UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E

INDUSTRIAS

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Evaluación de la Capacidad Antioxidante por el Método

DPPH de Nuevas Cromonas Haloalquil Sustituidas.

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DE INGENIERA DE ALIMENTOS

ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO

DIRECTOR: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN

Quito, Marzo 2018

DERECHOS DE AUTOR

© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2018

Reservados todos los derechos de reproducción

FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO

PROYECTO DE TITULACIÓN

DATOS DE CONTACTO

CÉDULA DE IDENTIDAD: 0201937059

APELLIDO Y NOMBRES: DUFFEY CASTILLO ZAIDA PAULINA

DIRECCIÓN: MACHALA Y RÍO TULIPE

EMAIL: pauduffey_23@hotmail.com

TELÉFONO FIJO: 022491712

TELÉFONO MOVIL: 0984651460

DATOS DE LA OBRA

TITULO: Evaluación de la Capacidad Antioxidante por el Método DPPH de Nuevas Cromonas

Haloalquil Sustituidas.

AUTOR O AUTORES: ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO

FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO DE

TITULACIÓN:

Marzo de 2018

DIRECTOR DEL PROYECTO DE TITULACIÓN: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN

PROGRAMA PREGRADO POSGRADO

TITULO POR EL QUE OPTA: INGENIERA EN ALIMENTOS

RESUMEN: Mínimo 250 palabras

Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13 nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El

X

estudio teórico de la EDE permite inferir en la capacidad de molécula antioxidante de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable. La actividad antioxidante se determinó mediante el radical estable DPPH y los resultados se expresaron como EC50 utilizando el estándar Trolox como referencia. De las 13 moléculas analizadas, 2 actuaron como anti radicales efectivos correspondientes a las estructuras de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona (A) y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (B). Se determinó un EC50 de 0.00185; 0.00093 y 0.000043 g para A, B y Trolox, respectivamente. En cuanto al poder anti radical (P.A.) expresado como 1/EC50 se obtuvo valores de 541.23; 1080.5 y 23081.8 A, B y Trolox respectivamente. Los resultados muestran una relación directamente proporcional entre el poder anti radical y la capacidad antioxidante. Por otro lado, los valores de EDE fueron 331.4 kJ/mol (A) y 280.7 kJ/mol (B) y evidencian una mayor facilidad para escindir el enlace C-H, en el compuesto B con el grupo azido (N3), donde el grupo funcional N3 que presenta características electro-atractoras favorece la deslocalización del radical a lo largo del anillo cromona. Asimismo, la densidad spin mostró la deslocalización del electrón en ambos compuestos y la capacidad del nitrógeno en el grupo azida de favorecer la potencia antioxidante. Finalmente, se observó que cuanto menor es el EDE, mayor es la capacidad de donar un átomo H de un grupo

hidroxilo, dando lugar a un radical más estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria farmacológica.

PALABRAS CLAVES: 2-Trifluorometilcromonas-3-metilsustituidas, DPPH, entalpía de disociación de enlace (EDE).

ABSTRACT:

Chromones are heterocyclic compounds, distributed in plants and pigments. Compounds derived from chromone with haloacyl substituents obtained by synthesis, show better liposolubility properties. furthermore, various biological activities, such as anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, antiviral, antitumor and anticancer activity. The present work evaluated the antioxidant capacity of 13 new haloalkyl substituted chromones, correlating the experimental results with enthalpy of bond dissociation (BDE). The theoretical study of BDE allows to infer the capacity of antioxidant molecule to donate an atom of H, to form an stable radical. The antioxidant activity was determined by the stable DPPH radical and the results were expressed as EC50 using Trolox as reference. Of the 13 molecules analyzed, 2 acted as effective anti-radicals corresponding to the structures of 3-nitromethyl-2-trifluoromethylchromone (A) and 3-azidomethyl-2-trifluoromethyl-chromone (B). An EC50 of 0.00185 was determined; 0.00093 and 0.000043 g for A, B and Trolox, respectively. Regarding

DEDICATORIA

Este trabajo va dedicado a mi familia que siempre me ha apoyado y de

una u otra manera han estado presentes en cada paso de mi vida.

A mi madre porque gracias a ella soy la mujer que soy, por su fortaleza,

porque nunca dejó de creer en mí, ha sabido mantenerse de pie ante

cualquier adversidad y me ayudó a llegar a este punto de mi vida, con sus

palabras siempre acertadas y su ejemplo de vida. ¡Te amo!

A mi padre por su paciencia, amor, ejemplo y tolerancia, me ayudó a

formar mi carácter y a saber que quiero en la vida.

A Doris por ser ejemplo de fuerza y de superación, nada es capaz de

derrotarte.

A Sofía porque siempre has sido amiga y hermana.

A Amanda por ser mi luz, cada vez que me abrazas el mundo se detiene,

eres parte de mi fuerza.

Andrea porque la vida nos hizo hermanas, siempre tuviste las palabras

justas para levantarme cuando sentía que el mundo se venía abajo.

¡Con amor para todos ustedes!

AGRADECIMIENTOS

Agradezco en primer lugar a mi Director el Dr. Cristian David Alcivar León

por su tiempo, paciencia y dedicación a este trabajo, por impartirme sus

conocimientos, experiencia y sus palabras de apoyo en todo este

proceso, por su amistad, Muchas Gracias.

Al personal del CIAL especialmente a la Bioq. María José Andrade y la

Ing. Michelle Guijarro quienes en su momento supieron guiarme y

ayudarme para el desarrollo del presente trabajo.

A mis padres por estar siempre presentes con su apoyo incondicional, por

no dudar de mí.

A mi tía Ana Alicia que siempre está apoyándome y fue parte importante

en el desarrollo de mi carrera, fue luz al final del túnel, millón Gracias.

A mi primo César Vega, sin tu ayuda esto no hubiese sido posible, estoy

agradecida eternamente contigo.

A mis amigas Andre, Gise, Pame, Edu, Taty, Dany que siempre me

hicieron barras y me ayudaron cuando necesité.

A mis amigos anónimos que con llamadas o mensajes siempre me

animaron a continuar.

