UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

Efeito fotossensibilizador in vitro da violeta de genciana na

terapia fotodinâmica sobre cândida albicans

RACHEL CHRISTINA DE QUEIROZ PINHEIRO

Orientador: Prof. Dr. Cacio Moura Netto

Dissertação apresentada ao Mestrado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Odontologia.

SÃO PAULO

2015

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

P718e

Pinheiro, Rachel Christina de Queiroz. Efeito fotossensibilizador in vidro da violeta de genciana na

terapia fotodinâmica sobre cândida albicans / Rachel Christina de Queiroz Pinheiro. -- São Paulo; SP: [s.n], 2015.

33 p. : il. ; 30 cm. Orientador: Cacio Moura Netto. Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em

Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Cândida albicans 3.

Laser de baixa intensidade 4. Violeta genciana 5. Azul de metileno. I. Moura Netto, Cacio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.

CDU: 615.831:616.314(043.3)

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

Efeito fotossensibilizador in vitro da violeta de genciana na

terapia fotodinâmica sobre cândida albicans

RACHEL CHRISTINA DE QUEIROZ PINHEIRO

Dissertação de mestrado defendida e aprovada

pela Banca Examinadora em 06/03/2015.

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Cacio Moura Netto

Universidade Cruzeiro do Sul

Presidente

Prof. Dr. Igor Prokopowitsch

Universidade Cruzeiro do Sul

Profa. Dra. Karla Baumotte de Carvalho

Universidade Gama Filho

DEDICATÓRIA

“Creio em mim mesmo. Creio nos que trabalham comigo,

creio nos meus amigos e creio na minha família. Creio que

Deus me emprestará tudo que necessito para triunfar,

contanto que eu me esforce para alcançar com meios

lícitos e honestos. Creio nas orações e nunca fecharei

meus olhos para dormir, sem pedir antes a devida

orientação a fim de ser paciente com os outros e tolerante

com os que não acreditam como eu acredito. Creio que o

triunfo é resultado de esforço inteligente, que não depende

da sorte, da magia, de amigos, companheiros duvidosos

ou de meu chefe. Creio que tirarei da vida exatamente o

que nela colocar. Por isso serei cauteloso quando tratar os

outros, como quero que eles sejam comigo. Não caluniarei

aqueles que não gosto. Não diminuirei meu trabalho por

ver que os outros o fazem. Prestarei o melhor serviço de

que sou capaz, porque jurei a mim mesmo triunfar na vida,

e sei que o triunfo é sempre resultado do esforço

consciente e eficaz. Finalmente, perdoarei os que me

ofendem, porque compreendo que às vezes ofendo os

outros e necessito de perdão.”

(Mahatma Gandhi)

Dedico esse trabalho a minha amada família.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por guiar o meu caminho.

A Nossa Senhora minha AMIGA e intercessora junto a Jesus.

Ao meu pai que mesmo ausente (in memoriam), sempre está presente.

A minha mãe por seu eterno incentivo e amor incondicional.

Ao meu marido e filhos que muitas vezes não aceitavam a minha ausência, mas compreenderam e ajudaram na concretização desse sonho, AMO VOCÊS.

A Nalva cujo amor e dedicação aos meus filhos, a Toby e a minha casa, me proporciona paz para a realização de sonhos.

As minhas irmãs pela torcida e apoio sempre.

As minhas irmãs-amigas, Daliana e Raquel, pelo incentivo, amparo, torcida e exemplo de como ser uma professora.

A Isabela Arrais mais um anjo que Deus me enviou.

Aos meus amigos de mestrado.

Aos meus alunos que me ajudam a procurar saber sempre mais.

A Daniele e Janaína que me auxiliam no dia a dia, e não me deixam enlouquecer.

ESSA CONQUISTA É NOSSA!

Ao professor Cacio Moura-Netto, meu orientador, por sua abnegada e inteligente dedicação ao estudo.

A professora Maria do Socorro Vieira, pela colaboração e atenção a mim dispensadas durante a construção deste sonho. Meu respeito, minha admiração, meu carinho, meus agradecimentos.

A Amanda de Farias Charamba e Matheus Sousa Peixoto pela colaboração na obtenção dos dados e construção deste trabalho.

Ao querido e solicito Bosco sem o qual essa pesquisa não teria se tornado realidade.

Aos meus amigos de disciplina que sempre entenderam a minha ausência.

A todos que direta ou indiretamente me auxiliaram de alguma forma e sempre torceram para que esse trabalho fosse concluído com sucesso,

MUITO OBRIGADA!

Só é lutador quem sabe lutar consigo mesmo.

(Carlos Drummond de Andrade)

PINHEIRO, Rachel Christina de Queiroz. Efeito fotossensibilizador in vitro da violeta de genciana na terapia fotodinâmica sobre cândida albicans. 2015. 33 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2015.

