UNIVERSIDAD DE MURCIA

Dña. Miranda Prats van der Ham2018

ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO

Mecanismos Moleculares de Resistencia Antibióticay Papel Epidemiológico del Semental Ovino

en la Agalaxia Contagiosa

A JuanA mis padres y mis hermanos

ÍndicePágina

1. Introducción 5

2. Resumen 112.1. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.2. Estudio 1. Presencia de Mycoplasma agalactiae en el semen de

moruecos asintomáticos naturalmente infectados. . . . . . . . . . . 142.3. Estudio 2. Detección de moruecos asintomáticos infectados por

Mycoplasma agalactiae en centros de inseminación artificial. . . . . 152.4. Estudio 3. Pleuroneumonía contagiosa caprina y otras

micoplasmosis emergentes de los pequeños rumiantes en zonas áridas. 162.5. Estudio 4. Mecanismos moleculares de resistencia a macrólidos y

lincomicina de Mycoplasma agalactiae. . . . . . . . . . . . . . . . . 172.6. Estudio 5. Mecanismos moleculares de resistencia a macrólidos y

lincosamidas en Mycoplasma capricolum subsp. capricolum. . . . . . 182.7. Estudio 6. La tendencia a una menor susceptibilidad a las

tetraciclinas de los agentes causantes de la agalaxia contagiosapuede deberse a distintos mecanismos moleculares. . . . . . . . . . . 19

2.8. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3. Summary 223.1. Objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243.2. Study 1. Presence of Mycoplasma agalactiae in semen of naturally

infected asymptomatic rams. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253.3. Study 2. Detecting asymptomatic rams infected with Mycopasma

agalactiae in ovine artificial insemination centres. . . . . . . . . . . 263.4. Study 3. Contagious caprine pleuropneumonia and other emergent

mycoplasmal diseases affecting small ruminants in arid lands. . . . . 273.5. Study 4. Molecular resistance mechanisms of Mycoplasma agalactiae

to macrolides and lincomycin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283.6. Study 5. 23S rRNA and L22 ribosomal protein are involved in the

acquisition of macrolide and lincosamide resistance in Mycoplasmacapricolum subsp. capricolum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.7. Study 6. The moderate drift towards less tetracycline-susceptibleisolates of contagious agalactia causative agents might result fromdifferent molecular mechanisms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.8. Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

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4. Artículos publicados 334.1. Presence of Mycoplasma agalactiae in semen of naturally infected

asymptomatic rams . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334.2. Detecting asymptomatic rams infected with Mycoplasma agalactiae

in ovine artificial insemination centers . . . . . . . . . . . . . . . . . 344.3. Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) and other emergent

mycoplasmal diseases affecting small ruminants in arid lands . . . . 354.4. Molecular resistance mechanisms of Mycoplasma agalactiae to

macrolides and lincomycin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.5. 23S rRNA and L22 ribosomal protein are involved in the acquisition

of macrolide and lincosamide resistance in Mycoplasma capricolumsubsp. capricolum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.6. The moderate drift towards less tetracycline susceptible isolates ofcontagious agalactia causative agents might result from differentmolecular mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.7. Aportaciones del doctorando en las publicaciones incluidas en lapresente tesis doctoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5. Apéndices 425.1. Estancias de investigación en el extranjero . . . . . . . . . . . . . . 425.2. Comunicaciones a congresos derivadas de la presente tesis doctoral . 435.3. Publicaciones en revistas nacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455.4. Conferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

6. Abreviaciones 48

7. Agradecimientos 50

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1. Introducción

1. Introducción

1. Introducción

La presente tesis doctoral por compendio consta de seis publicaciones científicasy, con arreglo a la normativa R-310/2015 de la Universidad de Murcia, aspira ala mención de “Doctorado Internacional”. Los artículos científicos presentados hansido publicados en revistas científicas indizadas en el Journal Citation Reports(JCR, 2015-2017), en las categorías de Ciencias veterinarias (Veterinary sciences)y Ecología (Ecology).

Dichas publicaciones conforman una unidad científica y temática, ya que suobjetivo común es mejorar las estrategias de control y prevención de la agalaxiacontagiosa, una micoplasmosis que afecta a los pequeños rumiantes. La importanciade la agalaxia contagiosa se debe principalmente a su efecto perjudicial sobrela producción láctea, lo que conlleva importantes pérdidas económicas. Españaes considerada como un área endémica de la agalaxia contagiosa, ya que lasituación clínica más habitual consiste en rebaños crónicamente infectados dondelos brotes clínicos de la enfermedad ocurren de forma esporádica y en los que lasintomatología de mayor relevancia son las mamitis, con frecuencia subclínicas.En este contexto, se ha demostrado que los sementales caprinos, comúnmenteasintomáticos, juegan un papel epidemiológico importante como transmisores deesta enfermedad puesto que son los responsables tanto de mantener la infeccióncomo de transmitirla dentro y entre distintos rebaños. Sin embargo, la funcióndesempeñada por los sementales ovinos en este sentido ha sido escasamenteestudiada. El conocimiento preciso de las distintas vías de excreción mediante lasque estos portadores ovinos son capaces de transmitir las especies de micoplasmascausantes de la agalaxia contagiosa, así como de las muestras más eficaces parasu diagnóstico o detección permitirá el diseño e implementación de protocolosefectivos para evitar los riesgos asociados a estos individuos. Además, teniendoen cuenta la ausencia de evidencias científicas acerca de la eficacia de otrasmedidas preventivas como las vacunas, los antimicrobianos son la principalestrategia empleada para controlar los brotes clínicos de agalaxia contagiosa.En este sentido, los macrólidos, lincosamidas y tetraciclinas, cuya eficacia frentea los micoplasmas causantes de esta enfermedad ha sido demostrada in vitro,son los grupos de antimicrobianos más empleados en el campo actualmente. Noobstante, estudios recientes han documentado la emergencia de resistencias a estosantimicrobianos en los últimos años, debido a su uso indiscriminado, en distintasespecies de micoplasmas de interés veterinario incluyendo Mycoplasma agalactiae,el agente causal principal de la agalaxia contagiosa. Así, la comprensión de losmecanismos moleculares implicados en este descenso de susceptibilidad a dichosantimicrobianos permitirá determinar la estrategia terapéutica más efectiva parael tratamiento tanto a nivel individual como de rebaño.

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1. Introducción

Por otro lado, la pleuroneumonía contagiosa caprina, la neumonía atípica y laqueratoconjuntivitis infecciosa son otras micoplasmosis emergentes o reemergentesque comparten con la agalaxia contagiosa las importantes repercusiones sobre lasanidad animal y los aspectos socioeconómicos ligados a los rebaños de pequeñosrumiantes. Del mismo modo, dichas enfermedades también son responsables desintomatología a nivel respiratorio y ocular, coincidiendo con el síndrome clásicode la agalaxia contagiosa.

Los seis artículos científicos que constituyen la presente tesis doctoral seenumeran a continuación:

1. Presence of Mycoplasma agalactiae in semen of naturally infectedasymptomatic rams.

Autores: Prats-van der Ham, M., Tatay-Dualde, J., de la Fe, C.,Paterna, A., Sánchez, A., Corrales, J.C., Contreras, A., Gómez-Martín,Á.Fecha de publicación: Agosto, 2016.Revista: Theriogenology.Volumen: 86.Páginas: 791-794.Categoría del Journal Citation Reports (2016): Veterinary sciences.Factor de impacto: 1,986.Factor de impacto quinquenal: 2,127.Posición: 15 de 136.DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.02.033

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1. Introducción

2. Detecting asymptomatic rams infected with Mycoplasma agalactiae in ovineartificial insemination centers.

Autores: Prats-van der Ham, M., Tatay-Dualde, J., de la Fe, C.,Paterna, A., Sánchez, A., Corrales, J.C., Contreras, A., Gómez-Martín,Á.Fecha de publicación: Febrero, 2017.Revista: Theriogenology.Volumen: 89.Páginas: 324-328.Categoría del Journal Citation Reports (2017): Veterinary sciences.Factor de impacto: 2,136.Factor de impacto quinquenal:2,209.Posición: 13 de 140.DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.09.014

3. Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) and other emergentmycoplasmal diseases affecting small ruminants in arid lands.

