UNIVERSIDAD DE LOS ANDES ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA ...

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO Y SU

INFLUENCIA EN EL ESCALADO DE BIO-REACTORES

Tesis de grado presentado en opción al título

INGENIERO QUÍMICO

MÉNDEZ CASSINELLI LUCERO

MÉRIDA, OCTUBRE, 2007

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO Y SU

INFLUENCIA EN EL ESCALADO DE BIO-REACTORES

Tesis de grado presentado en opción al título

INGENIERO QUÍMICO

Autor: Lucero Méndez Cassinelli

Co-tutor: Profesor. Ingeniero Rubén Gómez

Co-tutor: Profesor. Ingeniero Hans Valenzuela

MÉRIDA, OCTUBRE, 2007

Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de biorreactores _______________________________________________________________________________________________________

INDICE GENERAL

i

Índice general………………………………………………………………………………..i

Agradecimientos....................................................................................................................vi

Dedicatoria............................................................................................................................vii

Resumen..................................................................................................................................1

Introducción............................................................................................................................2

CAPÍTULO I.......................................................................................................................I.-1

Planteamiento del problema....................................................................................I.-1

Hipótesis..................................................................................................................I.-2

Objetivos..................................................................................................................I.-3

Antecedentes...........................................................................................................I.-4

CAPÍTULO II Marco teórico............................................................................................II.-1

II.1 Microbiología.................................................................................................II.-1

II.1.1 Microbiología industrial..............................................................................II.-2

II.1.1.1 Áreas de aplicación de la microbiología industrial...................................II.-3

II.2 Fermentación..................................................................................................II.-6

II.2.1 Fermentación butanodiólica……..…………………………………............II.7

II.2.2 El producto. 2,3-butanodiol........................................................................II.-8

II.2.2.1 Importancia y aplicaciones industriales..................................................II.-10

II.2.3 El microorganismo utilizado para la fermentación butanodiólica.............II.-10

II.2.3.1 Algunas cepas utilizadas para la fermentación butanodiólica................II.-13

II.2.3.1.1 Klebsiella pneumoniae.........................................................................II.-15

II.2.3.1.2 Aerobacter aerogenes……………………………..............................II.-16

II.2.3.1.3 Bacillus polymyxa………....................................................................II.-13


INDICE GENERAL

ii

II.2.3.1.4 Klebsiella oxytoca................................................................................II.-16

II.2.3.2 Factores que afectan el crecimiento del microorganismo.......................II.-19

II.2.3.2.1 Concentración de oxígeno disuelto…..................................................II.-19

II.2.3.2.2 Temperatura de crecimiento……..…..................................................II.-20

II.2.3.2.3 pH del medio de cultivo…...…............................................................II.-22

II.2.3.2.4 Nutrientes para el crecimiento.............................................................II.-24

II.2.3.2.5 Agitación y mezclado..........................................................................II.-26

II.2.3.2.6 Asepsia.................................................................................................II.-27

II.2.4 El medio de cultivo…………………........................................................II.-27

II.2.4.1 Medios sintéticos....................................................................................II.-29

II.2.4.2 Suero de leche…………………………...…………..............................II.-30

II.2.4.3 Preparación del medio de cultivo...…………………………….............II.-35

II.2.5 Preparación del inóculo e inoculación.......................................................II.-36

II.2.6 El equipo. Bio-reactores. Componentes principales y características.......II.-37

II.2.6.1 Bio-reactores. Clasificación....................................................................II.-39

II.2.6.1.1 Bio-reactores según la manera en que los reactantes atraviesan

el equipo…………………….……...………………………………...II.-40

II.2.6.1.1.1 Bio-reactores de flujo continuo.......................................................II.-40

II.2.6.1.1.2 Bio-reactores de flujo discontinuo...................................................II.-42

II.2.6.1.1.3 Bio-reactores de flujo semi-continuo...............................................II.-44

II.2.6.1.2 Bio-reactores según la forma de agitación...........................................II.-45

II.2.6.1.2.1 Bio-reactores aireados agitados........................................................II.-45

II.2.6.1.2.2 Bio-reactores tubulares tipo air lift...................................................II.-46


INDICE GENERAL

iii

II.2.7 Variables importantes a ser controladas durante el proceso

de fermentación………..……………………………………………….II.-48

II.2.7.1 Concentración de oxígeno….…...……..................................................II.-49

II.2.7.2 Temperatura............................................................................................II.-50

II.2.7.3 pH...........................................................................................................II.-51

II.2.7.4 Agitación y mezclado.............................................................................II.-51

II.2.7.5 Asepsia....................................................................................................II.-52

II.2.8 Transferencia de masa en un biorreactor……………...……………........II.-53

II.2.8.1 Resistencias que se oponen a la transferencia de masa..........................II.-55

II.2.8.2 Transferencia de oxígeno en procesos fermentativos.............................II.-56

II.2.8.3 Factores que afectan el coeficiente de transferencia de oxígeno............II.-57

II.3 Escalado de biorreactores…….....................................................................II.-58

II.3.1 Escalado según la relación potencia/volumen…………….......................II.-63

II.3.2 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno constante.......II.-63

II.3.2.1.Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante

el método estático.....................................................................................II.-65

II.3.2.2 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante

el método de Winkler...............................................................................II.-67

II.3.2.3 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante

el método dinámico de Humphrey............................................................II.-70

CAPÍTULO III. Metodología experimental.....................................................................III.-1

III.1 Fase experimental..…..……………………………………………………III.-1

III.1.1 Montaje de la fermentación.......................................................................III.-1


INDICE GENERAL

iv

III.1.2 Determinación del contenido de lactosa a través del método

colorimétrico………….…………...………………………………….....III.-9

III.1.3 Determinación del contenido de glucosa a través del método

enzimático……………………………………………………………...III.-12

III.1.4 Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante

el método estático…................................................................................III.-15


el método de Winkler…………............................................................III.-17


el método dinámico de Humphrey.........................................................III.-25

CAPÍTULO IV. Resultados y discusiones......................................................................IV.-1

CAPÍTULO V. Conclusiones...........................................................................................V.-1

CAPÍTULO VI. Recomendaciones.................................................................................VI.-1

VI.-1 Para el método de Winkler……...………………………………………..VI.-1

VI.-2 Para el método estático………………...…………………………………VI.-2

VI.-3 Para el método dinámico de Humphrey…...……………………………..VI.-3

Apéndice A. Muestra de cálculo.......................................................................................A.-1

A.1 Cálculo de la concentración de oxígeno disuelto a través del método

de Winkler..……………………………………………………………....A.-1

A.2 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto usando

la concentración de oxígeno disuelto determinado a través del método

de Winkler….……………………………………………………………A.-2

A.3 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto a través del


INDICE GENERAL

v

método estático.…………………………………………………………..A.-3

A.-4 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto a través

del método dinámico de Humphrey……………..……………………….A.-7

A.-5 Cálculo de la salinidad del suero…………..……………………………..A.-13

A.-6 Cálculo del contenido de lactosa en una muestra de suero...……………..A.-15

A.-7 Cálculo del contenido de glucosa en una muestra de suero……...……….A.-16

Apéndice B. Datos recopilados…………………………………………………………..B.-1

B.1 Datos recopilados para la realización del método de Winkler………..……..B.-1

B.2 Datos recopilados y gráficos realizados para la realización del

método estático…………………………………………………….……B.-11

B.3.- Datos recopilados y gráficos realizados para la realización del

método dinámico de Humphrey…………...……………………………B.-28

B.4.- Datos recopilados y gráficos realizados para la determinación de la

salinidad del suero.……………………………………………………...B.-45

B.5.- Datos recopilados y obtenidos para la determinación del contenido de

glucosa y lactosa en las muestras de suero………………………..……B.-47

Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de biorreactores

________________________________________________________________________________________________________________

AGRADECIMIENTOS

vi

A mi tutor, profesor y amigo Rubén Gómez, quien estuvo a mi lado

pacientemente, enseñándome, guiándome y quien logró obtener de mí más del 100%,

no solo porque cree que soy capaz de darlo sino porque, además, él lo da todos los días.

Al profesor Hans Valenzuela, gracias a usted aprendí que yo sola puedo salir de

cualquier situación.

A mi compañero de tesis y amigo, Manuel Colina, juntos aprendimos que un

buen grupo de trabajo obtiene mejores resultados. Gracias por soportarme.

A la familia Quijada Rosas quien siempre con todo su apoyo estuvieron a mi

lado, fortaleciédome en los momentos más difíciles. Teo, tu amor y comprensión me

acompañó y me enseñó a seguir adelante. Miguelón, tu sentido del humor me hizo salir

de la amargura más veces de las que sabes. Aram, tu amistad incondicional me respaldó

en todo momento.

A todos los técnicos e investigadores de los distintos laboratorios, en especial a

Julio Hernández, Manuel Unda, Yajaira Araque, Antonio Fernández y César Izaguirre;

sin ustedes a mi lado este trabajo nunca se hubiera realizado.

Un agradecimiento especial al laboratorio de membranas y en especial al

profesor Antonio Cárdenas por todo su apoyo con este proyecto y conmigo. Sin ustedes

no lo hubiera logrado.

A todos ustedes, GRACIAS.

Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de biorreactores ____________________________________________________________________________________

DEDICATORIA

vii

Dedicado a DIOS quien en todo momento me dio fuerzas para seguir adelante

sin importar los contratiempos. GRACIAS por acordarte de mí en todo momento.

A mi PAPI Víctor, quien sigue estando a mi lado aún cuando está fuera de mi

alcance. Tus principios y creencias siguen estando conmigo.

A mi MAMA Gloria, quien no solo cree en mí, sino que además me incita a

seguir adelante sin importar mis tropiezos. Tu Amor y comprensión seguirán siendo mi

compromiso a lo largo de mi vida.

A mi HERMANA y mi CUÑADO Karin y Raymond, que siempre están aquí

conmigo y saben como ayudarme y escucharme en todo momento. Muchas gracias por

todo su apoyo y comprensión.

A mi HERMANITA Alba, que siempre sabe como ponerme los pies en la tierra

recordándome mis errores. Tú me acompañas hoy y yo lo haré mañana.

A mi HIJA Victoria, por quien logro todos mis propósitos y es mi fuerza de

todos los días. Estoy muy ORGULLOSA de ti.

A mi TIA Coqui y mi TIO Lucho quienes, aunque lejos, siempre están cerca de

mí. Gracias por poder contar en todo momento con Ustedes.

RESUMEN


_____________________________________________________________________ RESUMEN

1

Este proyecto realizó el estudio teórico de una fermentación butanodiólica

usando suero de leche como medio de cultivo y cepas de Klebsiella Oxytoca como

microorganismo. Una vez diseñada la columna de vidrio de dos entradas laterales que

funciona como biorreactor, se realizaron tres distintos métodos para la determinación

del coeficiente de transferencia de oxígeno en el sistema fermentativo particular: el

método de Winkler, el método estático y el método dinámico de Humphrey. Además,

se hizo un estudio de la influencia de la aireación y del volumen en el escalado de

biorreactores.

De acuerdo a los resultados obtenidos para el escalado del sistema de

fermentación, el método dinámico de Humphrey fue el más eficiente comparándolo con

los métodos estático y de Winkler, para la determinación del coeficiente de

transferencia de oxígeno ( aK L ) encontrada, debido a que toma en cuenta la demanda

de oxígeno del microorganismo además, de las resistencias que se oponen a la

transferencia del gas hacia el líquido. Así, se obtuvo que los valores más altos de aK L

son encontrados fueron de 61,27 1min � , 71,43 1min � y 73,15 1min � para 1 litro de

medio de cultivo y aireaciones baja, media y alta respectivamente.

También, se logró observar que al aumentar el volumen del medio de cultivo se

requiere aumentar el flujo de aireación para así mantener constante el coeficiente de

transferencia de oxígeno.

INTRODUCCIÓN

Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de bio-reactores

______________________________________________________________________ INTRODUCCION

2

Uno de los problemas más comunes en cualquier industria se encuentra al

escalar un proceso y, en los procesos fermentativos es mayor el efecto debido a que se

toman en cuenta parámetros fisicoquímicos y biológicos. Existen una variedad de

fermentaciones cuyo parámetro crítico es la transferencia de oxígeno al medio de

cultivo. Es este el parámetro que determina la capacidad de un biorreactor al momento

del escalamiento del proceso; es por esto que es uno de los criterios escogidos para el

escalado; sin embargo, calcular este coeficiente no es tarea fácil, este valor es

susceptible las variaciones de una serie de parámetros fisicoquímicos.

Es esta la razón por la cual se desarrolla el presente trabajo de investigación,

para estudiar los diversos métodos de determinación del coeficiente de transferencia de

oxígeno a través de métodos desarrollados como el de Winkler, el método estático y, el

método dinámico de Humphrey y la influencia de este coeficiente en el escalado de

fermentadores observando el comportamiento del proceso frente a cambios de aireación

y cambios de volumen de medio de cultivo.

Este proyecto de grado se encuentra estructurado en los siguientes capítulos:

El capítulo I contiene la definición del problema a estudiar, justificación, el

alcance y las limitaciones del proyecto.

El capítulo II desarrolla los fundamentos teóricos básicos que deben tomarse en

cuenta para llegar a explicar y defender los resultados obtenidos durante la parte

experimental del proyecto.

El capítulo III muestra la metodología experimental, materiales y métodos

utilizados para la fase preliminar y la fase experimental.

El capítulo IV detalla los resultados obtenidos y su respectiva discusión.


______________________________________________________________________ INTRODUCCION

3

El capítulo V presenta las conclusiones finales del proyecto.

El capítulo VI contiene las recomendaciones finales.

CAPÍTULO I PLANTEAMIENTO DEL

PROBLEMA


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El escalamiento de cualquier proceso es uno de los problemas de mayor

importancia no sólo en fermentaciones sino en la industria en general. Para la industria

de la microbiología, este problema es aún más delicado debido a que en los bioprocesos

se encuentran células vivas, ya sean éstas unicelulares o pluricelulares, por lo cual se

hace necesario el estudio de las variables fisicoquímicas y biológicas del proceso para

lograr mantener al microorganismo en condiciones de mayor producción en el menor

tiempo de cultivo.

Dependiendo del tipo de microorganismo empleado en la fermentación, se

deben controlan distintos parámetros de operación, y estas variables son las

determinantes para el buen funcionamiento del fermentador; tales variables son las

precursoras de los diferentes criterios para el escalado exitoso de un fermentador.

La microbiología participa en diversos sectores de la industria; sin embargo,

existen muchos otros a las cuales no ha sido expandida, ya sea por falta de tecnología o

por falta de conocimientos en el cambio de escala.

Por las razones antes expuestas, el siguiente proyecto tiene como finalidad el

estudio del coeficiente de transferencia de oxígeno en fermentaciones aerobias y la

influencia de éste en el escalado de biorreactores; dicho estudio se divide en dos etapas.

La primera etapa consiste en el estudio de los distintos métodos para el cálculo del

coeficiente global de transferencia de oxígeno, para un proceso de fermentación en

medio sumergido donde se toma como modelo la fermentación de la Klebsiella oxytoca

y la segunda etapa consiste en la determinación del coeficiente global de transferencia

de oxígeno de acuerdo a los métodos seleccionados.


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-2

HIPÓTESIS

Se plantea que el coeficiente de transferencia de oxígeno influyendo en el

metabolismo de la Klebsiella oxytoca para la producción de 2,3-butanodiol, es un

parámetro importante en el escalamiento de los procesos fermentativos que involucren

tal microorganismo se asemejen a su comportamiento; por lo tanto, es importante su

uso como parámetro o criterio relevante en el escalado de dichos procesos biológicos.


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-3

OBJETIVOS

GENERALES:

Estudiar las técnicas para la determinación del coeficiente global de

transferencia de oxígeno, como elemento fundamental para el escalado de

biorreactores y el efecto del coeficiente de transferencia de oxígeno en el

escalado de biorreactores, que involucren un control estricto del caudal de

oxígeno.

ESPECÍFICOS:

Determinar el coeficiente global de transferencia de oxígeno para la

producción de 2,3-butanodiol en medio sumergido, usando cepas de

Klebsiella oxytoca y suero de leche como medio de cultivo, mediante los

métodos de Winkler, método estático y método dinámico de Humphrey

para volúmenes de 300 ml, 1 l y 2 l.

Seleccionar el mejor método para la determinación del coeficiente global

de transferencia de oxígeno que se ajuste a los requerimientos exigidos por

el proceso a estudiar.


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-4

ANTECEDENTES

La correlación entre la concentración de la penicilina producida y la potencia

consumida en agitación en fermentadores de diferentes volúmenes fue investigada por

Bartholomew [46] y Gaden [47] en 1950, y comunicaron que el escalamiento de la

producción de penicilina puede efectuarse con éxito con una relación potencia/volumen

de 1.5-3.0 HP/m3. La producción de estreptomicina también fue escalada por

Bartholomew [46] en 1960 utilizando la relación potencia-volumen de 2 HP/m3. Muchas

otras fermentaciones se desarrollaron haciendo uso del método de oxidación de una

solución con sulfito de sodio; sin embargo, Maxon y Steel [48] comunicaron que el

escalamiento de novobiocina no se podía efectuar con base en la tasa de oxidación de

sulfito, sino que podía usarse como criterio de escalamiento la tasa específica de

consumo de oxígeno de Streptomyces niveus, correlacionando la demanda de oxígeno

con la velocidad de la punta del impulsor, independientemente del diámetro utilizado.

También en 1960, Yoshida [49] y su grupo demostraron que la tasa de absorción

de oxígeno en solución de sulfito de sodio por unidad de volumen líquido, es más

rápida que en agua pura, especialmente con agitación forzada, que genera burbujas más

pequeñas y un área interfacial mayor. Por lo anteriormente expuesto se considera que el

método de oxidación no es adecuado para escalamiento de fermentación, especialmente

en cultivos de alta viscosidad o no Newtonianos.

Para 1966 Oldshue [50] utilizó el coeficiente de transferencia de oxígeno y un

análisis adimensional como criterios de escalamiento, y demostró que era posible

escalar con geometría no similar debido a que para altos valores de la relación potencia


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-5

por unidad de volumen, la relación diámetro del impulsor entre diámetro del tanque

puede variar de 0.2 a 0.5 y todavía se siguen obteniendo buenos resultados.

En 1969 Oldshue [51] escaló un tanque agitado bajo dos premisas: el primero

tenía similitud geométrica y el segundo no. El cambio en el tamaño del impulsor hizo

que el consumo de energía por unidad de volumen disminuyera, sin embargo, el

esfuerzo cortante aumentó. Este antecedente se hace importante para los procesos que

dependen del esfuerzo cortante.

Para 1972, Kinoshita y Yamada [52] extrapolaron la producción del ácido

glutámico tomando como base de escalamiento la geometría similar y el coeficiente de

transferencia de oxígeno similar. Ellos expusieron, luego de sus experiencias, que los

resultados obtenidos fueron muy satisfactorios debido a que la concentración del

producto en ambas escalas fue el mismo.

A lo largo de los años las técnicas de escalado fueron evolucionando, al igual

que los biorreactores; sin embargo, los métodos clásicos siguieron manteniéndose en

pie. Para el 2002, Wong, García y Rodríguez [38] escalaron la producción del antígeno

K88 utilizando Escherichia Coli como la cepa de producción y bajo el criterio de

coeficiente de transferencia de oxígeno constante aunado a la relación flujo volumétrico

de aire por unidad de volumen constante. Estudiando con valores probabilísticos

llegaron a la conclusión que este proceso puede ser descrito como una ecuación

polinomial de grado superior obteniendo hasta un 95% de confiabilidad.

También Znad [39] y sus compañeros realizaron en el 2004 un modelado y

escalado de un biorreactor del tipo air-lift para la producción de ácido glucónico basado


________________________________________________________________________________________________________________

CAPITULO I

I.-6

en modelos matemáticos anteriores y en un modelo particular que considera el efecto de

dos sustratos en la fermentación (glucosa y oxígeno disuelto).

CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO

Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de bio-reactores _______________________________________________________________________________________________________

CAPITULO II

II.-1

MARCO TEÓRICO

II.1 Microbiología

La microbiología se puede definir como la ciencia que trata de los seres vivos muy

pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder

resolutivo del ojo humano. Esta definición implica que el objeto material de la

microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que

abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde

partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan

diferentes como las bacterias, protozoos y parte de las algas y de los hongos [1]. Durante

cierto tiempo la microbiología quedo relegada como una disciplina meramente descriptiva

y aplicada únicamente a la medicina. Sin embargo, una corriente, en principio minoritaria,

dedicada a los estudios básicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de

capacidades metabólicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la

nutrición de las plantas, logró hacer ver la ubicación ecológica y la extrema diversidad

fisiológica de los microorganismos.

Podemos definir a los microorganismos como seres de tamaño microscópico

dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, bien sea acelular o

celular y, en este último caso, pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos,

coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciación en tejidos u órganos, y que necesitan

para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Bajo esta

denominación se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades

subcelulares [1].


CAPITULO II

II.-2

Por otro lado, la microbiología también se ocupa de las distintas actividades

microbianas en relación con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear

consecuencias perjudiciales (y en este caso estudia los nichos ecológicos de los

correspondientes agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota

patógena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así

como los métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las que traen

beneficios (ocupándose del estudio de los procesos microbianos que suponen la obtención

de materias primas o elaboradas y de su modificación y mejora racional con vistas a su

imbricación en los flujos productivos de las sociedades) [1].

Finalmente, la microbiología ha de ocuparse de todas las técnicas y metodologías

destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos; es decir, de

todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia empírica. [1]

II.1.1 Microbiología industrial

La microbiología industrial puede definirse como la parte de la microbiología que se

ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos. Desde otro punto de vista,

puede decirse también que los procesos de la microbiología industrial constituyen aquellos

procesos industriales catalíticos basados en el uso de micro-organismos [2].

Luego de muchos años de evolución, la microbiología participa a nivel industrial,

junto a la biotecnología estudiando la explotación de los microbios para uso en procesos

industriales. Estos procesos utilizan microorganismos generalmente, cultivados a gran

escala para obtener productos de valor comercial. Antiguamente todos los procesos de este

tipo, se basaban en la mejora de reacciones metabólicas que los microorganismos ya eran

capaces de llevar a cabo, generalmente para obtener mayores rendimientos del producto


CAPITULO II

II.-3

deseado; sin embargo, actualmente, con el uso de la ingeniería genética, la microbiología

industrial está encaminada a modificar los microorganismos a nivel molecular para no sólo

obtener rendimientos más altos, sino además, lograr que el microorganismo permanezca

inalterado ante variaciones bruscas de las condiciones del medio donde habita. Ejemplos

claros de procesos microbianos industriales son la fermentación industrial y el tratamiento

de aguas residuales.

El suceso que aportó el rápido desarrollo de la microbiología industrial fue la

producción de penicilina a partir del hongo Penicillium. Aunque, inicialmente fue un

proceso a pequeña escala, desarrollado por Howard Florey y sus colaboradores durante la II

Guerra Mundial, poco después se consiguió producir penicilina en grandes cantidades, al

tiempo que se utilizaban otros microorganismos para obtener una gran variedad de

antibióticos, como la estreptomicina[5].

II.1.1.1 Áreas de aplicación para la microbiología industrial

Las áreas de aplicación de la microbiología industrial son muy variadas y de ellas

surge la importancia y el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad. [2]

Las áreas principales son: salud, alimentación, producción vegetal y animal,

insumos industriales, minería y servicios [2].

En primer lugar se debe destacar la importancia de la microbiología industrial en el

mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su

aplicación en la producción de compuestos de actividad farmacológica y vacunas [2]. En la

figura II.-1 se muestran equipos utilizados en la industria farmacéutica.


CAPITULO II

II.-4

Figura II.-1 Equipos utilizados en la industria farmacéutica basados en microbiología industrial.

En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la

microbiología industrial en la producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos

lácteos, etc. [2]

La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción

vegetal y animal por un conjunto variado de procesos microbiológicos que se han

enriquecido notablemente en los últimos años (como ha sucedido con otras áreas) con la

utilización de técnicas de ingeniería genética [2].

El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación o sea con la

aplicación de microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley [2].

Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de

microorganismos en la purificación de efluentes, aspecto fundamental para el

mantenimiento de la calidad de vida [2].

En la tabla II-.1 se muestran algunos compuestos producidos por la microbiología

industrial.


CAPITULO II

II.-5

Tabla II.-1 Principales productos microbianos y procesos de interés en microbiología industrial y

biotecnología [9].

Sustancias Microorganismos

Productos industriales

Etanol (procedente de glucosa) Saccharomyces cerevesiae

Etanol (procedente de lactosa) Kluyveromyces fragilis

Acetona y butanol Clostridium acetobutylicum

2,3-butanodiol Enterobacter, Serratia

Enzimas Aspergillus, Bacillus, Mucor, Trichoderma

Productos agrícolas

Giberelinas Gibberella fujikuroi

Aditivos alimentarios

Aminoácidos (p. ej., lisina) Corynebacterium glutamicum

Ácidos orgánicos (ácido cítrico) Aspergillus niger

Nucleótidos Corynebacterium glutamicum

Vitaminas Ashbya, Eremothecium, Blakesles

Polisacáridos Xanthomonas

Productos médicos

Antibióticos Penicillium, Streptomyces, Bacillus

Alcaloides Claviceps purpurea

Transformaciones de esteroides Rhizopus, Arthrobacter

Insulina, hormona del crecimiento humano, somatostina, interferones Escherichia coli, Saccharomyces cerevesiae

Bio-combustibles

Hidrógeno Micro-organismos fotosintéticos

Metano Methanobacterium

Etanol Zymomonas, Thermoanaerobacter


CAPITULO II

II.-6

II.2. Fermentación

La fermentación es el proceso microbiano más estudiado y con mayor número de

aplicaciones a nivel industrial no sólo de alimentos, sino también en la farmacéutica.

La fermentación es un proceso generador de energía en el cual las moléculas

orgánicas actúan como dadores y como aceptores de electrones [9].

La primera explicación bioquímica del proceso por el cual el azúcar en solución

acuosa es descompuesto en alcohol y gas carbónico, en virtud de la acción de células vivas

de levadura, la dio el químico Francés Louis Pasteur, el cual vio que, mientras

descomponen el azúcar en ausencia de aire, las células de levadura viven y se propagan en

el líquido en fermentación y llamó al proceso de fermentación alcohólica “vida sin

oxígeno”. Pasteur explicó que, por la descomposición de la molécula de azúcar en ausencia

de aire, se pone a disposición de las células de levadura, de la misma manera que se

produce energía en los tejidos de los animales y las plantas que respiran para satisfacer sus

necesidades metabólicas cuando son oxidados los compuestos orgánicos en presencia de

aire.[8]

Extendiendo la interpretación bioquímica de la fermentación alcohólica hecha por

Pasteur a otros procesos, la palabra fermentación indica hoy la desasimilación anaeróbica

de compuestos orgánicos por la acción de los microorganismos u otras células o de

extractos celulares. Sin embargo, en muchos artículos técnicos y, en mayor grado aún en el

uso corriente en laboratorios y fábricas, el término fermentación denota la acción

microbiana regulada por el hombre. En el sentido más amplio, la palabra fermentación no

sólo designa los procesos de desasimilación anaeróbica como la formación de alcohol,

butanol-acetona, ácido láctico, etc., sino también la producción industrial de vinagre, ácido


CAPITULO II

II.-7

cítrico, enzimas, penicilina y otros antibióticos, riboflavina y otras vitaminas; todos estos

productos son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos de fermentación.

[8]

Para el desarrollo de este proyecto de investigación, se tomó una fermentación en

particular, la producción de 2,3-butanodiol a partir de suero de leche como medio de cultivo

y cepas de klebsiella oxytoca como microorganismo. En base a este punto de referencia se

desglosa la información siguiente.

II.2.1 Fermentación butanodiólica

Para el desarrollo de procesos microbianos en la formación de productos es

necesario optimizar tres elementos: el rendimiento del producto por gramo de sustrato, la

concentración del producto y la velocidad de formación del mismo. Los pasos principales

para el desarrollo de un proceso de fermentación son:

1. Selección de una cepa microbiana.

2. Determinación de los valores óptimos de temperatura, pH, concentración de

oxígeno, etc.

3. Determinación de los requisitos óptimos nutricionales y la concentración

celular.

4. Modificación de la estructura genética del micro-organismo para aumentar

la formación del producto.

Los cuatro aspectos se refieren básicamente a la regulación metabólica del

microorganismo. Normalmente el metabolismo está ajustado para producir solamente el

mínimo necesario de metabolitos. El éxito de una fermentación consiste en intervenir en la

regulación metabólica y provocar una sobreproducción del compuesto deseado. [15]


CAPITULO II

II.-8

En la fermentación butanodiólica los productos principales son: butanodiol, etanol y

dióxido de carbono. Enterobacter, Serratia, Erwinia, algunos Bacillus y Klebsiella son

microorganismos fermentadores butanodiólicos. [9]

En esta fermentación, el piruvato es convertido en acetoína, que a continuación se

reduce a 2,3-butanodiol con NADH. También se produce una gran cantidad de etanol, junto

con pequeñas cantidades de los ácidos presentes en la fermentación ácido-mixta. [9]

Los microorganismos fermentadores butanodiólicos pueden diferenciarse de los

fermentadores ácido mixtos de tres formas.

1.- La prueba de Voges-Proskauer detecta la acetoína, precursor del butanodiol y es

positiva con los fermentadores butanodiólicos pero no con los fermentadores ácido-mixtos.

2.- Los fermentadores ácido mixtos producen una cantidad de productos acídicos

cuatro veces mayor que los neutros, mientras que los fermentadores butanodiólicos forman

principalmente productos neutros. Por lo tanto, los fermentadores ácido-mixtos acidifican

los medios de incubación en una medida mucho mayor. Esta es la base de la prueba del rojo

de metilo. La prueba es positiva sólo para la fermentación ácido mixta debido a que el pH

desciende por debajo de 4.4 y el color del indicador pasa de amarillo a rojo.

3.- El dióxido de carbono y el hidrógeno molecular se forman en cantidades

similares por la actividad de la fórmico hidrogenoliasa durante la fermentación ácido mixta.