RESUMO

A proposta deste estudo foi avaliar a ação dos corantes violeta de genciana e azul

de metileno, in vitro, sobre Candida albicans, isolados ou como fotossensibilizantes

na TFD. Foi uma pesquisa experimental com abordagem quantitativa. A linhagem

de Candida albicans ATCC 1106 foi inoculada obtendo-se um overnight de 1,37x104

UFC/ml. Foi adicionado 50µl da suspensão fúngica (overnight) em 18,0ml de caldo

Saboraud, a esse conjunto foi adicionado o 0,2ml do corante da violeta genciana a

1%, esperou-se o tempo de preirradiação de 5 minutos e aplicou-se o laser

vermelho, a dose aplicada foi de 100J/cm², com energia total de 3J, depois foram

subcultivadas a 37°C em caldo Saboraud por 1 hora. Ao fim desse período, uma

alíquota de 1,0 ml foi diluída em 9,0ml de solução salina 0,85% esterilizada, foi

plaqueada e semeada 0,1 ml dessa diluição em ágar saboraud. As placas, em

triplicata, foram incubadas em estufa de crescimento de microrganismos a 37°C e

após 48h feito a contagem das UFCs/ml. Além da violeta genciana a 1% combinada

ao laser, foram analisados os grupos: azul de metileno a 1% associado ao laser,

azul de metileno a 1%, a violeta genciana a 1%, e o laser sem adição de corantes.

As análises foram realizadas no software IBM SPSS (21.0) e utilizou-se o teste de

Kruskal-Wallis (Mann-Whitney) e o teste de Friedman (Wilcoxon), adotando-se um

nível de significância de �=5%.. Como resultado observou-se que a violeta genciana

a 1% associada ao laser tem efeito importante contra Candida albicans na terapia

fotodinâmica.

Palavras-chave: Terapia fotodinâmica, Candida albicans, Laserterapia de baixa intensidade, Violeta genciana, Azul de metileno.

PINHEIRO, Rachel Christina de Queiroz. Photosensitizing effect in vitro of gentian violet in photodynamic therapy on candida albicans. 2015. 33 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2015.

ABSTRACT

This study aims to evaluate the action of the dyes gentian violet and methylene blue,

in vitro, on Candida albicans, isolated or as photosensitizer in the TFD. It was an

experimental research with a quantitative approach, the strain of Candida albicans

ATCC 1106 was inoculated obtaining an overnight of 1,37x104 UFC / ml. It was

added 50µl of the fungal suspension (overnight) in 18,0ml of Saboraud broth, to this

set was added 0.2 ml of the gentian violet dye 1%, it was waited 5 minutes of pre-

irradiation time and the red laser was applied, the applied dose was 100 J / cm², at

full power of 3J, then were subcultivated at 37 ° C in Sabouraud broth for 1 hour.

After this time, a part of 1.0 ml was diluted in 9,0ml of saline solution 0.85% sterile, it

was plated and spread 0.1 ml of this dilution in Sabaroud agar. The plates, in

triplicate, were incubated in a microorganism’s growth chamber at 37 ° C and after

48h, the UFCs/ml were counted. Besides the gentian violet 1% combined with the

laser, the following groups were analyzed: methylene blue 1% associated to the

laser, methylene blue 1%, gentian violet 1%, and the laser without adding any dye.

The analyzes were performed in IBM SPSS (21.0) software and was used the

Kruskal-Wallis test (Mann-Whitney) and the Friedman test (Wilcoxon), adopting a

significance level of �=5%. As a result, it was observed that the gentian violet 1%

associated to the laser has an important effect against Candida albicans in

photodynamic therapy.

Key Words: Photodynamic therapy, Candida albicans, Low level laser therapy,

Gencian violet, Blue methylene.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 10

2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 12

2.1 Terapia fotodinâmica ................................................................................. 12

2.2 Azul de metileno ........................................................................................ 14

2.3 Violeta genciana ......................................................................................... 15

2.4 Infecções fúngicas ..................................................................................... 16

3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................. 18

4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 19

4.1 Delineamento do estudo ........................................................................... 19

4.2 Local de realização do estudo .................................................................. 19

4.3 Espécies fúngicas ...................................................................................... 19

4.4 Determinação do efeito fungicida ............................................................ 19

4.5 Laser ........................................................................................................... 21

4.6 Avaliação estatística .................................................................................. 22

5 RESULTADOS ............................................................................................ 23

6 DISCUSSÃO................................................................................................ 26

7 CONCLUSÃO .............................................................................................. 29

REFERÊNCIAS ........................................................................................... 30

10

1 - INTRODUÇÃO

A crescente resistência de fungos e bactérias, em decorrência dos

tratamentos convencionais, resulta na necessidade de buscar alternativas

eficazes de cura. A terapia fotodinâmica (TFD) surge como essa opção, a qual

desde a pesquisa de Raab em 1900, que provou a ação do corante acridina com

a luz de relâmpagos sobre paramécios, encontra-se bem fundamentada

cientificamente.