Autores: Prats-van der Ham, M., de la Fe, C., Amores, J., Paterna, A.,Tatay-Dualde, J., Gómez-Martín, Á.Fecha de publicación: Agosto, 2015.Revista: Journal of Arid Environments.Volumen: 119.Páginas: 9-15.Categoría del Journal Citation Reports (2015): Ecology.Factor de impacto: 1,623.Factor de impacto quinquenal: 2,212.Posición: 89 de 150.DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaridenv.2015.03.006

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1. Introducción

4. Molecular resistance mechanisms of Mycoplasma agalactiae to macrolidesand lincomycin.

Autores: Prats-van der Ham, M., Tatay-Dualde, J., de la Fe, C.,Paterna, A., Sánchez, A., Corrales, J.C., Contreras, A., Gómez-Martín,Á.Fecha de publicación: Noviembre, 2017.Revista: Veterinary Microbiology.Volumen: 211.Páginas: 135-140.Categoría del Journal Citation Reports (2017): Veterinary sciences.Factor de impacto: 2,524.Factor de impacto quinquenal: 2,770.Posición: 8 de 140.DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.10.012

5. 23S rRNA and L22 ribosomal protein are involved in the acquisition ofmacrolide and lincosamide resistance in Mycoplasma capricolum subsp.capricolum.

Autores: Prats-van der Ham, M., Tatay-Dualde, J., Gómez-Martín, Á.,Corrales, J.C., Contreras, A., Sánchez, A., de la Fe, C.Fecha de publicación: Marzo, 2018.Revista: Veterinary Microbiology.Volumen: 216.Páginas: 207-211.Categoría del Journal Citation Reports (2017): Veterinary sciences.Factor de impacto: 2,524.Factor de impacto quinquenal: 2,770.Posición: 8 de 140.DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.02.014

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1. Introducción

6. The moderate drift towards less tetracycline-susceptible isolates ofcontagious agalactia causative agents might result from different molecularmechanisms.

Autores: Prats-van der Ham, M., Tatay-Dualde, J., Ambroset, C., de laFe, C., Tardy, F.Fecha de publicación: Julio, 2018.Revista: Veterinary Microbiology.Volumen: 220.Páginas: 39-46.Categoría del Journal Citation Reports (2017): Veterinary sciences.Factor de impacto: 2,524.Factor de impacto quinquenal: 2,770.Posición: 8 de 140.DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.05.001

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2. Resumen

2. Resumen

2. Resumen

Los artículos que conforman la presente tesis doctoral abordan por un lado elpapel epidemiológico del semental ovino en la agalaxia contagiosa y por otro, losmecanismos moleculares de resistencia de los agentes causantes de esta enfermedadfrente a macrólidos, lincosamidas y tetraciclinas. Ambos permiten mejorar lasestrategias de control y prevención de la agalaxia contagiosa.

En los últimos años se han producido avances importantes en el conocimientode las implicaciones de los sementales caprinos en la epidemiología de la agalaxiacontagiosa. Así, se han definido las distintas vías de excreción de los micoplasmascausantes de la enfermedad y se ha descrito la presencia de sementales caprinosinfectados en los centros de recogida de semen y mejora genética. Estos hallazgosdemuestran el papel del semental caprino asintomático como reservorio y fuente dedifusión de la infección. Además, han permitido la implementación de protocolospara prevenir y controlar la admisión y presencia de dichos portadores en loscentros de inseminación artificial sitos en áreas endémicas de agalaxia contagiosa.Sin embargo, las vías de excreción de Mycoplasma agalactiae, el principal agenteetiológico de la agalaxia contagiosa ovina, por parte de los moruecos han sidoescasamente descritas, y en su mayoría son observaciones obtenidas tras lainoculación experimental del agente. Por ello, se investigaron la presencia de M.agalactiae en el semen de moruecos asintomáticos infectados de forma natural(Estudio 1) y las muestras más eficaces para la detección de dichos portadores(Estudio 2). Debido a la importancia de otras micoplasmosis emergentes oreemergentes de los pequeños rumiantes, responsables de síntomas respiratoriosy/o oculares similares a aquellos producidos por la agalaxia contagiosa, éstas serecogen en el trabajo de revisión que incluye, entre otros, la neumonía atípicaovina causada por M. ovipneumoniae, una especie aislada también en moruecosasintomáticos, así como la pleuroneumonía contagiosa caprina causada por M.capricolum subsp. capripneumoniae, una especie de micoplasma filogenéticamentemuy próxima a M. mycoides subsp. capri y M. capricolum subsp. capricolum, y laqueratoconjuntivitis infecciosa ocasionada por M. conjunctivae (Estudio 3).

Por otro lado, debido a la ausencia de evidencias científicas acerca de la eficaciade las vacunas actualmente disponibles para prevenir la agalaxia contagiosa,el tratamiento basado en el uso de antimicrobianos es la estrategia de controlmás eficaz empleada al ocurrir brotes clínicos de esta enfermedad, si bien no seconsigue la curación microbiológica de los individuos infectados. No obstante, eluso indiscriminado de los antimicrobianos ha provocado un descenso significativoen la susceptibilidad de distintas especies de micoplasma de interés veterinario, loque puede producir el fallo de los tratamientos aplicados. En este sentido, se hadescrito la aparición de resistencias a las distintas familias de antimicrobianos en

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2. Resumen

M. bovis, un agente filogenéticamente cercano a M. agalactiae. Asimismo, se hadescrito el descenso generalizado de la susceptibilidad en el tiempo de este últimoagente en Francia, país donde la agalaxia contagiosa es igualmente endémica.En este contexto, dado que el conocimiento pormenorizado de los mecanismosde resistencia antimicrobiana favorece la selección de estrategias terapéuticasefectivas, y que hasta el momento éstos no han sido descritos en los micoplasmascausantes de la agalaxia contagiosa, se investigaron los mecanismos molecularesresponsables del descenso de susceptibilidad a macrólidos, lincosamidas ytetraciclinas analizando aislamientos de campo y cepas resistentes seleccionadasin vitro, con el fin de demostrar la presión selectiva de concentraciones antibióticassubinhibitorias sobre cepas inicialmente susceptibles (Estudios 4, 5 y 6).

La detección de moruecos asintomáticos crónicamente infectados y lasvías de transmisión asociadas a los mismos junto con la necesidad deconocer los mecanismos moleculares implicados en la resistencia frente a losmacrólidos, lincosamidas y tetraciclinas, que se encuentran entre los principalesantimicrobianos utilizados para el tratamiento de la agalaxia contagiosa, motivaronlos objetivos específicos de la presente tesis doctoral, expuestos a continuación.

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2. Resumen

2.1. Objetivos

PRIMERO Estudiar la presencia de Mycoplasma agalactiae en el semen demoruecos asintomáticos naturalmente infectados y determinar su dinámica deexcreción.

SEGUNDO Detectar la presencia de moruecos infectados por Mycoplasmaagalactiae en colectivos de sementales presentes en distintos centros deinseminación y determinar la muestra más eficaz para identificar a dichosportadores.

TERCERO Realizar una revisión bibliográfica que recoja informaciónactualizada acerca de las micoplasmosis emergentes que afectan a los pequeñosrumiantes y que son responsables de síntomas similares a los asociados a la agalaxiacontagiosa, incluyendo las enfermedades causadas por Mycoplasma capricolumsubsp. capripneumoniae, M. ovipneumoniae y M. conjunctivae.

CUARTO Evaluar la susceptibilidad antimicrobiana y dilucidar el papel de lasmutaciones que alteran el ARN ribosomal 23S y las proteínas ribosolmales L4y L22 en la resistencia a macrólidos y lincomicina en aislamientos de campo ymutantes seleccionados in vitro de Mycoplasma agalactiae.

QUINTO Investigar el efecto de mutaciones en los genes codificadores del ARNribosomal 23S y de las proteínas ribosomales L4 y L22 sobre el descenso de lasusceptibilidad de aislamientos de campo y mutantes seleccionados in vitro deMycoplasma capricolum subsp. capricolum frente a macrólidos y lincosamidas.

SEXTO Determinar y comparar la susceptibilidad a las tetraciclinas deaislamientos de campo con distintas características epidemiológicas de las cuatroespecies de micoplasma causantes de la agalaxia contagiosa, aisladas en Francia yEspaña.

SÉPTIMO Investigar los mecanismos moleculares responsables del descenso desusceptibilidad frente a las tetraciclinas en las especies de micoplasma implicadasen la agalaxia contagiosa.