Los fermentadores butanodiólicos producen un exceso de dióxido de carbono, y la relación

CO2/H2 es 5:1 o mayor. [9]

II.2.2 El producto. 2,3- butanodiol

El 2,3-butanodiol es un compuesto químico muy importante en la industria

alimentaria y en combustibles líquidos y puede ser producido por la bioconversión de


CAPITULO II

II.-9

recursos naturales. El 2,3-butanodiol es también conocido como 2,3-butilenglicol, 2,3-

dihidroxibutano o dimetiletilenglicol y es un compuesto quiral. Su fórmula química es

CH3CH(OH)CH(OH)CH3 con un peso molecular de 90.12 kDa. El 2,3-butanodiol tiene un

alto punto de ebullición entre 180-184 ºC y un bajo punto de congelamiento de -60 ºC. Se

presenta como un líquido incoloro e inodoro o en su forma cristalina. El poder calorífico

del 2,3-butanodiol es 27.198 J/g el cual es similar al de otros combustibles líquidos como el

etanol y el metanol. [16]

El 2,3-butanodiol es producido por vía ácido mixta. Los otros productos finales

incluyen etanol, acetato, lactato, formato y succinato. La acetoína (también conocida como

acetilmetilcarbinol) puede ser formada. [16]

El 2,3-butanodiol tiene tres esteroisómeros, las formas dextro-, levo-, y meso-.

Usualmente, una mezcla de dos tipos de 2,3-butanodiol es formado a partir de diferentes

microorganismos. De la fermentación del Bacillus polymyxa se produce la forma

ópticamente activa del 2,3-butanodiol (las formas dextro-(-)-2,3-butanodiol y levo-2,3-

butanodiol) en mayor proporción. [16]

Figura II.-2 Estereoisómeros del 2,3-butanodiol. (a) D-(-)-2,3- butanodiol (forma Levorrotatoria). (b) L-

(+)-2,3-butanodiol (forma Dextrorrotatoria). (c) Meso-2,3-butanodiol (forma ópticamente inactiva). [16]


CAPITULO II

II.-10

II.2.2.1 Importancia y aplicaciones industriales

Debido a la necesidad de caucho sintético durante la Segunda Guerra Mundial, la

producción del 2,3-butanodiol tomó auge en ese momento. Adicionalmente, muchos otros

derivados del 2,3-butanodiol tienen potencial uso como agentes anticongelantes, solventes

y plásticos. Además, puede ser agregado como agente saborizante en alimentos cuando es

convertido a diacetil por deshidrogenación. El compuesto metiletilcetona con un calor de

combustión más alto que el etanol, puede ser obtenido por deshidratación del 2,3-

butanodiol y es considerado como un efectivo aditivo líquido para combustible.[16]

La esterificación del butanodiol forma los precursores del poliuretano para usarlo en

medicamentos, productos cosméticos, lociones, etc.[16]

II.2.2.1 El microorganismo utilizado para la fermentación butanodiólica

Microorganismo es el nombre genérico que designa a los seres organizados, solo

visibles al microscopio, como bacterias, infusiorios, hongos, levaduras, etc. [10]

Bacterias son organismos de una sola célula. Su forma puede ser esférica, espiral,

etc. Pueden existir como organismos individuales, formando cadenas, grupos o pares. Las

bacterias son las formas de vida más abundantes en la tierra. Tienen una longitud entre 0,4

y 14 �m y sobre 0,2 a 12 �m de ancho. Consecuentemente, solo se pueden ver mediante

microscopio. Las bacterias se reproducen mediante la replicación del ADN y división en

dos células independientes. En circunstancias normales este proceso dura entre 15 y 30

minutos. [6]


CAPITULO II

II.-11

Algunas bacterias pueden formar esporas. Estas esporas se caracterizan por

presentar una capa protectora resistente al calor y que protege la bacteria de la falta de

humedad y comida. [6]

Las bacterias tienen un papel funcional ecológico específico. Por ejemplo, algunas

se encargan de la degradación de la materia orgánica, otras bacterias forman parte del

metabolismo del hombre. [6]

El microorganismo que se seleccione para una fermentación en particular, no sólo

debe efectuar la reacción deseada, sino que puede efectuar el cambio bioquímico necesario

en poco tiempo y que produzca el rendimiento máximo posible con un mínimo de atención.

El organismo apropiado debe también mantener su actividad de una generación a otra y

combatir infecciones. Aunque muchas cepas de una especie no satisfacen todos los

requisitos en un proceso especial, suele ser posible encontrar, aclimatar, mutar o criar cepas

específicas con cualidades adecuadas. [8]

Crecimiento es el incremento ordenado de todos los componentes de un organismo.

La multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento. En organismos unicelulares

la multiplicación conduce a un aumento en el número de individuos dando lugar a una

población o a un cultivo.[18]

El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular

(número de células por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de las

células por unidad de volumen de cultivo). Estos dos parámetros no siempre son

equivalentes, debido a que el promedio de peso seco de la célula varía en las distintas

etapas de la historia del cultivo. [18]


CAPITULO II

II.-12

La masa celular puede ser medida por la determinación del peso seco del cultivo o

por determinación de la turbidez. En los casos en que el gran número de células son viables,

el peso y la turbidez están relacionados directamente con el número de células. [18]

Los cultivos bacterianos dispersan o absorben luz y, estos fenómenos son

aproximadamente proporcionales a la masa celular. La densidad óptica de un cultivo en

crecimiento puede ser seguido en un espectrofotómetro a la longitud de onda en el que el

cociente de absorbancia es bajo (550-560 nm). La relación exacta de densidad óptica (a una

particular longitud de onda) y número de células, varía con la cepa y las condiciones, pues

la relación masa/número de células varía con el medio de cultivo y el tamaño celular. [18]

Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe

estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a

gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca

rápidamente y elabore el producto deseado en un período de tiempo corto. El

microorganismo debe también crecer en un medio de cultivo relativamente barato, así como

disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser

patógeno para el hombre o para los animales o plantas. [5, 13]

Otro requisito importante, es la facilidad de separar las células microbianas del

medio de cultivo; la centrifugación es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos

industriales más favorables para esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos

filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas), ya que estas células sedimentan más

fácilmente que las bacterias unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar. [5, 13]

Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan,

como máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100.000 encontradas

en la naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por


CAPITULO II

II.-13

elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o de bajo costo por otros

métodos. [5]

Actualmente, existen muchos otros productos químicos que se obtienen por

fermentación (un término técnicamente restringido a los procesos que ocurren en ausencia

de aire, como la producción de alcohol por levaduras, aunque este término a menudo se

utiliza de forma más amplia). Estos productos incluyen el ácido oxálico utilizado en tintes y

colorantes, el ácido propenóico (ácido acrílico) utilizado como intermediario en la

producción de plásticos, o el ácido láctico empleado para acidificar alimentos y como

anticongelante.[5]

Los microorganismos se han usado, así mismo, en la obtención de diferentes

enzimas utilizadas para aplicaciones tan diversas, como la eliminación de manchas en los

tejidos (gracias a la incorporación de enzimas en los detergentes que atacan proteínas y

ácidos grasos), o la conversión de harina de maíz en sirope (utilizado para endulzar

refrescos, galletas y pasteles) . [5]

Las bacterias con fermentación butanodiólica se encuentran genéticamente más

próximas entre sí con las bacterias que llevan a cabo la fermentación ácido-mixta. Una

especie de Klebsiella, K. pneumoniae, puede causar neumonía en los humanos, pero las

Klebsiellas se encuentran corrientemente en el suelo y agua y producen butanodiol. El

género de la Serratia también produce butanodiol. [13]

II.2.3.1 Algunas cepas utilizadas para la fermentación butanodiólica

Un gran número de especies pueden segregar 2,3-butanodiol como producto final. [16]

El Aerobacter Aerogenes y el Bacillus Polymyxa fermentan la glucosa y la

convierten en 2,3-butanodiol, alcohol etílico, dióxido de carbono e hidrógeno en


CAPITULO II

II.-14

condiciones aeróbicas y anaeróbicas. En realidad, la fermentación por el Aerobacter

Aerogenes se acelera muchísimo por una intensa aireación. [8]

Las células bacterianas son prácticamente transparentes, por ello no es

recomendable su estudio mediante la observación de suspensiones de células en agua o

tampones. El empleo de colorantes biológicos permite aumentar el contraste entre la célula

y el medio ambiente y, a través del empleo de técnicas especiales, es posible distinguir

algunos de los constituyentes celulares más importantes. Existe un tipo de tinción conocida

como tinción de Gram. Las bacterias tratadas con esta tinción se clasifican en: bacterias

Gram-positivas y Gram-negativas. [18]

Características de las bacterias Gram-negativas: las células presentan una doble

línea denominada membrana externa, luego se observa una línea más densa a los electrones

y que corresponde al péptidoglican, estructura que conforma la pared celular de la bacteria

Gram-positivas y que también es responsable de la rigidez y resistencia de la célula Gram-

negativa. [18]

Luego se encuentra el espacio peri-plasmático y la membrana citoplasmática que

posee similar característica a la de la bacteria Gram-positiva. En el interior se encuentran el

citoplasma y nucleoide, que aparecen menos compactos que los de las bacterias Gram-

positivas, pero que son estructuralmente semejantes. [18]

En las bacterias Gram-negativas existe la envoltura externa que no posee la bacteria

Gram-positiva y cuya estructura es semejante a la membrana citoplasmática. La membrana

externa se presenta como un triple perfil en el que las líneas densas a los electrones

corresponden a las proteínas que fijan los compuestos de metales pesados (para la

microscopía electrónica). El perfil transparente a los electrones tiene una composición

química compleja, al exterior de la bacteria se encuentran polímeros de heterosacáridos o


CAPITULO II

II.-15

azúcares que están unidos a un complejo de glúcidos fosfolípidos que se han denominado

lipopolisacáridos. [18]

II.2.3.1.1 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae es una bacteria aerobia, gran-negativa y quimio-organotrofa.

Esta bacteria se localiza en el suelo, agua, tracto digestivo de los humanos y otros animales,

respiratorio, etc; es la especie de mayor relevancia clínica dentro del género bacteriano

Klebsiella, compuesto por bacterias gram-negativas de la familia Enterobacteriaceae, que

desempeñan un importante papel como causa de las enfermedades infecciosas oportunistas.

El género fue llamado así en honor a Edwin Klebs, un microbiólogo alemán de finales del

siglo XIX.[6]

El bacilo ahora conocido como Klebsiella pneumoniae también fue descrito por

Karl Friedländer, y durante muchos años se conoció como el «bacilo de Friedländer».

En la tinción de Gram son negativos; la asimilación y la fermentación de la lactosa se puede

observar en el medio Kligler, donde son positivos y desprenden gas; y en la fermentación

acetónica o prueba de Voges Proskauer son positivos. Por último, sus condiciones óptimas

de cultivo son en agar nutritivo a 26ºC.[6]

La Klebsiella pneumoniae, dentro de este género bacteriano, está implicada

principalmente en infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto

urinario, neumonías, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida

quirúrgica. Son especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de

cuidados intensivos, neonatos, y pacientes con EPOC, diabetes mellitus o alcohólicos.[6]

Causa alrededor del 1% de las neumonías bacterianas y puede causar condensación

hemorrágica extensa del pulmón. Además, en ocasiones provoca infección del aparato


CAPITULO II

II.-16

urinario y bacteriemia a partir de lesiones focales en pacientes debilitados que puede

terminar con la vida del paciente. Algunas de las complicaciones más frecuentes son el

absceso pulmonar y el eficema.[6]

II.2.3.1.2 Aerobacter Aerogenes

El Aerobacter Aerogenes es un bacilo gram-negativo, por lo general no movible,

que no forma esporas, de 0.5-0.8 x 1.0-2.0 micras, se presenta aislado o en parejas y es un

habitante del suelo, las plantas, los granos y el conducto intestinal del hombre y los

animales. Puede utilizar el ácido cítrico como fuente exclusiva de carbono y la urea como

fuente exclusiva de nitrógeno. Crece y fermenta mejor a 30ºC. Cuando fermenta

carbohidratos, la proporción de gases formados es una parte de hidrógeno por dos o más

partes de dióxido de carbono. [8]

II.2.3.1.3 Bacillus Polymyxa

Migula que se mueve con gran rapidez, forma esporas y tiene tamaño 0.6-1.0

x 2.5-6.0 micras; los bacilos se presentan aislados o formando cadenas cortas. Las esporas

de este organismo variable al Gram que produce lodos, son ovalados y miden 1.0-1.5 x 1.5-

2.5 micras. [8]

II.2.3.1.4 Klebsiella Oxytoca

La klebsiella pertenece a la familia de las enterobacteriales, las cuales contienen

bacilos germinativos anaeróbicos facultativos, rectos, inmóviles, con necesidades

nutricionales sencillas. Las propiedades metabólicas de Enterobacteriales son muy útiles


CAPITULO II

II.-17

para caracterizar sus géneros constituyentes. Los miembros de esa familia, a menudo se

denominados enterobacterias o bacterias entericas (del griego enterikos, perteneciente al

intestino), degradan azucares mediante la ruta de Embdem-Meyerhof. Esta familia puede

dividirse en dos grupos, en función de sus productos de fermentación. La mayoría (p.ej.,

los géneros Eschericha, Proteus, Salmonela y Shigella) llevan a cabo una fermentación

acido mixta y producen principalmente lactato, acetato, succínico, formato y etanol. En la

fermentación butanodiólica los productos principales son butanodiol, etanol, y dióxido de

carbono. Enterobacter, Serratia, Erwia y Klebsiella son fermentadores butanodiólicos. [9].

Figura II.-3: Klebsiella oxytoca en medio Agar MacConkey en una placa de Petri.[6]

La clasificación taxonómica de la Klebsiella oxytoca se especifica a continuación:

(NCBI)

División: cellular organismos

Subdivisión: Bacteria

Clase: Proteobacteria

Orden: Gammaproteobacteria

Familia: Enterobacteriales


CAPITULO II

II.-18

Subfamilia: Enterobacteriaceae

Género: Klebsiella

Especie: Klebsiella oxytoca

Tabla II.-2: Características taxonómicas de la Klebsiella oxytoca. [14]

Características Klebsiella

Rojo de metilo (+)a

Voges- Proskauer (+)

Producción de indol D

Utilización de citrato (+)

Producción de H2S -

Ureasa (+)

�-Galactosidasa (+)

Gas a partir de lactosa (+)

Acido a partir de lactosa (+)

Fenilalanina desaminasa -

Lisina descarboxilasa (+)

Ornitina descarboxilasa -

Motilidad -

Licuefacción de gelatina (22ºC) -

% G+C 53-58

Otras características 0.3-1.0 x 0.6-6.0 �m; encapsulada


CAPITULO II

II.-19

II.2.3.2 Factores que afectan el crecimiento del microorganismo

Para su crecimiento, los microorganismos utilizados en los procesos tecnológicos,

requieren estrictas condiciones del medio ambiente, tales como concentración de oxígeno

disuelto, temperatura, pH, nutrientes, asepsia y agitación. El efecto de cada uno de ellos en

el crecimiento bacteriano se desglosa a continuación. [3]

II2.3.2.1 Concentración de oxígeno disuelto

Se distinguen dos tipos de microorganismos en función de su requerimiento en

oxígeno: los microorganismos aerobios, para los cuales la disponibilidad del oxígeno es

indispensable; y los microorganismos anaerobios, para los cuales el oxígeno es tóxico.

Existen, por último, algunos microorganismos capaces de adaptar su metabolismo a las

condiciones de oxigenación imperantes en el medio y que son por lo tanto aerobios

facultativos (éste es el caso de la bacteria Escherichia coli y de la levadura Saccharomyces

cerevisae, entre otros). [3]

La fermentación aerobia es hasta hoy la más utilizada, ya que el crecimiento es

mucho más rápido en aerobiosis que en anaerobiosis. Sin embargo, los microorganismos

anaerobios son capaces de sintetizar una serie de compuestos únicos (metano, etanol,

solventes, etc), lo que ha provocado un nuevo interés en su cultivo y estudio, en particular

para la industria química. Por otra parte es necesario mencionar dos limitantes que

presentan las fermentaciones aerobias:

a. Muy baja solubilidad del oxígeno en el agua, lo que hace necesario airear y

agitar fuertemente el medio de cultivo.


CAPITULO II

II.-20

b. Producción elevada de calor que debe ser constantemente removida a fin de

mantener estable la temperatura.[3]

II.2.3.2.2 Temperatura de crecimiento

Las temperaturas entre las cuales se puede desarrollar una célula microbiana varían

entre 10 y 60ºC. Según el rango de temperatura en el cual el crecimiento es posible

podemos distinguir microorganismos psicrófilos (4-25ºC), mesófilos (30-40ºC) y termófilos

(40-65ºC y más). [3]

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento óptima y particular. Si

consideramos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de

cultivo, existe una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento a

temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con

la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que es máxima.

Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se

produce la muerte celular. [7]

El incremento del crecimiento celular con la temperatura se debe al incremento

generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina

coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el

de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele

aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La

ausencia de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de

crecimiento y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser

fluidos a cristalinos, impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte


CAPITULO II

II.-21

celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de proteínas y a las alteraciones

producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. [7]

Es importante tener en cuenta que, a temperaturas muy bajas el metabolismo celular

es muy bajo y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué comenzar a morir. Sin

embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular

rápidamente y de manera irreversible. Esta característica permite esterilizar los equipos a

utilizar a través de calor y no de frío. [7]

Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de

crecimiento, los cuales se clasifican como se muestran en la tabla II.-3.

Tabla II.-3: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento. [7]

Tipo de micro-organismo Temperatura

mínima (ºC)

Temperatura

óptima (ºC)

Temperatura

máxima (ºC)

Psicrófilo -5 +5 12 – 15 15 - 20

Psicrótrofo -5 +5 25 – 30 30 - 35

Mesófilo 5 – 15 30 – 45 35 - 47

Termófilo 40 – 45 55 – 75 60 - 90

Además de los indicados, existen organismos termo-resistentes que pueden crecer a

temperaturas cercanas o incluso superiores a 100ºC en condiciones de alta presión. Son

microorganismos muy importantes desde el punto de vista ambiental; pero no tienen

aplicaciones conocidas en agronomía o en microbiología industrial. [7]

Los microorganismos psicrótrofos pueden ser mesófilos que pueden crecer a

temperaturas bajas. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se


CAPITULO II

II.-22

encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración

(4-8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30-35ºC). [7]

Los microorganismos deben ser cultivados a la temperatura adecuada para que su

crecimiento sea el deseado. En cualquier caso, hay que tener en cuenta los problemas

derivados de las altas temperaturas y tener control en los fermentadores para evitar dañar

los cultivos. Estas temperaturas, por otro lado, tienen interés aplicado en el campo de la

termodestrucción de microorganismos y en algunos procesos de fermentación en los que el

incremento de temperatura que se produce es capaz de eliminar los microorganismos

mesófilos patógenos presentes. [7]

II.2.3.2.3 pH del medio de cultivo

El pH de crecimiento de los microorganismos varía entre 3.0 y 8.0. En forma

general, las bacterias crecen a pH cercanos a la neutralidad (�pH 7.0), con la importante

excepción de las bacterias lácticas que resisten pH ácidos. Por el contrario, la mayoría de

los hongos filamentosos y levaduras prefieren pH ácidos, de alrededor de 5.0. Esta ácido-

tolerancia otorga una ventaja importante a las fermentaciones con hongos, ya que el riesgo

de contaminación bacteriana es bajo. [3]

La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio,

manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante (tabla II.-4).

[7]


CAPITULO II

II.-23

Tabla II.-4: Clasificación de los microorganismos respecto del margen normal de pH a los que crecen. [7]

Tipo de microorganismo Rango de pH óptimo

Neutrófilos 5.5 – 8

Acidófilos 0 – 5

Alcalófilos 8.5 – 11.5

Durante la fermentación, hay producción o consumo de ácido en el medio según el

microorganismo, lo cual produce una variación del pH. Este último es detectado gracias a

un electrodo inmerso en el medio. Este electrodo acciona dos bombas (una con ácido y otra

con álcali) que equilibran constantemente este parámetro. [3]

La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas

modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por

ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el

medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminación de aminoácidos. [7]

Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de

pH (alrededor del óptimo), los cambios bruscos pueden ser nocivos (afectando a la

membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico

disminuye rápidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. [7]

Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pH interior

es un sistema especial: a pH ácidos, el interior celular puede quedar en principio más

alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio.

De esta manera neutralizan, el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana

para establecer una fuerza protón motriz que les suministre energía. [7]


CAPITULO II

II.-24

Si el pH interior disminuye en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S.

typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas

translocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas

celadoras) para evitar las proteínas desnaturalizadas. [7]

Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilos

extremos u obligados). Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T.

ferrooxidans) y las arqueas del género Sulfolobus tienen su óptimo a pH 2, generando ellas

mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta ácido sulfúrico. (Sulfolobus es un notable

ejemplo de procariota extremófilo: su hábitat son fuentes termales ácidas y sulfatadas, en

otras palabras, es un organismo termoacidófilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas

altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y envueltas: a

pH neutro esas envueltas se desintegran. [7]

Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Por

ejemplo, Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos

carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim

gregoryi). [7]

II.2.3.2.4 Nutrientes para el crecimiento

En primer lugar, los microorganismos requerirán de una fuente de carbono de la

cual extraer la energía necesaria para su metabolismo. Las fuentes de carbono más comunes

son los hidratos de carbono, tales como almidón y azúcares. [3]

Durante los años sesenta, algunos hidrocarburos derivados del petróleo fueron

intensamente estudiados como fuentes de carbono de bajo costo. Esta situación cambió

radicalmente en la década del 70, debido al alza del precio del petróleo y hoy en día, por el


CAPITULO II

II.-25

contrario, se investiga la conversión biológica de hidratos de carbono en combustibles. En

la búsqueda de nuevas fuentes de carbonos, se está estudiando, desde hace poco, la

utilización de recursos ligno-celulósicos (pajas de cereales, árboles y sus residuos, etc.),

principal fuente de biomasa renovable. [3]

Muchas de estas fuentes de carbono requieren un tratamiento previo a su utilización;

es el caso, por ejemplo, del almidón que debe ser cocido e hidrolizado hasta glucosa antes

de ser trasformado en etanol por los microorganismos que realizan esta transformación. Es

también el caso de la celulosa y de los substratos ligno-celulósicos en general, los cuales

necesitan drásticos tratamientos físicos y/o químicos antes de ser utilizables con este fin. [3]

Otros elementos que son necesarios como nutrientes en cantidades importantes para

el crecimiento microbiano son el nitrógeno, el fósforo y el azufre. Estos son incorporados

en las moléculas estructurales y funcionales de la célula. El nitrógeno, en particular, debe

ser provisto en proporciones variables bajo la forma de nitrógeno proteico, obtenido a partir

de subproductos de la industria del maíz, extracto de levadura u otros; y no proteico (sales

de amonio, urea, etc.). Los otros dos elementos son aportados como sales de fosfato y

sulfato, respectivamente.

Por último, una serie de micro nutrientes (vitaminas, hierro, cobalto, cobre, zinc,

etc.), deben ser suministrados al medio.

La determinación de varios de estos nutrientes en forma continua durante la

fermentación permitirá en un futuro, espectaculares avances en el control de los procesos.

Esto ha sido posible gracias al reciente desarrollo de sensores o electrodos biológicos

(enzimáticos y microbianos). Esta tecnología, novedosa y específica tiene grandes ventajas

en materia de análisis, tales como respuesta rápida, aplicación en muestras coloreadas, uso


CAPITULO II

II.-26

repetido de los biocatalizadores, etc. El principal problema para su puesta en operación es

la dificultad de esterilizar el biosensor sin inactivarlo. [3]

II.2.3.2.5 Agitación y mezclado

Los dispositivos de aireación en fermentadores suministran a los microorganismos

el oxígeno necesario para su crecimiento. Estos dispositivos implican la agitación del

medio para asegurar la uniformidad de la suspensión microbiana, con objeto de acelerar la

velocidad de intercambio entre los gérmenes y el medio nutritivo y propiciar un contacto

adecuado gas-líquido. [11]

En los procesos aerobios, los fermentadores van equipados con sistemas de

aireación, con objeto de suministrar a los microorganismos el oxígeno necesario para su

crecimiento. Estos utilizan, asimismo, la agitación mecánica asegurando la uniformidad de

la suspensión microbiana y, sobre todo, provocando una mayor subdivisión de las burbujas

de aire, lo que favorece un aumento de la turbulencia del medio y, por lo tanto, un mejor

contacto gas-líquido. Los tipos de agitadores empleados en las industrias de fermentación

son los normalmente denominados rotativos, de hélice, paletas y turbinas. [11]

Los agitadores industriales son mecanismos sencillos destinados a moverse en el

seno de fluidos más o menos viscosos. Por lo general, trabajan sumergidos en el medio que

han de agitar y no producen demasiada alteración en la superficie libre de éste.

Particularmente, las turbinas de aspas planas han demostrado una superioridad indiscutible

en este tipo de procesos y equipan actualmente la mayor parte de los fermentadores

industriales. Estos agitadores, que giran en un plano horizontal, se colocan normalmente

por encima del dispositivo de aireación, que se encuentra situado, a su vez, cerca del fondo

del fermentador. [11]


CAPITULO II

II.-27

Durante los procesos bioquímicos de fermentación, las propiedades reológicas de

los medios de cultivo pueden diferir de las que inicialmente presentaban, debido

fundamentalmente a las variaciones de la concentración celular o también a las estructuras

filamentosas de ciertos micelios formados. [11]

La mayor parte de los medios de cultivo presentan el comportamiento reológico de

los fluidos Newtonianos. Sin embargo, en algunas ocasiones, ciertos medios de

fermentación se caracterizan por un comportamiento no Newtoniano. [11]

II.2.3.2.6 Asepsia

En el medio ambiente existen microorganismos patógenos y/o saprófitos que están

contaminando el aire, agua y suelo y que aprovechan los nutrientes a su alcance para

desarrollarse o permanecer sobre ellos; debido a esto no se puede considerar ningún lugar

libre de microorganismos. Esta situación crea dificultades en los estudios microbiológicos,

pues para estudiar los microorganismos es fundamental tenerlos en cultivos puros. [18]

II.2.4 El medio de cultivo

A los materiales nutritivos suministrados en una forma apropiada para el

crecimiento microbiano se les ha denominado medios de cultivo. [18]

El bajo costo, el rendimiento elevado, la comodidad en la manipulación, la

posibilidad de obtener un suministro continuo durante todo el año, la proximidad al

distribuidor y la pureza son los principales factores que intervienen en la selección del

medio de cultivo. [8]

Los componentes principales de las materias primas son carbohidratos, proteínas y

otros compuestos nitrogenados, fosfatos y otras sales inorgánicas, vitaminas y factores de


CAPITULO II

II.-28

crecimiento. El contenido de carbohidratos determina el rendimiento y en la mayoría de los

casos el valor de la materia prima. Los otros componentes son asimilados o utilizados en

biosíntesis. [8]

Los medios de cultivo pueden ser distribuidos de varias maneras, ya sea en tubos de

ensayo, matraces, placas Petri o botellas, dependiendo del método de inoculación. [18]

Un medio de cultivo puede ser líquido o sólido y debe parecerse lo más posible al

sustrato natural en el cual el microorganismo se desarrolla. Cualquiera sea el medio de

cultivo y la variedad de microorganismo que se desea cultivar, debe incluirse

necesariamente:

a) Agua.

b) Componentes que contengan nitrógeno (proteínas, aminoácidos, sales inorgánicas

que contengan nitrógeno).

c) Fuentes de energía (carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).

d) Factores de crecimiento adicionales.

Los requerimientos nutricionales de las bacterias van desde aquellos simplemente

inorgánicos de los autótrofos hasta los requerimientos de muchas vitaminas y factores de

crecimiento de las bacterias más exigentes. Es difícil obtener un medio capaz de satisfacer a

todos los microorganismos. [18]

Tipos de cultivo:

a) Cultivo en caldo: son cultivos en medios líquidos.

b) Cultivo en medio con agar inclinado: Son los realizados en tubos de ensayo

con unos 6 mL de medio sólido (por ejemplo agar nutritivo), que se han

dejado enfriar en posición inclinada. El inóculo generalmente se extiende

por toda la superficie del medio en forma de zig-zag.


CAPITULO II

II.-29

c) Cultivo por picadura: Los tubos con el medio agar se dejan solidificar en

posición vertical. El medio se inocula introduciendo verticalmente en el

centro del tubo el asa o pipeta cargada con el inóculo.

d) Método de difusión: Se utilizan tubos de ensayo o frascos con medio sólido.

El medio se funde. Se enfría a 45ºC, se inocula, se mezcla rodando el tubo

entre las manos y se deja solidificar en posición vertical, o se vierte en una

placa de Petri. [18]

II.2.4.1 Medios sintéticos

Muchos autores han desarrollado y preparado sus propios medios de cultivos

sintéticos, los cuales contienen en reglas generales agua, azúcares, compuestos

nitrogenados y microconstituyentes necesarios para el desarrollo del microorganismo en

particular. A continuación se presenta una serie de medios de cultivos sintéticos y su

respectivo autor:

Lee y Maddox [42] utilizaron un medio que contenía 50 g/L de lactosa, 5 g/L

peptona, 5 g/L extracto de levadura y 2 g/L de K2HPO4.

Por su parte de Mass y Jansen [43] prepararon un medio con la siguiente

composición 12 g/L K2HPO4.3H2O, 1.75 g/L KH2PO4, 2.9 g/L (NH4)2HPO4, 5.8 g/L

(NH4)2SO4, 13.1 g/L de extracto de levadura, 219 mg/L MgSO4.7H2O, 44 mg/L

FeSO4.7H2O, 8.8 mg/L CaCl2.2H2O, 0.9 mg/L ZnSO4.7H2O, 0.9 mg/L MnSO4.H2O, 44

mg/L EDTA(sal de disodio), 150 mg/L H2SO4 y 50 o 100 g/L glucosa.

Mientras que, el medio de cultivo utilizado por Eiteman y Miller [44]se constituía

por: 10 g/L K2HPO4.3H2O, 2.4 KH2PO4, 7 g/L (NH4)2SO4, 4 g/L (NH4)2HPO4, 0.01 g/L

MgSO4.7H2O, 0.01 g/L MnSO4.H2O, 0.01 g/L FeSO4.7H2O y 5 g/L extracto de levadura.


CAPITULO II

II.-30

Aun cuando existe una gran variedad de medios de cultivos sintéticos enriquecidos,

durante este proyecto se utilizará un desecho de la industria láctea, el suero de leche, el cual

presentará sus características a continuación.

