UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA - UTM y... · (2N) a 150 rpm/4 horas Se ajustó el pH a 2...
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA
DE LA MIXTECA
Producción de lacasa a partir de hongos
ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de
origen mezcalero
Avances
Alumna: I.A. Stefi Castillejos-Márquez
Director de tesis: Dr. Vania S. Robles-González
Co- Director: Dra. Ireri V. Robles-González
Asesores:
Dra. Edith Graciela González Mondragón
Dr. Raúl Salas Coronado
Dr. Rogelio Valadez Blanco
Huajuapan de León, Oaxaca. Mayo de 2014
Contenido Introducción
Justificación
Hipótesis
Objetivos
Metodología
Resultados y discusión
Conclusiones
2
Abreviaturas
• AE: Actividad enzimática
• CDS: Caldo dextrosa sabouraud.
• DQO: demanda química de oxígeno
• EM : Extracto de malta
• HL: hongo ligninolítico
• Lac: Lacasa
• Lip: lignino peroxidasa
• MC: medio de cultivo
• MnP: manganeso peroxidasa
• PeAh: Penca de agave Augustifolia haw (Espadín)
• PePz: Penca de agave Potatorum zucc (tóbala)
• PDS: papa dextrosa sabouraud.
• PiPz: Piña de agave Potatorum zucc (tóbala)
3
Introducción
Enzimas
4 Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012
Producción de enzimas
Organismo
• Bacteria
• Hongo
• Planta, etc.
Sistema fermentativo
• Sustrato
• Tipos de cultivo
• Condiciones de cultivo.
Recuperación
• Métodos Físicos
• Métodos químicos
5
6
Costos
elevados
Desechos industriales
Shin y Lee, 2000; Si, 1994; Ren et al., 2007; Steele et al., 2005; Kahraman y Yesilada, 2001; Pant y Adholeya, 2007
Comúnmente contienen
compuestos recalcitrantes como
fenoles, lignina, celulosa, etc;
7
Pueden utilizar como
sustrato a los
desechos debido a
enzimas que
producen
Dellamatrice, et al 2005; Archibald, et al., 1997; Takemori et al., 1992
8
Hongos
ligninolíticos (HL) Lacasa
(Lac)
Lignino
peroxidasa
(LiP)
Manganeso
peroxidasa
(MnP)
Pleurotus spp.
Trametes
versicolor. Homolka, et al., 1997, Mijiashvili, et al., 2006; Mendonça et al., 2010; Gedikli, et al., 2010; Archibald, et al., 1997; Osma, et
al., 2010
Aplicaciones de la lacasa
Lacasa
Textil
Papelera
Ambiental
Alimentaria
9
Proceso de elaboración del mezcal
Materia prima Trozamiento Cocimiento
(Hidrólisis)
Mieles de
cocimiento
Molienda Bagazo
15 a 20 kg /L
de mezcal
Rectificación
Fermentación
Destilación
Vinazas
8 a 15L / L de
alcohol
destilado
10 Robles- González et al., 2011
14 millones de
litros de vinazas
19 millones
de kg de
bagazo
11 Duarte et al., 1997; Sangave et al., 2007; García et al., 1997; Jiménez et al., 2003; Coca et al., 2005; Robles- González et
al., 2011; Romahnolo- Herrera, et al., 2011
Vinazas
DQO 70,000–150,000 mgO2/L DBO
35,000–50,000 mgO2/L
pH ácido 3.5 -4.5
Nitrógeno 900 mgNH3-
N/L
Azúcares reductores 962mg/L
Fenoles 478.4 -541.8 mg de ácido
gálico/L
Color oscuro
Características fisicoquímicas de las
vinazas.
Sistemas fermentativos
Enzimas
Fermentación en cultivo sumergido
Fermentación en estado
sólido
12 Aguilar et al., 2008; Toca et al., 2009; Moldes et al., 2003; Vintila et al., 2008
- Ambiente similar al
del hábitat natural
del hongo.
-Bajo requerimiento
energético
-Bajo costo
-Baja producción de
aguas de desecho
-Mayor facilidad para
obtener datos de pH,
acidez.
- Mejor extracción
del sustrato
producido
- Mejor transferencia
de nutrientes.
Métodos de extracción y
purificación
Precipitación, centrifugación y re- suspensión
Cromatografía de intercambio
iónico Identificación por cromatografía en
gel
13
Uso de membranas
Champagne y Ramsay, 2005; Paszczynski, et al., 1994; Shraddha, et al., 2011
Justificación del problema
• El estado de Oaxaca produce el 60% de mezcal a nivel
nacional, en el año 2012 se generaron cerca de 14
millones de litros de vinazas y más de 19 millones de
kilos de bagazo, por lo cual estos residuos pueden ser
aprovechados para la producción de lacasa.
14 COMERCAM, (2010-2011)
Originalidad
• La originalidad del trabajo radica en los siguientes puntos.
i) El uso de residuos de la industria mezcalera (vinazas y bagazo) para la producción de lacasa.
ii) Evaluación de actividad enzimática de lacasa en cepas de Pleurotus spp. (Parentales e híbridos) aisladas en la UTM.
iii) Formación y uso de pellets dobles (HL+bagazo).
15
Hipótesis
• La presencia de azúcares residuales de la fermentación
de agave así como de ácidos fenólicos en las vinazas de
origen mezcalero servirán como medio de cultivo para la
producción enzimática de lacasa empleando Trametes
versicolor y Pleurotus spp.
16
Objetivos
• General
– Producir lacasa a partir de Pleurotus spp. y
Trametes versicolor empleando vinazas y
bagazo de origen mezcalero como sustrato.
17
Objetivos • Específicos
– Efectuar la caracterización fisicoquímica del bagazo y las vinazas mezcaleras.
– Realizar el cultivo, propagación y mantenimiento de Pleurotus spp. y Trametes versicolor en medio sólido y líquido.
– Realizar la formación de pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo) para utilizarlos como biocatalizadores.
