UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE

TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

ANA KARLA LIMA FREIRE

MANAUS 2011

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ANA KARLA LIMA FREIRE

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE

TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza Co-orientador: Prof. Dr. Bodo Wanke

MANAUS

2011

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FICHA CATALOGRÁFICA Catalogação na Fonte: Auxiliadora Queiroz Batista – Bibliotecária - CRB11/ 596.

F866c Freire, Ana Karla Lima . Caracterização molecular de agentes causadores de Criptococose Isolados de pacientes atendidos em uma unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas / Ana Karla Lima Freire. – Manaus: UEA, 2011. 62 fl. : il ; 30 cm Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Profº. Dr. João Vicente Braga de Souza. Co-orientador: Prof°. Dr. Bodo Wanke. 1. Cryptococcus spp. 2. Genotipagem. 3. PCR-Fingerprinting.

4. URA5-RFLP. 5. ITS5/NL. I. Título. CDU 616.9

ii

FOLHA DE JULGAMENTO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA

UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS

ANA KARLA LIMA FREIRE

“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

______________________________________ Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.

Presidente

______________________________________ Profa. Ani Beatriz Jackisch Matsuura, Dra.

Membro

______________________________________ Profa. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra.

Membro

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AGRADECIMENTOS A Deus pelo sopro da vida e pelos planos, dEle, cumpridos. Aos meus pais queridos, pelo imenso amor, paciência, incentivo e suporte em todos os momentos. Ao meu noivo por todo amor, compreensão, pelas orações que nunca cessam e por fazer tudo parecer mais simples. Ao meu orientador, Dr. João Vicente Braga de Souza, pela oportunidade, aprendizado, idéias, paciência, amizade e pela chance de conhecer essa grande pessoa. Ao meu co-orientador, Dr. Bodo Wanke pela chance de compartilhar de sua experiência, conhecimento e colaboração. À Dra. Júlia Ignez Salem pela imensa gentileza na realização e otimização deste trabalho, com suas críticas e sugestões. Às minhas amigas Ivanete Sampaio e Mirlane Santos, pelos ensinamentos sobre os procedimentos. Aos funcionários dos Laboratório de Micobacteriologia e Micologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, pelo pronto auxílio. Ao Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, onde tudo começou. À Universidade do Estado do Amazonas pela qualificação profissional oferecida. À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela oportunidade concedida da utilização das instalações e materiais do Laboratório de Micologia. Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela cedência do espaço nos testes de biologia molecular. Ao INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência para a realização desta pesquisa. À Suframa e Fundação Muraki pelo apoio na estrutura deste Programa de Pós-Graduação. À CAPES pelo auxílio financeiro. À FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital n°.014/2006 PPSUS 2006.

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RESUMO

A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele, decorrente da aquisição de propágulos infectantes por via inalatória das espécies de leveduras patogênicas pertencente à classe dos Basidiomycetes e ao gênero Cryptococcus, afetando pacientes imunodeprimidos ou imunocompetentes. Embora a porta de entrada no hospedeiro humano seja o pulmão, o fungo apresenta tropismo pelo Sistema Nervoso Central (SNC), onde causa quadro grave de meningoencefalite. A partir do conhecimento de que existem 4 grupos moleculares de Cryptococcus neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e VGII, VGIII e VGIV) vem se tornando importante a identificação dos grupos incidentes em diferentes regiões geográficas do mundo. Neste sentido foi investigado quais os tipos moleculares de 60 cultivos de Cryptococcus spp., isolados de pacientes atendidos em uma unidade terciária do Estado do Amazonas, entre 2006-2010. Os isolados foram caracterizados pela PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e confirmados por PCR-RFLP do gene URA5. Avaliou-se também um protocolo experimental de PCR-RFLP utilizando como alvo a região ITS do DNAr. A presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies, foi analisada por PCR. Constatou-se que os pacientes em sua maioria são do sexo masculino (66,7%), com idade entre 16-30 anos (51,7%), portadores de HIV (75%) que apresentaram meningite (71,7%), cujos isolados de C. neoformans (66,7%) em sua maioria foram caracterizados como grupo molecular VNI (97,5%) e os de C. gattii como VGII (100%). Três isolados (5,0%) não puderam ser caracterizados por nenhum dos protocolos estudados e o protocolo experimental avaliado apenas discriminou 2 grupos moleculares de C. gattii (VGII e VGIII). Quanto aos mating types, 58 isolados foram do tipo α e apenas 2 foram do tipo a. C. neoformans do grupo molecular VNI é o principal agente etiológico. Entretanto, tem-se o encontro do grupo molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do Brasil. Além do exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para genotipagem utilizando como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente os 2 grupos moleculares de C. gattii.

Palavras-Chaves: Cryptococcus spp.; Genotipagem; PCR-Fingerprinting M13; URA5-RFLP; ITS5/NL4

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ABSTRACT Cryptococcosis is a systemic mycosis that affects deep organs and skin, resulting from the acquisition of infective propagules inhalation of pathogenic yeast species belonging to the class of Basidiomycetes and the genus Cryptococcus, affecting immunocompetent or immunocompromised patients. Althought the entrance to the human host is the lung, the fungus has tropism for Central Nervous System (CNS), where it causes severe meningoencephalitis. From the knowledge that there are four molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006-2010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting the ITS rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR. It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C. gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two were type a. C. neoformans VNI molecular group was the main etiologic agent. However, there is the meeting of the VNII molecular group has never been reported for the northern region of Brazil. Besides the above, it was found that the new methodology suggested for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region characterized only two groups of C. gattii. Key words: Cryptococcus spp., Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP, ITS5/NL4.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Imagem do ciclo de infecção por Cryptococcus spp............................... 14 Figura 2. Imagem de leveduras do Gênero Cryptococcus..................................... 19 Figura 3. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Sabouraud...................... 19 Figura 4. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Níger com produção de melanina.................................................................................................................. 20 Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB, amarelo, C. neoformans e azul, C. gattii........................................................................................................ 20 Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os Estados Brasileiros incluídos na análise................................................................. 25 Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico.................................. 33 Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA genômico................. 34 Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13...................... 35 Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5.......................................... 36 Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types................................................. 37 Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr.............................. 38

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus....... 18 Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo informações gerais, sorotipo (ST), mating type (MAT), tipo molecular (TM)........................................................................................................................ 29

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

µm Microlitros

BC British Columbia

CEP Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos

CGB Canavanina-glicina-azul de bromotimol

CR3 Complement Receptor Type 3

DNA Desoxirribonucleic Acid

dNTP Desoxirribonucleosídeo Trifosfato

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

EUA Estados Unidos da América

FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas

FMT-AM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

H Hora

HCl Ácido Clorídrico

HIV Human Immunodeficiency Virus

INPA Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

ITS Espaço Interno Transcrito

ITS5 Espaço Interno Transcrito 5

KCl Cloreto de Potássio

LCR Líquido Cefalorraquidiano

Mg Miligrama

MgCl2 Cloreto de Magnésio

Min Minuto

mL Mililitro

Nm Nanômetro

PCR Polymerase Chain Reaction

pH Potencial Hidrogeniônico

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Rpm Rotações por Minuto

S Segundo

SNC Sistema Nervoso Central

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Tris 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

U Unidade

UFC Unidade Formadora de Colônia

URA5 Urotidina Monofosfato Pirofosforilase 5

UV Ultravioleta

V Volts

VGI, VGII, VGIII, VGIV Variedade gattii do tipo I, II, III e IV

VNI,VNII, VNIII, VN IV Variedade neoformans do tipo I, II, III e IV.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 12

1.1 O Microrganismo........................................................................................... 12 1.2 A doença....................................................................................................... 13 1.3 Fatores de Virulência.................................................................................... 16 1.4 O Diagnóstico Laboratorial............................................................................ 18 1.5 A Epidemiologia e Grupos Moleculares........................................................ 21

2. OBJETIVOS..................................................................................................... 27 2.1 Geral.............................................................................................................. 27 2.2 Específicos.................................................................................................... 27 3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 28 3.1 Modelo de Estudo......................................................................................... 28 3.2 Universo de Estudo....................................................................................... 28 3.3 Procedimentos.............................................................................................. 29 3.4 Características dos Pacientes....................................................................... 39 4. RESULTADOS.................................................................................................

40

5. CONCLUSÃO..................................................................................................

56

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................

57

7. ANEXOS.......................................................................................................... 64

1

1 INTRODUÇÃO 1.1 O Microrganismo

Os estudos com Cryptococcus tiveram início em 1894, na Itália, quando Sanfelice registrou o primeiro isolado deste fungo a partir de suco de pêssego,

chamando-o de Saccharomyces neoformans1. No mesmo ano, foi relatada uma

infecção pela levedura em um paciente alemão, sendo a referida levedura chamada

de Saccharomyces hominis. Entretanto, observações posteriores demonstraram a

ausência dos ascóporos característicos do gênero Saccharomyces 2.

