) que leva a formação e liberação de prostanoides importantes na

sensibilização do nociceptor, ou seja, a IL-1β atua como um mediador hipernociceptivo

(PIRES, 2009). A IL-1β tem um papel central na defesa contra patógenos, no entanto,

a sua expressão pode ser desencadeada por fatores causadores de estresse do

hospedeiro ou do ambiente celular e irritantes cutâneos. É um mediador das respostas

inflamatórias, corroborando para a sobrevivência de células T, super regulação do

receptor dos linfócitos para IL-2, aumento da produção de anticorpos das células B

além da sua proliferação, e promoção da diferenciação das células T-helper 17

(ABRAMOVITS; BEJARANO; VALDECANTOS, 2013).

Outro componente que regula o extravasamento leucocitário é a

mieloperoxidase (MPO), uma enzima presente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos

onde se expressam em maior proporção, também está ativa nos monócitos, porém

em menor extensão. Quando há a diferenciação dos monócitos em macrófagos, a

expressão da MPO é geralmente perdida, podendo ser reiniciada sob certas

condições. A MPO está diretamente envolvida na homeostasia celular e é um fator

importante na iniciação e progressão de várias doenças inflamatórias. Quando ativa,

a MPO em associação ao peróxido de hidrogênio e cloro, produz um potente oxidante,

o ácido hipocloroso (HOCl), que é a chave para atividade microbicida dependente de

oxigênio dos neutrófilos. Além desta função, estudos tem demonstrado que o HOCl

pode ativar o fator de transcrição nuclear-κB (NF-κB) e a fosfoliração da tirosina em

células T e B, levando ao aumento da sinalização de cálcio e a produção do TNF. A

atuação do oxidante formado a partir da ação da MPO inclui ainda, a modulação da

resposta imune das reações inflamatórias, afetando interações célula-célula e a

adesão celular dos leucócitos, desempenhando papel importante na migração e

infiltração leucocitária (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009). A MPO, através da

produção do HOCl e radicais livres, promove danos teciduais, ativa NF-kB e outros

fatores de transcrição, modula o tônus vascular pelo óxido nítrico (NO), sendo seus

níveis representativos da progressão da doenças inflamatórias crônicas (MEOTTI et

al., 2008). A MPO através da sua função sinalizadora da sobrevivência dos neutrófilos

pode influenciar na duração de uma resposta inflamatória (VEEN; WINTHER;

HEERINGA, 2009).

54

3.4.1 Inflamação cutânea

A pele agindo como primeira linha de defesa do corpo frente a grandes lesões,

invasão por micro-organismos e traumas, possui muitos mecanismos de defesa.

Desequilíbrios nos mecanismos de defesa da pele, seja por atividade imunológica

inadequada ou por agressão através de agentes, leva a alterações na estrutura e

função cutânea ocasionando o aparecimento de doenças de pele de origem

inflamatória, que também podem estar relacionadas à diversas doenças sistêmicas. A

inflamação cutânea é um problema comum de pele que apresenta diversas

modificações morfológicas e fisiológicas neste tecido (ABDEL-MOTTALEB et al.,

2012; BICKERS; ATHAR, 2006; LEE et al., 2009).

Estímulos externos como alérgenos por contato e radiação UV são indutores

da inflamação cutânea, que é provocada e mantida pela interação de várias

populações de células (BARKER et al., 1991; LEE et al., 2009). A pele é

imunológicamente ativa e é capaz de reagir frente a estímulos antigênicos (KIMBER

et al., 1999). Após o contato com substâncias irritantes ou alérgenas, em menos de 2

h, mecanismos celulares são ativados na pele humana para aumentar a infiltração de

linfócitos T, independente da sensibilidade imune específica, refletindo a capacidade

da pele em responder a irritação química (FUCHS et al., 2001), a atividade das

citocinas e outros mediadores da inflamação determinam a magnitude da resposta

imune inata (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Os componentes celulares

primários do sistema imune inato são macrófagos, células dendríticas, células natural

killer (NK) e neutrófilos (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Em relação a

sensibilização de contato, as células dendríticas, especialmente as células de

Langerhans epidérmica, são os mais importantes componentes do sistema imune

cutâneo, além das citocinas que regulam seus movimentos, maturação e função. As

células de Langerhans, células imunocompetentes, se encontram na epiderme e

formam uma contínua rede que captura os antígenos que se encontram na pele, sendo

então responsável pela interação, internalização, processamento e transporte de

antígenos. Durante o transporte dos antígenos, as células de Langerhans adquirem a

habilidade de apresentar o antígeno para os linfócitos T, reguladas e estimuladas

pelas citocinas epidérmicas, as quais são induzidas ou mantidas pela sensibilização

55

da pele. A partir disso os linfócitos T se dividem e se diferenciam, representando a

base da sensibilização cutânea (KIMBER et al., 1999).

As células da epiderme e derme são conhecidas como produtoras de uma

grande variedade de citocinas, e o queratinócito é o principal produtor de muitas das

citocinas identificadas e moléculas de adesão, seja esta expressão constitutiva ou por

indução de vários estímulos (GRÖNE, 2002; KIMBER et al., 1999). Queratinócitos são

ativados através da indução por agentes alérgenos e irritantes, sintetizando e

secretando citocinas (FUCHS et al., 2001). Algumas citocinas são produtos exclusivos

das células de Langerhans, enquanto outras são produzidas por queratinócitos e

somente algumas citocinas são expressas por estas duas células (KIMBER et al.,

1999).

As citocinas produzidas pelos queratinócitos incluem as interleucinas -1, -6, -7,

-8, -10, -12, -15, -18, e -20, o TNF e interferons (IFN) alfa, beta e gama (GRÖNE,

2002). Das citocinas produzidas pelos queratinócitos, somente as citocinas IL-1α, IL-

1β e TNF ativam um número suficiente de mecanismos efetores de forma

independente para provocar a inflamação cutânea (CORSINI; GALLI, 2000). A

produção de citocinas pelos queratinócitos tem como consequências a ativação de

células endoteliais microvasculares da derme, acúmulo seletivo de células

mononucleares específicas da derme e epiderme, podendo, ainda, ter efeito sistêmico

sobre o sistema imune, sobre a proliferação de queratinócitos e processos de

diferenciação, além de afetar a produção de outras citocinas pelos queratinócitos

(BARKER et al., 1991; GRÖNE, 2002). Os queratinócitos também são responsivos às

citocinas derivadas das células T e das células dendríticas (FELDMEYER et al., 2010).

Estudos sugerem que os queratinócitos são a maior fonte de IL-1 na pele,

citocina que tem importante papel em doenças inflamatórias e alérgicas da pele, como

a psoríase ou dermatite de contato (FELDMEYER et al., 2010). A IL-1 existe em duas

formas, IL-1α e IL-1β, sendo a primeira predominantemente produzida e armazenada

nos queratinócitos, enquanto a segunda é essencialmente sintetizada por macrófagos

e monócitos (FUCHS et al., 2001). A IL-1, de maneira geral, induz a expressão de

moléculas de adesão sobre as células endoteliais que juntamente com a indução de

quimiocinas, estimula a infliltração de células inflamatória e imunocompetentes

(FELDMEYER et al., 2010) tais como monócitos, linfócitos e leucócitos

polimorfonucleares, assim como estimula a produção de outras citocinas (FUCHS et

al., 2001).

56

O TNF está armazenado nos monócitos da derme da pele e influenciado por

um estímulo, esta citocina pode ser produzida por queratinócitos e células de

Langerhans, atuando através da induçãoda expressão de moléculas de adesão

cutânea e endoteliais (CORSINI; GALLI, 2000) e da habilidade em aumentar a

permeabilidade vascular (MURAKAWA et al., 2006).

Níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de

oxigênio (ROS) contribuem para os mecanismos patofisiológicos associados a várias

patologias inflamatórias da pele (LEE et al., 2009), como psoríase, dermatite atópica

e dermatite de contato (FUCHS et al., 2001). Muitos agentes externos ou são por si

oxidantes ou catalisam a produção de ROS, direta ou indiretamente (BICKERS;

ATHAR, 2006). ROS podem ser liberadas durante a infiltração dérmica com células

inflamatórias ou podem ser produzidas pelos queratinócitos em resposta a alguma

exposição química. A produção constitutiva de ROS pelos queratinócitos se dá por

processos específicos e pode ser induzida por várias citocinas, fatores de crescimento

e outros estímulos fisiológicos. Já a exposição dos queratinócitos à substâncias

químicas irritantes, que tem ROS como mediadores, levam ao aumento da síntese de

citocinas (FUCHS et al., 2001) formando um ciclo. As citocinas IL-1 e TNF induzem a

produção celular de ROS, perpetuando sua própria formação e ação (FUCHS et al.,

2001).

3.4.2 Tratamento da Inflamação cutânea

O tratamento tópico de doenças cutâneas é muito interessante devido a

redução da ação sistêmica e dos efeitos colaterais sistêmicos das substâncias ativas,

quando comparadas a adminsitração oral ou parenteral. Além disso, a aplicação

tópica de medicamentos permite maior flutuação dos níveis plasmáticos típicos da

administração repetida de substâncias rapidamente eliminadas, e evita eliminação

pela primeira passagem através do fígado (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT;

KORTING, 2007).

Os tratamentos atuais para reações inflamatórias cutâneas se concentram no

alívio dos sintomas da doença cutânea, reparando a função de barreira, reduzindo o

prurido, as infecções secundárias e a inflamação. Para tratar inflamações cutâneas,

os veículos atualmente usados para a administração dos fármacos, empregam

formulações clássicas como pomadas e cremes, e muitos destes medicamentos são

57

uma combinação de hidratantes, anti-histamínicos, antibióticos e glucocorticoides,

alguns trazendo reações não desejáveis (ABDEL-MOTTALEB et al., 2012; LEE et al.,

2009). Os glucocorticoides representam a terapia padrão para a redução da

inflamação e da ativação da resposta imune em doenças dermatológicas, sendo a

terapia mais amplamente usada na dermatologia (SCHÄCKE; DÖCKE; ASADULLAH,

2002). A atuação dos glucocorticoides é através da redução da transcrição gênica

para IL-2, interferindo também na transcrição de TNF, IFN-γ, IL-1 (RAUH, 2008). No

entanto, esta terapia traz inúmeros efeitos adversos na pele como atrofia da epiderme

e derme, hipertricose, acne, dermatite perioral, distúrbios na pigmentação da pele,

eritema e telangiectasias (SCHÄCKE; DÖCKE; ASADULLAH, 2002).

Por outro lado, aproximadamente 50% dos medicamentos utilizados são

obtidos a partir de fontes naturais. O uso de medicamentos fitoterápicos aumentou

devido a melhor atividade terapêutica e menores efeitos colaterais quando comparado

ao medicamentos sintéticos (GUNASEKARAN et al., 2014). As plantas medicinais são

amplamente empregadas na medicina popular para tratar doenças inflamatórias

cutâneas. Estudo realizado por Sosa (2002) demonstrou que a maioria dos extratos

de algumas plantas selecionadas em Belize, na América Central, são empregadas

tradicionalmente pela população local em desordens cutâneas, demonstraram

atividade anti-inflamatória tópica em modelo de edema de orelha induzido pelo óleo

de cróton. Terapias empregando plantas tem obtido êxito no tratamento de doenças

dermatológicas por milhares de anos na Europa e Ásia, sendo usadas ainda nos dias

de hoje pela sua eficácia e algumas possuem comprovação ciêntífica para o seu uso

(BEDI; SHENEFELT, 2002).

Embora os fitoterápicos demonstrem admirável atividade terapêutica in vitro,

possuem menor eficácia in vivo por consequência de várias características como

pobre solubilidade lipídica, ocasionando baixa absorção e consequentemente, pobre

biodisponibilidade (KESARWANI; GUPTA, 2013). Além disso, deve ser considerada a

grande complexidade da composição dos derivados vegetais, como os extratos, em

que a presença de componentes com diversas características químicas e o sinergismo

que exite entre os mesmos influenciando na sua ação terapêutica, é um desafio tanto

relacionado à tecnologica farmacêutica como à avaliação da eficácia do fitoterápico

desenvolvido (KESARWANI; GUPTA, 2013).

O uso de veículos convencionais, como cremes e pomadas, para substâncias

ativas tem alguns inconvenientes como a baixa porcentagem do fármaco absorvida

58

associada a alta taxa de variações na absorção entre indivíduos, gerando doses

subterapêuticas do medicamento na pele de alguns indivíduos e indução de efeitos

colaterais locais ou sistêmicos indesejáveis em outros. A pele possui uma função de

barreira muito eficiente devido a camada córnea da pele, que dificulta a absorção de

ativos, sendo um grande desafio no desenvolvimento de medicamentos tópicos

garantir uma adequada penetração cutânea, mesmo considerando que a penetração

de ativos é facilitada nas desordens cutâneas como psoríase e dermatite (SCHÄFER-

KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007).

Desta forma, veículos que facilitam a penetração na barreira formada pelo

estrato córneo cutâneo (SCHÄFER-KORTING; MEHNERT; KORTING, 2007),

melhoram a atividade e superam os problemas relacionados às plantas medicinais

que podem comprometer a sua absorção e eficácia (GUNASEKARAN et al., 2014) é

uma alternativa promissora.

Nas últimas décadas tem-se intensificado o estudo de novos veículos para a

administração de derivados vegetais, que devem liberar o princípio ativo em uma

concentração adequada às necessidades do corpo durante o período de tratamento e

direcioná-lo para o local de ação. O uso de nanocarreadores tem inúmeras vantagens

para a administração de derivados vegetais e fitofármacos, como o aumento da

solubilidade e biodisponibilidade, proteção à toxicidade, aumento da atividade

farmacológica, aumento da estabilidade, manutenção da liberação do princípio ativo

e proteção da degradação física e química (GUNASEKARAN et al., 2014).

Na literatura encontram-se poucos trabalhos que trazem a incorporação de

extratos vegetais em nanoemulsões para aplicação tópica. Em trabalho recentemente

publicado, verificou-se que a nanoemulsão é um veículo adequado para incorporação

de extratos etanólicos líquido e seco da planta macela (Achyrocline satureioides), para

tratamento tópico de desordens cutâneas (BIDONE et al., 2014). Nanoemulsões

também se mostraram promissoras para veicular topicamente extratos hidroalcoólicos

de folhas e cascas de Vellozia squamata, demonstrando a mesma ação antioxidante

que os extratos (QUINTÃO et al., 2013). Sugumar e colaboradores (2014) verificaram

que o óleo de eucalipto incorporado em nanoemulsão para aplicação tópica,

demonstrou atividade antibacteriana para Stafilococos aureus e cicatrizante sem

causar irritação cutânea em ratos.

59

No entanto, para os fármacos classicamente empregados no tratamento da

inflamação cutânea, existem diversos trabalhos estudando nanocarreadores como

veículos tópicos.

Um estudo experimental empregando nanopartículas com tamanho entre 50 e

1000 nm, com e sem incorporação de betametasona, em orelhas de ratos saudáveis,

demonstrou a influência do tamanho das partículas. As partículas menores que 100

nm tiveram uma deposição seletiva nos folículos pilosos e glândulas sebáceas na pele

inflamada, sugerindo uma estratégia quando se quer veículos cujo alvo sejam locais

específicos da pele inflamada, redução dos efeitos adversos locais e da exposição da

pele saudável. Quando investigadas as nanopartículas contendo betametasona,

verificou-se aumento do efeito terapêutico com a redução do tamanho das partículas

(ABDEL-MOTTALEB et al., 2012). Sandig et al. (2013), avaliou o efeito analgésico

tópico in vivo de nanoemulsões com imipramina e doxepina, em ratos. O efeito

analgésico foi maior com a doxepina, sugerindo uma alternativa para terapia

analgésica tópica.

Subramanian et al. (2008), em estudo incorporando aspirina em nanoemulsões

para administração tópica com o objetivo de reduzir os efeitos adversos do fármaco,

comparou a atividade anti-inflamatória da aspirina em nanoemulsão e em suspensões

pela aplicação tópica em orelhas inflamadas de camundongos, no modelo de edema

de orelha induzido por óleo de cróton. A veiculação da aspirina em nanoemulsão

aumentou sua atividade anti-inflamatória no modelo testado quando comparado com

a veiculação em suspensão. A redução da inflamação, neste estudo, está associada

com alterações no acúmulo de citocinas pró-inflamatórias na orelha, sugerindo uma

alternativa para redução dos efeitos adversos associados à altas dosagens de aspirina

administradas oralmente.

Os nanocarreadores apresentando-se como alternativas para administração de

fármacos através do estrato córneo (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012), e

reconhecendo as inúmeras vantagens que estes veículos possibilitam aos derivados

vegetais, torna este trabalho de desenvolvimento de uma nanoemulsão contendo

extrato vegetal com ação anti-inflamatória, uma promissora alternativa na terapia anti-

inflamatória cutânea.

61

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Material vegetal

As cascas de R. ferruginea foram coletadas em Blumenau (SC), em parceria

com a Profa. Dra. Angela Malheiros, em outubro de 2013 de uma árvore com 35 cm

de diêmetro de tronco e a uma altura de 20 cm do solo. As cascas foram secas em

estufa de ar circulante a 45 ºC por 3 dias.

A droga vegetal foi pulverizada em moinho de facas e posteriormente tamisada

manualmente em tamis de malha de 2 mm, selecionando as partículas menores que

2 mm para a preparação da solução extrativa conforme item 4.3, de acordo com os

dados da análise granulométrica para otimização da extração de AMB das cascas de

R. ferruginea obtida por Baccarin e colaboradores (2014).

4.1.2 Materiais e reagentes

3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina, Sigma®, lote: #0001432567-V

Acetato de etila P.A., Vetec®, lote: 1203375

Acetonitrila, grau HPLC, Tedia®, lote: 1202016

Ácido fosfórico, Merck®, lote: K36616573641

Ácido mirsinoico A (AMA)

Ácido mirsinoico B (AMB)

Ácido sulfúrico, Merck®, lote: K37546331 729

Água purificada, obtido por destilação

Água ultrapura grau I, obtido pelo sistema Milli-Q® – sistema de obtenção de

água

Albumina, Applichem®, lote: 8M006877

Álcool etílico absoluto, Synth®, lote: 165608

Alkest® CSO 400, Oxiteno®, lote: 130501C114759

Aprotinina, Applichem®, lote: 7V003064

Capryol® 90, Gattefossé®, lote: 134950

Células NCTC clone 929, fibroblastos L-929 provenientes do Banco de Células

do Rio de Janeiro BCRJ: 0188, lote: 001163

62

Cetiol® 868, Audaz®, lote 1204889

Cetiol® V

Cloreto benzetônio, Fluka Biochemika®, lote: 1144892

Cloreto de potássio, Merck®, K37429936745

Cloreto de sódio PA, Merck®, lote: K38447104 807

Cromatoplaca sílica gel 60 F254, Merck®, lote: HX066874

D-Glicose, Nuclear®, lote: 02040651

Dimetilsulfóxido, Dinâmica®, lote: 35574

EDTA dissódico, Merck®, lote: K37886918 743

Eosina amarelada CI 4538, Vetec®, lote: 1100662

Fluoreto de fenildimetilsulfonil (PMSF), Sigma®, lote: 028K0766

Fosfato de potássio monobásico PA, Vetec®, lote: 0604392

Fosfato de sódio PA, Nuclear®, lote: 08061008

Fosfato de sódio dibásico PA, Nuclear®, lote: 08071042

Grades de cobre 400 mesh com filme FormVar/carbono para microscopia

eletrônica de transmissão

Hexadeciltrimetilamônio brometo, Fluka®, lote: 1312661

Hexano P.A., Lafan®, lote: 13280

Hidróxido de sódio PA, Merck®, lote: B0183698 749

Labrafil® M1944CS, Gattefossé®, lote: 136228

Labrasol®, Gattefossé®, lote: 139960

Membrana de diálise, Sigma-Aldrich®, lote 07796ME

Metanol, grau HPLC, J.T. Baker®, lote: M04CO2

Metanol P.A., Vetec®, lote: 1204283

Miristato de Isopropila, Casa das Essências®, lote: R3G121051214

Nitrogênio líquido

Óleo de cróton, Sigma®, lote: 065K1429

Pele de orelha de porco provenientes do Frigorífico Antônio Carlos (Antônio

Carlos – SC)

Peróxido de hidrogênio, Vetec®, lote: 0805129

Phenonip®, Pharma Special®, lote: GBG0007304

Placa para cultura de células de 96 poços 3599, Costar®

Placa para cultura de tecidos de 6 poços 92006, TPP®

63

Propilenoglicol, Via Farma, lote: 3252*ZL2731A003

Sepigel® 305, Fagron®, lote: 13125101ª

Solução de hematoxilina de Harris, Dinâmica®, lote: 40277

Span® 80, Sigma®, lote: 33706125

Streptavidina-HRP kit mouse IL-1β, R&D Systems, lote: AEM 4907031

Streptavidina-HRP kit mouse CXCL1/KC, R&D Systems, lote: AEM 6309021

Streptavidina-HRP kit mouse TNF-α, R&D Systems, lote: AEM 6409042

Tamis, abertura 2 mm/µm, Bertel®

Triglicérides Cáprico Capril, Embrafarma®, lote: 14038 (FI)

Triton® X-100, Sigma®, lote: 29085

Tween® 20, Vetec®, lote: 022911

Tween® 80, Dinâmica Química®, lote: 36668

Xileno PA, Cromato Produtos Químicos LTDA, lote: 0604.05/10

4.1.3 Equipamentos

Agitador magnético Mg-Multi Marte®

Agitador mecânico Fisatom® 713D

Aparato de permeação cutânea Microette Q-PakTM, composto por: células de

Franz Hanson Research, placa de agitação magnética MIXdrive com controle

MIXcontrol 2Mag Magnetic e Motion, banho de circulação programável Hanson

Research.

Autoclave Quimis® modelo 190.22

Balança analítica Bel® UMark 250ª

Balança Infravermelho Mettler-Toledo® LJ 16

Banho maria com circulação Marconi® MA 159

Banho ultrassônico Ultracleaner 800A Unique®

Câmara de ultravioleta Dist®

Capela de exaustão Permution® modelo CE0701

Centrífuga Hermle® Z300

Centrífuga Micro Fanem® Mod. 243

Chapa de aquecimento Fisatom®

Cromatógrafo Shimadzu® LC 20-AC com uma bomba quaternária LC-20AT

Shimadzu®, detector de varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de

64

fotodiodos (diodo array) SPD-M20A Shimadzu®, injetor automático SIL-20AHT

Shimadzu®, software LC Solution®

Espectrofotômetro de UV/VIS Shimadzu® modelo UV-1601

Estufa com 5% de CO2, 85% de umidade relativa e 37 ± 1 °C, Ultrasafe®,

modelo HF 212UV

Estufa de ar circulante Quimis®

Estufa de cultura Quimis® modelo 316.22

Estufa de secagem Fanem® modelo 315 SE

Estufa Fanem® 502C

Fluxo laminar Veco® modelo VLFS-12 série 8195

Freezer -80°C

Lâminas para microscopia 26,0x76,0 mm, Precision® Glass Line

Lamínula 24,0x32,0 mm Glasscyto®

Leitor de microplaca Spectro Star Nano, BMG Labtech

Microcentrífuga de velocidade refrigerada Vision® modelo VS-15000CFNII

Micrômetro digital Mitutoyo® modelo APB-2D

Microscópio eletrônico de transmissão Jeol modelo JEM-1200EXII

Microscópio óptico Olympus® CBA

Microscópio Olympus modelo CKX41 com sistema digital de imagem Q colors

3

Micropipeta automática Labmate® 100 µL e 50 µL

Micropipeta de precisão Microman Gilson® 250 µL

Micropipeta multicanal (12 canais 30-300 µL) Eppendorf® Research

pHmetro AJMicronal® AJX-512

Potenciômetro Digimed® modelo DM20

Triturador de tecidos Tissue TearorTM modelo 985370 Biospec® Products

Viscosímetro rotacional Haake® modelo VT 550, K10, DC30, tipo cone placa,

acoplado a um banho de água termostatizado e software Rheowin® 4 Data

Manager 430.0013 e Rheowin® 4 Job Manager

Vortex Biomixer® QL-901

Zetasizer Nano ZS Modelo ZEN3600 Malvern®

65

4.2 Análise das cascas pulverizadas de R. ferruginea

As cascas da R. ferruginea foram analisadas quanto ao do teor de cinzas totais,

cinzas insolúveis em ácido e perda por dessecação.

Para a determinação dos teores de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido

das cascas pulverizadas, foi empregado método farmacopeico (ANVISA, 2010), em

triplicata.

Para cinzas totais, foi pesado 3 g da planta pulverizada, em triplicata, e

transferida para cadinho previamente tarado e seco, ficando a droga uniformemente

distribuída. A droga contida no cadinho foi incinerada a temperatura máxima de 600

°C, até a eliminação de todo carvão. Após, foi resfriada em dessecador e pesada. Este

procedimento foi repetido até que a amostra atingisse peso constante. A porcentagem

de cinzas foi calculada em relação a droga seca e o resultado expresso em média ±

desvio padrão.