A TFD foi desenvolvida para combater lesões malignas, porém tem sido

utilizada com sucesso para o tratamento de infecções fúngicas, sendo empregada

com êxito contra Candida albicans (CA) e outras espécies de Candida (LYON et

al., 2011). Esses fungos comumente causam infecções das mucosas e pele em

pacientes com imunidade comprometida (MITRA, 2011).

Devido ao aumento da resistência as drogas antifúngicas disponíveis

comercialmente, pesquisas são realizadas no intuito de se obter alternativas de

tratamento (CALZAVARA-PINTON, 2012; LI 2013). Por isso, muitos autores estão

realizando continuamente estudos na área de TFD, os quais têm mostrado efeito

bactericida e fungicida em microrganismos orais, a partir da terapia com laser de

baixa intensidade (TLBI) (MAVER-BISCANIN, 2005; QUEIROGA, 2011; LI, 2013).

Essa terapia baseia-se no conceito de que um corante não tóxico,

conhecido como um fotossensibilizador (FS) costuma localizar-se,

preferencialmente, em certos tecidos ou células e, subsequentemente, ser ativado

pela luz visível, produzindo espécies reactivas de oxigénio (EROS), as quais

podem matar as células que se ligam ao FS (DAI, 2011; MACHADO-DE-SENA,

2014).

A multiplicidade de alvos nas células (mitocôndrias, lisossomos e núcleos)

dos fungos reduz o risco de cepas resistentes fotomutantes e este risco é

minimizado pela ausência de efeitos mutagênicos da TFD (CALZAVARA-

PINTON, 2012), a qual pode ser repetida várias vezes, sem indução aparente de

11

resistência, já que o DNA não é o alvo principal das EROS (MAISCH, 2009). O

perigo de danos no DNA em fungos é reduzido pela presença de uma membrana

que envolve o núcleo, atuando como uma barreira para a penetração de corantes

ou seus fotos produtos de alta energia (ZEINA, 2001).

Diferentes tipos de FSs são propostos na TFD. A interação entre o FS, a

membrana celular e estruturas intracelulares são de grande relevância na

resposta a TFD. Devido à grande diversidade de microrganismos, um FS com

propriedades físico-químicas distintas pode ser requerido (DOVIGO et al., 2011).

O Azul de metileno (AM) e a violeta genciana (VG) são

fotossensibilizadores catiônicos, das classes das fenotiazinas e dos triarilmetanos,

por serem relativamente lipofílicos, permeiam membranas e com carga positiva

são atraídos pelo potencial negativo das mitocôndrias, podendo atuar nesta

organela. Gerando EROS. Sendo que o primeiro gera reações do tipo II e o

segundo, reações do tipo I (OLIVEIRA, 2011).

Já sabendo dos resultados positivos da ação da VG como antifúngico

sobre CA, este trabalho objetivou avaliar a ação dos corantes violeta de genciana

e azul de metileno, in vitro, sobre Candida albicans, isolados ou como

fotossensibilizantes na TFD.

12

2 - REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Terapia fotodinâmica

A terapia fotodinâmica tem sido utilizada como alternativa para inativação

de microrganismos patogênicos em que uma combinação de um

fotossensibilizador e uma fonte de luz visível, na presença de oxigênio, é utilizada

nesse processo (HILF, 2007; MAISCH, 2009; LYON et al., 2011; BRESKEY et al.,

2013). Estudos com essa terapia estão em desenvolvimento para várias

aplicações na área da oncologia, dermatologia e oftalmologia. Já na odontologia a

cavidade oral é indicada para a TFD, já que é fácil o acesso para a iluminação

(PERNI, 2011).

O efeito antimicrobiano potente e de amplo espectro destacou esta terapia

como um tratamento alternativo promissor para infecções localizadas (KATO,

2013). Muitos relatos na literatura confirmaram inativação eficiente de várias

espécies de bactérias e leveduras após a luz e PS serem aplicados sobre as

células. (LYON, 2011; PERNI, 2011; KATO, 2013; LI, 2013)

O Fotossensibilizador tem sido usado na TFD por absorver luz com

elevada eficiência, sendo capazes de induzir ou participar de reações

fotoquímicas. Como a maioria das espécies microbianas não tem componentes

fotossensíveis endógenos é importante o uso de um fotossensibilizador capaz de

atrair luz e iniciar a formação de radicais livres (WILSON, 1993). As drogas

fotossensibilizadores atuam com um agente de absorção óptica ou cromóforo,

que produz fluorescência após a irradiação, causando citotoxidade no meio

(PUPO, 2011)

Após a luz ativar o FS, poderá seguir dois caminhos para gerar ERO: O

tipo I envolve a interação direta do FS com o meio para gerar radicais ou íons de

radicais como radicais hidroxila (HO) e ânions super óxido (O2); O tipo II,

geralmente, ocorre a geração de oxigênio singleto pela excitação do FS por

transferência de energia direta do estado tripleto do FS para a molécula do

13

oxigênio. A ERO gerada reage rapidamente com o seu ambiente dependendo da

localização da ativação do FS (MAISCH, 2009).