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2. Resumen

2.2. Estudio 1. Presencia de Mycoplasma agalactiae enel semen de moruecos asintomáticos naturalmenteinfectados.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la excreción de M. agalactiae,el principal agente etiológico de la agalaxia contagiosa, en el semen de moruecosinfectados de forma natural. Para ello, se analizaron eyaculados de 167 sementalesovinos pertenecientes a tres centros de inseminación distintos situados en un áreaendémica de agalaxia contagiosa mediante técnicas de diagnóstico microbiológicoy molecular. Además, se estudiaron distintos eyaculados obtenidos de los mismosindividuos con el fin de determinar la dinámica de excreción de dicho agente.M. agalactiae fue detectado en 56 (14,58%) de los 384 eyaculados analizados,pertenecientes a 44 (26,35%) de los moruecos estudiados. Estos resultadosconfirman la excreción de M. agalactiae en el semen de moruecos asintomáticosy la presencia de sementales ovinos portadores en los centros de inseminaciónestudiados, lo que representa un riesgo en cuanto a la difusión y el mantenimientode la agalaxia contagiosa en áreas endémicas, así como a la posible transmisiónvenérea de la enfermedad. De esta forma, los resultados obtenidos destacan lanecesidad de implementar medidas de control específicas para prevenir la admisiónde moruecos infectados a los centros de inseminación y la utilidad de la muestrade semen para identificar a dichos individuos.

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2. Resumen

2.3. Estudio 2. Detección de moruecos asintomáticosinfectados por Mycoplasma agalactiae en centros deinseminación artificial.

En áreas endémicas de agalaxia contagiosa, la situación clínica más frecuentees la de rebaños crónicamente infectados en los que los individuos asintomáticosrepresentan un factor de riesgo en cuanto a la transmisión de la infección. Elobjetivo del presente estudio fue detectar la presencia de moruecos infectados porM. agalactiae en distintos centros de inseminación y determinar la forma máseficaz de identificar a dichos portadores con el fin de diseñar e implementar unprotocolo adecuado para el control y la vigilancia de la agalaxia contagiosa. Paraello, se analizaron 215 sementales ovinos y 14 ovejas mediante hisopos auriculares,nasales y vaginales y muestras de suero. También se analizaron los eyaculadosde 147 de los moruecos estudiados. Todas las muestras se analizaron mediantetécnicas específicas de cultivo microbiológico y biología molecular para detectarM. agalactiae y serología para la detección de anticuerpos frente a este patógeno.De las 1077 muestras analizadas, 47 (4,4%) resultaron positivas a M. agalactiaey un morueco fue seropositivo. Así, 37 (17,2%) de los 215 moruecos analizadosestaban infectados por este patógeno. El tipo de muestra que proporcionalmentealcanzó un mayor número de resultados positivos a M. agalactiae fue el semen(13,6%), seguido de los hisopos nasales (5,8%). Por el contrario, el muestreodel conducto auditivo externo y del suero no fue efectivo para diagnosticar a losmoruecos infectados. Este estudio permitió detectar la presencia de portadoresasintomáticos en todos los centros de inseminación analizados, lo que destacala necesidad de implementar medidas de vigilancia específicas para prevenir laadmisión y presencia de dichos individuos en los centros de inseminación con el finde reducir el riesgo de transmisión de la agalaxia contagiosa.

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2. Resumen

2.4. Estudio 3. Pleuroneumonía contagiosa caprina y otrasmicoplasmosis emergentes de los pequeños rumiantesen zonas áridas.

La presente revisión bibliográfica recoge las principales características de lapleuroneumonía contagiosa caprina, detallando su epidemiología, diagnóstico ycontrol, e incluye también la descripción y repercusiones de otras micoplasmosisemergentes de los pequeños rumiantes en zonas áridas: la neumonía atípica causadapor Mycoplasma ovipneumoniae y la queratoconjuntivitis infecciosa causada porM. conjunctivae.

La pleuroneumonía contagiosa caprina, cuyo agente etiológico es Mycoplasmacapricolum subsp. capripneumoniae, es una de las enfermedades con mayorimpacto económico que afecta a los rebaños de pequeños rumiantes domésticossitos en zonas áridas de África y Asia. El cuadro clínico y lesional de estaenfermedad se manifiesta a nivel respiratorio mediante pleuroneumonía conhepatización unilateral, adherencias, pleuritis y acumulación de fluido pleural.La pleuroneumonía contagiosa caprina se extiende por distintos países comoKenia, Etiopía, Tanzania o Pakistán, y también afecta a otros rumiantes silvestrespresentes en zonas áridas, como las gacelas y los muflones. Por otro lado,M. ovipneumoniae es uno de los agentes infecciosos implicados en el síndromerespiratorio de los pequeños rumiantes, ha sido aislado en rebaños domésticospresentes en países europeos considerados semiáridos como España o Portugaly M. conjunctivae, que afecta principalmente a los rumiantes silvestres, ha sidoasociado a brotes clínicos de queratoconjuntivitis infecciosa en Arabia Saudí, Irán,Australia, India y en Europa, en los Pirineos y los Alpes, donde esta enfermedadse considera endémica.

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2. Resumen

2.5. Estudio 4. Mecanismos moleculares de resistencia amacrólidos y lincomicina de Mycoplasma agalactiae.

El empleo masivo de antimicrobianos para el control de enfermedades haprovocado un descenso notable en la susceptibilidad de distintas especies demicoplasmas que infectan a los animales, incluyendo M. agalactiae. Sin embargo,aún se desconocen los mecanismos moleculares responsables de la resistencia deeste patógeno a los macrólidos y la lincomicina. El objetivo del presente estudiofue investigar la relación entre los valores de concentración mínima inhibitoria(CMI) de dichos antimicrobianos y la presencia de mutaciones que alterasen elARN ribosomal 23S (23S ARNr) y/o las proteínas ribosomales L4 y L22 en 50cepas de campo de M. agalactiae y en mutantes resistentes del agente obtenidosin vitro. Los resultados de concentración mínima inhibitoria obtenidos revelaronuna tendencia creciente en la resistencia de las cepas de campo de M. agalactiaefrente a tilosina, en comparación con estudios anteriores. Además, las primerasalteraciones asociadas al descenso en la susceptibilidad (CMI tilosina ≥0.8 µg/ml)fueron cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína L22 (Ser89Leu yGln90Lys/His), mientras que las mutaciones afectando a los nucleótidos de lasposiciones 2058 y 2059 del 23S ARNr aparecieron para valores de CMI a partir de1.6 µg/ml. Estos resultados se obtuvieron tanto en las cepas de campo estudiadascomo en los mutantes seleccionados in vitro, por lo que se puede concluir que,a pesar de que en otras especies de micoplasmas la resistencia a macrólidosy lincosamidas de debe principalmente a mutaciones en el 23S ARNr, en M.agalactiae los cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína ribosomalL22 son responsables del descenso de susceptibilidad frente a estos compuestos.

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2. Resumen

2.6. Estudio 5. Mecanismos moleculares de resistencia amacrólidos y lincosamidas en Mycoplasma capricolumsubsp. capricolum.

Mycoplasma capricolum subsp. capricolum es uno de los agentes causales de laagalaxia contagiosa en el ganado caprino. La medida más eficaz para afrontar losbrotes clínicos de dicha enfermedad en los rebaños es el tratamiento con antibióticoscomo los macrólidos y las lincosamidas. Ambos antimicrobianos actúan inhibiendola síntesis proteica uniéndose específicamente a nucleótidos de los dominios II yV del ARN ribosómico 23S (23S ARNr). Además, las proteínas ribosomales L4 yL22, codificadas por los genes rplD y rplV, respectivamente, también forman partede este sitio de unión. El objetivo del presente estudio fue asociar la presencia demutaciones afectando a los componentes anteriormente descritos con el descensode la susceptibilidad de mutantes seleccionados in vitro y cepas de campo de M.capricolum subsp. capricolum. Se observó que la aparición de mutaciones en losgenes codificadores del 23S ARNr (A2058G, A2059G y A2062C) y de la proteínaribosomal L22 (provocando el cambio de aminoácido Ala89Asp) estaba asociadaal valores elevados de concentración mínima inhibitoria (CMI) tanto en cepas decampo como mutantes seleccionados in vitro, lo que demuestra su papel comomecanismos moleculares responsables de la resistencia a macrólidos y lincosamidas.Además, la presencia de dichas alteraciones a partir de valores de CMI de 0.8 µg/mlpermitió establecer un umbral de interpretación de resistencia antibiótica para M.capricolum subsp. capricolum.