Para a determinação das cinzas insolúveis em ácido, o resíduo obtido na

determinação de cinzas totais foi fervido por 5 minutos com 25 mL de ácido clorídrico

a 7% (p/V) em cadinho coberto com vidro de relógio. Após, o vidro de relógio foi lavado

com água quente, juntando a água de lavagem ao cadinho. O resíduo insolúvel em

ácido foi recolhido sobre papel filtro isento de cinzas, lavando-o com água quente até

que o filtrado se tornasse neutro. O papel filtro contendo o resíduo foi transferido para

o cadinho original e secado em chapa quente, após foi incinerado a cerca de 500 °C

até peso constante. A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido foi calculada em

relação a droga seca e expressa em média ± desvio padrão.

Para avaliação da perda por dessecação, foi empregado cerca de 1 g das

cascas pulverizadas e tamisadas em balança de infravermelho a 105 °C. A droga foi

uniformemente distribuída sobre o prato da balança, em triplicata. A perda por

dessecação foi expressa em porcentagem, sendo calculada a média e desvio padrão.

4.3 Obtenção e caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.

ferruginea

4.3.1 Obtenção

A solução extrativa das cascas de R. ferruginea foi obtida pelo método de

maceração dinâmica. A droga vegetal na proporção planta/solvente 10% (p/V) foi

66

macerada empregando-se solvente hidroalcoólico 90 °GL, à temperatura ambiente,

sob agitação em agitador mecânico (800 ± 30 rpm), sem renovação do líquido extrator,

por 2 h, conforme padronizado por Baccarin e colaboradores (2014). Posteriormente

a solução foi filtrada em três camadas de tecido Sontara®. A solução extrativa obtida

foi filtrada novamente a vácuo em filtro de papel. Após este processo foi calculado o

rendimento da solução extrativa obtida e expresso em porcentagem.

Para obtenção do extrato mole, o volume da solução extrativa foi reduzido até

cerca de 50% em banho-maria a 45 °C. Após, foi concentrado em estufa de ar

circulante a 45 °C até apresentar aspecto xaroposo. Ao término deste processo foi

calculado o rendimento, que foi expresso em porcentagem.

4.3.2 Caracterização

4.3.2.1 Aspectos organolépticos

Para análise dos aspectos organolépticos foi observado a cor e odor dos

derivados vegetais.

4.3.2.2 Determinação do pH

O pH da solução extrativa foi determinado por leitura direta em potenciômetro

calibrado a 25 °C. O resultado foi calculado pela média de três determinações.

Para a determinação do pH do extrato mole, foi realizado a diluição do mesmo

em água destilada na proporção de 1:10 (p/V), e o valor de pH determinado em

triplicata, calculando-se a média ± desvio padrão.

4.3.2.3 Determinação do resíduo seco (BRASIL, 2010)

O resíduo seco para derivados vegetais obtidos foi determinado em triplicata

empregando 2 mL da solução extrativa e aproximadamente 0,5 g do extrato mole. As

amostras foram transferidas para pesa-filtros e evaporadas até secura em chapa de

aquecimento. Depois foram dessecadas em estufa a 100-105 °C, por 3 h, resfriadas

em dessecador e pesadas. O procedimento foi repetido até peso constante. O resíduo

seco foi calculado em porcentagem sobre a massa pesada e sobre o volume de 2 mL,

sendo calculado a média e o desvio padrão.

67

4.3.2.4 Perfil qualitativo dos derivados vegetais de R. ferruginea por Cromatografia em

Camada Delgada (CCD)

Na análise do perfil qualitativo por CCD, a solução extrativa foi analisada sem

prévia diluição ou concentração e o extrato mole foi diluído para obtenção de uma

solução a 5 mg/mL em metanol. Os ácidos mirsinoicos AMA e AMB foram empregados

como marcadores sendo dissolvidos em acetona. Foram utilizadas cromatoplacas de

sílica gel e como sistema de eluição, uma mistura de hexano e acetato de etila (1:1)

(BACCARIN et al., 2014).

As soluções dos padrões de AMA e AMB e dos extratos foram aplicados com

capilares na forma de manchas circulares. Os cromatogramas foram desenvolvidos

de forma ascendente, em cubas saturadas com o sistema eluente até a altura de

aproximadamente 10 cm. Após a secagem, à temperatura ambiente, a cromatoplaca

foi visualizada em câmara de UV em 254 nm, e posteriormente realizada a revelação

com anisaldeído sulfúrico com posterior aquecimento da placa cromatográfica

(BACCARIN et al., 2014).

4.3.2.5 Determinação do teor de AMA e AMB

O teor de AMA e AMB (mg/g) nos derivados vegetais foi determinado

empregando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) usando metodologia

desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2014). As análises foram realizadas em

parceria com a mestranda Tailyn Zermiani. A detecção por varredura de espectro foi

realizada na faixa de comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm e os

comprimentos de onda de 260 e 270 nm foram selecionados para quantificação dos

marcadores AMA e AMB, respectivamente.

A fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa Kinetex XB®

C18, 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 µm. A fase móvel

utilizada foi uma mistura de acetonitrila (ACN), metanol e água acidificada com ácido

fosfórico a pH 2,5 (Quadro 1). Todos os solventes usados foram de grau HPLC e os

componentes da fase móvel foram filtrados a vácuo com membrana de celulose

regenerada com 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em

banho de ultrassom. Foi usado o método gradiente apresentado no Quadro 1, com

fluxo de 0,9 mL/min, volume de injeção de 20 L e temperatura de 35 °C.

68

Quadro 1 - Condições cromatográficas para análise dos derivados

vegetais de R. ferruginea por CLAE.

Tempo

(min)

Acetonitrila

(%)

*Água

(%)

Metanol

(%)

0 5 70 25

2 5 70 25

5 30 45 25

10 60 15 25

12 70 5 15

15 84 1 15

25 84 1 15

30 5 70 25

35 5 70 25

*Água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5.

Para a análise da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, diluiu-se a

amostra na proporção de 1:5 com metanol. Posteriormente as soluções foram filtradas

com membrana de PTFE modificada de 0,45 μm, colocadas em frasco do tipo vials

(1,5 mL), e injetadas em triplicata. Para análise do extrato mole, foi pesado 1 mg do

extrato e dissolvido em 1 mL de metanol, filtrado em membrana de PTFE modificada

de 0,45 μm, colocadas em frasco do tipo vials e injetado em triplicata. Os padrões

AMA e AMB foram injetados na concentração de 50 µg/mL em metanol.

A determinação do teor de AMB e AMA nos extratos foi determinada pelo

cálculo da área dos seus picos encontradas no cromatograma obtido pela análise das

soluções amostra, em comparação com a área dos mesmos nas soluções padrão.

4.4 Estudos de pré-formulação das nanoemulsões

4.4.1 Determinação da solubilidade do extrato

A partir dos óleos e tensoativos selecionados com base na literatura

pesquisada, que podem ser empregados no desenvolvimento da nanoemulsão, a

solubilidade do extrato mole na concentração de 10 mg/mL foi testada em 5 mL de

cada óleo e na mistura de óleo:tensoativo na proporção de 1:2 em um frasco com

tampa. Os frascos foram agitados em agitador vortex e mantidos por 24 h sob agitação

magnética a 25 ± 2 °C. A mistura obtida teve a absorbância analisada em

69

espectrofotômetro UV/Visível com varredura nos comprimentos de onda entre 190 nm

a 800 nm para seleção da melhor absorbância. Como branco foi usado o óleo ou

óleo:tensoativo correspondente. A partir do resultado encontrado para a absorbância,

foram selecionados os óleos e tensoativos para o desenvolvimento da nanoemulsão.

4.4.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato

O coeficiente de partição do extrato mole foi determinado usando o método de

agitação do frasco, conforme De Carli (2007).

O coeficiente de partição (P) é definido como a razão das concentrações em

equilíbrio de uma substância dissolvida em um sistema de duas fases, composto de

dois solventes imiscíveis, n-octanol e água, usando a equação 1.

𝑃 = 𝐶𝑛−𝑜𝑐𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙

𝐶á𝑔𝑢𝑎 (1)

O n-octanol foi saturado com uma quantidade idêntica de água, para isso, a

mistura dos dois solventes foi agitada por aproximadamente 12 h, em agitador

magnético a 400 rpm. A fase aquosa foi separada em funil de separação e

centrifugada 1400 rpm por 10 minutos.

Após a saturação, 10 mL de uma solução aquosa contendo 100 µg/mL do

extrato mole de R. ferruginea foi adicionado em 10 mL do n-octanol saturado. Esta

mistura sofreu agitação por 30 min, em banho-maria a 37 ± 0,5 °C, foi transferida para

um funil de separação e mantida em repouso por 5 minutos. Após o repouso, a fase

aquosa foi retirada e centrifugada por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi

analisado em triplicata por CLAE.

4.5 Desenvolvimento das nanoemulsões

4.5.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário

O processo de obtenção das nanoemulsões foi otimizado utilizando o diagrama

de fases pseudoternário a fim de determinar a melhor combinação e proporção entre

os componentes (fase oleosa, fase aquosa e sistema tensoativo).

Antes de dar início à construção do diagrama de fases, foi necessário

determinar a combinação de tensoativos selecionados com base no teste de

solubilidade e as suas proporções para que o valor de EHL (equilíbrio hidrófilo-lipófilo)

70

fosse semelhante ao EHL do óleo selecionado, miristato de isopropila (EHL 11,5)

(CONVERGENT COSMETICS, 2013). Foram realizadas três misturas contendo dois

tensoativos cada, sendo que a combinação considerou a mistura de um tensoativo

com valor de EHL alto e outro tensoativo com EHL baixo, conforme apresentado no

Quadro 2.

Quadro 2 - Combinações de tensoativos e suas respectivas proporções empregadas no desenvolvimento das nanoemulsões.

Combinação de Tensoativos Proporção

Capryol® 90 (EHL= 6) +

Alkest® CSO 400 (EHL= 13) 1,5:5,5

Capryol® 90 (EHL= 6) +

Tween® 80 (EHL= 15) 3,5:5,5

Alkest® CSO 400 (EHL= 13) +

Span® 80 (EHL= 4,3) 7,2:1,5

Para a mistura dos componentes na combinação de Capryol® 90 e Tween® 80

a temperatura foi a ambiente, já para as outras duas combinações a temperatura foi

de 45 °C para uma perfeita homogeneização dos tensoativos.

O diagrama foi estudado empregando dois métodos distintos, o método da

titulação e o método ponto a ponto. No método da titulação, baseado nos trabalhos

realizados por Shafiq-un-Nabi e colaboradores (2007) e Li e colaboradores (2005), as

misturas de óleo:tensoativo foram fixadas em diferentes proporções, como segue:

(1:9), (2:8), (3:7), (4:6), (5:5), (6:4), (7:3), (8:2), (9:1). Estas misturas receberam

concentrações adicionais de água em intervalo de 24 h, para que o volume total diário

em mL fosse: 1,1; 1,2; 1,25; 1,3; 1,35; 1,4; 1,45; 1,5; 1,55; 1,6; 1,65; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0;

2,2; 2,3; 2,5; 2,7; 3,0; 3,2; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 e 10,0. A água foi adicionada

com o auxílio de uma micropipeta, sob agitação, em vortex, mantendo-se a agitação

por 2-3 minutos após a sua completa adição. A cada adição de água, os sistemas

foram armazenados em estufa a 25 ± 2 °C por 24 h e após tiveram o seu aspecto

visual analisado a olho nu.

Os sistemas foram visualmente classificados como: FU – Fluido Turvo; FT –

Fluido Transparente; FL – Fluido Translúcido; FB: Fluido Branco, leitoso; SF:

Separação de Fases; GT: Gelificado Transparente; GL – Gelificado Translúcido; GU:

71

Gelificado Turvo; GR: Gelificado com Ressonância; EG: Emulsão Gelificada; E:

Emulsão. O diagrama foi plotado usando software Sigma Plot® 12.0.

Partindo dos resultados obtidos pelo diagrama de fases por titulação, excluíram-

se os pontos com separação de fases e com formação de emulsão e os demais pontos

foram preparados individualmente. Baseando-se no trabalho realizado por Peng et al.

(2010), ou seja, cada proporção dos componentes, óleo, mistura de tensoativos e

água, foram preparadas individualmente, misturando-se a proporção de óleo e mistura

de tensoativos primeiramente e após adicionando-se a quantidade total de água gota

a gota, sob agitação em vortex. O sistema foi mantido em agitação por 2-3 minutos

seguido de repouso por 24 h. O aspecto físico foi analisado visualmente a olho nu e

mensurada a distribuição do tamanho das gotículas por DLS após diluição em água.

A partir dos resultados encontrados foram selecionadas as formulações para

estudo de estabilidade preliminar e estabilidade termodinâmica.


nanoemulsões sem extrato

A partir do resultado obtido no diagrama de fases usando miristato de isopropila

como fase oleosa e a mistura de Alkest® CSO 400 e Span® 80 como tensoativos,

foram selecionadas 3 formulações que apresentaram tamanho médio de gotas menor

que 100 nm, com baixo índice de polidispersibilidade, com aspecto fluido e com baixa

concentração de tensoativo. As formulações escolhidas estão detalhadas no Quadro

3. As formulações selecionadas foram preparadas em duplicata para verificar a

reprodutibilidade do método de preparo, na quantidade total de 30 g.

Quadro 3 - Formulações dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o estudo de estabilidade preliminar.

Fórmula Óleo (%) Tensoativos* (%) Água (%)

4:6:20 13,3 20,0 66,7

5:5:70 6,3 6,3 87,5

6:4:20 20,0 13,3 66,7

*Alkest® CSO 400 e Span® 80 (7,2:1,5).

O método de preparo consistiu na pesagem de todos os componentes e da

mistura do óleo com a combinação de tensoativos Alkest® CSO 400: Span® 80 na

proporção de 7,2:1,5, respectivamente. Os recipientes contendo a água e a mistura

72

de óleo e tensoativos foram mantidas em banho-maria até atingirem a temperatura de

80 °C. Após aquecimento, a água foi gotejada lentamente na fase oleosa contendo

tensoativos, sob agitação em agitador mecânico com velocidade constante de 600

rpm. Após o término da adição de água, o sistema foi mantido sob agitação por mais

5 minutos com aquecimento, e, posteriormente, mais 3 minutos sem aquecimento.

As amostras ficaram em repouso por 24 h e, após este período, foram

analisadas quanto ao aspecto físico, diâmetro médio das gotas por DLS, índice de

polidispersibilidade, pH e separação de fases após centrifugação a 3000 rpm por 15

min, para visualização de qualquer sinal de instabilidade física. Após estas análises,

as amostras foram submetidas ao estudo de estabilidade preliminar em 6 ciclos de 24

h a 40 ± 2 °C e 4 ± 2 °C. Ao término do período, as amostras foram analisadas

novamente quanto aos aspectos verificados no tempo inicial.

As formulações que não apresentaram sinais de instabilidade, após o teste de

centrifugação no término do ciclo, foram encaminhadas para o ciclo gelo/degelo para

verificação da estabilidade termodinâmica. Este teste foi adaptado da metodologia

empregada por Shafiq-Un-Nabi e colaboradores (2007). As amostras passaram por 3

ciclos de 48 h a temperaturas de -4 ± 2 °C e 25 ± 2 °C.

4.5.3 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo

extrato

A partir dos resultados encontrados, o extrato mole das cascas da R. ferruginea

foi incorporado na concentração de 0,5% nas formulações 5:5:70 e 6:4:20 para

averiguar a compatibilidade entre as formulações e o extrato. A escolha da

concentração de 0,5% do extrato baseou-se no resultado obtido em estudo

farmacológico preliminar de atividade anti-inflamatória tópica no modelo de edema de

orelha induzido por óleo de cróton, Figura 30 do item 5.11, realizado em parceria com

a Profa. Dra. Marcia Maria de Souza do Laboratório de Farmacologia in vivo da

UNIVALI, descrito no item 4.11.2.

Neste estudo o extrato foi incorporado nas concentrações de 0,25%, 0,5% e

1,0% em creme convencional. A formulação do creme é apresentada no Quadro 4.

Para a incorporação do extrato na formulação do creme, o mesmo foi previamente

dissolvido em propilenoglicol em quantidade suficiente, e adicionado à formulação

pronta do creme.

73

Quadro 4 - Composição do creme convencional utilizado nos ensaios farmacológicos, liberação in vitro

e permeação cutânea in vitro.

Fase Componente/Função Concentração

Oleosa

Vaselina líquida/emoliente 1,0%

Crodalan®/emoliente 13,3%

Miristato de isopropila/emoliente 2,0%

Álcool cetoestearílico/emulsionante 3,0%

BHT/antioxidante 0,1%

Phenonip®/conservante 0,7%

Aquosa Água destilada/veículo Qsp

EDTA/sequestrante 0,1%

Agente de

consistência Sepigel®/polímero 7,5%

Para a incorporação do extrato nas nanoemulsões, inicialmente o extrato foi

adicionado na fase oleosa composta por tensoativos e óleo. As fases oleosa e aquosa

(água q.s.p.) foram levadas ao aquecimento em banho-maria até a temperatura de 80

°C. Devido à ocorrência de precipitação do extrato com aderência no fundo do

recipiente, foram realizados diversos testes para a dispersão do extrato na fase oleosa

(dispersão somente na mistura de tensoativos e depois adição de óleo; dissolução em

propilenoglicol com posterior adição da mistura de tensoativos seguida pela adição do

óleo). Por não ter sido possível adicionar diretamente o extrato na fase oleosa, optou-

se pela prévia dissolução do extrato mole em propilenoglicol e posterior adição da

água, com homogeneização sob aquecimento em banho-maria, método este que

permitiu a completa dispersão do extrato.

Assim o extrato mole da casca da R. ferruginea foi incorporado nas formulações

dissolvido na fase aquosa, a qual foi gotejada sob agitação a 600 rpm e sob

aquecimento a 80 °C sobre a fase oleosa da formulação acrescida de 0,75% de

preservante Phenonip® (composto por butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno,

fenoxietanol e propilparabeno). A mistura permaneceu sob agitação a 600 rpm por

mais 5 min, sob aquecimento e posteriormente mais 3 min sem aquecimento. Este

procedimento foi repetido para cada uma das formulações (5:5:70 e 6:4:20) em

duplicata, para estudo da estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo extrato.

Para aumento da viscosidade das nanoemulsões, nas formulações com e sem

extrato foi incorporado Sepigel® 305, um espessante polimérico pré-neutralizado em

74

emulsão inversa. A adição do Sepigel® 305 foi progressiva até a obtenção de uma

formulação com consistência adequada para aplicação tópica, por isso para cada

formulação a quantidade adicionada do agente de consistência variou de acordo com

as características individuais de cada formulação. Além disso a incorporação do

Sepige® foi após o esfriamento da nanoemulsão. A formulação de cada amostra

contendo ou não Sepigel® está representada no quadro 5.

Quadro 5 - Composição das nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea e com e sem Sepigel® testadas no estudo de estabilidade preliminar.

Amostra Óleo

%

Tensoativo

%

Água

%

Extrato

%

Propilenoglicol

%

Sepigel®

%

5:5:70 6,3 6,3 87,5 - - -

5:5:70 S 6,3 6,3 87,5 - - 0,96

5:5:70 RF 6,3 6,3 85,4 0,5 1,0 -

5:5:70 RFS 6,3 6,3 85,4 0,5 1,0 1,50

6:4:20 20,0 13,3 66,7 - - -

6:4:20 S 20,0 13,3 66,7 - - 0,85

6:4:20 RF 20,0 13,3 64,7 0,5 1,0 -

6:4:20 RFS 20,0 13,3 64,7 0,5 1,0 0,85

Nota: S: com Sepigel®; RF: com extrato mole de R. ferruginea; RFS: com extrato mole de R. ferruginea e Sepigel®, somente números: sem extrato e sem Sepigel®

Após o preparo de cada uma das amostras, as mesmas permaneceram 24 h

em repouso, e foram avaliadas quanto ao aspecto físico, pH, teste de centrifugação,

tamanho das gotículas e índice de polidispersibilidade (PDI). As análises foram

realizadas no tempo inicial (t0) e no tempo final (tf) do estudo.

Devido à instabilidade observada no estudo preliminar com as nanoemulsões

contendo extrato incorporado na fase aquosa com concentração de 0,5%, foram

realizados estudos com a incorporação do extrato na fase oleosa, usando 2 ou 5% de

propilenoglicol para prévia dissolução do extrato.

Novamente as formulações demonstraram perda de estabilidade. Decidiu-se

realizar novo estudo de estabilidade preliminar, reduzindo a concentração do extrato

para 0,25% e 0,13%, usando 2% de propilenoglicol para sua prévia dissolução e

incorporação na fase oleosa.

75

4.6 Caracterização das nanoemulsões

Partindo dos resultados obtidos no estudo de estabilidade preliminar, a

formulação escolhida para a continuidade dos estudos para etapa de caracterização

foi a 6:4:20, representada no Quadro 6.

Quadro 6 - Composição da nanoemulsão selecionada para incorporação do extrato mole de R. ferruginea.

Fase Componente/Função Concentração

Oleosa

Miristato de Isopropila/emoliente 20%

Alkest® CSO 400 + Span® 80 (7,2:1,5)/tensoativos 13,3%

Phenonip®/conservante 0,75%

Aquosa Água destilada/veículo 65,95%

Agente de

consistência Sepigel®/polímero 0,85%

O extrato foi incorporado na fase oleosa na concentração de 0,25% e 0,13% e,

após estudo de eficácia em modelo farmacológico, conforme metodologia descrita no

item 4.11.2, os estudos de caracterização foram conduzidos com a formulação

contendo 0,13% de extrato.

O extrato foi incorporado na nanoemulsão na fase oleosa após prévia

dissolução em 2% de propilenoglicol, sob aquecimento. Esta solução foi adicionada à

fase oleosa contendo os tensoativos e conservantes. A fase aquosa foi adicionada

gota a gota, sob agitação a 600 rpm e 85 °C. Após o término da adição da fase aquosa,

o sistema permaneceu sob agitação por 5 min, foi retirado do aquecimento e agitado

por mais 3 min. O Sepigel® foi adicionado ao sistema após o resfriamento do mesmo.

As nanoemulsões obtidas, com e sem extrato, foram caracterizadas usando os

métodos descritos a seguir.

4.6.1 Aspecto visual e estabilidade física

Após 24 h de preparo, as nanoemulsões foram analisadas quanto aos aspectos

visuais: cor, separação de fases e cremeação.

A estabilidade física foi verificada por percepção direta de cor e separação de

fases das nanoemulsões após centrifugação a 3000 rpm por 30 min (ANVISA, 2004).

76

4.6.2 Análise morfológica

O aspecto morfológico das nanoemulsões foi analisado usando microscopia

eletrônica de transmissão (MET). A nanoemulsão foi diluída na proporção de 1:100,

em água destilada, e uma gota desta solução foi depositada sobre uma grade de cobre

de 400 mesh coberta com filme FormVar/Carbono, e deixado em repouso por 1 h para

permitir a secagem. Sobre a grade com a nanoemulsão, foi adicionado 1 gota de

contraste negativo à base de acetato de uranila a 2% e deixado em contato por 10

minutos. O excesso de contraste foi retirado com papel filtro e a grade foi analisada

diretamente no MET a temperatura ambiente e 80 kV. A análise foi feita no Centro de

Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná (UFPR) em parceria com

a Profa. Dra. Joana Lea Meira Silveira.

4.6.3 Análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta

O tamanho médio da fase interna, a distribuição de tamanho e o potencial zeta

das nanoemulsões desenvolvidas foram determinados por espectroscopia de

correlação de fótons (DLS) no Laboratório de Pesquisa em Tecnologia Farmacêutica

da UNIVALI.

Para a análise do tamanho das gotículas a amostra foi diluída na proporção

1:100 em água ultrapura. O resultado foi expresso como média de 3 aferições. As

análises foram realizadas a 25 ± 2 ºC.

4.6.4 Comportamento reológico

A análise do comportamento reológico das nanoemulsões com e sem extrato

de R. ferruginea foi realizada em viscosímetro rotacional tipo cone-placa a 25 °C. A

amostra foi analisada em 3 etapas: rotação de 0-80 1/s por 180 segundos; rotação

constante de 80 1/s por 180 segundos e rotação de 80-0 1/s por 180 segundos,

retornando ao ponto estático (CZEPULA, 2006). Em cada etapa foram coletados 100

dados.

4.6.5 Quantificação dos marcadores da R. ferruginea por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência (CLAE)

Para análise quantitativa das formulações por CLAE foi usada metodologia

analítica desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2014). Foi pesado 0,5 g da

77

formulação dissolvido em 5 mL de acetonitrila e submetido ao banho de ultrassom por

20 minutos. A solução foi então centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos e o

sobrenadante filtrado e analisado em triplicata. A partir do resultado da triplicata das

áreas obtidas nas análises dos padrões de AMA e AMB, foi calculado o teor médio e

o desvio padrão nas amostras.