Figura 1 - O mecanismo de ação da terapia fotodinâmica. Números em sobrescritos denotam o número de elétrons desemparelhados em cada molécula. Adaptado de Konan et al. (2002)

Em qualquer caso (Tipo I/Tipo II), o tempo de vida das espécies reativas é

relativamente baixa, o que implica que a ação do dano está focada no tecido alvo,

sem afetar os tecidos vizinhos, de uma forma significativa (LYON, 2011).

O oxigênio singleto gerado pela excitação de fotossensibilizadores é um

agente de oxidação não específica. Consequentemente, não há nenhuma defesa

celular contra ela. De fato, enzimas antioxidantes, como a superóxido-dismutase e

catalase são inativadas por ela. Isso significa que não deve haver nenhuma

diferença na suscetibilidade à TFD entre organismos resistentes a antifúngicos

convencionais e os seus homólogos. A alta reatividade do oxigênio singleto tem

outras vantagens, porque apesar de a localização do fotossensibilizador poder ser

determinada pelas suas propriedades físico-químicas, a difusão de oxigênio

singleto deve ser suficiente para ser capaz de inativar outras estruturas e

biomoléculas. Portanto, é pouco provável que os fungos possam desenvolver

resistência ao oxigênio singleto. Além disso, os processos de TFD nunca foram

associados com efeitos mutagênicos nos microrganismos e o oxigênio singleto só

está presente durante a iluminação e os fungos não são continuamente expostos

a ela, como eles são com antifúngicos convencionais. O oxigênio singleto não

pode viajar para outras partes do corpo, tais como o trato intestinal, durante o

14

tratamento. Estes últimos fatos tornam o desenvolvimento de resistência ainda

mais improvável (DONNELLY et al., 2008).

Dois pontos devem ser considerados quando a eficácia do procedimento

fotodinâmica é avaliada: (i) a concentração do fotossensibilizador no tecido alvo,

(ii) a intensidade de fótons incidentes no tecido alvo (LYON, 2011). Uma

concentração demasiadamente elevada de FS irá dificultar esse corante de se

ligar a célula microbiana que se dejesa, e a luz será absorvida, inutilmente, por

moléculas de corantes não ligados a qualquer célula microbiana. (DAI, 2011).

Os passos básicos de TFD incluem: (1) a administração de um FS (um

produto químico capaz de induzir uma reação fotodinâmica que transfere energia

para o tecido), (2) o tempo de espera suficiente para a absorção de local ou

sistêmica do fármaco – tempo de preirradiação - TIP, e (3), em seguida, irradiar

com uma luz a área de tratamento ou dentro do paciente para desencadear a

reação fototóxica (BRESKEY et al., 2013).

Quando comparado com outras terapias, a TFD tem várias vantagens, tais

como elevada especificidade alvo (PS pode ser entregue às células e a luz pode

ser centrada no local da lesão), tem pouco efeito colateral indesejável e pouca

probabilidade de levar ao desenvolvimento de resistência por microrganismos,

este tratamento não está associado com o efeito genotóxicos ou mutagênicos

para fungos (DONNELLY et al., 2008).

2.2 Azul de metileno

Os estudos demonstram a TFD com azul de metileno (AM) aumentando a

permeabilidade da membrana de CA, podendo diminuir a resistência desta

levedura a tratamentos adicionais com outras drogas. Esses corantes são

conhecidos por se localizarem na membrana plasmática de leveduras, logo, este

é a estrutura danificada após a iluminação e foi proposta que o aumento da

permeabilidade, resultante de tal dano, é a razão para a morte celular (GIROLDO

et al., 2009). Para outros autores esse FS é um inibidor da respiração

(MORALES, 2013).

15

2.3 Violeta genciana

Violeta genciana (VG) é uma mistura de corantes triarilmetanos, usada

para tingir o cabelo, colorir papel ou têxteis, e é usado em laboratórios de

microbiologia. Derivado do alcatrão de carvão tem sido amplamente utilizado

como um produto antisséptico. Sua atividade antimicrobiana tem sido reconhecida

e é recomendada para tratamento de candíase (MARDH, 2002). O mecanismo de

ação da VG não está relacionado com uma lesão primária da membrana

citoplasmática sendo provavelmente relacionada com a inibição de uma via

metabólica (ELVES, 2012).