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2. Resumen

2.7. Estudio 6. La tendencia a una menor susceptibilidad alas tetraciclinas de los agentes causantes de la agalaxiacontagiosa puede deberse a distintos mecanismosmoleculares.

La agalaxia contagiosa de los pequeños rumiantes está causada por cuatroespecies de micoplasma: Mycoplasma agalactiae, M. mycoides subsp. capri, M.capricolum subsp. capricolum y M. putrefaciens, cuya importancia depende dela región geográfica estudiada y del hospedador afectado. Las tetraciclinas sonun grupo de antibióticos cuyo bajo coste y amplio espectro justifican su ampliautilización a la hora de tratar las mamitis, uno de los síntomas principales de laagalaxia contagiosa, especialmente en rebaños de aptitud láctea. Los objetivosdel presente estudio fueron comparar la susceptibilidad a las tetraciclinas deaislamientos de campo de las distintas especies de micoplasma causantes de laagalaxia contagiosa obtenidas en distintos años y con distintas característicasepidemiológicas en Francia y España e investigar los mecanismos molecularesresponsables del descenso de susceptibilidad a dichos antimicrobianos. Para ello, sedeterminó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de 120 cepas y se compararonestadísticamente los resultados obtenidos. Además se estudiaron las secuencias delos genes codificantes del sitio de unión de las tetraciclinas (genes rrs), el ARNribosómico 16S. La pérdida de susceptibilidad a las tetraciclinas a partir del año2010 no es significativa, y los valores actuales de CMI de M. agalactiae son máselevados que los del resto de agentes implicados en la agalaxia contagiosa. Estosdescensos en la susceptibilidad no siempre se asociaron a mutaciones en los genescodificantes del 16S ARNr, lo que sugiere la existencia de otros mecanismos deresistencia aún por dilucidar.

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2. Resumen

2.8. Conclusiones

PRIMERA Mycoplasma agalactiae es excretado de forma intermitente en elsemen de moruecos asintomáticos naturalmente infectados.

SEGUNDA Hay moruecos portadores infectados por Mycoplasma agalactiaepresentes en todos los centros de inseminación artificial estudiados.

TERCERA Las muestras más efectivas para detectar moruecos asintomáticosinfectados por Mycoplasma agalactiae son el semen y los hisopos nasales. Por elcontrario, el análisis de las muestras de conducto auditivo externo y del suero noes adecuado para detectar a dichos portadores.

CUARTA En las cepas de campo actuales de Mycoplasma agalactiae se observauna tendencia creciente en la resistencia frente a la tilosina. Los mecanismosmoleculares responsables de dicha resistencia son los cambios en la secuencia deaminoácidos de la proteína ribosomal L22 y mutaciones puntuales en el ARNribosomal 23S.

QUINTA Las mutaciones en el 23S ARNr y la proteína ribosomal L22 de M.capricolum subsp. capricolum son los mecanismos moleculares responsables de laresistencia a macrólidos y lincosamidas en esta especie de micoplasma.

SEXTA No existen diferencias significativas en la susceptibilidad a tetraciclinasen los agentes causantes de agalaxia contagiosa actuales, independientemente delorigen de los aislamientos, si bien las cepas de M. agalactiae son en generalmenos susceptibles a esta clase de antibióticos que M. mycoides subsp. capri, M.capricolum subsp. capricolum y M. putrefaciens.

SÉPTIMA No existe una relación clara entre las mutaciones en los genescodificantes del 16S ARNr y el descenso de la susceptibilidad a tetraciclinas enlos micoplasmas causantes de agalaxia contagiosa, lo que sugiere la existencia deotros mecanismos de resistencia.

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3. Summary

3. Summary

3. Summary

The present doctoral thesis is formed by different scientific articles whichaddress the epidemiological role of rams in contagious agalactia and the molecularmechanisms behind the resistance of the etiological agents of this disease tomacrolides, lincosamides and tetrayclines. These subjects allow improving thepreventive and control measures of contagious agalactia.

In the last years there have been significant advances in the understandingof the epidemiological role of goat bucks in contagious agalactia, including theexcretion routes of its causative agents and the spread of this infection betweenthe individuals kept in different breeding centres. These findings demonstrate theimportance of asymptomatic goat bucks as permanent reservoirs and sources ofcontagious agalactia causative mycoplasmas. Moreover, they have allowed theimplementation of preventive protocols to control the admission and presenceof unapparent infected individuals in artificial insemination centres located incontagious agalactia endemic areas. However, the information available aboutthe different excretion routes of Mycoplasma agalactiae, the primary mycoplasmaspecies responsible for ovine contagious agalactia, in rams is scarce, and consistmainly of experimental results obtained after the experimental inoculation ofthis pathogen. Therefore, the presence of this mycoplasma species in semen ofnaturally infected rams and the most efficient samples to detect infected carrierswere investigated (Studies 1 and 2, respectively). Owing to the importance ofother emergent or re-emergent mycoplasmosis of small ruminants responsiblefor respiratory and/or ocular symptoms which are also associated to contagiousagalactia, ovine atypical pneumonia caused by M. ovipneumoniae, a mycoplasmaspecies which has also been retrieved from asymptomatic rams, contagious caprinepleuropneumonia caused by M. capricolum subsp. capripneumoniae, a speciesphylogenetically close to M. mycoides subsp. capri and M. capricolum subsp.capricolum, and infectious keratoconjunctivitis provoked by M. conjunctivae werereviewed in Study 3.

On the other hand, due to the lack of scientific evidence concerning theefficacy of the currently available vaccines, antibiotherapy is the main strategyapplied to control contagious agalactia. This measure has shown to be efficient totreat clinical outbreaks but has limited effects on carriers in chronically infectedherds, as it is unable to eliminate infection. Notwithstanding, the extensive use ofantimicrobials has caused a remarkable decrease in the susceptibility of differentanimal mycoplasma species, which may lead to treatment failures. In this sense,acquired resistance to several antimicrobial families has been demonstrated inM. bovis, a cattle pathogen phylogenetically closely related to M. agalactiae.Moreover, an overall loss in susceptibility over time has been reported for this

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3. Summary

species in France, which is also an enzootic area of contagious agalactia. Inthis context, considering that an accurate and detailed understanding of theantimicrobial resistance mechanisms allows the selection of effective therapeuticstrategies, and that these mechanisms have yet to be elucidated in contagiousagalactia causative mycoplasmas, the molecular mechanisms behind macrolide,lincosamide and tetracycline resistance were addressed analysing field isolates andin vitro selected mutants so as to demonstrate the selective effect of subinhinibitoryantimicrobial concentrations on initially susceptible strains (Studies 4, 5 and 6).

The detection of chronically infected asymptomatic rams, their ability to spreadinfection and the need to elucidate the molecular mechanisms responsible forantimicrobial resistance against macrolides, lincosamides and tetracyclines, whichare among the antibiotics most applied in the field to treat contagious agalactia,motivated the specific objectives of the present doctoral thesis, which are presentedhereafter.

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3. Summary

3.1. Objectives

FIRST To study the presence of Mycoplasma agalactiae in semen of naturallyinfected asymptomatic rams and to determine its excretion dynamics.

SECOND To detect the presence of rams infected with Mycoplasma agalactiaein different herds housed in artificial insemination centres and to determine themost efficient sample to detect such carriers.

THIRD To review recently published literature about emergent mycoplasmaldiseases affecting small ruminants and responsible for symptoms which arealso associated to contagious agalactia, including those caused by Mycoplasmacapricolum subsp. capripneumoniae, M. ovipneumoniae and M. conjunctivae.

FOURTH To assess the antimicrobial susceptibility and the role of mutationsaltering 23S ribosomal ARN and ribosomal proteins L4 and L22 in the acquisitionof macrolide and lincomcyn resistance of field isolates and in vitro selected mutantsof Mycoplasma agalactiae.

FIFTH To investigate the effect of mutations in the genes encoding 23Sribosomal RNA and ribosomal proteins L4 and L22 on the loss of susceptibilityof field isolates and in vitro selected mutants of Mycoplasma capricolum subsp.capricolum to macrolides and lincosamides.

SIXTH To determine and to compare the tetracycline susceptibility of fieldisolates with different epidemiological characteristics belonging to the fourcontagious agalactia causative mycoplasma species collected in France and Spain.

SEVENTH To investigate the molecular mechanisms behind the decreasedsusceptibility to tetracyclines of contagious agalactia causative mycoplasmas.