4.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão

Amostras de nanoemulsões com e sem extrato foram avaliadas quanto à

estabilidade acelerada. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente (23 ± 2

°C) e a 40 ± 2 °C por 6 meses e foram avaliados aspectos como aparência (cor,

separação de fases), tamanho de gota por DLS, potencial zeta, reologia, pH e

quantificação dos marcadores do extrato por CLAE. As avaliações foram realizadas

no tempo zero, 30, 90 e 180 dias.

4.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R. ferruginea

As nanoemulsões e cremes contendo ou não o extrato de R. ferruginea tiveram

o seu potencial de irritação cutânea avaliados em duplicata pelo método da difusão

em gel de agarose (Agarose overlay) de acordo com o Guia para Avaliação de

Segurança de Produtos Cosméticos (ANVISA, 2003) e a Farmacopeia Americana

(UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007), seguindo o método desenvolvido pelo

Laboratório de Farmacologia In Vitro da Univali. O ensaio foi feito em parceria com a

doutoranda Liliani Thiesen.

A suspensão celular de fibroblastos (L929) a 300.000 células/mL foi tripsinizada

e transferida na concentração de 2 mL/poço em placa de 6 poços. Após 24 h, o meio

de cultura foi substituído por DMEM contendo 0,01% de vermelho neutro como corante

vital e mantido por 1 h no escuro até aparecimento de coloração vermelha celular.

Após este período, o excesso de corante vital foi removido e cada poço lavado com

PBS. Em cada poço foi adicionado 3 mL de uma mistura na proporção 1:1,2 de meio

agarose:meio DMEM (mistura overlay). As placas permaneceram por 15 minutos em

temperatura ambiente para secagem.

As amostras das nanoemulsões e cremes foram incorporadas em discos de

papel (0,54 cm), previamente lavados com PBS e secos, com posterior autoclavação

78

(121 °C/20 min). Como controle positivo foi usada a solução de Triton X-100 e como

controle negativo o meio DMEM. As placas foram incubadas por 24 h em estufa a 37

°C com 5% de CO2.

O grau de irritação foi avaliado pela zona de lise (zona com ausência de

incorporação do corante vital), usando um paquímetro e a avaliação seguiu a

classificação descrita pela Farmacopéia Americana (UNITED STATES

PHARMACOPEIA, 2007), conforme quadro 7.

Quadro 7 - Grau de reatividade para teste de difusão em ágar.

Grau Reatividade Descrição da Zona de Reatividade

0 Nenhuma Nenhuma zona detectável em torno ou embaixo da amostra

1 Leve Algumas células malformadas ou degeneradas embaixo da

amostra

2 Médio Zona limitada a área embaixo da amostra

3 Moderado A zona se estende de 0,5 a 1,0 cm além da amostra

4 Severo A zona se estende mais que 1,0 cm além da amostra

Fonte: United States Pharmacopeia, 2007.


ferruginea

O estudo de liberação dos marcadores do extrato de R. ferruginea incorporados

na nanoemulsão e creme e do extrato mole a 0,13% em propilenoglicol, foi conduzido

em células de difusão de Franz (n=6), com área de difusão de 1,53 cm² e com volume

do compartimento receptor de 6,5 mL, interligadas a um banho termostatizado

estabilizado a 32 °C e dispostas sobre uma placa magnética para promover agitação

constante do meio receptor a 600 rpm.

A escolha do meio receptor foi realizada mediante ensaio de solubilidade do

extrato mole na concentração de 3,482 mg/mL, ou seja, 10 vezes a concentração dos

marcadores no extrato usado na formulação, para garantir a condição sink do ensaio.

Foram testadas diversas soluções para garantir a solubilidade, como álcool 25%, 50%

e 70% e tampão fosfato pH 7,2 com 30% de PEG 400. Como melhor meio receptor,

foi selecionado o sistema solvente álcool 70%.

79

O compartimento receptor de cada célula de Franz foi preenchido com o meio

receptor. Sobre este compartimento, a membrana de acetato de celulose (membrana

de diálise), previamente hidratada por 12 h em água destilada, foi disposta de maneira

a evitar a formação de bolhas. Acima da membrana, foi disposto um disco de teflon

que teve seu orifício completamente preenchido com 300 mg de cada formulação e

do extrato mole em solução. A oclusão da formulação e da solução de extrato foi feita

com disco de acrílico, demonstrado na Figura 6. Cada célula foi selada com anel

metálico e fechada com trava de metal, conforme demonstrado na Figura 7. Só então

a placa magnética foi acionada para que a agitação ocorresse. A agitação foi cessada

a cada coleta das amostras.

Figura 6 - Foto demonstrativa da montagem da célula de Franz com nanoemulsão.

Figura 7 - Foto demonstrativa do detalhe do sistema das células de difusão de Franz fechado e da

coleta das amostras.

80

A coleta das amostras foi realizada adicionando 1 mL de meio receptor fresco,

armazenado em béquer com circulação externa de água a temperatura constante de

32 °C, com auxílio de seringa, através da válvula localizada no braço inferior da célula.

Assim igual volume do meio receptor contido no compartimento receptor da célula, foi

coletado através da cânula de amostragem localizada no braço superior da célula,

demonstrado na Figura 7. As amostras foram coletadas nos tempos de 1, 2, 4, 6, 8,

12 e 24 h. As amostras foram analisadas por CLAE para quantificação dos marcadores

AMA e AMB, após filtração. A massa dos marcadores acumulada no compartimento

receptor em cada tempo foi calculada considerando a área efetiva para a liberação na

célula.

Para avaliação da cinética de liberação, os perfis de liberação obtidos a partir

das formulações foram ajustados aos modelos matemáticos de ordem zero, primeira

ordem, modelo de Higuchi e equação geral de liberação (BIDONE et al., 2014;

BRUSCHI et al., 2007).

4.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo extrato

de R. ferruginea

O ensaio de permeação cutânea também foi realizado em células de difusão

de Franz (n=6) empregando nanoemulsão e creme convencional contendo 0,13% de

extrato de R. ferruginea e extrato mole a 0,13% em propilenoglicol. A solução

receptora foi composta de solução hidroalcoólica a 70% garantindo a condição sink,

determinado em ensaio de solubilidade do extrato descrito no item 4.9. O

procedimento da análise foi realizado nas mesmas condições dos estudos de

liberação in vitro (item 4.9).

Como membrana foi utilizada pele de orelha de porco. As orelhas foram obtidas

no Frigorífico Antônio Carlos (Antônio Carlos-SC). Antes do ensaio, as orelhas foram

limpas em água corrente, secas com papel toalha e embrulhadas em papel alumínio.

As orelhas limpas foram armazenadas em congelador até o momento do uso.

Antes do uso, as orelhas foram descongeladas à temperatura ambiente. A pele

da face anterior da orelha foi depilada com lâmina e seccionada em círculos em áreas

sem a presença de lesões, vasos sanguíneos e manchas. Os cortes foram realizados

com auxílio de bisturi e pinça, evitando a retirada do tecido adiposo. Os cortes de pele

foram hidratados por 12 h em solução tampão fosfato pH 7,2.

81

Os cortes circulares de pele foram dispostos sobre cada célula de Franz

preenchida com o meio receptor, evitando a formação de bolhas. Acima da membrana,

foi colocado um disco de teflon que teve seu orifício completamente preenchido com

300 mg de cada formulação e do extrato mole em solução. O procedimento de

oclusão, fechamento e condução do ensaio foi semelhante ao realizado para o ensaio

de liberação in vitro (item 4.9).

Amostras da solução receptora (1 mL) foram coletadas em diferentes intervalos

de tempo (1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h), com reposição simultânea, como descrito no item

4.9, filtradas e quantificadas por CLAE, empregando metodologia descrita no item

4.6.5. Além da análise de quantificação dos marcadores AMA e AMB na solução

receptora, foi realizada análise da formulação remanescente na pele ao final do ensaio

(tempo de 24 h), no estrato córneo e na pele.

Para análise da formulação remanescente, foi retirado o seu excesso sobre a

pele com o auxílio de uma gaze umedecida em água destilada e com 2 fitas adesivas

que foram aderidas sobre a pele e retiradas em sequência. A formulação em excesso

juntamente com a gaze e as fitas foram colocadas em um tubo tipo Falcon contendo

5 mL de acetonitrila para extração em banho de ultrassom por 1 h.

O estrato córneo da área da pele que ficou em contato com a formulação foi

retirado por tape stripping e a pele viável coletada. As amostras foram analisadas

quanto à retenção dos marcadores AMA e AMB. Para o tape stripping foram utilizadas

10 fitas adesivas. As fitas foram aderidas sobre a pele, permanecendo em contato por

30 segundos, realizando uma pressão com um peso padrão de 200 g, e então

retiradas e colocadas, todas juntas, em um tubo tipo Falcon contendo 5 mL de

acetonitrila para extração, conforme descrito anteriormente. A pele viável foi cortada

em pequenos pedaços com um bisturi e colocados em um tubo tipo Falcon com 5 mL

de acetonitrila para extração, conforme descrito anteriormente.

Após a extração, o líquido foi transferido para outro tubo tipo Falcon e

centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi analisado por CLAE

conforme metodologia descrita no item 4.6.5. Os resultados foram expressos em

concentração do marcador em função do tempo (OECD, 2004).

82

4.11 Ensaios farmacológicos da atividade anti-inflamatória

Os ensaios farmacológicos para avaliação da atividade anti-inflamatória tópica

do extrato, das nanoemulsões e do creme contendo o extrato, bem como a

quantificação de mediadores químicos e análise histológica foram realizados nos

laboratórios de Farmacologia in vivo e Farmacologia in vitro do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI com auxílio da Pós-doutoranda

Kathryn A. B. S. da Silva.

4.11.1 Animais

Para os ensaios farmacológicos foram utilizados camundongos Swiss fêmeas

entre 2 a 3 meses de idade (25 a 30 g), oriundos do Biotério Central da Univali. Os

animais foram mantidos no biotério setorial em caixas com maravalha, com no máximo

20 animais/caixa com ciclo claro/escuro de 12 h, aclimatados a temperatura de 22 ± 2

°C e tratados com água e ração ad libitum, inclusive durante os experimentos. As

caixas foram trocadas em dias alternados por técnico responsável conforme rotina

interna do biotério. Os animais permaneceram no biotério por no máximo 3 dias.

Durante os experimentos, os mesmos foram conduzidos para a sala experimental e

permaneceram em ambientação por um período mínimo de 1 h. Água e comida foram

oferecidas, livremente, inclusive durante os experimentos. Os experimentos foram

aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UNIVALI sob Nº de

Parecer: 03/2014 (ANEXO A).

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato incorporado em creme

para definição da concentração de extrato a ser incorporado nas nanoemulsões,

conforme item 4.5.3, cada grupo experimental teve 8 animais, os quais integraram os

seguintes grupos experimentais: G1 – controle negativo (animais sem tratamento); G2

– grupo tratado com o creme veículo sem o extrato; G3 – grupo tratado com o creme

contendo 1,0% do extrato; G4 – grupo tratado com o creme contendo 0,5% do extrato;

G5 – grupo tratado com o creme contendo 0,25% do extrato; G6 – grupo tratado com

o creme contendo AMB 0,5%; G7 – grupo tratado com o creme contendo AMB 0,1%;

G8 – grupo tratado com o creme contendo 0,1% de dexametasona.

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato incorporado nas

nanoemulsões, cada grupo experimental teve um número de 6 animais, os quais

integraram os seguintes grupos experimentais: G1- controle negativo (animais sem

83

tratamento); G2-grupo tratado com nanoemulsão sem extrato da planta; G3-grupo

tratado com nanoemulsão contendo 0,13% do extrato da planta; G4 –grupo tratado

com nanoemulsão contendo 0,25% do extrato da planta; G5 - grupo tratado com

creme sem extrato da planta; G6 – grupo tratado com creme contendo 0,13% do

extrato da planta; G7 – grupo tratado com creme contendo 0,25% do extrato da planta;

G8 – grupo tratado com creme contendo 0,50% do extrato da planta; G9 - (controle

positivo) grupo tratado com creme contendo 0,1% de dexametasona. Foram portanto,

9 grupos de 6 animais para cada experimento.

4.11.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo da R. ferruginea e do AMB

incorporados em creme convencional e nanoemulsão

A avaliação com o creme convencional contendo o extrato e o AMB, foi

realizada previamente ao desenvolvimento da nanoemulsão, com o objetivo de definir

a concentração do extrato para incorporação na nanoemulsão, conforme item 4.5.3.

Os cremes e as nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea e o composto isolado

AMB foram avaliados quanto a ação anti-inflamatória de acordo com o método de

edema de orelha induzido pelo óleo de cróton em camundongos, descrito por Carlson

e colaboradores (1985) com algumas modificações. Foi empregado como controle

negativo a formulação sem extrato e como controle positivo creme contendo 0,1% de

dexametasona. As orelhas (esquerda e direita) tiveram suas espessuras medidas com

o auxílio de um micrômetro digital 6 h após a aplicação do óleo de cróton. Os animais

foram tratados com os cremes através da aplicação direta de 50 µL da formulação na

superfície interna do pavilhão de cada orelha direita. O óleo de cróton a 2,5% (v/v) foi

dissolvido em acetona PA e, 20 µL desta solução foi aplicado na superfície externa da

orelha direita, após 30 minutos dos respectivos tratamentos. Os animais foram

eutanasiados por decapitação para a medida das espessuras das orelhas. A medida

da espessura das orelhas foi realizada utilizando um micrômetro digital, aplicado no

centro do lóbulo de cada orelha. A diferença de espessura das orelhas esquerda e

direita foi calculada para cada tratamento para posterior análise do efeito anti -

edematogênico e os valores foram expressos em µm. Os dados obtidos foram

analisados estatisticamente usando análise de variância e o Teste de Comparação

Múltipla Newman-Keuls usando GraphPad Prism software versão 5. O nível de

significância foi p < 0.05.

84

4.11.3 Dosagem de citocinas em pele inflamada tratada com creme e

nanoemulsões contendo R. ferruginea

Nova indução do processo inflamatório foi realizada conforme descrito no item

4.11.2. Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha

pela aplicação do óleo de cróton, fragmentos com 6 mm2 de diâmetro foram coletados,

com o auxílio de um perfurador de metal, das orelhas direita de cada animal e imersos

em nitrogênio líquido e armazenados a - 80 °C. Os tecidos foram preparados seguindo

metodologia descrita por Otuki e colaboradores (2005), com algumas adaptações.

Os tecidos removidos das orelhas foram homogeneizados em tampão fosfato

salina (PBS) contendo 0,05% de Tween® 20, fluoreto de fenilmetilsulfonila 0,1 mM,

cloreto de benzometônio 0,1 mM, EDTA sódico 10 mM, e aprotinina A 2 ng/mL. Em

seguida, o homogeneizado foi centrifugado a 3.000 g por 10 minutos a 4 ºC, e o

sobrenadante armazenado a -80 ºC até o momento da análise. Os níveis teciduais

das citocinas interleucina 1β (IL-1β), quimiocina derivada de queratinócitos (KC) e

fator de necrose tumoral (TNF), foram determinados usando um kit de ensaio

imunoenzimático ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) seguindo as

recomendações do fabricante.

Resumidamente, uma placa de 96 poços foi incubada por aproximadamente 16

h com anticorpo de captura. Posteriormente, a placa passou por 3 lavagens com wash

buffer (tampão fosfato salina (PBS) contendo 0,05% de Tween® 20) e incubada por 1

h com 300 µL de tampão de bloqueio em cada poço da placa. Após 3 lavagens, 100

µL de diluições seriadas da citocina em estudo e das amostras foram adicionadas a

cada poço da placa e incubada por 2 h. Após 3 lavagens foi adicionado 100 µL de

anticorpo de detecção em cada poço, e a placa foi novamente incubada por 2 h. A

placa foi lavada por 3 vezes e foi adicionado 100 µL de streptavidina em cada poço,

seguido da incubação da placa por 20 minutos ao abrigo da luz. Após 3 lavagens foi

adicionado 100 µL de solução de substrato em cada poço seguido da incubação da

placa por 20 minutos ao abrigo da luz. Ao término deste tempo, a reação foi

interrompida com a adição de 50 µL da solução de bloqueio (H2SO4 à 2N), com

posterior leitura dos resultados em leitor de microplaca em dois comprimentos de

onda, 450 nm e 550 nm. Os resultados foram expressos como pg de citocina/mg de

tecido. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente usando análise de

variância e o Teste de Comparação Múltipla Newman-Keuls usando GraphPad Prism

software versão 5. O nível de significância foi p < 0.05.

85

4.11.4 Determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO) em pele inflamada

tratada com creme e nanoemulsões contendo R. ferruginea

Nova indução do processo inflamatório foi realizada conforme descrito no item

4.11.2. Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha

pela aplicação do óleo de cróton, fragmentos com 6 mm2 de diâmetro foram coletados,

com o auxílio de um perfurador de metal, das orelhas direita de cada animal 6 h após

a aplicação do óleo de cróton e imersos em nitrogênio líquido e armazenados a -80

°C. Os fragmentos congelados do tecido removido das orelhas foram preparados de

acordo com metodologia descrita por Otuki e colaboradores (2005), com algumas

modificações.

Inicialmente, os tecidos foram homogeneizados com tampão I pH 4,7 (contendo

0,58% de cloreto de sódio, 0,56% de EDTA, 0,3% de fosfato de sódio (NaH2PO4) e

0,28% de fosfato dissódico (Na2HPO4), na proporção de 100 mL de tampão I para

cada 5 g de pele. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos a 4

°C. O sobrenadante foi descartado e a amostra foi ressuspendida com 111 µL de

tampão I, utilizando um vortex. A cada amostra foi adicionado 333 µL de solução de

NaCl 0,2% com agitação em vortex. Após 30 segundos, foi adicionado à amostra, 333

µL de solução de glicose a 5% contendo NaCl 1,6%, como posterior agitação em

vortex. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4 °C. O

sobrenadante foi desprezado e a amostra foi ressuspendida com adição tampão II pH

5,4 (contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio, 0,78% de NaH2PO4 e

0,71% de Na2HPO4), na proporção de 100 mL de tampão II para cada 5 g de amostra.

As amostras ressuspendidas passaram por 3 ciclos de congelamento em nitrogênio

líquido e descongelamento em banho-maria a 37 °C, sendo posteriormente

centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4 °C.

Duplicatas de 25 µL de amostra do sobrenadante resultante foram adicionadas

a uma placa com 96 poços, seguido de uma duplicata do branco (solução de NaPO4

0,08 M). A reação teve início com a adição de 25 µL de solução a 3,8 mg/mL de

brometo de hexadeciltrimetilamônio em dimetilsufóxido (DMSO) em todos os poços

ao abrigo da luz, com incubação a 37 °C por 5 minutos. Posteriormente foi adicionado

100 µL de peróxido de hidrogênio diluído em NaPO4 0,08 M, em todos poços com

incubação da placa a 37 °C por 5 minutos. A atividade enzimática foi determinada

colorimetricamente usando leitor de microplaca em 650 nm. Os resultados foram

86

expressos em densidade óptica/mg de tecido. Os dados obtidos foram analisados

estatisticamente usando análise de variância e o Teste de Comparação Múltipla

Newman-Keuls usando GraphPad Prism software versão 5. O nível de significância

foi p < 0.05.

4.11.5 Análise histológica em pele inflamada tratada com creme e nanoemulsões

contendo R. ferruginea

Após os respectivos tratamentos e 6 h após a indução do edema de orelha pela

aplicação do óleo de cróton, descrito no item 4.11.2, foram coletados fragmentos de 6

mm2 das orelhas direitas, seccionados longitudinalmente e mantidos em

paraformaldeído 4% (PFA) por 24 h. O processamento dos tecidos foi realizado

através da desidratação por passagens sucessivas em etanol de concentrações

crescentes (etanol 70%, etanol 80%, etanol 90% e, finalmente, etanol absoluto) e em

seguida dois banhos de xilol por 30 minutos, com a finalidade de tornar os tecidos

translúcidos (etapa de clareamento ou diafanização). Quando os tecidos tornaram-se

translúcidos, foram colocados na parafina, na qual passaram por três banhos de 1 h

até o processo de inclusão (montagem do bloco e posicionamento do tecido).

Foram realizados cortes com espessura de 4 µm em micrótomo disponibilizado

pelo LAFEX (Laboratório de Farmacologia Experimental – UFSC), e posteriormente

foram corados em coloração de hematoxilina e eosina (HE) para avaliação dos sinais

de inflamação, como por exemplo infiltrado celular e edema (espessura dérmica). Um

corte foi selecionado como representativo para análise qualitativa da resposta

inflamatória mediada por células. Para este experimento foi incluído um naive para

comparação com os demais grupos do experimento.

87

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Material vegetal

A coleta das cascas de R. ferruginea foi realizada em árvores com 35 cm de

diâmetro e na porção inferior do tronco, a 20 cm do solo, baseado nos resultados

encontrados para o teor de marcadores nas soluções extrativas (item 5.2).

As cascas coletadas foram analisadas quanto ao teor de cinzas totais e

insolúveis em ácido e quanto à perda por dessecação, como segue.

5.1.1 Determinação de cinzas totais e cinzas insolúveis em ácido

A determinação do teor de cinzas totais permite a verificação de impurezas

inorgânicas não-voláteis que podem estar presentes, como contaminantes (FARIAS,

2004). As cinzas insolúveis em ácido compreendem o resíduo obtido das cinzas totais

com ácido clorídrico diluído após filtragem, lavagem e incineração. O método destina-

se à determinação de sílica e constituintes silícicos da droga.

As cascas coletadas apresentaram teor de cinzas de 7,25% ± 0,12 para cinzas

totais e de 1,78% ± 0,11 para cinzas insolúveis em ácido. Em estudo realizado por

Baccarin e colaboradores (2014), o valor de cinzas totais encontrado foi de 7,95% e

para cinzas insolúveis em ácido foi de 0,51%. Comparando os resultados obtidos na

análise realizada neste estudo com os dados já descritos, o valor para cinzas totais

ficou próximo do encontrado anteriormente e o valor para cinzas insolúveis em ácido

ficou acima do encontrado anteriormente. Porém como não existe monografia

específica na literatura para as cascas da R. ferruginea, esses dados são importantes

para, juntamente com a realização de mais determinações, estabelecer os parâmetros

de qualidade para a droga vegetal.

5.1.2 Perda por dessecação

A perda por dessecação das cascas de R. ferruginea foi de 8,2% ± 0,17%, em

trabalho anterior realizado por Baccarin e colaboradores (2014), a perda por

dessecação foi de 7,82% ± 0,40. Os dois resultados se mostram próximos e a

inexistência de monografia que estabeleça os parâmetros de qualidade para as

88

cascas da R. ferruginea, coloca o resultado dentro das variações farmacopéicas, de

8-14% (FARIAS, 2004).

5.2 Obtenção e Caracterização dos derivados vegetais das cascas de R.

ferruginea

Na obtenção da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, nomeado neste

estudo como abril/2013, foi usado o material vegetal coletado em Blumenau (SC) em

outubro de 2009, o qual estava armazenado em embalagens lacradas ao abrigo da

luz em sala climatizada, sem referência ao diâmetro da árvore em que foi realizada a

coleta. Na quantificação por CLAE do teor de AMB na solução extrativa obtida (7,93

mg/g) foi obtido um teor menor do que o obtido no estudo de Baccarin e colaboradores

(2014), 70 mg/g, no qual foram usadas cascas de árvore com diâmetro de 20-25 cm.

A partir deste resultado, foi realizado um estudo para verificação da variação

do teor de marcadores em diferentes diâmetros da árvore da R. ferruginea (15, 21, 25,

35, 38, 59 cm) e também em diferentes condições da árvore como diâmetro com 38

cm na região de calo, em uma árvore caída e em uma árvore morta. Conforme

apresentado na Tabela 1, os resultados demonstraram que o maior teor de marcador

encontrado foi na casca coletada da árvore com 35 cm de diâmetro de tronco (78,28

mg/g), cujo valor foi semelhante ao obtido por Baccarin et al. (2014)..

Portanto, foram coletadas cascas da parte mais superior do tronco, onde se

inicia a formação de galhos, de uma árvore com diâmetro de 35 cm. O resultado

encontrado para o teor de AMB foi muito baixo novamente (0,79 mg/g), motivando a

realização de pesquisa da variação do teor de AMB na casca da árvore com 35 cm de

diâmetro com coleta em 3 regiões diferentes do tronco: próxima ao solo (20 cm),

superior (próxima dos galhos) e região intermediária entre estas duas. Os resultados

encontrados demonstraram que a região mais próxima ao solo possui maior teor de

AMB e AMA (21,21 e 22,41 mg/g, respectivamente). Esta foi então a região

especificada para a coleta das cascas: árvore com tronco de 35 cm de diâmetro e

altura entre 20 e 100 cm do solo.