II.2.4.2 Suero de leche

El lactosuero o suero de leche es la fracción líquida de la leche que se separa de la

cuajada durante la fabricación del queso, con una relación aproximada de 9 Kg de suero por

cada Kg de queso producido, los cuales se clasifican en sueros ácidos y dulces: los primeros

proceden de una coagulación láctica de la caseína; mientras que, los sueros dulces se

producen en la coagulación enzimática. [21, 23, 26]

La lactosa, componente presente en mayor concentración, es la principal

responsable de la alta demanda biológica de oxígeno de este efluente, por lo que no puede

eliminarse como vertido de la industria láctea. El volumen de este efluente industrial es el

85% del volumen inicial de leche destinada a la producción quesera. Este subproducto

posee interés industrial derivado de su contenido en lactosa (65-80% en base seca) y

proteínas (9.9-15.5% en base seca). Sin embargo, el principal problema es la recuperación

económica de estos componentes del suero, debido a su elevada dilución. [26]

La composición del lactosuero varía con la calidad de la leche utilizada y con el

proceso de fabricación. Una composición media de ambos tipos de suero se muestra en la

tabla II.- 5 [25]. Cuando se centrifuga el suero, el contenido en grasa disminuye hasta el

0.03-0.05%, lo que hace que pase a tener un contenido muy bajo en vitaminas liposolubles

(A, D y E). [21]


CAPITULO II

II.-31

Tabla II.-5: Composición de sueros dulces y ácidos en (%m/v). [25]

Tipo de suero sin centrifugar

Dulce Ácido

Humedad 93-94 94-95

Grasa 0,3-0,5 0,3-0,6

Proteínas 0,8-1,0 0,8-1,0

Lactosa 4,5-5,0 3,8-4,2

Minerales 0,5-0,7 0,7-0,8

Ácido láctico y otros 0,1 0,1-0,8

Aunque la composición del suero lácteo varía de forma importante según la leche de

origen o el queso fabricado, la composición media de un suero fresco convencional se

resume en la tabla II.- 6. [23]

Tabla II.-6: Composición media del suero de leche. [23]

Componente % base húmeda %base seca

Agua 94,25 -

Proteínas 0,8 13

Lactosa 4,3 75

Grasa 0,1 2

Otros 0,55 10

Las principales proteínas del suero lácteo son �-lactoalbúmina, que se encuentra

sólo en determinadas especies animales, constituyen la fracción más importante de las


CAPITULO II

II.-32

proteínas de la leche humana, y la �-lactoglobulina. Otras proteínas importantes en el suero

lácteo son las inmunoglobulinas. Tradicionalmente, este subproducto no era considerado en

todo su valor debido a la gran cantidad de agua que contiene y, cuando no era vertido, su

uso se limitaba al riego de campos, que de esta forma no requieren de otro tipo de abonos, o

al uso de forraje para animales, fundamentalmente cerdos. [22]

Usualmente, los métodos para el aprovechamiento del lactosuero han tenido

especial énfasis en la recuperación y fraccionamiento de las proteínas mediante procesos de

membranas, lo que significa la recuperación del 15 al 22% de las proteínas totales de la

leche. Industrialmente se procede a la concentración del suero por ultra-filtración, con lo

que se obtiene un permeado libre de proteínas. El concentrado recuperado por ultra-

filtración del suero lácteo contiene �-lactoglobulina (55-60%), �-lactoalbúmina (15-25%) y

seroproteínas (10%). Este producto contiene un alto valor debido a sus excelentes

propiedades funcionales y nutricionales, y tiene ya un mercado definido. [26]

Algunas industrias tratan el efluente de suero a través de una etapa de ultra-

filtración, sin embargo, el permeado de la etapa de ultra-filtración mantiene inalterada la

carga contaminante del suero, por lo que la separación de las proteínas no es una solución

al problema del tratamiento de efluentes, sino una forma de rentabilizar un subproducto.

Una alternativa de utilización del permeado son los procesos de bajo costo, entre los que se

incluyen la alimentación de ganado, su uso como fertilizante y el secado para su empleo en

productos alimentarios. [26]

El lactosuero es un producto de gran interés no solo a su alto contenido en lactosa y

en proteínas solubles ricas en aminoácidos indispensables (lisina y triptófano), así como por

la presencia de numerosas vitaminas del grupo B (tiamina, ácido pantoténico, riboflavina,


CAPITULO II

II.-33

piridoxina, ácido nicotínico y cobalamina) y ácido ascórbico. Sin embargo, su alto

contenido en sales minerales limita en algunos casos su consumo en bruto. [21]

Del suero pueden obtenerse gran cantidad de productos, algunos de los cuales se

muestran en la figura II.-4. [24]

Figura II.-4: Algunos procesos y productos asociados con la utilización del suero. [24]

Normalmente el suero no va a ser procesado en la propia industria quesera, sino que

tiene que ser transportado hasta una central, donde los procesos de concentración y

deshidratación se realizarán en plantas a gran escala de evaporación y secado,

disminuyendo así los costos. [21]

Otro de los inconvenientes del suero es su elevada concentración en sales minerales.

La desmineralización se realiza según las técnicas de electrodiálisis, ósmosis inversa y

resinas cambiadoras de iones. [21]

SUERO

Pasteurización Concentración Fermentación

Crema suero

Suero pasteurizado dulce

Proteínas de suero

Suero seco

Suero conden

d

Suero condensado dulce

Riboflavina

Alcohol etílico

Ácido láctico

Goma Xanthan

Mantequilla

Bebidas

Lactosa

Hidrolizados de proteína

Sopas Quesos

Fabricacion de queso

Piensos

Bombones

Panade ría

Alimentacion infantil

Jarabes hidrolizados

Píldoras

Riboflavina concentra

Alcohol butílico, acetona

Acido acético

Acidulantes alimentarios

Resinas, recubrimiento Curtidos


CAPITULO II

II.-34

El suero desmineralizado en polvo tiene en alimentación humana aplicaciones

variadas. En panadería añadiendo 2% de suero en polvo a la harina se producen mejoras en

el pan. El suero en polvo puede también ser usado en pasteles y galletas. Puede añadirse a

los zumos de frutas para aumentar su contenido en proteínas. [21]

Suero desmineralizado parcialmente por electrodiálisis, al que se añade grasa,

permite obtener leches maternales por aproximarse mucho a la de la leche materna. [21]

Las proteínas del lactosuero son de excepcional calidad por no ser deficientes en

ningún aminoácido. Tienen un elevado contenido de lisina (11% en �-lactoglobulina y 10-

11% en �-lactoalbúmina) lo que hace que sean un complemento ideal para la ración de

cualquier organismo en crecimiento. Desde el punto de vista nutricional tiene un valor

biológico superior a la caseína; su extracción es de gran interés (proteínas). [21]

La lactosa es un disacárido formado por los monosacáridos glucosa y galactosa. En

la industria farmacéutica se utiliza la lactosa por ser uno de los glúcidos más adecuados

para preparar medios fermentativos para el desarrollo de mohos productores de antibióticos.

También se utilizan grandes cantidades de lactosa refinada en la preparación de numerosos

medicamentos. En la industria alimentaria se utiliza añadiéndola a algunas pastas en

panadería y pastelería. En la fabricación de patatas fritas se sumergen éstas en una

disolución de lactosa para mejorar y regularizar el color tras la cocción. En la preparación

de alimentos dietéticos y para niños se utiliza lactosa muy pura, por constituír una fuente de

galactosa. [21]

La lactosa tiene un pobre poder edulcorante y limitada solubilidad que puede ser

mejorada por su hidrólisis a cantidades equimoleculares de los monosacáridos. Esta

hidrólisis puede ser llevada a cabo por procesos de catálisis ácida y enzimática. La

selección del método apropiado dependiendo de la naturaleza del sustrato, uso del producto,


CAPITULO II

II.-35

necesidad de condiciones sanitarias y costos de inversión y producción, fueron estudiados

por Gekas. [19]

El lactosuero constituye un excelente medio de cultivo principalmente para aquellos

microorganismos capaces de metabolizar la lactosa para producir proteínas, a las que se le

conoce como lacto-proteínas. [21]

El suero puede someterse a diversos procesos fermentativos conducentes a la

obtención de ácidos, alcoholes, enzimas, vitaminas, bebidas alcohólicas, etc. Algunas de

estas fermentaciones han encontrado aplicaciones industriales, mientras que otras no han

pasado de la fase experimental. [21]

II.2.4.3 Preparación del medio de cultivo para una fermentación

Casi todas las materias primas tienen que someterse, antes de exponerlas a la acción

microbiana, a tratamientos físicos y químicos para obtener un substrato apropiado para el

organismo y que se adapte a las condiciones del tratamiento. La clarificación es, a menudo,

necesaria para obtener líquidos completamente transparentes; se realiza agregando una

pequeña cantidad de un material insoluble y de mucha superficie o produciendo un

precipitado. El ajuste de pH del substrato a un valor óptimo inicial antes de la inoculación

de los microorganismos es una parte de la preparación de las materias primas. El pH inicial

óptimo depende de la especie de organismo usado, de la reacción deseada y de las

condiciones del proceso. [8]

La temperatura inicial óptima depende de factores análogos a los que controlan el

pH. Aunque la mayoría de los organismos toleran rangos de temperatura amplios, existen

intervalos óptimos, tanto para el crecimiento como para la acción enzimática. Con

frecuencia son idénticos o están muy próximos. [8]


CAPITULO II

II.-36

Algunos procesos exigen la esterilización completa o parcial de la materia prima. La

esterilización completa suele efectuarse durante la preparación del material o después de

ella, calentando la sustancia en un autoclave a una temperatura a la cual se destruyan todos

los microorganismos. Las soluciones transparentes, en las cuales es buena la transmisión de

calor, se esterilizan con relativa facilidad. Suelen ser suficientes 15 minutos a 120 ºC. [8]

La esterilización parcial de la materia prima se realiza exponiéndola a 80-100 ºC,

temperatura a la cual mueren las células vegetativas de todos los organismos. En la

pasteurización, que suele aplicarse a la leche y la crema, se expone la sustancia al calor

mínimo suficiente para destruir todas las bacterias patógenas; 60ºC durante 20-30 minutos

o bien 80-85 ºC durante un minuto, o menos, son las temperaturas comúnmente usadas. [8]

II.2.5 Preparación del inóculo e inoculación

El inóculo es cualquier cantidad de organismos vivos, con o sin el medio en el cual

se desarrollan, que sirve como iniciador para un substrato recientemente preparado. Los

organismos proliferarán en el seno del substrato en la superficie del mismo y catalizarán un

cambio bioquímico deseado. [8]

Los inóculos tienen que poder propagarse rápidamente y completar la acción

microbiana deseada en un tiempo limitado. Se preparan de muchas maneras y de diferentes

tipos. [8]

Es esencial usar una técnica aséptica durante la inoculación y manejo en el

laboratorio. La transferencia de los cultivos puede hacerse mediante un asa (alambre de

cromo- níquel o de platino) o una pipeta Pasteur. La esterilización se hace a la llama de un

mechero y enfriado antes de entrar en contacto con el crecimiento microbiano. Los tapones

de algodón de los tubos deben tomarse sólo por la superficie que queda por fuera del tubo,


CAPITULO II

II.-37

procurando que la parte que va en el interior no se contamine. La boca del tubo o matraz

debe flamearse momentáneamente después de destaparse y de nuevo inmediatamente antes

de volver a poner el tapón. Para reducir al mínimo el peligro de contaminación del tubo, se

mantiene en posición inclinada próximo a la llama del mechero y trabajarse con rapidez. [18]

II.2.6 El equipo. Bio-reactores. Componentes principales y características.

Un fermentador es un recipiente de vidrio o acero inoxidable si el uso es

farmacéutico, o de material menos noble, como acero al carbono, en el caso de aplicaciones

menos exigentes en pureza. Por lo general, el reservorio tiene una altura 2.5 a 4 veces

superior a su diámetro, y en función de la aplicación, su volumen varía entre 1.000-10.000 l

en el caso de un producto farmacéutico, a 1.500.000 l. [3]

El tamaño del biorreactor a utilizar depende del proceso de producción y de como

éste va a operar. Los fermentadores modernos son cilindros verticales, cerrados, con fondo

cónico o cóncavo, y están provistos de controladores automáticos los cuales regulan la

temperatura, la agitación y la aireación y medios para la esterilización automática con vapor

[13].

Para el cultivo de los microorganismos en procesos industriales a menudo se utilizan

fermentadores, como el mostrado en la figura II.-5, con agitación especialmente diseñados,

que pueden funcionar en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. La adición de nutrientes, el

muestreo y la vigilancia de la fermentación pueden realizarse en condiciones de asepsia. [9]

Con equipos a gran escala es muy difícil el proceso de transferencia de oxígeno

desde el gas al líquido y se deben tomar las precauciones para asegurar una aireación

adecuada. Para lograr este efecto de manera controlada se utilizan dos instrumentos

separados: un dispositivo de aireación llamado difusor y uno de mezclado llamado


CAPITULO II

II.-38

impulsor. El difusor es un instrumento con una serie de agujeros en un aro de metal o una

boquilla, a través de los cuales se puede hacer pasar aire hasta el fermentador, esterilizado

por filtración, a gran presión. El aire entra al biorreactor en forma de pequeñas burbujas, a

partir de las cuales el oxígeno pasa, por difusión hacia el líquido. Un buen sistema de

distribución debe asegurar que las burbujas sean tan pequeñas que el paso del oxígeno al

líquido se haga fácilmente.

A continuación se presenta el esquema explicativo de un bio-reactor industrial en la

figura II.-5.

Figura II.-5: Esquema de un fermentador ilustrando su construcción y los dispositivos para la aireación y

procesos de control. [13]


CAPITULO II

II.-39

En los fermentadores pequeños, el uso de un solo difusor puede ser suficiente para

asegurar una adecuada aireación, pero en los fermentadores de tamaño industrial, el agitado

del fermentador con una rueda de paletas es esencial. El agitado cumple dos funciones:

mezcla las burbujas del gas por todo el líquido y mezcla los organismos por todo el líquido,

asegurando de este modo el acceso uniforme de todas las células microbianas a los

nutrientes. Uno de los agitadores más corrientes es una lámina plana o un disco plano unido

a un eje central, que gira a gran velocidad al girar el eje unido a un motor. Con el fin de

asegurar el máximo de mezclado gracias al impulsor, suelen instalarse deflectores

verticalmente a lo largo del diámetro interno del biorreactor. Al ser revuelto por el

impulsor, el líquido pasa al lado de las placas dispersadoras y de este modo se rompen en

fragmentos más pequeños. [13]

Los bio-reactores en general, deben cumplir con una variedad de parámetros y

características para tener un óptimo desarrollo de sus funciones. Entre las características

más importantes se encuentran: capacidad de operar de manera aséptica, agitación y

aireación adecuadas, bajo consumo de potencia, control de temperatura y pH, facilidad para

toma de muestras, pérdidas por evaporación mínimas, bajo mantenimiento, flexibilidad,

ensamblaje por soldaduras y fácil escalado.

II.2.6.1 Bio-reactores. Clasificación

Existen diferentes formas de clasificar a los bio-reactores. La clasificación más

utilizada para los reactores en general, se basa en la manera en que el flujo de reactantes

atraviesa al equipo para lograr la reacción. Existen tres formas distintas: flujo continuo,

flujo discontinuo y, flujo semi continuo. También se utiliza una clasificación específica


CAPITULO II

II.-40

para los biorreactores o fermentadores para procesos aeróbicos, los cuales son: estanques

aireados agitados, reactores tubulares (air-1ift), estanques a recirculación.

A continuación se desarrollan cada uno de los diferentes tipos de bio-reactores.

II.2.6.1.1 Bio-reactores según la manera en que los reactantes atraviesan el equipo.

II.2.6.1.1.1 Bio-reactores de flujo continuo

Para estos equipos siempre es posible visualizar una entrada de reactantes del que se

alimentan y una salida de productos. Los biorreactores que operan a flujo continuo también

lo hacen en estado estacionario. Existen dos tipos de reactores que operan a flujo continuo:

los reactores tubulares (RP) y los reactores agitados permanentemente (RAP).

El reactor tipo tanque agitado permanentemente (RAP) se usa cuando se requiere

una agitación intensa. Este, puede usarse solo o en una batería de RAP en serie. Se emplean

reactores continuos agitados permanentemente para obtener mayores producciones, siempre

y cuando el tiempo de reacción sea razonablemente corto, cuando se desea que la

temperatura sea uniforme dentro del reactor y, cuando la mano de obra es cara. En el caso

de reacciones en fase líquida, que operan en estado estacionario, los caudales de las

corrientes de entrada y de salida permanecen constantes, por lo que nivel de líquido dentro

del tanque es fijo. Su única desventaja radica en que la conversión de reactantes es más baja

en comparación a los reactores de flujo tubular. [20].

A continuación, en la figura II.-6, se presenta un esquema general de un reactor

agitado permanentemente.


CAPITULO II

II.-41

Figura II.-6: Diagrama general de un reactor agitado permanentemente. [14]

Los reactores de flujo tubular (RP) operan en continuo y se caracterizan por la

aparición de gradientes de concentración en la dirección del flujo, aproximándose a la

suposición de flujo pistón, en contraposición con los gradientes escalonados típicos de las

baterías de RAP. Los reactores tubulares pueden estar constituidos por varias tuberías o

tubos en paralelo, donde los reactivos se alimentan de forma continua por un extremo y los

productos se recogen de forma continua por el otro. [14] Las reacciones en fase gaseosa, que

precisan una producción en continuo, se llevan a cabo, preferentemente, en tales unidades

de reacción, así como también se emplean para muchos procesos en fase líquida. Los

tiempos de reacción son generalmente cortos; siendo este hecho más factible con el empleo

de temperaturas elevadas. Los reactores tubulares operan a presión casi constante. El

reactor tubular es de fácil mantenimiento y produce la conversión más alta por volumen de

reactor de cualquiera de los reactores de flujo. La desventaja radica en su dificultad para


CAPITULO II

II.-42

controlar la temperatura dentro del reactor, y pueden formarse puntos calientes cuando la

reacción producida es exotérmica. [20]

Los reactores de lecho fijo son una modificación al reactor RP. Son tubos

empacados con catalizador y se usa específicamente para reacciones en fase gas. En su

interior tendrán lugar la formación de gradientes de composición y temperatura en las

direcciones radial y axial, por lo cual tiene problemas para el control de la temperatura, así

como para el reemplazo del catalizador. Cuando ocurre un acanalamiento del gas, se hace

inefectivo el uso de una parte del lecho catalítico. La ventaja de este tipo de reactor es que

en la mayoría de las reacciones se obtienen altas conversiones por peso de catalizador. [20]

La fermentación en continuo puede llevarse a la práctica fundamentalmente de dos

formas diferentes:

a. En una sola etapa: el cultivo se realiza en un fermentador en régimen

estacionario, alimentándose el tanque agitado con el medio nutritivo

y con los microorganismos, con un caudal idéntico al de la corriente

efluente, constituida por mezcla de productos obtenidos y micro-

organismos arrastrados en la misma.

b. En varias etapas: el cultivo se realiza en una serie de fermentadores

dispuestos en cascada o en serie. El alimento fresco se introduce en

el primer tanque agitado y los distintos efluentes se envían,

respectivamente, a cada uno de los restantes reactores.[27]

II.2.6.1.1.2 Bio-reactores de flujo discontinuo

En un reactor discontinuo, también conocido como reactor Batch, todos los

reactantes se mezclan inicialmente en el reactor y, una vez puesto en marcha, la


CAPITULO II

II.-43

concentración de los reactantes varía con el tiempo, pero en cualquier momento ésta puede

considerarse uniforme para todo el sistema. La agitación proporciona la mezcla de las

especies alimentadas, que inicialmente estaban separadas y además facilita la transferencia

de calor. [20]

Los reactores discontinuos son tanques que normalmente van provistos de sistemas

de agitación y de sistemas de intercambio de calor para mantener la temperatura de

reacción dentro de un intervalo deseable (Figura II.-7). Estos reactores son adecuados,

principalmente, para llevar a cabo reacciones relativamente lentas de varias horas de

duración, en los que, además, hay que tener en cuenta el tiempo muerto para llenar, vaciar y

acondicionar las materias primas y que en los equipos grandes pueden llegar a ser alrededor

de una hora. La agitación mantiene la uniformidad de la masa de reacción y favorece la

transmisión de calor. En general, estos reactores operan en fase líquida. [20]

Figura II.-7: Diagrama general de un reactor de flujo discontinuo [14].


CAPITULO II

II.-44

Los reactores discontinuos son muy empleados en la práctica debido a su

flexibilidad con respecto al tiempo de reacción, a los tipos de reacciones y al número de

reacciones que son capaces de procesar, aunque su principal uso son para operaciones a

pequeña escala. Tienen la ventaja de obtener altas conversiones que pueden lograrse

dejando los reactivos dentro del reactor por largos períodos de tiempo. Las desventajas son

sus altos costos de operación por unidad de producción y la dificultad de obtener

producción a gran escala.

II.2.6.1.1.3 Bio-reactores de flujo semi continuo

Las operaciones que se conocen como semi continuo o en semi Batch pueden

llevarse a cabo en uno o varios tanques agitados. Algunos reactivos se alimentan a los

reactores como una sola carga y los restantes se alimentan posteriormente, de forma

gradual. Este método de operación está especialmente indicado en sistemas de reacción en

los que se producen grandes variaciones de calor y cuando la capacidad de transmisión de

calor es limitada, empleándose la limitación de las de las concentraciones de algunos

reactivos para controlar la velocidad de reacción, de manera que sea posible disminuir la

velocidad de generación de calor en el caso de reacciones exotérmicas y mantener la

velocidad de consumo de calor, cuando se trate de reacciones endotérmicas. Otras

situaciones que hacen aconsejables esta clase de funcionamiento se plantean cuando la

presencia de altas concentraciones puede influir sobre la formación de productos colaterales

indeseables, o cuando uno de los reactivos es un gas de solubilidad limitada, de forma que

sólo pueda alimentarse en función de su solubilidad [14].

El reactor semi Batch tiene las mismas desventajas que el reactor Batch; sin

embargo, entre sus ventajas se encuentran el buen control de temperatura y su capacidad de


CAPITULO II

II.-45

minimizar las reacciones laterales como se explicó con anterioridad. Este equipo se usa

generalmente para reacciones que se producen en dos fases, en el cual el gas se burbujea

continuamente a través del líquido.

II.2.6.1.2 Bio-reactores según la forma de agitación

II.2.6.1.2.1 Bio-reactores aireados agitados

Estos son los más tradicionales y tuvieron un gran desarrollo durante los años 50 y

se usan para la producción de antibióticos como la penicilina a escala industrial. El diseño

implementado en aquella época se ha mantenido hasta hoy, a pesar que se han efectuado

varias modificaciones importantes, en particular en el sistema de agitación. [3]

El fermentador agitado consiste en un cilindro vertical que posee varios deflectores

para prevenir la formación de un torbellino durante la agitación. El aire estéril penetra por

la base del reservorio, a través de un distribuidor circular. El eje vertical lleva una o varias

hélices en función de la relación altura/diámetro como se muestra en la figura II.-8. En los

últimos veinte años, varias compañías han modificado los agitadores de sus fermentadores,

con el fin de disminuir los gastos en energía de agitación. [3]

A pesar de que este modelo de fermentador no es el más económico de instalar ni de

operar, sigue siendo el más utilizado desde los últimos treinta años. La razón de su éxito

reside en su gran versatilidad para ser usado a cualquier escala de producción y para un

gran número de procesos sin modificaciones del diseño. Por lo tanto, los costos

relativamente elevados de inversión y operación se encuentran compensados por su

flexibilidad. [3]


CAPITULO II

II.-46

Figura II.-8: Tanques agitados. El mezclado se realiza mecánicamente. [4]

El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que

posee pequeños orificios espaciados regularmente. [4]

El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina

inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales

difunde el O2 hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o

seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que

imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor

mezclado. [4]

II.2.6.1.2.2 Biorreactores tubulares tipo air-lift

Se trata de un reactor en forma de torre o columna, en el cual el aire es introducido

en la base del tubo, y la ascensión de las burbujas de aire constituye el único tipo de

agitación existente. [3,17] Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base


CAPITULO II

II.-47

de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una

circulación de líquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo,

lo que favorece el mezclado (Figura II.-9). Su desventaja radica en que generan demasiada

espuma. [4,17]

A pesar de que el modelo agitado permite concentraciones superiores de biomasa, el

fermentador tubular, por su simplicidad y costos inferiores de energía, mantenimiento e

instalación, es preferido en algunos procesos al anterior. Estos fermentadores son utilizados

en la producción de cerveza, vinagre y ácido cítrico. [3,17]

Figura II.-9: Esquema de un biorreactor del tipo air-lift. El mezclado se realiza mediante inyección

de aire. [4]

II.2.6.1.2.3 Bio-reactores a recirculación

Todos los fermentadores de este tipo tienen en común el flujo del medio de cultivo

en una dirección definida. Esto se ha logrado gracias a la incorporación de tubos de

aspiración en el diseño, lo cual permite una recirculación interna del fluido, o por el uso de

un conducto de recirculación, el que permite una recirculación externa. [3]


CAPITULO II

II.-48

La fuerza motora se desarrolla por el efecto de ascensión de las burbujas de aire

(air-lift) o por un sistema de flujo hidrodinámico. Existe gran polémica sobre las virtudes

de este tipo de sistema, el cual para muchos, es tan eficiente a más que el tanque agitado

con respecto a la transferencia de masa, y con una economía sustancial de energía. [3]

Este sistema es usado, por ejemplo, por la compañía ICI (Imperial Chemical

Industries) de Inglaterra, para producir proteína unicelular en un fermentador de 1.500.000

l. Este tipo de fermentadores ha producido un interés creciente por la reducción en los

costos de producción. Sin embargo, no se conocen bien aún los problemas en la síntesis de

un producto que pueden derivar de las fluctuaciones ambientales a las que es sometido un

microorganismo en este tipo de fermentadores por la falta de agitación. Por lo tanto, el

desarrollo de la investigación en este sentido es indispensable. [3]

II.2.7 Variables importantes a ser controladas durante el proceso de fermentación

Las actividades asociadas con los reactores biológicos incluyen el contacto gas-

líquido, la detección de concentraciones en línea, el mezclado, la transferencia de calor, el

control de la espuma, y la alimentación de nutrientes y los reactivos tales como los

necesarios para controlar el pH.

Es posible identificar un número elevado de variables que influyen sobre el diseño y

el funcionamiento de un reactor químico con transmisión de calor, a partir del tamaño y del

tipo de reactor; de la distribución del catalizador en los lechos si éstos existen, de su

clasificación según su tamaño y porosidad; de la geometría de la superficie a través de la

cual tiene lugar la transmisión de calor; así como del diámetro del tubo, de su longitud,

entre otros. La experiencia, sin embargo, ha demostrado que la temperatura del reactor, el

pH del medio de cultivo y la concentración del oxígeno en la solución, son las variables


CAPITULO II

II.-49

primarias; la composición y el caudal de alimentación tienen una importancia secundaria; y

las características geométricas del catalizador, si existen, y los equipos auxiliares de

transmisión de calor son factores terciarios. A continuación se desglosará el efecto directo e

intrínseco de cada variable durante el proceso de fermentación y las razones por la cual es

un parámetro importante a controlar durante el proceso de fermentación.

II.2.7.1 Concentración de oxígeno

En los procesos aeróbicos típicos es indispensable la presencia de aire mientras que

en los procesos anaerobicos es imperativa la ausencia de aire. [8]

Uno de los factores críticos durante el control de un proceso de fermentación es el

suministro de oxígeno adecuado. Debido a que el oxígeno es un gas poco soluble en

líquidos y menos en soluciones, se hace necesario mantener un alto burbujeo del gas a

través del sustrato para lograr que el microorganismo mantenga una respiración sin

impedimentos.

Según las necesidades específicas, el aire puede suministrarse de varias maneras. La

más sencilla es por contacto superficial: el líquido o la masa húmeda de substrato, con

preferencia en capas delgadas, se expone a la acción de la atmósfera. En la escala

laboratorio es conveniente airear un gran número de matraces que contienen pequeñas

cantidades de líquido, agitándolos constantemente por medio de un agitador. De esta

manera, se consigue una aireación uniforme en cada matraz. [8]

El método de aireación más empleado es hacer burbujear aire a través del substrato

líquido. Puesto que la superficie de las burbujas y el tiempo de contacto son los principales

factores en una aireación eficaz, se han ideado diversos dispositivos para distribuír el aire


CAPITULO II

II.-50

en forma de burbujas del tamaño más pequeño posible y mantenerlas flotando en el líquido

el mayor tiempo posible. [8]

La cantidad de aire necesaria en un proceso se expresa en volumen de aire por

volumen de líquido y por minuto. La cantidad de aire que necesita un proceso varía según

el tamaño de las burbujas y según la altura del nivel del líquido. Se necesita de diez a

cincuenta veces más aire en forma de burbujas grandes que en forma de burbujas finamente

distribuidas. [8]

II.2.7.2 Temperatura

La temperatura es otro de los parámetros fundamentales a controlar en un proceso

de fermentación. Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima

tendrán un crecimiento retardado produciendo una disminución de la conversión esperada.

Por el contrario, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una

respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares

que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. A fin de

obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen

estrecho de temperatura y de ser posible constante. La velocidad de producción de calor

debida a la agitación y a la actividad metabólica no se ve compensada por las pérdidas de

calor que resultan de la evaporación, por lo que se debe recurrir a sistemas de refrigeración

como las chaquetas de agua.

Se puede operar con sólo camisa de enfriamiento, pero si se aumenta la escala es

necesario usar serpentines.


CAPITULO II

II.-51

II.2.7.3 pH:

La mayoría de los microorganismos crecen óptimamente entre un intervalo de pH de

5.5 a 8.5; sin embargo, durante el período de crecimiento en un fermentador, los

metabolitos celulares son liberados al medio, lo cual acarrea una variación en el pH del

medio de cultivo. Por lo tanto, para mantener el pH del medio de cultivo constante se añade

un ácido o una base al medio en los momentos que sean necesarios, mezclándose

rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el bio-

reactor.

II.2.7.4 Agitación y mezclado:

La agitación es la operación que acelera el contacto entre las fases que se

encuentran dentro del biorreactor. Una fermentación microbiana puede ser considerada

como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-

líquido. La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. La fase sólida

consiste en células individuales, burbujas de micelio, sustratos insolubles o productos del

metabolismo que precipitan. La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro

continuo de oxígeno, para la eliminación del dióxido de carbono para el ajuste del pH con

amonio gaseoso. Una adecuada agitación del cultivo microbiano es esencial para la

fermentación ya que produce los siguientes efectos: dispersión del aire en la solución de

nutrientes, homogeneización para la temperatura, el pH y la concentración de nutrientes en

todo el equipo, suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos y dispersión

de los líquidos inmiscibles, si existen. Bajo estas premisas se hace notar que cuanto mayor

sea la agitación mejor será el crecimiento microbiano; sin embargo, la agitación excesiva


CAPITULO II

II.-52

puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo cual ocasiona un descenso

en la viabilidad celular, por lo tanto se debe conseguir un balance entre la necesidad de

mezclado evitando el daño celular. Generalmente, se utilizan agitadores rotativos los cuales

tienen un sistema interno mecánico de agitación ya que éstos son más flexibles en las

condiciones de operación, son más comerciales, proveen de una eficiente transferencia de

gases a las células y se tiene mayor experiencia en cualquier escala. En la figura II.-10 se

muestra de manera gráfica el efecto de la agitación en un biorreactor.