A Organização Mundial de Saúde recomenda a aplicação tópica de GV em

uma concentração de 1% para o tratamento inicial de candidíase oral em

pacientes infectados pelo HIV em contextos de recursos limitados, uma vez que o

custo do tratamento tem um custo baixo, é bem tolerado (MALEY, 2013). No

entanto, devido às suas propriedades de coloração e estigma a VG não é usado

atualmente para o tratamento da CA. Estudos realizados por Jurevic, 2011, em III

ensaio clínico multicêntrico internacional para avaliar a segurança e eficácia de

violeta de genciana em comparação em concentrações diferentes de VG mostrou

que esse FS na concentração de 0,00165% não mancha a cavidade oral, é

estável, bem tolerada, e possui uma potente atividade anti-Candida. Em uma

pesquisa realizada por ELVAS em 2012, ela concluiu que VG apresenta uma

atividade fungicida contra a maioria Candida spp, onde a C. albicans e C.

tropicalis foram às espécies mais suscetíveis. Estudos já confirmam o potencial

de ação da VG no tratamento da candidíase oral devido à sua atividade

antibiofilme e antigerminação, é possível que a produção de radicais

hidroxil/peroxido pode facilitar a penetração de GV através da matriz levando a

inibição da síntese da parede celular dos fungos. Os estudos clínicos para

determinar a eficácia da GV no tratamento desta doença são garantidos

(TRABOULSI et al., 2011)

Uma dificuldade é que a administração destes FSs altamente coloridos

para os seres humanos provoca uma coloração indesejável de dentes, lábios e

mucosa bucal (CALZAVARA-PINTON, 2012). Porém, estudos in vivo

16

demonstraram que a cavidade oral é especialmente adequada para a TFD, pois é

relativamente acessível para a iluminação (DURTBUDAK, et al., 2001; PERNI,

2011), onde o FS fornecido e a aplicação de luz são fáceis de se manusear

(LYON et al., 2011).

200 300 400 500 600 700 800 900

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abs

orbâ

ncia

(u.

a)

Comprimento de onda (nm)

ADV DAUF UNIPHAR1 UNIPHAR

584

301 247

207

Gráfico1- Mostra o comprimento de onda na qual a VG absorve melhor a luz. As bandas aparecem em torno de 584 nm, 301 nm, 247 nm e 207 nm. Gentilmente cedido por João Jarllys Nóbrega de Souza, aluno de doutorado em química,

2.4 Infecções fúngicas

A incidência de infecções fúngicas superficiais e profundas tem aumentado

significativamente ao longo dos últimos 20 anos. Várias razões têm sido proposta

para o aumento da incidência de infecções fúngicas, incluindo o aumento do uso

de medicamentos antineoplásicos e imunossupressores, antibióticos de amplo

espectro, próteses, enxertos e cirurgias mais agressivas (DONNELLY et al.,

2007), até porque com o desenvolvimento da medicina, no campo da cirurgia e

transplantologia, tem aumentado de forma dramática o número de indivíduos

imunocomprometidos, os quais são mais susceptíveis a infecções fúngicas,

17

(KARKOWSKA-KULETA, 2009). Micoses invasivas representam uma ameaça

exponencialmente crescente para a saúde humana devido a uma combinação de

diagnóstico lento e a existência de, relativamente, poucas classes de drogas

antifúngicas disponíveis e eficazes, podendo resultar em alta mortalidade (DAI et

el., 2012).

Muitos dos fatores de virulência fúngica tem se desenvolvido naturalmente

durante a evolução do organismo e originalmente atua como uma defesa contra

condições ambientais desfavoráveis e por este caminho muitos deles tornou-se

importante como fatores de virulência, facilitando a infecção (KARKOWSKA-

KULETA, 2009).

A Candida albicans apresenta-se como a mais prevalente espécie

envolvida em infecções (LYON et al., 2011), representam uma das micoflora

oportunistas da cavidade oral com especial importância para a saúde humana

(GRICE, 2012), provoca micoses superficiais e doença sistêmica disseminada

(PFALLER, 2007). Há também aqueles pacientes com leucemia,

imunossupressão, usuários de corticoides, pacientes com outras condições

debilitantes que podem desenvolver infecções sistêmicas e/ou locais mais graves,

extensas e difíceis de serem tratadas na presença desse fungo (EGGIMANN et

al., 2003, PUPO, 2011).

A alta taxa de mortalidade das infecções invasivas por cândida e

disponibilidade limitada de agentes antifúngicos eficazes torna necessário

desenvolver novas terapias antifúngicas. (LI, 2013).