Os resultados das análises foram comparados ao resultado encontrado por

Baccarin e colaboradores (2014). Inicialmente, foi considerado somente o teor de

AMB, pois de acordo com estudo anterior, este era o marcador majoritário nas cascas

de R. ferruginea (TURMINA, 2005). No entanto, com os resultados obtidos no presente

89

estudo, observou-se que a concentração de AMA se assemelha a do AMB nas cascas

da R. ferruginea e, conforme revisão bibliográfica, o AMA apresenta igualmente efeito

anti-inflamatório (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; MIZUSHINA et al., 2000),

assim sendo, foram considerados como marcadores para este estudo o AMA e o AMB.

A média dos resultados encontrados para o teor de marcadores AMB e AMA

em todas as soluções extrativas preparadas encontram-se na Tabela 1. Em algumas

amostras de cascas analisadas, foi encontrada maior concentração do marcador AMA

do que do AMB.

Tabela 1 - Teor de marcadores AMA e AMB nas soluções extrativas das cascas de R. ferruginea.

Droga vegetal Teor* AMA

(mg/g)

Teor* AMB

(mg/g)

Resíduo Seco

(%)

Abril/2013 12,00 ± 0,05 7,93 ± 0,14 0,791 ± 0,008

15 cm 12,11 ± 0,07 8,09 ± 0,08 0,356 ± 0,362

21 cm 7,97 ± 0,26 6,75 ± 0,06 0,407 ± 0,003

25 cm 48,22 ± 0,87 48,03 ± 0,24 0,580 ± 0,014

35 cm 44,53 ± 0,56 78,28 ± 0,38 0,560 ± 0,040

38 cm 20,65 ± 0,17 12,51 ± 0,06 1,110 ± 0,021

38 cm – calo 261,27 ± 1,78 153,68 ± 0,28 1,110 ± 0,092

59 cm 39,05 ± 0,27 23,91 ± 0,10 1,320 ± 0,030

Árvore Caída 9,06 ± 0,10 19,57 ± 0,08 0,156 ± 0,014

Árvore Morta 11,74 ± 0,27 13,54 ± 0,03 0,115 ± 0,007

35 cm – Próximo dos

galhos 0,21 ± 0,03 0,79 ± 0,01 0,900 ± 0,021

35 cm – Parte Superior 3,35 ± 0,09 4,46 ± 0,01 0,575 ± 0,018

35 cm – Parte

Intermediária 11,64 ± 0,05 15,18 ± 0,13 0,520 ± 0,014

35 cm – Parte Inferior 20

cm do solo 22,41 ± 0,10 21,21 ± 0,16 0,753 ± 0,005

*Teor de marcadores expressos em mg/g de resíduo seco.

De acordo com estes achados, há grande variabilidade no teor de marcadores

AMA e AMB nas cascas da R. ferruginea. Esta variabilidade aparenta estar

relacionada à idade da planta (diâmetro do tronco) e da região do tronco. Isso traz

embasamento para estudos mais aprofundados a respeito da padronização na coleta

das cascas de R. ferruginea. Os resultados encontrados neste trabalho abrem

90

caminho para novas investigações para padronização da região de coleta das cascas

de R. ferruginea com o objetivo de extração de maior concentração de marcadores.

A partir dos resultados obtidos (Tabela 1), a solução extrativa foi preparada

usando 475 g de cascas pulverizadas da R. ferruginea coletadas da árvore com 35

cm de diâmetro e da região próxima ao solo (20 cm de altura). O rendimento da

solução após filtração foi de 75,78% (V/V). O processo de maceração dinâmica com

possível evaporação do líquido extrator e os processos de fi ltração (tecido e papel)

podem ter influenciado na redução do rendimento da solução extrativa.

Após concentração da solução extrativa em estufa de ar circulante, obteve-se

o extrato mole com um rendimento de 6,60% (p/p), em relação a droga vegetal seca.

Os derivados vegetais obtidos foram analisados quanto aos aspectos

organolépticos como cor e odor, pH, resíduo seco, perfil qualitativo em CCD e teor

dos marcadores AMA e AMB por CLAE. Os resultados obtidos são apresentados na

Tabela 2 e Figura 8.

Tabela 2 - Resultados das análises realizadas nos derivados vegetais das cascas da R. ferruginea.

Derivado Aspectos

organolépticos pH

Resíduo

Seco

(%)

Teor AMA*

(mg/g)

Teor AMB*

(mg/g)

Solução

Extrativa

Avermelhado,

odor alcoólico

5,83 ±

0,03 0,48 ± 0,02

42,14 ±

0,04

36,88 ±

0,06

Extrato Mole Vinho escuro,

odor adocicado

4,21 ±

0,01 51,17 ± 0,53

40,06 ±

0,02

37,34 ±

0,09

*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido.

Os resultados demonstram a presença dos ácidos mirsinoicos nos derivados

obtidos a partir das cascas da R. ferruginea, com redução do pH no extrato mole,

devido a concentração do mesmo e a presença dos ácidos mirsinoicos. O processo

de concentração praticamente não provocou alteração no teor de marcadores

analisados, demonstrando a estabilidade do extrato frente à temperatura.

91

Figura 8 - Perfil cromatográfico da solução extrativa e do extrato mole

das cascas de R. ferruginea por CCD.

Nota: AMA - padrão ácido mirsinoico A; AMB -padrão ácido mirsinoico B -; sistema

eluente: hexano:acetato de etila (1:1); revelador anisaldeído sulfúrico.

Nos estudos realizados por Baccarin e colaboradores (2014), os extratos das

cascas de R. ferruginea foram quantificados usando somente o AMB como marcador,

e este apresentava maior área do que o pico correspondente ao AMA, o que foi

deduzido como tendo o extrato maior concentração de AMB do que AMA. No presente

trabalho, além do AMB, usou-se também o AMA como marcador (Figura 9). Conforme

apresentado no cromatograma da solução extrativa (Figura 10), embora a área do

pico correspondente ao AMA seja menor do que a do AMB, a concentração deste é

maior. Esta diferença provavelmente está relacionada com a absortividade desta

substância no comprimento de onda usado na análise.

O ácido mirsinoico A foi detectado com tempo de retenção de 16,22 minutos

(Figura 9a), confirmando sua presença na solução extrativa e no extrato mole das

cascas de R. ferruginea no pico 3 (Figura 10 e Figura 11), bem como a do ácido

mirsinoico B, detectado com tempo de retenção de 15,79 minutos (Figura 9b),

correspondendo ao pico 1 (Figura 10 e Figura 11).

92

Figura 9 - Perfis cromatográficos por CLAE dos padrões de ácidos mirsinoicos A (a) e B (b); 260 nm

para o AMA e 270 nm para o AMB.

Figura 10 - Perfil cromatográfico por CLAE da solução extrativa das cascas de R. ferruginea.

Pureza: 76,2%

Pureza: 98,9%

93

Para o extrato mole obteve-se a concentração dos marcadores AMA e AMB,

igualmente a partir da determinação do tempo de retenção e do cálculo das áreas dos

picos para os marcadores, conforme Tabela 2. O perfil cromatográfico do extrato mole

está representado na Figura 11.

Figura 11 - Perfil cromatográfico por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea.

5.3 Estudos de pré-formulação

5.3.1 Determinação da solubilidade do extrato

Uma seleção adequada dos óleos e tensoativos e as suas concentrações

ótimas é de extrema importância para se obter nanoemulsões estáveis e clinicamente

aceitáveis. O teste de solubilidade do ativo em óleo é tido como um critério de seleção

do melhor óleo. A solubilidade do extrato no óleo influencia na manutenção do extrato

na forma de solução na fase interna da nanoemulsão (AZEEM et al., 2009). Para a

determinação da solubilidade do extrato mole da casca da R. ferruginea em óleo foram

selecionados 4 tipos de óleos. A seleção foi baseada na biocompatibilidade, não

toxicidade e aceitação clínica dos componentes para uso tópico. Os óleos

selecionados estão descritos abaixo:

- Triglicérides de ácido cáprico e caprílico (TCC), que são triglicerídes de cadeia

média, constituídos principalmente por ésteres de ácidos caprílicos e cápricos

derivados do óleo de coco. O que influenciou sua escolha foi a sua alta

compatibilidade com a pele, sendo bastante permeável e considerado

94

toxicologicamente e dermatologicamente inócuo e é classificado como GRAS

(Generally Recognized As Safe) pelo FDA (EMBRAFARMA).

- Miristato de isopropila, é um éster de origem sintética, obtido a partir da reação

de esterificação do ácido mirístico com o álcool isopropílico. Com baixo ponto

de turvação, é muito usado na formulação de cosméticos, tem excelente

emoliência e é um ótimo diluente para óleos vegetais.

- Capryol® 90 (monocaprilato de propilenoglicol), tensoativo água/óleo (EHL= 6),

solubilizante. Usado em muitos trabalhos como fase oleosa em nanoemulsões.

- Cetiol® V (oleato de isodecila), éter emoliente com baixo espalhamento, no

entanto, possui composição semelhante aos lipídios da pele.

- Cetiol® 868 (estearato de octila), éster emoliente com excelente espalhamento,

lubricidade e sobre-engorduramento para a pele. Dá sensação de emoliência

sem toque de oleosidade.

O teste de solubilidade foi realizado em duplicata para cada tipo de óleo

selecionado. Após 24 h do teste, as amostras apresentaram diferenças visuais

características (Figura 12). Os tubos contendo os óleos Capryol® (amostras 5 e 6),

miristato de isopropila (amostras 3 e 4) e triglicérides cáprico e caprílico (amostras 1

e 2) apresentaram coloração avermelhada homogênea, cor esta característica do

extrato mole, demonstrando que o mesmo dispersou nestes óleos. Para confirmar

esta informação, as amostras foram analisadas quanto a porcentagem de

transmitância e absorbância em espectrofotômetro UV/Visível. Inicialmente foi

encontrado o comprimento de onda de maior absorbância da amostra por meio da

varredura nos comprimentos de onda entre 190 nm e 800 nm. A transmitância e a

absorbância foram analisadas no comprimento de onda selecionado para cada

amostra, desconsiderando a absorbância do óleo puro. Os resultados para

transmitância e absorbância das amostras são apresentados na Tabela 3.

95

Figura 12 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea em diferentes óleos: (1) e (2) Poly: triglicérides de ácido cáprico e caprílico (TCC); (3) e (4) MI: miristato

isopropila; (5) e (6) Cap 90: Capryol 90; (7) e (8) CeV: Cetiol V; (9) e (10) Ce868: Cetiol 868.

Tabela 3 - Valores de transmitância e absorbância da mistura de óleo e extrato mole de R. ferruginea

no teste de solubilidade.

Amostra Comprimento de

Onda (nm) Absorbância Transmitância (T%)

Poly (1) 320,5 0,590 25,6

Poly (2) 320,5 0,757 17,5

MI (3) 320,5 0,667 21,7

MI (4) 320,5 0,807 15,6

Cap 90 (5) 320,5 0,877 13,3

Cap 90 (6) 320,5 0,978 10,5

Ce V (7) 356,5 0,261 55,1

Ce V (8) 356,5 0,127 74,3

Ce 868 (9) 320,5 0,246 56,5

Ce 868 (10) 320,5 0,039 91,6

Nota: Poly 1 e 2: extrato mole + triglicérides do ácido cáprico e caprílico; MI 3 e 4: extrato mole + miristato de isopropila; Cap 90 5 e 6: extrato mole + Capryol 90®; Ce V 7 e 8: extrato mole + Cetiol V®; Ce 868 9 e 10: extrato + Cetiol 868®.

Analisando os resultados para a transmitância e absorbância, foi observado

que os menores valores de transmitância e os maiores valores de absorbância foram

para as amostras que se apresentaram visualmente com coloração avermelhada

homogênea, ou seja, as amostras 1, 2, 3, 4, 5 e 6, onde a luz teve menor penetração

e maior absorção devido a coloração, indicando melhor dispersão do extrato.

Confirmando que os óleos triglicérides de ácido cáprico e caprílico, miristato de

96

isopropila e Capryol® 90 dispersaram melhor o extrato mole da R. ferruginea. As

amostras 5 e 6 contendo o Capryol® 90 apresentaram a menor transmitância e a maior

absorbância entre todas as amostras, isto provavelmente se deve a sua função

tensoativa, com valor baixo de EHL, o que confirma o seu maior poder de dissolução

do extrato. Com isso, este composto foi testado como tensoativo para a análise

seguinte de solubilidade. Seguindo estas considerações, os óleos selecionados foram

os triglicérides de ácido cáprico e caprílico e o miristato de isopropila.

A segunda etapa dos testes de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea foi

realizada com a mistura de cada um dos dois óleos escolhidos com diferentes

tensoativos na proporção de 1:2. A seleção dos tensoativos foi feita baseada em

revisão bibliográfica e em estudos anteriores sobre o desenvolvimento de

nanoemulsões, levando em conta a biocompatibilidade e não-toxicidade. Baseado

nestes critérios foram selecionados 7 tensoativos, sendo 6 não-iônicos devido a

capacidade desta classe de tensoativos sofrerem menor influência do pH e alterações

na força iônica (AZEEM et al., 2009). Desta forma, foram usados 7 tensoativos

diferentes para cada óleo selecionado, realizando-se o teste em duplicata para cada

uma das misturas. Os tensoativos escolhidos foram: Labrafil® M 1944 CS, Labrasol®,

Alkest® CSO 400, Tween® 80, Span® 80, Tween® 20, Capryol® 90. Após 24 h de teste,

observou-se que a temperatura de 25 °C não foi adequada para a realização da

análise com os tensoativos Alkest® CSO 400, Tween® 80, Tween® 20, e Span® 80,

devido a consistência muito viscosa dos mesmos não permitir a adequada

homogeneização das amostras. Assim o teste foi realizado por mais 24 h a uma

temperatura de 30 °C para as amostras que empregavam estes tensoativos.

As misturas na proporção de 1:2, em duplicata, foram identificadas usando

números da seguinte forma: (1) e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo +

Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo

+ Span® 80; (11) e (12) óleo + Tween® 20 e (13) e (14) óleo + Capryol® 90.

A análise visual das amostras após o teste demonstrou que as misturas de

miristato de isopropila (MI) com os tensoativos, amostras 6, 7, 8, 13 e 14 apresentaram

coloração mais avermelhada e homogênea, evidenciando que o extrato ficou melhor

disperso nestas misturas (Figura 13). A diferença de coloração entre as amostras 5 e

6, e 13 e 14 pode estar relacionada com a ineficiência da agitação durante o teste nas

amostras 5 e 13 por causa da aderência do extrato à barra magnética e o vidro do

frasco, dificultando a agitação.

97

Figura 13 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea com óleo

miristato de isopropila com diferentes tensoativos: (1) e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4) óleo +

Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span® 80; (11)

e (12) óleo + Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90.

Já no teste realizado com triglicérides de ácido cáprico e caprílico, as amostras

7, 8, 13 e 14 apresentaram, visualmente, maior dispersão do extrato, quando o óleo

foi misturado ao Tween® 80 (amostras 7 e 8) e ao Capryol® 90 (amostras 13 e 14),

conforme mostrado na Figura 14.

Figura 14 - Aspecto das misturas no teste de solubilidade do extrato mole de R. ferruginea com o óleo triglicérides cáprico caprílico com diferentes tensoativos: (1) e (2) óleo + Labrafil® M 1944 CS; (3) e (4)

óleo + Labrasol®; (5) e (6) óleo + Alkest® CSO 400; (7) e (8) óleo + Tween® 80; (9) e (10) óleo + Span®

80; (11) e (12) óleo + Tween® 20; (13) e (14) óleo + Capryol® 90.

Para confirmar os resultados encontrados na análise visual das amostras, as

mesmas tiveram a transmitância e absorbância medidas por espectrofotometria. Os

resultados encontrados são apresentados nas Tabelas 4 e 5 e, confirmaram os

resultados da análise visual. Os valores de absorbância para as misturas com miristato

de isopropila em ordem decrescente foi Capryol® 90 > Tween® 80 > Alkest® CSO 400

> Labrafil® M 1944 CS > Tween® 20 > Labrasol® > Span® 80.

98

Tabela 4 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de solubilidade do extrato

mole de R. ferruginea em miristato de isopropila e diferentes tensoativos.



MI1 Fil2 (1) 350 2,039 0,9

MI1 Fil2 (2) 350 1,665 2,2

MI1 Sol3 (3) 350 0,592 25,6

MI1 Sol3 (4) 350 0,536 29,2

MI1 Alk4 (5) 350 1,699 2,4

MI1 Alk4 (6) 350 2,408 0,8

MI1 Tw805 (7) 395,5 2,635 0,5

MI1 Tw805 (8) 395,5 2,150 0,7

MI1 Sp806 (9) 671 - 286 193,6

MI1 Sp806 (10) 671 - 324 211,4

MI1 Tw207 (11) 369 1,317 4,8

MI1 Tw207 (12) 369 1,521 3,1

MI1 Cap908 (13) 350 1,702 2

MI1 Cap908 (14) 350 4,000 0

Nota: 1Miristato de isopropila; 2Labrafil® M 1944 CS; 3Labrasol®; 4Alkest® CSO 400; 5Tween® 80; 6Span®

80; 7Tween® 20; 8Capryol® 90.

99

Tabela 5 - Resultados da análise de transmitância das amostras do teste de solubilidade do extrato

mole de R. ferruginea em triglicérides de ácido cáprico e caprílico e diferentes tensoativos.



Poly1 Fil2 (1) 350 0,813 15,6

Poly1 Fil2 (2) 350 0,726 18,7

Poly1 Sol3 (3) 350 0,416 38,4

Poly1 Sol3 (4) 350 0,547 28,4

Poly1 Alk4 (5) 350 1,473 3,4

Poly1 Alk4 (6) 350 1,355 4,9

Poly1 Tw805 (7) 384,5 1,597 2,5

Poly1 Tw805 (8) 384,5 1,601 3,0

Poly1 Sp806 (9) 395,2 - 208 161,3

Poly1 Sp806 (10) 395,2 - 0,099 125,7

Poly1 Tw207 (11) 369 1,147 7,1

Poly1 Tw207 (12) 369 1,171 6,7

Poly1 Cap908 (13) 350 4,000 0

Poly1 Cap908 (14) 350 4,000 0

Nota: 1Triglicérides de ácido cáprico e caprílico; 2Labrafil® M 1944 CS; 3Labrasol®; 4Alkest® CSO 400; 5Tween® 80; 6Span® 80; 7Tween® 20; 8Capryol® 90.

Avaliando os resultados encontrados, foi selecionado como óleo o miristato de

isopropila e os tensoativos Capryol® 90, Tween® 80 e Alkest® CSO 400 para o

desenvolvimento das nanoemulsões.

5.3.2 Determinação do coeficiente de partição do extrato mole

O coeficiente de partição (log de P) de uma substância em n-octanol/água é um

parâmetro matemático que prediz o transporte desta substância através das

membranas biológicas, uma delas a sua penetração percutânea, descrevendo a

distribuição de uma substância entre a fase aquosa, o veículo, e a fase lipídica, o

estrato córneo (GOMBAR; ENSLEIN, 1996; KORINTH et al., 2012). O octanol simula

de modo simplificado a barreira lipídica do estrato córneo auxiliando na predição da

penetração de substâncias químicas na pele, sendo a permeabilidade dessas

substâncias diretamente proporcional aos seus coeficientes de partição (KORINTH et

al., 2012).

O coeficiente de partição n-octanol/água para o extrato mole de R. ferruginea

foi realizado através da adição de uma solução aquosa contendo o extrato ao octanol

100

saturado pela água. A análise dos marcadores AMA e AMB em CLAE das fases

aquosas do teste de partição não detectou a presença dos mesmos, o que indica que

a partição é de 100% dos marcadores para o octanol, ou seja, estes compostos

migram da fase aquosa para a fase lipídica simulada.

Em ensaio de determinação do coeficiente de partição para os marcadores

AMA e AMB usando o método de CLAE de fase reversa, Zermiani (2014) encontrou o

log de P de 3,30 e 3,21, respectivamente. Estes valores indicam que os marcadores

AMA e AMB do extrato das cascas de R. ferruginea possuem alta lipofilicidade,

sugerindo que quando aplicados na pele irão migrar do veículo aquoso para o estrato

córneo, aumentando a penetração percutânea dos mesmos (KORINTH et al., 2012).

5.4 Desenvolvimento das nanoemulsões

5.4.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário

Sabe-se que a mistura de tensoativos tem uma eficiência melhor na formação

de nanoemulsões, do que o uso de tensoativos puros, dispersando-se e dissolvendo-

se mais rapidamente dentro da fase contínua (PENG et al., 2010). A otimização dos

sistemas, neste estudo, foi realizada usando o diagrama de fases pseudoternário

obtido pelos métodos de titulação e ponto a ponto e com três diferentes misturas de

tensoativos considerando o valor de EHL do miristato de isopropila (EHL 11,50), fase

oleosa: Capryol® 90 (EHL= 6) + Alkest® CSO 400 (EHL= 13); Capryol® 90 (EHL= 6)

+ Tween® 80 (EHL= 15) e Alkest® CSO 400 (EHL= 13) + Span® 80 (EHL= 4,3),

conforme apresentado no Quadro 2.

O diagrama de fase pseudoternário é um triângulo equilátero em que se

representa a mistura de 4 componentes (óleo, água e a mistura de tensoativos) onde

os vértices deste triângulo representam os componentes puros. Podem ser

construídos a partir de dados obtidos por titulação ou ponto a ponto de diferentes

composições de amostras, sendo uma ferramenta ideal para caracterizar regiões que

apresentam o aspecto desejável para a incorporação da substância ativa

(DAMASCENO et al., 2011).

Os diagramas pseudoternários formados pelo método ponto a ponto para a

combinação dos tensoativos Capryol® 90:Alkest® CSO 400 (1,5:5,5), apresentaram

visualmente a formação de maior número de diferentes sistemas, os quais não foram

observados no diagrama formado pelo método da titulação (Figura 15).

101

Figura 15 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato

de isopropila, Capryol 90 e Alkest CSO 400, usando métodos diferentes: titulação e ponto a ponto.

Nota: FT: fluido transparente; FL: fluido translúcido; FB: fluido branco; GT: gelificado transparente; GU:

gelificado turvo; GL: gelificado translúcido; GR: gelificado com ressonância; EG: emulsão gelificada; SF: separação de fases.

No método da titulação, a adição de água nos sistemas fluidos transparentes

(FT) contendo concentrações semelhantes de óleo e tensoativo resultou na turvação

destes, ou seja, a formação de sistemas fluidos translúcidos (FL). Com a contínua

adição de água, houve a formação de sistemas fluidos brancos, quando a

concentração de tensoativo foi menor que a do óleo. Na região com concentrações

semelhantes dos três componentes, houve a formação de sistemas gelificados

viscosos. Este aspecto foi alterado para visualmente emulsionado quando a

concentração de óleo foi maior que a de tensoativos. Este resultado evidencia que no

método da titulação ocorrem alterações físicas e físico-químicas dos sistemas

promovidas pela diluição dos sistemas formados com a adição de água, enquanto no

método da ponto a ponto há a formação clara e bem distinta dos sistemas.

Comparando os dois diagramas para a combinação dos tensoativos Capryol®

90:Alkest® CSO 400, a maior diferença é encontrada na região central do diagrama

cujas condições resultaram em sistemas fluidos ou gelificados. No diagrama obtido

por titulação foi observado maior área com formulações com aspecto de fluídos

translúcidos enquanto pelo método direto, as mesmas proporções dos componentes

resultaram em sistemas gelificados. Tais resultados apontam que a diluição dos

sistemas fluidos com água pode levar a diluição da fase aquosa externa, sem

promover alteração ou reestruturação do sistema, comportamento este comum às

nanoemulsões (ANTON; VANDAMME, 2011). Sistemas com características de

102

cristais líquidos (GR) com maior grau de organização foram obtidos somente pelo

método ponto a ponto.

O tamanho da fase interna dos sistemas preparados pelo método direto usando

os tensoativos Capryol® 90 e Alkest® CSO 400, foi de 9,33 ± 0,41 nm e 16,23 ± 0,66

nm para os sistemas fluidos transparentes com concentração de tensoativo maior que

50%. O aumento de água na formulação resultou em sistemas com aspecto gelificado

e turvo, com tamanho entre 13,25 ± 0,35 nm e 20,30 ± 0,72 nm. Os sistemas

gelificados com ressonância (GR), provavelmente com formação de cristais líquidos,

foram obtidos na região do diagrama com concentração semelhante dos três

componentes e/ou proporção de água levemente inferior aos demais. Tais sistemas

apresentaram tamanho entre 24,28 ± 1,02 nm e 100,24 ± 11,38 nm. Sistemas

gelificados translúcidos com tamanho entre 17,03 ± 5,71 nm e 80,50 ± 1,42 nm foram

formados com o aumento progressivo da água, nas regiões com proporções

semelhantes de tensoativo e água. Não foi observada uma relação direta entre o

tamanho da fase interna e o aspecto físico observado.