Figura II.-10: Comparación de patrones de flujo en bio-reactores con y sin deflectores. (A) Tanque sin

deflectores (se forman vórtices). (B) Tanque con deflectores (no se forman vórtice). [15]

II.2.7.5 Asepsia

La tecnología microbiana es única, en el sentido de que requiere que los procesos

sean operados sin contaminación biológica. No existe un método cuantitativo seguro y

confiable para medir la concentración de contaminantes en un sistema debido a que los

contaminantes individuales varían mucho en su efecto potencial. Un proceso típico de

fermentación es susceptible de contaminarse por el medio, el inóculo y el proceso de


CAPITULO II

II.-53

inoculación, el suministro de aire, la adición de nutrientes, antiespumantes y otros aditivos

durante el proceso, y el fermentador en sí mismo. En la práctica, la contaminación ocurre

principalmente por un diseño defectuoso de los sellos del reactor o durante las técnicas de

transferencia ya sea del inóculo, aditivos u otros

II.2.8 Transferencia de masa en un biorreactor

El término fermentación distinguía antiguamente a los procesos en los cuales el

oxígeno estaba ausente, pero en la actualidad el término se ha extendido a los procesos

aerobios. En algunas fermentaciones aerobias, aportar la cantidad suficiente de oxígeno

puede ser un problema difícil de resolver. El oxígeno es escasamente soluble en agua; la

saturación con aire presurizado a temperatura ambiente solo proporciona 6 a 7 miligramos

de oxígeno por litro. [14]

Como se explicó anteriormente, en los procesos de fermentación aeróbicos es

necesario un suministro adecuado de oxígeno que satisfaga los requerimientos metabólicos

de los organismos empleados. La oxidación de la fuente de carbono y su transformación en

células, productos y CO2 establece una demanda que es necesario satisfacer a través de la

aireación y la agitación del cultivo. [15]

Para conocer los requerimientos de oxígeno en un proceso de fermentación

cualquiera, se hace necesario calcular las resistencias a la transferencia que encuentra el

oxígeno para llegar a la célula. Estas resistencias a la transferencia son: transferencia

difusional del oxígeno a través de la película de gas y líquido que rodea las burbujas de

aire, el camino de las burbujas a través de la solución y a través de la película que rodea la

célula y la reacción bioquímica intracelular. Se ha demostrado que la mayor resistencia la

opone la película del líquido que rodea las burbujas siempre y cuando la célula sea un


CAPITULO II

II.-54

organismo unicelular; en caso contrario, la mayor resistencia es impuesta por la difusión a

través del agregado mismo. [15]

La velocidad de transferencia de masa viene dada por la siguiente expresión:

Velocidad de transferencia = coeficiente de transferencia *área*fuerza directriz

Debido a que el número y tamaños de burbuja es algo difícil de estimar, el área de

transferencia se suele incorporar con el coeficiente de transferencia de materia con un

término aKl . El subíndice l significa que la resistencia de la película líquida debería

predominar claramente para un gas escasamente soluble tal como el oxígeno.

La fuerza directriz viene dada por el gradiente de concentración entre la interfase

gas-líquido, la cual se asemeja a la solubilidad y la concentración de oxígeno en el seno del

líquido. Sustituyendo todos los parámetros en la expresión anterior, se obtiene:

� �LgL CCaKOTR �� ** (Ec. 1)

De esta manera se representa de manera cuantitativa la transferencia de oxígeno del

sistema de aireación. [15].

Sin embargo, antes de estudiar cualquier método de cálculo para la obtención del

coeficiente de transferencia de oxígeno, es importante definir el término demanda de

oxígeno. Cuando la velocidad de un proceso está limitada por la concentración de oxígeno,

la tasa específica de respiración )( 2Qo también aumenta rápidamente con la concentración

de oxígeno disuelto, hasta que se alcanza una asíntota. La concentración por debajo de la

cual la respiración está fuertemente limitada se llama concentración crítica de oxígeno, la

cual varía típicamente entre 0.5 y 2 ppm para bacterias, levaduras y mohos bien dispersados

que crecen entre 20 y 30 ºC. Por encima de la concentración crítica, la absorción específica


CAPITULO II

II.-55

de oxígeno aumenta sólo débilmente con el incremento de la concentración de oxígeno. La

fórmula que describe el proceso es:

g

M

YXXQoXQo **)(

* 22

�� (Ec. 2)

Donde:

X : Concentración del organismo, M: como subíndice significa mantenimiento, gY :

Rendimiento de masa celular por masa de oxígeno y Q: tasas de absorción de oxígeno en

mas de 2O por masa de organismos.

Este tipo de correlación se aplica a casi cualquier sustrato implicado en el

metabolismo energético celular y está sustentada por datos experimentales y

consideraciones energéticas. Sin embargo, está basado en suposiciones válidas en o

próximas a las condiciones de equilibrio en estado estacionario, y puede no ser válido

durante los estados de transición.

Si la demanda de oxígeno supera las posibilidades de suministro del mismo (OTR)

el crecimiento se realiza bajo limitación de oxígeno; por lo cual, el comportamiento se

vuelve lineal en lugar de exponencial.

II.2.8.1 Resistencias que se oponen a la transferencia de masa

Las resistencias están determinadas por los obstáculos que se oponen a la

transferencia. Estas son:

1. En la película gaseosa (para gases muy solubles).

2. En la interfase gas-líquido.

3. En la película líquida (para gases poco solubles).


CAPITULO II

II.-56

4. En el seno del líquido.

5. En la película líquida que rodea al sólido.

6. En la interfase sólido-líquido.

7. En la fase sólida conteniendo las células.

8. En los sitios de la reacción bioquímica.

II.2.8.2 Transferencia de oxígeno en procesos fermentativos

La demanda de oxígeno debe ser satisfecha mediante el suficiente suministro de

oxígeno contenido en el aire. El medio usual de airear es por burbujeo de aire en el medio

de cultivo. En esta situación, para que las células reciban oxígeno contenido en las

burbujas, éste se debe difundir en el gas hasta la interfase gas-líquido, luego debe disolverse

en el medio de cultivo y ser transportado como oxígeno disuelto hasta la superficie de la

célula, tal como se muestra esquemáticamente en la figura II.-11. [28]

Figura II.-11: Representación esquemática de los mecanismos de transferencia de oxígeno. [28]

Los diversos procesos de transporte mencionados pueden ser llevados a cabo cada

uno a una determinada velocidad, pero el proceso global se realizará a la velocidad del paso

más lento, o limitante. Se ha determinado que el paso limitante en la aireación de


CAPITULO II

II.-57

fermentaciones es el paso del oxígeno del gas al líquido. En la figura II.-12 se puede

apreciar la situación en la interfase gas-líquido. [28]

Figura II.12: Perfil de presiones parciales y concentraciones de oxígeno alrededor de la interfase

gas-líquido. [28]

II.2.8.3 Factores que afectan el coeficiente de transferencia de oxígeno

1. Agitación:

Aumenta el área de intercambio por ruptura de las burbujas aumenta el aK L

Disminuye el espesor de la película aumenta el aK L

Aireación: aumenta el número de burbujas aumenta el aK L

2. Temperatura: afecta el coeficiente de difusión y la solubilidad.

3. Viscosidad: a mayor viscosidad, mayor resistencia a la transferencia y aumenta

el aK L .


CAPITULO II

II.-58

4. Tensoactivos: afectan el área de transferencia y el efecto global depende de la

concentración. Si aumenta la concentración aumenta la resistencia de la película y

disminuye el aK L

5. Fuerza iónica: disminuye la solubilidad disminuyendo así el aK L .

6. Sustancias orgánicas: anti-espumantes, peptonas, micelios y biomasa disminuyen el

aK L , mientras que, los alcoholes, cetonas y ésteres lo aumentan.

7. Configuración del biorreactor.

8. Las propiedades físicas del sistema gas-líquido.

II.3 Escalado en biorreactores

Durante el desarrollo de cualquier proceso biotecnológico pueden considerarse tres

escalas de operación: laboratorio, planta piloto e industrial. En el laboratorio se llevan a

cabo experimentos en biorreactores generalmente de vidrio con volúmenes pequeños de 5 a

10 L de capacidad. Las investigaciones en este nivel permiten evaluar el proceso para saber

si realmente se trata de la creación de un nuevo producto o proceso, interesante para ser

llevado a una escala mayor. Entre estos estudios están el aislamiento y selección de cepas,

su preservación y mejoramiento genético, la formulación de medios de cultivo y el

conocimiento de reguladores y las condiciones ambientales que determinan la producción

del compuesto en cuestión. [13]

En la escala piloto, los experimentos se efectúan con volúmenes mayores a los de

trabajo en el laboratorio y se emplean equipos que son la versión miniaturizada de los que

existen a nivel industrial. Trabajar en esta escala es muy similar a la operación de una

planta industrial y resulta indispensable para los procesos que se llevarán a esta última, ya


CAPITULO II

II.-59

que es factible hacer una evaluación más realista del proceso, de tal forma que los

resultados que se obtengan conduzcan a escalar de manera exitosa el proceso a nivel

comercial. [13]

A escala industrial prácticamente no se realiza investigación, el objetivo principal es

obtener el producto que pretende ser comercializado al menor costo de producción. [13]

En cualquier nivel que se trabaje, el fin que se persigue es proporcionar a las células

los nutrientes y el ambiente necesarios para favorecer la formación de cierto producto.

Se podría definir escalamiento de procesos como el conjunto de procedimientos que

conducen a trasladar y predecir resultados experimentales de una escala de operación a otra.

Constituye una actividad que tiene gran importancia durante el desarrollo de un proceso

biotecnológico de interés industrial.

En términos generales existen dos tipos de escalamiento: el ascendente, cuando el

proceso se lleva del laboratorio a planta piloto y posteriormente a nivel industrial y, el

descendente, cuando se desea optimizar un proceso industrial, evaluar nuevas materias

primas, modificar el procedimiento o el equipo, aumentar los rendimientos de producción o

recuperación del producto.

Para escalar un proceso completo debe seleccionarse un criterio para cada una de las

operaciones unitarias que lo constituyen. Desde el punto de vista de la biotecnología, el

escalamiento ascendente de una fermentación es el proceso más estudiado, esto se debe a

que al cultivar células en reactores de gran capacidad, su actividad metabólica puede

modificarse.

Uno de los problemas más comunes en cualquier industria se presenta al escalar un

proceso en particular. El escalamiento es un conjunto de procedimientos que conducen a

trasladar y predecir resultados experimentales desde un proceso de tamaño conocido a otro.


CAPITULO II

II.-60

Cuando la fermentación estudiada es un proceso aerobio es importante analizar cada una de

las variables y resultados en ambas escalas desde el punto de vista fisicoquímico como

biológico debido al doble carácter que presenta el proceso de fermentación.

El problema de traslación de escala ha sido estudiado ampliamente en Ingeniería

Química para el caso de sistemas de materia inanimada, utilizando un enfoque que consiste

en la correlación de las variables involucradas por métodos de análisis teóricos o análisis

dimensional, para luego determinar las nuevas condiciones mediante la aplicación de

diversos criterios de similitud. En la figura II.-13 se muestra un claro ejemplo de un

proceso de escalado desde escala piloto a escala industrial.

Para el escalamiento en la industria en general se utilizan diversos tipos de

similitudes, tales como: similitud geométrica referida a las relaciones entre longitudes,

similitud cinemática la cual exige que las razones de velocidad entre ambos sistemas en

puntos concretos deben ser semejantes, similitud dinámica donde aplica la igualdad entre

razones de fuerza en puntos equivalentes, y similitudes térmicas y químicas aplicada a

igualdades de temperaturas y composiciones semejantes para puntos particulares. La

situación ideal sería obtener la total semejanza resultante de la aplicación de todos los

criterios; sin embargo, esto no se hace posible debido a que diversos criterios dan como

resultado condiciones contradictorias y/o incompatibles.


CAPITULO II

II.-61

Figura II.-13: Ejemplo de escalado de biorreactores desde escala piloto hasta escala industrial.

En el caso del escalamiento de una fermentación aeróbica, el predecir resultados a

escala de producción basados en el escalamiento de datos obtenidos en el laboratorio o en

la planta piloto requiere de un análisis cuidadoso de cada una de las escalas, tanto en sus

variables fisicoquímicas como biológicas.

Desde el punto de vista de diseño se debe tratar de delinear las variables físicas

(geometría, número de impulsores, etc.) del fermentador y procurar que se mantengan las

mismas condiciones de mezclado, agitación y aireación. Sin embargo, no se puede lograr lo

anterior porque existen limitaciones dimensionales y económicas que restringen los

procedimientos de escalamiento.

En el caso de las fermentaciones es necesario seleccionar criterios que no sólo

cumplan con los factores fisicoquímicos, sino además, con factores biológicos derivados de

las células vivas que en el medio de cultivo se encuentran. La Ingeniería Bioquímica utiliza

criterios como la relación potencia/volumen constante, número de Reynolds constante,


CAPITULO II

II.-62

coeficiente de transferencia de oxígeno constante, capacidad de bombeo del rotor constante

por unidad de volumen, y tiempo de mezclado constante, todos aunados con la semejanza

geométrica. Cabe destacar que todos estos criterios son basados en resultados netamente

empíricos por lo cual presentan un sobre diseño a veces excesivo dependiendo de las cepas

escogidas y el biorreactor seleccionado. En la figura II.-14 se muestra a rasgos generales la

zona donde el escalamiento de un proceso fermentativo se hace efectivo.

Figura II.-14: Dependencia de la fermentación y las variables de operación.

La figura II.-14 muestra esquemáticamente la concentración relativa del producto

final en una fermentación afectada por la relación potencia/volumen o por el coeficiente

volumétrico de transferencia de oxígeno. El patrón hiperbólico que se observa en general,

es independiente de las especies microbianas estudiadas: bacterias, levaduras o mohos.


CAPITULO II

II.-63

En la práctica se han escogido varios criterios para efectuar el cambio de escala,

todos ellos basados en resultados empíricos.

Los mejores criterios para pasar de una escala a otra son la relación

potencia/volumen constante o coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno

constante. Conviene señalar que si se mantiene la similitud geométrica, es imposible escalar

siguiendo más de un criterio.

II.3.1 Escalado según la relación potencia/volumen

El criterio de constancia de la potencia por unidad de volumen es, tal vez el más

antiguo y tuvo un origen más bien intuitivo. Pese a sus comienzos poco confiables fue

aplicado con éxito durante la década de los 40 para el diseño de plantas productoras de

penicilina y demás antibióticos. Hoy se considera que su aplicación trae consigo una

exagerada sobre dimensión de equipos y parámetros de operación y su uso ha sido

declinado notoriamente.[29]

II.3.2 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno constante

Usualmente es la transferencia de oxígeno la que determina la capacidad de un

fermentador y por ello se la ha escogido como criterio para escalamiento.[15]

Los métodos de escalado de fermentaciones más antiguos se basaban en la similitud

geométrica basada en dimensiones físicas proporcionales. Se pensaba que aplicando la

misma potencia por unidad de volumen que en el equipo de planta piloto se conseguiría un

rendimiento equivalente de proceso en grandes fermentadores. El escalado basado en un

coeficiente de transferencia de oxígeno, aKl equivalente ha sido razonablemente


CAPITULO II

II.-64

satisfactorio. Usualmente, para mejorar la transferencia de materia es más eficaz un

incremento de la agitación mecánica que un aumento de la velocidad de aireación.

Un medio adecuado para escalar los procesos aeróbicos consiste en medir la

concentración de oxígeno disuelto que es adecuada en equipos pequeños y ajustar las

condiciones en la planta hasta que se alcance dicha concentración. El criterio del

coeficiente de transferencia de oxígeno constante recibió mucha atención a partir de la

década del 60. Este criterio se fundamenta en la importancia que tiene la adecuada

oxigenación de las células en un cultivo aeróbico y la dificultad que ello implica, debido

tanto a la limitada solubilidad del oxígeno en el medio de cultivo como a las resistencias

existentes a esta operación de transferencia. Sin embargo, en ocasiones, este criterio

produce sobreestimaciones, por lo cual sólo se le considera válido en aquellos casos en el

que el suministro de oxígeno sea limitante o crítico en el proceso de fermentación. [29]

Para el adecuado desarrollo de este criterio de escalamiento, existe una serie de

métodos de medición los cuales presentan características positivas y también algunas

limitaciones y desventajas. Entre las dificultades que presenta este criterio de escalado, se

encuentran:

El valor de aK L varía durante el transcurso de la fermentación,

debido al aumento de la viscosidad, los problemas de espuma y el

aumento de la concentración celular.

Las correlaciones de aK L sólo son válidas en ciertos rangos y para

geometrías particulares, por lo tanto, al emplear una correlación de

aK L deben especificarse las condiciones ambientales y el tiempo de

fermentación en que se determinó éste, pues puede ocurrir que se


CAPITULO II

II.-65

utilice una correlación que no sea la apropiada para el proceso

estudiado.

El método de determinación de aK L .[15]

A continuación se describen los métodos más usados para la determinación del valor

del coeficiente de transferencia de oxígeno, mejor conocido como aK L .

II.3.2.1 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el método

estático

Este método también es conocido como método del “Gassing in”. Los métodos de

evaluación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante técnicas de desgasificación

requieren una reducción previa de la concentración de oxígeno disuelto hasta un valor

ligeramente superior al crítico con el propósito de medir el incremento de la concentración

de oxígeno disuelto en el medio, durante un período adecuado de aireación y agitación. En

este método se reduce la concentración de oxígeno mediante la desgasificación del líquido

con nitrógeno gaseoso o por ultrasonido, de manera que la solución es despojada de

oxígeno. Entonces, el líquido desoxigenado es aireado y agitado con el objeto de medir el

incremento de la concentración de oxígeno disuelto durante un tiempo t. [17]

La velocidad de transferencia de oxígeno es igual a la pendiente de la tangente a la

curva de valores de concentración de oxígeno disuelto en función del tiempo de aireación

tal como se muestra en la figura II.-15 de acuerdo con la siguiente ecuación: [17]

� �LLL CCaK

dtdCOTR �� ** (Ec. 11)

La integración de la ecuación conduce a la siguiente expresión: [17]

� � taKCC LL *ln * �� (Ec. 12)


CAPITULO II

II.-66

Por consiguiente, la representación gráfica de ln (C*-CL) en función del tiempo

corresponde a una línea recta cuya pendiente es -KLa como se muestra en la figura II.-16.

Figura II.-15: Representación esquemática de la concentración de oxígeno disuelto en una solución

durante el período de aireación. [17]

Figura II.-16: Representación esquemática de la determinación de KLa por el método estático de

desgasificación. [17]


CAPITULO II

II.-67

La determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno, KLa por el método

estático también se realiza en el caldo de fermentación, agregándole células muertas o

micelio para simular la concentración del medio real. El detector del cambio de la

concentración de oxígeno disuelto normalmente es del tipo recubierto por membrana, a

causa de la naturaleza compleja de los caldos de fermentación. Además, el punto donde se

realiza la determinación debe ser representativo del volumen total del caldo. [17]

El tiempo de respuesta del detector, definido como el tiempo necesario para

registrar el 63% de un cambio repentino, debe ser mucho menor que el tiempo de respuesta

a la transferencia de masa del sistema (1/ KLa). La principal desventaja de este método es su

dependencia de las mediciones realizadas en un solo punto del fermentador, el cual puede

no ser representativo de todo el volumen del medio. [17]

II.3.2.2 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el método de

Winkler.

El método de Winkler es una titulación por yodometría realizada comúnmente para

conocer la cantidad de oxígeno disuelto en agua. El análisis de oxígeno disuelto es un

ensayo clave en las actividades de control de la contaminación del agua y en los procesos

de tratamiento de aguas residuales y sirve como base para cuantificar los niveles de

demanda bioquímica de oxígeno, aerobicidad de los métodos de tratamiento, tasa de

aireación y grado de polución de los ríos. Esta técnica titulométrica tiene diversas

modificaciones, dependiendo del tipo de muestra. Este procedimiento utiliza una solución

alcalina de yoduro de potasio como agente oxidable, la cual libera, en medio ácido al

oxidarse, una cantidad de iodo proporcional a la concentración de oxígeno disuelto. El iodo


CAPITULO II

II.-68

liberado puede titularse con una solución estándar de tiosulfato de sodio, en presencia de

almidón como indicador. [45]

Las reacciones que ocurren son:

1. Entre el sulfato de manganeso y el hidróxido de potasio, para formar hidróxido

manganoso.

4224 )(2 SOKOHMnKOHMnSO (Ec. 3)

2. Oxidación del hidróxido manganoso a hidróxido mangánico por el oxígeno disuelto

en el agua.

3222 )(42)(4 OHMnOHOOHMn (Ec. 4)

3. Disolución del precipitado de hidróxido mangánico por el ácido sulfúrico. En este

punto la muestra se considera como fijada y se reduce la importancia de introducir

oxígeno adicional.

OHSOMnSOHOHMn 2342423 6)(3)(2 (Ec. 5)

4. Oxidación del iodo presente en el yoduro de potasio por el sulfato mangánico.

Como la aparición de esta última sustancia proviene de la reacción del oxígeno

disuelto presente en la muestra original, la cantidad de yodo liberado es

directamente proporcional a la de oxígeno disuelto.

2424342 22)( ISOKMnSOKISOMn (Ec. 6)

5. La etapa final es la titulación del yodo liberado con tiosulfato de sodio en presencia

de almidón. Este último reactivo produce una coloración azul oscura con el I2, que

va desapareciendo con el progreso de la valoración, hasta que se desvanece

completamente en el punto final.[45]


CAPITULO II

II.-69

��

�

IOSOSI

azulcoloralmidónI

22

.2

642

322

2 (Ec. 7)

Después de un período de aireación para la muestra de agua desgasificada (por

medio de ultrasonido o por ebullición) se realizan las siguientes acciones simultáneamente:

se suspende la agitación y la alimentación de aire, se anota el tiempo marcado por el

cronómetro y se toma una muestra. Cada muestra se mezcla con un exceso de reactivo

estándar de ioduro, recién preparado. La titulación se realiza con solución de tiosulfato de

sodio (Na2S2O3) hasta el punto final con un indicador de almidón. [17]

En la práctica, la concentración inicial de oxígeno disuelto, CL, es igual a cero,

entonces la ecuación es: [17]

� �LLL CCaK

dtdCOTR �� ** (Ec. 8)

**CaKdt

dCOTR LL �� (Ec, 9)

Donde, OTR: velocidad de transferencia de oxígeno (g/L*s); KLa: coeficiente

volumétrico de transferencia de masa (1/s); C*: concentración de oxígeno en la superficie

de separación gas-líquido (g/L); CL: concentración de oxígeno en el seno del líquido

(g/L).[17]

Entonces reordenando la ecuación (Ec. 9) se tiene:

� �tOO

CaK ifl �

��

][][* 22*

(Ec. 10)

De la ecuación (E. 10) se puede calcular el valor de aKl , o bien entregar el valor de

**CaKl , que representa la máxima velocidad volumétrica de transferencia de oxígeno

posible en un sistema dado. [29]


CAPITULO II

II.-70

Este método tiene la ventaja de no necesitar ningún aparato analítico especial y es

un experimento simple de realizar. Sus mayores objeciones están en el hecho de no utilizar

caldo de cultivos ni células y basarse en un modelo químico simple que no garantiza

representar adecuadamente la realidad de una fermentación.[29] Pese a ello, este método es

aún utilizado, en especial para cuantificar el efecto de cambios en el diseño del equipo o en

las condiciones de operación, más que para obtener valores de aKl[29]; sin embargo, el

tiempo requerido para cada determinación, usualmente de varias horas de acuerdo con las

velocidades de aireación y de agitación, dificultan su aplicación a escala industrial. [17]

II.3.2.3 Escalado según el coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el método

dinámico de Humphrey

En el método dinámico se utiliza la actividad respiratoria de un cultivo en

crecimiento para disminuír el contenido de oxígeno del medio antes de reiniciar la

aireación. La figura II.-17 ilustra esquemáticamente este procedimiento. [17]

La concentración de oxígeno en el fermentador antes del punto A es estable. El

suministro de aire se suspende repentinamente en el punto A, entonces el valor del

coeficiente de transferencia de oxígeno, aKl , es igual a cero y la pendiente de la línea AB

es una medida de la velocidad de respiración del cultivo: [17]

� � xOdt

dCL *2�� (Ec, 13)

La aireación se reinicia en el punto B y la concentración de oxígeno disuelto

aumenta hasta alcanzar el valor inicial. El incremento observado de la concentración de

oxígeno disuelto en el período BC es la diferencia entre la transferencia de oxígeno hacia la

solución y la demanda de oxígeno por la respiración del cultivo. [17]


CAPITULO II

II.-71

Figura II.-17: Representación esquemática de la determinación del coeficiente de transferencia de

oxígeno por el método de desgasificación dinámica. [17]

� � � � xOCCaKdt

dCLL

L ** 2* �� (Ec. 14)

Donde, �(O2): velocidad específica de respiración (g O2/g células*h); x:

concentración de células (g células seca/l); CL: Concentración de oxígeno disuelto en el

fermentador. Esta ecuación también se puede expresar como: [17]

� � ��

�� xO

dtdC

aKCC L

LL **1

2* � (Ec. 15)

La representación gráfica de esta última ecuación (figura II.-18), con CL en el eje de

las ordenadas y � � xOdt

dCL *2� en las abcisas, es una línea recta cuya pendiente es -1/KLa.

La recta se construye con los valores a las tangentes a la curva BC de la figura II.-17

correspondientes a diferentes valores de CL. [17]


CAPITULO II

II.-72

Figura II.-18: Representación esquemática de la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno,

KLa, por el método dinámico de Humphrey. [17]

El flujo de aire se debe reponer antes que el valor de Cl alcance la llamada

concentración crítica de oxígeno, valor bajo el cual la velocidad de metabolismo se hace

dependiente de Cl , existiendo el peligro de ocasionar daños irreversibles en el sistema

respiratorio de las células. Este valor crítico depende de cada sistema en particular, pero

como indicación general es recomendable no operar por debajo del 10% de saturación.[28]

Entre las ventajas que presenta el método se encuentran:

La determinación se realiza IN SITU.

Es un método muy rápido

Solo requiere de un electrodo que mida oxígeno disuelto.

Puede calcularse la concentración en la interfase gas-líquido, C*.

Entre las limitaciones también se pueden mencionar:

Se requiere un electrodo de respuesta rápida.

El coeficiente de transferencia de oxígeno, aKl que se calcula es puntual.

Se producen errores debidos al tiempo de respuesta del electrodo.

CAPÍTULO III METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

III.1 Fase experimental.

III.1.1 Montaje de la fermentación.

Materiales:

Columnas de vidrio de 300 ml cilíndricas, con 5 cm de diámetro interno y

40 cm de altura.

Columnas de vidrio de 1 l y 2 l de capacidad con o sin dos orificios

laterales, con 9,54 cm de diámetro interno y 46 cm de altura.

Compresor de aire con control de presión, GENERAL ELECTRIC, con

máximo 30 psi de presión, de 1/6 Hp y 60 Hz.

Mangueras de diferentes diámetros.

Columnas de vidrio de 5,41 cm de diámetro interno y 20 cm de altura para

empacar con sílica-gel y soda lime.

Sílica gel con indicador de humedad MERCK.

Soda lime granular con indicador RIEDEL DE HAËN AG SEELZE-

HANNOVER

Columna de vidrio empacada con algodón.

Algodón

Material cerámico poroso (frita) utilizado como burbujeador

Baño de María MEMMERT.

Autoclave HIRAYAMA MFG CORP.

Vasos de precipitados esterilizados.

Fiolas esterilizadas.

Balanza analítica.

Suero de leche pasteurizado con composición igual a la tabla II.-6.

Glucosa anhidra para fines bioquímicos MERCK

Lactosa monohidratada para fines bioquímicos MERCK

Centrífuga ALC 4233 ECT.

Metabisulfito de sodio para análisis químicos QUIMICAS RB, C.A.

Inóculo de Klebsiella Oxytoca proveniente del Centro Venezolano de

colecciones de microorganismos, en Caracas Venezuela.

Método:

El suero proveniente de “Lácteos Santa Rosa” se centrifugó para eliminar las

grasas y proteínas insolubles, luego se filtró, se tomaron muestras para conocer el

contenido de lactosa y glucosa y se almacenó bajo congelación.

Se realizaron varias centrifugaciones a diferentes revoluciones para conocer la

velocidad apropiada de eliminación de grasas y proteínas y, de esta manera se obtuvo

que la velocidad adecuada fuera de 3000 rpm durante 25 minutos (Figura III.-1) para

eliminar todas las grasas y proteínas.

Figura III.-1: Centrífuga utilizada para eliminar las grasas y proteínas poco solubles en el suero

Luego, conociendo el contenido de lactosa y glucosa en el suero, éste es

enriquecido con la lactosa necesaria hasta obtener 50 g/L de lactosa aproximadamente y

se volvió a medir el contenido de lactosa. También se enriqueció con glucosa hasta

obtener una composición de 50 g/L de este azúcar. La razón por la cual se agregaron

ambos azúcares es porque el micro-organismo utilizado (Klebsiella Oxytoca), tarda más

en alimentarse y adaptarse a la lactosa, ya que debe hidrolizarla antes de consumirla; así

que la glucosa agregada es un nutriente durante la hidrólisis de la lactosa.

El suero se pasteurizó a 85ºC durante 15 minutos en el baño de María (Figura

III.-2). No se esterilizó en el autoclave, debido a que los azúcares utilizados son

degradados a temperaturas superiores a 90ºC; sin embargo la pasteurización elimina los

microbios presentes en el suero.

Figura III.-2: Baño de María utilizado.

Previamente, con 24 horas de anticipación, se preparó el pre-inóculo, para esto

se tomaba un 10% de volumen de suero con el que iba a trabajar, ya pasteurizado, en

una fiola con agitador magnético y tapón de algodón y papel de aluminio esterilizados.

Se flameó la boca de la fiola esterilizada y la boca del recipiente que contenía el suero y

se realizaba el trasvase. Se volvía a flamear las bocas y se tapaban los recipientes. Una

vez trasvasado el suero se realizaba la siembra del microorganismo. Se tomaba la cuña

de crecimiento (Figura III.-3) y un asa de platino y el suero de la fiola cerca del

mechero, se calentaba el asa hasta el rojo vivo y se destapaban los recipientes, el asa se

enfriaba en el medio de crecimiento de la cepa sin tocarla y luego se arrastraba un poco

de ella con el asa para luego sumergirla en el suero. Este procedimiento se realizó tres

veces consecutivas y luego se flamearon las bocas de los recipientes para ser tapados.