¡A todos ustedes Gracias!

i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN ………………………………………………………………………1

ABSTRACT ……………………………………………………………………..2

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................3

1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES LIBRES .......3

1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE ......................................................................................5

2. METODOLOGÍA .................................................................................9

2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES ..................................9

2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES ...........9

2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE ENLACES Y

DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN. ..........................................10

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...........................................................12

2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR

TRATAMIENTOS DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA .. 12

2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA 3-NITROMETIL-2-

TRIFLUROMETILCROMONA.................................................................. 13

2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS

DE 3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA. ........................... 14

2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2

TRIFLUOROMETILCROMONA ............................................................... 15

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..........................................................17

3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ....................................................17

3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE

CAPTACIÓN DPPH DE 3-NITROMETIL-2-

TRIFLUOROMETILCROMONA. .............................................................. 21

3.2. ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE ...............................22

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................27

4.1. CONCLUSIONES .......................................................................27

4.2. RECOMENDACIONES ...............................................................28

ii

5. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................29

6. ANEXOS ...........................................................................................31

iii

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 1. ANOVA 3-nitrometil-2-triflurometilcromona .............................12

Tabla 2. Prueba TUKEY 3-nitrometil-2-triflurometilcromona ..................13

Tabla 3. Diferencia significativa 3-nitrometil-2-triflurometilcromona .......13

Tabla 4. ANOVA 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ..........................14

Tabla 5. Prueba TUKEY 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ...............15

Tabla 6. Diferencia significativa 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ....15

Tabla 7. Resumen de resultados de la capacidad antioxidante .............17

Tabla 8. Concentración Efectiva EC50 ...................................................18

Tabla 9. Energía de disociación de enlace………………………………...22

Tabla 10. Energía de disociación de enlace. ...........................................23

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura.1 Generación de radicales libres ...............................................33

Figura.2 Radical libre y molécula normal ...............................................4

Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. ......................5

Figura 4. Nuevas Moléculas ....................................................................7

Figura 5. Reacción química entre especie antioxidante y el radical. .......8

Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH .............................................19

Figura 7. Cinética de estabilización de la molécula A ............................19

Figura 8. Cinética de estabilización de la molécula B ............................19

Figura 9. Curva dosis-respuesta 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona ....20

Figura 10. Curva dosis-respuesta 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ..21

Figura 11. Curva dosis-respuesta trolox ..................................................22

Figura 12. Especies Radicalarias ...........................................................22

v

ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA

ANEXO 1 Cálculo de UPM6 ..............................................................31

ANEXO 2 Imágenes del trabajo experimental ....................................32

1

RESUMEN

Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y

pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes

haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de

liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad

antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y

anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13

nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados

experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El estudio

teórico de la EDE permite inferir en la capacidad de molécula antioxidante de

donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable. La

actividad antioxidante se determinó mediante el radical estable DPPH y los

resultados se expresaron como EC50 utilizando el estándar Trolox como

referencia. De las 13 moléculas analizadas, 2 actuaron como anti radicales

efectivos correspondientes a las estructuras de 3-nitrometil-2-

triflurometilcromona (A) y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (B). Se

determinó un EC50 de 0.00185; 0.00093 y 0.000043 g para A, B y Trolox,

respectivamente. En cuanto al poder anti radical (P.A.) expresado como

1/EC50 se obtuvo valores de 541.23; 1080.5 y 23081.8 A, B y Trolox

respectivamente. Los resultados muestran una relación directamente

proporcional entre el poder anti radical y la capacidad antioxidante. Por otro

lado, los valores de EDE fueron 331.4 kJ/mol (A) y 280.7 kJ/mol (B) y

evidencian una mayor facilidad para escindir el enlace C-H, en el compuesto

B con el grupo azido (N3), donde el grupo funcional N3 que presenta

características electro-atractoras favorece la deslocalización del radical a lo

largo del anillo cromona. Asimismo, la densidad spin mostró la

deslocalización del electrón en ambos compuestos y la capacidad del

nitrógeno en el grupo azida de favorecer la potencia antioxidante.

Finalmente, se observó que cuanto menor es el EDE, mayor es la capacidad

de donar un átomo H de un grupo hidroxilo, dando lugar a un radical más

estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener

actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de

novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria

farmacológica.

Palabras clave: 2-Trifluorometilcromonas-3-metilsustituidas, ensayo de DPPH, entalpía de disociación de enlace (EDE), densidad de spin

2

ABSTRACT

Chromones are heterocyclic compounds, distributed in plants and pigments.

Compounds derived from chromone with haloacyl substituents obtained by

synthesis, show better liposolubility properties. furthermore, various biological

activities, such as anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, antiviral,

antitumor and anticancer activity. The present work evaluated the antioxidant

capacity of 13 new haloalkyl substituted chromones, correlating the

experimental results with enthalpy of bond dissociation (BDE). The

theoretical study of BDE allows to infer the capacity of antioxidant molecule

to donate an atom of H, to form an stable radical. The antioxidant activity

was determined by the stable DPPH radical and the results were expressed

as EC50 using Trolox as reference. Of the 13 molecules analyzed, 2 acted

as effective anti-radicals corresponding to the structures of 3-nitromethyl-2-

trifluoromethylchromone (A) and 3-azidomethyl-2-trifluoromethyl-chromone

(B). An EC50 of 0.00185 was determined; 0.00093 and 0.000043 g for A, B

and Trolox, respectively. Regarding the anti-radical power (P.A.) expressed

as 1 / EC50, values of 541.23 were obtained; 1080.5 and 23081.8 A, B and

Trolox respectively. The results show a directly proportional relationship

between anti-radical power and antioxidant capacity. On the other hand, the

BDE values were 331.4 kJ / mol (A) and 280.7 kJ / mol (B) and show a

greater facility to cleave the CH bond, in compound B with the azido group

(N3), where the functional group N3 that presents electro-actractor

characteristics favors the delocalization of the radical along the chromone

ring. Likewise, the spin density showed the delocalization of the electron in

both compounds and the nitrogen capacity in the azide group to favor the

antioxidant potency. Finally, it was observed that the smaller the BDE, the

greater the capacity to donate an H atom of a hydroxyl group, giving rise to a

more stable radical. Due to the biological activity of chromones, since it

contains antioxidant activity, it allows us to open a door towards the creation

of novel compounds useful for the food industry and the pharmaceutical

industry.

Keywords: 2-Trifluoromethyl-chromonas-3-methylsubstituted, DPPH, Bond

dissociation enthalpy (BDE), spin density.

1. INTRODUCCIÓN

3

1. INTRODUCCIÓN

1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES

LIBRES

Los procesos de oxidación provocan deterioro en la composición de algunos

productos, por ende daños en la función nutricional y sensorial (Figura 1).

Estos procesos son causados por la acción de los radicales libres (Figura 2),

que son moléculas o intermediarios muy reactivos, que en su estructura

química presenta un electrón desapareado o libre, por lo tanto tienden a

captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su propia

estabilidad. Actualmente, se busca retardar este tipo de reacciones con el

uso de bajas temperaturas, reducción de presión y oxígeno, enzimas que

catalizan la oxidación y material de empaque adecuado (J. Pokorny,

Yanishlieva, Alonso, & Gordon, 2004).

Una vía para detener el proceso oxidativo es la utilización de compuestos

inhibidores de la oxidación que eviten la iniciación y/o propagación de

reacciones en cadena de los radicales libres, que son causantes de

problemas a la salud por una exposición prolongada a diversos

contaminantes responsables de producir distintos tipos de radicales libres

(Avello & Suwalsky, 2006).