– Evaluar la actividad enzimática de lacasa utilizando pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo).
– Evaluar la influencia de la concentración de fructosa en vinazas en la producción de la enzima lacasa.
– Realizar la separación, extracción y purificación parcial de la lacasa del medio de cultivo líquido.
18
METODOLOGÍA
19
Plan general de trabajo
20
Caracterizar fisicoquímicamente las
vinazas y el bagazo de origen
mezcalero
Evaluar los medios de cultivo
sólidos y líquidos
Evaluar la actividad enzimática de las cepas de
Pleurotus spp.y de Trametes versicolor.
Mantener y propagar los hongos
ligninolíticos
Fermentación en estado sólido
(bagazo + HL)
Obtener la enzima
Extraer e identificar la enzima lacasa producida
por el hongo ligninolítico que presente la mayor
actividad enzimática
Seleccionar las cepa de Pleurotus spp. con mayor actividad enzimática
Formar el biocatalizador
(bagazo+HL) (cepas con mayor
actividad enzimática)
FASE I: Caracterización fisicoquímica de vinazas
21
Parámetro Método
pH Método estándar 423
Demanda Química de Oxígeno
(mgO2/L)
Método estándar 5220 D
Sólidos suspendidos volátiles, fijos y
totales (mg/mL)
Método estándar 2540
Conductividad (µS/cm) Método estándar 2510 B
Sulfatos (mg SO2- 4/L Método 8051 HACH MR
Fosfatos (mg PO3- 4/L) Método 8048 HACH MR
Nitrógeno total (mg N/L) Método 10071 HACH MR
Fenoles totales (mg ácido gálico/L) Box, 1983
Color (abs 580 nm) Peña et al., 2003
Aromáticos totales (abs 254 nm) Benitez et al., 2003
Minerales: Cu+2, Na+1, K+1, Ca+2, Zn+2,
Fe+3, Mg+2, Ni+2, Cd+2.
Método estándar 3111 B
Azúcares reductores König et al., 2002
22
FASE 1: Caracterización fisicoquímica de
bagazo
Parámetros Método
Fenoles totales (mg ácido
gálico/L)
Box, 1983
Minerales: Cu+2, Na+1, K+1, Ca+2,
Zn+2, Fe+3, Mg+2, Ni+2, Cd+2.
Método estándar 3111 B
• Tratamiento del bagazo para
determinación de fenoles totales (hidrólisis
alcalina).
23
Reducción de
tamaño manual
Polvo de bagazo
(malla de 0.5mm)
4 mL de NaOH
(2N) a 150 rpm/4
horas
Se ajustó el pH a 2
con HCl 10%
Hongos ligninolíticos
Cepas parentales de Pleurotus spp.
UTMR UTMB
Híbrido de
Pleurotus spp.
H1R4B6, H2R2B4, H3R2B1, H2R2B2
Trametes versicolor
24 Paula Cecilia Guadarrama Mendoza, 2011. Tesis doctoral
Diseño factorial simple donde el efecto del medio de cultivo a 7
niveles, sobre 1 variables de respuesta serán analizadas (actividad
enzimática).
• Mantenimiento y propagación de las
cepas de HL.
25
Tomar un pedazo de
0.5cm de diámetro de
cajas petri con medio
agar bacteriológico +
extracto de malta
Inocular en medio caldo
dextrosa sabouraud 2%
a Tv y a las cepas de
Pleurotus spp. en el
medio seleccionado en
la fase II
Incubar a
temperatura
30°C/ 7 a
10 días y se
mantendrá
a 4°C
26
Medio de formación de Pellets + Dextrosa (Medio A)
Medio de formación de pellets
+ E.M (Medio B)
CDS al 2% (Medio C)
CDS 2% + E.M
(Medio D)
Diseño factorial simple donde el efecto del medio de cultivo a 4
niveles, sobre 2 variables de respuesta serán analizadas (crecimiento
y actividad enzimática)
FASE II: Evaluación de medios de cultivo
para el crecimiento de Pleurotus spp.
27
Sustrato Sólido
Polvo PiPz
Polvo PePz
Polvo PeAh
Diseño factorial simple donde el efecto del medio sólido a 4 niveles,
sobre 2 variables de respuesta serán analizadas (crecimiento y
actividad enzimática)
FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus
spp que presenten la mayor actividad enzimática
de lacasa y evaluación de actividad enzimática de
Trametes versicolor.
28
Inocular a las
cepas a un
medio líquido
Incubar a
temperatur
a 30°C/ 7 -
10 días
A 4000g /
20
minutos.
Determinación de
actividad
enzimática
Lacasa (1)
1Wolfenden y Wilson, 1982
• Determinación de actividad enzimática de
lacasa
29
300 µL de buffer citrato- fosfatos (0.1 M, pH 3)
100 µL de ABTS 1mM
1 mL de muestra
600 µL de Agua desionizada
ABS=
Wolfenden y Wilson, 1982
FASE IV: Formación del los pellets dobles
(HL+Bagazo)
30
Medio de
cultivo
seleccionado,
por 8-10días
Reducción
de tamaño
Mezcla
30mg de
hongo y 50
mg de
bagazo en
100mL
Agitador
orbital
150rpm
Obtención
de pellets
FASE V: Obtención de lacasa empleando pellets
dobles de HL + bagazo en fermentación en cultivo
sumergido y fermentación en estado sólido.
31
• Bagazo + HL
• Se realizaron experimentos por duplicado, empleando ensayos destructivos
Fermentación en estado
sólido
• Vinazas+ pellets dobles
• Se realizaron experimentos por duplicado
Fermentación en cultivo sumergido
Fermentación en estado sólido
(FES)
32
En cajas petri
adicionar 0.5 g de
bagazo. Esterilizar por 15
minutos a 15 psi.
Adicionar 15 mg
de HL
Muestras destructivas: Consistió en inocular
n muestras e ir tomando una muestra cada
tercer día y evaluar la AE durante 15 días.