La fiola con el suero se colocaba durante 24 horas en el baño de María agitado a la

temperatura de crecimiento óptimo de la cepa (35ºC±3ºC).

Figura III.-3: Cuña de crecimiento de Klebsiella oxytoca

Una vez que el pre-inóculo se encontraba en el baño se disponía a lavar las

mangueras, uniones metálicas y columnas de vidrio a usar para luego someterlos a

esterilización en el autoclave (Figura III.-4) a 120ºC de temperatura y 1.5 bar de presión

durante 15 minutos, todo esto envuelto en papel de periódico. Después de transcurrido

este tiempo se dejaba enfriar los equipos dentro del autoclave hasta el momento del

montaje del experimento. También se colocaba la sílica gel, la soda lime y el algodón a

utilizar en una estufa (Figura III.-5) a 105ºC durante toda la noche para que estos

reactivos eliminaran la humedad que habían adsorbido por el contacto con el aire

atmosférico.

Figura III.-4: Autoclave utilizado para la esterilización de los equipos.

Figura III.-5: Estufa utilizada para regenerar la sílica gel y secar el material de vidrio.

Habiendo transcurrido 24 horas de crecimiento microbiano se colocaba la

columna de vidrio sobre el soporte metálico (Figura III.-6) y se conectaban todas las

mangueras y uniones metálicas necesarias, también se colocaba otra columna de vidrio

empacada con sílica gel y de soda lime para evitar el paso de la humedad ambiental al

sistema y luego, otra columna de algodón que evitaba el paso de partículas sólidas.

Después, se conectó todo el sistema de columnas entre sí a través de mangueras

esterilizadas de la siguiente manera: el compresor estaba unido a la columna de sílica

gel y soda lime (Figura III.-7) y ésta, a su vez estaba conectada a la columna de

algodón para luego llegar al bio-reactor (columna de vidrio que contenía el suero). Una

manguera adicional fue colocada alrededor de la última columna y esta transportaba

agua de calefacción que se encontraba a 39 ±3ºC para mantener el sistema fermentativo

a 35ºC (Figura III.-8).

Figura III.-6: Columnas de vidrio de distintos volúmenes.

Figura III.-7: Columnas de vidrio con sílica gel y soda lime

Figura III.-8: Sistema de fermentación

Finalmente, se agregó el suero pasteurizado a la columna de fermentación junto

al pre-inóculo procurando trabajar de manera rápida y con el equipo necesario para

evitar contaminación de la muestra y se puso en marcha el compresor (Figura III.-9)

controlando la presión de salida del aire para obtener una aireación baja, media o alta y

así comenzar el proceso fermentativo y hacer las mediciones correspondientes 24 horas

más tarde.

Figura III.-9: Compresor utilizado.

III.1.2 Determinación del contenido de lactosa a través del método

colorimétrico

El ácido pícrico es reducido por los azúcares reductores, en medio alcalino, a

ácido picrámico de color rojo, siendo la intensidad del color desarrollado directamente

proporcional a la concentración del glúcido en solución. Midiendo fotométricamente la

densidad óptica de la solución reducida a 520 nm y comparándola con soluciones

patrones del mismo azúcar, tratadas en condiciones similares, es posible determinar su

concentración.[53]

Materiales:

Espectrofotómetro METROLAB

Balones aforados de 100 ml.

Pipetas de 2 ml.

Pipetas de 10 ml:

Papel de filtro

Pro-pipetas

Baño de María MERMMET

Reactivos:

Ácido pícrico para análisis químico MERCK

Carbonato de sodio para análisis químico REAGENTS.

Lactosa monohidratada para análisis químico MERCK.

Agua destilada.

Método:

Se preparó 500 ml una solución de saturada de ácido pícrico, además se

preparó 200 ml de una solución de carbonato de sodio al 22% p/p, y 100

ml de una solución patrón de lactosa a una concentración de 4 g/l.

Se transfirió 2 ml de la muestra previamente homogeneizada a un balón

aforado de 100 ml, en el que se encontraba solución saturada de ácido

pícrico hasta la mitad y se llevó al aforo con la misma solución. Se

mezcló y filtró a través del papel de filtro.

Se rotularon dos balones aforados de 100 ml, como muestra y patrón.

En el balón rotulado como “muestra” se colocaron 10 ml del filtrado

obtenido, 10 ml, de agua destilada, 10 ml, de solución saturada de ácido

pícrico y 10 ml, de solución de carbonato de sodio.

En el balón rotulado como “patrón”, se colocaron 10 ml, de solución

patrón de lactosa, 10 ml, de agua destilada. 10 ml, de solución saturada

de ácido pícrico y 10 ml, de solución de carbonato de sodio.

Se mezclaron simultáneamente ambos balones y fueron colocados en

baño de María destapados por 20 minutos a 70ºC. Se enfriaron ambas

soluciones, se diluyeron hasta el aforo con agua destilada y se

homogenizó cada balón.

Se midió la densidad óptica de ambas soluciones en un

espectrofotómetro, a una longitud de onda de 520 nm (Figura III.-10).

Figura III.-10: Espectrofotómetro utilizado para medir densidad óptica en soluciones

Se calculó la concentración de lactosa en la muestra aplicando la

siguiente relación:

5*%p

m

A

ALactosa �

Donde:

Am: Absorbancia de la muestra.

Ap: Absorbancia de la solución patrón.


CAPITULO III

III.-1

III.1.3 Determinación del contenido de glucosa a través del método enzimático o de

Trinder.

Las determinaciones de glucosa han probado su utilidad en el diagnóstico y manejo de

la Diabetes Mellitus. Las pruebas de tolerancia a la glucosa son útiles en el diagnóstico de

diabetes, hipoglucemia y enfermedades de los sistemas renal, pituitario y tiroidal. [54]

Los métodos químicos usados anteriormente en la cuantificación de glucosa carecen

de especificidad y resultaron con intervalos más amplios que los de los valores normales.[54]

Trinder introdujo un procedimiento totalmente enzimático que mejoró en gran

cantidad la especificidad y ofrece un fácil manejo. Este procedimiento está basado en un

método modificado de Trinder en el cual el p-hidroxibencensulfonato reemplaza al fenol en la

fórmula brindando un reactivo menos corrosivo y más seguro. [54]

La glucosa oxidasa convierte la glucosa en peróxido de hidrógeno y ácido D-

glucónico. La peroxidasa cataliza la oxidación del peróxido de hidrógeno a 4-aminofenazona

con la subsecuente unión con el p-hidroxibencensulfonato. El producto final es un colorante

hidroquinoleína el cual absorbe a 500 nm. La intensidad del color es directamente

proporcional a la concentración de la glucosa. [54]

Materiales:

Equipo Reactivo Cat. No. 2800 (Kit de glucosa, Figura III.-11)

Espectrofotómetro METROLAB.

Tubos de ensayo

Micropipeta de 0.01ml.

Pipeta de 1 ml


CAPITULO III

III.-2

Baño de María MEMMERT.

Agua destilada

Figura III.-11: Kit de glucosa

Reactivos:

Reactivo de glucosa reconstituido: para ello se añade el contenido total del

frasco a la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta. Mezcle

suavemente para disolver. No se ingiera. La toxicidad no ha sido establecida.

Una vez reconstituido, el reactivo es estable por 30 días a 2-8ºC. Protéjalo de la

luz,

Reactivo de calibración o patrón (viene en el kit).

Método:

Se colocó 1.0 ml de reactivo de glucosa en tubos etiquetados como blanco y

muestra.

Se precalentó el reactivo de glucosa por cinco minutos a 37ºC.


CAPITULO III

III.-3

Se colocó 0.01 ml de la muestra dentro del tubo etiquetado como muestra y

mezcle bien.

Se incubó los tubos a 37ºC por 10 minutos.

Se colocó cero de absorbancia en el espectrofotómetro a 500 nm y se ajustó a

100 de absorbancia con la solución patrón.

Se leyó y registró la absorbancia para las muestras.

La linearidad se extiende hasta 500 mg/L. Los especímenes que excedan de

este valor deberán ser diluidos con agua destilada y reevaluadas. Multiplique el

resultado por el factor de dilución para obtener el resultado final.

Para muestras sin diluir, la concentración se calculó como:

pp

m CA

AdlmgaGlu *)/(cos �

Donde:



CP: Concentración de la solución patrón, en mg/dl

Las muestras que se obtuvieron en esta fermentación, fueron diluídas con 5 mL

de agua destilada, por lo tanto, la concentración de glucosa se calcula como:

274.0*)/(cosp

m

A

AdlmgaGlu �

Donde:




CAPITULO III

III.-4

III.1.4 Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el

método estático.

Materiales

Electrodo que mide oxígeno disuelto tipo Oxi 197i

Registrador de oxígeno disuelto tipo CellOx 325

Planchas de calentamiento CORNING.

Cronómetro digital.

Mangueras de diámetro fino.

Sistema para la fermentación.

Método:

Las primeras corridas se realizaron con agua y luego con el suero para corroborar la

suposición que las propiedades del suero son similares a las del agua; sin embargo, a cada

fluido se le realizó el mismo tratamiento.

Se tomó el volumen de líquido a estudiar y se colocó en una plancha de calentamiento

(Figura III.-12) hasta lograr la ebullición y desoxigenación del líquido. Luego, se trasvasó el

líquido ya enfriado hasta la temperatura de operación (35� 3ºC) a través de una manguera de

diámetro fino y, por último, se sumergió el electrodo que mide oxígeno disuelto unido al

registrador (Figura III.-20), se puso en marcha el compresor a un caudal de aire fijo de

acuerdo al volumen estudiado y la aireación necesitada (Tabla III.-1) y se registró cada

minuto la concentración de oxígeno disuelto en el fluido hasta que las lecturas se hicieran


CAPITULO III

III.-5

constantes. En ese momento se detuvo el cronómetro y se apagó el compresor de manera

simultánea.

Tabla III.-1: Flujo volumétrico de aire utilizado en función del volumen de medio de cultivo estudiado

Volumen del medio de cultivo V.V.M (ml/(ml*min)) 300 mL 1 L 2 L

0,3 96 minml 306 min

ml 553 minml

0,5 159 minml 924 min

ml 1048 minml

1 312 minml 553 min

ml 2160 minml

Figura III.-20: Electrodo que mide oxígeno disuelto Oxi 197i y registrador de oxígeno disuelto CellOx 325.

Cuando se trabajó con el suero era necesario hacer una corrección de la lectura de

oxígeno disuelto debido a la salinidad que presentaba este medio, por lo cual se realizó una


CAPITULO III

III.-6

curva de calibración de conductancia en función de la concentración de sal para luego leer la

conductancia de la muestra problema (suero) y así conocer su salinidad.

Con esta serie de datos se realizaron las gráficas concentración de oxígeno disuelto en

función del tiempo de oxigenación, observadas en el capítulo IV (Gráficos IV.-1, IV.-2 y IV.-

3) y en el apéndice B (Gráficos B.-1 hasta B.-9) y se les añadió una línea de tendencia

polinómica de segundo grado con ecuación conocida, la cual corresponde a la ecuación (Ec.

11) mostrada en el capítulo II de este trabajo.

Para conocer el coeficiente global de transferencia de oxígeno ( aK L ) a través de este

método, se derivó la ecuación obtenida como línea de tendencia, obteniéndose una recta según

la ecuación (Ec. 12) del capítulo II, cuya pendiente es - aK L .

III.2.5 Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el

método de Winkler.

Se desarrolló este método para conocer oxígeno disuelto en aguas blancas y residuales;

sin embargo, también se aplica para conocer el oxígeno disuelto cuando se sustituye el medio

de cultivo por agua, en sistemas fermentativos. A continuación se explica detalladamente el

procedimiento del método de Winkler.

Materiales:

Bureta de 50 ml.

Soporte universal.

Fiolas yodométricas.

Cronómetro digital.


CAPITULO III

III.-7

Planchas de calentamiento CORNING.

Pipetas de 10 ml, graduadas en divisiones de 0.1 ml.

Pipetas de 2 ml.

Pipeta volumétrica de 50 ml.

Sistema para la fermentación.

Reactivos:

Solución alcalina de yoduro de potasio KI (KI para análisis LABORATORY

REAGENTS): se disolvió 500 g de hidróxido de sodio NaOH o 700 g de

hidróxido de potasio KOH y 135 g de yoduro de sodio NaI o 150 g de yoduro de

potasio KI en agua destilada y se diluyó a 1 l. La solución final no debe presentar

coloración con almidón cuando se diluye y acidifica. Se almacenó en un

recipiente ámbar y tapado.

Solución de sulfato manganoso MnSO4: se disolvió 364 g de sulfato manganoso

hidratado MnSO4.H2O en agua destilada. Se filtró y diluyó a 1 l. No deben

liberarse más que trazas de yodo cuando a esta solución se le añade una solución

acidificada de yoduro de potasio, KI.

Solución de tiosulfato de sodio Na2S2O3 (Na2S2O3 para análisis J.T. BAKER)

0.025 N: se disolvió 6.21 g de tiosulfato de sodio pentahidratado Na2S2O3.5H2O

y 200 mg de carbonato de sodio en agua destilada recientemente hervida y fría y

diluír a 1 l. Se preservó esta solución agregando 5 ml de cloroformo CHCl3. Esta

solución no debe prepararse antes de 12 a 15 horas antes de su uso para evitar su

degradación.


CAPITULO III

III.-8

Cristales de dicromato de potasio K2Cr2O7 (K2Cr2O7 para análisis

DIAGNOSTICOS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA) para estandarizar la

solución de tiosulfato de sodio: Se pesó alrededor de 210 mg de dicromato de

potasio estándar primario, que previamente se redujo a polvo y se secó a 120ºC

durante 4 horas y disolver en 100 ml de agua en una fiola yodométrica de 500 ml

con tapón de vidrio. Se agitó por rotación hasta disolver el sólido, se retiró el

tapón y se agregó rápidamente 3 g de yoduro de potasio KI, 2 g de bicarbonato

de sodio NaHCO3 y 5 ml de ácido clorhídrico. Se insertó el tapón suavemente en

la fiola, se agitó por rotación para mezclar y se dejó reposar en la oscuridad

durante 10 minutos. Se enjuagó el tapón y las paredes internas de la fiola con

agua destilada y se tituló el yodo liberado con solución de tiosulfato de sodio

hasta que la solución tome color verde amarillento. Se agregó 3 ml de almidón y

se continuó la titulación hasta que desapareció el color azul. Se calculó la

normalidad como sigue:

TiosulfatoOCrKTiosulfato VOCrmolK

OCreqK

OCrgK

OCrmolKmN /

16*

4.2941*

722

722

722

722722 �

�

��

��

Solución indicadora de almidón: se mezcló 6 g de almidón soluble con un poco

de agua destilada en un mortero hasta que se formó una pasta. Se diluyó esta

pasta en 1 l de agua hirviendo. Se dejó enfriar. Luego, se agregó 20 g de

hidróxido de potasio y se mezcló. Se dejó en reposo por 2 horas. Se agregó 6 ml

de ácido acético glacial. Se mezcló completamente. Se añadió ácido clorhídrico

concentrado hasta ajustar el pH de la solución a 4. Por último, se almacenó la

solución en una botella con tapa de vidrio. Esta solución es estable por 1 año.


CAPITULO III

III.-9

Ácido sulfúrico concentrado H2SO4.

Método:

Este método mide el oxígeno disuelto en agua, la cual fue la sustitución del medio de

cultivo; sin embargo no es aplicable en muestras de suero ya que la presencia de una gran

variedad de iones en el suero produce una gran liberación de yodo, lo cual conduce a

resultados de oxígeno disuelto muy por encima del valor real leído con un electrodo que mide

oxígeno disuelto.

Para lograr este montaje se tomó una cantidad de agua y se colocó a ebullir en una

plancha de calentamiento (Figura III.-12) para eliminar el oxígeno disuelto. Una vez enfriada

esta agua hasta una temperatura de 35ºC se trasvasaba por medio de una manguera muy fina

al fermentador y se colocó en funcionamiento el compresor al mismo tiempo que se puso en

marcha el cronómetro (Figura III.-13).

Figura III.-12: Plancha de calentamiento


CAPITULO III

III.-10

Figura III.-13: Cronómetro digital

Una vez que el electrodo que mide oxígeno disuelto mantenía una lectura constante se

realizaban las siguientes acciones simultáneamente: se detenía el cronómetro y se apagaba el

compresor para detener la aireación. Inmediatamente, se tomaba una muestra de 200 ml la

cual se trasvasaba por medio de una manguera fina hasta una fiola yodométrica. Después, se

le adicionaron 2 ml de solución de sulfato manganoso seguido de 2 ml de solución alcalina de

yoduro por debajo de la superficie del líquido y se colocó el tapón a la fiola.

Luego de tapada la fiola se mezclaba la muestra invirtiendo el recipiente varias veces.

Se dejaba reposar para que el flóculo precipitara y se repetía el mezclado (Figura III.-14). En

este momento se dice que el oxígeno se encuentra fijado en forma del precipitado marrón,

entonces se tomaban 4 muestras de 50 ml cada una en 4 fiolas yodométricas tapadas (Figura

III.-15). Se dejaba en reposo las 4 muestras nuevamente hasta observar nuevamente el flóculo

en el fondo de la fiola, en ese momento se tomaba 1a fiola y se le agregaba 2 ml de ácido

sulfúrico concentrado dejando que el mismo cayera por el cuello y la pared de la fiola y se

tapaba la misma con firmeza. La temperatura de la muestra no debería superar los 30ºC para

evitar pérdidas de yodo por volatilización; sin embargo, como nuestro sistema debía

mantenerse a 35ºC se debía sostener firmemente el tapón para evitar que el gas de yodo

pudiese levantarlo.


CAPITULO III

III.-11

Figura III.-14: Fijación del oxígeno disuelto en el agua

Figura III.-15: Separación de la muestra en cuatro muestras de menor volumen

Se mezclaba nuevamente por inversión, hasta que el precipitado se disolviera por

completo (Figura III.-16). Finalmente, se comenzaba la titulación de la muestra con solución

de tiosulfato de sodio hasta la aparición de un color amarillo claro (Figura III.-17). Se

agregaban 1 o 2 ml de solución indicadora de almidón (Figura III.-18) y se continuaba la

titulación hasta la desaparición del color azul (Figura III.-19).


CAPITULO III

III.-12

Figura III.-16: Disolución del precipitado formado usando ácido sulfúrico concentrado

Figura III.-17: Titulación con tiosulfato de sodio hasta color amarillo claro

Figura III.-18: Cambio de color al agregar el almidón como indicador


CAPITULO III

III.-13

Figura III.-19: Punto final de la titulación yodométrica. Desaparición del color azul.

Se registraba el volumen del tiosulfato de sodio gastado en la titulación y su

normalidad por la estandarización de la misma solución. Se obtenía el valor del coeficiente de

transferencia de oxígeno según la ecuación Ec. 10 mostrada en el capítulo II de este proyecto:

� �tOO

CaK ifl �

��

*2][][

* 22*

Donde KLa: coeficiente volumétrico de transferencia de masa (1/s); C*: concentración

de oxígeno en la superficie de separación gas-líquido (g/l); [O2]i: Concentración de oxígeno

inicial (g/l); [O2]f: Concentración de oxígeno final (g/l); y �t: intervalo de tiempo (s).

Así, se obtuvo el valor **CaKl , que representa la máxima velocidad volumétrica de

transferencia de oxígeno posible en un sistema dado.


CAPITULO III

III.-14

III.2.6 Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el método

dinámico de Humphrey.

Materiales:

Electrodo que mide oxígeno disuelto tipo Oxi 197i.

Registrador de oxígeno disuelto tipo CellOx 325.

Cronómetro.

Sistema de fermentación.

Método:

Al sistema fermentativo se le conectó termopares unidos a termocuplas (Figura III.-20)

previamente esterilizados con una solución de metabisulfito de sodio de 0.5 g/l. Una vez

realizado lo anterior, se trasvasaba el medio de cultivo pasteurizado (suero de leche) y se

inoculaba con el pre-inóculo preparado con 24 horas de anticipación.

Figura III.-20: Termocupla y termopares utilizados


CAPITULO III

III.-15

Se colocó en funcionamiento el compresor a una presión fija (Tabla III.-1) durante 24

horas más y una vez culminado ese tiempo, se sumergió el electrodo en el seno del líquido y

se registraron los valores de oxígeno disuelto durante 10 minutos. Luego de este tiempo se

detuvo el funcionamiento del compresor y se registraron los valores de concentración de

oxígeno disuelto hasta que se llegó a concentraciones de 1 ppm. En este punto se reinició el

suministro de aire y se siguió anotando valores de oxígeno disuelto hasta los 70 minutos

(Figura III.-21).

Figura III.-21: Sistema fermentativo para el método dinámico de Humphrey

Con los datos recopilados se construyeron los gráficos presentados en el apéndice B

(Gráficos B.-10 hasta B.-18) y se le añadieron a cada tramo de la gráfica su respectiva línea de

tendencia. Para calcular mediante este método el coeficiente global de transferencia de

oxígeno, se tomó el tramo de reaireación como un sistema individual y a esta curva se le


CAPITULO III

III.-16

desarrolló su línea de tendencia polinomial de segundo grado que corresponde a la ecuación

(Ec.14) del capítulo II y se derivó hasta obtener una recta cuya pendiente es -1/ aK L , que

corresponde a la ecuación (Ec.15).

CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES


CAPÍTULO IV

IV.- 1

RESULTADOS OBTENIDOS Y DISCUSIONES

Al revisar los resultados obtenidos a través del método de Winkler, se debe acotar

que en él, no se calcula el coeficiente global de transferencia de masa aK L , sino **CaK L ,

que representa la máxima velocidad volumétrica de transferencia de oxígeno posible en un

sistema dado y es directamente proporcional a la concentración de oxígeno en la superficie

de separación gas-líquido. Según se observa en la tabla IV.-1, para el volumen menor de

medio de cultivo (300 mL), los valores obtenidos de **CaK L son los más altos,

obteniéndose 0,2± 0,1 ppm/min para todas las aireaciones y, para los volúmenes mayores

este valor disminuyó a la mitad; este comportamiento es lógico debido a que a mayor

volumen de medio de cultivo, mayor es la cantidad de aire necesario para saturar el medio

de cultivo y más lenta es la transferencia de oxígeno desde el estado gaseoso hacia el seno

del líquido.

Tabla IV.-1: Determinación de la velocidad máxima de transferencia de oxígeno tomando agua como medio de cultivo a

diferentes aireaciones y diferentes volúmenes según el método de Winkler.

Aireación V=300 mL V=1 L V=2 L Baja (0,2±0,1) ppm/min (0,1±0,1) ppm/min (0,1±0,1) ppm/min Media (0,2±0,1) ppm/min (0,1±0,1) ppm/min (0,1±0,1) ppm/min Alta (0,2±0,1) ppm/min (0,1±0,1) ppm/min (0,0±0,1) ppm/min

Los resultados obtenidos según el método estático se muestran en la tabla IV.-2 y

se observa que a medida que aumenta la aireación en el medio de cultivo, mayor es la

transferencia del oxígeno para un volumen fijo y siendo razonable debido que mientras

mayor sea la aireación, más burbujas son producidas y existe mayor área de transferencia

de oxígeno; por lo tanto, existe más oxígeno disuelto en el medio.


CAPÍTULO IV

IV.- 2

Tabla IV.-2: Coeficiente de transferencia de oxígeno medidos en agua y suero oxigenados como medio de cultivo a

diferentes aireaciones y diferentes volúmenes.

PARA AGUA PARA SUERO Aireación V=300 mL V=1 L V=2 L V=300 mL V=1 L V=2 L

Baja 0,02±0,02 1min � 0,01±0,00 1min � 0,00±0,00 1min � 0,14 1min � 0,10 1min � 0,01 1min �

Media 0,04±0,02 1min � 0,04±0,00 1min � 0,03±0,00 1min � 0,16 1min � 0,14 1min � 0,04 1min �

Alta 0,03±0,03 1min � 0,15±0,06 1min � 0,03±0,00 1min � 0,22 1/min 0,16 1min � 0,07 1min �

También se observa que a medida que aumenta el volumen del medio de cultivo,

disminuye la velocidad de transferencia de oxígeno al medio. Esto es, al igual que para el

método anterior, al existir mayor volumen de medio, se necesita mayor cantidad de aire

para lograr saturar el medio, así que para lograr el mismo coeficiente de transferencia de

oxígeno en dos diferentes volúmenes, se hace necesario aumentar la aireación para

mayores volúmenes.

El método estático se realizó por triplicado al utilizar agua como medio de cultivo

y una vez cuando se utilizó suero como medio de cultivo, esto es debido a que este medio

contiene iones sulfito disueltos y este ión es un envenenador del electrodo que mide

oxígeno disuelto utilizado, y es la razón por la cual los resultado con agua se presentan

junto a la desviación estándar normal y en el suero no.

También se observa que la transferencia de oxígeno es mucho mayor para el suero

que para el agua puesto que el coeficiente de transferencia de oxígeno es mayor en el

suero para cualquier volumen de medio de cultivo y cualquier aireación presentada en la

tabla IV.-2; por lo tanto, la suposición previa que se hace con el método de Winkler que el

agua y el suero se comportan de manera similar en la transferencia de oxígeno, resulta

incierta. Esta afirmación es demostrada a través de los gráficos IV.-1, IV.-2 y IV.-3 ya

que las tres líneas que se encuentran en la parte superior de los gráficos representan la

transferencia de oxígeno hacia el suero.


CAPÍTULO IV

IV.- 3

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

V=300 mL y aireación baja para agua V=300 mL y aireación media para agua

V=300 mL y aireación alta para agua V=300 mL y aireación baja para suero

V=300 mL y aireación media para suero V=300 mL y aireación alta para suero

Gráfico IV.-1: Representación gráfica de la transferencia de oxígeno medidos en agua y suero oxigenados

como medio de cultivo y con un volumen de 300 mL, a diferentes aireaciones.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10

Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (

ppm

)

V= 1 L y aireación baja para agua V= 1 L y aireación media para agua

V= 1 L y aireación alta para agua V= 1 L y aireación baja para suero

V= 1 L y aireación media para suero V= 1 L y aireación alta para suero


como medio de cultivo y con un volumen de 1 L, a diferentes aireaciones.


CAPÍTULO IV

IV.- 4

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (

ppm

)

V= 2 L y aireación baja para agua V= 2 L y aireación media para agua

V= 2 L y aireación alta para agua V= 2 L y aireación baja para suero

V= 2 L y aireación media para suero V= 2 L y aireación alta para suero


como medio de cultivo y con un volumen de 2 L, a diferentes aireaciones.

Luego, se realizó una comparación entre las concentraciones de oxígeno disuelto

leídas mediante el electrodo que mide oxígeno disuelto Oxi 197i y la titulación

yodométrica del método de Winkler, con el fin de conocer la precisión de ambos métodos

debido a que en el método de Winkler se presentan errores por lectura de volumen,

manipulación de la muestra y trasvase de la misma. Estos errores traen consigo resultados

superiores a los obtenidos con el electrodo puesto a que, durante el método de Winkler, la

muestra ya trasvasada, se agita y tiene contacto con una columna de aire que se encuentra

por encima de la superficie del líquido en la fiola yodométrica, reaccionando los reactivos

con este oxígeno gaseoso, como se muestra en las tablas IV.-3, IV.-4 y IV.-5.

Esta comparación entre procedimientos permite demostrar que el método cuyos

resultados son más fiables entre los dos comparados, es el método estático debido a que su


CAPÍTULO IV

IV.- 5

apreciación es de 0,01 ppm en comparación con la apreciación de 0,1 ppm para el método

de Winkler.

Tabla IV.-3: Comparación de la concentración de oxígeno disuelto medidos en agua como medio de cultivo

según los métodos estático y de Winkler y con un volumen de 300 mL, a diferentes aireaciones.

Concentración de oxígeno disuelto en agua (ppm) Aireación para el método de Winkler Para el método estático % error Baja 5,4±0,1 4,96±0,01 8,87 Media 5,5±0,1 5,12±0,01 7,03 Alta 5,8±0,1 5,19±0,01 11,75


según los métodos estático y de Winkler y con un volumen de 1 L, a diferentes aireaciones.

Concentración de oxígeno disuelto en agua (ppm) Aireación para el método de Winkler para el método estático % error Baja 5,8±0,1 5,02±0,01 15,14 Media 6,0±0,1 5,20±0,01 14,81 Alta 6,2±0,1 5,28±0,01 17,61


según los métodos estático y de Winkler y con un volumen de 2 L, a diferentes aireaciones.

Concentración de oxígeno disuelto en agua (ppm) Aireación para el método de Winkler para el método estático % error Baja 5,5±0,1 5,31±0,01 3,01 Media 5,7±0,1 5,46±0,01 4,76 Alta 5,9±0,1 5,52±0,01 5,98

Se observa es que los mayores errores se presentan para volúmenes de 1 L; esto

posiblemente se debe a que a este volumen fueron los primeros experimentos realizados,

lo que conlleva a errores de trasvase y de aprendizaje del método particular. El resto de las

desviaciones se encuentran entre 3.01% y 11.75%.


CAPÍTULO IV

IV.- 6

Al igual que en el método estático, en el método dinámico de Humphrey, se

distingue que a medida que aumenta la aireación para un volumen determinado también

aumenta el coeficiente de transferencia de oxígeno como se muestra en las tablas IV.-6,

IV.-7 y IV.-8, excepto para el volumen de 300 mL. Esto se debe a que para todos los

volúmenes se tomó un tiempo fijo de fermentación de 24 horas y para el volumen de 300

mL este tiempo era demasiado prolongado para que la bacteria se mantuviese con vida; es

decir, los nutrientes se agotaron con mayor rapidez produciendo que la bacteria muriera

progresivamente e incluso en el momento de la medición, una parte de la colonia del

microorganismo se encontraba en estado de inanición, lo cual puede ser constatado a

través de los resultados obtenidos de concentración de glucosa y lactosa al inicio y final

del proceso fermentativo.

Tabla IV.-6: Coeficiente de transferencia de oxígeno medido en suero oxigenados como medio de cultivo y

con un volumen de 300 mL, a diferentes aireaciones.

Concentraciones iniciales (%m/v)

Concentraciones finales (%m/v)

Aireación aK L (1/min) [Lactosa] [Glucosa] [Lactosa] [Glucosa] 0,3 V.V.M 8,77 5,336 5,795 0,1570 0,147 0,5 V.V.M 7,11 5,142 4,544 0,1484 0,117 1 V.V.M 2,04 5,100 5,366 0,1284 0,055


con un volumen de 1 L, a diferentes aireaciones.