Atualmente, esta levedura capsulada é taxonomicamente descrita como

fazendo parte da Classe Basidiomycetes, Família Cryptococcaceae e gênero

Cryptococcus3. O gênero engloba mais de 50 espécies que se caracterizam

morfologicamente por se apresentarem na forma de levedura esférica, que variam

de 4 a 10 µm de diâmetro, possuem cápsula e reproduzem-se assexuadamente por

brotamento4.

As leveduras das espécies de Cryptococcus podem formar hifas verdadeiras

durante reprodução sexuada, mas não são considerados fungos dimórficos

verdadeiros, porque a fase filamentosa é apenas transitória, surgido após fusão

entre dois mating types: a e α resultando no estágio sexuado do fungo denominado

Filobasidiella spp5. Como patógenos, apresentam-se como intracelulares

facultativos, os quais fisiologicamente são capazes de tolerar desde baixas

temperaturas ambientais, à temperatura corpórea dos mamíferos (37°C)6.

As espécies patogênicas do gênero Cryptococcus atualmente são

classificadas em duas: C. neoformans e C. gattii. Passoni (1999) descreveu que C.

neoformans tem a capacidade de colonizar a mucosa do sistema respiratório de

pombos (Columba spp.), sem causar doença, comportando-se como endosaprófitas

naturais destas aves. A peculiar adaptação de pombos aos centros urbanos

proporciona o isolamento do fungo em fontes ambientais, inclusive em poeira

domiciliar7. Já C. gattii é encontrado isolado em espécies de árvores, principalmente

Eucalyptus camaldulensis8.

2

As duas espécies foram classificadas em cinco sorotipos: Cryptococcus

neoformans (sorotipos A, D e o híbrido AD) de distribuição cosmopolita e encontrada

com facilidade em hábitat de pombos (Columba spp.), e Cryptococcus gattii

(sorotipos B e C) predominante em regiões tropicais e subtropicais e originalmente

encontrado em restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis 9,10,11,12.

Os sorotipos B e C (C. gattii) são hábeis em infectar e causar doenças em

hospedeiros imunocompetentes, enquanto que os sorotipos A e D (C. neoformans)

ocorrem em pacientes imunocomprometidos, principalmente naqueles infectados

pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) 13.

Litvintseva et al. (2007)14 explicam que o sorotipo AD é um híbrido das

variedades A e D. Ao contrário do que se pensava, a infecção por esse sorotipo

parece ser comum. Em estudo, realizado na América do Norte, foi relatado que 7,5%

dos isolados ambientais eram sorotipo AD14. Na Europa, Dromer et al. (2007)15

observaram que 30% dos isolados pertenciam também a esse sorotipo. No Brasil a

presença do sorotipo AD foi relatada por Nishikawa et al. (2003)11, isolado tanto em

amostras de origem clínica como ambientais.

1.2 A Doença

A Criptococose, antigamente conhecida como torulose ou blastomicose

Européia, é uma micose sistêmica que acomete órgãos internos e a pele14.

O primeiro caso de infecção humana provocada por C. neoformans foi

detectado há pouco mais de 100 anos por Busse e Buschke na Alemanha.

Entretanto, a Criptococose começou a receber atenção especial a partir da década

de 80, com o aumento da população imunocomprometida decorrente da pandemia

de HIV e uso de agentes imunossupressores, para a terapia do câncer ou

transplantes de órgãos. Por esta razão, a Criptococose oportunista transformou-se

em uma infecção relativamente comum neste começo de milênio16.

Quanto à patogenia, a doença caracteriza-se pela inalação de basidiósporos

ou leveduras desidratadas infectantes que chegam até os espaços alveolares. A

3

progressão da infecção para as formas sintomáticas depende da competência

imunológica do indivíduo, da virulência do isolado e da quantidade do inóculo

fúngico inalado (Figura 1)17.

Figura 1. Imagem do ciclo de infecção por Cryptococcus spp. Fonte: www.bmolchem.wisc.edu

Mecanismos de defesa do organismo, através da ativação de macrófagos,

normalmente são suficientes para uma satisfatória e protetora resposta do

hospedeiro. Entretanto, os fatores de virulência podem tornar a resposta imunológica

ineficaz, permitindo a infecção pulmonar, bem como a subseqüente disseminação do

fungo para outros órgãos e sistemas, em especial ao Sistema Nervoso Central

(SNC)18,19.

Uma maior susceptibilidade de infecção pelo fungo é manifestada por

alterações da imunidade celular ou humoral. A infecção pulmonar é o sintoma

preliminar da aquisição da Criptococose, resultando em doença pulmonar

progressiva ou foco pulmonar assintomático, que pode conduzir à disseminação

hematogênica e mais freqüentemente à infecção do SNC ou comprometimento

cutâneo. A infiltração nodular pulmonar é o achado clínico mais freqüente da

Criptococose pulmonar20.

O neurotropismo de C. neoformans vem sendo associado com sua

capacidade em utilizar as catecolaminas (adrenalina, noradrenalina e dopamina)

como substratos necessários ao seu desenvolvimento. Isto justifica o fato de que as

ÁÁrrvvoorreess oouu OOccooss EExxccrreettaass

EEssppoorrooss IInnaallaaççããoo PPuullmmõõeess

IInnssttaallaaççããoo nnooss aallvvééoollooss

DDiisssseemmiinnaaççããoo ppaarraa oo SSiisstteemmaa NNeerrvvoossoo

CCuullttuurraa PPoossiittiivvaa

4

áreas cerebrais ricas em catecolaminas são as mais afetadas pelo Cryptococcus

durante a meningoencefalite, quadro prevalente da doença17,21.

O quadro de meningoencefalite varia de acordo com o quadro geral de saúde

dos indivíduos acometidos. Em pacientes imunocomprometidos, as manifestações

clínicas são agudas e predominantes, e em pacientes sem comprometimento

imunológico tendem a ser mais crônicas22.

A Criptococose é a infecção fúngica mais frequente e fatal em pacientes com

aids e a terceira causa de doença oportunista do SNC. Estudos multicêntricos

internacionais demonstraram que a taxa de mortalidade dos pacientes acometidos

de HIV aproximou-se de 69%, sendo que a maioria dos pacientes que foram ao

óbito, ocorreu nos primeiros 30 dias de co-infecção23. Sua prevalência varia de 2,9 a

13,3% representando importante causa de mortalidade na aids, apesar do

tratamento específico23,24.

Em indivíduos hígidos, as respostas imunológicas celular e humoral delimitam

a contaminação pela espécie C. neoformans, caracterizando um quadro

assintomático da doença. A resistência da infecção depende da sensibilização

prévia de linfócitos e posterior ativação de macrófagos e neutrófilos, além de uma

resposta humoral mediada por anticorpos opsonizantes25.

Quanto ao perfil característico dos indivíduos acometidos por Criptococose,

estudos prospectivos realizados na região Sudeste do Brasil, no período entre 1998

e 2003 relataram a presença de 96 pacientes com diagnóstico clínico-laboratorial de

Criptococose, sendo que destes a maior predominância (81,3%) foi de pacientes

portadores de aids26.

Em recentes estudos brasileiros sobre o perfil epidemiológico dos pacientes

acometidos com Criptococose por C. neoformans, constatou-se que a maioria dos

pacientes era do sexo masculino, com faixa etária de 30 a 39 anos e portadores de

HIV27,28 e que casos de infeçcão por C. gattii acometia pacientes sem

imunocomprometimento evidente29.

5

1.3 Fatores de Virulência

Os fatores de virulência estão abaixo e relacionados na Tabela 1.

1.3.1 A cápsula

A patogenicidade é determinada pela cápsula do Cryptococcus, composta

principalmente pelo polissacarídeo glicuronoxilmanana4. Este fator de virulência

impede a fagocitose e ativação do sistema complemento16. O processo fagocítico é

impelido, uma vez que o potencial zeta negativo dos componentes capsulares

decorre, e isto provoca repulsão eletrostática entre o fungo e os macrófagos30.

No meio ambiente, a cápsula possibilita a sobrevivência em condições de

baixa umidade, protegendo a levedura contra alta desidratação31.

A cápsula criptocócica fornece uma barreira física em torno da parede fúngica

e modula respostas imunes do hospedeiro em diversos níveis. O material capsular

está relacionado tanto com alterações na eficiência do processo fagocítico fúngico,

quanto com a resistência à destruição da parede celular pelos efeitos imunes,

redução na produção de citocinas pró-inflamatórias e a apresentação dos antígenos

aos linfócitos T. Este fator de virulência, ainda interfere, no funcionamento dos

componentes do complemento impossibilitando a ligação aos receptores CR3 dos

leucócitos o que prejudica a resposta humoral30,32.