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3. Summary

3.2. Study 1. Presence of Mycoplasma agalactiae in semenof naturally infected asymptomatic rams.

The purpose of the present study was to assess the presence of M. agalactiae,the main causative agent of ovine contagious agalactia, in semen of naturallyinfected rams. Therefore, semen samples from 167 rams residing in three differentartificial insemination centres of a contagious agalactia endemic area were studiedby microbiological and molecular techniques. In addition, serial ejaculates from thesame rams were evaluated to determine the excretion dynamics of this pathogen.Of the 384 samples studied, M. agalactiae was detected in 56 (14.58%) whichbelonged to 44 different rams (26.35%). These findings confirm the ability of M.agalactiae to be excreted in semen of asymptomatic rams. Furthermore, theseresults also evidence the presence of these asymptomatic carriers of M. agalactiaeat ovine artificial insemination centres, representing a serious health risk regardingthe spread and maintenance of contagious agalactia, especially in endemic areas.Moreover, the excretion of M. agalactiae in semen also points to the risk ofvenereal transmission of this disease. The current results highlight the need toimplement control measures to prevent the admission of infected rams into artificialinsemination centres and the necessity to continuously monitor semen samples toeffectively detect infected individuals.

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3. Summary

3.3. Study 2. Detecting asymptomatic rams infected withMycopasma agalactiae in ovine artificial inseminationcentres.

In endemic areas, the most common clinical situation of contagious agalactiaconsists of chronically infected herds, and asymptomatic infected individualsrepresent an epidemiological risk regarding the transmission of this disease. Theaim of this work was to detect the presence of asymptomatic rams infected with M.agalactiae in different artificial insemination centres, and to determine the mosteffective way to identify these individuals so as to implement adequate surveillanceprotocols. For this purpose, 215 rams and 14 teaser sheep were sampled takingauricular, nasal, and vaginal swabs and serum samples. In addition, ejaculatesfrom 147 rams were analyzed. These samples were subjected to specific cultureand molecular techniques to isolate and identify mycoplasmas, and to a serologicaltest to detect antibodies against M. agalactiae. M. agalactiae was detected in 47(4.4%) of the 1077 samples analyzed, and also one individual resulted seropositive.Thus, 37 (17.2%) of the 215 studied rams were infected with this pathogen. Thespecimens which proportionally yielded the greatest number of positive resultswere semen samples (13.6%), followed by nasal swabs (5.8%). In contrast, thesampling of the external auricular canal and the serological analyses resultedinsufficient to effectively detect infected individuals. Asymptomatic rams infectedwith M. agalactiae were detected in all the analyzed artificial insemination centres,highlighting the need to implement adequate surveillance protocols to preventthe presence of these individuals in these centres, and thus reducing the risk oftransmitting contagious agalactia.

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3. Summary

3.4. Study 3. Contagious caprine pleuropneumonia andother emergent mycoplasmal diseases affecting smallruminants in arid lands.

This report reviews the most important features of contagious caprinepleuropneumonia and examines in detail the most novel aspects of its epidemiology,diagnosis and control. The repercussions of two other emergent or re-emergentmycoplasmal diseases affecting small ruminants of arid zones are also addressed:atypical pneumonia caused by Mycoplasma ovipneumoniae and infectiouskeratoconjunctivitis, whose main responsible agent is Mycoplasma conjunctivae.

One of the most economically impacting diseases affecting small domesticruminants in arid lands of Africa and Asia is contagious caprine pleuropneumonia,whose causative agent is Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae. Theexclusively respiratory clinical-lesional picture caused by this pathogen includespleuropneumonia with unilateral hepatization, adhesions, pleuritis and pleuralfluid accumulation. Its improved diagnosis has confirmed the spread of the diseaseacross different countries such as Kenya, Ethiopia, Tanzania or Pakistan, alsodiagnosing infection in other ruminant species of these arid zones such as gazellesor mouflons. On the other hand, Mycoplasma ovipneumoniae, which participateswith other microorganisms in the domestic small ruminant respiratory syndrome,has been isolated in herds reared in semi-arid European countries such as Portugalor Spain, and Mycoplasma conjunctivae, which mostly affects wild ruminants, hasbeen recently associated to clinical outbreaks of infectious keratoconjunctivitis inSaudi Arabia, Iran, Australia, India or European zones including the Pyrenees orthe Alps, where it is considered endemic.

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3. Summary

3.5. Study 4. Molecular resistance mechanisms ofMycoplasma agalactiae to macrolides and lincomycin.

The extensive use of antimicrobials for disease control has caused aremarkable decrease in antimicrobial susceptibility of different animal mycoplasmaspecies, including Mycoplasma agalactiae, the main causative agent of contagiousagalactia. However, the molecular mechanisms behind resistance to macrolidesand lincomycin have not yet been elucidated in this mycoplasma species. Theaim of the present study was to investigate the association between minimuminhibitory concentration (MIC) values of different antimicrobials and mutationsin the 23S rRNA encoding genes and ribosomal proteins L4 and L22, analysingboth field isolates (n= 50) and in vitro selected resistant mutants of M.agalactiae. The obtained MIC results of the studied field isolates demonstratean increasing development of tylosin resistance in this bacterium, in comparisonto previous studies. Interestingly, predicted amino acid changes in L22 (Ser89Leuand Gln90Lys/His) were the first variations observed when MICs of M. agalactiaestarted to increase (tylosin MIC ≥0.8 µg/ml), whereas mutations at positions 2058or 2059 of domain V of 23S rRNA appeared from MIC values of 1.6 µg/ml. Theseresults were consistent in both field isolates and in vitro selected mutants of M.agalactiae. Thus, although in other mycoplasma species resistance to macrolidesand lincosamides had been mainly related to mutations in the 23S rRNA encodinggenes, this work demonstrates the role of alterations in ribosomal protein L22 indecreased susceptibility of M. agalactiae.

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3. Summary

3.6. Study 5. 23S rRNA and L22 ribosomal proteinare involved in the acquisition of macrolide andlincosamide resistance in Mycoplasma capricolumsubsp. capricolum.

Mycoplasma capricolum subsp. capricolum is one of the causative agents ofcaprine contagious agalactia, and antimicrobial therapy is the most commonlyapplied measure to treat outbreaks of this disease. Macrolides and lincosamidesbind specifically to nucleotides at domains II and V of the 23S rRNA. Furthermore,rplD and rplV genes encode ribosomal proteins L4 and L22, which are alsoimplicated in the macrolide binding site. The aim of this work was to study therelationship between mutations in these genes and the acquisition of macrolideand lincosamide resistance in M. capricolum subsp. capricolum. For this purpose,in vitro selected resistant mutants and field isolates were studied. This studydemonstrates the appearance of DNA point mutations at the 23S rRNA encodinggenes (A2058G, A2059G and A2062C) and rplV gene (Ala89Asp) in associationto high minimum inhibitory concentration (MIC) values. Hence, it provesthe importance of alterations in 23S rRNA domain V and ribosomal proteinL22 as molecular mechanisms responsible for the acquisition of macrolide andlincosamide resistance in both field isolates and in vitro selected mutants of M.capricolum subsp. capricolum. Moreover, these mutations enable us to provide aninterpretative breakpoint of antimicrobial resistance for this mycoplasma speciesat MIC 0.8 µg/ml.

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3. Summary

3.7. Study 6. The moderate drift towards lesstetracycline-susceptible isolates of contagiousagalactia causative agents might result from differentmolecular mechanisms.

The etiological agents of contagious agalactia are four mycoplasma(sub)species, Mycoplasma agalactiae, M. mycoides subsp. capri, M. capricolumsubsp. capricolum and M. putrefaciens, of which the relative importance dependson the geographical region and the animal host. Tetracyclines are non-expensive,broad-spectrum antimicrobials which are often used to control mastitis, one ofthe main symptoms of contagious agalactia, in dairy herds. However, the invitro efficiency of tetracyclines against each of the etiological agents of thisdisease has been poorly assessed. The aims of this study were to comparethe tetracycline susceptibilities of various field isolates, belonging to differentmycoplasma (sub)species and subtypes, collected over the years from differentclinical contexts in France and Spain, and to investigate the molecular mechanismsbehind the decreased susceptibility of some isolates to tetracyclines. The minimuminhibitory concentrations (MICs) of tetracyclines were determined in vitro ona set of 120 isolates. Statistical analyses were run to define the significanceof any observed differences in MICs distribution. As mutations in the genesencoding tetracycline targets, i.e. 16S ribosomal RNA, (rrs loci) are most oftenassociated with increased tetracycline MICs in animal mycoplasmas, these geneswere sequenced. The loss of susceptibility to tetracyclines after year 2010 isnot significant and recent MICs are higher in M. agalactiae, especially isolatesfrom mastitis cases, than in other etiological agents of contagious agalactia. Theobserved increases in MICs were not always associated with mutations in the genesencoding 16S rRNA, which suggests the existence of other resistance mechanismsyet to be deciphered.