Figura 1. Generación de radicales libres (Cataño 2001)

4

Los procesos oxidativos provocan diferentes patologías como trastornos

cardiovasculares, procesos neurodegenerativos e incluso cáncer (Machado

& Marques, 2010). Como una alternativa para contrarrestar los efectos

nocivos de formación de radicales libres en la última década se ha

investigado una variedad importante de antioxidantes naturales que

muestran diversas actividades biológicas como, agentes antibacteriales,

antivirales, antiinflamatorios, antialergénicos, antitrombóticos y

vasodilatadores (Valenzuela & Pérez, 2016). La variada actividad biológica

muestra una estrecha relación con las propiedades curativas de una gran

cantidad de plantas medicinales (García Bacallao, Vicente García Gómez,

Rojo Domínguez, & Sánchez García, 2001)

Por otra parte, las condiciones de estrés oxidativo, son reconocidas por estar

directamente relacionados al daño de varios procesos bioquímicos en

células, afectando a lípidos, ADN y proteinas (Halliwell, 2007; Riboli & Norat,

2003; von Zglinicki, 2002). El análisis de evidencia epidemiológica muestra la

capacidad de reducir el riesgo de enfermedades como el cáncer,

promoviendo una dieta rica en frutas y vegetales, que promueven un balance

oxidativo homeostático para el organismo (Riboli & Norat, 2003).

Figura 2. Radical libre y molécula normal (Libre de Derechos (S.F.)

5

1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

La relación estructura-actividad anti-radicalaria u antioxidante, depende de la

estructura química y se encuentra fuertemente influenciada por los

sustituyentes, que son determinantes en la eficiencia de la actividad

antioxidante. En moléculas con el anillo estructural cromona, como los

flavonoides tres porciones estructurales determinan la potencia antioxidante

o actividad secuestrante de radicales libres.

(a) La estructura de catecol en el anillo B,

(b) Los dobles enlaces en posición 2 y 3 en conjugación con el grupo

carbonilo en el anillo C,

(c) La presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5.

La Figura 3, muestra la relación estructura actividad antioxidante de los

flavonoides, que presentan el anillo estructural cromona.

Particularmente, es conocido el efecto antioxidante y nutracéutico de

diversas cromonas, (Balasundram, Sundram, & Samman, 2006) ubicuas en

el reino vegetal (K Sharma et al., 2011) representando una característica

relevante, la capacidad antioxidante de estos compuestos, que promueven la

disminución de radicales libres (Phosrithong, Samee, Nunthanavanit, &

Ungwitayatorn, 2012). Por lo tanto, la evaluación de la capacidad

antioxidante de cromonas y análogos estructurales (Dias, Machado, &

Marques, 2011) (por ejemplo: flavoniodes, isoflavonoides) sugieren un rol

importante en procesos oxidativos (Li & Yang, 2010). En recientes años este

tipo de compuestos han suscitado gran interés, debido a que son altamente

reactivos como donadores de hidrógeno o electrones y por lo tanto

Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. El recuadro de color gris señala la porción estructural del anillo responsable de la estructura – actividad antioxidante.

6

presentan facilidad para interaccionar en la disminución y bloquear la

formación de radicales libre (Seyoum, Asres, & El-Fiky, 2006). Esta

evidencia motiva el interés y busqueda de nuevos compuestos antioxidantes,

consistentes con la relación estructura-actividad de un nucleo estructural

cromona y sustituyentes que presenten átomos de halógeno.

Por otra parte, la industria de alimentos tiene entre sus retos más

importantes la conservación de productos. Evitar la descomposición por

microorganismos, proteger la salud de los consumidores y evitar pérdidas

económicas, se encuentran entre las metas comunes de toda empresa (Jan

Pokorny, Yanishlieva, & Gordon, 2005). Es aquí, donde los antioxidantes son

elementos relevantes, debido a su capacidad para controlar el daño

oxidativo, presente de forma natural en lípidos y proteínas, componentes

mayoritarios de algunos alimentos (Valenzuela & Pérez, 2016). En la

actualidad variados antioxidantes naturales son empleados por la industria

de alimentos, estos son provenientes de frutas y vegetales. Sin embargo, su

aplicación a veces no resulta viable o efectiva ya que modifican el aroma,

sabor y valor nutricional. Es así, que el estudio de nuevas moléculas, que

presenten el núcleo cromona y sustituyentes que favorezcan la capacidad

antioxidante suscita un interés constante (De la Vega, Cañarejo, & Pinto,

2017).

Las nombres de las moléculas estudiadas son: 2-difluorometil-3-

metilcromona (1); 2- diclorometil-3-metilcromona (2); 3-metil-2-

pentafluoroetilcromona (3); 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona (4); 3-

azidometil-2-trifluorometilcromona (5); 3-ftalimidoilmetil-2-

trifluorometilcromona (6); 2-clorodifluorometil-3-metilcromona (7); 6-cloro-3-

metil-2-trifluorometilcromona (8); 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona (9);

3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona (10); 3-nitrometil-2-

trifluorometilcromona (11); 3-bromometil-2-clorodifluorometilcromona (12); 3-

cianometil-2-trifluorometilcromona (13), estos se presentan en la Figura 4.

7

De los diversos métodos para evaluar la capacidad antioxidante, uno muy

utilizado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil

(DPPH) el cual se controla mediante la reducción de la absorbancia a una

longitud de onda. El DPPH presenta una coloración violeta cuando está

presente como radical libre, y absorbe alrededor de 520 nm produciendo una

disminución de la absorbancia que cambia a color amarillo (Figura 5).

Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que

puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical, se produce

la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R (Muñoz Juárez & Gutiérrez, 2009).

Figura 4. Nuevas Moléculas (Alcivar 2016)

8

Figura 5. Reacción química entre la especie antioxidante y el radical DPPH.

N

N

NO2

O2N

O2N Antioxidante

DPPH (color: violeta)

NH

N

NO2

O2N

O2N

DPPH--H (color: amarillo)

Antioxidante: cromona

Respecto a la relación estructura – actividad observada en compuestos que

presentan el anillo cromona, se ha observado que el número y posición de

los grupos hidroxilos, influencia en la actividad frente a radicales, debido a

que determinan el carácter de la actividad secuestrante (Muñoz Jauregui &

Ramos Escudero, 2007). En este trabajo se estudiará la capacidad

antioxidante experimental de nuevos derivados que presentan el núcleo

cromona y sustituyentes perhaloalquilo en posiciones 2 y 3. Evaluando la

energía de disociación de enlace (EDE) por métodos teóricos y la densidad

espín de las de los nuevos compuestos. Las correlaciones observadas de

relación estructura – actividad, permitirá inferir en la influencia de grupos

funcionales y su efecto en la tendencia a reaccionar con moléculas

radicalarias (Vakarelska-Popovska & Velkov, 2016)

Por otra parte, la energía de disociación de enlace (EDE) se define como la

cantidad de energía necesaria para romper o formar un enlace. Esta

característica específica del enlace , varía en su valor entre enlace fuertes y

enlaces débiles (Morrison & Boyd, 1998). Otra propiedad teórica evaluada, la

densidad espín pone en evidencia la deslocalización del electrón a lo largo

del sistema conjugado π de la molécula (Bort, 2001).