A TFD reduz a habilidade de a CA causar uma infecção sistêmica (KATO,

2013)

18

3 - PROPOSIÇÃO

A proposta deste estudo foi avaliar a ação dos corantes violeta de genciana

e azul de metileno, in vitro, sobre Candida albicans, isolados ou como

fotossensibilizantes na TFD.

19

4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Delineamento do estudo

Foi realizado um estudo do tipo experimental e quantitativo em laboratório,

aonde foi testada, in vitro, a VG a 1% como fotossensibilizador de terapia

fotodinâmica.

Por ser uma pesquisa que não envolve seres humanos não foi necessária

a apreciação no comitê de ética.

4.2 Local de realização do estudo

A pesquisa foi realizada no Laboratório de Genética de Microrganismos do

Departamento de Biologia do Centro de Ciências Exatas e da Natureza da

Universidade Federal da Paraíba na cidade de João Pessoa-Pb, no período

compreendido entre dezembro de 2014 a janeiro de 2015.

4.3 Espécies fúngicas

Foi utilizada, na presente pesquisa, a linhagem de Candida albicans ATCC

1106 (padrão internacional, referência), pertencente a coleção de microrganismos

do Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro

de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba-João Pessoa-Pb.

4.4 Determinação do efeito fungicida

A metodologia desta pesquisa utilizou o método proposto por Craig;

Gudmundson (1991) (Pereira et al, 2014) modificado para a determinação

fúngica, a linhagem de Candida albicans ATCC 1106 foi inoculada em caldo

Saboraud incubadas a 37°C por 18-20 horas, obtendo-se um overnight de

1,37x104 UFC/ml. Foi adicionado 50µl da suspensão fúngica (overnight) em

18,0ml de caldo Saboraud, a esse conjunto foi adicionado o 0,2 ml do corante AM

20

a 1% ou a VG a 1%,, em seguida levamos esse conjunto para o vortex, logo após

plaqueamos, esperou-se o tempo de preirradiação (TPI) de cinco minutos e

aplicou-se o laser. A dose aplicada foi de 100J/cm², com energia total de 3J,

numa distância de 1,0 cm por ponto em toda extensão da placa de petri, com a

ponta a 1,0 cm de altura da placa, depois foram subcultivadas a 37°C em caldo

Saboraud por 1 hora. Ao fim desse período, uma alíquota de 1ml era diluída em

9ml de solução salina 0,85% esterilizada e levada para o vortex, que foi diluída

convenientemente, em seguida foi plaqueada e semeada em ágar saboraud 0,1

ml desse subcultivo. As placas foram incubadas em estufa de crescimento de

microrganismos a 37°C. A contagem de células viáveis neste tubo foi determinada

e designada como o tempo 0 para a determinação do efeito pós-antimicrobiano. O

recrescimento da cultura foi monitorado por um período de 0, 24 e 48 horas, pelo

método padrão de contagem em placas. A leitura das placas foi efetuada após

incubação por 48 horas a 37° C. Os experimentos foram realizados em triplicata.

Os resultados da contagem de células viáveis (UFC/ ml) da cultura tratada foram

descritos em tabela.

A sequência foi respeitada na manipulação e determinação do efeito

fungicida e na contagem das UFCs, com exceção do TPI, que não foi necessário,

para os grupos dos corantes AM a 1% e VG a 1% sem usar o laser, para o grupo

controle e para o grupo do laser sem FS.

21

Figura 2- Esquema do passo a passo da metodologia

Figura 3- Esquema para aplicar o laser a 1cm de distância

4.5 Laser

Foi empregado o Laser vermelho semicondutor (GaA1As e InGaAlP),

aparelho laser DUO MMOPTICS São Carlos, SP, Brasil (Fig. 4), com

comprimento de onda (λ) de 660 nm, a potência do parelho foi de 100 mW., a

dose aplicada foi de 100J/cm², com energia total de 3J, numa distância de 1 cm

por ponto em toda extensão da placa de petri, com a ponta do spot a 1cm de

altura da placa, a emissão do laser foi contínua, com o modo de operação

pontual. Essas especificações foram indicadas pelo fabricante do aparelho no

18,Oml CALDO SABARAUD +

50µ OVERNIGHT

0,2ml CORANTE

1ml SUSPENSÃO

FÚNGICA + 9ml SOLUÇÃO

SALINA 0,85%

1h ESTUFA

DILU

IR

0,1ml ÁGAR

SABARAUD ESTUFA 48h

UFCs

22

caso de terapia fotodinâmica sem fibra óptica As placas de petri selecionadas

para o uso do FS + laser esperou o tempo de preirradiação de 5 minutos.

Figura 4: Aparelho laser DUO MMOPTICS São Carlos, SP, Brasil.