1.3.2 Lacase e Melanina

As colônias de Cryptococcus, quando semeadas em Ágar Níger apresentam coloração marrom, isso foi observado pela primeira vez, em 1962 por Staib33.

Porém, o mecanismo pelo qual ocorria a produção desse pigmento, no entanto, não

havia sido estabelecido ainda33,34. Todavia, desde então, a detecção da melanina

em meio de cultura tem sido utilizada para isolamento, purificação e identificação

desse microrganismo em laboratórios de análises clínicas4.

A melanina é um fator de virulência muito estudado no gênero Cryptococcus.

Esta é um pigmento carregado negativamente, que resiste à degradação em pH

6

ácido4. Ela é responsável pela proteção da célula fúngicas, contra a ação fagocitária

dos macrófagos, atuando como antioxidante, além disso, inibe a produção de TNF-

α, citocina importante para desencadeamento da resposta imune celular35.

Tanto C. neoformans quanto C. gattii secretam a lacase, enzima dependente

de cobre, substância que catalisa a formação de melanina, quando estes

microrganismos crescem em substratos contendo compostos difenólicos5, incluindo

as catecolaminas4.

Um estudo de interrupção gênica revelou que cepas selvagens de

Cryptococcus são mais virulentas que seus mutantes albinos21, portanto a melanina

é importante na patogenicidade da Criptococose.

1.3.3 Mating Types

Cryptococcus spp. possuem dois tipos sexuais ou mating types (MAT)

complementares: MATa e MATα3.

C. neoformans e C. gattii se reproduzem assexuadamente por brotamento,

estando a grande maioria dos isolados clínicos e ambientais presentes na forma

anamórfica haplóide. Apesar disso, essa levedura pode se reproduzir

sexuadamente, correspondendo ao estado perfeito, sendo este estágio denominado

de Filobasidiella neoformans e F. bacillispora, correspondente aos anamorfos C.

neoformans e C. gattii, respectivamente3,36,37.

O MATα apresenta maior prevalência tanto em amostras clínicas como

ambientais2,4,38. Essa maior prevalência do mating type α sugere que ele tenha

vantagem seletiva permitindo maior sobrevivência do fungo no meio ambiente e

também maior virulência39.

7

Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus.

Fator de Virulência Funções no Ambiente

Funções na Patogênese

Cápsula Prevenção da dessecação

Proteção contra predadores ameboides

Anti-fagocítico

Imunomodulador

Lacase Degradação da Lignina

Proteção contra luz ultravioleta

Interferência no stress oxidativo

Resistência à morte oxidativa

Melanina Tolerância ao calor e frio

Redução da susceptibilidade à degradação enzimática

Antifagocítico

Imunomodulador

Fosfolipase Função Nutricional (ainda indefinida) Crescimento intracelular

Proteases Função Nutricional Dano Tecidual

Urease Captação de Nitrogênio Crescimento intracelular

Mating Type Reprodução Sexual Regulação dos Fatores de Virulência

Fonte: Casadevall et al., 200330.

1.4 O Diagnóstico Laboratorial

As leveduras de Cryptococcus spp. podem ser visualizadas facilmente em

espécimes clínicos como líquido cefalorraquidiano (LCR), escarro, lavado brônquico,

urina e outros tipos de secreções ou fluidos, por microscopia óptica contendo tinta

8

da China. Nesta coloração, visualiza-se a levedura no interior da cápsula (Figura 2),

uma vez que esta contrasta com a tinta40.

Figura 2. Imagem de leveduras do Gênero Cryptococcus. Fonte: www.adam.com

A microscopia é positiva quando há 103 ou 104 UFC/mL de células fúngicas.

O diagnóstico laboratorial através do teste da tinta da China tem sensibilidade de 70-

90% dos pacientes com aids, porém cai para somente 50% em pacientes

imunocompetentes17.

C. neoformans pode ser isolado em meios de cultivo que contenham uma

fonte de carbono, nitrogênio e oxigênio41, produzindo colônias brancas mucóides

(dependendo da espessura da cápsula), usualmente após 48 e 72 h (Figura 3).

Figura 3. Imagem de cultivo de Cryptococcus em Ágar Sabouraud. Fonte: Acervo Pessoal

As espécies do gênero Cryptococcus tem atividade de urease. A

patogenicidade de C. neoformans está relacionada com a sua capacidade de

crescer a 37 ºC. No entanto, a temperatura ótima de crescimento está entre 30-

9

35ºC. Em meios de cultura como o ágar níger, a presença de compostos difenólicos

propicia a produção de lacase que leva à formação de melanina (Figura 4), que pode

ser observada pelo aparecimento de coloração marrom nas colônias33.

Figura 4. Imagem de cultivo de Cryptococcus em Ágar Níger com produção de melanina. Fonte: Acervo Pessoal

Alguns sorotipos de C. neoformans podem ser diferenciados pela reação de

coloração quando cultivados em meio ágar CGB, pois C. gattii é resistente à

canavanina e utiliza a glicina como fonte de Carbono e Nitrogênio, modificando o pH

do meio, deixando-o alcalino. O azul de bromotimol funciona como um indicador da

mudança de pH, modificando a coloração do meio, de amarelo para azul,

caracterizando C. gattii, diferenciando de C. neoformans (Figura 5)42.

Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB, amarelo, C. neoformans e azul, C. gattii. Fonte: Severo LC. In: Consenso em Criptococose, 200843.

Inúmeras técnicas baseadas na análise do DNA têm sido utilizadas para

estudos de detecção, caracterização, filogenia e epidemiologia do gênero

Cryptococcus. Essas técnicas incluem análises RFLP (fragmentos de DNA gerados

10

por enzimas de restrição). Em 1997, ao utilizar esta metodologia, Franzot et al.44 ao

analisarem a diversidade genética de isolados C. neoformans do Brasil e da cidade

de Nova York (EUA), através do perfil de RFLP da seqüência do gene URA5,

sugeriram uma dispersão global de certos isolados patogênicos.

1.5 A Epidemiologia e Grupos Moleculares

Cryptococcus neoformans possui distribuição geográfica mundial,

freqüentemente associa-se a habitat de aves, excretas secas, ricas em fontes de

nitrogênio, como uréia e creatinina. Uma vez que tenha condições favoráveis para o

seu crescimento abundante, esta levedura forma microfocos, notadamente em

centros urbanos e relacionados a pombos45.

C. neoformans é mais comum no continente europeu, embora tenha

distribuição mundial, onde mais de 30% dos casos da doença são causados por

essa espécie2. Países como Suíça, Alemanha, Áustria46 e França47 já informaram

sobre seu isolamento.

A Criptococose neoformans ocorre como primeira manifestação oportunista

em cerca de 4,4% dos casos de aids no Brasil48. Esta micose sistêmica associada à

aids predomina nas regiões, Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil 49,50,51. Por outro

lado, Cryptococcus neoformans é capaz de causar infecção fatal em indivíduos

aparentemente normais52.

Todavia, esta espécie já foi encontrada no Brasil, sendo isolada de árvores

em diferentes localidades53,54,55: Rio de Janeiro (RJ), em Teresina (PI), em Boa Vista

e Ilha de Maracá (RR), no interior do Amazonas e na Cidade de São Paulo56.

Espécies de C. neoformans são isoladas com maior freqüência na Europa e

América do Sul. No Brasil, por ser área endêmica desta espécie, há um grande

interesse em se determinar os genótipos dos isolados deste fungo3,49,54,57.

A Criptococose por Cryptococcus gattii ocorre na América Latina, em países

como Argentina, Brasil, Venezuela11, Peru e Colômbia58,59. No Brasil, principalmente

nas regiões Norte e Nordeste, estudos clínico-epidemiológicos vem mostrando a

11

importância dessa espécie que acomente o SNC de adultos jovens e crianças, com

alta letalidade60. Sabe-se que Criptococose gattii pode ocorrer em áreas de clima

temperado e apresentar-se sob forma de surtos. Em áreas, onde há alta pressão

endêmica por C. gattii, observa-se significativa associação deste agente com aids50.

Em estudo prévio, na Região Norte do Brasil, realizado na Fundação de

Medicina Tropical do Estado do Amazonas, Santos (2000)61 relatou que a frequência

da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma significante

fração dentre os casos reportados (33%, n=75), dado este realmente preocupante,

frente à vasta região de florestas, um dos hábitats deste fungo.