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de

una serie de nuevas cromonas haloalquil sustituidas con diversos grupos

funcionales por el método DPPH. Se asistió la interpretación de los

resultados experimentales por estudios téoricos ab initio, que permitieron la

predicción de entalpías de formación de enlace (EDE), debido a su conocida

influencia en la disminución de radicales libres y su capacidad para eliminar

los mismos.

2. METODOLOGÍA

9

2. METODOLOGÍA

2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES

Los 13 compuestos estudiados en la presente tesis, fueron provistos por el

Dr. Cristian Alcivar León (Facultad de Ciencias de la Ingeniería. CIAL. UTE,

Quito, Ecuador), los mismos fueron sintetizados y estudiados en la tesis

doctoral de tema ¨Estudio de nuevos benzopiranos haloalquilsustituidos¨

(Alcívar León, 2016).

A continuación, se describen los nombres químicos: 2-difluorometil-3-

metilcromona (1); 2- diclorometil-3-metilcromona (2); 3-metil-2-

pentafluoroetilcromona (3); 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona (4); 3-

azidometil-2-trifluorometilcromon (5); 3-ftalimidoilmetil-2 trifluorometilcromona

(6); 2-clorodifluorometil-3-metilcromona (7); 6-cloro-3-metil-2-

trifluorometilcromona (8); 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona (9); 3-

hidroximetil-2-trifluorometilcromona (10); 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona

(11); 3-bromometil-2 clorodifluorometilcromona (12); 3-cianometil-2-

trifluorometilcromona (13).

2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES

Se evaluó la actividad secuestrante de radicales libres para los 13 derivados

haloalquil sustituidos, a través del ensayo DPPH, utilizando TroloxTM (6-

hidroxi- 2,5,7,8 - tetrametilcromona - 2 - carboxílico) como estándar (Dias et

al., 2011). El método consiste en la reducción de una solución metanólica

de DPPH en presencia de un antioxidante donador de hidrógeno. Tras la

reacción, el DPPH de color violeta (máximo de absorción a 515 nm) produce

una solución amarilla de DPPH2. El cambio de color de violeta a naranja

nos indica que el compuesto analizado presenta capacidad antioxidante,

esta variación de color es determinada utilizando un espectrofotómetro que

mide la absorbancia.

La capacidad antioxidante de los nuevos compuestos se determinó al

agregar soluciones metanolicas (250 µL) de concentración conocida (3 a 4

mM) a 1000 µL de una solución metanólica de DPPH (preparada a partir de

20 mg de DPPH en 500 ml de metanol), la cual se diluyó para obtener un

valor de absorbancia a 515 nm en el rango entre 0.9-1.0 unidades de

10

absorbancia. El porcentaje de DPPH en la solución se determinó, mediante

la ecuación 1

%DPPH en solución

[1]

El porcentaje de DPPH en solución se representó frente a la concentración

de los compuestos ensayados, con el fin de obtener los correspondientes

valores de EC50 que muestran la concentración efectiva que conduce a una

pérdida del 50 % de la actividad de DPPH (Dias, Machado, & Marques,

2011).

Los valores de EC50 (mM) obtenidos con su respectiva desviación estándar

son: 460 ± 0,015 C-NO2; 59 ± 0,036 C-N3; 8,3 ± 0,0977 Trolox.

Para todos los compuestos analizados se utilizó metanol como disolvente.

Se utilizó una solución DPPH_metanólica como control negativo y Trolox

como control positivo. Las medidas fueron realizadas por triplicado con la

finalidad de estimar el coeficiente de variación experimental en cada medida.

2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE

ENLACES Y DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN.

Para predecir las entalpías de disociación de enlace (EDE) y distribución de

la densidad de spin en especies radicalarias. Se utilizó cálculos téoricos ab

initio, mediante el software Gaussian 09.

Para las moléculas neutras se realizó un cálculo de optimización de energía

con el nivel de teoría PM6.

Asimismo, de cada molécula neutra optimizada, se generaron radicales por

la eliminación de un átomo de hidrógeno. Se realizó de cada posible radical

un calculó de optimización de geometría, utilizando multiplicidad de spin 2, al

nivel de teoría de capa abierta uPM6. Se tomó en cuenta las estructuras

radicalarias que presentaron menor energía de disociación del enlace C-H

(BDE), asociadas con la formación de radicales, se calculó de acuerdo a la

ecuación 2:

[2] 𝐸𝐷𝐸 𝐻𝑓 𝑀 + 𝐻𝑓 𝐻 − 𝐻𝑓 𝑀 − 𝐻

11

Donde Hf (M.), Hf (H) y Hf (M-H) representan, las entalpías de formación de la

especie radical, hidrógeno y neutra formado por la eliminación de un enlace

C-H. El átomo de hidrógeno presentó un valor de energía de 0.0830298

Hartrees, calculado al mismo nivel de teoría (uPM6) mostrados en el Anexo

1.

Por otra parte, los valores de densidad de espín (DE) corresponden a la

probabilidad de localización del electrón desapareado en la molécula. De los

radicales que presentaron actividad antioxidante por el ensayo experimental

de DPPH se generó los orbitales que muestran la distribución de densidad

de espín, los mismos que ponen en evidencia los átomos de la estructura

radicalaria donde se produce la deslocalización electrónica.

Finalmente, se correlacionó los valores EC50 (µM) y la entalpía de

disociación de enlace EDE (kJ mol -1) de los compuestos que presentaron

actividad antioxidante, respecto a Trolox.

A continuación se detalla el cálculo de la EDE para los compuestos que

presentaron actividad antioxidante.

[4]

𝑬𝑫𝑬𝑵𝟑 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴− 𝑯

𝐸𝐷𝐸𝑁3 − 36,5924443 + − ,5 2257 − − 37.228855 2 = 0,134154

EDE N3 = 0,134154 Hartree EDE N3 = 352,221 kJ/mol

𝑬𝑫𝑬𝑵𝑶𝟐 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴−𝑯

𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − 77.5 66 235 + − ,5 2257 − − 78. 67 75 4 = 0,158216

EDE NO2 = 0,158216 EDE NO2 = 415,396 kJ/mol

12

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los valores experimentales se ajustaron con funciones de regresión no

lineal, y los resultados se compararon con los determinados utilizando el

agente antioxidante de referencia Trolox. Todas las mediciones se realizaron

por triplicado.

2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA

La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de varianza de un factor para

los datos experimentales de absorbancia. Se compararon los valores

medios de absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones.

La prueba-F en la tabla ANOVA permite determinar, si hay diferencias

significativas entre las medias.

Fuente Suma de Cuadrados

Gl*

Cuadrado Medio

Razón-F Valor-p

Entre grupos

0.00237 3 0.00079 15.88 0.010

Intra grupos 0.000398 8 0.00004975

Total (Corr.) 0.002768 11

*Gl: grados de libertad

En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una

diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con

un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las

concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de

significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso

aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.

Donde el valor F es una estrategia para poner a prueba la hipótesis de

igualdad de medias, refleja el grado de parecido entre las medias que se

están comparando. Si la hipótesis nula es verdadera, la relación será

alrededor de 1 (Pérez López, 2005).