Concentraciones iniciales (%m/V)




con un volumen de 2 L, a diferentes aireaciones.


CAPÍTULO IV

IV.- 7

Concentraciones iniciales (%m/v)



También se debe explicar que, mientras mayor es la aireación, mayor es la rapidez

de crecimiento de la cepa en el sistema fermentativo así que más rápido consume los

nutrientes en solución como se observa en las tres tablas anteriores donde las

concentraciones menores de nutrientes en soluciones se observan en las experiencias con

mayor aireación.

Debido a lo anteriormente expuesto, se puede concluir que para el volumen de 300

mL no son representativos los resultados obtenidos ni de respiración de la cepa ni del

coeficiente de transferencia de oxígeno en el sistema de fermentación dado.

Una vez observados todos los resultados obtenidos para los tres métodos realizados

se pueden obtener una serie de conclusiones, lo primero es que el método más adecuado

para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno es el método dinámico

de Humphrey debido a su precisión, a su realización in situ y además, es el único método

que toma en cuenta la demanda de oxígeno del microorganismo (respiración) en el medio

de fermentación.

También es importante aclarar que no es cierta la suposición de que el suero se

comporta similar al agua en cuanto a la transferencia de oxígeno, ya que el suero

solubiliza mayor cantidad de oxígeno y lo hace más rápido que el agua como fue

observado en los coeficientes de transferencia de oxígeno para agua y suero en la

realización del método estático. La concentración de oxígeno disuelto en función del

tiempo forma parábolas en el caso del agua mientras que el suero forma curvas similares a


CAPÍTULO IV

IV.- 8

las logarítmicas, llegando más rápidamente a la saturación de oxígeno disuelto que el

agua.

Otro punto importante es que el escalado de la fermentación del 2,3-butanodiol a

través del coeficiente de transferencia de oxígeno constante no obtiene resultados

satisfactorios debido a que a medida que aumenta el volumen se debe ajustar la aireación

para lograr obtener el mismo coeficiente de transferencia de oxígeno; es decir, se necesita

una mayor aireación para conseguir el mismo Kla y para esta fermentación es necesario

mantener restringida la aireación para lograr la producción del 2,3-butanodiol.

CAPÍTULO V CONCLUSIONES


CAPÍTULO V

V.-1

CONCLUSIONES

El mejor método de medición del coeficiente de transferencia de oxígeno en sistemas

fermentativos es el método dinámico de Humphrey.

La suposición de que el agua y el suero se comportan de manera similar en cuanto a la

transferencia de oxígeno es falsa.

El 2,3-butanodiol obtenido de manera biológica (fermentación) es un proceso que se

puede escalar si se relaciona el coeficiente de transferencia de oxígeno y el volumen de

medio de cultivo; sin embargo al mantener constante el coeficiente de transferencia de

oxígeno este escalado no es factible.

A mayor aireación, mayor coeficiente de transferencia de oxígeno al medio de cultivo.

A medida que aumenta el volumen del medio de cultivo se necesita mayor aireación

para lograr mantener constante el coeficiente de transferencia de oxígeno.

CAPÍTULO VI RECOMENDACIONES


CAPÍTULO VI

VI.-1

RECOMENDACIONES

VI.-1 Para el método de Winkler:

Aún cuando se fija el oxígeno disuelto con el sulfato de manganeso es necesario

agitar por inversión con mucho cuidado ya que si existe una columna de aire muy

alta sobre el nivel del líquido, este aire puede reaccionar con el sulfato en exceso

produciendo errores.

El volumen de líquido que se fija (200 ml) se divide en cuatro volúmenes más

pequeños (de 50 ml cada uno) y esta manipulación produce errores.

El tiosulfato de sodio se degrada muy rápidamente (en cuatro días cambió de 0.0123

a 0.011665 N) por lo cual se hace necesario estandarizar la solución diariamente con

dicromato de potasio.

Para volúmenes de muestra mayores a 70 ml, se debe tener mayor cuidado luego de

agregarle el ácido sulfúrico puesto que se libera una mayor cantidad de yodo lo cual

puede levantar la tapa de la fiola yodométrica produciendo pérdidas de yodo y

errores de titulación.

Es importante levantar la tapa con cuidado para la primera adición de tiosulfato para

evitar pérdidas de yodo gaseoso. También se debe mantener la temperatura de

titulación y preferiblemente no estar por encima de 30 ºC puesto que todo el yodo

está gaseoso a esta temperatura.

El método de Winkler sólo puede ser aplicable si el medio de cultivo se sustituye por

agua puesto que los virajes de color no son observables en el suero (de color

amarillo).

El trasvase de la muestra para fijar el oxígeno disuelto también se hace por manguera

por lo que también presenta errores.


CAPÍTULO VI

VI.-2

VI.-2 Para el método estático:

A mayor aireación, se le adhieren burbujas al electrodo en la membrana semi-

permeable lo cual produce errores de lectura. Las burbujas se eliminan agitando el

electrodo y este movimiento produce aireación adicional en el sistema así que, se

debe prevenir este hecho colocando el electrodo en una zona alejada de donde

emerjen las burbujas.

Estudiando este método con agua, se observa el taponamiento de la frita con

partículas que no son eliminados ni por filtración ni por ebullición por lo cual es

necesario un tratamiento engorroso para el mantenimiento de la frita (aireación a

presión, ácido nítrico concentrado, horno de templado, etc.). Así que, al trabajar con

este método usando el suero como medio de cultivo, se hace necesario el

mantenimiento de la frita cada vez que se termine cada corrida.

Se debe tomar una lectura luego de parar la aireación cuando el sistema estabilice ya

que este es el punto de comparación entre el método estático y el método de Winkler.

Es difícil mantener las mismas condiciones de aireación cada vez que se repite el

experimento ya que el taponamiento de la frita ofrece una resistencia adicional que el

aire entrante debe vencer para poder entrar al sistema fermentativo.


CAPÍTULO VI

VI.-3

VI.-3 Para el método dinámico de Humphrey:

Se necesitan aproximadamente treinta minutos de reposo para poder recuperar 200

mL de espuma formada por lo cual se hace necesario el uso de antiespumante de

base aceite para evitar la formación de espuma.

La columna de sílica gel contiene una parte de cal sodada (soda lime) para lograr

eliminar toda la humedad del aire comprimido y de esta manera evitar el transporte

de microorganismos contaminantes al sistema fermentativo.

La columna de algodón sirve para eliminar posibles microorganismos que pasen con

el aire, también elimina partículas suspendidas y esta columna es obligatoria para

lograr mantener la asepsia del sistema.

Dentro del sistema fermentativo se encuentra un termopar conectado a una

termocupla para registrar la temperatura del sistema y este termopar se debe

esterilizar por medio de una solución de metabisulfito de sodio de 0.5 g/L antes de

ser sumergido al sistema.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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APÉNDICE A MUESTRA DE CÁLCULO


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-1

MUESTRA DE CÁLCULO

A.-2 Calibración del rotámetro utilizado

Se calibró el rotámetro haciendo uso del anemómetro y conociendo la altura del

flotador. El flujo de aire se controlaba a través de una válvula. Este rotámetro fue utilizado

solo en las experiencias para 1 l y 2 l de medio de cultivo debido a que para el volumen de

300 ml los caudales de aire suministrados eran muy pequeños y no eran percibidos por este

rotámetro, asi que se utilizó un rotámetro digital que directamente registra caudales de aire

en minml . Los datos recopilados para la curva de calibración del rotámetro.

Tabla A.1: Datos recopilados para la calibración del rotámetro usado para las experiencias de 1 l y 2l

Altura del flotador del rotámetro

Presión de salida del compresor (psi)

Velocidad del aire de salida (m/s)

Diámetro interno de la tubería por donde circula el aire (cm)

1 4 0,37 0,59 1,5 5 0,55 0,59 2 5,3 0,91 0,59

2,5 5,5 1,31 0,59 3 6 1,48 0,59

Se calculó el caudal de aire que entra al rotámetro como sigue:

� � � � ��

��

��

��

��

��

l

ml

m

lsmAs

mvmlQ1

1000*

1

1000*

min1

60*)(*min 3

2

4

*)(

22 D

mA�

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-2

4

100

1*59,0*

)(

2

2 �

��

��

��

�cm

mcm

mA

�

22 05*75,2)( mEmA ��

� � ��

��

��

��

��

��

l

ml

m

lsmEs

mmlQ1

1000*

1

1000*

min1

60*0575,2*37,0min 3

2

� � min94,606minmlmlQ �

Tabla A.2: Caudales de aire suministrado para cada altura de rotámetro utilizado.

Altura del flotador Caudal de aire

suministrado (ml/min) 1 607

1,5 902 2 1493

2,5 2149 3 2428

Se graficó el caudal de aire que entra al rotámetro en función de la altura del

flotador del mismo y se le realizó una regresión lineal para conocer la línea de tendencia.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-3

y = 1,24E+03x - 9,39E+02

R2 = 9,81E-01

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5 6Altura del flotador

Cau

dal (

ml/

min

)

calibración de rotámetro pequeño Regresión lineal

Gráfico A.1: Calibración del rotámetro utilizado para las experiencias de 1 l y 2 l y su regresión lineal.

A.-2 Cálculo del flujo volumétrico de aire utilizado de acuerdo a la aireación necesaria y

el volumen de medio de cultivo.

Para sistemas fermentativos la aireación se expresa en términos de V.V.M la cual es

una relación entre el volumen de aire suministrado por volumen de medio de cultivo. Así,

al fijar el volumen del medio de cultivo utilizado y conociendo a través de la bibliografía

que el valor máximo utilizado para producir butanodiol es 1 V.V.M, podemos escoger los

volúmenes y las aireaciones necesarias para cada sistema fermentativo. Entonces para 1 L

de medio de cultivo y una aireación de 0,3 V.V.M se requiere:


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-4

)(

min)/(..

mledioVolumendem

mlflujoaireMVV �

ml

mlflujoaire

1000

min)/(min

13,0 �

min/300mleFlujodeair �

Con la curva de calibración del rotámetro obtenida en el paso A.1 se realizó el

mismo cálculo anterior para las distintas aireaciones en los diferentes volúmenes. Los

resultados son recopilados en las tablas A.3, A.4 y A.5.

Tabla A.3: Altura de flotador del rotámetro necesaria para obtener las aireaciones del sistema de fermentación

en estudio, para un volumen de 1 l de medio de cultivo.

Altura rotámetro Presión de salida

(psi)Caudal de aire

(ml/min) Aireación(V.V.M )

1 4 306 0,3 1,2 4,5 553 0,5 1,5 5 924 1



Altura rotámetro Presión de salida

(psi)Caudal de aire

(ml/min) Aireación(V.V.M)

1,2 4,5 553 0,3 1,6 5 1048 0,5 2,5 5,2 2160 1


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-5

Tabla A.5: Caudal de aire necesario para obtener las aireaciones del sistema de fermentación en estudio, para

un volumen de 300 ml de medio de cultivo.

Presión de salida (psi)

Caudal de aire (ml/min)

Aireación(V.V.M)

2 96 0,3

2,5 159 0,5

3 312 1

A.-2 Cálculo de la concentración de oxígeno disuelto a través del método de Winkler.

A través del método de Winkler se realiza una titulación yodométrica para conocer

la concentración de oxígeno disuelto al sustituir el medio de cultivo de la fermentación por

agua. Primero se desoxigena el agua por ebullición de la misma y esta es trasvasada a la

columna de fermentación, donde se conecta al sistema de aireación y, al iniciar la aireación

se pulsa el cronómetro para conocer el tiempo de aireación.

Al terminar el periodo de aireación se detiene el cronómetro y se toma una muestra

de 200 ml de agua oxigenada a la cual se le fija el oxígeno disuelto. Previamente se

normaliza la solución de tiosulfato de sodio. Tomando como ejemplo los datos recolectados

para 300 ml de volumen de medio de cultivo y aireación media, mostrados en la tabla A.-6,

se realizaron los siguientes cálculos.

Tabla A.-6: Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el método

de Winkler para 300 ml de volumen de medio y 0,3 V.V.M de aireación en su primera repetición.

Primera corrida Normalidad del 0,013256 0,013256 0,013256 0,013256


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-6

tiosulfato de sodio (N) Volumen de muestra

(ml) 50 50 50 50 Volumen de tiosulfato

gastado (ml) 4,8 5,1 5,8 4,5

Haciendo uso de las reacciones químicas presentadas como ecuaciones Ec.-3 hasta

Ec.-7 en el capítulo II de este proyecto, se calculó la concentración de oxígeno disuelto en

el medio como se muestra a continuación:

Para:

[O2] [=] ppm [=] mg/l,

Ntios [=] equi/l,

Vtios [=] Vmuesra [=] l.

mL

Omol

mg

OHMnmol

Omol

SOMnmol

OHMnmol

Imol

SOMnmol

OSmol

Imol

OSequi

OSmolmLN

O50

.1

32000*

)(.4

.1*

)(.1

)(.2*

.1

)(.1*

.2

.1*

.2

.1*3.6*009963.0

][23

2

342

3

2

342

232

22

32

232

2

��

��

��

��

��

��

��

��

�

��

�

��

�

��

�

��

�

��

�

ppmO 0,5][ 2 �

A.-3 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto usando la

concentración de oxígeno disuelto determinado a través del método de Winkler.

Tiempo de aireación (min,s,cs) 30,00,45

muestra

tiostios

V

Omol

mg

OHMnmol

Omol

SOMnmol

OHMnmol

Imol

SOMnmol

OSmol

Imol

OSequi

OSmolVN

O��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

�

��

�

23

2

342

3

2

3422

32

22

32

232

2

.1

32000*

)(.4

.1*

)(.1

)(.2*

.1

)(.1*

.2

.1*

.2

.1**

][


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-7

Conociendo la concentración final de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, se

utilizó la ecuación Ec.- 10 mostrada en el capítulo II, tomando que la concentración inicial

de oxígeno disuelto es cero y colocando el tiempo de aireación en minutos, entonces para el

ejemplo se tiene:

� �tOO

CaK ifl �

��

][][* 22*

(Ec. 10)

�

��

��

��

��

ss

ppmppmCaKl

60

min1*36,0min30

00,5* *

min/2.0min/167.0* * ppmppmCaKl ��

De la misma manera se realizó para los cuatro volúmenes recolectados de muestra y

se calculó un promedio de los valores de **CaKl para ser reportado como valor final.

A.-4 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto a través del método

estático.

El método estático y el de Winkler se realizaban paralelamente cuando el medio de

cultivo era agua pura debido a que durante el tiempo de aireación del medio de cultivo, se

registraban valores de concentración de oxígeno disuelto cada minuto, leído a través del

electrodo que mide oxígeno disuelto y con el método de Winkler se registraba el tiempo

total de aireación.

Primero se leyó la concentración inicial de oxígeno disuelto en el medio una vez que

este era trasvasado al biorreactor y se anotaba este dato como valor de concentración de


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-8

oxígeno en un tiempo cero y luego se reportaban valores cada minuto como los mostrados a

continuación en la tabla A.-7.

Tabla A.7.- Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero desgasificados

con 1 l de volumen y 0,3 V.V.M de aireación para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el

método estático.

t, (min) [O2]agua 1, ppm

[O2]agua 2, ppm

[O2]agua 3, ppm

[O2]suero,ppm

0 0,74 0,55 0,43 1,22 1 0,97 0,60 0,43 3,94 2 1,17 1,36 0,58 4,31 3 1,59 1,98 0,95 4,64 4 1,81 2,42 1,09 4,96 5 2,01 2,88 1,39 5,21 6 2,37 3,17 1,50 5,46 7 2,48 3,52 1,63 5,72 8 2,57 3,92 2,01 6,18 9 2,82 4,16 2,33 6,24

10 3,04 4,33 2,31 6,28 11 3,17 4,30 2,54 6,31 12 3,43 4,50 2,57 6,32 13 3,50 4,50 3,12 6,35 14 3,68 4,54 3,33 6,36 15 3,96 4,68 3,29 6,38 16 3,83 4,78 3,48 6,39 17 3,96 4,92 3,75 6,41 18 3,97 5,00 3,67 6,39 19 4,11 4,98 3,99 6,42 20 4,23 5,11 3,85 6,43

21 4,32 5,22 4,17 6,32

22 4,41 5,14 4,17 6,36 23 4,52 5,38 4,21 6,39 24 4,62 5,23 4,24 6,39 25 4,55 5,23 4,69 6,39 26 4,53 5,49 4,79 6,40 27 4,90 5,45 5,12 6,41 28 4,70 5,47 5,23 6,41 29 4,72 5,59 4,97 6,44 30 4,88 5,57 4,93 6,46 31 5,08 5,64 4,92 6,47 32 4,96 5,64 5,29 6,49 33 4,97 5,85 5,10 6,48 34 5,07 5,74 5,09 6,49 35 4,94 5,81 5,23 6,48

36 5,21 5,62 5,21 6,47 37 5,15 5,65 5,28 6,48 38 5,04 5,78 5,12 6,48 39 5,31 5,76 5,30 6,49 40 5,24 5,87 5,27 6,50 41 5,19 5,93 5,25 6,48 42 5,28 5,92 5,28 6,47 43 5,31 6,04 5,51 6,49 44 5,37 5,96 5,36 6,49 45 5,29 5,86 5,41 6,51

Con estos datos se construyó una gráfica concentración de oxígeno disuelto versus

tiempo de aireación como la expuesta en la gráfica A.2.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-9

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Agua 1 Agua 2 Agua 3 Suero

Gráfico A.2: Representación esquemática de los datos experimentales de la concentración de oxígeno disuelto

en agua y suero durante el período de aireación para 1l de volumen y 0,3 V.V.M de aireación.

Con estas curvas se graficó una curva de tendencia para cada una de ellas y se

obtuvo sus respectivas ecuaciones de tendencia. En el caso del agua pura se realizaba este

procedimiento por triplicado y, en el caso del suero, se realizaba sólo una vez debido a que

el suero contiene iones sulfito los cuales son envenenadores del cátodo del electrodo que

mide oxígeno disuelto. Para explicar este paso se tomaron las muestras de agua y se

muestran en la gráfica A.3.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-10

y�= ��0,002x2�+ �0,217x �+ �0,997

y�= ��0,003x2�+ �0,264x �+ �1,403

y�= ��0,003x2�+ �0,254x �+ �0,185

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

Agua 1 Agua 2Agua 3 Curva de tendencia 1 (Agua 1)Curva de tendencia 2 (Agua 2) Curva de tendencia 3 (Agua 3)

Gráfico A.3.: Representación esquemática de las líneas de tendencia y sus ecuaciones respectivas a las cuales se

ajusta las curvas de concentración de oxígeno disuelto en agua durante el período de aireación para 1l de volumen y 0,3

V.V.M de aireación.

Se derivaron cada una de estas funciones cuadráticas de tendencia y se calculó el

coeficiente de transferencia de oxígeno según la ecuación Ec. 12, como la pendiente de la

derivada multiplicada por -1

� � taKCC LL *ln * �� (Ec. 12)

Tabla A.8.- Funciones de tendencia y sus respectivas derivadas para el cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno

usando agua como medio de cultivo según el método estático.

Funciones de tendencia Derivadas Kla (1/min)

Y1 = -0,002x2 + 0,217x + 0,997 dY/dX=-0,004*X+0,217 0,004

Y2= -0,003x2 + 0,264x + 1,403 dY/dX=-0,006*X+0,264 0,006

Y3= -0,003x2 + 0,254x + 0,185 dY/dX=-0,006*X+0,254 0,006


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-11

Luego, se calculó un valor del coeficiente global de transferencia de oxígeno

promedio para el caso del agua, según la ecuación:

n

aKaK

ni

iiL

promL

��

�� 1

)(

3

min/1)006,0006,0004,0( �promLaK

1min0053,0 ��promLaK

Por último, como se realizaron las muestras con agua por triplicado, se hace

necesario conocer la desviación estándar normal y para esto se le aplica la siguiente

ecuación:

1

)(1

2

�

��

�

n

XXS

ni

ipromi

n

13

min)005,0006,0(min)005,0006,0(min)005,0004,0( 121212

��

��

nS

1min001,0 ��nS

Cabe destacar que cuando se utilizaba suero como medio de cultivo, la experiencia

se realizaba una sola vez debido a que el suero presenta iones sulfito en solución los cuales,


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-12

son envenenadores del cátodo del electrodo, así que el cálculo de la desviación estándar

solo fue realizado cuando la muestra analizada era agua.

Por lo tanto, el valor del coeficiente global de transferencia de oxígeno para este

caso, es:

1min00,001,0 ��aK L

De la misma manera se realizaron los cálculos del coeficiente de transferencia de

oxígeno según el método estático para los diferentes volúmenes y aireaciones, tanto para el

agua como para el suero.

A.-5 Cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno disuelto a través del método

dinámico de Humphrey.

Para la realización de este método primeramente, se montaba el sistema de

fermentación con suero como medio de cultivo y un pre-inóculo de cepas de Klebsiella

Oxytoca como microorganismo. Una vez cumplidas 24 horas de fermentación, se

registraban valores de concentración de oxígeno disuelto en el medio versus tiempo.

Durante los primeros diez minutos el sistema no era perturbado; al cumplir dicho tiempo se

apagaba la bomba de alimentación de aire al sistema de fermentación y se recolectaban los

valores de oxígeno disuelto cada minuto hasta que dicha concentración llegaba

aproximadamente a 1 ppm. En ese momento se reiniciaba la aireación al sistema

fermentativo y se seguían tomando los datos hasta cumplir 70 minutos de estudio o hasta

que se llegara al estado estacionario. Los datos tomados para este ejemplo son de la tabla

A.9 para un volumen de medio de cultivo de 1 l y aireación media.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-13

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Datos recopilados Líneas de tendencia

Tabla A.9 : Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para el sistema fermentativo de 1 l

de volumen y 0,5 V.V.M de aireación para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno mediante el

método dinámico de Humphrey.

t(min)

[O2] ppm

0 5,37 1 5,3 2 5,37 3 5,41 4 5,42 5 5,52 6 5,45 7 5,42 8 5,39 9 5,41

10 5,52 11 5,52 12 4,01 13 3,53

14 3,34 15 3,22 16 3,09 17 3,01 18 2,96 19 2,89 20 2,83 21 2,75 22 2,68 23 1,83 24 1,99 25 1,91 26 1,94 27 2,34 28 2,69 29 3,14

30 3,29 31 3,41 32 3,52 33 3,65 34 3,81 35 3,98 36 4,09 37 4,25 38 4,31 39 4,39 40 4,42 41 4,44 42 4,49 43 4,5 44 4,51 45 4,54

46 4,65 47 4,66 48 4,67 49 4,67 50 4,69 51 4,68 52 4,61 53 4,59 54 4,53 55 4,52 56 4,53 57 4,54 58 4,54 59 4,47 60 4,53 61 4,56

62 4,55 63 4,53 64 4,52 65 4,5 66 4,49 67 4,46 68 4,48 69 4,49 70 4,46

Gráfico A.4: Representación esquemática de los datos experimentales de la concentración de oxígeno

disuelto en el sistema fermentativo para 1l de volumen y 0,5 V.V.M de aireación según el método dinámico de

Humphrey


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-14

y�= �0,0131x �+ �5,3531

5,2

5,4

5,6

5,8

6

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (min)

conc

entr

ació

n de

oxí

geno

di

suel

to (p

pm)

Luego los datos fueron separados para obtener cada línea de tendencia, mostrada

como la línea azul, como se muestra a continuación.

Tabla A.10: Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para el sistema

fermentativo de 1 l de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de

oxígeno mediante el método dinámico de Humphrey

Gráfico A.5: Representación esquemática de la concentración de oxígeno disuelto en una solución durante el período de

aireación para 1l de volumen y 0,3 V.V.M de aireación.

t (min) [O2] ppm

0 5,37

1 5,3

2 5,37

3 5,41

4 5,42

5 5,52

6 5,45

7 5,42

8 5,39

9 5,41

10 5,52

11 5,52


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-15

y�= ��0,1881x�+ �6,4019

0

1

2

3

4

5

6

10 15 20 25Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Tabla A.11.- Concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero desgasificados con 1 l de volumen y

0,3 V.V.M de aireación.


aireación para 1l de volumen y 0,3 V.V.M de aireación


0,3 V.V.M de aireación .

11 5,52

12 4,01

13 3,53

14 3,34

15 3,22

16 3,09

17 3,01

18 2,96

19 2,89

20 2,83

21 2,75

22 2,68

23 1,83


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-16

y�= ��0,007x2�+ �0,6155x ��9,0466

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

23 28 33 38 43 48

Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

24 1,99

25 1,91

26 1,94

27 2,34

28 2,69

29 3,14

30 3,29

31 3,41

32 3,52

33 3,65

34 3,81

35 3,98

36 4,09

37 4,25

38 4,31

39 4,39

40 4,42

41 4,44

42 4,49

43 4,5

44 4,51

45 4,54

46 4,65


aireación para 1l de volumen y 0,3 V.V.M de aireación.


0,3 V.V.M de aireación.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-17

y�= ��0,009x �+ �5,0792

4

4,1

4,2

4,3

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

5

45 50 55 60 65 70 75

Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

47 4,66

48 4,67

49 4,67

50 4,69

51 4,68

52 4,61

53 4,59

54 4,53

55 4,52

56 4,53

57 4,54

58 4,54

59 4,47

60 4,53

61 4,56

62 4,55

63 4,53

64 4,52

65 4,5

66 4,49

67 4,46

68 4,48

69 4,49

70 4,46


aireación para 1l de volumen y aireación baja.

Luego, la gráfica A.5 muestra una curva polinómica de segundo orden la cual

representa la diferencia entre la transferencia de oxígeno hacia la solución y la demanda de

oxígeno por la respiración del microorganismo, así que se deriva la función de tendencia de

esta curva y luego se calcula el coeficiente de transferencia de oxígeno sabiendo que la

línea recta obtenida de la derivada de la función tiene como pendiente -1/KLa.

Función de tendencia Derivada de la función Pendiente de la derivada


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-18

y = -0,007x2 + 0,615x - 9,046 dY/dX=-0,014*X+0,615 -0,014

pendienteaK L

1��

014,01

��

�aK L

1min43,71 ��aK L

De igual forma se realizó el cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno

disuelto según el método dinámico de Humphrey para diferentes volúmenes y aireaciones.

A.-6 Cálculo de la salinidad del suero.

La salinidad es un factor que influye en la lectura del electrodo que mide oxígeno

disuelto por lo cual se hace necesario introducir este valor en el registrador del electrodo

para que presente el valor correcto de oxígeno disuelto. Para determinar el valor de la

salinidad del suero se preparó una serie de soluciones con concentración conocida de

cloruro de sodio y se les midió la conductividad en mSiems. Con estos valores se construyó

una gráfica de conductividad en función de la concentración de sal en la solución y se le

graficó una línea de tendencia con su respectiva ecuación. Este procedimiento se muestra a

continuación.

Tabla A.14.- Datos de las soluciones salinas preparadas y su conductividad eléctrica medida para la determinación de la

salinidad del suero de leche.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-19

masa NaCl pesado (g)

Volumen de enrase (ml)

Concentración de la solución (g NaCl /ml)

Conductividad leída (mS)

0 100 0 1,00

0,1054 100 0,001054 3,25

0,2033 100 0,002033 6,07

0,3087 100 0,003087 9,06

0,4037 100 0,004037 11,63

0,5060 100 0,00506 14,50

y�= �0,0004x��0,0003

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0 5 10 15

Conductividad (mS)

Con

cent

raci

ón d

e N

aCl (

g/m

L)

Datos recopilados Línea de tendencia obtenida

Gráfico A.9: Representación gráfica del comportamiento de la concentración de sales presentes en el suero en función de

la conductividad eléctrica

Luego, se midió la conductividad del suero usado para cada experiencia y haciendo

uso de la ecuación de tendencia obtenida se calculó la concentración de sal disuelta en el

suero. El ejemplo del cálculo se muestra a continuación.

Tabla A.15.- Conductividad eléctrica medida para suero utilizado para el sistema fermentativo con 300 ml de volumen de

medio de cultivo y aireación baja.

Volumen del Aireación Conductividad (mS)


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-20

medio

300 mL 0,3 V.V.M 9,34

mlgmSdadConductivimSml

gNaCl 0003.0)(**0004.0][ ��

mlgmSmSml

gNaCl 0003,034,9**0004,0][ ��

mlgNaCl /194,3][ �

De la misma manera se realizó para todas las muestras de suero utilizadas. Este

valor se introducía en el registrador del electrodo para, de esta manera, tener el valor real de

la concentración de oxígeno disuelto en el medio salino.

A.-7 Cálculo del contenido de lactosa en una muestra de suero.

Se medió el contenido de lactosa a través de un método colorimétrico usando ácido

pícrico. Se tomaba una muestra de 2 ml de suero, se enrasó con solución de ácido pícrico

saturado hasta 100 ml y se filtró. Se tomaron 10 ml de este filtrado y se agregó 10 ml de

agua destilada, 10 ml de solución de bicarbonato de sodio al 22 % y 10 ml de ácido pícrico

saturado en un balón aforado de 100 ml. Esta mezcla se colocó en baño de María destapada

por 20 minutos a 70ºC. Se enfrió la solución y se diluyó hasta el aforo con agua destilada y

se homogeneizó para medirle la densidad óptica a 520 nm. El mismo procedimiento se

realizó para una solución de 4 g/l de lactosa. Se registraron los valores de absorbancia tanto

para la muestra problema como para la solución patrón.

La concentración de lactosa se mide haciendo uso de la siguiente ecuación.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-21

5*%p

m

A

ALactosa �

Tabla A.16.-Datos recopilados para muestras, necesarios para el cálculo de la concentración de lactosa

Muestras de lactosa

Absorbancia leída

Patrón 0,254

1 0,574

La concentración de lactosa para este ejemplo es:

5*254,0574,0

% �Lactosa

%213,2% �Lactosa

A.-7 Cálculo del contenido de glucosa en una muestra de suero.

Este cálculo se realizó mediante el método enzimático el cual es el mismo que se

utiliza para conocer la concentración de glicemia en la sangre. Se coloca 1 ml de reactivo

de glucosa en tubos etiquetados como patrón y muestra. Luego, se precalientan ambos

tubos por cinco minutos a 37ºC. Después se coloca 0.01 ml de la muestra en su respectivo

tubo y se mezcla bien y se incuban los tubos a 37 ºC por 10 minutos. Finalmente se mide la

absorbancia de la muestra y el patrón a 500 nm y se registran estos valores.

Para conocer la concentración de glucosa en la muestra se utiliza la siguiente

ecuación:

274.0*)/(%cosp

m

A

AVmaGlu �


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE A

A.-22

Para detallar este cálculo se toma el siguiente ejemplo.