Os sistemas contendo mais de 50% de água e cerca de 20% de tensoativo

apresentaram aspecto fluido transparente e translúcido no diagrama por ponto a

ponto, com tamanho de gotículas entre 8,01 ± 0,39 nm e 26,76 ± 20,34 nm. Com o

aumento da proporção de água, os sistemas apresentaram aspecto branco e maior

tamanho (entre 20,86 ± 5,77 nm e 62,19 ± 19,72 nm). O aumento da concentração de

água, com tensoativos inferior a 20% e óleo entre 0 e 50%, resultou em sistemas

fluidos translúcidos ou branco, sendo que o aumento da concentração de óleo levou

a formação de sistemas com maior tamanho (entre 57,21 ± 27,94 nm e 205,9 ± 61,98

nm) e branco, característicos de emulsões.

Com o uso da mistura de Alkest® CSO 400 e Span® 80 foi obtida uma maior

área do diagrama com formulações com aspecto gelificado (Figura 16) quando

comparado ao uso do Capryol® como tensoativo lipofílico. Empregando o método da

titulação, a formação de sistemas com aspecto fluido translúcido ocorreu conforme se

foi procedendo a diluição do sistema fluido transparente, reduzindo a concentração de

tensoativo e aumentando a proporção de óleo, elevando a turbidez do sistema. Nestas

mesmas proporções, pelo método ponto a ponto, foi observada a definição de uma

maior área gelificada translúcida.

No método de titulação, o sistema formado sofreu diluição pela adição da água,

transformando a emulsão gelificada (EG) em fluido branco (FB), e este em sistemas

103

de fases separadas com a continuidade da adição de água. Já, o sistema gelificado

turvo (GT), com a diluição, passou a gelificado transparente (GT) e, posteriormente

fluido transparente (FT) e fluido translúcido (FL). Esta interferência da diluição do

sistema com o acréscimo de água não se observa quando o método utilizado para o

preparo do diagrama é o do ponto a ponto, proporcionado a obtenção de sistemas

bem definidos.

Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato de isopropila, Alkest CSO 400 e Span 80, usando métodos diferentes: titulação e ponto a ponto.

Nota: FU: fluído turvo; FT: fluído transparente; FL: fluído translúcido; FB: fluído branco; GT: gelificado transparente; GU: gelificado turvo; GL: gelificado translúcido; GR: gelificado com ressonância; EG: emulsão gelificada; SF: separação de fases.

A análise de tamanho das gotículas dos sistemas obtidos com a combinação

de Alkest® CSO400 e Span® 80 revelou que os sistemas formados com a

concentração de tensoativo maior que 50% e baixa concentração de óleo e água, com

aspecto fluido transparente e translúcido, apresentaram tamanho entre 6,13 ± 0,47

nm e 14,92 ± 2,04 nm. Este tamanho de gotículas aumentou quando a concentração

de tensoativo foi reduzida, ficando entre 18,2 ± 3,53 nm e 62,97 ± 29,02 nm. A

formação de uma maior região com sistemas de aspecto gelificado, quando a

concentração de água foi aumentada, com concentrações cada vez menores de óleo

e tensoativo, resultou em tamanhos de gotículas entre 6,54 ± 0,26 nm e 100,5 ± 2,15

nm, tendendo ao aumento do tamanho com o aumento da concentração de óleo.

Novas regiões com sistemas fluidos translúcidos e transparentes e uma região

fluida com aspecto turvo foram identificadas com a concentração de tensoativos na

faixa de 25% a 40%, com concentrações elevadas de água e óleo, apresentando

tamanho das gotículas entre 4,85 ± 1,34 nm e 16 ± 5,34 nm. Os fluidos brancos

104

formaram-se com as concentrações mais altas de óleo juntamente com a mistura de

tensoativos e cerca de 50% de fase aquosa, com tamanho de gotícula entre 7,3 ± 2,14

nm e 73,49 ± 25,11 nm.

Nos diagramas de fase obtidos usando a combinação miristato de isopropila e

Capryol® 90:Tween® 80 (Figura 17), a proporção entre os tensoativos (3,5:5,5) não foi

adequada para a emulsificação do óleo. Conforme observado no diagrama, houve

formação de grandes regiões com separação de fases em ambos os métodos de

preparo empregados. Este comportamento pode estar relacionado com o baixo EHL

do Capryol® 90. Alguns trabalhos relatam o uso do Capryol® 90 como fase oleosa no

desenvolvimento de nanoemulsões, assim como a avaliação da sua eficiência com

várias combinações de tensoativos não iônicos (SHAKEEL et al., 2013). A

desestabilização dos sistemas foi observada principalmente nas regiões com maior

concentração de óleo, mas também nas regiões com maior proporção de tensoativos

e quantidades semelhantes de água e óleo.

A formação de fluidos transparentes foi observada na região diagrama em que

a concentração de tensoativo era maior que de óleo. Nestas proporções houve a

emulsificação do óleo devido à molhabilidade do mesmo pela água através da ação

tensoativa.

Comparando-se os sistemas formados entre os dois métodos usados, observa-

se que no método da titulação houve formação de maior número de diferentes

sistemas, demonstrando menor estabilização. Já no método ponto a ponto, os

sistemas formados apresentaram regiões melhor definidas. Este comportamento está

relacionado com a constante diluição dos sistemas pela adição diária e contínua de

água no método da titulação, com consequente transformação dos sistemas ou

desestabilização dos sistemas formados.

105

Figura 17 - Diagrama de fases pseudoternários obtidos na otimização das nanoemulsões de miristato

de isopropila, Capryol 90 e Tween 80, usando métodos diferentes: titulação e ponto a ponto.

Nota: FU: fluido turvo; FT: fluido transparente; FL: fluido translúcido; FB: fluido branco; GU: gelificado turvo; EG: emulsão gelificada; SF: separação de fases.

Na avaliação da distribuição de tamanho das gotículas nos sistemas formados

pelo método ponto a ponto, observou-se que os sistemas com concentração da

mistura de tensoativo acima de 70% e água menor que 30% da composição total,

apresentaram tamanho das gotículas entre 12,42 ± 1,09 nm e 30,64 ± 2,90 nm, ou

seja, tamanhos em escala nanométrica, com aspectos fluídos transparentes ou turvos,

sem a formação de um sistema emulsionado. Provavelmente houve apenas a

formação de micelas de tensoativo. Nas composições com concentração de

tensoativos entre 55% e 70%, com a quantidade de óleo igual ou maior que a de água,

o tamanho das gotículas aumentou, ficando entre 99,29 ± 81,28 nm e 240,5 ± 77,10

nm, com aspecto fluido turvo ou transparente. Estas diferenças de tamanho

demonstram a influência da concentração de tensoativo.

Com a redução progressiva da concentração da mistura de tensoativos houve

uma redução do tamanho das gotículas dos sistemas. Os sistemas com aspecto

gelificado turvo apresentaram tamanho de 18,2 ± 0,36 nm quando a proporção de

tensoativo e água superou a de óleo, sendo este menor que 20%. Tamanhos entre

86,90 ± 1,87 nm e 219,06 ± 2,72 nm ocorreram nas formulações com concentrações

semelhantes entre os três componentes com ligeiro aumento da proporção de água.

Sistemas com concentração de óleo e tensoativo semelhantes e baixa concentração

de água, apresentaram aspecto fluido transparente com tamanho das gotículas entre

14,36 ± 2,04 nm e 21,90 ± 15,58 nm. Com o aumento da concentração de água, os

sistemas apresentaram aumento do tamanho das gotículas tendendo a formação de

sistemas com aspecto fluido turvo a branco e tamanho entre 21,25 ± 1,47 nm e 164,75

106

± 65,27 nm. Sistemas translúcidos com tamanho entre 12,73 ± 0,76 nm e 16,92 ± 0,39

nm foram obtidos com concentração de água e tensoativos semelhantes e menor

concentração de óleo. O aumento da proporção de água em relação ao óleo, com

tensoativo entre 10% e 40%, resultou em aumento de tamanho, ficando entre 77,54 ±

51,21 nm e 197,3 ± 100,7 nm, com sistemas de aspecto turvo e tendendo ao

branqueamento.

Analisando os resultados encontrados em todos os diagramas formados

independente da combinação de componentes, percebeu-se diferenças nos sistemas

formados de acordo com o método empregado para sua formação.

Segundo Anton e Vandamme (2011) o método da titulação empregado para

construção de diagrama de fases para obtenção de nanoemulsão, pode gerar erros

de interpretação. Esta diferença pode estar relacionada com a lenta alteração e/ou

organização do sistema emulsionado quando a água é titulada em pequenos volumes.

Embora o método da titulação seja o método empregado no desenvolvimento de

nanoemulsões, em que o óleo e o tensoativo são misturados previamente e a água é

adicionada posteriormente, a adição de água continuamente em um sistema

nanoemulsionado já formado, dilui a fase externa, sem alterar o tamanho das gotículas

(ANTON; VANDAMME, 2011). Assim, percebe-se como melhor método para o

desenvolvimento do diagrama de fases pseudoternário para o desenvolvimento de

nanoemulsões, o método ponto a ponto, pois apresenta resultados mais reprodutíveis

e confiáveis dos sistemas formados.

No presente trabalho os sistemas formados foram classificados de acordo com

as características visuais observadas a olho nu, pois a classificação entre

nanoemulsões e microemulsões não é segura baseada somente na observação visual

do aspecto do sistema e aferição do tamanho das gotículas. São sistemas muito

semelhantes entre si quanto às características físicas e ao tamanho das gotículas,

apenas diferenciando-se quanto à estabilidade. Tanto nanoemulsões como

microemulsões se apresentam nas formas fluida translúcida ou transparente e com

tamanho de gotículas menor de 100 nm (ANTON; VANDAMME, 2011;

MCCLEMENTS; RAO, 2011; MCCLEMENTS, 2012).

Nos resultados encontrados ficou evidente que os diagramas desenvolvidos

utilizando como um dos tensoativos o Alkest® CSO 400, tiveram maior formação de

sistemas com aspecto gelificado. Isto porque o caráter não-iônico deste tensoativo,

com a parte hidrofóbica proveniente do óleo de mamona e a porção hidrofílica

107

proveniente da cadeia de óxido de eteno (óleo de mamona 40 EO), apresentando alto

grau de etoxilação elevando o seu valor de EHL, tem seu caráter hidrofílico mais

acentuado. Quanto maior for o grau de etoxilação do tensoativo maior é a cadeia polar

da molécula, o que estabiliza estericamente a gotícula de óleo no sistema, formando

sistemas com aspecto gelificado (DALTIN, 2011).

A combinação de Capryol® 90 e Tween® 80 não foi adequada para a formação

de sistemas estáveis na sua maioria e, embora a combinação de Capryol® 90 e Alkest®

CSO 400 apresentou conformidade para a formação de sistemas mais estáveis, esta

teve a continuidade dos seus testes inviabilizado pelo alto custo do tensoativo

Capryol® 90. Portanto para dar continuidade a otimização da nanoemulsão foram

selecionados 3 sistemas a partir do diagrama com a combinação dos tensoativos

Alkest® CSO400 e Span® 80. Conforme apresentado na Tabela 6, estes sistemas

apresentaram tamanho de fase interna menor que 100 nm, aspecto fluido branco e

PDI próximo a 0,2.

Tabela 6 - Formulações e características dos sistemas nanoemulsionados selecionados para o estudo de estabilidade preliminar.

Fórmula Óleo1 (%) Tensoativos2

(%) Água (%) Aspecto

Tamanho

d (nm)3 PDI4

4:6:20 13,3 20,0 66,7 Fluído

Branco 66,98 0,283

5:5:70 6,3 6,3 87,5 Fluído

Branco 23,09 0,216

6:4:20 20,0 13,3 66,7 Fluído

Branco 73,49 0,153

1– Miristato de isorpropila. 2- *Alkest® CSO 400 e Span® 80 (7,2:1,5). 3- Tamanho expresso como média em número. 4- PDI: índice de polidispersibilidade.

As formulações selecionadas foram submetidas aos estudos de estabilidade

preliminar e estabilidade termodinâmica, a fim de proceder a escolha da formulação.


nanoemulsões

O teste de estabilidade preliminar foi realizado com o objetivo de escolher a

formulação mais estável para posterior incorporação do extrato da R. ferruginea. Para

esta análise foram preparados lotes de 30 g em duplicata.

108

Das três formulações analisadas, a 4:6:20 durante o processo de resfriamento,

após a emulsificação, formou um sobrenadante com aspecto gelificado diferente do

sistema formado na porção inferior do frasco, com aspecto fluido. Foi então verificado

a influência de alteração no processo de emulsificação, elevando-se o período de

agitação sem aquecimento de 3 minutos para 5 minutos. Esta alteração não provocou

mudanças no sistema formado, permanecendo heterogêneo. Assim, esta formulação

não foi submetida ao teste de estabilidade preliminar e excluída do estudo.

Os resultados da estabilidade preliminar para as formulações 5:5:70 e 6:4:20

estão expostos na Tabela 7.

Tabela 7 - Resultados das análises no tempo inicial (ti) e final (tf) das nanoemulsões sem extrato

submetidas aoestudo de estabilidade preliminar.

Amostra

(réplica)

Aspecto1 pH Centrifugação2 Tamanho

(nm)3 PDI4

ti tf ti tf ti tf ti tf ti tf

5:5:70

(1) FL FL 6,65 7,08 + + 7,90 ± 6,4

11,89 ±

7,2 0,291 0,264

5:5:70

(2) FL FL 6,49 6,94 + + 10,84 ± 6,1

13,76 ±

6,3 0,290 0,266

6:4:20

(1) FLL FLL 6,60 6,72 + + 62,14 ± 3,5

58,99 ±

0,6 0,087 0,095

6:4:20

(2) FLL FLL 6,61 6,70 + + 56,17 ± 1,4

57,26 ±

1,4 0,068 0,065

Nota: 1FL: fluido translúcido; FLL: fluido leitoso levemente translúcido. 2(+) em conformidade; (-) em não conformidade. 3Tamanho expresso como média do número ± SD. 4PDI: índice de

polidispersibilidade.

Comparando o aspecto físico das amostras escolhidas pelo diagrama de fases

(Tabela 6) e o aspecto destas mesmas formulações preparadas para o estudo da

estabilidade preliminar (tinicial – Tabela 7), percebe-se a alteração do aspecto, de fluido

branco para fluido translúcido. Isto se deve, provavelmente à influência da

temperatura sobre o tensoativo polietoxilado Alkest® CSO 400.

Para o desenvolvimento do diagrama de fases foi utilizada a temperatura de 45

°C, no entanto esta temperatura não foi adequada para reproduzir o mesmo sistema

para o teste de estabilidade preliminar. A temperatura de 45 °C gerou sistemas

gelificados e não fluidos, quando houve o aumento na quantidade do lote, para 30 g.

109

Então, foi necessário o aumento da temperatura para 80 °C obtendo-se assim

sistemas fluidos porém não mais de cor branca, e sim sistemas translúcidos.

Esta alteração se deve ao tensoativo Alkest® CSO 400, um tensoativo não

iônico etoxilado, que não apresenta em sua molécula cargas verdadeiras de sais

dissociados e, que seriam responsáveis pela sua alta solubilidade em água. Neste

tensoativo as cargas que atraem moléculas de água, estão distribuídas por todos os

átomos de oxigênio na cadeia polimérica da molécula. Assim a força de atração para

as moléculas de água é fraca. Porém a agitação molecular provocada pelo

aquecimento de uma solução com tensoativo não iônico etoxilado rompe esta força

de atração, consequentemente, menos moléculas de água se estabilizam ao longo da

cadeia do tensoativo, fazendo com que o tensoativo sofra precipitação e resulte em

uma solução com aspecto de névoa ou turvo (DALTIN, 2011). Mudanças na

temperatura levam às modificações na hidratação das cadeias polietoxiladas deste

tensoativo (SOLANS; SOLÈ, 2012). Por isso a temperatura de 45 °C para a formação

da nanoemulsão e a agitação através do agitador mecânico não foram suficientes para

romper a força de atração entre as moléculas de água e o tensoativo etoxilado Alkest®

CSO 400, sendo necessário o aumento da temperatura de aquecimento.

Comparando os resultados encontrados no estudo de estabilidade preliminar

(Tabela 7) com os resultados obtidos na etapa de otimização (Tabela 6), o tamanho

das gotículas diminuiu significativamente na formulação 5:5:70, e na formulação

6:4:20 houve grande redução no índice de polidispersibilidade.

Devido à alta concentração de tensoativo na formulação 5:5:70 e a temperatura

maior durante o processo de emulsificação, a quebra das gotículas provocada pela

agitação foi mais efetiva, gerando tamanhos mais reduzidos. Segundo Amani e

colaboradores (2008), a energia total empregada durante a formação do sistema é um

fator dominante no controle do tamanho das gotículas finais em uma nanoemulsão. A

agitação somada a maior concentração da mistura de tensoativos e a alta temperatura

durante a emulsificação aumentaram a energia interfacial das gotículas, reduzindo

seus tamanhos (FERNANDEZ et al., 2004; IZQUIERDO et al., 2005).

Na proporção 6:4:20, com concentração de tensoativo menor que a de óleo, as

condições de preparo não alteraram significativamente o tamanho das gotículas,

porém tornou o sistema mais homogêneo, percebido pela redução do índice de

polidispersibilidade. Este resultado demonstra a influência da temperatura e da

concentração de tensoativos na formação de nanogotículas, provocada pela

110

capacidade dos tensoativos não iônicos com cadeia polietoxiladas realizar a transição

de fases com variações de temperatura, modificando a sua solubilidade nas diferentes

fases do sistema com consequente formação de nanoemulsões (SOLANS et al.,

2005).

Analisando os resultados no tempo inicial e final da estabilidade preliminar

(Tabela 7), percebe-se que o aspecto físico das formulações permaneceu inalterado,

sem evidência de qualquer instabilidade, assim como o teste de centrifugação não

revelou qualquer separação de fases nos sistemas. Como principal alteração observa-

se o aumento do pH na formulação 5:5:70, porém não representativa para degradação

química.

Prosseguindo nos testes de estabilidade preliminar, foi realizado ciclo

gelo/degelo, com adaptação da temperatura para -4 ± 2°C e 25 ± 2°C, para verificação

da estabilidade termodinâmica.

Todas as formulações apresentaram alteração de aspecto, com separação de

fases, aumento da fluidez e cremeação demonstrando instabilidade frente a variações

críticas de temperatura, o que é esperado para uma nanoemulsão. As nanoemulsões

têm por definição serem um sistema não estável termodinamicamente, ou seja, o ciclo

gelo/degelo apenas acelerou a desestabilização. Uma nanoemulsão sempre terá

quebra do sistema em determinado tempo, sendo a proporção desta separação

dependente da barreira de energia livre entre a nanoemulsão (sistema disperso) e a

energia livre das fases separadas deste mesmo sistema, e do processo de transporte

de moléculas envolvido. Nas nanoemulsões, a energia livre do sistema disperso é

maior do que a energia livre das fases separadas, sendo que esta barreira de energia

formada entre o sistema disperso e o sistema separado, deve ser suficientemente

grande para assegurar a estabilidade do sistema por um período de tempo

(MCCLEMENTS, 2012). Neste estudo, o emprego de alterações críticas das

temperaturas acelerou a redução desta barreira de energia, provocando a

desestabilização dos sistemas.

A partir dos resultados de estabilidade preliminar, as duas formulações 5:5:70

e 6:4:20 foram mantidas no estudo para a etapa posterior de incorporação do extrato

de R. ferruginea.

111

5.5 Obtenção e estudo de estabilidade preliminar das nanoemulsões contendo

extrato de R. ferruginea

A concentração de extrato mole incorporada nas nanoemulsões selecionadas

(5:5:70 e 6:4:20) baseou-se no resultado encontrado em ensaio farmacológico

empregando modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton para cremes

convencionais contendo 0,25%, 0,5% e 1,0% de extrato mole de R. ferruginea,

juntamente com creme convencional contendo 0,5% e 0,1% do marcador AMB,

representado na figura 30 no item 5.11. Embora a inibição do edema proporcionada

pelas diferentes concentrações não tenha diferenças significativas entre si, a

concentração de 0,5% do extrato mole de R. ferruginea foi escolhida para

incorporação nas nanoemulsões por ser esta concentração intermediária.

O extrato mole foi primeiramente incorporado na fase aquosa da nanoemulsão,

após prévia dissolução em propilenoglicol devido à dificuldade de dissolução deste na

fase oleosa, conforme procedimento descrito no item 4.5.3. Nesta etapa do estudo foi

adicionado o agente de consistência Sepigel® com o objetivo de aumentar a

consistência da fase externa das nanoemulsões, adequando-as para aplicação tópica,

conforme realizado em alguns trabalhos que também empregaram modificadores

reológicos com este objetivo (MOU et al., 2008; SONNEVILLE-AUBRUN; SIMONNET;

L’ALLORET, 2004; YILMAZ; BORCHERT, 2006).

Os resultados do estudo de estabilidade preliminar para as formulações

contendo extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, estão expressos

na Tabela 8.

Na amostra 5:5:70 S a adição do agente de consistência promoveu leve

aumento do tamanho das gotículas e diminuição do PDI, indicando maior estabilização

do sistema com a homogeneização do tamanho das gotículas. No caso da amostra

6:4:20 S, ocorreu o contrário, a adição do Sepigel® levou a diminuição do tamanho

das gotas com elevação do valor de PDI. Isso ocorreu provavelmente em função da

proporção de água na amostra 5:5:70 ser maior (87,5%) que na amostra 6:4:20

(66,7%), o que pode ter levado ao maior intumescimento do polímero, levando a

formação de uma rede polimérica com maior estabilidade para o sistema.

A adição do extrato mole da R. ferruginea provocou claramente a

desestabilização dos sistemas, evidenciada pela separação de fases na amostra

6:4:20 RF no teste de centrifugação no tempo zero e na amostra 5:5:70 RF no teste

112

de centrifugação no tempo final. Esta desestabilização provocada pelo extrato é

percebida nos valores do índice de polidispersibilidade, os quais se elevaram,

principalmente na amostra 6:4:20 RF. Isso se deve, provavelmente, a característica

complexa do extrato com componentes solúveis e insolúveis, formando diversos

tamanhos de gotículas. O acréscimo do Sepigel® na amostra 6:4:20 RFS contendo o

extrato provocou uma melhor estabilização, com redução do PDI, embora tenha

apresentado valor elevado, com redução do tamanho. Já na amostra 5:5:70 RFS

contendo o extrato, o Sepigel® elevou o valor de PDI. A adição do extrato também

provocou redução do pH, por este possuir característica levemente ácida (pH do

extrato = 4,21).

O aumento dos valores de PDI nas amostras contendo extrato e Sepigel®,

observado nas análises após o estudo de estabilidade preliminar, indica a

desestabilização do sistema ao término do ensaio. Foi possível observar que a adição

do extrato foi a causa da desestabilização das amostras, e que a adição do Sepigel®

como agente de consistência, formou uma rede polimérica estabilizando os sistemas,

sem alteração significativa no tamanho das gotas.

Em uma nanoemulsão a sua elevada estabilidade intrínseca leva em

consideração a estabilização estérica causada pelo o uso de tensoativos não-iônicos

e polímeros (TADROS et al., 2004), o que foi percebido nas formulações

desenvolvidas. As formulações sem extrato apresentaram uma maior estabilidade

considerando o aspecto físico após o teste de estabilidade, sem qualquer alteração

visual, e os seus baixos índices de polidispersibilidade.

Uma vez que os resultados do estudo preliminar de estabilidade das

nanoemulsões com extrato incorporado na fase aquosa mostraram instabilidades

físico-químicas, foi testada a incorporação de 0,5% de extrato na fase oleosa da

formulação, com prévia dissolução em propilenoglicol nas concentrações de 2% e 5%.

Este novo método de preparo demonstrou melhor estabilização quanto ao pH

e ao tamanho de fase interna e valores de PDI, conforme observado na Tabela 9. No

entanto, demonstrou resultados não adequados para uma nanoemulsão e

desestabilização dos sistemas no término do estudo, com separação de fases. Na

formulação 6:4:20 RFS, como possível consequência da menor proporção de água, o

extrato não se dispersou totalmente na fase oleosa, mesmo com a dissolução prévia

em propilenoglicol, apresentando separação de fases no término do estudo.

113

Tabela 8 - Resultados do estudo de estabilidade preliminar para as amostras com e sem extrato mole de R. ferruginea, incorporado na fase aquosa, com e

sem Sepigel®.