Tabla 1. Tabla ANOVA para absorbancias por Tratamientos de 3-nitrometil-2-

triflurometilcromona

13

El ―valor de p‖ representa una seguridad del 95% que la asociación que

estamos estudiando no sea por el azar. Por conceso se ha aceptado un

0.05% de arbitrariedad, es decir, de error (MANTEROLA & PINEDA, 2008)

Los grados de libertad Gl nos describe al espacio e hiperespacios de libertad

a través de los cuales una medida de resumen puede moverse y tomar

diferentes valores (La Cruz-Oré & Luis, 2013)

2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA

En la Tabla 2 se muestra los resultados de la prueba de Tukey para la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

Método: 95.0 porcentaje Tukey HSD

Se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en

columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre

aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.

La Tabla 3 aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar

cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior

de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El

asterisco que se encuentra al lado de los 4 pares indica que estos pares

muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0%

de confianza.

Concentraciones Casos Media Grupos Homogéneos

1 3 0.2583 X

2 3 0.2663 X

3 3 0.2873 X

4 3 0.2920 X

Contraste Diferencia +/- Límites

1 – 2 -0.008 0.0184359

1 – 3 * -0.029 0.0184359

1 – 4 * -0.0336667 0.0184359

Tabla 2. Tabla prueba TUKEY para la para 3-nitrometil-2-triflurometilcromona

Tabla 3. Tabla prueba TUKEY para la 3-nitrometil-2-triflurometilcromona - diferencia significativa.

14

* indica una diferencia significativa.

El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el

procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.

Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que uno o más pares son

significativamente diferentes, cuando la diferencia real es igual a 0.

Este análisis estadístico ayuda a identificar cuál es la concentración

adecuada para que la cromona presente actividad antioxidante. En este caso

la concentración que presenta una mejor respuesta en capacidad

antioxidante es la solución con mayor concentración.

2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.

En la Tabla 4 se realizó un análisis de varianza de un factor para los

resultados de absorbancia. Se compararon los valores medios de

absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones. La prueba-F

en la tabla ANOVA determina si hay diferencias significativas entre las

medias

Fuente Suma de

Cuadrados Gl Cuadrado

Medio Razón-F Valor-p

Entre grupos

0.0124476 3 0.00414919 13.04 0.0019

Intra grupos 0.00254533 8 0.000318167 Total (Corr.) 0.0149929 11

Gl: grados de libertad

En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una

diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con

un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las

2 – 3 * -0.021 0.0184359

2 – 4 * -0.0256667 0.0184359

3 – 4 -0.00466667 0.0184359

Tabla 4. Tabla ANOVA para absorbancias por Tratamientos 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

15

concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de

significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso

aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.

2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2 TRIFLUOROMETILCROMONA

En la Tabla 5 indican los resultados de la prueba de Tukey, se han

identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en

columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre

aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.

Tabla 5. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

Método: 95.0 porcentaje Tukey HSD La Tabla 6 muestra los resultados de aplicar un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares de contraste, muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza.

Tabla 6. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona- diferencia significativa

* indica una diferencia significativa.

El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el

procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.

Tratamientos Casos Media Grupos Homogéneos

A1 3 0.4050 X A2 3 0.4173 X A3 3 0.4200 X

A4 3 0.4873 X

Contraste Diferencia +/- Límites

A1 - A2 -0.01233 0.0466225 A1 - A3 -0.01500 0.0466225

A1 - A4 * -0.08233 0.0466225 A2 - A3 -0.00267 0.0466225

A2 - A4 * -0.07000 0.0466225 A3 - A4 * -0.06733 0.0466225

16

Con este método hay un riesgo del 5.0 % al decir que uno o más pares son

significativamente diferentes, cuando la diferencia real es igual a 0.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

17

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

En la Tabla 7 se muestra un resumen de todos los datos calculados para la

determinación de la capacidad antioxidante.

La Ecuación 3 nos indica el cálculo para determinar la concentración molar

[3]

, 7

25 ,24 , ,67

2 2 ,67 ,8 2 25 2 , 42

MTRA

Vfinal

bco

DPPH (l

mtra/...) Absorbancia (515 nm) %

DPPH mM y=a+bx desviación 1/2 Abs EC50 1/EC50

gr cromona (abs) (l) (ml)

(/ml DPPH) 1 2 3 prom cons.

x µM

(l mtra/mlDPPH)

(g cromonaj)

1/g cromona

C-NO2

10 0,0107 0,963 220 1 220 0,262 0,260 0,253 0,2583 73,17 0,63 460 0,01586305 1726,761453 1,85E-03 541,2325

10 0,0107 0,963 200 1 200 0,273 0,274 0,252 0,2663 72,34 0,578

10 0,0107 0,963 180 1 180 0,290 0,290 0,282 0,2873 70,16 0,515

10 0,0107 0,963 160 1 160 0,293 0,291 0,292 0,2920 69,68 0,458

C-N3

10 0,0085 0,963 120 1 120 0,404 0,376 0,435 0,4050 57,94 0,3811 59 0,036918727 1088,826135 9,26E-04 1080,494

10 0,0085 0,963 80 1 80 0,414 0,413 0,425 0,4173 56,66 0,2540

10 0,0085 0,963 60 1 60 0,421 0,418 0,421 0,4200 56,39 0,1905

10 0,0085 0,963 40 1 40 0,509 0,475 0,478 0,4873 49,39 0,1270

Trolox

10 0,0017 0,969 80 1 80 0,103 0,104 0,104 0,1037 89,30 0,042 8,3 0,097707665 254,847764 4,33E-05 23081,83

10 0,0017 0,969 60 1 60 0,167 0,161 0,169 0,1657 82,90 0,032

10 0,0017 0,969 40 1 40 0,217 0,218 0,226 0,2203 77,26 0,0214

10 0,0017 0,969 20 1 20 0,357 0,357 0,357 0,3570 63,16 0,0107

Tabla 7. Resumen de resultados de la capacidad antioxidante

18

Se evaluó una serie de cromonas con diferentes sustituyentes, se evaluó su

capacidad para capturar el 2,2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH), y determinar

su actividad para secuestrar radicales libres. La actividad antiradicalaria para

los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-

trifluorometilcromona, con sustituyentes nitro y azida en posición del anillo

cromona presentaron los valores de EC50 mostrados en la Tabla 8.

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

1/EC50

Nombre Molécula 1/g cromona

3-nitrometil-2-triflurometilcromona NO2 541.2325

3-azidometil-2-trifluorometilcromona N3 1.080.494

Trolox Trolox 23081.83

Los valores medios de la concentración efectiva y de la desviación estándar

se representan para cada molécula con una concentración conocida

obtenida a partir de experimentos independientes llevados a cabo por

triplicado.