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3. Summary

3.8. Conclusions

FIRST Mycoplasma agalactiae is excreted intermittently in semen ofasymptomatic naturally infected rams.

SECOND There are asymptomatic rams infected with Mycoplasma agalactiaein all the studied artificial insemination centers.

THIRD The most effective samples to detect rams infected with Mycoplasmaagalactiae are semen and nasal swabs. In contrast, the analysis of the externalauricular canal and serum samples is not sufficient to detect such carriers.

FOURTH An increasing development of resistance to tylosin can be observedin current field isolates of Mycoplasma agalactiae. The molecular mechanismsinvolved are amino acid changes in ribosomal protein L22 and hotspot mutationsin the genes encoding 23S ribosomal RNA.

FIFTH Mutations altering 23S rRNA and ribosomal protein L22 are involved inthe acquisition of macrolide and lincosamide resistance in Mycoplasma capricolumsubsp. capricolum.

SIXTH No significant loss of susceptibility to tetracyclines was detected inrecent years in mycoplasmas responsible for contagious agalactia whatever theorigin of the isolates, while Mycoplasma agalactiae is less susceptible than M.mycoides subsp. capri, M. capricolum subsp. capricolum and M. putrefaciens.

SEVENTH There is no simple relationship between mutations in 16S rRNAencoding genes and decreased susceptibility to tetracyclines in the studiedcontagious agalactia causative mycoplasmas, which suggests the existence of otherresistance mechanisms.

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4. Artículos publicados

4. Artículos publicados

4. Artículos publicados

4.1. Presence of Mycoplasma agalactiae in semen ofnaturally infected asymptomatic rams

Revista: Theriogenology

Abstract: The purpose of the present study was to assess the presence ofMycoplasma agalactiae (Ma), the main causative agent of ovine contagiousagalactia (CA), in semen of naturally infected rams. Therefore, semensamples from 167 rams residing in three different artificial insemination(AI) centers of a CA–endemic area were studied by microbiological andmolecular techniques. In addition, serial ejaculates from the same rams wereevaluated to determine the excretion dynamics of Ma. Of the 384 samplesstudied, Ma was detected in 56 (14.58%) which belonged to 44 different rams(26.35%). These findings confirm the ability of Ma to be excreted in semenof asymptomatic rams. Furthermore, these results also evidence the presenceof these asymptomatic carriers of Ma in ovine AI centers, representing aserious health risk regarding the spread and maintenance of CA, especiallyin endemic areas. Moreover, the excretion of Ma in semen also points to therisk of venereal transmission of this disease. The current results highlightthe need to implement control measures to prevent the admission of infectedrams in AI centers and the necessity to continuously monitor semen samplesto effectively detect infected individuals.

URL: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.02.033

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4. Artículos publicados

4.2. Detecting asymptomatic rams infected withMycoplasma agalactiae in ovine artificialinsemination centers

Revista: Theriogenology

Abstract: Mycoplasma agalactiae (Ma) is the main causative agent of ovinecontagious agalactia, which is a serious disease of small ruminants. Inendemic areas, its most common clinical situation consists of chronicallyinfected herds, and asymptomatic infected individuals represent anepidemiological risk regarding the transmission of this disease. The aimof this work was to detect the presence of asymptomatic rams infectedwith Ma in different artificial insemination centers, and to determine themost effective way to identify these individuals so as to implement adequatesurveillance protocols. For this purpose, 215 rams and 14 teaser sheep weresampled taking auricular, nasal, and vaginal swabs and serum samples.In addition, ejaculates from 147 rams were analyzed. These samples weresubjected to specific culture and molecular techniques to isolate and identifymycoplasmas, and to a serological test to detect antibodies against Ma.Mycoplasma agalactiae was detected in 47 (4.4%) of the 1077 samplesanalyzed, and also one individual resulted seropositive. Thus, 37 (17.2%)of the 215 studied rams were infected with Ma. The specimens whichproportionally yielded the greatest number of positive results for thispathogen were semen samples (13.6%), followed by nasal swabs (5.8%). Incontrast, the sampling of the external auricular canal and the serologicalanalyses resulted insufficient to effectively detect infected individuals.Asymptomatic rams infected with Ma were detected in all the analyzedartificial insemination centers, highlighting the need to implement adequatesurveillance protocols to prevent the presence of these individuals in thesecenters, reducing the risk of transmitting contagious agalactia.

URL: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.09.014

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4. Artículos publicados

4.3. Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) andother emergent mycoplasmal diseases affecting smallruminants in arid lands

Revista: Journal of Arid Environments

Abstract: One of the most economically impacting diseases that affectssmall domestic ruminants in arid lands of Africa and Asia is contagiouscaprine pleuropneumonia (CCPP), whose causative agent is Mycoplasmacapricolum subspecies (subsp.) capripneumoniae (Mccp). The exclusivelyrespiratory clinical-lesional picture caused by Mccp includes the presenceof pleuropneumonia with unilateral hepatization, adhesions, pleuritis andpleural fluid accumulation. Its improved diagnosis has confirmed the spreadof the disease across these continents (e.g. Kenya, Ethiopia, Tanzania orPakistan), also confirming its presence on other typical species of these aridzones (e.g. gazelles or mouflons). This report reviews the most importantfeatures of CCPP and examines in detail the most novel aspects of itsepidemiology, diagnosis and control. In brief, the repercussions of twoother mycoplasmal emergent diseases also affecting small ruminants ofarid zones are also addressed: atypical pneumonia caused by Mycoplasmaovipneumoniae, which participates with other microorganisms in thedomestic small ruminant respiratory syndrome occurred in semi-arid areas ofEurope (e.g. Portugal or Spain), and infectious keratoconjunctivitis, whosemain responsible agent is Mycoplasma conjunctivae. This last disease mostlyaffects wild ruminants worldwide with recent reports of clinical outbreaks incountries as Saudi Arabia, Iran, Australia, India or European zones as thePyrenees or the Alps, where it is considered endemic.

URL: https://doi.org/10.1016/j.jaridenv.2015.03.006

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4. Artículos publicados

4.4. Molecular resistance mechanisms of Mycoplasmaagalactiae to macrolides and lincomycin

Revista: Veterinary Microbiology

Abstract: The extensive use of antimicrobials for disease control has causeda remarkable decrease in antimicrobial susceptibility of different animalmycoplasma species, including Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae), themain causative agent of contagious agalactia. However, the molecularmechanisms behind M. agalactiae resistance to macrolides and lincomycinhave not yet been elucidated. The aim of the present study was to investigatethe association between minimum inhibitory concentration (MIC) values ofdifferent antimicrobials and mutations in the 23S rRNA gene and ribosomalproteins L4 and L22, analysing both field isolates (n= 50) and in vitroselected resistant mutants of M. agalactiae. The obtained MIC results ofthe studied field isolates demonstrate an increasing development of tylosinresistance in this bacterium, in comparison to previous studies. Interestingly,predicted amino acid changes in L22 (Ser89Leu and Gln90Lys/His) were thefirst variations observed when MICs of M. agalactiae started to increase(tylosin MIC ≥0.8 µg/ml), whereas mutations at positions 2058 or 2059of domain V of the 23S rRNA gene appeared from MIC values of 1.6µg/ml. These results were consistent in both field isolates and in vitroselected mutants of M. agalactiae. Thus, although in other mycoplasmaspecies resistance to macrolides and lincosamides had been mainly relatedto mutations in the 23S rRNA gene, this work demonstrates the roleof alterations in ribosomal protein L22 in decreased susceptibility of M.agalactiae. Moreover, these mutations can be used as molecular markers toset an interpretative breakpoint of antimicrobial resistance for M. agalactiae.