33
Enjuagar las cajas
con 5 mL de buffer
Citrato-fosfato 0.1
M, pH 3.
Filtrarlas por filtro
Whatman No. 41,
en filtros gooch
Filtro Econofilter
Agilent 0.45 µm
Realizar la medición
enzimática de lacasa,
cada tercer día.
34
Fermentación en cultivo sumergido
(FCS)
En un matraz con
180 mL de
vinazas diluidas a
674, 917, 1303, y
1918 mg de
fructosa /L añadir
pellets dobles
Agitar a 180 rpm, y
tomar 3 mL cada
tercer día.
Filtrar
empleando
Econofilter
Agilent 0.45
µm, y
determinar la
actividad
enzimática
de lacasa.
Tratamiento control
35
• Medio seleccionado adecuado para el crecimiento del hongo.
• Hongos ligninolíticos
Fermentación en estado
Sólido
• Medio seleccionado adecuado para el crecimiento del hongo.
• Pellets dobles
Fermentación en cultivo sumergido
Diseño experimental
• Cultivo sumergido
– Diseño factorial Na x 4
Donde los factores de origen de la cepa y 4 concentración de fructosa en
las vinazas mezcaleras serán evaluados.
– Realizaran cinéticas por lote cada 15 días
– La variables de respuesta será:
– Actividad enzimática.
Nota: a) N= número de cepas seleccionadas con mayor actividad enzimática
36
Concentración de vinazas
mezcaleras diluidas
mg
fructosa/L mgO2/L
674 5000
917 7000
1303 10000
1918 15000
Diseño experimental
• Cultivo en estado solido
– Diseño factorial de Na x 3, donde el efecto del medio sólido a 3 niveles y
el número de cepas seleccionadas con mayor actividad con N niveles.
– La variable de respuesta será:
– Actividad enzimática.
– Se realizaran cinéticas por lote cada 15 días
Nota: a) N= número de cepas seleccionadas con mayor actividad enzimática.
37
38
FASE VI: Identificación de la enzima
lacasa.
• FCS
Tomar 5 mL del
medio de cultivo
bajo condiciones
estériles. Filtro Econofilter
Agilent 0.45 µm Introducir 500 µL en un centricon
Ultracel 10 Kda, y se centrifugó a
hasta obtener 100 µL de
concentrado.
• Electroforesis SDS-PAGE
39
Se elaboró el
gel SDS-
PAGE 7%
La muestra se
corrió a 120V, por
90 minutos
Se adicionó la
muestra en los
pozos del gel Se
utilizaron
estándares de
pesos moleculares
de Biorad Se realizó la
desnaturalización
térmica de la
muestra con buffer
de carga (1:1)
40
Se sumergió el gel
en la solución
teñidora de azúl
comassie 250G.
El gel se decoloró
con lavados de
agua desionizada
• Electroforesis SDS-PAGE
La tinción (2minutos /1KW) y
la decoloración se realizaron
con calentamiento a
microondas
• Zimograma- Gel nativo
41
Se elaboró el
gel nativo.
(gel
concentrador
al 4% y gel
separador al
7%)
Se colocó el gel
nativo en la cámara
y se adicionó buffer
de corrida
La muestra se
corrió a 120V, por
90 minutos
Se adicionó la
muestra en
los pozos del
gel
Añadir 50 µL de
buffer de carga y
50 µL de muestra.
42
• Zimograma- Gel nativo
Se sumergió el gel
en la solución 1
mM de ABTS
durante 10
minutos.
El gel se enjuago
con buffer citrato
fosfato 0.1 M, pH
3.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
43
Fase I. Caracterización fisicoquímica de vinazas
44
Parámetro Resultados vinazas DQO (mg O2/L) 62500 ± 7053 Fructosa (mg/L) 5900 ± 100 pH 2.4 ± 0.02 Color (abs 475nm) 2.8 ± 0.09 Fenoles totales (mg ácido gálico /L) 497 ± 109 SST (mg/L) 9400 ± 2690 SSF (mg/L) 1200 ± 290
SSV (mg/L) 8200 ± 2970 Conductividad (µS/cm) 4.5 ± 0.01 Na+1 (ppm) 48.3 ± 5.8 K+1 (ppm) 113 ± 21 Ca+2 (ppm)} 541 ± 51 Mg+2 (ppm) 141 ± 22 Fe+3 (ppm) 4.5 ± 0.3 Cu+2 (ppm) 1.82 ± 0.12 Zn+2 (ppm) 0.4 ± 0.03 Ni+2 (ppm) No detectado Cd+2 (ppm) No detectado Compuestos aromáticos totales (abs 254nm) 84.0 ± 3.6 Nitrógeno total (mg N/mL) 45.5 ± 3.5 N-NO3
- (mg/L) 228.8 ± 5.3 NO2
- (mg/L) 455 ± 21 SO4
2- (mg/L) 425 ± 7 PO4
-3 (mg/L) 105 ± 5
45
Parámetros Bagazo de penca de
agave Potatorum zucc
Bagazo de penca de
agave Angustifolia haw
Fenoles totales (ácido
gálico, mg/g de bagazo)
0.038a ± 0.0019 0.014b ± 0.0005
Cenizas (g/g de bagazo) 0.12a ± 0.007 0.11a ± 0.008
Ca+2 (ppm) 265 239a ± 22 520 202 311a ± 6659
K+1 (ppm) 48 159a ± 3814 16 386b ± 4548
Mg+2 (ppm) 34 075a ± 775 26 969a ± 1816
Na+1 (ppm) 894a ± 98 417b ± 119
Fe+3 (ppm) 1106a ± 208 738a ± 195
Cu+2 (ppm) 482a ± 16 480a ± 1
Zn+2 (ppm) 269a ± 47 546b ± 2
Ni+2 (ppm) No detectable No detectable
Cd+2 (ppm) No detectable No detectable
Fase I. Caracterización fisicoquímica del bagazo
Nota: Superíndice a- a: no hay diferencia significativa, a un nivel de significancia de 0.05; superíndice a-b: existe
diferencia significativa. Desing Expert versión 6.0.10.