Los valores EC50 se calcularon a partir de cada curva como la concentración

efectiva capaz de reducir 50 % de DPPH. La Figura 6, muestra los

resultados obtenidos para los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona

y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, con sustituyentes NO2 y N3 en

contraste con trolox. En el caso de Días (2011) se realizó un procedimiento

similar, con un tiempo de estabilización de 20 minutos, determinando el

porcentaje de DPPH para cada compuesto y cada concentración, los

compuestos reaccionaron de diferente forma y algunos no presentaron

reducción de radicales DPPH, lo que indica que el centro de cromona es

importante pero no es el único responsable de la capacidad secuestrante de

radicales libres (Dias et al., 2011).

Según el estudio realizado por Sharma (2011), se comparó la actividad

antioxidante de un grupo de cromonas con medicamentos estándar

utilizados en el tratamiento de hongos. Los resultados arrojan resultados

más prometedores para el grupo de cromonas, incluso mejor que los

fármacos, este ensayo se lo realizó por el ensayo de DPPH, mostrando

capacidad antioxidante a una concentración de 1mg/ml.

Por otra parte, se calculó el porcentaje de DPPH (Tabla 7) utilizado en la

soluciones para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona y la 3-nitrometil-2-

Tabla 8. Concentración Efectiva EC50

19

trifluorometilcromona. La actividad antioxidante mostró un perfil dependiente

del tiempo y de cada nivel de concentración de cromona.

El

DPP

H

mue

stra

un

máxi

mo

de

absorción típico a

515 nm, que desaparece tras la reducción a la correspondiente hidrazina

(DPPH2). Este ensayo colorimétrico se utiliza comúnmente para establecer

relaciones estructura-actividad.

En primer lugar se determinó el tiempo de estabilización para la reducción

del DPPH, las Figuras 7 y 8 muestran la cinética de estabilización de los

compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-

trifluorometilcromona. La decoloración de la mezcla de DPPH con la solución

de cromona se realizó en estado estacionario y se comprobó que el tiempo

para que se estabilice el DPPH era de 8 horas para los dos moléculas que

mostraron actividad antioxidante, de las 13 cromonas estudiadas.

Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH

0

500

1000

1500

2000

2500

3-nitrometil-2-triflurometilcromona

3-azidometil-2-trifluorometilcromona

TROLOX

1/E

C 5

0

Móleculas

Capacidad Antioxidante (DPPH)

20

0,4

0,5

0,6

0,7

9:36 12:00 14:24 16:48

Ab

sorb

anci

as

Tiempo

Cinética de estabilización de C-NO2

Figura 7. Cinética de estabilización de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona.

Figura 8. Cinética de estabilización de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona.

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

9:36 10:48 12:00 13:12 14:24 15:36 16:48

Ab

sorb

anci

as

Tiempo

Cinética de estabilización de C-N3

21

Figura 9. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-

nitrometil-2-trifluorometilcromona.

y = 0,0633x + 59,304 R² = 0,942

68

69

70

71

72

73

74

75

160 170 180 190 200 210 220

% D

PP

H

µl cromona

Compuesto C-NO2

3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DPPH DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.

Las curvas dosis-respuesta correspondientes para los compuestos

antiradicales más eficaces se muestran en las Figuras 9 y 10 junto con trolox

(Figura 11) como control. Muestran una relación de proporción directa entre

los microlitros de cromona agregada y el porcentaje de DPPH cosumido.

Figura 10. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

y = 0,0903x + 48,321 R² = 0,6385

48

50

52

54

56

58

60

30 50 70 90 110

% D

PP

H

µl cromona

COMPUESTO C-N3

22

Figura 11. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante de trolox

y = 0,4204x + 57,138 R² = 0,9487

60,00

65,00

70,00

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

20 30 40 50 60 70 80 90

% D

PP

H

µl de cromona

TROLOX

La Figura 10 una curva de calibración para el compuesto 3-azidometil-2-

trifluorometilcromona con un bajo valor del coeficiente de determinación (R2

= 0.639). Por lo tanto, los datos no se ajustarían a la respuesta directamente

proporcional de una ecuación lineal. Sin embargo, el aumento de niveles de

microlitros de cromona (µl) incrementaría el tamaño de la muestra

corregiendo la repuesta lineal (Restrepo & González, 2007).

Los dos compuestos que mostraron actividad antioxidante (Figura 4)

presentaron como caracteristica en común al grupo CF3 en la posición 2 del

anillo cromona y sustituyentes electroatrayentes específicos como el grupo

funcional nitro y azido, que favorecen la actividad antioxidante.

El procedimiento experimental realizado asegura un análisis reproducible y

fiable de los datos, ya que las condiciones se mantienen constantes para

cada evaluación de barrido de radicales y los resultados se interpretan de

acuerdo a parámetros calculados relevantes para la capacidad antioxidante.

3.2. ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE

La Tabla 9, presenta los valores de la entalpia de disociación de enlace

(EDE) de todos los compuestos estudiados y de color gris se señala los

nombres de las estructuras y los valores de EDE de los compuestos que

presentaron actividad antioxidante.

23

Compuesto Método uPM6*

(EDE/kJ mol-1

)

3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona 246.5

3-azidometil-2-trifluorometilcromona 280.7

3-ftalimidoilmetil-2-trifluorometilcromona 297.5

3-cianometil-2-trifluorometilcromona 313.1

3-bromometil-2-clorodifluorometilcromona 316.3

3-metil-2-pentafluoroetilcromona 316.7

2-clorodifluorometil-3-metilcromona 317.3

6-cloro-3-metil-2-trifluorometilcromona 317.9

2- diclorometil-3-metilcromona 318.2

3-bromometil-2-trifluoroometilcromona 319.8

3-nitrometil-2-trifluorometilcromona 331.4

2-difluorometil-3-metilcromona 345.4

3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona 570.7

Trolox 131.1

* Método de capa cerrada uPM6.

Los valores de EDE de todas las moléculas estudiadas se obtuvieron

utilizando modelos de capa abierta con el nivel de teoría semi-empírico PM6

(Stewart, 2007). Cuanto menor es la EDE, mayor es la capacidad de donar

un átomo H de un grupo, dando lugar a un radical estable, que deslocaliza el

electrón desapareado alrededor del sistema conjugado que posea la

molécula, favoreciendo el proceso de actividad anti-radicalario (Dias et al.,

2011). El detalle del cálculo de la energía de disociación de enlace C-H,

determinado por el método de capa abierta uPM6 se detalla en el Anexo 1.

Por otra parte, la Tabla 10 muestra los resultados de la EDE y potencial de

ionización (PI) calculados para los compuestos que presentaron actividad

antioxidante.

La aplicabilidad de métodos PM6 implementados en el modelado de la

actividad antioxidante o anti-radicalaria de flavonoides, muestra que la

entalpía de disociación de enlace (EDE) de los grupos -OH podría calcularse

mucho más rápido con el método semiempírico PM6 y con una calidad

similar a los métodos de la Teoría del Funcional de la Densidad (DFT) (Amić

& Lučić, 2010). Por lo tanto, los cálculos de la EDE mostrados en la Tabla 9,

presentan un buen grado de confiabilidad, que permite inferir tendencias

generales y correlaciones entre los resultados de capacidad antioxidante

determinados por el ensayo DPPH y valores teóricos de la EDE.