Um recente surto de infecção por Cryptococcus gattii, no clima temperado da

Ilha de Vancouver, British Columbia (BC), Canadá, deflagrou o início e a

colaboração de pesquisadores no esforço de investigação deste distúrbio em

relação às descrições geográficas, demográficas e microbiológicas, referenciando as

características clínicas dos casos de Criptococose, bem como identificar possíveis

reservas ambientais responsáveis pelo surto. Como a maioria dos pacientes eram

imunocompetentes, a infecção criptocócica foi listada como doença notificável em

BC, Canadá62.

A partir de então, muitos questionamentos foram surgindo em relação à

virulência da espécie de Cryptococcus que gerou a epidemia em BC. Por isso,

ferramentas moleculares foram utilizadas para caracterizar o genótipo envolvido no

surto. Os estudos genotípicos utilizando PCR-Fingerprinting e PCR-RFLP realizados

por Meyer et al. (1999)63 conseguiram distinguir oito genótipos, sendo 4 de C.

neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e VGII, VGIII e VGIV).

Após as análises que reproduziram a metodologia de Meyer et al. (1999)63, um

estudo posterior constatou que VGII era o grupo molecular causador do surto na Ilha

de Vancouver62.

As técnicas moleculares de tipificação incluem a PCR-Fingerprinting onde um

lócus de polimorfismo no DNA é amplificado gerando diferentes fragmentos que

geram diferentes padrões de bandas de DNA e podem ser relacionados com uma

espécie, variedade ou linhagem. A técnica de RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) é um fingerprinting que utiliza sequências arbitrárias que geram

12

diferentes padrões de amplificação, os quais permitem no caso de Cryptococcus

spp. discriminar grupos moleculares e também são utilizados em estudos

epidemiológicos64,65.

A metodologia proposta por Meyer et al. (1999)63 propuseram a tipagem

molecular de Cryptococcus spp. através do PCR-Fingerprinting que utilizou como

primer uma seqüência obtida do “núcleo” do fago M13 para detectar seqüências

minissatélites hipervariadas existentes no genoma da levedura. Este protocolo

permitiu a separação dos isolados de C. neoformans e C. gattii em oito grandes

grupos moleculares, como já foi mencionado.

Em 2003, um dos primeiros grandes estudos multicêntricos de caracterização

molecular de espécies de Cryptococcus foi realizado pelo Ibero American

Cryptocococcal Study Group, que envolveu oito países da America Latina e a

Espanha. O minissatélite M13 foi utilizado para diferenciação dos grupos

moleculares das espécies e a confirmação dos mesmos ocorreu por análises de

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) do Gene Urotidina Monofosfato

Pirofosforilase (URA5), o qual demonstrou a prevalência de VNI dentre as cepas de

Cryptococcus neoformans66.

Muitos estudos utilizando a classificação de Meyer et al. (1999)63 foram

realizados em diversas partes do mundo. Na Austrália, um estudo de 61 isolados

clínicos e 49 ambientais (isolados de eucaliptos e outras árvores) de C. gattii revelou

que 92% dos clínicos pertenciam ao genótipo VGI e 100% dos ambientais isolados

de eucaliptos, eram VGI, além disso, três isolados clínicos e um ambiental de outra

árvore, que não o eucalipto, foi VGII e apenas um isolado clínico foi VGIII67.

Na Índia, o genótipo VNI mostrou-se predominante ocorrendo em 89% dos 57

isolados clínicos, os genótipos VNIV e VGII também foram encontrados, com

porcentagens de 2% e 9%, respectivamente68.

Em Barcelona, Espanha, o tipo VNI ocorreu em todos os 22 isolados

escolhidos randomicamente para genotipagem, todos foram provenientes de

amostras do solo misturadas a excrementos de pombos69.

13

Na América Latina, Meyer et al. (2003)66, ao estudarem 304 cepas de

Cryptococcus spp. do Brasil, Argentina, Chile, Colômbia, México, Peru, Venezuela,

Guatamela e Espanha, encontraram o genótipo VNI em 68,2% dos isolados e o

genótipo VNII, em pequena proporção (5,6%) seguido do genótipo VNIII (sorotipo

AD) com 4,1% e do VNIV, com 1,8%. Já o genótipo VGI foi encontrado em 3,5% dos

isolados, VGII, em 6,2%, VGIII em 9,1% e VGIV em 1,5%. O Brasil participou do

estudo com 66 cepas. Dessas 82,3% foram VNI, 3% VNII e 13,6% VGII66.

Em relação aos estudos realizados no Brasil, Casali et al. (2003)38 ao estudar

105 cepas clínicas e 19 ambientais relataram que o genótipo VNI era o mais comum

na região sul do Brasil (89,3%), seguido pelo genótipo VGI (8,9%) e VNIV (7,3%), ao

qual pertenciam todos os isolados obtidos de Eucalyptus spp. O estudo de Abegg et

al. (2006)9, no Rio Grande do Sul, relatou que todos os genótipos de C. neoformans

foram VNI, já os C. gatiii, VGI9.

Já em 2008, Trilles e colaboradores70 realizaram um estudo verificando a

distribuição dos tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii em todo o Brasil, a

fim de correlacionar os genótipos com as regiões geográficas e condições dos

hospedeiros. Foram analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de

C. gattii, de todas as regiões do Brasil, representadas por onze Estados. Os tipos

moleculares mais comuns foram VNI (64%) e VGII (21%), seguido por VNII (5%),

VGIII (4%), VGI e VNIV (3% cada), e VNIII (< 1%). O tipo molecular VGIV não foi

identificado dentre os isolados estudados no Brasil. O estudo revelou ainda que o

genótipo VGII ocorreu predominantemente na macrorregião nordeste, e o VNI na

macrorregião sudeste, como ilustra a Figura 6. Do Estado do Amazonas foram

obtidos 12 isolados e os tipos moleculares identificados foram VNI e VGII70.

Em recente estudo realizado por Silva (2009)71, na Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas, foram realizadas tanto a feno quanto a genotipagem de 40

isolados clínicos, sendo que usando o meio CGB (Canavanina-Glicina-Azul de

Bromotimol), foi observado que 75,5% (n=31) e 22,5% (n=9) dos isolados eram

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, respectivamente. Já a PCR-

fingerprinting usando a seqüência M13, mostrou que a maioria dos isolados, 72,5%

(n=29) era do genótipo VNI e que todos os nove isolados da espécie C. gattii eram

do genótipo VGII71.

14

Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os Estados Brasileiros incluídos na análise. Fonte: Trilles et al., 200870.

Métodos moleculares tem sido desenvolvidos para diagnóstico e

monitoramento de infecções fúngicas, bem como para tipificação dos isolados,

visando principalmente, estudos epidemiológicos. A reação em cadeia de polimerase

(PCR) tem sido a principal ferramenta utilizada no desenvolvimento de protocolos de

detecção de DNA de C. neoformans e C. gattii72.

Quanto à possibilidade de se utilizar a Região ITS (Internal Transcript Space)

para caracterização de Cryptococcus, os genes ribossomais são alvos estudados

nos sistemas baseados em PCR, para detecção e identificação deste patógeno

fúngico 73,74. As regiões ITS possuem sequências altamente variáveis que tem sido

usadas para identificação de fungos nos mais diferentes formatos de níveis de

espécie 75,76,77.

Em 1999, Irobi e colaboradores78 descreveram um método molecular para

identificação de leveduras do gênero Candida, tendo como alvo a região ITS. Os

primers utilizados foram ITS5 (5’-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e NL4 (5’-

GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’). O método provou ser simples e reprodutível, além

de oferecer potenciais vantagens sobre os métodos de fenotipagem78.

Já em 2009, Santos e colaboradores79 identificaram agentes causadores de

fungemias (Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida

glabrata, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e Histoplasma capsulatum)

utilizando PCR/RFLP, e entre as combinações de pares de enzimas de restrição,

15

somente uma combinação (par de primers ITS5/NL4 e enzima de restrição Ddel)

produziu um padrão RFLP específico para cada microrganismo estudado. Neste estudo, a região dos primers ITS5 e NL4, permitiu a distinção de genótipos VGII e

VNI79.

Diante do contexto, há escassez de estudos desta natureza na região Norte,

especialmente no Estado do Amazonas71. Em um país com dimensões continentais,

há necessidade de realizar pesquisas sobre as características genotípicas do gênero

Cryptococcus, pois fatores ambientais, geográficos e climáticos propiciam variações

tanto na feno quanto na genotipagem, e conseqüentemente na patogenicidade das

infecções oportunistas43.

O evento que ocorreu em Vancouver aumentou ainda mais o interesse das

comunidades médico-científicas em conhecer os grupos moleculares causadores da

doença, pois as espécies estão começando a ocupar novos nichos ecológicos. É de

grande importância monitorar onde e quantos casos de infecção por Cryptococcus

estão ocorrendo, a fim de identificar os grupos moleculares envolvidos, mesmo em

regiões com clima onde não seria esperado encontrar a espécie. Este estudo traz

informações particulares sobre os genótipos que causam infecção no Amazonas.