4.6 Avaliação estatística

Realizou-se o teste de normalidade (Shapiro-Wilk) para verificar a

distribuição dos dados, onde se observou que, para todos os grupos, a

distribuição das contagem de UFCs foi não-normal (p<0,05). Na comparação das

médias de UFCs entre os grupos, nos mesmos períodos de tempo, realizou-se o

teste de Kruskal-Wallis e, na comparação entre os grupos, dois a dois, realizou-se

o teste de Mann-Whitney. Já para a comparação da contagem de UFCs dentro

dos grupos, nos diferentes períodos de tempo, utilizou-se o teste de Friedman,

sendo as diferenças identificadas mediante o teste de Wilcoxon. Para todas as

análises adotou-se um nível de significância α=5%. As análises foram realizadas

no software estatístico IBM SPSS (21.0).

23

5 - RESULTADOS

Na referida pesquisa quando se utilizou a VG a 1% associado ao laser, foi

realizado a TFD, observou-se que na 0h houve uma diminuição nas UFCs, porém

nas 24h e 48h não houve formação de colônias, o que pode ser observado na

Tabela 1.

Ao se pesquisar apenas a VG a 1%, foi observado que, na 0h, houve uma

redução nas UFCs, e nas 24h e 48h não houve formação de colônias (Tabela 1).

Quando se pesquisou o AM a 1% combinado com o laser, ou seja, foi

efetivado a TFD, constatou-se que na 0h houve uma redução das UFCs, e nas

24h e 48h não houve o desenvolvimento de UFCs (Tabela 1).

No grupo do AM a 1% isolado foi registrado que a 0h, 24h e 48h houve um

aumento gradativo na formação das UFCs (Tabela 1).

No grupo em que apenas o laser foi utilizado, houve uma diminuição das

UFCs na 0h, e nas 24h e 48h não houve produção dessas colônias (Tabela 1).

Figura 5- Grupo dos FSs + Laser; Grupo dos corantes sem laser; Grupo do laser e Grupo controle no T0h

24

Figura 6- Grupo dos FSs + Laser; Grupo dos corantes sem laser; Grupo do laser e Grupo controle no T24h

Figura 7- Grupo dos FSs + Laser; Grupo dos corantes sem laser; Grupo do laser e Grupo controle no T48h

25

Tabela 1. Valores médios para as Unidades Formadoras de Colônia (UFC’s) obtidas para o grupo controle e para os grupos tratados com Laser, Violeta, Laser + Violeta, Azul de metileno e Laser + Azul de metileno, nos tempos “0h”, “24h” e “48h”.

Grupo

Tempo Controle Laser Violeta Laser +

Violeta

Azul de

metileno

Laser + Azul

de metileno

0h 3,43 X 10³ A a

6,10 x 10² A b

2,04 x 10³ A

c

1,95 x 10³ A

c

4,9 x 10³ A d

1,73 x 10³ A c

24h 1,53 x 106 B a

0 B b

0 B b

0 B b

1,64 x 106 B a

0 B b

48h 2,45 x 108 C a

0 B b

0 B b

0 B b

1,37 x 107 C c

0 B b

Valores expressos em UFC/ml. Letras maiúsculas iguais em colunas e minúsculas iguais em linhas indicam não haver diferenças estatisticamente significantes (p> 0,05) entre os grupos. Teste de Kruskal-Wallis. Teste de Friedman.

26

6 - DISCUSSÃO

A resistência de microrganismos aos medicamentos utilizados para tratar

infecções (DOVIGO, 2011;SHARON, 2012; CALZAVARA-PINTON, 2012; LI,

2013) causa sérios danos em pacientes imunocomprometidos e debilitados

(CARVALHO, 2009; MITRA, 2011; DAI, 2012), podendo aumentar as infecções

sanguineas (ATALAYA, 2015), elevando a morbidade e mortalidade dos

pacientes. Os estudos em busca de uma terapia que proporcione a cura, sem

causar resistência vêm crescendo na atualidade, surgindo, desta forma, a TFD.

Por reduzir a habilidade de a Candida albicans causar uma infecção

sistêmica (KATO, 2013; MALEY, 2013) a TFD tem sido considerada um

tratamento alternativo promissor para infecções localizadas (LYON, 2011; PERNI,

2011; LI, 2013; PAZ-CRISTOBAL, 2014), apesar de Javed, 2014, concluir, em

um artigo de revisão, que a eficácia clínica antimicrobiana da TFD, como uma

estratégia terapêutica potente para infecções fúngicas orais, requer mais

investigações.