Amostra

(réplica)

Aspecto1 pH Teste de

Centrifugação2

Tamanho

(nm)3 PDI4

tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal

5:5:70 (1) FL FL ND ND + + 23,99 ± 11,03 17,50 ± 8,28 0,196 0,246

5:5:70 (2) FL FL ND ND + + 14,31 ± 9,59 18,43 ± 5,54 0,214 0,271

5:5:70 S(1) CBF CBF 6,32 6,08 + + 34,47 ± 1,81 33,15 ± 0,26 0,173 0,186

5:5:70 S(2) CBF CBF 5,68 6,43 + + 34,55 ± 1,31 34,72 ± 3,01 0,182 0,173

5:5:70 RF (1) FOMC SF ND ND + - 41,03 ± 4,28 37,34 ± 4,60 0,336 0,474

5:5:70 RF (2) FOMC SF ND ND + - 38,31 ± 5,68 34,38 ± 6,31 0,299 0,495

5:5:70 RFS (1) CMCF CMCF 4,81 4,96 + + 43,18 ± 9,23 79,54 ± 37,94 0,554 0,842

5:5:70 RFS (2) CMCF CMCF 4,71 5,04 + + 34,71 ± 21,48 88,85 ± 50,73 0,546 0,874

6:4:20 (1) FLL FLL ND ND + + 66,08 ± 0,23 61,23 ± 1,24 0,065 0,097

6:4:20 (2) FLL FLL ND ND + + 56,44 ± 2,80 57,02 ± 1,33 0,074 0,075

6:4:20 S (1) GCBC GCBC 7,35 6,71 + + 53,19 ± 1,22 52,18 ± 0,98 0,144 0,178

6:4:20 S(2) GCBC GCBC 7,17 6,59 + + 45,64 ± 1,41 34,57 ± 14,94 0,163 0,196

6:4:20 RF (1) FOM SF ND ND - - 49,97 ± 2,74 ND 0,633 ND

6:4:20 RF (2) FOM SF ND ND - - 46,90 ± 3,66 ND 0,763 ND

6:4:20 RFS (1) CCME CME 4,99 4,06 + + 47,16 ± 3,61 30,92 ± 20,82 0,591 0,997

6:4:20 RFS (2) CCME CME 4,93 4,04 + + 40,80 ± 14,36 36,20 ± 6,90 0,657 0,986

Nota: ND: não determinado; 1 CBF: creme branco levemente fluido; CCME: creme consistente marrom escuro; CME: creme marrom escuro; CMCF: creme marrom claro levemente fluido; FLL: fluido leitoso levemente translúcido; FOMC: fluido opaco marrom claro; FOME: fluido opaco marrom; FL: fluido translúcido; GCBC:gel-creme branco consistente; SF: separação de fases.2(+): em conformidade; (-): em não conformidade. 3tamanho expresso como média em número

± SD. 4índice de polidispersibilidade.

114

Tabela 9 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as formulações com o

extrato de R. ferruginea incorporado na fase aquosa (linhas em cinza) e na fase oleosa com diferentes concentrações de propilenoglicol (linhas em branco).

Amostra

(réplica)

Aspecto1 pH Teste de

Centrifugação2

Tamanho

(nm)3 PDI4

tinicial tf inal tinicial tf inal tinicial tf inal tinicial tf inal tinicial tf inal

5:5:70 RFS (1) CMCF CMCF 4,81 4,96 + + 43,18 ±

9,23

79,54 ±

37,94 0,554 0,842

5:5:70 RFS (2) CMCF CMCF 4,71 5,04 + + 34,71 ±

21,48

88,85 ±

50,73 0,546 0,874

5:5:70 (1)

RFS 2% CFBE CFBE 5,00 4,53 + -

26,27 ±

15,98

32,64 ±

20,05 0,698 0,677

5:5:70 (2)

RFS 2% CFBE CFBE 5,11 4,68 + -

27,78 ±

15,22

48,03 ±

11,29 0,533 0,929

5:5:70 (1)

RFS 5% CFBE CFBE 5,25 4,60 + -

34,32 ±

18,57

32,14 ±

25,86 0,613 0,576

5:5:70 (2)

RFS 5% CFBE CFBE 5,11 4,61 + -

19,76 ±

18,43

42,57 ±

26,33 0,668 0,835

6:4:20 RFS (1) CCME CME 4,99 4,06 + + 47,16 ±

3,61

30,92 ±

20,82 0,591 0,997

6:4:20 RFS (2) CCME CME 4,93 4,04 + + 40,80 ±

14,36

36,20 ±

6,90 0,657 0,986

6:4:20 (1)

RFS 2% CCBE SF 5,00 ND + -

35,52 ±

17,28 ND 0,428 ND

6:4:20 (2)


27,60 ±

7,64 ND 0,441 ND

6:4:20 (1)


52,53 ±

3,34 ND 0,519 ND

6:4:20 (2)


60,58 ±

54,75 ND 0,503 ND

Nota: ND: não determinado; 1CCBE: creme consistente bege escuro; CCME: creme consistente

marrom escuro; CFBE: creme fluído bege escuro; CME: creme marrom escuro; CMCF: creme marrom claro levemente fluido; SF: separação de fases. 2(+): em conformidade; (-): em não conformidade. 3Tamanho expresso como média em número ± SD. 4Índice de polidispersibilidade.

Com base nestes resultados, um novo teste foi realizado, com redução da

concentração do extrato para 0,25% e 0,13% com incorporação na fase oleosa e

aquosa com prévia dissolução em 2% de propilenoglicol.

Nestes resultados, apresentados na Tabela 10, foi verificado que a redução da

concentração do extrato de 0,5% para 0,25% e 0,13% propiciou a incorporação do

mesmo nas formulações selecionadas, as quais permaneceram homogêneas durante

o estudo sem evidências de separação de fases, mesmo após o teste de

centrifugação. Exceto para uma réplica da formulação 6:4:20 com 0,13% de extrato

incorporado na fase oleosa do sistema (6:4:20 FO 0,13% (2)), que apresentou leve

115

separação de fases após a centrifugação, apresentando aumento do tamanho das

gotículas e confirmando a desestabilização.

As formulações 5:5:70 apresentaram-se mais instáveis com aumento relevante

no tamanho das gotículas e na distribuição do tamanho. O pH apresentou leve

redução. As formulações 6:4:20 apresentaram acentuada redução do pH e redução

do tamanho das gotículas com pouca elevação na distribuição de tamanho, no tempo

final do estudo. Esta formulação apresenta maior concentração de óleo e o dobro da

concentração de tensoativo em relação a formulação 5:5:70, o que possivelmente

favoreceu a dissolução dos ácidos mirsinoicos na formulação com as alterações

bruscas de temperatura, ocasionando a redução no valor de pH.

A partir dos resultados encontrados, a formulação 6:4:20 contendo 0,25% e

0,13% do extrato incorporado na fase oleosa do sistema, foi selecionada para

continuidade dos estudos.

116

Tabela 10 - Tabela comparativa dos resultados da estabilidade preliminar para as nanoemulsões com 0,25% e 0,13% de extrato de R. ferruginea, incorporados

na fase oleosa (linhas cinzas) e na fase aquosa (linhas brancas).

Amostra Aspecto1 pH

Teste de

Centrifugação2

Tamanho

d (nm)3 PDI4

tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal tinicial tfinal

5:5:70 FO 0,25% (1) CFB CFB 5,0 4,81 + + 24,93 ± 7,77 2660 ± 2402 0,461 0,201

5:5:70 FO 0,25% (2) CFB CFB 5,19 4,90 + + 42,54 ± 1,96 1532 ± 2622 0,702 0,527

5:5:70 FA 0,25% (1) CFB CFB 5,39 5,10 + + 39,77 ± 1,94 1618 ± 2766 0,376 0,567

5:5:70 FA 0,25% (2) CFB CFB 5,40 5,29 + + 29,84 ± 8,95 20,28 ± 8,84 0,388 0,231

5:5:70 FO 0,13% (1) CFBC CFBC 5,18 5,02 + + 30,28 ± 10,62 24,61 ± 11,64 0,325 1,0

5:5:70 FO 0,13% (2) CFBC CFBC 5,25 5,28 + + 33,01 ± 7,76 33,08 ± 13,33 0,262 1,0

5:5:70 FA 0,13% (1) CFBC CFBC 5,63 5,32 + + 45,72 ± 19,10 23,26 ± 11,92 0,204 0,899

5:5:70 FA 0,13% (2) CFBC CFBC 5,42 5,40 + + 33,80 ± 0,78 22,29 ± 1,08 0,255 1,0

6:4:20 FO 0,25% (1) CCBE CCBE 5,13 3,50 + + 65,39 ± 33,28 16,76 ± 1,49 0,171 0,414

6:4:20 FO 0,25% (2) CCBE CCBE 5,07 3,54 + + 80,92 ± 9,44 46,04 ± 28,14 0,166 0,459

6:4:20 FA 0,25% (1) CCBE CCBE 5,82 3,80 + + 70,56 ± 6,96 25,58 ± 15,02 0,151 0,481

6:4:20 FA 0,25% (2) CCBE CCBE 5,61 3,94 + + 69,20 ± 5,76 26,35 ± 7,35 0,171 0,275

6:4:20 FO 0,13% (1) CCBC CCBC 5,31 3,57 + + 70,72 ± 7,2 39,03 ± 35,09 0,127 0,250

6:4:20 FO 0,13% (2) CCBC CCBC 5,42 3,56 + - 72,85 ± 1,80 90,02 ± 0,31 0,149 0,175

6:4:20 FA 0,13% (1) CCBC CFBC 5,70 3,64 + + 63,04 ± 5,68 49,36 ± 21,81 0,146 0,214

6:4:20 FA 0,13% (2) CCBC CFBC 6,20 3,74 + + 56,84 ± 23,44 35,33 ± 24,63 0,209 0,282

Nota: 1CCBE: creme consistente bege escuro; CCBC: creme consistente bege claro; CFB: creme fluído bege; CFBC: creme fluido bege claro. 2(+) em conformidade; (-): em não conformidade. 3Tamanho expresso como média em número ± SD. 4Índice de polidispersibilidade.

117

5.6 Caracterização das nanoemulsões contendo extrato de R. ferruginea

Partindo dos resultados obtidos no estudo de estabilidade preliminar, a

formulação escolhida para continuidade dos estudos foi a 6:4:20 contendo 0,13% e

0,25% de extrato das cascas de R. ferruginea.

A fim de selecionar uma única concentração do extrato nas nanoemulsões,

antes da caracterização completa do sistema, foi realizado estudo in vivo da atividade

anti-inflamatória em modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton, conforme

metodologia descrita no item 4.11.2, com o objetivo de avaliar qual a concentração

mais efetiva do extrato incorporado na nanoemulsão e em uma base de creme

convencional. O teste foi realizado com a nanoemulsão sem extrato, nanoemulsão

com extrato a 0,13% e 0,25%, creme sem extrato, creme com extrato a 0,13%, 0,25%

e 0,5%. A nanoemulsão com 0,13% de extrato apresentou atividade anti-inflamatória

mais efetiva com significativa diferença em relação a nanoemulsão com 0,25% de

extrato, conforme figura 31 do item 5.11. Em relação ao creme, não houve diferença

estatística na inibição do edema de orelha entre as diferentes concentrações. Como

um dos objetivos deste estudo é averiguar a diferença de ação entre os veículos creme

e nanoemulsão, optou-se pelo emprego da mesma concentração de extrato em

ambos veículos, 0,13% de extrato em nanoemulsão e creme. O extrato foi incorporado

nas formulações após prévia dispersão em propilenoglicol.

A caracterização das nanoemulsões desenvolvidas requer o emprego de

diferentes técnicas de análise para garantir que o sistema desenvolvido apresente as

características desejadas para uma nanoemulsão.

Após 24 h de preparo, a nanoemulsão sem adição de extrato apresentou

aspecto semissólido consistente, homogêneo, na cor branca, com toque aveludado.

A adição do extrato desenvolveu cor caramelo na nanoemulsão, que apresentou

aspecto semissólido com menor consistência em relação ao veículo branco,

homogêneo, com toque aveludado. Após o teste de centrifugação, as formulações

demonstraram adequada estabilidade física, não apresentando qualquer indício de

instabilidade como separação de fases, cremeação ou sinais de precipitação.

Para a análise da distribuição de tamanho de gota e potencial zeta, as

formulações foram diluídas em água ultrapura na proporção de 1:100, e analisadas

por DLS, a temperatura de 25 °C. O tamanho das gotículas foi expresso como média

de 3 aferições. Todas as formulações apresentaram-se monodispersas. Para a

118

nanoemulsão com 0,13% de extrato, a média de tamanho foi de 47,88 ± 8,20 nm com

0,228 ± 0,004 de PDI, representado na figura 18(B). Para a nanoemulsão sem extrato

a média de tamanho das gotas foi de 57,43 ± 3,37 nm com 0,114 ± 0,016 de PDI,

representado na figura 18(A).

As figuras 18A1 e 18B1 representam a taxa de correlação das nanoemulsões

sem e com extrato, respectivamente. A taxa de correlação informa sobre a correlação

entre o tempo e o movimento provocado pelo espalhamento de luz das gotículas

(SCHÄTZEL, 1987), representando a taxa de decaimento das gotas em suspensão,

influenciada pelo tamanho das mesmas, durante o tempo de incidência da luz. A taxa

de correlação de ambas formulações analisadas representa a homogeneidade dos

sistemas quanto ao tamanho.

A incorporação do extrato no sistema provocou redução do tamanho das gotas,

o que também foi encontrado em outros trabalhos incorporando substâncias ativas

(OKUR et al., 2011; SANDIG et al., 2013), havendo a hipótese de que as moléculas

de um ativo incorporado no sistema participam da sua microestrutura podendo causar

influências devido a interações moleculares (SANDIG et al., 2013). Possivelmente

devido a estas interações moleculares houve elevação do PDI quando da

incorporação do extrato, indicativo da diminuição da homogeneidade do tamanho das

gotas do sistema, pois o PDI é um índice que indica o desvio da média de tamanho

das gotas (KELMANN et al., 2007).

A caracterização de nanoemulsões por DLS possui algumas limitações como,

não reconhecimento de pequenas populações de gotículas grandes dentro do

sistema, além da técnica reconhecer somente formas esféricas perfeitas e necessitar,

algumas vezes, da amostra diluída para promover maior transparência para a análise.

O emprego da microscopia eletrônica de transmissão (MET) como técnica

complementar a técnica por DLS, é uma ferramenta confiável e informativa para

caracterizar as nanoemulsões (KLANG et al., 2012).

119

Figura 18 - Gráficos representativos da distribuição do tamanho da fase interna da nanoemulsão sem

extrato (A) e da nanoemulsão com extrato (B), com seus respectivos gráficos de taxa de correlação correspondentes (A1 e B1).

Sendo assim, para verificar a morfologia da fase interna, as nanoemulsões com

e sem extrato de R. ferruginea foram analisadas por MET.

Na MET a amostra é iluminada por um feixe de elétrons que interage com o

material provocando um espalhamento de elétrons, obtendo-se uma imagem

contrastada. A resolução na MET é proporcional a aceleração na voltagem dos

elétrons, que para sistemas coloidais, pode ser entre 80 e 200 kV (KLANG et al.,

2012). No presente estudo foi utilizada a voltagem de 80 kV para visualizar as

nanoemulsões diluídas. A diluição foi necessária devido ao aspecto semissólido dos

sistemas.

As imagens obtidas pela MET das nanoemulsões com e sem extrato, figura 19,

demonstram as gotículas da fase interna esféricas envolvidas por um sistema

estruturado formado pelo polímero Sepigel® e pelo tensoativo polietoxilado Alkest®

CSO 400, sem a formação de agregados. Em função da “rede” formada pelo polímero

e pelo tensoativo, a imagem das gotículas aparece com as bordas com pouca nitidez.

Na imagem da nanoemulsão com extrato algumas gotículas apresentam menor

120

intensidade de cor, comportamento este que pode estar relacionado com a

evaporação da amostra provocada pelo feixe de elétrons (KLANG et al., 2012).

Figura 19 - Micrografias eletrônicas obtidas após coloração negativa da nanoemulsão sem extrato (A)

e da nanoemulsão com extrato (B). Aumento de 15.000x.

O potencial zeta representa a força de repulsão entre as gotículas e possui

relação com a estabilidade da dispersão (BALI; ALI; ALI, 2010), sendo o valor maior

que +/- 30 mV indicativo de máxima estabilidade (ARAÚJO et al., 2011). O valor

encontrado para a nanoemulsão com extrato foi de -34,7 ± 1,15 mV e para a

nanoemulsão sem extrato foi de -19,95 ± 0,21 mV. Os resultados indicam que a

característica ácida do extrato (pKa de 4,5 para o AMA e de 4,8 para o AMB, de acordo

com Zermiani (2015)) aumentou o potencial zeta da nanoemulsão, o que pode levar a

maior estabilidade do sistema em relação a ausência do extrato devido ao aumento

da força de repulsão entre as gotículas.

121

O pH da nanoemulsão com extrato foi de 5,25 ± 0,02 e para o sistema sem

extrato foi de 5,19 ± 0,01, indicando que para aplicação tópica, os nanossistemas

possuem valor de pH próximo ao pH fisiológico da pele, mostrando-se adequados.

Para a avaliação reológica das nanoemulsões foi utilizado o viscosímetro

rotacional Haake® VT 550, em que o fluido é cisalhado entre duas superfícies, uma

estática e outra em movimento, e as tensões de cisalhamento geradas são

determinadas através de medições de torque.

O comportamento reológico demonstrado pelas nanoemulsões com e sem

extrato, representado na Figura 20, foi do tipo pseudoplástico com índice de

comportamento de fluxo inferior a 1, calculado pelo modelo de Ostwald-de-Waele

(Tabela 11), e tixotrópico. A viscosidade aparente média da nanoemulsão com extrato

foi de 5773,28 ± 950,85 mPa.s, inferior ao valor encontrado para a nanoemulsão sem

extrato que foi de 7356,34 ± 303,59 mPa.s, indicando que a incorporação do extrato

no sistema provocou redução da viscosidade. A adição do extrato também reduziu o

valor de tixotropia de 2,99.107 Pa-1 para 1,90.107 Pa-1.

Figura 20 - Perfil de viscosidade da nanoemulsão veículo (imagem à esquerda) e da nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole das cascas de R. ferruginea (imagem à direita).

Tabela 11 - Análise da constante de Ostwald-de-Waele (K) e do índice de comportamento de fluxo (n)

para a nanoemulsão veículo e para a nanoemulsão com extrato de R. ferruginea.

Formulação K (mPa.sn) n R

Nanoemulsão veículo 5,20.105 0,0230 0,8122

Nanoemulsão 0,13% extrato

R. ferruginea 4,51.105 0,0061 0,8739

Conforme apresentado na Figura 21, a nanoemulsão com 0,13% de extrato

mole de R. ferruginea apresentou perfil cromatográfico semelhante ao do extrato mole

122

e os componentes da formulação não interferem na integração dos picos dos

marcadores AMA e AMB. O teor dos marcadores AMA e AMB foi 54,10 ± 0,08 µg/g e

53,03 ± 0,03 µg/g, respectivamente, representando 103,87% e 109,25% em relação a

concentração teórica de marcadores na formulação (52,08 µg/g e 48,54 µg/g de

formulação para AMA e AMB, respectivamente).

Figura 21 - Perfis cromatográficos por CLAE do extrato mole de R. ferruginea, da nanoemulsão contendo 0,13% de extrato mole de R. ferruginea e da nanoemulsão veículo, em 270 nm.

5.7 Estudo de estabilidade acelerada da nanoemulsão

O estudo de estabilidade de um produto prevê o seu comportamento em

determinado intervalo de tempo, sob certas condições ambientais, com o objetivo de

avaliar o seu desempenho, segurança e eficácia (ANVISA, 2004).

As nanoemulsões com extrato, em triplicata, e sem extrato, em duplicata, foram

submetidas ao estudo de estabilidade acelerada, por um período de 180 dias em

temperatura ambiente (23 ± 2 °C) e à 40 °C. As avaliações foram realizadas nos

123

tempos zero (24 h), 30, 90 e 180 dias. Os resultados das análises estão expostos na

Tabela 12.

Observando os resultados das análises da nanoemulsão branco (veículo), não

houve alterações importantes em suas características físico-químicas ao longo do

estudo, demonstrando a sua provável estabilidade.

A presença do extrato provocou a desestabilização do sistema ao longo do

estudo realizado, tendo as amostras expostas a 40 °C alterações aceleradas em

relação a temperatura ambiente. Possivelmente, esta alteração tenha sido provocada

pelas interações moleculares entre o veículo com o extrato mole de R. ferruginea.

A nanoemulsão com extrato apresentou perda da homogeneidade, com a

presença de duas fases distintas, uma mais translúcida e outra mais opaca, a partir

do 30° dia exposta a 40 °C e a partir do 90º dia exposta a temperatura ambiente. Até

o período de 90 dias, estas amostras recuperaram o aspecto homogêneo inicial após

o teste de centrifugação realizado ao término de cada período de tempo, somente

após 180 dias de estudos, as amostras não recuperaram a homogeneidade (Figura

22).

As amostras de nanoemulsões com extrato expostas a temperatura ambiente,

tiveram redução gradual do tamanho médio da fase interna com aumento gradual no

valor de PDI e do potencial zeta, com pouca redução na concentração dos marcadores

AMA e AMB e poucas alterações nos valores de pH, em comparação a nanoemulsão

exposta a temperatura de 40 °C.

As amostras de nanoemulsão com extrato expostas a temperatura de 40 °C,

apresentaram aumento no tamanho médio da fase interna ao longo do tempo do

estudo, com poucas modificações no valor de PDI, grande redução do potencial zeta

e pH, com maior redução da concentração de AMA em relação ao AMB.

124

Tabela 12 – Resultado do estudo de estabilidade acelerada das nanoemulsões nas temperaturas ambiente e 40 ºC.

Parâmetros (média ± desvio

padrão)

Formulações

Nanoemulsão 0,13% Extrato Mole

R. ferruginea Nanoemulsão Branco

t0 t30d

amb t30d

40 ºC t90d

amb t90d

40 ºC t180d amb t180d 40ºC t0

t30d

amb t30d

40 ºC t90d

amb t90d

40 ºC t180 d amb

t180 d 40

ºC Cor C C C C CE C CE B B B B B B B

Homogeneidade + + - - - - - + + + + + + +

Odor + + - + - + - + + + + + + +

Consistência SC SF LF LF LF LF LF SC SC SC SC SC SC SC

Centrifugação + + + + + - - + + + + + + +

pH 5,24 ± 0,02

5,7 ± 0,09

5,13 ± 0,14

5,25 ± 0,07

4,87 ± 0,10

5,46 ± 0,43

4,64 ± 0,26

5,19 ± 0,01

6,2 ± 0,10

5,9 ± 0,24

5,7 ± 0,14

5,65 ± 0,05

6,22 ± 0,03

6,14 ± 0,17

Viscosidade média (mPa.s)

5,77.103 ±

9,51.102

2,42.103 ±

7,59.102

1,35.102 ±

3,02.101

2,54.102 ±

4,48.101

1,15.102 ±

2,45.101

9,92.101 ±

1,88.101

8,64.101 ±

5,71.101

7,36.103

±

3,03.102

8,26.103

±

1,23.103

5,85.103

±

2,06.103

7,16.103 ±

1,07.102

7,84.103

±

7,64.102

7,10.103 ±

8,34.102

6,15.103

±

1,60.103

Tixotropia (Pa-1) 1,90.107

±2,25.106

-5,49.105

±1,83.105

5,28.104

±3,92.104

-2,52.105

±1,15.105

-1,35.105

±9,03.104

-1,72.105

±5,46.104

-6,85.104

±1,18.105

2,99.107 ±

9,12.105

3,06.107 ±

4,58.106

2,58.107 ±

5,30.106

2,93.107

±2,43.106

1,44.107 ±

2,12.106

2,85.107±

5,59.106

2,09.107 ±

5,66.106

Teor AMA (µg/g) 61,30 ±

1,32 59,33 ±

0,80 51,4 ± 0,54

45,9 ± 6,99

41,34 ± 4,65

53,38 ± 2,09

29,96 ± 2,97

NA NA NA NA NA NA NA

Teor AMB (µg/g) 57,6 ±

0,23

56,07 ±

0,50

53,77 ±

0,72

55,28 ±

3,77

57,51 ±

2,86

51,91 ±

1,15

48,48 ±

2,03 NA NA NA NA NA NA NA

Tamanho médio fase interna (nm)

47,88 ±

8,20

31,09 ±

13,26

36,63 ±

19,63

18,68 ±

7,28

65,91 ±

5,13

12,41 ±

1,70

74,13 ±

2,50

57,43 ±

3,37

55,63 ±

0,28

58,06 ±

1,81

51,75 ±

9,79

60,52 ±

0,84

53,91 ±

2,96

55,66 ±

4,38

Polidispersibilidade (PDI)

0,228 ± 0,004

0,277 ± 0,02

0,447 ± 0,02

0,331 ± 0,03

0,224 ± 0,02

0,363 ± 0,03

0,204 ± 0,01

0,114 ± 0,01

0,144 ± 0,009

0,114 ± 0,01

0,131 ± 0,01

0,123 ± 0,004

0,142 ± 0,009

0,132 ± 0,02

Potencial Zeta (mV) -34,7 ±

1,15 -31,3 ± 5,03

-38,56 ± 1,85

-36,73 ± 2,44

-25,83 ± 1,46

-37,63 ± 1,45

-17,46 ± 3,03

-19,95 ± 0,21

-17,7 ± 2,96

-16,25 ± 0,07

-16,7 ± 3,67

-15,7 ± 0,56

-15,65 ± 3,74

-13,15 ± 0,91

Nota: B: branco; C: caramelo; CE: caramelo escuro; LF: líquido fluido; S: semi-sólido; SC: semi-sólido consistente; SF: semi-sólido fluido; t: tempo; d: dias; amb: temperatura ambiente; +: em conformidade; -: não conformidade; NA: não se aplica.