Estas informações são importantes para a epidemiologia da doença no Estado, uma

vez que os dados do Amazonas ainda são pouco conhecidos, pois há ausência de

outros estudos. Estudos similares devem ser estimulados em todas as áreas

endêmicas, determinando o grau de sua potencialidade patogênica em indivíduos

imunocomprometidos ou imunocompetentes.

16

2 OBJETIVOS 2.1 Geral

Caracterizar por métodos moleculares agentes causadores de Criptococose,

isolados de pacientes atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do

Amazonas.

2.2 Específicos

- Investigar quais os grupos moleculares causadores de Criptococose através do

PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pelo perfil de restrição (PCR-

RFLP) utilizando o gene URA5;

- Avaliar a possibilidade de se utilizar uma PCR-RFLP, tendo como alvo a região ITS

do DNAr, para caracterização dos grupos moleculares de Cryptococcus;

- Verificar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e

MATa) das espécies por PCR;

- Descrever e correlacionar as características epidemiológicas dos pacientes com os

grupos moleculares, a partir dos dados obtidos nas requisições de exames.

17

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Modelo de Estudo

Estudo descritivo transversal com a finalidade de caracterizar os isolados

causadores de Criptococose no Estado do Amazonas.

3.2 Universo de estudo Local: Este estudo foi realizado no Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e no Laboratório de

Micobacteriologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).

Período: O período de estudo foi entre Março de 2006 a Fevereiro de 2010. Amostras: Os isolados foram obtidos de material clínico procedente do Laboratório de Micologia da FMT-HVD.

Aspectos éticos: Este projeto de pesquisa foi registrado e aprovado pelo CEP-FMT/AM, Processo n°. 763/2010-FMT-AM, CAAE – 0007.0.114.000-10 (Anexos).

Financiamento: Este estudo foi financiado pela FAPEAM, através do edital N°.014/2006 PPSUS 2006.

Microrganismos Analisados Isolados Clínicos

Os 60 isolados deste estudo foram obtidos de pacientes acometidos por

Criptococose, portadores de HIV ou não, internados na Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre março de 2006 a fevereiro de 2010. De

cada paciente foi utilizado apenas um único isolado fúngico (o primeiro isolado da

amostra enviada ao Laboratório). Estes isolados estavam sendo mantidos sob

refrigeração (4oC), na Coleção de Fungos da FMT-HDV.

Cepas de Referência

As linhagens foram caracterizadas genotipicamente de acordo com as cepas-

padrão concedidas gentilmente pela Coleção de Culturas da Fundação Oswaldo

18

Cruz (FIOCRUZ-RJ) (Tabela 2). Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo informações gerais, sorotipo (ST), mating type (MAT), tipo molecular (TM). Isolados WM N°. País Fonte ST MAT TM WM 148R WM 148 Austrália CLIN A Alpha VNI WM 626R WM 626 Austrália CLIN A Alpha VNII WM 628R WM 628 Austrália CLIN AD Alpha VNIII WM 629R WM 629 Austrália CLIN D Alpha VNIV WM 179R WM 179 Austrália CLIN B Alpha VGI WM 178R WM 178 Austrália CLIN B Alpha VGII WM 161R WM 161 Austrália CLIN B Alpha VGIII WM 779R WM 779 África do Sul VET C Alpha VGIV

3.3 Procedimentos

3.3.1 Determinação dos grupos moleculares

3.3.1.1 Reativação dos isolados fúngicos

A fim de reativar os microrganismos, foi utilizado o cultivo em Ágar Sabouraud

a 37 oC por 48 h. Após este período, foram purificados em placa contendo Ágar

Níger, e apenas uma colônia foi retirada e semeada em Caldo Sabouraud a 30 °C,

para obtenção da biomassa, utilizada nos estudos genotípicos (extração de DNA)

(Figura 7).

3.3.1.2 Extração de DNA genômico

A extração foi baseada na utilização de membrana de sílica (Kit QIAamp

Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany) (Figura 8).

Cerca de 90 mg de biomassa foram transferidos com auxílio de alça

descartável para eppendorf contendo 180 µL de tampão de lise e pérolas de vidro

lavadas em ácido (450-600 nm). As células foram rompidas com choque mecânico e

depois se procedeu à extração genômica com adição de Proteinase K overnight a 56

°C, em seguida adicionou-se 200 µL de tampão de guanidina e fez-se a agitação a

frio em vórtex por 15 s e incubou-se por 10 min a 70 °C. Passado este período, foi

adicionado o mesmo volume, 200 µL, desta vez de etanol e foi homogeneizado em

19

agitador. A mistura foi transferida para as colunas de sílica e foi centrifugada a 8000

rpm em 1 min. O material foi transferido para novo tubo da coluna e 500 µL do

primeiro tampão de lavagem foi adicionado à coluna, em seguida, foi centrifugado

por 1 min a 8000 rpm. Novamente o tubo da coluna foi trocado, e 500 µL do segundo

tampão de lavagem foi adicionado à coluna de sílica, e centrifugado a 14000 rpm por

3 min. Mais uma vez, o tubo da coluna foi retirado e o tampão de eluição do DNA foi

adicionado, procedendo com a centrifugação a 8000 rpm por 1 min, desprezando a

coluna e armazenando o filtrado a 4 °C.

A concentração de DNA Genômico foi verificada através de leitura em

espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare) no

comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50

μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260

e 280 nm.

3.3.1.3 PCR-Fingerprinting RAPD utilizando o minissatélite M13

Foi utilizada a seqüência específica do minissatélite M13 (5’-

GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Meyer et al., 1999)63. A reação de amplificação foi

realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução

tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada

dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase

(Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96,

Applied Biosystens, a reação consitiu em 6 min de desnaturação (94 oC); 40 ciclos

de 1 min desnaturação à 94 ºC, 1 min de anelamento à 50 ºC e 2 min de extensão à

72 ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72 ºC. Os produtos da

amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60

V (Figura 9).

3.3.1.4 PCR-RFLP do Gene URA5

A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50 μL. Cada

reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com conjunto de extração QIAamp

DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,

KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, e 1,5 U de Taq DNA polimerase

20

(Recombinante Invitrogen) e 50 ng de cada primer URA5 (5´-ATGTCCTCCCAAGC

CCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC´-3).

A PCR foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, iniciou-se

com 2 min de desnaturação (94 ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30

s de anelamento à 61 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, finalizou-se com um ciclo de

extensão final de 10 min à 72 ºC.

Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de

agarose 1,5%, por 2 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados

sob luz ultravioleta.

Oito microlitros dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da

enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I (10 U/µL)e Hha I (20 U/µL) em

incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C, e separados por eletroforese em gel de

agarose 3%, por 5 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados

sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP foram visualizados comparando-os com os

padrões obtidos das cepas de referência (VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 10).

3.3.1.5 Determinação dos Mating Types

O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um volume

final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'- CTTCACTGC

CATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e os primers do

tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) e Mat-aR (5’-

AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).

Cada reação conteve 20 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM,

pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e

1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen).

A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens,

primeiramente foi realizada desnaturação inicial a 94 °C por 3 min, em seguida

foram realizados 35 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento a

58 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 7 min

21

à 72 ºC. As reações de amplificação foram realizadas de acordo com o

procedimento de Chaturvedi et al. (2000) modificado80.

O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por

eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 100 V, corado com SybrGreen e

iluminado com luz ultravioleta (Figura 11).

3.3.2 Caracterização dos grupos moleculares utilizando região ITS do DNAr

A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi conduzida com um

volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com

conjunto de extração QIAamp DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução

tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada

dNTP, e 3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen) e 50 pM de cada

primer ITS5 (5´-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-´3) e NL4 (5´-GGTCCGT

GTTTCAAGACGG-´3).

A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens,

primeiramente com desnaturação inicial por 6 min a 94 °C, em seguida foram

realizados 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento à 55 ºC e

1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 10 min à 72

ºC.

O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por

eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e iluminados com luz

ultravioleta.

Oito microlitros e meio dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de

tampão da enzima Ddel (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) e foram digeridos

com 5,0 U da mesma (10 U/µL) em incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C , e

separados por eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 110 V, corados com

SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP

foram visualizados comparando-os com os padrões obtidos das cepas de referência

(VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 12).

22

Amostra Biológica

Isolamento em Ágar Níger

Conservação a 4 °C Reativação em Ágar Sabouraud

Purificação em Ágar Níger

Uma colônia é cultivada em Caldo Sabouraud

REAT

IVAÇ

ÃO/I

SOLA

M. F

ÚN

GIC

O

Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico

23

Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA Genômico.