URL: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.10.012

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4. Artículos publicados

4.5. 23S rRNA and L22 ribosomal protein are involvedin the acquisition of macrolide and lincosamideresistance in Mycoplasma capricolum subsp.capricolum

Revista: Veterinary Microbiology

Abstract: Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (Mcc) is one of thecausative agents of contagious agalactia, and antimicrobial therapy isthe most commonly applied measure to treat outbreaks of this disease.Macrolides and lincosamides bind specifically to nucleotides at domains IIand V of the 23S rRNA. Furthermore, rplD and rplV genes encode ribosomalproteins L4 and L22, which are also implicated in the macrolide bindingsite. The aim of this work was to study the relationship between mutationsin these genes and the acquisition of macrolide and lincosamide resistancein Mcc. For this purpose, in vitro selected resistant mutants and fieldisolates were studied. This study demonstrates the appearance of DNA pointmutations at the 23S rRNA encoding genes (A2058G, A2059G and A2062C)and rplV gene (Ala89Asp) in association to high minimum inhibitoryconcentration values. Hence, it proves the importance of alterations in23S rRNA domain V and ribosomal protein L22 as molecular mechanismsresponsible for the acquisition of macrolide and lincosamide resistance inboth field isolates and in vitro selected mutants. Moreover, these mutationsenable us to provide an interpretative breakpoint of antimicrobial resistancefor Mcc at MIC 0.8 µg/ml.

URL: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.02.014

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4. Artículos publicados

4.6. The moderate drift towards less tetracyclinesusceptible isolates of contagious agalactia causativeagents might result from different molecularmechanisms

Revista: Veterinary Microbiology

Abstract: Contagious agalactia is a mycoplasmosis that affects smallruminants, is associated with loss of milk production and high morbidityrates, and is highly deleterious to dairy industries. The etiological agentsare four mycoplasma (sub)species, of which the relative importance dependson the countries and the animal host. Tetracyclines are non-expensive,broad-spectrum antimicrobials and are often used to control mastitis indairy herds. However, the in vitro efficiency of tetracyclines against eachof the etiological agents of contagious agalactia has been poorly assessed.The aims of this study were i) to compare the tetracycline susceptibilitiesof various field isolates, belonging to different mycoplasma (sub)species andsubtypes, collected over the years from different clinical contexts in France orSpain, and ii) to investigate the molecular mechanisms behind the decreasedsusceptibility of some isolates to tetracyclines. The Minimum InhibitoryConcentrations (MICs) of tetracyclines were determined in vitro on a setof 120 isolates. Statistical analyses were run to define the significance of anyobserved differences in MICs distribution. As mutations in the genes encodingthe tetracycline targets (rrs loci) are most often associated with increasedtetracycline MICs in animal mycoplasmas, these genes were sequenced. Theloss of susceptibility to tetracyclines after year 2010 is not significant andrecent MICs are higher in M. agalactiae, especially isolates from mastitiscases, than in other etiological agents of contagious agalactia. The observedincreases in MICs were not always associated with mutations in the rrsalleles which suggests the existence of other resistance mechanisms yet tobe deciphered.

URL: https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.05.001

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4. Artículos publicados

4.7. Aportaciones del doctorando en las publicacionesincluidas en la presente tesis doctoral

Dña. Miranda Prats van der Ham, doctoranda del Grupo de Investigación deSanidad de Rumiantes del Departamento de Sanidad Animal de la Universidad deMurcia, expone que su labor en los siguientes artículos científicos ha sido:

Prats-van der Ham, M; de la Fe, C; Amores, J; Paterna, A; Tatay-Dualde, J;Gómez-Martín, Á. 2015. Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) andother emergent mycoplasmal diseases affecting small ruminants in arid lands.Journal of Arid Environments 119, 9-15.

• Revisión bibliográfica y redacción del artículo.

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; de la Fe, C; Paterna, A; Sánchez, A;Corrales, JC; Contreras, A; Gómez-Martín, Á. 2016. Presence of Mycoplasmaagalactiae in semen of naturally infected asymptomatic rams. Theriogenology86, 791-794.

• Diseño del estudio, ejecución de los análisis laboratoriales, análisis delos resultados y redacción del artículo.

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; de la Fe, C; Paterna, A; Sánchez, A;Corrales, JC; Contreras, A; Gómez-Martín, Á. 2017. Detecting asymptomaticrams infected with Mycoplasma agalactiae in ovine artificial inseminationcenters. Theriogenology 89, 324-328.

• Diseño del estudio, toma de las muestras, ejecución de los análisislaboratoriales, análisis de los resultados y redacción del artículo.

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; de la Fe, C; Paterna, A; Sánchez,A; Corrales, JC; Contreras, A; Gómez-Martín, Á. 2017. Molecular resistancemechanisms of Mycoplasma agalactiae to macrolides and lincomycin.Veterinary Microbiology 211, 135-140.

• Diseño del estudio, ejecución de los análisis laboratoriales, análisis delos resultados y redacción del artículo.

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4. Artículos publicados

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Gómez-Martín, Á; Corrales,JC; Contreras, A; Sánchez, A; de la Fe, C. 2018. 23S rRNA andL22 ribosomal protein are involved in the acquisition of macrolideand lincosamide resistance in Mycoplasma capricolum subsp. capricolum.Veterinary Microbiology 216, 207-211.

• Toma de muestras, ejecución de los análisis laboratoriales, análisis delos resultados y redacción del artículo.

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Ambroset, C; de la Fe, C; Tardy,F. 2018. The moderate drift towards less tetracycline-susceptible isolates ofcontagious agalactia causative agents might result from different molecularmechanisms. Veterinary Microbiology 220, 39-46.

• Toma de muestras, ejecución de los análisis laboratoriales, análisis delos resultados y redacción del artículo.

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5. Apéndices

5. Apéndices

5. Apéndices

5.1. Estancias de investigación en el extranjero

Estancia 1:

Centro de investigación y departamento de destino: Anses-Laboratoire deLyon (Francia), Unité des Mycoplasmoses des Ruminants.

Fechas de estancia: 29/09/2016 – 31/03/2017 (6 meses).

Investigador responsable: Florence Tardy.

Objetivos científicos:

• Estudiar la susceptibilidad a las tetraciclinas de aislamientos de lascuatro especies de micoplasmas causantes de la agalaxia contagiosa condistintas características epidemiológicas.

• Investigar los mecanismos moleculares responsables del descenso dela susceptibilidad a dichos antimicrobianos mediante el estudio dela secuencia de los genes codificantes de su sitio de unión al ARNribosomal.

Estancia 2:

Centro de investigación y departamento de destino: Anses-Laboratoire deLyon (Francia), Unité des Mycoplasmoses des Ruminants.

Fechas de estancia: 01/10/2017 – 31/03/2018 (6 meses).

Investigador responsable: Florence Tardy.

Objetivos científicos:

• Evaluar la actividad de las bombas de transporte activo en aislamientosde campo de las cuatro especies de micoplasma causantes de la agalaxiacontagiosa.

• Asociar dicha actividad con cambios en la susceptibilidad a laoxitetraciclina para demostrar el papel de este mecanismo en laresistencia antibiótica de los micoplasmas.

• Estudiar la capacidad formadora de biofilms y su impacto sobre lasusceptibilidad a tetraciclinas de los aislamientos seleccionados.

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5. Apéndices

5.2. Comunicaciones a congresos derivadas de la presentetesis doctoral

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Ambroset, C; de la Fe, C;Tardy, F. 2018. Estudio de la susceptibilidad de los micoplasmas causantesde la agalaxia contagiosa a las tetraciclinas. XLIII Congreso Nacional yXIX Congreso Internacional de la Sociedad Española de Ovinotecnia yCaprinotecnia, 09/2018. Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia,Zaragoza (España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; De la Fe, C; Paterna, A;Sanchez, A; Corrales, JC; Contreras, A; Buendia, A; Gómez-Martín, A. 2017.Diseminación sistémica de Mycoplasma agalactiae en moruecos asintomáticosnaturalmente infectados. XLII Congreso Nacional y XVIII CongresoInternacional de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia,09/2017. Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, Salamanca(España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; De la Fe, C; Paterna, A;Sanchez, A; Corrales, JC; Contreras, A; Gómez-Martín, A. 2017. Presenciade moruecos asintomáticos infectados por Mycoplasma agalactiae en centrosde inseminación. XLII Congreso Nacional y XVIII Congreso Internacionalde la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, 09/2017. SociedadEspañola de Ovinotecnia y Caprinotecnia, Salamanca (España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Gómez-Martín, A; Paterna,A; Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; de la Fe, C. 2017. Molecularcharacterization of Mycoplasma agalactiae field isolates with acquiredresistance to tylosin. 7th Congress of European Microbiologists (FEMS),07/2017. Federations of European Microbiological Societies, Valencia(España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; de la Fe, C; Paterna,A; Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; Gómez-Martín, A. 2017.Multilocus sequence typing of Mycoplasma agalactiae to study its geneticvariability in a contagious agalactia endemic area. 7th Congress of EuropeanMicrobiologists), 07/2017. Federations of European Microbiological Societies,Valencia (España).