É comum usuários de prótese apresentarem candidíase, uma infecção

oportunista multifatorial, decorrente da ação patogênica do fungo CA, sendo

considerada a doença de maior prevalência na mucosa oral (SHARON, 2010;

MORALES, 2013; FORD, 2015;). Apesar das orientações quanto à higiene e a

recomendação do uso de antifúngicos, observa-se frequente recorrência dessa

infecção (NEPPELEMBROEK, 2008).

A VG é um tradicional fungicida agente utilizado para o tratamento de

candidíase (VAZQUEZ, 2002; MARDH, 2002), é muito comum o seu uso em

crianças e idosos, além de pacientes portadores de vírus HIV.

Ao se associar, nesta pesquisa, a VG a 1% com o laser vermelho (660nm),

foi constatado que houve uma redução, nas primeiras horas, de colônias

formadas, e, no decorrer das horas, não foi verificado a presença de UFCs. No

estudo realizado por Oliveira, 2011, em célula de adenosarcoma, in vitro, ele

27

utilizou a VG a 1% associado com o laser Nd:YAG, o resultado foi satisfatório,

nesta mesma pesquisa, o pesquisador também utilizou o AM a 1% com o laser

Nd:YAG, os resultados foram satisfatórios.

Neste estudo, ao se utilizar a VG a 1%, sem a TFD, foi observado que na

0h houve uma diminuição das UFCs, e nas 24h e 48h não houve formação de

colônias. Traboulsi, 2011, testou concentrações menores do FS, a VG a 4µg/ml

(0,0004%), reduziu a massa de biofilmes em pacientes com o vírus HIV, porém

ele conclui que quanto maior for a concentração da VG, melhores são os

resultados obtidos. Jurevic, 2011 também utilizou pacientes HIV (+) para testar se

a concentração da VG fazia diferença no tratamento da CA, utilizou

concentrações variadas e mostrou que a concentração de 0,00165%, a mais

baixa testada por ele, mostrou-se estável, bem tolerada, não manchou a mucosa

oral e possuiu potente ação contra a CA. Apesar de esses dois últimos estudos

terem um resultado bom com concentrações mais baixas da VG, visto que

buscavam tratar pacientes sem trazer o desconforto de corar a boca, ainda houve

formação de UFCs.

Ao ser testado o corante AM a 1% com o laser, foi analisado que ele,

gradativamente, com o tempo, diminuiu as UFCs, ou seja, tem ação antifúngica.

Teichert, 2002, utilizou concentrações mais baixas do corante AM, e quase todas

reduziram as UFCs, porém as concentrações do AM a 0,045% e 0,05% foram as

únicas que obtiveram resultados semelhantes a este estudo, não havendo

crescimento de colônias. Souza, 2006 utilizando a concentração de 0,01%

também conseguiu reduzir o número de UFCs. Corroborando com esta pesquisa,

há um consenso de que o AM pode ser utilizado com excelentes resultados (MIA

2011; QUEIOROGA, 2011; KHADEMI, 2014). Deve-se ter precaução ao se

determinar as concentrações dos FSs, pois uma concentração mais alta faz-se

necessário para uma eficácia maior da TFD, porém concentrações muita altas

tendem a não ser absorvidas pelos fungos, dificultado a ação da TFD (DAI, 2011;

KATO, 2013)

28

Quando se utiliza o AM a 1% sem o laser, foi possível observar um

aumento do número de CA, porém Souza, 2006 afirma que houve uma redução,

embora não significativa, ou seja, não é viável o uso do AM sem a TFD.

No presente estudo, ao ser testado o laser sem FS, foi constatado ser fatal

para microrganismo, confirmando esses resultados está a pesquisa de Maver-

Biscanin, 2004, uma pesquisa in vivo, que comparou o uso do laser de

comprimento de onda de 685nm e 830nm, com o uso de gel oral antifúngico

(myconazolum), associado a uma solução antisséptica para a prótese Com base

nesta pesquisa, os autores relatam que não há condição de concluir se o efeito

fungicida foi alcançado devido ao efeito da bioestimulçaõa do LBI, ou devido a

efeitos fototérmico ou fotodinâmico relacionada com cromóforos endógenos

presentes nos fungos. Indo de encontro a esses achados está a pesquisa de

Sousa, 2006, que não apresentou redução para a CA e sim para a Candida

tropicalis ao usar apenas o laser sobre esses fungos.

29

7 -CONCLUSÃO

� A violeta genciana e o azul de metileno, associados ao laser, assim como a

violeta genciana e o laser isolados são capazes de impedir a formação de

colônias para o fungo Candida albicans;

� Ao analisar, in vitro, a capacidade antifúngica do azul de metileno sem

associação com o laser, verificou-se que não apresentou atividade

antifúngica;

� Ao confrontar o efeito antifúngico da terapia fotodinâmica do azul de

metileno e da violeta de genciana, conclui-se que ambos têm atividade

antifúngica sobre a candida albicans.

30

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