Medio líquido
• En el medio A y B no se observó crecimiento en las cepas ensayadas.
• En CDS 2% (Medio C) y CDS 2% + extracto de malta (Medio D) se logró el crecimiento.
Medio sólido
• No se observó crecimiento en la piña de agave Potatorum zucc (tobalá).
• En PeAh y PePz si se observó crecimiento y se procedió con al evaluación de actividad enzimática de lacasa
FASE II: Evaluación de medios de cultivo
para el crecimiento de Pleurotus spp.
46
47
Cepa Actividad enzimática
UTM-B (Medio C) 94±7 U/L
UTM-B (Medio D) 248±0.2 U/L
H1R4B6 (Medio C) 6.9±0.1 U/L
H1R4B6 (Medio D) 81±1 U/L
UTM-R (Medio C) 1.6±0-003 U/L
UTM-R (Medio D) 7.4±0.7 U/L
H2R2B4(Medio C) 6.4±0.017 U/L
H2R2B4(Medio D) 18.3±0.7 U/L
H2R3B4 (Medio C) 3.1±1 U/L
H2R3B4 (Medio D) 2.4±0.3 U/L
H3R2B1 (Medio C) 2.9±0.034 U/L
H3R2B1 (Medio D) 81±1 U/L
Tv (Medio C) 538±58 U/L
Actividad enzimática
obtenidas de las
cepas de Pleurotus
spp. y Trametes
versicolor
evaluadas en el
medio C y D; En
cultivo sumergido
Nota: cds: Caldo dextrosa
sabouraod (Medio C).
Cds+em: caldo dextrosa
sabouraud con extracto de
malta (Medio D). TVC: Trametes versicolor.
FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus spp que
presenten la mayor actividad enzimática de lacasa y
evaluación de actividad enzimática de Trametes
versicolor (Tv)
Fase IV. Formación de pellets
dobles. Los pellets dobles formados con BPeAh +PsUTM-B. y BPeAh+Tv presentaron un diámetro promedio de 0.5 ± 0.1 cm.
Pellets dobles formados con BPeAh – Pleurotus spp.(a) o Trametes versicolor (b).
(b) (a)
48
Fase V. Actividad 1. Cinética de AE
evaluadas en FCS.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20
Act
ivid
ad
en
zim
áti
ca
(U/L
)
Tiempo (días)
Cinética de actividad de lacasa empleando pellets de BPeAh-Tv y vinazas
mezcaleras. ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM diluidas a 917 mg
de fructosa/L
49
2402 U/L
997.33 U/L
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 Acti
vid
ad
en
zim
áti
ca (
U/L
)
Tiempo (días)
Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando pellets de BPeAh - Ps-
UTM-B con vinazas mezcaleras ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM
diluidas a 917 mg de fructosa/L.
50
13.9 U/L
1.33 U/L
A concentraciones de 1303 y 1918 mg fructosa/L, no se observó actividad enzimática.
Eggert et al.(1996) reportan que a concentraciones altas de azúcares simples en el medio de cultivo, pueden causar inhibición en la producción de lacasa.
51
52
Hongo ligninolítico (H.L) Descripción Actividad enzimática Ref.
Trametes versicolor (Tv) Se utilizó un cultivo sumergido
empleando vinazas mezcaleras. Se
uso los hongos inmovilizados
formando pellets dobles (Tv+BPeAh)
2402 U/L Nuestros
resultado
s
Trametes versicolor
MZKI G-99
Se utilizó un medio sintético, el cual
se inoculo con pellets del micelio del
hongo.
11.8 U/L 1
Trametes versicolor
ATCC 20869
Se empleo un cultivo sumergido,
utilizando al medio Kirk´s. Se
formaron pellets con el micelio del
hongo para la posterior producción de
lacasa.
1,385 U/L 2
Trametes versicolor
(CBS100.29)
Se empleo un cultivo sumergido
empleando un medio propuesto por
Tien y Kirk, 1988. Se emplearon
pellets formados por el H.L y alginato
de calcio.
4000U/L 3
Actividades enzimáticas mostradas por hongos ligninolíticos.
Notas. 1) Tišma, et al., 2012. 2) Thiruchelvam y Ramsay, 2007. 3) Dominguez, et al., 2007
Resultados de actividad enzimática obtenidos en FCS.
Microorganismo AE de lacasa
(U/L) obtenida
en medio de
cultivo
Medio D
AE de lacasa
(U/L) obtenida
en medio de
cultivo
Medio C
AE de lacasa
(U/L) obtenida en
Medio de cultivo
empleando
concentración de
fructosa de 674
mg/L
AE de lacasa (U/L)
obtenida en medio
de cultivo
empleando
concentración de
fructosa de
917mg/L
Trametes
versicolor
CDBB-h-1051
NE 538 ± 58 NE NE
Pleurotus spp.-
UTM-B
248 ± 0.2 94 ± 7 NE NE
Pellets dobles
formados con
BPeAh-Tv
NE 38a ± 11 881a ± 163 350a ± 77
2402b ± 76
Pellets dobles
formados
BPeAh-Ps-UTM-
B
No presentó
actividad
enzimática
NE 1.3a ± 0.02 13.9a ± 0.5
53
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 3 6 9 12 15
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
(U/L
)
Tiempo (días)
Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando Tv– Polvo
BPePz (◊) y BPeAh (□).
Fase V. Actividad 2. Cinética de Actividad
enzimática de lacasa en FES.
386.9 U/L
225.6 U/L
0
5
10
15
20
25
30
35
0 3 6 9 12 15
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
(U/L
)
Tiempo (días)
Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando Ps- UTM-B – Polvo de
BPeAh (□).Polvo de BPePz (◊).
55
33.1 U/L
23.1 U/L
Fase VI. Separación e identificación de lacasa obtenida
en FCS empleando Trametes versicolor y BPeAh
mediante ultrafiltración, SDS-PAGE y zimogramas.