125

Figura 22 - Fotografia demonstrando o aspecto visual das nanoemulsões branco e com extrato após o

término do estudo de estabilidade acelerada, expostas a temperatura ambiente e a 40 °C.

Os resultados encontrados indicam também alterações no comportamento

reológico das nanoemulsões com a adição do extrato de R. ferruginea. As oscilações

observadas no perfil da tensão de cisalhamento indicam alterações de força para

alcançar o gradiente ou a velocidade de cisalhamento previsto, representando a

heterogeneidade das amostras (Figuras 23 e 24). A exposição das amostras a 40 °C

agravou e acelerou as alterações reológicas. O índice de comportamento de fluxo

inicial da nanoemulsão com extrato, calculado pelo modelo matemático de Ostwald-

de-Waelle, foi menor que a unidade indicando um comportamento pseudoplástico,

sem limiar de tensão de cisalhamento. Este comportamento permaneceu ao longo do

estudo em temperatura ambiente, ocorrendo redução gradual da viscosidade aparente

e antitixotropia. A 40 °C estes comportamentos foram acelerados porém de modo

diferenciado. Em 30 dias o comportamento reológico demonstra alteração, com índice

de comportamento de fluxo pouco superior a unidade, com a viscosidade aparente

muito reduzida e elevação da tixotropia. A partir do período de 90 dias em estufa, a

nanoemulsão teve o valor de n próximo de 1, com presença de antitixotropia e maior

redução da viscosidade aparente.

126

Figura 23 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato (NE branco)

durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero, e após exposição a temperatura ambiente nos tempos 30, 90 e 180 dias.

Nota: As cores diferentes representam a réplica de cada análise da amostra.

127

Figura 24 - Perfis de viscosidade das nanoemulsões com (NE 0,13%) e sem extrato (NE branco)

durante o estudo de estabilidade acelerada no tempo zero e após exposição a temperatura de 40 °C nos tempos 30, 90 e 180 dias.

Nota: As cores diferentes representam a réplica de cada análise da amostra.

128

Conceitualmente as nanoemulsões são sistemas termodinamicamente

instáveis, ou seja, a energia livre da dispersão coloidal formada é maior que a energia

livre da sua fase separada (óleo e água), sendo possível proporcionar estabilidade

cinética, garantindo uma grande barreira energética entre os dois estados e

controlando a transferência de massa entre os componentes. Portanto, uma

nanoemulsão tende a se desestabilizar em um dado tempo, dependendo da energia

de barreira formada entre a nanoemulsão e as suas fases separadas e o transporte

de massas envolvido. A força da energia de barreira é determinada principalmente

pela prevenção da aproximação entre as gotas da fase interna como interações

repulsivas hidrodinâmicas e coloidais (estérica e eletrostática). A taxa de

desestabilização das nanoemulsões depende da sua composição e das condições

ambientais (MCCLEMENTS, 2012).

Neste estudo foi verificado que a presença do extrato mole das cascas de R.

ferruginea acelerou a desestabilização do sistema, quando comparado com o veículo,

sendo que a exposição a temperatura de 40 °C colaborou para este processo.

Um sistema tende sempre a se reverter a um estado de baixa energia livre, que

para as nanoemulsões implica na separação de fases, sob a influência da temperatura

(MCCLEMENTS, 2012). Durante a exposição a temperatura ambiente foi observado

que as gotículas da fase interna sofreram redução de tamanho com potencial zeta

elevado. O tamanho da fase interna depende da energia livre interfacial, a qual é

grande para a formação de tamanhos reduzidos de fase interna, que se reduz a um

valor mínimo quando o tamanho diminuiu até um certo valor e depois se eleva

novamente para uma redução ainda maior da fase interna (MCCLEMENTS, 2012). As

amostras quando expostas a temperatura de 40 °C apresentaram desestabilização

mais rápida, ao 30° dia, com aumento do tamanho da fase interna ao longo do estudo

e potencial zeta sendo gradualmente reduzido. Ou seja, a temperatura elevada

favoreceu a aproximação das gotículas, diminuindo o potencial zeta em 49,68%,

levando a fusão entre as gotículas, com aumento de tamanho médio em 54,91%. Já

quando exposta a temperatura ambiente, o tamanho médio da fase interna das

nanoemulsões teve um decréscimo de 74,08%, e o potencial zeta aumentou em

8,44%.

A estabilidade eletrostática de sistemas coloidais tem sido indicada pelo valor

de potencial zeta, que quando se apresenta com valor negativo, representa uma alta

energia de barreira entre as gotículas (HATANAKA et al., 2010). O aumento do

129

potencial zeta durante o estudo em temperatura ambiente, revela grande repulsão

entre as gotículas, e quando a interação entre as gotas é predominantemente de

repulsão, fenômenos de instabilidade como cremeação, coalescência e floculação não

são geralmente importantes em função da predominância do movimento Browniano

das gotículas (FRYD; MASON, 2010). Provavelmente por isto, os testes de

centrifugação ao término de até 90 dias de estudo, reverteu a cremeação do sistema,

provocada pela instabilidade do sistema contendo extrato, no estudo a temperatura

ambiente. A taxa de reversão entre o sistema coloidal e as fases separadas, em uma

nanoemulsão, é determinada pela frequência em que as gotículas de óleo entram em

contato uma com a outra, fenômeno este que depende do movimento Browniano,

agitação aplicada e forças da gravidade, ou seja a centrifugação (MCCLEMENTS,

2012). A reversão da separação de fases também foi verificada nas amostras

expostas a 40 °C. No entanto, após o período de 180 dias de exposição a temperatura

ambiente e a 40 °C, a não reversão do sistema, representou a desestabilização física

irreversível do sistema.

A desestabilização do sistema durante o estudo a 40 °C ficou evidente também

analisando a redução da concentração dos marcadores AMA e AMB, 51,12% e

15,83%, respectivamente, especialmente para o AMA. Enquanto que, quando

expostas a temperatura ambiente, os marcadores do extrato nas nanoemulsões

apresentaram pouca redução em suas concentrações, 12,92% para o AMA e 9,87%

para o AMB. Zermiani (2014) verificou que em ensaios de degradação forçada do

extrato mole das cascas de R. ferruginea, o AMA demonstra menor estabilidade,

sofrendo hidrólise ácida e oxidação, enquanto o AMB sofre degradação menos

significativa em meio ácido. Quanto à degradação térmica, nenhum dos dois

marcadores apresentaram degradação quando expostos a temperatura de 40 °C por

60 dias, diferente dos dados encontrados neste estudo. Esta diferença demonstra a

possibilidade de interação entre os componentes do extrato e da nanoemulsão o que

levou a degradação dos marcadores.

Nas nanoemulsões, a adição de um agente doador de consistência contribuiu

para a formação da energia de barreira estérica, favorecendo a estabilidade do

sistema, conforme percebe-se quando se verificada a estabilidade estudada com o

veículo.

Estas alterações observadas na nanoemulsão contendo extrato e exposta a

temperatura elevada (40 °C) podem ser explicada por possível interação molecular

130

entre o extrato e os componentes que formam a barreira eletrostática e estérica da

formulação, reduzindo-a, pois se percebe grande redução da viscosidade do sistema

na presença do extrato e do potencial zeta. A viscosidade aparente apresentou

redução semelhante entre a nanoemulsão com extrato exposta a temperatura

ambiente e a 40 °C, queda de cerca de 98,28 e 98,50% até o término do estudo,

respectivamente. A mistura de tensoativos e polímeros possuem propriedades

reológicas e a habilidade em estabilizar sistemas coloidas. O tensoativo não iônico

polietoxilado, usado na composição da nanoemulsão, possui grande sensibilidade a

temperatura, podendo também sofrer interações eletrostáticas em sistemas aquosos

envolvendo componentes iônicos, embora menos importante que a temperatura

(GALINDO-ALVAREZ et al., 2011). A instabilidade desta classe de tensoativo frente a

temperaturas elevadas, se deve a desidratação da porção polar da sua molécula,

provocando mudanças em sua solubilidade levando à redução da tensão interfacial e

aumento da flexibilidade interfacial, provocando a coalescência das gotas de óleo da

fase interna de uma nanoemulsão submetida a altas temperaturas (GUTTOFF;

SABERI; MCCLEMENTS, 2015).

Em estudo realizado por Guttoff, Saberi e Mcclements (2015) no

desenvolvimento de uma nanoemulsão contendo vitamina D pelo método da

emulsificação espontânea, foi verificada a estabilidade do sistema em temperatura

ambiente e a 80 °C. O sistema se manteve estável em temperatura ambiente porém

instável com elevação no tamanho da fase interna quando armazenado a 80 °C. Os

autores relacionaram este comportamento à presença do tensoativo não iônico, que

possui estabilidade dependente da temperatura. Foi avaliado então, a influência da

adição de um co-tensoativo, o dodecil sulfato de sódio, na formulação. O co-tensoativo

melhorou a estabilidade térmica da nanoemulsão, provavelmente, por ter aumentando

as forças de repulsão entre as gotas da fase interna, reduzindo a tendência à

coalescência.

Considerando que a nanoemulsão veículo apresentou-se estável durante o

estudo, o tensoativo Alkest® CSO 400, possivelmente sofreu interação molecular com

o extrato e a temperatura intensificou esta interação, provocando a desestabilização

do sistema. Este achado nos indica a necessidade de testes com novos tensoativos

para estudo de interações com o extrato.

Sandig e colaboradores (2013) relataram o estudo de estabilidade para

nanoemulsões com imipramina e doxepina, preparadas usando banho ultrassônico,

131

somente a temperatura ambiente e por período de 3 meses. As nanoemulsões com e

sem substâncias ativas não apresentaram alterações significativas em suas

características físico-químicas que evidenciasse perda de estabilidade. Alam e

colaboradores (2012) avaliaram a estabilidade acelerada de uma nanoemulsão com

betametasona, preparada por emulsificação espontânea, por 3 meses nas

temperaturas de 4 °C e 25 °C, em que foram avaliados mensalmente aspectos como

tamanho da fase interna, viscosidade e índice de refração, já o teor do fármaco foi

avaliado mensalmente por 3 meses na nanoemulsão armazenada nas temperaturas

de 30, 40, 50 e 60 °C. A nanoemulsão não apresentou mudanças significativas nos

aspectos físicos e químicos. Atrux-Tallau e colaboradores (2014) verificaram a

estabilidade de uma nanoemulsão contendo licorice (extrato da raiz de Glycyrrhiza

glabra) preparada por processo de ultrassonificação. Neste estudo, a estabilidade foi

verificada através da análise do tamanho das gotas e observações macroscópicas,

para verificar sinais de desestabilização, em diferentes nanoemulsões armazenadas

a 4 °C, temperatura ambiente (22 °C) e 40 °C, por 3 meses. Não foi verificado qualquer

sinal de desestabilização (floculação, cremeação ou sedimentação) e o tamanho da

fase interna não apresentou aumento de valor, demostrando estabilidade física ,

segundo os autores.

Baseado nos resultados encontrados no estudo de estabilidade acelerada, a

nanoemulsão contendo extrato não permaneceu estável com alterações no seu

aspecto, redução do teor de AMA e perda da viscosidade inicial. Este estudo revelou

que, para a incorporação do extrato mole das cascas de R. ferruginea são necessárias

adequações farmacotécnicas, como construção do diagrama de fases utilizando o

extrato na composição para verificar a formulação mais adequada e estável à

incorporação do mesmo, além de mais testes com diferentes tensoativos.

5.8 Avaliação do potencial irritante das nanoemulsões contendo R. ferruginea

O ensaio in vitro para avaliação do potencial irritante das nanoemulsões neste

estudo foi baseado na citotoxicidade pela difusão em gel de agarose, que é

recomendado para emulsões com a fase externa aquosa. Neste teste a citotoxicidade

em cultura de fibroblastos é baseada na medida no diâmetro do halo formado pela lise

celular revelado pelo corante vermelho neutro (ANVISA, 2003).

132

O potencial irritante encontrado neste estudo para as nanoemulsões com e sem

extrato da R. ferruginea, foi moderado de acordo com a classificação descrita pela

Farmacopéia Americana (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2007). A média do

halo de lise de uma duplicata foi de 6,5 ± 0,70 mm para a nanoemulsão com extrato e

7,25 ± 0,35 mm para a nanoemulsão sem extrato, conforme figura 25. Os cremes com

e sem extrato de R. ferruginea (Figura 25) e o extrato mole, figura 26, não

apresentaram formação de halo, indicando nenhuma ação irritante na metodologia

empregada.

Figura 25 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro para as nanoemulsões e cremes contendo extrato de R. ferruginea.

Figura 26 - Fotografia de placa de cultivo celular do teste de irritação cutânea in vitro para o extrato mole da casca de R. ferruginea a 0,25% em DMSO.

133

Baseado nos resultados encontrados, a composição da nanoemulsão é

responsável pelo grau irritativo acusado no ensaio, pois foi a única formulação com

formação de halo mesmo sem adição do extrato.

Em estudo prévio realizado por Müller (2013), o potencial de irritação do

tensoativo Alkest® CSO 400, referenciado como R400, foi de grau severo com

formação de halo com 1,1 cm de diâmetro. Este dado suporta a avaliação da possível

causa do grau de irritação da nanoemulsão, como consequência do grau irritante do

Alkest® CSO 400, empregado na formulação. A maioria dos tensoativos induz a

reações irritantes na pele, pois provoca alterações bioquímicas como dissolução das

membranas lipídicas que perdem sua capacidade de barreira aumentando a sua

permeabilidade, podendo levar a lise celular quando o tensoativo se encontra em altas

concentrações (EFFENDY; MAIBACH, 1996).


ferruginea

O perfil de liberação in vitro de sistemas coloidais contendo fármacos é uma

caracterização físico-química muito importante, pois além de prever a performance in

vivo, pode ser correlacionada à microestrutura do veículo, descrevendo o

comportamento estrutural da formulação em escala microscópica e as possíveis

interações entre o fármaco e o veículo (MORAIS; BURGESS, 2014).

Para a execução do ensaio de liberação foi escolhida a membrana sintética de

acetato de celulose por ser inerte e recomendada pelo FDA (FDA, 1997) e como meio

receptor uma solução hidroalcoólica 70%, por ter sido capaz de proporcionar a

condição sink para a dissolução dos marcadores do extrato, AMA e AMB. Como

amostra foi usado 300 mg de cada formulação teste, por ser esta a capacidade do

suporte para a amostra nas células.

Conforme observado no perfil de liberação do extrato na concentração de

0,13% em propilenoglicol (Figura 27), a liberação do AMB ocorreu após 2 h de ensaio,

enquanto o AMA foi liberado a partir de 4 h de análise. Por ser a amostra uma solução,

o perfil observado pode estar relacionado com a resistência dos marcadores em

transpor a membrana, devido às características físico-químicas destas moléculas e da

própria membrana. A membrana se apresenta com característica hidrofílica sendo

uma barreira a passagem dos marcadores AMA e AMB, que são compostos fenólicos

134

e com características hidrofóbicas. Estes compostos químicos são muito reativos

podendo formar ligações de hidrogênio (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2004)

e consequente lentificação na liberação para o meio receptor. Este mesmo

comportamento foi observado por Plessis e colaboradores (2001), quando avaliou a

liberação de diversos compostos fenólicos através de membrana de silicone, que foi

saturada com octanol ou tolueno para que interagissem com os compostos fenólicos

e influenciassem nas suas absorções através da membrana. Este trabalho demonstra

o grande efeito das ligações de hidrogênio quando a membrana pode interagir com a

substância que irá permeá-la (PLESSIS et al., 2001). A diferença nos tempos de

detecção entre o AMA e o AMB, se deve, provavelmente, a maior reatividade do AMA

em formar ligações de hidrogênio em relação ao AMB, o que retardou mais a sua

liberação.

Figura 27 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do extrato mole de R. ferruginea

0,13% em propilenoglicol. n= 6 células.

A Figura 28 apresenta o perfil de liberação dos marcadores AMA e AMB

presentes no extrato mole de R. ferruginea incorporado na nanoemulsão. Para ambos

os marcadores, foi observado um maior lag time com início da liberação mais

retardado do que o observado no perfil de liberação da solução de extrato. Conforme

apresentado na Figura 28, o AMB e o AMA foram liberados a partir de 6 e 12 h de

análise, respectivamente.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

1 2 4 6 8 12 24

Qu

an

tid

ad

e li

ber

ad

a µ

g/cm

²

Tempo (horas)

AMB AMA

135

Figura 28 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB da nanoemulsão com 0,13% de

extrato mole de R. ferruginea. n= 6 células.

Um comportamento de liberação semelhante ao das nanoemulsões é

observado no perfil de liberação dos cremes convencionais contendo o extrato (Figura

29). A liberação dos marcadores AMB e AMA ocorreu a partir de 4 e 12 horas,

respectivamente. Em relação ao marcador AMB, o início da liberação foi mais lento

do que a partir da solução, porém mais rápido do que quando o extrato foi incorporado

nas nanoemulsões. Os resultados indicam que as nanoemulsões possuem uma maior

capacidade de retenção dos ativos na fase interna oleosa, provavelmente pelo seu

grau de organização na interface, assim como, a maior afinidade dos marcadores pela

fase interna do sistema.

Figura 29 - Perfil de liberação in vitro dos marcadores AMA e AMB do creme com 0,13% de extrato

mole de R. ferruginea. n= 6 células.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

1 2 4 6 8 12 24

Qu

an

tid

ad

e li

ber

ad

a µ

g/cm

²

Tempo (horas)

AMB AMA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1 2 4 6 8 12 24

Qu

an

tid

ad

e lI

ber

ad

a u

g/cm

²

Tempo (horas)

AMB AMA

136

Para análise cinética do perfil de liberação de fármacos a partir de formas

farmacêuticas são empregados diferentes modelos matemáticos. No entanto, a

seleção do melhor modelo que descreve corretamente a liberação de fármacos é

muito difícil, em função de diversas etapas envolvidas durante o transporte e liberação

dos fármacos no interior de uma forma farmacêutica. Como parâmetro para escolha

do modelo matemático em que o perfil de liberação apresenta melhor ajuste é utilizado

o valor de coeficiente de determinação (R²), não se devendo utilizar modelos em que

o coeficiente seja baixo. Para a descrição adequada de um perfil de liberação,

recomenda-se o uso de pelo menos 5 tempos de dissolução (COSTA, 2002).

Neste estudo, para analisar o mecanismo de liberação dos marcadores do

extrato a partir das formulações, os perfis de liberação foram ajustados em diferentes

modelos matemáticos (ordem zero, primeira ordem, Higuchi e Peppas). A análise

cinética foi realizada com os resultados da quantidade de marcadores dissolvidos

após período de lag time, ou seja, após o início da liberação.

O perfil de liberação do AMA em todas as formulações e do AMB na solução

do extrato em propilenoglicol e no creme, apresentou um bom ajuste ao modelo

cinético de ordem zero (Tabela 13). O perfil de liberação do AMB a partir da

nanoemulsão seguiu uma cinética de acordo com o modelo da equação geral da

liberação. Este modelo é empregado para analisar a liberação de formas

farmacêuticas poliméricas, quando o mecanismo de liberação não é bem conhecido

ou quando estão envolvidos mais que um mecanismo de liberação (COSTA, 2002). A

partir do ajuste a este modelo e a partir do expoente de liberação obtido (n = 1,995),

observou-se que o mecanismo de liberação do AMB a partir da nanoemulsão segue

super transporte caso-II, em que a liberação é controlada somente pelo relaxamento

das cadeias poliméricas (BRUSCHI et al., 2007; COSTA, 2002).

O fluxo de liberação dos marcadores em cada formulação foi obtido a partir da

constante de liberação K no modelo cinético com melhor ajuste. Os resultados obtidos

confirmam que as emulsões lentificam a liberação dos marcadores, pois o fluxo de

liberação destes quando incorporados no creme, assim como, na nanoemulsão, é

menor do que o fluxo de liberação a partir da solução do extrato em propilenoglicol.

Esta liberação retardada proporcionada pelas emulsões é baseada na lipofilicidade do

fármaco incorporado na fase dispersa (disperso ou dissolvido na fase interna da

emulsão), reduzindo a cedência destes para a membrana e o meio de liberação

(MORAIS; BURGESS, 2014).

137

Comparando o fluxo de liberação dos marcadores a partir do creme e da

nanoemulsão, independente do modelo matemático empregado para o ajuste, foi

observado que a nanoemulsão diminuiu ainda mais o fluxo de liberação, prolongando

a liberação dos marcadores.

Para um fármaco lipofílico dissolvido ou disperso na fase interna oleosa de uma

emulsão O/A, durante o processo de liberação, deve, inicialmente, se particionar para

a fase externa aquosa da emulsão. No caso das nanoemulsões, emulsões com

tamanho da fase interna muito pequeno, espera-se uma liberação mais rápida que

para macroemulsões (MORAIS; BURGESS, 2014). No entanto, o modo de preparo

da nanoemulsão, em que o extrato é incorporado na fase oleosa antes da formação

da emulsão, pode resultar na maior proteção aos marcadores lipofílicos AMA e AMB,

fazendo com que a liberação seja retardada.

Além do efeito da lipofilicidade dos marcadores, o uso do tensoativo polimérico

na composição da nanoemulsão deve ser considerado ao se avaliar o perfil de

liberação. Os tensoativos poliméricos ao formarem um filme espesso na interface da

fase interna proporcionam maior estabilidade e uma forte barreira ao transporte de

fármacos (MORAIS; BURGESS, 2014; NAM et al., 2012). O uso do tensoativo não-

iônico Alkest® CSO 400 para a formação das nanogotículas provavelmente formou um

filme interfacial polimérico nas gotículas o que pode ter retardado o transporte dos

marcadores na interface do sistema e consequentemente seu fluxo. Provavelmente,

não pode ter ocorrido influência do polímero Sepigel® adicionado a fase externa da

nanoemulsão, já que o mesmo foi adicionado à nanoemulsão já formada, no entanto,

seriam necessários testes para confirmar esta probabilidade.

A incorporação do extrato no creme convencional foi realizada após o veículo

estar pronto. Este procedimento pode não promover a total incorporação do extrato

na fase interna da emulsão, embora os marcadores possuam alto coeficiente de

particção. Isto por ter resultado também no maior fluxo dos marcadores para esta

amostra.

Comparando o perfil de liberação entre as formulações, a nanoemulsão

proporciona uma liberação mais lenta para os marcadores do que o creme

convencional, devido a provável incorporação adequada do marcador na fase interna

e a formação das estruturas poliméricas interfaciais das gotículas.

138

Tabela 13 - Análise dos dados obtidos com o ensaio de liberação in vitro do AMB e AMA a partir do extrato mole em propilenoglicol, do creme e da nanoemulsão

contendo extrato.

Formulação Marcador

Modelos matemáticos

Ordem zero Primeira ordem Higuchi Equação Geral de Liberação

R2 K R2 K R2 K R2 K n

Solução AMB 0,9593 0,0264 0,9548 2,49.10-4 0,7313 0,0916 0,9547 0,0250 0,9993

AMA 0,9751 0,0255 0,8767 1,88.10-4 0,5463 0,0665 0,9496 0,0049 1,4582

Creme AMB 0,9984 0,0404 0,8836 0,0003 0,5357 0,1018 0,9910 0,0048 1,6124

AMA 1,0000 0,0142 0,5997 5,67.10-5 0,3333 0,0231 0,9951 1,72.10-7 4,342

Nanoemulsão AMB 0,9897 0,0367 0,8085 0,0002 0,4664 0,0830 0,9913 0,0018 1,995

AMA 1,0000 0,0042 0,5999 1,67.10-5 0,3333 0,0068 0,9951 5,06.10-8 4,342

139

5.10 Estudo de permeação cutânea in vitro das nanoemulsões contendo extrato

de R. ferruginea

A metodologia empregada para estudar a permeação cutânea in vitro das

nanoemulsões, usando as células de Franz, é um experimento clássico que se baseia

na avaliação da difusão passiva dentro e através da pele não viável. Neste modelo o

transporte do fármaco é controlado pelo seu coeficiente de difusão dentro dos lipídeos

do estrato córneo, pela retenção através da adsorção pela queratina dos corneócitos

e o coeficiente de partição entre a formulação que contém o fármaco e os lipídeos do

estrato córneo (BOLZINGER et al., 2012).

Parâmetros físico-químicos do fármaco como massa molar, número de ligações

de hidrogênio doadoras e receptoras, e o coeficiente de partição octanol-água (Log

de P), têm relação com o coeficiente de permeabilidade cutânea (BOLZINGER et al.,

2012).

O estudo de permeação cutânea com a nanoemulsão e o creme contendo

extrato e a solução do extrato em propilenoglicol, que é um promotor de permeação

cutânea, revelou a ausência dos marcadores AMA e AMB no meio receptor, no estrato

córneo e na pele. A presença dos marcadores foi encontrada na formulação

remanescente e nas duas primeiras fitas adesivas que foram aderidas à pele para

extração dos resquícios da formulação, após o término do estudo, conforme

apresentado na Tabela 14.