Tabla A.17.- Datos recopilados para muestras, necesarios para el cálculo de la concentración de glucosa

Muestras de glucosa

Absorbancia leída

Patrón 0,060

1 1,269

274.0*060,0

269,1)/(%cos �VmaGlu

%795,5)/(%cos �VmaGlu

APÉNDICE B

DATOS RECOPILADOS

�Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno y su influencia en el escalado de biorreactores

________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

B.1.- Datos recopilados para la realización del método de Winkler.

Tabla A.1: (a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación baja en su primera repetición. (b) Tiempo total de

aireación y concentración promedio de oxígeno disuelto en la muestra

Primera corrida

Normalidad de tiosulfato de sodio (N) 0,013256 0,013256 0,013256 0,013256

Volumen muestra (mL) 50 50 50 50

Volumen tiosulfato gastado (mL) 4,8 5,1 5,8 4,5

Concentración de oxígeno disuelto

calculado (ppm) 5,09 5,41 6,15 4,77

(a)

Tiempo de aireación (min,s,cs) 30,00,45 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,36

(b)

Tabla B.-1: (a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación baja en su segunda repetición. (b) Tiempo total de


Segunda corrida Normalidad de tiosulfato de sodio (N) 0,013256 0,013256 0,013256 0,013256

Volumen muestra (mL) 50 50 50 50 Volumen tiosulfato gastado (mL) 5,1 5,3 4,9 4,5


calculado (ppm) 5,41 5,62 5,20 4,77

(a)

Tiempo de aireación (min,s,cs) 30.00.59 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,25

(b)


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

Tabla B.-2: (a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación baja en su tercera repetición. (b) Tiempo total de


Tercera corrida





calculado (ppm) 5,94 6,15 4,35 5,94

(a)


promedio (ppm) 5,59

(b)

Tablas B.3: (a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación media en su primera repetición. (b) Tiempo total de


Primera corrida Normalidad de tiosulfato de sodio (N) 0,009963 0,009963 0,009963 0,009963



calculado (ppm) 5,02 5,18 5,42 5,50

(a)


promedio (ppm) 5,28

(b)

Tablas B.4 :(a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación media en su segunda repetición. (b) Tiempo total de




Concentración de oxígeno disuelto calculado (ppm) 5,18 5,50 5,74 5,90


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-3

�

(b)

Tablas B.5:(a) Datos experimentales para la determinación de oxígeno disuelto de aire en agua determinado por el

método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación media en su tercera repetición. (b) Tiempo total de


Tercera corrida



Volumen tiosulfato gastado (mL) 6,9 6,8 7,3 7

Concentración de oxígeno disuelto calculado

(ppm) 5,50 5,42 5,82 5,58

(a)

�

(b)


método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación alta en su primera repetición. (b) Tiempo total de





(ppm) 5,93 6,24 5,32 5,52

(a)


promedio (ppm) 5,75

(b)


promedio (ppm) 5,58


promedio (ppm) 5,6


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-4


método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación alta en su segunda repetición. (b) Tiempo total de





(ppm) 6,24 5,01 5,52 5,93

(a)


promedio (ppm) 5,68

(b)


método de Winkler para 300 mL de volumen de medio y aireación alta en su tercera repetición. (b) Tiempo total de


Tercera corrida Normalidad de tiosulfato de sodio (N) 0,012784 0,012784 0,012784 0,012784



calculado (ppm) 5,83 5,62 6,44 5,93

(a)

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación baja en su primera repetición. (b) Tiempo total de aireación

y concentración promedio de oxígeno disuelto en la muestra





promedio (ppm) 5,96


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-5

(a)

Tiempo de aireación (min,s,cs) 45.00,14 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,54

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación baja en su segunda repetición. (b) Tiempo total de aireación





(ppm) 5,70 5,82 6,18 5,57

(a)


promedio (ppm) 5,82

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación baja en su tercera repetición. (b) Tiempo total de aireación





(ppm) 5,82 6,42 5,82 5,82

(a)

(b)


promedio (ppm) 5,97


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-6


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación media en su primera repetición. (b) Tiempo total de





(ppm) 5,49 5,81 6,35 5,81

(a)


promedio (ppm) 5,87

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación media en su segunda repetición. (b) Tiempo total de


Segunda corrida





(a)

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación media en su tercera repetición. (b) Tiempo total de






promedio (ppm) 6,27


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-7

(a)


promedio (ppm) 5,79

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación alta en su primera repetición. (b) Tiempo total de aireación





calculado (ppm) 6,84 7,24 5,45 5,75

(a)


calculado (ppm) 6,32

(b)


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación alta en su segunda repetición. (b) Tiempo total de aireación





calculado (ppm) 6,35 5,75 6,84 6,55

(a)


promedio (ppm) 6,37

B


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-8


método de Winkler para 1 L de volumen de medio y aireación alta en su tercera repetición. (b) Tiempo total de aireación


Tercera corrida





calculado (ppm) 7,24 5,26 5,75 5,55

(a)

(b)


método de Winkler para 2L de volumen de medio y aireación baja en su primera repetición. (b) Tiempo total de aireación





calculado (ppm) 6,30 5,81 3,44 5,81

(a)

Tiempo de aireación (h.min.s,cs) 1.40.00,37 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,34

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación baja en su segunda repetición. (b) Tiempo total de aireación


Segunda corrida





promedio (ppm) 5,95


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-9


(a)


promedio (ppm) 5,98

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación baja en su tercera repetición. (b) Tiempo total de aireación


Tercera corrida





(a)


promedio (ppm) 5,09

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación media en su primera repetición. (b) Tiempo total de





calculado (ppm) 7,28 4,85 5,13 5,60

(a)


promedio (ppm) 5,72

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación media en su segunda repetición. (b) Tiempo total de



________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-10




calculado (ppm) 7,18 5,22 5,31 6,00

(a)

Tiempo de aireación (h.min.s,cs) 1.40.00.82 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,93

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación media en su tercera repetición. (b) Tiempo total de


Tercera corrida





calculado (ppm) 6,69 5,90 4,13 5,31

(a)

Tiempo de aireación (h.min.s,cs) 1.40.00.47 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 5,51

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación alta en su primera repetición. (b) Tiempo total de aireación


Primera corrida





(ppm) 4,64 5,91 6,96 6,73

(a)


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-11

Tiempo de aireación (h.min.s,cs) 1,40,07,96 Concentración de oxígeno disuelto

promedio (ppm) 6,0591608

(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación alta en su segunda repetición. (b) Tiempo total de aireación


Segunda corrida





calculado (ppm) 5,68 6,26 5,57 5,68

(a)



(b)


método de Winkler para 2 L de volumen de medio y aireación alta en su tercera repetición. (b) Tiempo total de aireación



Volumen muestra (mL) 50 50 50 50 Volumen tiosulfato gastado (mL) 4,6 4,5 5,5 5


calculado (ppm) 5,33 5,22 6,38 5,80

(a)



(b)


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-12

B.2.- Datos recopilados y gráficos realizados para la realización del método estático.

Tabla B.27.- Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero

desgasificados con 300 mL de volumen y aireación baja para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno

según el método estático.�

t, (min) [o2]agua,

ppm[o2]agua,

ppm[o2]agua,

ppm

[O2]suero,ppm

0 0,56 0,43 0,49 0,37

1 1,72 1,23 0,86 2,32

2 2,27 1,98 1,18 3,05

3 3,52 2,34 2,36 4,13

4 3,65 3,06 2,41 4,91

5 5,12 3,56 2,99 5,68

6 6,01 3,83 3,12 6,19

7 4,82 4,16 3,29 6,23

8 5,96 5,03 4,20 6,28

9 5,19 4,76 5,67 6,25

10 5,35 5,12 4,93 6,29

11 5,60 5,04 5,08 6,32

12 5,60 5,24 5,22 6,34

13 5,76 5,38 5,28 6,35

14 5,87 5,49 5,39 6,40

15 5,75 5,71 5,86 6,36

16 5,84 5,96 6,01 6,38

17 5,91 6,15 5,97 6,37

18 6,13 6,27 6,08 6,34

19 5,88 6,03 6,13 6,39

20 5,91 5,86 6,22 6,28

21 6,26 6,00 6,18 6,23

22 6,03 6,16 6,13 6,29

23 6,02 6,05 6,23 6,35

24 6,02 6,08 6,18 6,34

25 6,12 6,10 6,24 6,39

26 6,03 6,07 6,23 6,37

27 6,24 6,09 6,10 6,35

28 6,22 6,14 6,14 6,20

29 6,09 6,10 6,08 6,31

30 6,14 6,05 6,09 6,34

�

y = -0.0102x2 + 0.4224x + 2.0573

y = -0.0109x2 + 0.477x + 1.1137

y = -0.0122x2 + 0.5326x + 0.5525

y = -0,0117x2 + 0,4462x + 2,61970,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroCurva de tendencia (Agua 1) Curva de tendencia (Agua 2)Curva de tendencia (Agua 3) Curva de tendencia (suero)

Gráfico B.1: Representación esquemática de los datos experimentales de la concentración de oxígeno disuelto

en agua y suero durante el período de aireación para 300 mL de volumen y aireación baja y sus curvas de tendencias.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

Tabla B.28.- Funciones de tendencia y sus respectivas derivadas para el cálculo del coeficiente de transferencia de

oxígeno según el método estático tomando un volumen de medio de cultivo de 300 mL y aireación baja.

Promedio para el agua Para el suero

Función de tendencia Y=-0,0111*X2+0,4773*X+1,241 Y= -0,0117*X2 + 0,4462*X + 2,6197

Derivada de la función de tendencia Y=-0,0222*X+0,4773 Y=-0,0234*X+0,4462 Coeficiente de transferencia de

oxígeno (min-1) 0,0222 0,0234


desgasificados con 300 mL de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de

oxígeno según el método estático.�

t, (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,67 0,52 0,55 0,42

1 1,89 1,67 1,70 2,01

2 2,04 1,87 2,15 3,47

3 3,99 2,76 2,48 4,10

4 4,81 3,65 3,02 5,17

5 5,36 4,18 4,16 6,46

6 5,70 4,74 4,81 6,67

7 5,93 5,34 5,48 6,66

8 6,20 5,36 5,87 6,72

9 6,22 6,19 6,19 6,86

10 6,33 6,24 6,36 6,82

11 6,35 6,29 6,39 6,90

12 6,34 6,32 6,44 6,87

13 6,33 6,00 6,40 6,88

14 6,39 6,29 6,42 6,97

15 6,42 6,37 6,38 6,96

16 6,45 6,42 6,46 6,94

17 6,46 6,49 6,53 6,83

18 6,48 6,46 6,40 6,84

19 6,50 6,52 6,38 6,92

20 6,55 6,58 6,61 6,95

21 6,54 6,49 6,64 6,98

22 6,57 6,52 6,62 6,95

23 6,57 6,48 6,60 6,97

24 6,60 6,47 6,56 7,01

25 6,61 6,45 6,58 6,96

26 6,63 6,51 6,48 7,03

27 6,67 6,55 6,43 7,05

28 6,67 6,57 6,48 6,99

29 6,69 6,53 6,42 6,98

30 6,72 6,61 6,49 7,04


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

y = -0.0126x2 + 0.5296x + 1.4761

y = -0.0311x2 + 0.848x + 0.5398

y = -0,0127x2 + 0,496x + 2,7092

y�=��0,0117x2�+�0,4736x�+�2,2651

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (

ppm

)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroPolinómica (Agua 2) Polinómica (Agua 3)Curva de tendencia (suero) Curva de tendencia (Agua 1)


en agua y suero durante el período de aireación para 300 mL de volumen y aireación media y sus curvas de tendencia.


oxígeno usando agua como medio de cultivo según el método estático tomando un volumen de medio de cultivo de 300

mL y aireación media.

. Promedio para el agua Para el suero


Derivada de la función Y=-0,0368*X+0,6171 Y=-0,0254*X+0,496

Coeficiente de transferencia de oxígeno (min-1) 0,0222 0,0254


desgasificados con 300 mL de volumen y aireación alta para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno


t, (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,62 0,49 0,38 0,75

1 2,27 2,16 1,93 3,42

2 4,54 5,05 4,75 5,34


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

3 5,96 5,89 5,79 6,21

4 5,28 6,06 5,89 6,43

5 5,75 6,12 6,19 6,55

6 6,02 6,29 6,58 6,82

7 6,37 6,34 6,61 6,96

8 6,60 6,42 6,65 7,08

9 6,34 6,58 6,67 7,14

10 6,69 6,70 6,70 7,21

11 6,75 6,64 6,70 7,18

12 6,79 6,57 6,71 7,19

13 6,75 6,68 6,75 7,23

14 6,80 6,65 6,79 7,26

15 6,88 6,71 6,81 7,18

16 6,85 6,79 6,82 7,20

17 6,87 6,82 6,86 7,21

18 6,90 6,81 6,93 7,20

19 6,97 6,85 6,96 7,19

20 7,09 6,93 7,02 7,17

21 7,05 6,94 7,16 7,21

22 7,16 7,06 7,13 7,19

23 7,20 7,07 7,18 7,18

24 7,23 7,12 7,17 7,20

25 7,21 7,19 7,15 7,17

26 7,25 7,11 7,19 7,21

27 7,24 7,18 7,23 7,18

28 7,12 7,13 7,12 7,19

29 7,24 7,02 7,10 7,22

30 7,15 7,01 7,09 7,21

�

y = -0.0103x2 + 0.3982x + 3.4003

y = -0.0361x2 + 0.8717x + 2.0848

y = -0,0104x2 + 0,394x + 3,9542

y = -0,0102x2 + 0,4182x + 3,1759

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroCurva de tendencia (Agua 2) Curva de tendencia (Agua 3)Curva de tendencia (suero) Curva de tendencia (Agua 1)

�


en agua y suero durante el período de aireación para 300 mL de volumen y aireación alta.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2


oxígeno usando agua como medio de cultivo según el método estático tomando un volumen de medio de cultivo de 300

mL y aireación alta.



Derivada de la función Y=-0,0376*X+0,5445 Y=-0,0208*X+0,394 Coeficiente de transferencia de oxígeno

(min-1) 0,0376 0,0208

Tabla A.2.- Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero desgasificados

con 1 L de volumen y aireación baja para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el método

estático.�

t, (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm0 0,74 0,55 0,43 1,22 1 0,97 0,60 0,43 3,94 2 1,17 1,36 0,58 4,31 3 1,59 1,98 0,95 4,64 4 1,81 2,42 1,09 4,96 5 2,01 2,88 1,39 5,21 6 2,37 3,17 1,50 5,46 7 2,48 3,52 1,63 5,72 8 2,57 3,92 2,01 6,18 9 2,82 4,16 2,33 6,24

10 3,04 4,33 2,31 6,28 11 3,17 4,30 2,54 6,31 12 3,43 4,50 2,57 6,32 13 3,50 4,50 3,12 6,35 14 3,68 4,54 3,33 6,36 15 3,96 4,68 3,29 6,38 16 3,83 4,78 3,48 6,39 17 3,96 4,92 3,75 6,41 18 3,97 5,00 3,67 6,39 19 4,11 4,98 3,99 6,42 20 4,23 5,11 3,85 6,43

21 4,32 5,22 4,17 6,32 22 4,41 5,14 4,17 6,36 23 4,52 5,38 4,21 6,39

t, (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm24 4,62 5,23 4,24 6,39 25 4,55 5,23 4,69 6,39 26 4,53 5,49 4,79 6,40 27 4,90 5,45 5,12 6,41 28 4,70 5,47 5,23 6,41 29 4,72 5,59 4,97 6,44 30 4,88 5,57 4,93 6,46 31 5,08 5,64 4,92 6,47 32 4,96 5,64 5,29 6,49 33 4,97 5,85 5,10 6,48 34 5,07 5,74 5,09 6,49 35 4,94 5,81 5,23 6,48

36 5,21 5,62 5,21 6,47 37 5,15 5,65 5,28 6,48 38 5,04 5,78 5,12 6,48 39 5,31 5,76 5,30 6,49 40 5,24 5,87 5,27 6,50 41 5,19 5,93 5,25 6,48 42 5,28 5,92 5,28 6,47 43 5,31 6,04 5,51 6,49 44 5,37 5,96 5,36 6,49 45 5,29 5,86 5,41 6,51

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

y = -0.0102x2 + 0.4224x + 2.0573

y = -0.0109x2 + 0.477x + 1.1137

y = -0.0122x2 + 0.5326x + 0.5525

y = -0,0117x2 + 0,4462x + 2,61970,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 5 10 15 20 25 30 35Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)



en agua y suero durante el período de aireación para 1L de volumen y aireación baja.


oxígeno usando agua como medio de cultivo según el método estático tomando un volumen de medio de cultivo de 1 L y

aireación baja.



Derivada de la función Y=-0,0222*X+0,477 Y=0,0234*X+0,4462Coeficiente de transferencia de

oxígeno (min-1) 0,0222 0,0234


desgasificados con 1 L de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno


t, (min) [O2]agua,

ppm[O2] agua,

ppm[O2] agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,66 0,89 0,75 0,55

1 1,34 1,35 1,23 3,29

2 2,08 2,84 2,20 3,76

3 2,74 3,34 2,76 4,17

4 3,43 3,46 3,46 4,70

5 3,80 3,96 3,98 5,11


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

6 4,24 4,25 4,33 5,32

7 4,40 4,36 4,68 5,46

8 4,46 4,49 4,70 5,57

9 4,74 4,69 4,81 5,66

10 4,89 4,74 4,90 5,73

11 4,88 4,61 5,04 5,78

12 5,00 5,02 5,10 5,82

13 4,97 4,97 5,02 5,86

14 5,22 5,02 5,22 5,90

15 5,22 5,25 5,19 5,90

16 5,12 5,11 5,30 5,93

17 4,96 5,10 5,29 5,94

18 5,12 5,13 5,36 6,00

19 5,19 5,19 5,30 6,03

20 5,15 5,11 5,38 6,04

21 5,12 5,13 5,44 5,92

22 5,19 5,27 5,37 5,95

23 5,14 5,39 5,41 5,97

23 5,14 5,39 5,41 5,97

24 5,18 5,48 5,43 6,00

25 5,00 5,35 5,56 6,02

26 4,97 5,50 5,39 6,04

27 5,22 5,43 5,32 6,05

28 5,12 5,40 5,43 6,05

29 4,96 5,55 5,50 6,07

30 5,12 5,59 5,52 6,09

31 5,19 5,61 5,37 6,14

32 5,15 5,47 5,58 6,14

33 5,31 5,53 5,50 6,15

34 5,13 5,53 5,60 6,16

35 5,33 5,56 5,53 6,14

36 5,28 5,56 5,44 6,17

37 5,30 5,55 5,55 6,16

38 5,42 5,47 5,64 6,14

39 5,46 5,55 5,68 6,22

40 5,20 5,69 5,61 6,25

41 5,39 5,70 5,59 6,27

42 5,59 5,65 5,62 6,28

43 5,55 5,70 5,70 6,10

44 5,47 5,74 5,69 6,15

45 5,33 5,61 5,58 6,17

�

�

y�= ��0,02x2�+ �0,585x�+ �1,043

y�= ��1,726E �02x2�+ �5,135E �01x �+ �1,456E +00

y�= ��0,019x2�+ �0,590x �+ �1,096

y�= ��0,02x2�+ �0,5629x �+ �2,27280,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 5 10 15 20 25Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroCurva de tendencia (Agua 1) Curva de tendencia (Agua 2)Curva de tendencia (Agua 3) Línea de tendencia (suero)

Gráfico B.5.: Representación esquemática de la concentración de oxígeno disuelto en una solución durante el

período de aireación para 1L de volumen y aireación media.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2



aireación media.



Derivada de la función Y=-0,0374*X+0,5628 Y=-0,04*X+0,5629 Coeficiente de transferencia de

oxígeno (min-1) 0,0374 0,04


desgasificados con 1 L de volumen y aireación alta para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno


t (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,65 0,48 0,59 0,64

1 1,33 1,08 1,01 4,19

2 1,61 1,75 1,91 4,37

3 2,19 3,12 3,48 4,81

4 3,66 5,33 4,70 5,22

5 4,43 6,27 5,08 5,42

6 5,06 5,64 5,31 5,54

7 5,36 5,69 5,38 5,63

8 5,61 5,85 5,47 5,68

9 5,69 5,77 5,58 5,71

10 5,78 5,76 5,61 5,74

11 5,81 5,83 5,65 5,77

12 5,93 5,81 5,67 5,79

13 5,95 5,84 5,70 5,81

14 5,83 5,85 5,70 5,82

15 5,92 5,86 5,71 5,84

16 5,99 5,79 5,75 5,86

17 5,96 5,83 5,78 5,88

18 5,94 5,96 5,75 5,90

19 6,01 5,81 5,78 5,91

20 6,09 5,84 5,79 5,93

21 6,04 6,12 5,79 5,95

22 6,07 5,86 5,85 5,96

23 6,05 6,15 5,85 5,93

24 6,07 5,84 5,86 5,95

25 6,13 5,97 5,88 5,97

26 6,06 5,94 5,94 5,92

27 6,12 5,87 5,95 5,88

28 6,09 6,01 5,92 5,86

29 6,11 6,00 5,99 5,87

30 6,13 6,01 6,02 5,92

31 6,10 5,96 6,25 5,95

32 6,13 6,00 6,29 5,96

33 6,14 6,08 5,92 5,97

34 6,15 6,01 6,23 6,01

35 6,14 6,01 6,37 6,02

36 6,13 6,60 6,29 6,05

37 6,16 6,61 6,24 6,06

38 6,14 6,21 6,25 6,08

39 6,12 6,18 6,24 6,09

40 6,10 6,14 6,23 6,10

41 6,12 6,27 6,27 6,12

42 6,14 6,20 6,21 6,14

43 6,16 6,18 6,23 6,15

44 6,14 6,16 6,24 6,16

45 6,12 6,17 6,15 6,18


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

y�= ��0,042x2�+ �0,999x �+ �0,262

y�= ��0.1016x2�+ �1.5881x��0.1348

y�= ��0,080x2�+ �1,334x �+ �0,148

y�= ��0,08x2�+ �1,1405x�+ �1,9106

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 2 4 6 8 10 12Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroCurva de tendencia (agua 1) Curva de tendencia (Agua 2)Curva de tendencia (Agua 3) Curva de tendencia suero

Gráfico B.6: Representación esquemática de la concentración de oxígeno disuelto en una solución durante el período de

aireación para 1L de volumen y aireación alta.



aireación alta..



Derivada de la función Y=-0,149*X+1,307 Y=-0,16*X+1,1405 Coeficiente de transferencia de

oxígeno (min-1) 0,149 0,16

Tabla A.38.- Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero

desgasificados con 2 L de volumen y aireación baja para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno


t (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,45 0,77 0,63 1,43

1 0,70 1,21 0,69 1,66

2 0,63 2,97 0,80 2,81

3 0,78 2,48 0,89 3,88

4 0,85 1,95 0,96 4,22

5 1,03 1,94 1,02 4,58

6 1,48 1,99 1,25 4,80

7 1,36 2,17 2,49 4,92

8 1,65 2,40 2,64 5,06

9 1,71 2,57 2,86 5,18


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

10 1,84 2,60 3,09 5,26

11 2,12 2,84 3,59 5,30

12 2,05 2,95 3,69 5,35

13 2,31 3,04 4,39 5,40

14 2,34 3,10 4,19 5,46

15 2,40 3,41 4,06 5,52

16 2,38 3,37 4,18 5,58

17 2,37 3,51 4,12 5,63

18 2,68 3,47 4,10 5,69

19 2,60 3,66 4,20 5,76

20 2,69 3,95 4,13 5,82

21 2,82 3,93 4,08 5,89

22 2,97 4,03 4,15 5,93

23 3,21 4,12 4,34 5,98

24 3,56 4,01 4,58 6,14

25 3,34 4,27 4,57 6,26

26 3,40 4,25 4,56 6,35

27 3,35 4,39 4,52 6,39

28 3,57 4,36 4,60 6,44

29 3,40 4,41 4,65 6,47

30 3,76 4,53 4,70 6,48

31 3,77 4,69 4,68 6,50

32 3,87 4,76 4,51 6,50

33 3,97 4,78 5,07 6,55

34 4,12 5,08 5,01 6,56

35 4,08 5,04 4,98 6,57

36 3,99 5,02 4,94 6,58

37 4,04 4,98 4,96 6,59

38 4,31 4,92 4,97 6,62

39 4,42 4,97 5,18 6,63

40 4,68 4,96 5,16 6,65

41 4,10 5,15 5,24 6,61

42 4,47 5,08 5,26 6,68

43 4,60 5,12 5,24 6,69

44 4,60 5,08 5,27 6,70

45 4,71 5,14 5,31 6,71

46 4,75 5,17 5,36 6,72

47 5,39 5,13 5,36 6,75

48 5,35 5,14 5,19 6,75

49 5,59 5,19 5,20 6,62

50 5,53 5,21 5,48 6,58

51 5,58 5,21 5,49 6,55

52 5,57 5,28 5,41 6,56

53 5,59 5,27 5,45 6,57

54 5,53 5,29 5,52 6,58

55 5,52 5,31 5,49 6,60

56 5,60 5,32 5,26 6,61

57 5,51 5,26 5,38 6,64

58 5,28 5,29 5,26 6,65

59 5,70 5,37 5,55 6,65

60 5,49 5,32 5,52 6,66

61 5,47 5,41 5,52 6,67

62 5,47 5,27 5,55 6,66

63 5,63 5,35 5,53 6,67

64 5,60 5,32 5,54 6,67

65 5,53 5,47 5,59 6,67

66 5,58 5,54 5,61 6,67

67 5,60 5.,34 5,82 6,71

68 5,69 5,26 5,75 6,73

69 5,71 5,53 5,67 6,72

70 5,83 5,40 5,66 6,72

71 5,91 5,45 5,73 6,73

72 5,90 5,40 5,79 6,74

73 6,07 5,43 5,71 6,73

74 6,05 5,61 5,74 6,70

75 6,10 5,46 5,92 6,71

76 6,01 5,58 5,63 6,73

77 6,17 5,45 5,90 6,76

78 5,63 5,37 5,82 6,77

79 5,72 5,59 5,85 6,78

80 5,68 5,60 5,93 6,78

81 5,91 5,42 5,82 6,79

82 5,95 5,51 5,82 6,80

83 6,04 5,67 5,83 6,81

84 6,02 5,59 5,93 6,81

85 5,97 5,56 5,78 6,82

86 5,94 5,61 5,88 6,83

87 5,93 5,59 5,81 6,84

88 5,92 5,59 5,85 6,84

89 5,99 5,65 5,86 6,83

90 5,98 5,62 5,88 6,83

91 5,98 5,59 5,88 6,83

92 6,17 5,64 5,94 6,84

93 6,12 5,56 6,01 6,83

94 6,11 5,63 5,78 6,84

95 6,09 5,58 5,79 6,84

96 5,98 5,60 6,04 6,83


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-3

97 5,99 5,54 6,08 6,76

98 6,01 5,58 6,21 6,73

99 5,97 5,54 6,08 6,75

100 5,98 5,81 6,09 6,76

y�= ��0,001x2�+ �0,139x �+ �0,483

y�= ��0,001x2�+ �0,147x�+ �1,408

y�= ��0,003x2�+ �0,250x �+ �0,596

y�=��0,0065x2�+�0,3141x�+�2,4752

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)



aireación para 2L de volumen y aireación baja.



aireación baja.