EXTR

AÇ

ÃO

60 Isolados

Colônia do Caldo Sabouraud

90 mg de biomassa fúngica

Extração pelo Kit Qiagen® Obtenção do DNA Leitura em

Espectrofotômetro da Concentração de DNA e

pureza

24

Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13

PCR

- FIN

GER

PRIN

TIN

G

Minissatélite M13

(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)

60 Isolados

DNA

Mix de PCR

Amplificação

DNA amplificado Gel de Agarose 1,4%

Primer Oligonucleotídeo

25

Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5

PCR

- RFL

P G

ene

UR

A5

60 Isolados

DNA

Mix de PCR

Amplificação

DNA amplificado

Gel de Agarose 3%

Primer URA5/SJ01

DNA digerido Sau96I e HhaI

Gene URA5 URA5 (5'-TGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG-3') SJ01 (5'-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC-3')

26

Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types.

PCR

- Mat

ing

Type

s

DNA

Mix de PCR

Amplificação

DNA amplificado

Gel de Agarose 2%

Par de primers Mat-αF/Mat-αR

ou Mat-aF/mat-aR

MATα Mat-αF (5'- CTTCACTGC CATCTTCACCA-3') Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3')

MATa Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’)

Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).

60 Isolados

27

Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr.

PCR

- RFL

P IT

S

DNA

Mix de PCR

Amplificação

DNA amplificado

Gel de Agarose 2%

Par de primers ITS5/NL4

DNA digerido Ddel

DNAr

ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3) NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')

60 Isolados

28

3.4 Caracterização Epidemiológica dos Pacientes

O perfil dos pacientes acometidos por Criptococose (gênero, idade, infecção

pelo HIV e tipo de amostra clínica de isolamento) foi obtido através da análise das

requisições de exames, presentes no Laboratório de Micologia da FMT-HVD.

29

4 RESULTADOS

Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que será

submetido à publicação na Revista Mycoses (Alemanha) (B1).

ARTIGO ORIGINAL Molecular characterization of causative agents of Cryptococcosis isolated from patients in a tertiary healthcare in the State of Amazonas. Ana Karla Lima Freire,1 Amaury dos Santos Bentes,2 Lucilaide Oliveira Santos,1 Maurício Morishi Ogusku,2 Julia Ignez Salem,2 Bodo Wanke 1,3 and João Vicente Braga de Souza1,2

1 Laboratório de Micologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Universidade do Estado do Amazonas, Brasil 2 Laboratório de Micobacteriologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Brasil 3 Laboratório de Micologia, Fundação Osvaldo Cruz, Brasil. SUMMARY From the knowledge that there are four molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006-2010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting the ITS1 rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR. It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C. gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two were type a. It found the prevalence of VNI molecular group, the meeting of the VNII molecular group, never before reported for the northern region of Brazil, and suggested that the new methodology for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region characterized only the two molecular groups C. gattii. Key words: Cryptococcus, Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP, ITS5/NL4.

30

INTRODUÇÃO

A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete os órgãos internos e a pele,

decorrente da inalação de propágulos infectantes das espécies patogênicas

leveduriformes - Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A doença

apresenta-se de forma subaguda ou crônica, afetando tanto os indivíduos

imunodeprimidos (aids, principalmente) como os imunocompetentes. A aids é o fator

predisponente mais importante para infecção, sendo que, falhas no sistema

imunológico, inato e adaptativo, induzido pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency

Virus) são responsáveis pela disseminação da Criptococose. Uma das

características do gênero Cryptococcus é o tropismo meningoencefálico que resulta

em elevada mortalidade na ausência de tratamento.1-3

A patogenicidade do gênero Cryptococcus é determinada, principalmente, pela

cápsula polissacarídica, que promove resistência a fagocitose, proteção da levedura

e inativação do sistema complemento; e pela produção da enzima fenol-oxidase

responsável pelo neurotropismo do fungo.4

Tanto C. neoformans quanto C. gattii, apesar de reproduzirem-se assexuadamente,

possuem um sistema complementar com dois mating types: a e α. Para que este tipo

de reprodução sexuada ocorra é necessário que haja o encontro entre dois mating

types opostos. Geneticamente, o locus mating type é a região do genoma fúngico

que regula o ciclo sexual e pode ser diferente entre células de mating types

opostos.5

A espécie C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que C.

gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Porém,

este cenário foi remodelado em 1998, quando foi observado um surto de infecção

por Cryptococcus gattii, no clima temperado da Ilha de Vancouver, British Columbia

(BC), Canadá, caracterizado por ferramentas de PCR-Fingerprinting.6-9

As técnicas moleculares de tipificação PCR-Fingerprinting fundamentam-se na

amplificação de produtos de PCR a partir de regiões gênicas que permitem estudos

filogenéticos e propiciam discussões nos vários níveis taxonômicos até mesmo de:

espécie, variedade ou linhagem.10-11 Atualmente, devido aos estudos realizados por

31

Meyer et al. [12], foram definidos oito grandes grupos moleculares a partir dos

protocolos de PCR-Fingerprinting Minissatélite M13 e PCR-RFLP-URA5. Os grupos

moleculares correspondentes a C. neoformans são VNI, VNII, VNIII e VNIV,

enquanto o C. gattii é subdividido em VGI, VGII e VGIII e VGIV.12-13

Outra região gênica que vem sendo utilizada na detecção e identificação de

patógenos fúngicos por PCR corresponde as regiões do espaço transcrito interno

(ITS), com sequências conservadas, encontradas em genes ribossomais.14-21 O uso

da região ITS foi estabelecida em 1999, quando Irobi et al. [15] descreveram um

método molecular para identificação de leveduras do gênero Candida.

Especificamente para Cryptococcus spp., os estudos realizados por Santos et al.

[19] , utilizando o mesmo alvo e primers, diferenciaram as espécies C. neoformans e

C. gattii. Segundo os autores, os resultados demonstram que a região gênica possui

potencial para distinção das espécies e talvez até mesmo dos grupos gênicos.19

Os estudos de tipificação molecular aperfeiçoam o diagnóstico fúngico, elucidam a

diversidade genética e corroboram com bases científicas para estudos

epidemiológicos globais.20,22-23 Atualmente, estes estudos também possuem

importância na associação de diferentes grupos moleculares às características de

virulência, à sensibilidade aos antifúngicos e a terapêutica.24-25

Investigar os grupos moleculares do gênero Cryptococcus, isolados de pacientes

atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do Amazonas, foi o objetivo do

presente estudo. Especificamente pretendeu-se: determinar os grupos moleculares

por PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pela PCR-RFLP do gene

URA5; avaliar a utilização de uma PCR-RFLP tendo como alvo a região ITS do DNAr

para caracterizar os grupos moleculares de Cryptococcus; analisar a presença de

genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies por

PCR; e caracterizar os pacientes quanto ao gênero, idade, infecção pelo HIV e

amostra clínica, de onde os agentes foram isolados.

32

Materiais e Métodos

Microrganismos analisados

Os 60 isolados de Cryptococcus spp. analisados foram obtidos de amostras de

pacientes acometidos por Criptococose, internados na Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD), entre março de 2006 e fevereiro de

2010. Foi analisado apenas o isolado obtido da primeira amostra processada de

cada paciente, mantido sob refrigeração (4 oC), na Coleção de Fungos da FMT/HVD.

Os microrganismos foram reativados em meio de cultivo Ágar Sabouraud a 37 oC

por 48h. Posteriormente, foram semeados em Caldo Sabouraud a 30 ºC por 48h

para obtenção da massa fúngicas a ser utilizada nos estudos de caracterização

molecular. Para a caracterização foram utilizadas cepas padrões: WM 148 (sorotipo

A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII), WM 629 (sorotipo

D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII), WM 161 (sorotipo

B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Estas foram gentilmente cedidas pela

coleção de fungos da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-Brasil. Extração do DNA Genômico

Na extração foi utilizado o kit comercial QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden,

Germany). A concentração do DNA Genômico foi verificada por leitura em

espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare), no

comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50

μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260

e 280 nm. Caracterização dos Grupos Moleculares PCR-Fingerprinting: Foi utilizada a seqüência específica do minissatélite M13 (5’-

GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (MEYER et al. [12]). A reação de amplificação foi

realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução

tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada

33

dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase

(Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96,

Applied Biosystens, a reação consistiu em 6 min de desnaturação (94oC); 40 ciclos

de 1 min desnaturação à 94ºC, 1 min de anelamento à 50ºC e 2 min de extensão à

72ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72ºC. Os produtos da

amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60

V.