Sin embargo, con la finalidad de verificar la tendencia determinada con el

método semiempírico uPM6, se desarrolló para los compuestos 5 (C-N3) y

11 (C-NO2) que mostraron actividad antioxidante, un cálculo de la EDE con

Tabla 9. Entalpia de disociación de enlace, calculada (uPM6) C-H, correspondientes a la formación de especies radicalarias para los derivados de cromona bajo estudio.

24

un nivel de teoría más sofisticado uB3LYP/6-311++ g (d,p). La Tabla 10

muestra los resultados de la EDE (kJ/mol) y presentan una tendencia similar

entre los métodos estudiados.

Compuesto

Método uB3LYP/6-311++ g (d,p)

P. I.* (kcal/mol)

(EDE/kJ mol-1

)

3-nitrometil-2-trifluorometilcromona

352,221 175,7

3-azidometil-2-trifluorometilcromona

415,396 165,9

* P.I.: Potencial de ionización determinado con el método uB3LYP/6-311++ g (d,p).

La EDE permite inferir en la capacidad de la potencial molécula antioxidante

de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable, el

cual dependiendo de sus características estructurales podría deslocalizar la

carga, favoreciendo procesos de actividad secuestrante de radicales libres,

por lo tanto de acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que el

valor de EDE del compuesto 11 con el sustituyente nitro es menor que el

compuesto 5 con el sustituyente azida. Los resultados de EDE son

respectivamente 352,2 y 415,4 kJ/mol respectivamente. Este resultado

sugiere una mayor facilidad de la3-azidometil-2-trifluorometilcromona para

donar un átomo de hidrógeno que la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

En cuanto al valor del potencial de ionización (P.I.) se define de manera

general como la energía necesaria para sustraer un electrón de un sistema

en equilibrio. Por tanto, el P.I. presenta relación con la energía del orbital

HOMO, siendo el orbital HOMO el orbital molecular ocupado de más alta

energía. Por lo tanto, una eficiente atracción de carga requiere que el P.I

presente un valor bajo de energía, resultando concordante el valor menor de

175,7 kcal/mol de la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, respecto al valor

de P.I. de 165,9 kcal/mol de 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.

La Figura 12 a – b, muestran las especies radicalarias más estables

calculadas, de los compuestos que presentaron actividad antioxidante. Se

observa deslocalización electrónica desde el enlace doble C2-C3 del anillo

4-pirano hacia los grupos electroatractores, azida (-C-N3) y nitro (-C-NO2).

Asimismo, la densidad de espín mostrada en las figuras 12 c – d, de los

compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-

trifluorometilcromona, localiza orbitales sobre los átomos en los cuales se

deslocaliza el electrón desapareado del radical. Se puede inferir que la

coplanaridad observada entre el sustituyente –CH-N3 y el anillo cromona en

Tabla 10. Energía de disociación de enlace, correspondientes a la formación de

especies radicalarias para los derivados de cromona bajo estudio.

25

el radical formado del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona

favorece el eficiente traslape de orbitales p, que contribuyen a una mejor

deslocalización del electrón a lo largo de los enlaces conjugados.

Se sugiere que la planaridad del sustituyente –CH-N3 favorece una mayor

eficiencia para deslocalizar el electrón en la especie radicalaria, estando

correlacionada la relación de estructura con el comportamiento antioxidante.

Como puede notarse el radical del compuesto 3-nitrometil-2-

trifluorometilcromona, no muestra el grupo CH-NO2 en el mismo plano del

núcleo estructural cromona.

Criterios estructurales para la actividad antioxidante de flavonoides que

presentan una cercanía estructural con los compuestos estudiados en la

presente tesis, muestran una alta dependencia con su estructura química,

donde planaridad y conjugación extendida π, a lo largo de los anillos muestra

una marcada influencia en la capacidad antioxidante (Amic et al., 2007).

La distribución de la densidad de espín en las especies de radicales, se

correlacionan con los valores calculados de energía de disociación de enlace

EDE. Los zonas de color azul y verde muestran los orbitales donde se

deslocaliza el electrón del radical, el compuesto con el sustituyente azida

(N3) presenta mayor conjugación alternada π, respecto al grupo nitro (NO2)

Figura 12. Especies radicalarias de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (a) y 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona (b).

(a) (b)

(c) (d)

26

para deslocalizar el electrón. Esta observación se condice con la mejor

capacidad antioxidante y un valor de EDE menor para la cromona con el

sustituyente electro-atractor metilazida (-CH2N3) en posición 3 del heterociclo

cromona.

De las 13 cromonas estudiadas, el radical de 3-hidroximetil-2-

trifluorometilcromona, es el que presenta menor valor de EDE mientras que

el radical de 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona es el que presenta mayor

valor de EDE.

Las cromonas se comportan de una manera especial debido a que su radical

más estable no corresponde necesariamente a la conformación favorecida

de la molécula que presenta mayor capacidad antioxidante.

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

27

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1. CONCLUSIONES

Se evaluó las propiedades antioxidantes de 13 cromonas haloalquil

sustituidas, de las cuales dos mostraron actividad antioxidante, 3-

azidometil-2-trifluorometilcromona y 3-nitrometil-2-

trifluorometilcromona.

Se realizó cálculos teóricos químico cuánticos, utilizando modelos

semi-empíricos PM6 para determinar la energía de disociación de

enlace (EDE) de las especies radicalarias. Sin embargo del conjunto

de moléculas estudiadas (1 - 13), el estudio teórico de EDE con el

método semiempírico uPM6 no permite inferir que a menor valor de

EDE existiría una mayor capacidad antioxidante.

Las cromonas que presentaron actividad antioxidante, presentan

sustituyentes nitrometil (-CH2NO2) y azidometil (-CH2N3) en posición

3 y el grupo trifluorometilo (-CF3) en posición 2. Estos rasgos

estructurales relevantes evidencian la influencia de los sustituyentes

electroatractores mencionados, en el comportamiento químico y

actividad antioxidante observada. Se mostró los sitios de

deslocalización a lo largo del anillo cromona y sustituyentes utilizando

los mapas de distribución de densidad de espín.

Los resultados del presente trabajo permiten inferir una relación

estructura-actividad diferente a los observados en diversos derivados

de flavonoides. La capacidad antioxidante observada en este grupo

de compuestos muestra una marcada influencia de los sustituyentes

electroatractores nitro y azida en posición 3 del anillo cromona y se

infiere que la coplanaridad y conjugación π, del sustituyente en el

radical favorece en gran medida la deslocalización del electrón a lo

largo del sistema conjugado.

Los valores de EDE analizados para todas las estructuras estudiadas

nos indican que el radical de 3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona es

la estructura que menor energía necesita para donar un átomo de

hidrogeno por los tanto es el radical más estable del grupo estudiado.

28

4.2. RECOMENDACIONES

Para continuar con el estudio de actividades biológicas de los

compuestos analizados, se recomienda realizar un posterior ensayo

de toxicidad de los compuestos que presentaron capacidad

antioxidante, con el objetivo de poder utilizar este tipo de cromonas en

la industria de alimentos.