Derivada de la función Y=-0,0034*X+0,179 Y=-0,013*X+0,3141Coeficiente de transferencia de

oxígeno (min-1) 0,0034 0,013


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

Tabla A.40.- Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero

desgasificados con 2 L de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno


t (min) [O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2]agua,

ppm[O2] suero,

ppm

0 0,57 0,66 0,92 0,56

1 0,86 2,16 1,19 4,26

2 2,20 3,16 2,80 4,50

3 1,84 3,28 3,49 4,26

4 1,75 3,44 3,67 4,85

5 3,69 4,58 3,86 5,10

6 4,14 4,45 4,41 5,24

7 4,29 4,37 4,39 5,39

8 4,51 4,34 4,52 5,49

9 4,56 4,56 4,69 5,58

10 4,46 4,65 4,77 5,68

11 4,98 4,56 4,71 5,74

12 5,06 4,69 4,89 5,78

13 5,03 4,63 5,01 5,83

14 4,99 4,97 5,06 5,88

15 5,23 5,17 5,11 5,91

16 5,57 5,21 4,95 5,92

17 5,68 5,28 5,12 5,91

18 5,13 4,39 5,10 5,95

19 5,46 4,81 5,10 5,98

20 5,43 4,77 5,19 6,00

21 5,65 5.,04 5,14 6,01

22 5,40 5,09 5,15 6,02

23 5,52 4,84 5,23 6,02

24 5,43 4,99 5,23 6,04

25 5,78 5,10 5,23 6,04

26 5,52 5,16 5,22 6,07

27 5,70 5,27 5,24 6,09

28 5,66 5,16 5,28 6,10

29 5,68 5,56 5,22 6,11

30 5,71 5,57 5,18 6,12

31 6,01 5,57 5,29 6,13

32 5,82 5,55 5,28 6,13

33 5.,90 5,39 5,25 6,14

34 6,02 5,24 5,30 6,15

35 6,00 5,34 5,29 6,16

36 5,67 5,29 5,23 6,17

37 6,05 5,26 5,29 6,18

38 6,18 5,40 5,27 6,18

39 5,93 5,35 5,31 6,19

40 5,84 5,62 5,27 6,20

41 5,80 5,55 5,25 6,20

42 5,87 5,58 5,27 6,04

43 6,06 5,65 5,36 6,06

44 6,09 5,72 5,40 6,08

45 5,99 5,71 5,30 6,11

46 6,33 5,74 5,38 6,13

47 5,98 5,76 5,41 6,15

48 6,01 5,78 5,39 6,14

49 5,98 5,84 5,44 6,15

50 6,05 5,87 5,44 6,16

51 6,31 5,91 5,59 6,10

52 6,21 5,96 5,39 6,08

53 5,72 6,02 5,37 6,11

54 6,40 6,02 5,52 6,12

55 6,12 5,87 5,48 6,15

56 6,15 5,91 5,39 6,16

57 5,82 5,90 5,44 6,19

58 6,17 6,13 5,39 6,20

59 6,27 5,93 5,47 6,21

60 6,00 5,87 5,43 6,20

61 6,11 5,91 5,41 6,20

62 6,01 5,93 5,43 6,23

63 6,16 5,94 5,45 6,23

64 5,99 6,01 5,50 6,24

65 6,01 5,66 5,51 6,26

66 6,15 5,76 5,50 6,30

67 6,14 6,20 5,44 6,30

68 6,08 6,31 5,49 632

69 6,29 6,30 5,46 6,32

70 6,27 5,73 5,49 6,34

71 5,80 5,97 5,52 6,35

72 5,93 5,97 5,45 6,35

73 6,20 6,02 5,54 637

74 6,18 6,01 5,49 6,38

75 6,17 5,94 5,42 6,39

76 5,89 5,96 5,48 6,40


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

77 5,87 5,94 5,50 6,41

78 5,92 5,97 5,50 6,39

79 5,98 5,98 5,52 6,40

80 5,96 5,98 5,50 6,28

81 5,97 6,06 5,62 6,27

82 5,94 6,04 5,52 6,26

83 5,89 6,05 5,59 6,28

84 5,91 6,08 5,57 6,25

85 5,91 6,07 5,54 6,27

86 5,91 5,96 5,67 6,29

87 5,92 5,93 5,58 6,30

88 5,95 5,93 5,60 6,35

89 6,19 6,05 5,58 6,36

90 6,12 6,09 5,53 6,37

91 6,15 6,27 5,61 6,38

92 6,17 6,04 5,67 6,37

93 6,10 5,94 5,60 6,39

94 6,04 6,18 5,59 6,37

95 6,00 6,20 5,53 6,37

96 6,08 6,15 5,62 6,37

97 6,24 6,09 5,59 6,40

98 6,13 6,06 5,69 6,42

99 6,12 6,24 5,71 6,39

100 5,96 6,29 5,88 6,42

.

y�= ��0,018x2�+ �0,604x�+ �0,573

y�= ��0,017x2�+ �0,484x�+ �1,722

y�= ��0,0167x2�+ �0,4752x �+ �2,7647

y�= ��0,0176x2�+ �0,5176x�+ �1,4709

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 5 10 15 20 25Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Agua 1 Agua 2Agua 3 SueroCurva de tendencia (Agua 1) Curva de tendencia (Agua 2)Curva de tendencia (suero) Curva de tendencia (Agua 3)


aireación para 2L de volumen y aireación media.



aireación media.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2



Derivada de la función Y=-0,0.35*X+0,535 Y=-0,1048*X+0,9127 Coeficiente de transferencia de oxígeno

(min-1) 0,035 0,1048

Tabla A.42: Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para agua y el suero desgasificados

con 2 L de volumen y aireación alta para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el método

estático.�

t (min) [O2]agua 1, ppm

[O2]agua 2, ppm

[O2]agua 3, ppm

[O2]suero,ppm

0 0,93 0,71 0,79 0,66

1 1,25 1,32 1,29 4,84

2 1,58 1,78 1,81 5,04

3 2,86 2,63 2,59 5,65

4 3,45 3,46 3,21 6,12

5 3,68 3,96 3,49 6,17

6 4,67 4,44 3,67 6,20

7 4,53 4,59 3,98 6,23

8 4,76 4,67 4,21 6,25

9 4,84 4,72 4,68 6,27

10 5,10 4,96 4,81 6,28

11 5,19 5,08 4,95 6,30

12 5,30 5,21 5,12 6,33

13 5,40 5,36 5,26 6,35

14 5,50 5,41 5,31 6,37

15 5,54 5,58 5,46 6,38

16 5,56 5,54 5,50 6,40

17 5,64 5,61 5,56 6,38

18 5,78 5,68 5,73 6,42

19 5,83 5,74 5,78 6,43

20 5,85 5,77 5,61 6,45

21 5,88 5,83 5,71 6,47

22 5,95 5,84 5,73 6,47

23 6,49 5,89 5,76 6,49

24 5,91 5,91 5,84 6,51

25 5,96 5,94 5,89 6,51

26 5,99 5,96 5,94 6,52

27 5,99 6,02 5,98 6,53

28 5,89 6,02 6,00 6,54

29 6,29 6,17 6,12 6,55

30 6,29 6,08 6,06 6,56

31 6,03 6,14 6,19 6,57

32 5,98 6,11 6,16 6,55

33 6,11 6,12 6,17 6,56

34 6,07 6,17 6,19 6,58

35 6,12 6,16 6,11 6,58

36 6,06 6,17 6,12 6,52

37 6,19 6,18 6,17 6,51

38 6,16 6,06 6,03 6,49

39 6,17 5,99 5,98 6,49

40 6,19 6,12 6,11 6,53

41 6,06 6,17 6,19 6,53

42 5,99 6,20 6,21 6,52

43 6,08 6,23 6,23 6,54

44 6,04 6,16 6,24 6,56

45 6,06 6,15 6,31 6,58

46 6,16 6,18 6,27 6,58

47 6,11 6,17 6,29 6,59

48 6,12 6,20 6,27 6,61

49 6,17 6,21 6,28 6,62

50 6,10 6,19 6,28 6,59

51 6,17 6,15 6,27 6,56

52 6,13 6,17 6,30 6,58

53 6,32 6,20 6,31 6,58

54 6,28 6,21 6,30 6,52

55 6,27 6,20 6,29 6,51

56 6,30 6,23 6,31 6,49

57 6,31 6,25 6,29 6,49

58 6,27 6,26 6,24 6,53

59 6,29 6,28 6,27 6,53


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

60 6,27 6,29 6,30 6,52

61 6,28 6,29 6,31 6,54

62 6,31 6,31 6,27 6,56

63 6,30 6,29 6,29 6,58

64 6,29 6,24 6,31 6,58

65 6,31 6,27 6,30 6,59

66 6,34 6,30 6,29 6,61

67 6,30 6,31 6,31 6,51

68 6,29 6,30 6,24 6,52

69 6,31 6,29 6,28 6,53

70 6,29 6,31 6,29 6,54

71 6,24 6,27 6,28 6,55

72 6,28 6,29 6,33 6,52

73 6,29 6,31 6,21 6,51

74 6,33 6,30 6,25 6,49

75 6,34 6,29 6,24 6,49

76 6,34 6,24 6,27 6,53

77 635 6,27 6,30 6,58

78 6,.38 6,30 6,29 6,58

79 6,28 6,29 6,34 6,59

80 6,33 6,33 6,31 6,61

81 6,21 6,34 6,21 6,62

82 6,25 6,34 6,26 6,59

83 6,34 6,35 6,30 6,53

84 6,31 6,38 6,29 6,52

85 6,21 6,34 6,31 6,54

86 6,26 6,34 6,29 6,56

87 6,30 6,36 6,24 6,51

88 6,35 6,39 6,28 6,49

89 6,29 6,37 6,28 6.,49

90 6,29 6,36 6,29 6,53

91 6,41 6,34 6,33 6,58

92 6,38 6,30 6,34 6,58

93 6,30 6,31 6,34 6,59

94 6,30 6,29 6,35 6,61

95 6,31 6,31 6,38 6,51

96 6,32 6,29 6,34 6,52

97 6,31 6,24 6,30 6,53

98 6,40 6,28 6,30 6,53

99 6,38 6,32 6,31 6,53

100 6,36 6,34 6,34 6,52

�

�

y�= ��0,0188x2�+ �0,6012x �+ �1,0028

y�= ��0,0188x2�+ �0,5973x �+ �0,9856

y�= ��0,0156x2�+ �0,5423x�+ �0,9423

y�= ��0,0196x2�+ �0,5127x�+ �3,4391

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 5 10 15 20 25Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)



aireación para 2L de volumen y aireación alta.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2



aireación alta.



Derivada de la función Y=-0,0354*X+0,5803 Y=-0,0392*X+0,5127 Coeficiente de transferencia de oxígeno

(min-1) 0,0354 0,0392


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-3

B.3.- Datos recopilados y gráficos realizados para la realización del método dinámico de

Humphrey.

Tabla A.44: Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para el sistema de fermentación

con 300 mL de volumen y aireación baja para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el

método dinámico de Humphrey.�

t (min) [O2] leído,

ppm Regresiones

0 5,73 5,73

1 5,70 5,73

2 5,81 5,74

3 5,76 5,75

4 5,77 5,75

5 5,65 5,76

6 5,76 5,76

7 5,77 5,77

8 5,78 5,78

9 5,80 5,78

(*)10 5,80 5,79

11 5,69 5,90

12 5,50 5,46

13 5,11 5,01

14 4,86 4,57

15 4,12 4,12

16 3,65 3,68

17 3,02 3,23

18 2,75 2,79

19 2,34 2,34

(**)20 1,96 1,90

21 2,36 2,44

22 3,43 3,24

23 3,92 3,93

24 4,19 4,50

25 4,89 4,95

26 5,68 5,30

27 5,32 5,52

28 5,41 5,40

29 5,38 5,40

30 5,41 5,40

31 5,39 5,40

32 5,39 5,39

33 5,42 5,39

34 5,38 5,39

35 5,40 5,39

36 5,36 5,39

37 5,38 5,39

38 5,39 5,39

39 5,42 5,38

40 5,37 5,38

(*) Se detuvo la aireación al sistema

(**) Se reinició la aireación al sistema


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

Datos experimentales Líneas de tendencia

�

Gráfico B.10: Representación esquemática de la concentración de oxígeno disuelto en una solución durante el proceso

fermentativo para 300 mL de volumen de medio de cultivo y aireación baja para la realización del método de Humphrey.


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 300 mL y aireación baja.

Zonas estudiadas

Funciones de tendencia Derivada de la función Coeficiente de transferencia de oxígeno (min-1)

Desde t= min hasta t=10 min Y = 0,0061*xX+ 5,7268 - -

Desde t=10 min hasta t=20 min Y = -0,4453*X + 10,803 - -

Desde t=20 min hasta t=27 min Y= -0,057*X2 + 3,2496*X - 40,662 dY/dX=-0,114*X+3,2496 8,7719298

Desde t=28 min hasta t=40 min y = -0,0013x + 5,4353 - -


con 300 mL de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el


t(min) [O2] ppm Regresiones

0 6,33 6,38

1 6,40 6,39

2 6,38 6,41

3 6,46 6,42

4 6,47 6,43

5 6,45 6,44

6 6,46 6,45


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

7 6,48 6,47

8 6,50 6,48

9 6,46 6,49

(*)10 6,47 6,50

11 5,79 5,96

12 5,38 5,25

13 4,76 4,53

14 4,06 3,82

15 3,17 3,11

16 2,39 2,40

(**)17 1,42 1,69

18 2,13 2,33

19 3,31 3,24

20 4,10 4,01

21 4,23 4,63

22 5,46 5,12

23 5,55 5,46

24 5,62 5,67

25 5,68 5,73

26 5,70 5,69

27 5,72 5,70

28 5,77 5,72

29 5,65 5,74

30 5,76 5,76

31 5,77 5,78

32 5,78 5,79

33 5,80 5,81

34 5,80 5,83

35 6,02 5,85

36 6,04 5,86

37 5,87 5,88

38 5,84 5,90

39 5,92 5,92

40 5,94 5,93

�

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35 40Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

Datos experimentales Líneas de tendencia�


fermentativo para 300 mL de volumen de medio de cultivo y aireación media para la realización del método de

Humphrey.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 300 mL y aireación media.

Zonas estudiadas


Desde t=0 min hasta t=10 min y = 0,0121x + 6,3814 - -


Desde t=17 min hasta t=23 min y = -0,0703x2 + 3,5081x - 38,036 dY/dX=-0,1406*X+3,5081 7,1123755



con 300 mL de volumen y aireación alta para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el



0 7,20 7,21

1 7,19 7,21

2 7,17 7,20

3 7,18 7,19

4 7,19 7,18

5 7,31 7,18

6 7,20 7,17

7 7,18 7,16

8 7,21 7,15

9 6,84 7,15

(*)10 7,19 7,14

11 7,22 7,13

12 6,29 6,03

13 4,81 4,76

14 3,12 3,49

15 2,19 2,21

(**)16 1,10 0,94

17 3,42 3,39

18 5,34 5,00

19 6,21 6,12

20 6,43 6,76

21 6,55 6,90

22 6,82 6,55

23 6,56 6,64

24 6,58 6,65

25 6,54 6,66

26 6,41 6,68

27 7,08 6,69

28 6,77 6,70

29 6,65 6,72

30 6,74 6,73

31 6,64 6,75

32 6,70 6,76

33 6,81 6,77

34 6,79 6,79

35 6,82 6,80

36 6,84 6,82

37 6,87 6,83

38 6,81 6,84

39 6,90 6,86

40 6,83 6,87

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)



fermentativo para 300 mL de volumen de medio de cultivo y aireación alta para la realización del método de Humphrey.


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 300 mL y aireación alta.

Zonas estudiadas






�



dinámico de Humphrey.�


0 5,75 5,73

1 5,70 5,73

2 5,72 5,74

3 5,75 5,74

4 5,77 5,75

5 5,76 5,75

6 5,76 5,75


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

7 5,77 5,76

8 5,78 5,76

9 5,80 5,77

(*)10 5,80 5,77

11 5,73 5,77

12 5,65 5,69

13 5,50 5,30

14 5,12 4,90

15 4,76 4,51

16 4,06 4,11

17 3,68 3,72

18 3,09 3,32

19 2,89 2,93

(**)20 2,98 3,03

21 3,09 3,31

22 3,43 3,57

23 3,92 3,81

24 4,12 4,03

25 4,35 4,24

26 4,48 4,43

27 4,65 4,61

28 4,69 4,77

29 4,90 4,91

30 4,91 5,03

31 5,12 5,14

32 5,36 5,23

33 5,32 5,30

34 5,37 5,36

35 5,40 5,41

36 5,43 5,44

37 5,51 5,45

38 5,44 5,44

39 5,47 5,42

40 5,46 5,39

41 5,44 5,48

42 5,44 5,48

43 5,45 5,48

44 5,55 5,48

45 5,53 5,48

46 5,54 5,49

47 5,54 5,49

48 5,56 5,49

49 5,56 5,49

50 5,52 5,49

51 5,53 5,49

52 5,55 5,49

53 5,55 5,49

54 5,54 5,49

55 5,56 5,49

56 5,56 5,50

57 5,55 5,50

58 5,52 5,50

59 5,56 5,50

60 5,53 5,50

61 5,51 5,50

62 5,54 5,50

63 5,53 5,50

64 5,52 5,50

65 5,51 5,50

66 5,51 5,51

67 5,52 5,51

68 5,53 5,51

69 5,52 5,51

70 5,53 5,51

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)

Datos �experimentales L íneas �de�tendenc ia�


fermentativo para 1 L de volumen de medio de cultivo y aireación baja para la realización del método de Humphrey.


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 1 L y aireación baja.

Zonas estudiadas




Desde t=20 min hasta t=35 min y = -8,16E-03x2 + 6,09E-01x - 5,88 dY/dX=-0,01632*X+0,608 61,27

Desde t=35 min hasta t= 40min y = 0,0012x + 5,4593 - -

�

Tabla A.4: Datos experimentales de concentración de oxígeno en función del tiempo para el sistema de fermentación con

1 L de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el método



0 5,37 5,35

1 5,3 5,37

2 5,37 5,38

3 5,41 5,39

4 5,42 5,41

5 5,52 5,42

6 5,45 5,43

7 5,42 5,44


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

8 5,39 5,46

9 5,41 5,47

(*)10 5,52 5,48

11 5,52 5,50

12 4,01 4,15

13 3,53 3,96

14 3,34 3,77

15 3,22 3,58

16 3,09 3,39

17 3,01 3,21

18 2,96 3,02

19 2,89 2,83

20 2,83 2,64

21 2,75 2,45

22 2,68 2,27

(**)23 1,83 2,08

24 1,99 1,78

25 1,91 2,07

26 1,94 2,34

27 2,34 2,59

28 2,69 2,84

29 3,14 3,06

30 3,29 3,27

31 3,41 3,47

32 3,52 3,66

33 3,65 3,82

34 3,81 3,98

35 3,98 4,12

36 4,09 4,25

37 4,25 4,36

38 4,31 4,46

39 4,39 4,55

40 4,42 4,62

41 4,44 4,68

42 4,49 4,73

43 4,5 4,77

44 4,51 4,79

45 4,54 4,80

46 4,65 4,79

47 4,66 4,66

48 4,67 4,65

49 4,67 4,64

50 4,69 4,63

51 4,68 4,62

52 4,61 4,61

53 4,59 4,60

54 4,53 4,59

55 4,52 4,58

56 4,53 4,58

57 4,54 4,57

58 4,54 4,56

59 4,47 4,55

60 4,53 4,54

61 4,56 4,53

62 4,55 4,52

63 4,53 4,51

64 4,52 4,50

65 4,5 4,49

66 4,49 4,49

67 4,46 4,48

68 4,48 4,47

69 4,49 4,46

70 4,46 4,45

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to (p

pm)



fermentativo para 1 L de volumen de medio de cultivo y aireación media para la realización del método de Humphrey.


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 1 L y aireación media.

Zonas estudiadas










0 5,38 5,33

1 5,39 5,33

2 5,42 5,34

3 5,18 5,35

4 5,36 5,35


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

5 5,22 5,36

6 5,36 5,37

7 5,38 5,37

8 5,45 5,38

9 5,46 5,39

(*)10 5,39 5,40

11 4,93 4,54

12 4,73 4,31

13 4,22 4,08

14 4,03 3,86

15 3,79 3,63

16 3,52 3,41

17 3,30 3,18

18 2,98 2,95

19 2,83 2,73

20 2,64 2,50

21 2,57 2,28

22 2,39 2,05

(**)23 2,21 1,82

24 2,39 2,22

25 2,41 2,48

26 2,74 2,73

27 2,95 2,97

28 3,19 3,20

29 3,29 3,41

30 3,49 3,60

31 3,76 3,79

32 3,83 3,96

33 4,19 4,11

34 4,32 4,26

35 4,52 4,39

36 4,59 4,50

37 4,61 4,60

38 4,73 4,69

39 4,76 4,77

40 4,83 4,83

41 4,86 4,87

42 4,87 4,91

43 4,89 4,93

44 4,90 4,93

45 4,91 4,92

46 4,93 4,90

47 4,69 4,87

48 4,71 4,87

49 4,82 4,87

50 5,08 4,87

51 4,95 4,86

52 4,96 4,86

53 5,02 4,86

54 4,98 4,86

55 4,96 4,86

56 4,95 4,86

57 4,93 4,86

58 4,93 4,86

59 4,93 4,86

60 4,90 4,86

61 4,81 4,86

62 4,85 4,86

63 4,86 4,86

64 4,88 4,86

65 4,79 4,86

66 4,81 4,85

67 4,82 4,85

68 4,81 4,85

69 4,79 4,85

70 4,77 4,85

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)



fermentativo para 1 L de volumen de medio de cultivo y aireación alta para la realización del método de Humphrey.

Tabla B.54 Funciones de tendencia y sus respectivas derivadas para el cálculo del coeficiente de transferencia de oxígeno

según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 1 L y aireación alta.

Zonas estudiadas




Desde t=23 min hasta t=38 min y = -6,835E-03x2 + 6,006E-01x - 8,262 dY/dX=-0,1367*X+0,6006 73,153

Desde t=30 min hasta t=70 min y = -3,75E-03x + 5,09 - -




t(min) [O2]ppm Regresiones

0 6,45 6,40

1 6,42 6,38

2 6,38 6,37

3 6,69 6,35

4 6,06 6,33

5 6,09 6,31

6 6,09 6,30

7 6,33 6,28

8 6,28 6,26


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

9 6,08 6,24

(*)10 6,30 6,23

11 6,27 6,21

12 6,64 6,19

13 6,21 6,17

14 6,04 6,16

15 5,98 6,14

16 5,97 5,66

17 5,88 5,40

18 5,62 5,14

19 5,24 4,88

20 4,79 4,62

21 4,40 4,36

22 4,03 4,10

23 3,66 3,84

24 3,36 3,58

25 3,09 3,33

26 2,84 3,07

27 2,60 2,81

28 2,38 2,55

29 2,17 2,29

(**)30 1,94 2,03

31 1,74 1,77

32 2,06 2,54

33 2,83 3,00

34 3,86 3,42

35 4,20 3,80

36 4,57 4,15

37 4,81 4,46

38 4,89 4,74

39 5,03 4,99

40 5,18 5,20

41 5,26 5,37

42 5,30 5,51

43 5,35 5,62

44 5,40 5,69

45 5,46 5,72

46 5,52 5,73

47 5,58 5,69

48 5,63 5,62

49 5,69 5,52

50 5,76 5,38

51 5,82 5,93

52 5,89 5,93

53 5,98 5,93

54 5,94 5,93

55 5,94 5,93

56 5,86 5,93

57 5,95 5,93

58 5,99 5,93

59 5,94 5,93

60 5,97 5,93

61 5,98 5,93

62 5,90 5,93

63 5,90 5,93

64 5,95 5,93

65 5,96 5,93

66 5,97 5,93

67 5,98 5,93

68 5,99 5,93

69 5,82 5,93

70 5,83 5,93

�

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)

Datos �experimentales � L íneas �de�tendenc ia�


fermentativo para 2 L de volumen de medio de cultivo y aireación baja para la realización del método de Humphrey.

�


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 2 L y aireación baja.

Zonas estudiadas



Desde t=10 min hasta t= 30min y = -0,259x + 9.8 - -

Desde t=30 min hasta t= 51min y = -1,742E-02x2 + 1,586x - 3,037E+01 dY/dX=-0,03484*X+1,586 28,702

Desde t=51 min hasta t= 70min y = 2,556E-04x + 5,913 - -


con 2 L de volumen y aireación media para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno según el método



0 6,21 6,20

1 6,28 6,18

2 6,28 6,17

3 6,18 6,15

4 6,04 6,14


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

5 6,05 6,12

6 6,03 6,11

7 6,04 6,09

8 5,99 6,07

9 5,98 6,06

(*)10 6,08 6,04

11 6,06 6,03

12 6,09 6,01

13 6,03 6,00

14 6,01 5,98

15 5,67 5,89

16 5,55 5,58

17 5,42 5,28

18 5,39 4,98

19 4,99 4,67

20 4,40 4,37

21 4,25 4,07

22 3,87 3,76

23 3,40 3,46

24 3,09 3,16

25 2,89 2,86

26 2,57 2,55

27 2,17 2,25

28 1,68 1,95

(*)29 1,92 1,96

30 2,30 2,37

31 2,46 2,75

32 3,01 3,11

33 3,25 3,45

34 3,67 3,77

35 4,50 4,07

36 4,24 4,35

37 4,87 4,61

38 5,07 4,84

39 5,21 5,06

40 5,36 5,25

41 5,39 5,42

42 5,55 5,57

43 5,67 5,70

44 5,72 5,81

45 5,78 5,90

46 5,83 5,96

47 5,85 6,01

48 5,89 6,03

49 5,91 6,03

50 5,91 6,02

51 5,95 5,98

52 5,93 5,91

53 5,92 5,83

54 5,93 5,73

55 5,91 5,93

56 5,93 5,93

57 5,94 5,93

58 5,96 5,93

59 5,94 5,93

60 5,93 5,93

61 5,91 5,94

62 5,91 5,94

63 5,92 5,94

64 5,96 5,94

65 5,94 5,94

66 5,99 5,94

67 5,93 5,94

68 5,92 5,95

69 5,96 5,95

70 5,95 5,95

�


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)



fermentativo para 2 L de volumen de medio de cultivo y aireación media para la realización del método de Humphrey.

�


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 2 L y aireación media.

Zonas estudiadas



Desde t=10 min hasta t=29 min y = -3,105E-01x + 1,061E+01 - -

Desde t=29 min hasta t=46 min y = -1,057E-02x2 + 1,028*x - 1,896E+01 dY/dX=-0,02114*X+1,028 47,30369

Desde t=46 min hasta t=70 min y = 1,559E-03x + 5,840 - -





0 6,28 6,29

1 6,31 6,29

2 6,32 6,29

3 6,25 6,29

4 6,26 6,28

5 6,25 6,28

6 6,33 6,28

7 6,27 6,28

8 6,32 6,27


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

9 6,26 6,27

(*)10 6,29 6,27

11 6,23 6,27

12 5,89 5,66

13 5,60 5,22

14 4,89 4,78

15 4,09 4,35

16 3,67 3,91

17 3,08 3,47

18 2,78 3,04

19 2,41 2,60

20 2,11 2,17

21 1,94 1,73

(**)22 1,74 1,29

23 2,24 2,28

24 2,68 2,69

25 2,94 3,08

26 3,26 3,44

27 3,51 3,78

28 4,16 4,10

29 4,73 4,39

30 5,12 4,67

31 5,32 4,92

32 5,26 5,15

33 5,35 5,36

34 5,74 5,55

35 5,76 5,71

36 5,84 5,85

37 5,92 5,97

38 5,79 6,07

39 5,86 6,14

40 5,89 6,20

41 5,92 6,23

42 6,15 6,24

43 6,15 6,23

44 6,18 6,19

45 6,22 6,13

46 6,23 6,05

47 6,25 6,20

48 6,23 6,20

49 6,18 6,20

50 6,17 6,20

51 6,19 6,19

52 6,20 6,19

53 6,15 6,19

54 6,16 6,18

55 6,12 6,18

56 6,18 6,18

57 6,20 6,18

58 6,19 6,17

59 6,17 6,17

60 6,15 6,17

61 6,13 6,16

62 6,14 6,16

63 6,17 6,16

64 6,21 6,16

65 6,16 6,15

66 6,12 6,15

67 6,13 6,15

68 6,15 6,14

69 6,19 6,14

70 6,21 6,14


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-1

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 10 20 30 40 50 60 70Tiempo (min)

Con

cent

raci

ón d

e ox

ígen

o di

suel

to

(ppm

)



fermentativo para 2 L de volumen de medio de cultivo y aireación alta para la realización del método de Humphrey.

�


oxígeno según el método dinámico de Humphrey tomando un volumen de medio de cultivo de 2 L y aireación alta.

Zonas estudiadas



Desde t=10 min hasta t=22 min y = -4,362E-01x + 1,089E+01 - -

Desde t=22 min hasta t=44 min y = -1,106E-02x2 + 9,271E-01x - 1,319E+01 dY/dX=-2,036E-2*X+8,742E-1 49,115914



________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-2

B.4.- Datos recopilados y gráficos realizados para la determinación de la salinidad del

suero.

Tabla A.9: Datos de las soluciones salinas preparadas y su conductividad eléctrica medida para la

determinación de la salinidad del suero de leche

masa NaCl(g) Volumen de enrase (mL) Concentración de sal (g NaCl/mL) Conductividad (mS)

0 100 0 1,00

0,1054 100 0,001054 3,25

0,2033 100 0,002033 6,07

0,3087 100 0,003087 9,06

0,4037 100 0,004037 11,63

0,506 100 0,00506 14,5

y�= �0,001x��0,001

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0 1 2 3 4 5 6 7

Concentración de NaCl (g/mL)

Con

duct

ivid

ad (m

S)

Datos �recopilados L ínea�de�tendenc ia�obtenida

Gráfico A.7: Representación gráfica del comportamiento de la concentración de sales presentes en el suero en función de

la conductividad eléctrica


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-3

Tabla B.61: Conductividad eléctrica medida para suero utilizado en cada experiencia y concentración de sales

calculada.

Volumen de medio Aireación Conductividad (mS) Concentración de NaCl (g/mL)

300 mL

Baja 9,34 3,194

Media 9,75 3,345

Alta 9,68 3,319

1 L

Baja 9,09 3,101

Media 9,13 3,116

Alta 9,16 3,127

2 L

Baja 10,01 3,441

Media 9,87 3,389

Alta 9,79 3,360


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-4

B.5.- Datos recopilados y obtenidos para la determinación del contenido de glucosa y

lactosa en las muestras de suero.

Tabla B.62: Datos experimentales de absorbancia de las muestras inicial y final en los diferentes procesos fermentativos

Volumen del medio y aireación Muestra

Absorbancia en la

muestra de lactosa

Concentración calculada de

lactosa (%m/V)

Absorbancia en la

muestra de glucosa

Concentración calculada de

glucosa(%m/V)

300 mL baja

Inicial 0,238 5,336 1,269 5,795

Final 0,809 1,570 0,032 0,147

300 mL media

Inicial 0,247 5,142 0,995 4,544

Final 0,856 1,484 0,026 0,117

300 mL alta

Inicial 0,249 5,100 1,175 5,366

Final 0,989 1,284 0,012 0,055

1 L baja

Inicial 0,252 5,040 1,116 5,096

Final 0,408 3,113 0,936 4,274

1 L media

Inicial 0,263 4,829 1,121 5,119

Final 0,640 1,984 0,836 3,818

1 L alta

Inicial 0,257 4,942 1,098 5,0142

Final 0,697 1,822 0,294 1,343

2 L baja

Inicial 0,251 5,060 1,21 5,526

Final 0,625 2,032 0,929 4,242

2 L media

Inicial 0,253 5,020 1,158 5,288

Final 0,480 2,646 0,884 4,037

2 L alta

Inicial 0,257 4,942 1,173 5,357

Final 0,533 2,383 0,865 3,950


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-5

B.6.- Datos recopilados y obtenidos para la calibración del rotámetro y el cálculo de las

aireaciones suministradas para los distintos volúmenes de medio de cultivo

Tabla B.-63: Datos recopilados y cálculos realizados para la calibración del rotámetro utilizado en las experiencias de 1 l

y 2 l

Altura del flotador

Presión de salida (psi)

Velocidad del aire (m/s)

Diámetro (cm)

Area transversal (m¨2)

Caudal de aire (m^3/s)


1 4 0,37 0,59 2,73E-05 1,01157E-05 606,94 1,5 5 0,55 0,59 2,73E-05 1,50369E-05 902,21 2 5,3 0,91 0,59 2,73E-05 2,48792E-05 1492,72

2,5 5,5 1,31 0,59 2,73E-05 3,58151E-05 2148,91 3 6 1,48 0,59 2,73E-05 4,04629E-05 2427,77



y = 1,24E+03x - 9,39E+02

R2 = 9,81E-01

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5 6Altura del flotador

Cau

dal (

ml/

min

)

calibración de rotámetro pequeño Regresión lineal�

Gráfico A.1: Calibración del rotámetro utilizado para las experiencias de 1 l y 2 l y su regresión lineal.


________________________________________________________________________________________________________________

APÉNDICE B

B.-6



Altura del flotador Presión de salida (psi)


Aireación(V.V.M )

1 4 306 0,3

1,2 4,5 553 0,5

1,5 5 924 1



Altura rotámetro Presión de salida (psi) Caudal de aire (ml/min) Aireación (V.V.M)

1,2 4,5 553 0,3

1,6 5 1048 0,5

2,5 5,2 2160 1

Tabla A.5: Caudal de aire necesario para obtener las aireaciones del sistema de fermentación en estudio, para

un volumen de 300 ml de medio de cultivo.

Presión de salida (psi) Caudal de aire

(ml/min) Aireación(V.V.M)

2 96 0,3

2,5 159 0,5

3 312 1

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