Gene URA5 RFLP: A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50

μL, contendo 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50

mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 50 ng de cada primer URA5 (5´-

ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAAC

ACCGTACTC´-3) e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A

PCR foi realizada em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação

consitiu em 2 min de desnaturação inicial (94oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação

à 94ºC, 30 s de anelamento à 61ºC e 1 min de extensão à 72ºC; por fim foi realizada

uma extensão final de 10 min à 72ºC. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR

foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com SybrGreen

e iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros dos produtos de PCR foram

misturados a 1 µL de tampão da enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I

(10U/ µL) e Hha I (20U/ µL) em incubação por 3 horas ou overnight à 37°C. Os

fragmentos de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% por

5 h a 100V.

Gene ITS RFLP: A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi

conduzida com um volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA

molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2

mM de cada dNTP, e 50 pmoles de cada primer ITS5 (5´-

GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-´3) e NL4 (5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-´3) e

3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A amplificação foi

realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consistiu em 6

min de desnaturação inicial (94oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94°C, 30 s

de anelamento à 55°C e 1 min de extensão à 72°C; por fim foi realizada uma

extensão final de 10 min à 72°C. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram

34

visualizados por eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e

iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros destes produtos de PCR foram

digeridos pela enzima de restrição Ddel (10U/ µL) (New England Biolabs, Beverly,

MA, USA) em incubação overnight a 37 °C. Os fragmentos de restrição foram

analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110V.

Mating Types: O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um

volume final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'-

CTTCACTGCCATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e

os primers do tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’)

e Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’). A reação de PCR continha 20 ng

de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5

mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e 1,5 U de Taq DNA polimerase

(Recombinante Invitrogen). As reações de amplificação foram realizadas de acordo

com o procedimento de Chaturvedi et al. [26] modificado. Os produtos de

amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110

V.

Características dos pacientes

As informações sobre gênero, idade, infecção pelo HIV e tipo de amostra clínica de

onde se isolaram os agentes microbianos, foram obtidas das requisições de exames,

presentes no Laboratório de Micologia da FMT/HVD.

Resultados Dos 60 isolados obtidos, 40 (66,7%) foram caracterizados como C. neoformans, 17

(28,3%) eram C. gattii e apenas 3 (5%) dos isolados não puderam ser

caracterizados por nenhum dos protocolos estudados.

As metodologias de PCR-Fingerprinting (Fig. 1) e PCR-RFLP URA-5 (Fig. 2)

ilustram que os grupos moleculares encontrados foram VNI (39/60; 65%), VNII (1/60;

1,7%) e VGII (17/60; 28,3%). Estratificando os grupos moleculares incluídos em sua

respectiva espécie, tem-se que do total de 40 isolados de C. neoformans, 39 (39/40;

97,5%) eram grupo molecular VNI e 1 (1/40; 2,5%) do VNII; e todos os 17 isolados

35

da espécie C. gattii foram grupo molecular VGII (17/17; 100%). Foi observada

concordância total entre os dados de ambas as metodologias aplicadas.

Conforme indicado na Tabela 1, a correlação entre os grupos moleculares dos

isolados, com as características dos pacientes obtidas nas requisições de exames

demonstrou a prevalência do sexo masculino (40/60; 66,7%), faixa etária de 16-30

anos (31/60; 51,7%), os isolados obtidos foram derivados principalmente do líquor

(43/60; 71,7%) e a maioria do pacientes tinha infecção pelo HIV (45/60; 75%). Ainda

em relação à idade, observou-se que C. gattii (VGII) acometeu todos os grupos

etários, sendo que 4 (6,7%) casos da doença ocorreram em crianças de 0-15 anos.

Quanto ao achado de VNII, o isolado foi obtido de hemocultura, indivíduo do sexo

masculino, 36 anos, portador de HIV, autóctone.

.

Figura 1. Perfil de PCR-Fingerprinting com o minissatélite M13, das cepas de referência de Cryptococcus spp. 1, 2, 3, 4 e 5 são amostras dos isolados.

Figura 2. Perfil de RFLP-PCR utilizando o gene URA5 e as enzimas de restrição HhaI e Sau96I. 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são isolados.

Bp

2200

738

123

pb 1000

600 500

250

50

M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1 2 3 4 5 6

M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1 2 3 4 5 M

36

O experimento que visou avaliar a capacidade de descriminar os grupos moleculares

através de uma PCR-RFLP da região ITS do DNAr, resultou em três distintos perfis,

um dos quais com 60, 120, 500 e 700 pares de base (pb) foi encontrado em todos os

quatro grupos moleculares de C. neoformans e em dois C. gattii (VGI e VGIV). Os

demais perfis foram observados nos grupos moleculares de C. gattii, sendo um com

60, 300, 400 e 490 pb em VGII e o outro com 60, 110, 150, 300 e 700 pb em VGIII

(Fig. 3).

Figura 3. Distinção entre espécimes de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers ITS5/NL4 e a digestão feita com a enzima de restrição Ddel.

Quanto à caracterização dos mating types contatou-se que 58 eram do tipo alfa e

apenas 2 do tipo a (Fig. 4).

Figura 4. Mating Types dos isolados de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers α-MatF/α-MatR, onde o MATα gera um fragmento de 101 pb.

M VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV pb

1000

700

500

250

50

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pb

1000

250

101

50

37 TABELA 1. Correlação entre os grupos moleculares dos isolados com as características dos pacientes.

Espécie n/%

Grupo Molecular

n/%

SEXO n (%)

IDADE n (%)

AMOSTRA BIOLÓGICA n (%)

INFECÇÃO PELO HIV n

(%)

Mas Fem 0-15 16-30 31-45 46-60 >60 Líquor Hemocultura Escarro Outros

* Sim Não C

. neo

form

ans

40 (6

6,7)

VNI (39/97,5)

25

(41,7)

14

(23,3) -

23

(38,3)

13

(21,7)

3

(5) -

31

(51,7)

3

(5)

1

(1,7)

4

(6,7)

36

(60)

3

(5)

VNII (1/2,5)

1

(1,7) - - -

1

(1,7) - - -

1

(1,7) - -

1

(1,7) -

C. g

attii

17 (2

8,3)

VGII (17/100)

12

(20)

5

(8,3)

4

(6,7)

6

(10)

3

(5)

2

(3,3)

2

(3,3)

11

(18,3) -

1

(1,7)

5

(8,3)

7

(11,7)

10

(16,7)

Indeterminado (3/5)

2

(3,3)

1

(1,7) -

2

(3,3) -

1

(1,7) -

1

(1,7)

1

(1,7) -

1

(1,7)

1

(1,7)

2

(3,3)

TOTAL n

(%) 40

(66,7) 20

(33,3) 4

(6,7) 31

(51,7) 17

(28,3) 6

(10) 2

(3,3) 43

(71,7) 5

(8,3) 2

(3,4) 10

(16,6) 45

(75) 15

(25)

*Amostras como: Lavado Brônquico, Líquido Ascítico, Mielocultura e Urina.

38

Discussão Cryptococcus neoformans predominou entre os isolados (66,7%), esse agente causa

doença quase que exclusivamente entre pacientes imunossuprimidos. De fato, a

maioria dos isolados do presente trabalho, foram obtidos a partir de pacientes com

aids. Este dado corrobora com a literatura que demonstra que esta espécie é

responsável por até 82,3% dos casos de infecção.13,27 Quanto ao grupo molecular,

os resultados obtidos são semelhantes aos estudos anteriores que encontraram

perfis característicos de VNI, como tipo molecular predominante.13,27 Um estudo

realizado com isolados Ibero-Americanos, provenientes de nove países, incluindo o

Brasil, mostrou a prevalência de VNI dentre as 340 cepas de Cryptococcus

neoformans.13 Especificamente, das 66 cepas brasileiras três tipos moleculares

foram encontrados, sendo VNI predominante, com 82,3%, seguido por VGII (13,6%)

e VNII (3,0%), não indicando de quais Estados ou regiões os isolados foram

obtidos.13 Casali et al. [28], em um importante levantamento sobre Criptococose em

amostras da região Sul do Brasil, demonstrou que 105 isolados clínicos e 19

ambientais foram compatíveis com C. neoformans, com predominância do grupo

molecular VNI. Em 2008, Trilles et al. [27] realizaram um estudo de verificação da

distribuição dos tipos moleculares oriundos de onze Estados do Brasil. Foram

analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de C. gattii. Os 12

isolados do Estado do Amazonas pertenciam aos grupos moleculares VNI e VGII.

No presente estudo, apenas um isolado foi caracterizado como VNII (1,7%).

Este dado está de acordo com a literatura, que vem demonstrando que este é o

terceiro grupo molecular com uma frequência de 3 a 5% em análises feitas no

Brasil.27 Entretanto, nenhum dos isolados do Estado do Amazonas analisados em

estudos anteriores, foram caracterizados como pertencente ao referido grupo

molecular.27,29 Assim sendo, esse é o primeiro relato de existência de C. neoformans

do grupo molecular VNII na região Norte do Brasil.