56
250 kDa
75 kDa
15 kDa
10 kDa
25 kDa
150 kDa
100 kDa
50 kDa
30kDa
(a)
SDS-PAGE de lacasa de Trametes versicolor y BPeAh.
M1 M2
M1/
M2
PM (KDa)
B1 100
B2 50- 75
B3 30- 50
B4 15- 25
57
Organismo Peso molecular (kDa) Ref
HL 60 - 100 Madhavi y Lele, 2006;
Kunamneni et al.
Paraconiothyrium
variabile
84 Forootanfar et al., 2011.
Coriolus hirsutus 55-73 Shin y Lee, 2000; Koroljova-
Skorobogat’ko, et al., 1998.
Monocillium indicum 72 Thakker, et al., 1992.
Trichoderma 71 Assavanig, et al., 1992,
Trametes troji 70 Garzillo, et al., 1998
Ganoderma lucidum 40-68 Ko, et al., 2001; D’souza et
al., 1999
Pleurotus sajor-caju 61 Murugesan et al., 2006.
Pleurotus ostreatus 59 Sannia, et al., 1986
Trametes multicolor 36 Leitner et al., 2002.
Pesos moleculares de lacasa obtenida mediante HL
58
250 kDa
75 kDa
15 kDa
10 kDa
25 kDa
150 kDa
100 kDa
50 kDa
30kDa
M1/
M2
PM (KDa)
B1 100
B2 50- 75
(a) Zimograma y (b) SDS-PAGE de lacasa de Trametes versicolor y BPeAh.
(b)
M1 M2
(a)
M1 M2
59
- Varias isoenzimas de lacasa se han detectado en
muchas especies de hongos. Más de una isoenzima se
produce en la mayoría de los hongos de la pudrición
blanca (Kunamneni et al; Moldes et al., 2004; Pezzella et
al., 2012; Xiao et al., 2003.).
CONCLUSIONES
60
FASE I
• La muestra analizada de vinazas presentó: una fuerte coloración
café obscuro, un bajo pH, alto contenido de materia orgánica
expresado como DQO, alto contenido de fructosa residual de la
fermentación de la obtención del mezcal, alto contenido de cenizas
la cual se vio reflejado en el alto contenido de minerales
principalmente de calcio y magnesio.
61
• El bagazo presentó alto contenido de cenizas (120 mg /g de
bagazo) el cual se reflejó en el alto contenido de minerales
principalmente de Calcio, magnesio, potasio cobre, zinc, hierro,
siendo mayor en el bagazo del agave Potatorum zucc (Tobalá).
• La cantidad de minerales presentes en las muestras de bagazo
estudiadas fue mayor a las encontradas en la muestra de vinazas.
62
• El contenido de fenoles totales expresados como ácido gálico
presente en las muestra de vinazas y bagazo, fue importante (497 ±
109 mg/L y 0.014 ± 0.0005 mg ácido gálico/g de bagazo),
considerando las cantidades que se generan de estos desechos por
la industria mezcalera y además de que se ha reportado a estos
compuestos como inductores de la actividad enzimática.
63
FASE II
• El medio de cultivo sólido de agar
bacteriológico y extracto de malta, resulto
ser un medio apropiado para la propagación
de las cepas de Pleurotus spp.
• El medio líquido adecuado para el
crecimiento de las cepas de Pleurotus spp.
fue el medio CDS 2% con adición de
extracto de malta.
64
FASE III
• La cepa parental UTM-B mostró la mayor actividad enzimática (248
± 0.2 U/L) en la etapa de selección de las cepas de Pleurotus spp.
(Fase III).
65
FASE IV
• Se obtuvieron pellets dobles a partir de polvo de agave Angustifolia
haw (Espadín) con diámetros promedio de 0.5 ± 0.1 cm.
66
FASE V
• Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en FCS
fueron utilizando pellets formados con Tv-BPeAh, y vinazas
mezcaleras diluidas a una concentración de 917 mg de fructosa /L,
obteniéndose al noveno día una AELac de 2402 ± 76 U/L
• Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en la FES
fueron con la cepa de Tv y bagazo Pz, obteniéndose una actividad
enzimática de lacasa (AELac) de 386.9 ± 27.4 U/L al sexto día de
fermentación.
• De los resultados concluimos que el mejor sistema de fermentación
para la producción de lacasa fue el sistema en cultivo sumergido.
67
• Las vinazas y el bagazo provenientes de los desechos de la
producción de mezcal, sirvieron como medio de cultivo para la
producción de lacasa empleando Trametes versicolor y Pleurotus
spp.
68
FASE VI
• Se logró la separación a temperatura ambiente de la enzima lacasa
producida por los pellets formados por Trametes versicolor y
BPeAh en FCS, mediante el uso de membranas de 0.45 µm y de 10
kDa.
• Se identificaron cuatro bandas intensas mediante SDS-PAGE, dos
de las cuales tuvieron pesos moleculares de 100 kDa y cercano a
los 50 kDa (pesos moleculares reportados para la enzima lacasa).
69
FASE VI
• Mediante el zimograma se constató la presencia de al menos dos
bandas con actividad de lacasa, lo cual apoyó lo observado en los
resultados obtenidos de AELac determinadas en las FCS y FES.
70
Cronograma de actividades
71
Actividad/mes
es
Ene
201
3
Feb
201
3
Mar
201
3
Abr
201
3
May
201
3
Jun
201
3
Jul
201
3
Ago
201
3
Sep
201
3
Oct
201
3
Nov
201
3
Dic
201
3
Ene
201
4
Feb
201
4
Mar
201
4
Abr
201
4
May
201
4
Jun
2014
Jul
2014
Ago,
Sep,
2014
Obtención y
caracterizació
n fisicoquímica
de las vinazas
Y bagazo
Propagación
de los hongos
Evaluación de
cepas, medios
de cultivo
Formación de
pellets
Cinéticas de
FES y FCS.