Tabela 14 - Resultados do estudo de permeação cutânea para a nanoemulsão e creme contendo extrato de R. ferruginea e para o extrato de R. ferruginea em propilenoglicol, em modelo de célula de Franz, usando pele de porco.

Formulações Formulação Remanescente1

AMA (µg/cm²)

Porcentagem Retida AMA (%)

AMB (µg/cm²)

Porcentagem Retida AMB (%)

Extrato Mole de R. ferruginea 0,13% em propilenoglicol

8,07 ± 1,72 13,14 ± 2,80 13,09 ± 2,60 11,69 ± 2,33

Creme 0,13% de R. ferruginea

1,75 ± 0,49 12,37 ± 3,75 2,21 ± 0,53 16,09 ± 4,30

Nanoemulsão 0,13% de R. ferruginea

2,86 ± 0,80 15,97 ± 4,34 3,01 ± 0,73 18,52 ± 4,19

Nota: 1A formulação remanescente corresponde ao excesso de formulação sobre a pele no término do estudo juntamente com as duas primeiras fitas adesivas que foram aderidas a pele de porco.

140

Observando os resultados das porcentagens retidas dos marcadores nas

formulações foi verificado que houve a cedência dos marcadores a partir das

formulações. Os marcadores AMA e AMB são derivados de ácidos benzoicos

prenilados (GAZONI, 2009), ou seja, compostos fenólicos (NOVAES, 2011), os quais

são muito suscetíveis a formação de ligações de hidrogênio (CARVALHO;

GOSMANN; SCHENKEL, 2004) e apresentam alta lipofilicidade (ZERMIANI, 2014).

Estas características dos marcadores originam diversas hipóteses quanto ao

resultado encontrado para o estudo de permeação cutânea.

A presença de grupos ligantes de hidrogênio nas substâncias, retardam a sua

penetração dérmica, possivelmente devido a interação destes grupos com os grupos

–COOH dos ácidos graxos e –OH dos grupos amidas das ceramidas presentes nos

lipídeos do espaço intercelular do estrato córneo (PLESSIS et al., 2001). Segundo

resultados encontrados para um estudo sobre a influência do número e a substituição

do grupo –OH, em uma seleção de fenóis sobre a permeação in vitro em epiderme

humana, estas ligações de hidrogênio afetam negativamente o coeficiente de difusão

das substâncias, sendo dependente da simetria das substituições do grupo –OH

(PLESSIS et al., 2002). Os marcadores AMA e AMB por pertencerem aos compostos

fenólicos, podem sofrer estas interações moleculares com os lipídeos do estrato

córneo, no entanto, não foi detectado a presença dos mesmos na análise do estrato

córneo. Isto sugere que esta interação ocorreu, provavelmente, nas camadas bem

superficiais do estrato córneo, a qual foi extraída nas primeiras duas fitas adesivas e

quantificadas juntamente com a formulação remanescente.

Quanto à característica lipofílica dos marcadores AMA e AMB, possivelmente,

não afetou a permeação dos marcadores, já que no estudo de liberação in vitro

ocorreu a partição dos ácidos a partir das formulações.

Para a nanoemulsão, deve-se também levar em conta a influência gerada pelo

tensoativo polimérico presente em sua composição, o que pode ser observado na

maior porcentagem retida dos marcadores nesta formulação. O filme polimérico

interfacial formado pelo Alkest® CSO 400 pode ter dificultado a eficiência do transporte

dos marcadores para a pele. Na literatura sugere-se o uso de um sistema híbrido

lipídeo-polímero para otimizar a nanoemulsão como veículo tópico, além de melhorar

a estabilidade da dispersão (NAM et al., 2012).

Estes resultados encontrados, porém, não comprometeram a atividade

farmacológica anti-inflamatória tópica, conforme descrito no item 5.11. O que pode

141

indicar a possibilidade de limitações no método analítico empregado para a

quantificação dos marcadores para este ensaio, já que houve a cedência dos

marcadores a partir da formulação. Sugere-se, então, estudos aprofundados a

respeito da permeação dos marcadores AMA e AMB, com o objetivo de confirmar as

possíveis variáveis que podem influenciar a permeação cutânea dos mesmos.

5.11 Ensaios farmacológicos

O método do edema de orelha é frequentemente empregado para o estudo do

potencial efeito anti-edematogênico de possíveis agentes anti-inflamatórios tópicos.

Neste método há a indução de reações inflamatórias dérmicas, evidenciada pelo

aumento da espessura da orelha, onde um sensibilizante químico é aplicado,

refletindo a dermatite alérgica de contato (KIMBER et al., 1999; LEITE et al., 2011). O

óleo de cróton, agente sensibilizante escolhido para este estudo, contém 12-O-

tetradecanoilforbol acetato (TPA) como principal agente irritante na sua composição

(LEITE et al., 2011; OLIVEIRA, 2009). É necessária uma única aplicação do óleo de

cróton para a obtenção de resultados de atividade antiedematogênica de compostos

em processos inflamatórios agudos, tendo como primeiro sinal de irri tação cutânea e

inflamação local o edema (LEITE et al., 2011; OTUKI et al., 2011). A exposição da

pele ao TPA induz respostas que englobam uma forte reação inflamatória similar

aquelas observada em várias doenças cutâneas severas (PASSOS et al., 2013), com

ativação da proteína kinase C que leva a ativação de outras cascatas enzimáticas que

por sua vez liberam o fator de ativação plaquetária (PAF), o ácido araquidônico (AA)

e seus metabólitos como as prostaglandinas e leucotrienos (HORINOUCHI et al.,

2013; LEITE et al., 2011). Estes eventos, juntamente com as citocinas geradas pela

indução com TPA, que inclui TNF, IL-1β, KC, MIP-2 (PASSOS et al., 2013), levam aos

sinais microscópicos da inflamação aguda como aumento da permeabilidade vascular,

vasodilatação e migração celular (HORINOUCHI et al., 2013; LEITE et al., 2011).

Para definição da concentração de extrato a ser incorporada na nanoemulsão

na fase da sua otimização, item 5.5, inicialmente foi realizado teste de edema de

orelha incorporando o extrato mole de R. ferruginea em um veículo de creme

convencional, formulação descrita no item 4.5.3, Quadro 4. O resultado encontrado,

representado na Figura 30, indica redução do edema induzido pelo óleo de cróton, e

com base neste resultado a concentração de extrato escolhida para incorporação na

142

nanoemulsão foi de 0,5%, pois foi a concentração intermediária que apresentou efeito

antiedematogênico, não apresentando diferença significativas entre as concentrações

empregadas no ensaio.

Figura 30 - Efeito dos cremes contendo extrato mole de R. ferruginea (RF 0,25%, 0,5% e 1,0%) e AMB (0,5% e 0,1%) administrados topicamente sobre edema de orelha induzido pelo óleo de cróton.

Nota: Cada barra representa a média S.E.M. para 8 animais. Os símbolos gráficos indicam os níveis

de significância quando comparado com o grupo controle. Significativamente diferente do controle, *** para P < 0,0001, ** para P < 0,01 e * para P < 0,05.

Posteriormente, novo teste de avaliação anti-inflamatória foi realizado para

definição da concentração de extrato de R. ferruginea a ser incorporado na

nanoemulsão com formulação definida no item 4.6 Quadro 6 e no creme convencional,

formulação descrita no item 4.5.3 Quadro 4, com o objetivo de avaliar a ação anti-

inflamatória confrontando as mesmas concentrações de extrato em veículos

diferentes. O resultado encontrado, representado na Figura 31, indica que a

concentração de 0,13% de extrato apresentou atividade anti-inflamatória mais efetiva

quando incorporado no veículo nanoemulsão. Quando se compara a inibição do

edema provocada pela ação do extrato incorporado no creme convencional, não

houve diferença estatística entre as concentrações testadas. Para averiguar a

influência na ação anti-inflamatória do extrato mole das cascas de R. ferruginea

incorporado em diferentes veículos, a concentração de extrato incorporada na

nanoemulsão e creme convencional foi de 0,13%.

Conforme observado na Figura 31, a aplicação tópica do óleo de cróton

promoveu a formação do edema nas orelhas do grupo controle, apresentando uma

143

espessura média de 455,5 ± 36,65 µm. De acordo com Patrick e colaboradores (1987),

a aplicação do óleo de cróton desenvolve um edema auricular após 1h da aplicação,

no entanto, seu efeito máximo se dá após 6 horas.

Figura 31 - Efeito das nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R. ferruginea e dexametasona administrados topicamente sobre edema de orelha induzido por óleo de cróton. O edema de orelha foi mensurado após 6 h da indução com óleo de cróton.

Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de significância quando comparado com o grupo controle e (#) indica o nível de significância quando comparado entre os grupos. Significativamente diferentes do controle, *** para P < 0,0001 e diferentes

entre os grupos, # para P < 0,05.

A presença do extrato da R. ferruginea proporcionou a redução do edema em

todas as orelhas tratadas com a nanoemulsão e o creme, conforme observa-se na

Tabela 15 que indica a porcentagem de inibição do edema nos grupos tratados,

demonstrando a atividade anti-inflamatória tópica das formulações contendo o extrato.

Esse resultado também demonstra que os veículos, nanoemulsão branco e creme

branco, não causaram interferência na ação.

144

Tabela 15 - Porcentagem de inibição e média da espessura do edema de orelha induzido pelo óleo de

cróton 2,5% nos grupos tratados com as nanoemulsões e cremes contendo extrato mole de R. ferruginea.

Tratamento Inibição do edema

(%)

Espessura ± s

(µm)

Nanoemulsão 0,13% 90,50% 43,25 ± 1,6

Nanoemulsão 0,25% 64,98% 159,5 ± 41,02

Creme 0,13% 56,53% 198,0 ± 28,8

Creme 0,25% 58,64% 188,4 ± 38,86

Creme 0,5% 64,65% 161,0 ± 22,2

Dexametasona 0,1% 97,80% 10,0 ± 10,0

A inibição do edema no grupo tratado com a nanoemulsão com 0,13% de

extrato, foi superior a todas as outras formulações contendo extrato da R. ferruginea.

Comparando os resultados entre as nanoemulsões, a menor concentração de 0,13%

de extrato, foi mais efetiva em relação à concentração de 0,25% de extrato, ou seja,

a atividade anti-inflamatória tópica do extrato de R. ferruginea veiculado na

nanoemulsão foi potencializada. Esta diferença de ação entre as nanoemulsões é,

possivelmente, devido a melhor incorporação e/ou dissolução na fase oleosa durante

o seu preparo, pois nesta concentração, 0,13%, o extrato demonstrou melhor

homogeneização em relação as concentrações maiores.

Comparando os resultados entre os diferentes veículos, nanoemulsão e creme,

ficou evidente que a nanoemulsão se apresenta como melhor veículo em comparação

ao creme, 1,6% mais eficaz, com significativa diferença estatística quanto ao efeito

inibitório do edema. Confirmando mais uma vez a potencialização do efeito anti-

inflamatório do extrato quando incorporado em nanoemulsão.

A resposta antiedematogênica dos cremes contendo o extrato da R. ferruginea,

não apresentou diferença estatística entre as diferentes concentrações, conforme

verificado na Figura 31.

Estes resultados demonstram a ação anti-inflamatória tópica do extrato de R.

ferruginea em modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton. Esta atividade

farmacológica deve-se possivelmente a presença do AMA e AMB no extrato mole da

planta, pois estudos anteriores, com estes compostos isolados, confirmaram a

atividade anti-inflamatória de ambos em modelo de edema de orelha induzido por TPA

(DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; MIZUSHINA et al., 2000). No entanto, deve-

145

se levar em conta que nesse estudo foi utilizado o extrato da planta, o qual contém

inúmeros componentes desconhecidos, ainda, e podem atuar sinergicamente com os

marcadores conhecidos proporcionando esta atividade farmacológica. A ação

sinérgica entre os componentes do extrato de R. ferruginea ficou claro no estudo

realizado por Baccarin (2010), em que a avaliação da atividade farmacológica quanto

à antinocicepção, demonstrou que o resultado foi superior no extrato seco que não

continha maior concentração do marcador AMB.

Para a realização dos demais testes farmacológicos foi selecionado como

grupo de tratamento, a nanoemulsão com 0,13% de extrato da R. ferruginea, pois esta

forma farmacêutica demonstrou melhor ação farmacológica em relação a todos os

demais grupos. Para verificar a influência do veículo na ação anti-inflamatória tópica

do extrato, optou-se por confrontar a nanoemulsão com o creme incorporando a

mesma concentração do extrato de R. ferruginea, ou seja, 0,13%.

Histologicamente, a análise do tecido das orelhas no grupo controle, tratado

somente com óleo de cróton 2,5%, quando comparado ao naive, evidencia a derme

mais espessa, com elevada concentração de infiltrado celular e maior extravasamento

plasmático, caracterizando o edema visualizado macroscopicamente (figuras 32 A e

B). Estes achados ganham suporte com estudo realizado por Patrick e colaboradores

(1987), que observaram, após 6 h da aplicação do óleo de cróton, um aumento do

número de vasos sanguíneos, edema moderado a severo, com um difuso infiltrado

celular.

Os grupos tratados com creme e nanoemulsão contendo 0,13% de extrato de

R. ferruginea (Figuras 32 E e G), apresentaram-se histologicamante com redução do

extravasamento plasmático e espessura dérmica, em relação ao grupo controle,

demonstrando a atividade anti-inflamatória tópica. Apresentam também semelhante

concentração de células em relação aos grupos que receberam creme e nanoemulsão

sem extrato (Figuras 32 D e F). Visualiza-se que não houve redução da espessura

dérmica e do extravasamento plasmático nos grupos tratados com os veículos creme

e nanoemulsão sem extrato, em relação ao grupo controle. Estas observações

confirmam que a presença do extrato de R. ferruginea possui efeito anti-inflamatório.

Os resultados histológicos confirmam os resultados macroscópicos encontrados na

avaliação da atividade anti-inflamatória tópica pelo método do edema de orelha

induzido por óleo de cróton.

146

Figura 32 - Fotomicrografias dos cortes histológicos das orelhas dos camundongos, corados em hematoxilina-eosina (HE), 6 horas após a indução do edema

com óleo de cróton 2,5% (4x e 10x). (A) naive, (B) controle negativo, (C) controle positivo tratado com dexametasona 0,1%, (D) tratamento com veículo-creme, (E) tratamento com creme 0,13% extrato de R. ferruginea, (F) tratamento com veículo-nanoemulsão, (G) tratamento com nanoemulsão 0,13% extrato de R. ferruginea. As setas indicam a presença de infiltrado celular e as barras vermelhas indicam a espessura dérmica.

147

Para elucidar os mecanismos envolvidos na inibição do edema de orelha

provocado pela nanoemulsão contendo extrato de R. ferruginea, foi realizada a

quantificação de algumas citocinas envolvidas em um processo inflamatório como a

IL-1β, o TNF e a KC, além da avaliação da atividade enzimática da MPO.

A diferença na quantidade de infiltrado celular nos grupos tratados pode ser

elucidada pela avaliação indireta da atividade da MPO, a qual faz referência somente

a infiltração de neutrófilos, pois a MPO é uma enzima sinalizadora da infiltração

(HORINOUCHI et al., 2013) e sobrevivência de neutrófilos (VEEN; WINTHER;

HEERINGA, 2009).

No resultado obtido pela medida indireta da atividade da MPO neste estudo,

Figura 33, o grupo que recebeu o óleo de cróton 2,5% apresentou elevada atividade

da MPO, indicando o estímulo promovido pela aplicação do óleo de cróton a liberação

desta enzima pelos neutrófilos. Percebe-se que houve significativa redução da

atividade enzimática no grupo tratado com a nanoemulsão com 0,13% de extrato

(concentração média= 0,355 ± 0,06 DO/mg correspondendo a 64,60% de inibição),

tanto em relação ao grupo controle como quando comparado com o grupo tratado com

o creme com 0,13% de extrato (concentração média= 0,689 ± 0,02 DO/mg

correspondendo a 31,30% de inibição). Estes resultados demonstram o efeito da

nanoemulsão com 0,13% de extrato em reduzir a atividade da MPO,

consequentemente promovendo a redução da infiltração e migração de neutrófilos no

local da inflamação, além de evidenciar melhor resultado quando o veículo é a

nanoemulsão e não o creme.

148

Figura 33 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a

atividade da mieloperoxidase no sobrenadante de homogeneizados das orelhas tratadas com óleo de cróton 2,5%. A atividade da MPO foi mensurada após 6 h da indução pelo óleo de cróton.

Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M. para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de

significância quando comparado com o grupo controle e (#) quando comparado entre os grupos. Significativamente diferente do controle, *** para P < 0,0001, * para P < 0,05, significativamente diferente entre os grupos, ## para < 0,01.

Estas observações se confirmam também analisando os resultados obtidos

através da quantificação da KC, uma quimiocina responsável pelo recrutamento de

neutrófilos (FILIPPO et al., 2008), representada na Figura 34. A quantificação da KC

realizada no grupo controle demonstra uma quantidade elevada como resposta a

aplicação do óleo de cróton. O grupo tratado com a nanoemulsão contendo 0,13% de

extrato apresentou redução na quantificação da quimiocina (concentração média=

365,96 ± 35,6 pg/mg correspondendo a 42,72% de inibição) assim como o creme com

0,13% do extrato (concentração média= 268,97 ± 72,73 pg/mg correspondendo a

57,90% de inibição), não apresentando diferença estatística significativa entre si.

149

Figura 34 - Efeito da nanoemulsão e creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a inibição

da quimiocina derivada de queratinócitos (KC) induzida por óleo de cróton 2,5% em orelhas de camundongos.

Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M. para 6 animais. Os símbolos gráficos indicam os níveis de significância quando comparado com o grupo controle. Significativamente diferente do controle, ** para P < 0,01.

O tratamento com veículos tópicos contendo extrato da R. ferruginea inibe a

infiltração e migração de neutrófilos para o local da inflamação. A ação do extrato de

R. ferruginea é melhorada quando veiculado em nanoemulsão, em relação a inibição

da enzima mieloperoxidase liberada pelos neutrófilos. Não se observou diferença na

ação do extrato entre os veículos com relação ao recrutamento de neutrófilos,

representada pela inibição da quimiocina KC.

Os queratinócitos quando expostos a agentes irritantes ou sensibilizantes

respondem através da síntese e liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e

TNF, que induzem as células endoteliais a expressarem moléculas de adesão

necessárias ao acúmulo de células inflamatórias (FUCHS et al., 2001).

A análise da quantificação das citocinas IL-1β e TNF, representada pela Figura

35, evidencia diferenças na atividade inibitória entre os grupos tratados com a

nanoemulsão e o creme contendo o extrato da R. ferruginea. A nanoemulsão

contendo o extrato reduziu a quantidade de IL-1β (concentração média= 668,49 ± 39,4

pg/mg) e TNF (concentração média 251,24 ± 10,64 pg/mg) correspondendo a 40,96%

e 42,23%, respectivamente.

Comparando-se a ação do extrato nos diferentes veículos, percebe-se que a

nanoemulsão foi superior ao creme com relação a inibição da TNF, com diferença

150

estatística significativa, o creme inibiu 28,72% (concentração média= 309,95 ± 2,47

pg/mg). Para IL-1β, a inibição do creme com extrato foi de 45,89% (concentração

média= 612,72 ± 21,52 pg/mg), sem diferença estatística significativa. Como o TNF

também é produzido a partir da MPO ativa (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009),

este resultado tem estreita ligação com a maior redução da MPO observado no grupo

tratado com a nanoemulsão com 0,13% de extrato.

Figura 35 - Efeito da nanoemulsão e do creme contendo 0,13% de extrato de R. ferruginea sobre a produção de IL-1β e TNF, induzida por óleo de cróton 2,5% em orelhas de camundongos.

Nota: Cada barra representa a média ± S.E.M para 6 animais. O símbolo gráfico (*) indica o nível de significância quando comparado com o grupo controle e (#) quando comparado entre os grupos. Significativamente diferente do controle, *** para P < 0,0001, significativamente diferente entre os

grupos, # para P < 0,05.

Estes resultados demonstram a ação anti-inflamatória tópica do extrato mole

de R. ferruginea veiculada em nanoemulsão e creme, com redução do edema,

infiltrado celular e redução da quantificação de citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF,

redução da atividade da MPO e da quimiocina KC. Em relação a veiculação do extrato

em nanoemulsão e creme, a nanoemulsão demonstrou melhor ação anti-inflamatória

que o creme, quanto à inibição do edema de orelha induzido pelo óleo de cróton tanto

macroscopicamente como microscopicamente, além de melhor ação inibitória da

atividade da MPO e redução na produção de TNF. Estes achados demonstram que a

ação anti-inflamatória tópica do extrato mole da R. ferruginea testada em modelo de

edema de orelha induzido por óleo de cróton, é influenciada pelo veículo e sua

provável interação com o sistema fisiológico da pele.

151

6 CONCLUSÕES

A coleta das cascas de R. ferruginea foi padronizada para árvores com 35 cm

de diâmetro e no tronco à altura de 20 cm do chão, devido ao maior teor de

marcadores. O marcador AMA apresenta-se em maior concentração que o AMB nas

cascas de R. ferruginea. Foi obtido extrato mole das cascas de R. ferruginea com teor

de 37,34 ± 0,09 mg/g de AMB de 40,04 ± 0,02 mg/g de AMA.

Foi desenvolvida a nanoemulsão a partir da seleção da melhor e mais estável

proporção de componentes em um diagrama de fases pseudoternário. A nanoemulsão

foi desenvolvida pelo método de inversão de fases, usando como componente oleoso

o miristato de isopropila, a mistura de tensoativos Alkest® CSO400 e o Span® 80. O

extrato mole das cascas de R. ferruginea foi incorporado na fase oleosa da

nanoemulsão. Para adequação da viscosidade da nanoemulsão para aplicação

tópica, foi usado um doador de consistência.

A nanoemulsão contendo extrato apresentou textura cremosa na cor caramelo

claro, com pH de 5,24 ± 0,02, o tamanho médio da fase interna foi de 47,88 ± 8,20 nm

com índice de polidispersibilidade adequado no valor de 0,228 e potencial zeta de -

34,7 ± 1,15 mV. A análise morfológica por MET, confirmou que o sistema é pouco

disperso sem a formação de agregados com as gotículas na forma esférica. O sistema

apresentou comportamento reológico pseudoplástico tixotrópico, com viscosidade

média de 5773,28 ± 950,86 mPa.s-1. O teor dos ácidos AMA e AMB foi de 54,10 ± 0,08

μg/g e 53,03 ± 0,03 μg/g de formulação, respectivamente.

O estudo de estabilidade acelerada revelou a necessidade de adequações

farmacotécnicas futuras para assegurar a estabilidade da nanoemulsão incorporando

o extrato mole de R. ferruginea, pois houve um decréscimo de 51,12% para o AMA e

de 15,83% para o AMB após 180 dias a 40 °C, com diminuição de 98,50% na

viscosidade aparente.

A nanoemulsão veículo e contendo extrato apresentaram moderado grau de

irritação cutânea in vitro. O extrato mole não desenvolveu irritação no ensaio de

difusão em ágar. Estes resultados demonstram que o grau de irritação das

nanoemulsões se deve a composição das mesmas.

152

O ensaio de liberação in vitro demonstrou liberação mais lenta dos marcadores

AMA e AMB quando incorporados na nanoemulsão.

Os marcadores AMA e AMB não permearam através da pele de porco no

estudo de permeação cutânea, sendo detectados somente na formulação

remanescente. Sugere-se novos estudos aprofundados quanto a influência de

variáveis na permeação cutânea dos marcadores do extrato em nanoemulsão.

A atividade anti-inflamatória tópica foi maior para a nanoemulsão em

comparação ao creme convencional com a mesma concentração de extrato (0,13%),

com inibição do edema de orelha de 90,5 e 56,53%, respectivamente. O resultado da

análise histológica dos tecidos inflamados não demonstrou diferenças visuais

significativas entre o tratamento com o creme convencional e a nanoemulsão

contendo extrato. A quantificação de citocinas e da atividade da MPO, demonstrou

que a nanoemulsão contendo extrato possui melhor atividade inibitória na liberação

de TNF e MPO, não havendo diferença significativa, entre os tratamentos, quanto à

inibição da liberação de KC e IL-1β. Portanto, a incorporação do extrato em um

sistema nanoemulsionado promoveu uma maior eficácia anti-inflamatória tópica, em

modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton, em relação à emulsão

convencional não diferindo estatisticamente do creme contendo 0,1% de

dexametasona, demonstrando o seu potencial anti-inflamatório tópico.

Sugere-se a continuidade dos estudos buscando o aprimoramento

farmacotécnico da nanoemulsão para adequá-la a incorporação do extrato de R.

ferruginea e também buscar maiores evidências quanto a permeação cutânea do AMA

e AMB presentes no extrato quando incorporado em nanoemulsão.

153

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ANEXO A – Parecer Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA-

UNIVALI

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