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5. Apéndices

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Andrade, JD; Gómez-Martín,Á; Paterna, A; Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; De la Fe, C. 2016.Situación epidemiológica y control de la agalaxia contagiosa en rebaños decabra malagueña (CABRAMA). XLI Congreso Nacional y XVII CongresoInternacional de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia,09/2016. Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, Talavera dela Reina (España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Gómez-Martín, Á; Paterna,A; Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; De la Fe, C. 2016. Detecciónde Mycoplasma agalactiae en el conducto auditivo externo de moruecosasintomáticos. XLI Congreso Nacional y XVII Congreso Internacional dela Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, 09/2016. SociedadEspañola de Ovinotecnia y Caprinotecnia, Talavera de la Reina (España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Gómez-Martín, Á; Paterna,A; Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; De la Fe, C. 2016. Límitede detección de Mycoplasma agalactiae en muestras de semen ovino. XLICongreso Nacional y XVII Congreso Internacional de la Sociedad Españolade Ovinotecnia y Caprinotecnia, 09/2016. Sociedad Española de Ovinotecniay Caprinotecnia, Talavera de la Reina (España).

Prats-van der Ham, M; Tatay-Dualde, J; Gómez-Martín, Á; Paterna, A;Corrales, JC; Sánchez, A; Contreras, A; De la Fe, C. 2016. Presencia deMycoplasma agalactiae en semen de moruecos asintomáticos naturalmenteinfectados. XLI Congreso Nacional y XVII Congreso Internacional de laSociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia, 09/2016. SociedadEspañola de Ovinotecnia y Caprinotecnia, Talavera de la Reina (España).

Prats vd Ham, M; Gómez-Martín, Á; Paterna, A; Serrano, M; Amores,J; Corrales, JC; Tatay-Dualde, J; Sánchez, A; Contreras, A; De la Fe, C.Ausencia de portadores de Mycoplasma agalactiae y M. ovipneumoniae ensementales ovinos de la raza segureña. XXXVIII Jornadas Científicas yXIV Jornadas Internacionales de la Sociedad Española de Ovinotecnia yCaprinotecnia, 09/2013. Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia,Málaga (España).

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5. Apéndices

5.3. Publicaciones en revistas nacionales

Prats van der Ham, M; Gómez Martín, Á; Paterna, A; Serrano, M;Amores, J; Corrales, JC; Tatay Dualde, J; Sánchez, A; Contreras, A; Dela Fe, C. 2014. Diferencias en la epidemiología de la agalaxia contagiosaovina y caprina. Tierras ganadería 191, 97-101.

Prats-van der Ham, M; Gómez-Martín, Á; Tatay-Dualde, J; Paterna,A; Amores, J; Corrales, JC; Contreras, A; Sánchez, A; De la Fe, C. 2013.Particularidades etiológicas y epidemiológicas de la agalaxia contagiosaovina: similitudes y diferencias con el caprino. Anales de Veterinaria deMurcia 29, 39-48.

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5. Apéndices

5.4. Conferencias

Prats van der Ham, M. 2016. Situación epidemiológica de la agalaxiacontagiosa en las explotaciones de cabra malagueña. Jornadas TécnicasCaprinas de la Asociación Española de Criadores de la Cabra Malagueña,Casabermeja (España).

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6. Abreviaciones

6. Abreviaciones

6. AbreviacionesADN / DNA: ácido desoxirribonucleico / desoxiribonucleic acid

ARN / RNA: ácido ribonucleico / ribonucleic acid

ARNr / rRNA: ácido ribonucleico ribosomal / ribosomal ribonucleic acid

CCPP: pleuroneumonía contagiosa caprina / contagious caprinepleuropneumonia

CMI / MIC: concentración mínima inhibitoria / minimum inhibitoryconcentration

M.:Mycoplasma

Ma: Mycoplasma agalactiae

Mcc: Mycoplasma capricolum subsp. capricolum

Mccp: Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae

Mconj: Mycoplasma conjunctivae

Mmc: Mycoplasma mycoides subsp. capri

Movp: Mycoplasma ovipneumoniae

Mput: Mycoplasma putrefaciens

PCR: reacción en cadena de la polimerasa / polymerase chain reaction

subsp.: subespecie / subspecies

VNTR: número variable de repeticiones en tándem / variable number tandemrepeats

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7. Agradecimientos

7. Agradecimientos

7. AgradecimientosLos trabajos que conforman la presente tesis doctoral han sido financiados por

los proyectos AGL2013-44771-R y AGL2016-76568-R del Ministerio de Economíay Competitividad, cofinanciados con fondos FEDER.

Miranda Prats van der Ham es beneficiaria de un contrato predoctoralconcedido por la Universidad de Murcia (FPU UMU 2015), que incluye las ayudasrecibidas para realizar estancias en el extranjero.

Al grupo de investigación de Sanidad de Rumiantes de la Facultad deVeterinaria de la Universidad de Murcia, por hacer posible este proyecto y porconfiar en mí dándome la oportunidad de iniciarme en la investigación y en elconocimiento del sector de los pequeños rumiantes. A Christian de la Fe, JuanCarlos Corrales, Antonio Contreras y Antonio Sánchez, por su inestimable apoyo,sus aportaciones e ideas, sus enseñanzas y por hacer funcionar el trabajo en grupo.

A las instituciones y, más concretamente, a las personas sin cuya implicacióny colaboración no hubiera sido posible realizar los trabajos incluidos en lapresente tesis doctoral: a la Asociación Nacional de Criadores de Ovino Segureño(ANCOS), al Centro Regional de Selección y Reproducción Animal de Valdepeñas(CERSYRA), al Centro de selección y mejora genética de Ovino y Caprino deCastilla y León (OVIGEN), a la Asociación Española de Criadores de la CabraMalagueña (CABRAMA) y al resto de asociaciones y colaboradores que con suayuda han formado parte de este proyecto.

A la Unidad Docente de Enfermedades Infecciosas y al grupo de comidas en elseminario, por vuestra compañía y apoyo, y por formar parte de esta etapa.

A los compañeros y amigos del ANSES de Lyon (Francia), en especial alos miembros de la Unité des Mycoplasmoses des Ruminants y a su directora,Florence Tardy, por acogerme en su grupo durante mi estancia en el extranjero,por sus enseñanzas, su guía, su profesionalidad y su compañerismo. Por hacer estaexperiencia tan enriquecedora, tanto a nivel científico como a nivel personal. Mercibeaucoup à tous, pour votre aide et amitié. C’était un vrai plaisir de partager avecvous des bons moments au labo, au bureau des doctorants et aussi aux after-works!

A mis compañeros de laboratorio, Juan Tatay, Joaquín Amores, Ana Paterna yÁngel Gómez, por enseñarme lo que es la investigación, por animarme y ayudarmecuando lo he necesitado, por la motivación y por ser mi ejemplo a seguir enesta etapa. También a mi nueva compañera, Ana García-Galán, y a los técnicosSilvia Porras y José Martínez, por vuestro apoyo y colaboración. Muchas graciaspor vuestra amistad y por los buenos momentos vividos fuera del trabajo, entreEstrellas de Levante y rock&roll.

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7. Agradecimientos

Gracias también a mis amigos, desde Ibiza hasta Australia pasando por Madrid,Murcia, Valencia, Francia y Suiza entre otros, por vuestra compañía, cariño yapoyo durante este tiempo, y por ayudarme a desconectar compartiendo conmigovuestras visiones del mundo.

A mi familia, sobre todo a mis padres y mis hermanos, parte indispensable demi vida, por su apoyo incondicional, por quererme, ayudarme y darme fuerzas entodo momento. Gracias por ser mi isla. También a la belle-famille de Valencia, porvuestro cariño y vuestros consejos, y por hacerme sentir como una más desde elprimer día.

A Juan, parte fundamental de nuestra pequeña familia murciana, por compartirtu vida conmigo, por quererme y apoyarme también en los momentos más difíciles.Gracias por entenderme, por ayudarme y por motivarme a ser la mejor versión demí misma. Este trabajo es resultado de nuestra sinergia, sin ti no hubiera sidoposible.

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