Separación y
purificación de
la enzima
Redacción de
la tesis
72
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA
DE LA MIXTECA
Producción de lacasa a partir de hongos
ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de
origen mezcalero
Diapositivas de apoyo
Alumna: I.A. Stefi Castillejos Márquez
Director de tesis: Dr. Vania S. Robles González
Co- Director: Dra. Ireri V. Robles González
Huajuapan de León, Oaxaca. Agosto de 2013
Característic
as de las
enzimas
MnP(1.11.1.13)
Mn(II):
H2O2oxidoreductas
a
LiP (1.11.1.14)
diarilpropano O2
H2O2oxidoreductas
a
Lac (1.10.3.2) p-
benzodiol
O2oxidoreductasa
Grupo
proteico Hemo Hemo
Cobre I,II=I Cobre
III=2
PM (KDa) 32.- 62.5 (122) 38 – 47 (42) 60 – 100
Punto
isoeléctrico 2.8 – 7.2 3.2 – 4.7 3- 7
Punto de pH 2.6 – 4.5 2.0 – 5.0 2.0 – 8.5
H2O2 Si Si No
Especificida
d Mn2+
Amplia, aromáticos
incluidos, no
fenólicos
Amplia, fenólicos y
no fenólicos
74
Tabla 2. Características de enzimas ligninolíticas.
Notas: Yadav.M., et al., 2009; Osma, et al., 2010; Madhavi y Lele, 2009.
Marco teórico
75
Suelos
-Asolvar suelos,
menor
permeabilidad.
-Inibición en la
germinación de
semillas
-Remoción de
metales pesados
Vinazas Impacto ambiental
Agua
- Disminución de
oxigeno disuelto.
-Disolución de
metales pesados.
-Inhibición de la
fotosintesis.
-Producción de
malos olores.
Kannabiran y Pragasam, 1993; Díaz et al., 2002; García et al., 1997; Pant y Adholeya,2007
Introducción Hongo ligninolítico Aplicación Ref.
Pleurotus sajor- caju F6
y F2, Pleurotus
ostreatus
Decoloración de efluentes municipales y
lodos.
1
Trametes versicolor Decoloración y producción enzimática en
efluentes de la industria papelera
2
Trametes versicolor Decoloración en efluentes de la industria
textil
3
Trametes versicolor Decoloración de colorante antraquinona 4
76
1) Dellamatrice, et al., (2005); 2) Gómez et al., (2004). 3) Harech y Datta, (2002); 4) Guo et al., (2008)
Medio de inducción
Reactivo Concentración (g/L)
Dextrosa anhidra 10.0
peptona de soya 2.5
K2HPO4 1.0
KH2PO4 1.0
MgSO4.7H2O 0.5
NaCl 0.3
NH4Cl 1.0
CaCl2.2H2O 0.1
Tiamina 0.02
Solución de elementos traza 2mL
77
Elementos traza
Reactivo Concentración (g/L)
FeSO4.7H2O 5.0
MnSO4.H2O
CoCl2.6H2O 1.0
ZnCl2 1.0
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.5
CuSO4.5H2O 0.3
NiCl2.6H2O 1.0
78
Inductores de crecimiento
Enzima Inductor Ref
Lacassa
Sulfato de cobre (1000U/L, 50microM).
(control 820 U/l)
1,2,4
Azul de metileno (1150U/L, 20microM). 2
2,4-dimetoxifenol, Pyrogallol, ácido
veratrico, catecol. (incrementan de 1.6 -2.5
veces)
6
Mg2+, Zn2+, Ca2+, Mn2+ 7, 4
Floureno, Antraceno, Pireno. 7
Manganeso peroxidasa Ácido veratrico , pirogallol (incrementan
1.6-2 veces)
6
Lignino peroxidasa Tween 80. 8
79 1) Gnanamani, A; et.al.1959. 2) Zhiyu, L. 2009. 3) Malhotra, K; et.al. 2004. 4) Li- Quiong, G., et al. 2011. 5)Hess, J.
2002. 6) Elisashvili, V., et.al. 2010. 7) pozdnyakova, N. et.al. 2011. 8) Asgher, M. 2006.
Lacasa
• Lacasa (benzenodiol:oxygeno
oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) son
oxidasas multicobres, que catalizan
reacciones de oxidación, y tiene como
sustrato compuestos aromáticos, y al
mismo tiempo ocurre el oxígeno molecular
a agua(b). Su peso molecular es de 60 -
100KDa. Puntos isoeléctricos de 3 a 7 ,
pH óptimo de 3.6. (a).
80 a) Madhavi, V; et.al 2009. b) Lettera, V; et.al. 2010.
Lignino Peroxidasa
• Ligninasa es el nombre genérico para un
grupo de isozimas que catalizan la
despolimerización oxidativa de lignina .
• Ensayo : Ligninasa cataliza la oxidación
del alcohol veratrílico a veratraldehido en
presencia de peróxido de hidrógeno (a).
• La actividad de Lip, fue determinada a T
de entre 25 y 65 C a su pH óptimo (b).
81 a) Tien, M; Kirk, K. 1988. b) Yang, J; et.al. 2005.
Manganeso peroxidasa
• Oxida al Mn(II) a Mn(III) y muestra
actividad oxidasa, produciendo peróxido
de hidrógeno por oxidación del sustrato al
estado reducido como NAD(P)H,
glutationa (GSH), ditiotreitol (DTE) y ácido
dihidroximaleico. La reacción es
catalizada de la siguiente manera (a):
2 Mn2+ + H2O2 2Mn3++H2O
82 a) Pasczynki et al., 1986
Arabiloxilano
• Polisacaridos que se encuentran en el salvado de trigo,
cebada y centeno. Las unidades de arabinosa que lo
componen producen compuestos viscosos con el agua
que afectan la consistencia de la masa, retención de
burbujas de la fermentación en las películas de gluten y
almidón y la textura final del pan..
83
Columna de cromatografía. • DEAE Sephacel ™ es un intercambiador de
aniones débiles a base de celulosa moldeada.