Dentre os 17 isolados de C. gattii, 10 foram obtidos a partir de pacientes sem

imunocomprometimento evidente e 7 de pacientes com aids. O C. gattii é

considerado um patógeno primário, no entanto, estudos recentes tem demonstrado

este causando infecção em imunocomprometidos.30-33 Apenas o grupo molecular

VGII (100%) foi encontrado, sendo esse resultado compatível com recentes estudos

que demonstraram ser o referido grupo, o principal causador da doença em

39

imunocompetentes, em diferentes Estados das regiões Norte e Nordeste do Brasil. 27,29,34

Três isolados ficaram sem caracterização quanto ao grupo molecular. Esta

situação pode ser explicada, porque a maioria dos isolados de Cryptococcus são

haplóides, no entanto, alguns isolados diplóides ou aneuplóides podem levar a

fenótipos instáveis, que podem interferir na genotipagem.35 Estudos são necessários

para avaliar este resultado, uma vez que pode se tratar, inclusive, de outras

espécies ou subespécies, ainda não classificadas.

O protocolo elaborado para genotipagem (PCR-RFLP ITS1) demonstrou ser

adequado somente para a distinção entre os grupos moleculares VGII e VGIII,

correspondentes ao Cryptococcus gattii. Para a caracterização dos oito grupos

moleculares das espécies, novos estudos precisam ser efetuados utilizando outras

regiões gênicas do ITS1 e enzimas de restrição.

O mating type α tem maior prevalência em amostras clínicas26,36-37, dados

esses também encontrado no presente estudo. Kozel sugere que essa maior

prevalência do mating type α é devida a vantagens seletivas de maior sobrevivência

no meio ambiente e maior virulência.38 A sugestão tem por base, estudos de

infecção em camundongos que demonstraram que o, mating type do tipo α é

significativamente mais virulento que o a.39

A presente pesquisa constatou ainda que os pacientes do sexo masculino,

com idade entre 16-30 anos, portadores do HIV são os principais acometidos por

Criptococose no Estado do Amazonas-Brasil. A literatura descreve o gênero

masculino como o mais acometido pela infecção, bem como nesta faixa etária, fato

esse atribuído à epidemiologia da aids37,40 e, mais recentemente, tem-se que as

mulheres obtém proteção contra a Criptococose gerada por seus próprios

hormônios.36,41

O achado de C. gattii como agente de meningite em crianças de 0-15 anos

não portadoras de HIV, está em de acordo com o exposto na literatura.31,34,42-43 No

Brasil, estudo realizado no Estado do Amazonas, região Norte, demonstrou que a

frequência da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma

significante fração dentre os casos reportados (33%, n=75).42 Também na região

Norte, no Estado do Pará em um período de sete anos, 24% (n=78) dos pacientes

com Criptococose, hospitalizados, eram crianças.43 Esta alta frequência de

meningite criptocócica continuou sendo observada de 2003-2007 (8/43; 18,6%)

40

ainda no mesmo Estado.34 Já no Piauí e Maranhão, Estados da região Nordeste,

21% (n=257) eram casos de Criptococose na infância.44 A região Norte abrange uma

grande área de floresta Amazônica e mais estudos sobre a etiopatogenia da

Criptococose em humanos, e mais especificamente em crianças, bem como seus

perfis moleculares, precisam ser executados, uma vez que os dados de infecções

infantis são preocupantes.34

O líquor foi o principal material biológico de isolamento fúngico, isto pode ser

explicado, porque a maioria dos pacientes (dependendo da cepa infectante, do

estado imunológico do paciente e do quantidade do inóculo inalado) apresenta

disseminação criptocócica e neurocriptococose. Essa advém do fato do gênero

Cryptococcus produzir fenol-oxidase que converte uma grande variedade de

substratos hidroxibenzóicos, incluindo as catecolaminas, em um pigmento marrom

ou preto, conhecido como melanina, a qual funciona como fator de virulência do

fungo para sua proliferação no organismo do hospedeiro.30,45 Como o líquor é rico

em substratos fenólicos, tem-se a explicação para o neurotropismo do

Cryptococcus.30 Os resultados obtidos dão suporte à literatura, pois demonstram a

alta freqüência da retrovirose e alta prevalência do isolamento do agente em líquido

cefalorraquidiano. Em estudo recente no Estado do Amazonas, obteve-se a alta

prevalência de indivíduos infectados pelo HIV e que desenvolveram co-infecção

criptocócica (29/40; 72%).29 Sendo a Criptococose umas das principais causas de

morbimortalidade em pacientes com aids. Em muitos indivíduos, essa micose é a

primeira indicação da evolução da infecção pelo vírus para o quadro de aids.46

Conclusivamente, a Criptococose no Estado do Amazonas mantem-se

prevalente em portadores do vírus HIV, tendo o C. neoformans do grupo molecular

VNI como principal agente etiológico. Entretanto, tem-se o encontro do grupo

molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do Brasil. Além do

exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para genotipagem utilizando

como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente os 2 grupos

moleculares de C. gattii.

Agradecimentos À Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pelo suporte, ao Instituto Nacional de Pesquisas

41

da Amazônia pela permissão e cedência do espaço para a realização dos ensaios,

aos funcionários do Laboratório de Micobacteriologia (INPA) pelo pronto auxílio, ao

INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência, à CAPES pelo apoio

financeiro e à FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital

N.014/2006 PPSUS 2006.

Referências

1 Kwon-Chung KJ, Hill WB, Bennett JE. New, special stain for histopathological diagnosis of cryptococcosis. J Clin Microbiol 1981; 13: 383-387.

2 Py EA, Aloé M, Burlamaqui L, Guasti S, Monerat PJT. Relato de cinco casos

de meningite criptocócica em crianças com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Arquiv Bras Pediat 1997; 4: 15-20.

3 Yamamoto Y, Kohno S, Koga H et al. Random amplified polymorphic DNA

analysis of clinically and environmentally isolated Cryptococcus neoformans in Nagasaki. J Clin Microbiol 1995; 33: 3328–3332.

4 Diamond RD. Cryptococcus neoformans. In: Mandell, G.L., Bennett, J. E. and Dolin, R. (eds.) Principles and practice of infectious diseases. New York: Churchill Livingstone, 1995; 2331-2340.

5 Bovers M, Hagen F, Boekhout T. Diversity of the Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii species complex. Rev Iberoam Micol 2008; 25: S4-12.

6 Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL et al. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci USA 2004; 172: 58-63.

7 Nguyen MH, Yu, CY. In vitro comparative efficacy of voriconazole and itraconazole against fluconazole-susceptible and -resistant Cryptococcus neoformans isolates. Antimicrob Agents Chem 1998; 42: 471-472.

8 Nishikawa MM, Lazéra MS, Barbosa GG et al. Serotyping of 467 Cryptococcus neoformans isolates from clinical and environmental sources in Brazil: analysis of host and regional patterns. J Clin Microbiol 2003; 41: 73-77.

9 Ohkusu M, Tangonan N, Takeo K et al. Serotype, mating type and ploidy of Cryptococcus neoformans strains isolated from patients in Brazil. Rev Inst Med Trop S Paulo 2002; 44: 299-302.

10 Aoki FH, Imai T, Tanaka R, Mikami Y, Taguchi H, Nishimura NF, Nishimura K, Miyaji M, Schreiber AZ, Branchini ML. New PCR primer pairs specific for Cryptococcus neoformans serotype A or B prepared on the basis of random amplified polymorphic DNA fingerprint pattern analyses. J Clin Microbiol 1999; 37: 315-320.

42

11 Kwon-Chung KJ, Boekhout T, Fell JW, Diaz M. Proposal to conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C. bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae). Taxon 2002; 51: 804-806.

12 Meyer W, Marszewska K, Amirmostofina M et al. Molecular typing of global

isolates of Cryptococcus neoformans var. neoformans by polymerase chain reaction fingerprinting and randomly amplified polymorphic DNA - a pilot study to standardize techniques on which to base a detailed epidemiological survey. Electrophoresis 1999; 20: 1790–1799.

13 Meyer W, Castañeda A, Huynh JS, Castañeda E, IberoAmerican Cryptococcal Study Group. Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg Infect Dis 2003; 9: 189-195.

14 Holmes AR, Cannon RD, Shepherd MG, Jenkinson HF. Detection of Candida albicans and other yeasts in blood by PCR. J Clin Microbiol 1994; 32: 228–231.

15 Irobi J, Schoofs A, Goossens H. Genetic identification of Candida species in HIV-positive patients using