Según la bibliografía analizada el nivel de teoría PM6 modela de

manera fiable los resultados de EDE y permite correlacionarlos con la

capacidad antioxidante. Sin embargo, se sugiere realizar un estudio

con niveles de teoría más sofisticados en los 13 compuestos para

minimizar los errores intrínsecos del nivel de cálculo semiempírico

PM6. Esto permitiría predecir otras propiedades electrónicas con

mayor fiabilidad para continuar un estudio de relación estructura-

actividad, utilizando descriptores mecánico cuánticos.

5. BIBLIOGRAFÍA

29

5. BIBLIOGRAFÍA

Alcívar León, Christian David. (2016). Estudio de nuevos benzopiranos haloalquil sustituidos. Facultad de Ciencias Exactas.

Amic, Dragan, Davidovic-Amic, Dusanka, Beslo, Drago, Rastija, Vesna, Lucic, Bono, & Trinajstic, Nenad. (2007). SAR and QSAR of the antioxidant activity of flavonoids. Current medicinal chemistry, 14(7), 827-845.

Amić, Dragan, & Lučić, Bono. (2010). Reliability of bond dissociation enthalpy calculated by the PM6 method and experimental TEAC values in antiradical QSAR of flavonoids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18(1), 28-35. doi: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.11.015

Avello, Marcia, & Suwalsky, Mario. (2006). Radicales libres, antioxidantes naturales y mecanismos de protección. Atenea (Concepción)(494), 161-172.

Balasundram, Nagendran, Sundram, Kalyana, & Samman, Samir. (2006). Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food chemistry, 99(1), 191-203.

Bort, Juan Andrés. (2001). Química teórica y computacional (Vol. 2): Publicacions de la Universitat Jaume I.

De la Vega, Juan C, Cañarejo, Magali A, & Pinto, Nicolás S. (2017). Avances en Tecnología de Atmósferas Controladas y sus Aplicaciones en la Industria. Una Revisión. Información tecnológica, 28(3), 75-86.

Dias, MM, Machado, NFL, & Marques, MPM. (2011). Dietary chromones as antioxidant agents—the structural variable. Food & function, 2(10), 595-602.

García Bacallao, Lourdes, Vicente García Gómez, Luis, Rojo Domínguez, Delia Mercedes, & Sánchez García, Elsa. (2001). Plantas con propiedades antioxidantes. Revista cubana de investigaciones biomédicas, 20(3), 231-235.

Halliwell, Barry. (2007). Biochemistry of oxidative stress. Biochemical Society Transactions, 35(5), 1147-1150.

30

K Sharma, S, Kumar, S, Chand, K, Kathuria, A, Gupta, Anjali, & Jain, R. (2011). An update on natural occurrence and biological activity of chromones. Current medicinal chemistry, 18(25), 3825-3852.

La Cruz-Oré, De, & Luis, Jorge. (2013). ¿ Qué significan los grados de libertad? Revista Peruana de Epidemiología, 17(2).

Li, Yong, & Yang, Zheng-yin. (2010). Rare earth complexes with 3-carbaldehyde chromone-(benzoyl) hydrazone: synthesis, characterization, DNA binding studies and antioxidant activity. Journal of fluorescence, 20(1), 329-342.

Machado, NFL, & Marques, MPM. (2010). Bioactive chromone derivatives-structural diversity. Current bioactive compounds, 6(2), 76-89.

MANTEROLA, CARLOS, & PINEDA, VIVIANA. (2008). El valor de" p" y la" significación estadística": Aspectos generales y su valor en la práctica clínica. Revista chilena de cirugía, 60(1), 86-89.

Morrison, Robert Thornton, & Boyd, Robert Neilson. (1998). Química orgánica: Pearson Educación.

Muñoz Jauregui, Ana María, & Ramos Escudero, Fernando. (2007). Componentes fenólicos de la dieta y sus propiedades biomedicinales. Horizonte Médico, 7(1).

Muñoz Juárez, MA, & Gutiérrez, DM. (2009). Determinación de actividad antioxidante de diversas partes del árbol Nicotiana glauca. Facultad Química, Universidad Autónoma de Queretaro.

Pérez López, César. (2005). Métodos estadísticos avanzados con SPSS. Thompson. Madrid.

Phosrithong, Narumol, Samee, Weerasak, Nunthanavanit, Patcharawee, & Ungwitayatorn, Jiraporn. (2012). In vitro antioxidant activity study of novel chromone derivatives. Chemical biology & drug design, 79(6), 981-989.

Pokorny, J., Yanishlieva, N., Alonso, J.J.A., & Gordon, M. (2004). Antioxidantes de los alimentos: aplicaciones prácticas: Acribia.

Pokorny, Jan, Yanishlieva, N, & Gordon, Michael. (2005). Antioxidantes de los alimentos. Editorial Acribia, SA Zaragoza. España.

Restrepo, Luis F, & González, Julián. (2007). From pearson to Spearman. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 20(2), 183-192.

31

Riboli, Elio, & Norat, Teresa. (2003). Epidemiologic evidence of the protective effect of fruit and vegetables on cancer risk. The American Journal of Clinical Nutrition, 78(3), 559S-569S.

Seyoum, Ameha, Asres, Kaleab, & El-Fiky, Fathy Kandeel. (2006). Structure–radical scavenging activity relationships of flavonoids. Phytochemistry, 67(18), 2058-2070.

Stewart, James J. P. (2007). Optimization of parameters for semiempirical methods V: Modification of NDDO approximations and application to 70 elements. Journal of Molecular Modeling, 13(12), 1173-1213. doi: 10.1007/s00894-007-0233-4

Vakarelska-Popovska, Maria H, & Velkov, Zhivko. (2016). Monohydroxy flavones. Part IV: Ehthalpies of different ways of O–H bond dissociation. Computational and Theoretical Chemistry, 1077, 87-91.

Valenzuela, Carolina, & Pérez, Patricio. (2016). Actualización en el uso de antioxidantes naturales derivados de frutas y verduras para prolongar la vida útil de la carne y productos cárneos. Revista chilena de nutrición, 43(2), 188-195.

von Zglinicki, Thomas. (2002). Oxidative stress shortens telomeres. Trends in biochemical sciences, 27(7), 339-344.

6. ANEXOS

32

ANEXO 1

Cálculo de uPM6

𝐸𝐷𝐸𝑁3 − . 577948 + . 83 298 − − . 8 6722 = 0,1069072

EDE N3 = 0,1069072 Hartree EDE N3 = 280,7 kJ/mol

𝑬𝑫𝑬𝑵𝑶𝟐 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴−𝑯

𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − .266857 + . 83 298 − − .3 427 = 0,1262154

EDE NO2 = 0,1262154 EDE NO2 = 331,3785 kJ/mol

33

ANEXO 2

Imágenes del trabajo experimental realizado en el

laboratorio

Medición de absorbancias de las

nuevas cromonas

Segundo grupo de soluciones de

cromonas

Preparación de material Primer grupo de soluciones de cromonas