• El ion intercambio grupo es dietilaminoetilo, conserva su carga y mantiene consistentemente alta capacidad en toda la gama de trabajo, pH 2-9.
• DEAE Sephacel es macroporosa y tiene un límite de exclusión de aproximadamente 1000 000 daltons de las proteínas globulares.
84
Norma
• NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-052-
SEMARNAT-2005, QUE ESTABLECE
LAS CARACTERÍSTICAS, EL
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN,
CLASIFICACIÓN Y LOS LISTADOS DE
LOS RESIDUOS PELIGROSOS.
85
Ciclo de vida de los hongos
86
87
88
Actividades enzimáticas obtenidas de la cinética en cultivo
sumergido empleando pellets dobles con diferentes soportes.
Origen del polvo de bagazo Actividad enzimática (U/L)
PiAT + Tv –A 1362.4
PiAT + Tv- B 2668.0
PeAT+Tv-A 1476.2
PeAT+Tv-B 5634.8
PeAE+Tv-A 4304.1
PeAE+Tv-A 1432.3
Aserrín + Tv-A 49.0
Aserrín + Tv-B 1308.0
89
Actividad enzimática
• Una unidad de actividad enzimática (símbolo U) es la
cantidad de enzima que en una reacción
enzimática cataliza la conversión de
1 µmol de sustrato por minuto. Se utiliza también en
combinación con otras unidades (U/mg de proteína o
U/mL) para señalar, respectivamente, la actividad
enzimática específica o la concentración de actividad
enzimática.
90
91
Enzima Métodos para
determinar actividad
enzimática
Estructura Referencia
Lacasa
ABTS
Karp et al., 2012;
Dwivedi et al., 2011;
Babiĉ y Pavko,
2012; Iandolo et al.,
2011; Schückel et
al., 2011; Zhi-Xin et
al., 2010.
Siringaldazina
Mikiashvili et al.,
2006; Schückel et
al., 2011; Zhi-Xin et
al., 2010.
2,6 dimetoxifenol
Tlecuitl-Beristain et
al., 2008; Schückel
et al., 2011; Zhi-Xin
et al., 2010.
Guayacol Schückel et al.,
2011; Zhi-Xin et al.,
2010.
2,4-diclorofenol / 4-
aminoantipirina
Schückel et al.,
2011;
92
93
Enzima y hongo Método de extracción Método de purificación Ref.
Lacasa; Pleurotus
ostreatus.
Lacasa, Coniothyrium
variabile.
Homogeneización de los cuerpos
fructíferos del hongo, seguido por
centrifugación a 13000g/30 minutos y
filtración del sobrenadante.
Sulfato de amonio al 80% de
saturación, centrifugación a 10000g/40
minutos, re-suspensión del precipitado.
Se realizó una diálisis y cromatografía
de intercambio iónico (columna aniónica
con sepharosa), se recolectaron las
fracciones de la enzima, y se filtraron
con una membrana PM-10. Se sometió
a una columna de intercambio aniónico
Q.
Lettera
et al.,
2010;
Foroot
anfar et
al.,
2011;
Salony
et al.,
2006
Lacasa, Cyathus bulleri.
Sedimentación por centrifugación,
filtración, ultrafiltración,
Precipitación de proteínas con sulfato
de amonio, centrifugación,
cromatografía en gel.
Autore
et al.,
2009
Lacasa, Polyporus sp.
Homogeneización y centrifugación a
5000g/15min
Concentración del sobrenadante por
ultrafiltración (viva flow 200 system,
200cm2), seguido por el análisis con
cromatografía de intercambio iónico
(anionico, DEAE, sepharosa flujo
rápido). Se comprobó la presencia de
lacasa por el ensayo de actividad. Las
fracciones positivas se sometieron a
ultrafiltración, finalmente se sometió a
una columna sephadexG100.
Lo-
Qion et
al., 2011.
Métodos para la purificación de lacasa.
Enzima Referencia
Hongos se la pudrición
blanca
Lacasa Pointing, 2001; Silverio
et al., 2013;
Lignino peroxidasa Pointing, 2001; Pant y
Adholeya, 2007.
Manganeso peroxidasa Pointing, 2001;
Champagne y Ramsay,
2005.
Glioxal oxidasa Kersten, 1990; Pointing,
2001.
Superoxido dismutasa Pointing, 2001.
Glucosa oxidasa Wong et al., 2008;
Pointing, 2001.
Aril alcohol oxidasa Goswami et al., 2013;
Pointing, 2001,.
Celobiosa: quinona
oxidoreductasa
Pointing, 2001.
Celobiosa
deshidrogenasa
Pointing, 2001.
Versatil peroxidasa Pointing, 2001. 94
Sustratos de la Lacasa
• Laccases are nonspecific with regard to reducing substrates. They catalyze oxidation of various organic substances, including O and p-diphenols, aminophenols, polyphenols, polyamines, methoxy phenols, lignins, aryl diamines, and some inorganic ions with simultaneous direct reduction of dioxygen to water without intermediate production of hydrogen peroxide (Yaropolov et al., 1994; Solomon et al., 1996; Reinhammar, 1984; Gianfreda et al., 1999; Morozova et al., 2007)
95
Marco teórico
96
Producen
Bacterias
Hongos
Más
utilizadas
Debido a :
- Cantidad
- Tipo y Variedad
Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012; Wang et al., 2013; Vhardwaj et al., 2013; Ramesh y Venugopalan, 1987
Aplicaciones de lacasa en la industria textil, papelera y
biorremediación
Enzima Aplicaciones Ref
.
Lacasa
Despolimerización de lignina
1,2 Deslignificación de pastas de madera
Blanqueo de pastas kraft
Degradación de blanqueo de colorantes textiles 3,4
,5
Biodegradación de hidrocarburos xenobióticos
aromáticos policiclicos. 6,7
Ref: 1)Bourbonnais et al, 1997; .2) Lund y Ragauskas, 2001; 3) Mc Kay, 1979; 4) Cripps et al. 1990; 5)Cooper, 1993; 6) Pointing, 2001; 7) Bamforth y Singleton,
2005.
97
Enzima Aplicaciones Ref.
Lacasa
Estabilidad de vinos (reducción de compuestos
polifenólicos) 1,2
Estabilización de cerveza (reducción de compuestos
polifenólicos) 2,3
Clarificante en el procesamiento de jugos de fruta
(reducción de compuestos polifenólicos) 4,5
En panadería, aumentando la fuerza, estabilidad,
maleabilidad de la masa. (ruptura de los enlaces
entrecruzados de ácido ferúlico y arabinoxilano) 6,7
Mejoramiento de los parámetros sensoriales de los
alimentos (eliminando compuestos indeseables, controla
olor y mejora sabor.
8,9,
10
Participa en gelificación de la pectina de remolacha. 10
. Ref: 1) Conradet al., 2002 ; 2)Minussiet al., 2002. 3) Giovanelli, 1989. 4)Minussiet al., 2007; 5)Siebert, 1999. 6) Labatet al., 2000; 7)Si , 1994. 8)
Bouwens et al., 1997; 9) Takemoriet al., 1992. 10) Montereali et al., 2010
98
Aplicaciones de lacasa en la industria alimentaria
Marco teórico
• Las vinazas se definen como los residuos líquidos
remanentes en la etapa de la destilación de los azucares
fermentados de diferentes sustratos (melazas, caña de
azúcar, jugos de uva, agave previamente hidrolizado,
etc.)
99
Definición de vinazas
Robles- González et al., 2011
Marco teórico
• Definición de bagazo
– El bagazo es el residuo de los azucares extraídos
para producir el mezcal, es decir, azúcar, lignina,
celulosa y hemicelulosa
100 Rodríguez-Macías et al., 2010
101
Condiciones de cultivo
Temperatura (24- 30°C)
Relación C/N (0.7g/g)
pH (4 – 6)
Sales: CaCl2, CuSO4, MgSO4
Champagne y Ramsay, 2005; Songulashvili et al., 2006; Khalili et al., 2010; Miskiashvili et al., 2006.
102
103
104
105
106
107
108
109
110
Histidina
111
112
Estructuras tridimensionales de las lacasas de los
basidiomicetos
T. versicolor (A, PDB 1gyc, Piontek et al., 2002)
Función de la lacasa en HL
• Algunas de las funciones que cumple la
lacasa se relacionan con la morfogénesis,
la pigmentación de los conidios, la
formación de rizoformos, el desarrollo de
cuerpos fructificantes y la protección
frente a compuestos fenólicos tóxicos
liberados durante la degradación de la
lignina.
113
• The chemical analysis of winery
wastewater has indicated that sugars
make up a large portion of the chemical
oxygen demand, whereas organic acids
play a more prominent role in the acidity of
the wastewater (Malandra et al., 2003).
114
• The composition of South African distillery wastewater
• during the 1999 harvest season displayed the following
• properties: pH ranging from 3.7 to 4.8, COD from 7.4
• to 28.5 g/L, conductivity from 140 to 400 mS/m, total
• dissolved solids from 1000 to 2800 mg/L, nitratesfrom
• 35 to 132 mg/L, chlorides from 20 to 425 mg/L, phosphates
• from 98 to 251 mg/L, ammonia from 68 to
• 378 mg/L, potassium from 330 to 490 mg/L, sodium
• from 18 to 170 mg/L, magnesium from 14 to 86 mg/L,
• and calcium from 21 to 90 mg/L (Malandra et al.,
• 2004).
115
116
UTM-B (Medio D) 248 U/L Nuestros
resultados
Pleurotus ostreatus 13,000 U/L Tellez-
Tellez, et al.,
2008
Pleurotus ostreatus 98 82 U/L Mikiasshvili,
et al., 2006 Pleurotus ostreatus 108. 284 U/L
Pleurotus ostreatus (ATCC
32783)
12,200 U/L Tlecuitl-
Beristain, et
al., 2008
Pleurotus ostreatus CP50 600U/L Tinoco, et
al., 2011
Pleurotus sajor- caju 80,000 U/L Patrick, et
al., 2011
Pleurotus sajor- caju PS- 2001
Pleurotus ostreatus
13,000 U/L
147 U/L
Bettin, et al.,
2008
Freixo, et
al., 2011.
Hongo ligninolítico (H.L) Actividad enzimática Ref.
Actividades enzimáticas de lacasa obtenidas por hongos ligninolíticos
empleando diversos sustratos sólidos.
117
Microorganismo Sistema de cultivo Observaciones Resultados Ref
Trametes
versicolor y
Funalia Trogii
FES; sustrato:
salvado de trigo.
Humidificación del
medio sólido (HMS):
vinazas, residuos de
la elaboración de
aceite de oliva y
suero lácteo, a
concentraciones de
25, 50 y 100%, y
melasas al 1 y 5%.
Actividad enzimática máxima
(AE máx)se obtuvo al decimo
día empleando a Trametes
versicolor y vinazas al 50%,
con una actividad de lacasa
de 8510 ± 5170 U/L
Boran y
Yesilad
a, 2011
Trametes hirsuta
(BT 2566)
FES ; sustrato:
salvado de cebada
o semilla de uva
HMS: medio de
cultivo mineral.
AE máx se obtuvo empleando
como sustrato semillas de uva
23000 U/L
Moldes
et al.,
2003
Pleurotus
ostreatus(ATCC
32783)
FES; Inmovilizada
en: esponja de
poliuretano de baja
densidad.
HMS: medio mineral,
sustrato para HL
AE máx obtenida fue de 2430
U/L
Téllez-
Téllez
et al.,
2008
Pleurotus
ostreatus
FES ; sustrato:
salvado.
HMS: vinazas
estériles en una
relación 1:1.
AE máx promedio obtenida
fue de 20 000 U/L a los 22
días de fermentación.
Ramíre
z et al.,
2003.