Universidad de la Habana Instituto de Farmacia y...

Universidad de la HabanaInstituto de Farmacia y Alimentos

Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Farmacéuticas

Título: Actividad antimicrobiana, balance redox celular, seguridad y ventajas económicas de una crema elaborada con propóleos de Manzanillo, en paceinte con pie diabético.

Autor: Msc. Isis Beatriz Bermúdez CampsTutores: Dra. Olga Sonia León FernándezDra. Ofelia Bilbao Bevoredo.

Ciudad de la HabanaDiciembre 2003

Feliz el hombre que se dedica a

la sabiduría y que se hace preguntas

hasta que obtenga respuestas.

Tirácides 14, 20

Dedicada:

A ti Señor que llenas mi vida, ennobleces mis pasos e iluminas mi camino.A mi esposo y mis hijas, mis más preciados tesoros.A la memoria de mis abuelos y de mi madreA mi padre

Agradecimientos:

El camino para alcanzar una meta no siempre resulta tan fácil como se espera, sólo la fuerza y el empeño que llena nuestro interior, permite que metas inalcanzables sean superadas.Llegar al final de este proyecto fue siempre mi meta, pero sólo fue posible por ti Señor, que con tu amor infinito, me diste la oportunidad de contar con personas en las que encontré un motivo más para agradecerte.Hoy frente a ti, doy las gracais a todos los que supieron entregar parte de si, para hacer realidad este sueño.Ante todo mi esposo y mis hijos que supieron soportat con paciencia y con amor, las horas de soledad, compartiendo con mis éxitos y mis fracasos, por ser únicos e insustituibles en mi corazón.A la Dra. Olga Sonao León Fernández porque a pesar de las múltiples tareas que cada día enfrentaba, supo siempre encontrar un espacio de su escaso tiempo disponible, para trasmitirme su experiencia an el campo de la invetigación científica. Gracias Olga por hacerme sentir segura, por la confianza que depositó en mi trabajo y por hacer de este sueño una realidad.A la Dra. Ofelia Bilbac Bevoredo por sus sabios consejos, por ese optimismo que sipo trasmitirme y por aceptar sis reparos la dirección de este trabajo.A mi querido Gastón, en quién encontré un profesional son límites, con el que pude contar en todo momento y compartir los obstáculos que el camino tuvo durante mi paso.A Idelsys por demostarme una vez más, que puedo contar con ella en los momentos más arduos.A mis abuelos Justo y Esperanza porque siempre fueron mi razón de ser.A mi madre que hoy no comparte mi dicha, pero la fuerza de su espíriu me ha hecho claudicar. Gracias mami porque para llevar este proyecto, siempre tuve tu apoyo incondicional, hoy tu anhelado sueño sa hace realidad.A mi padre por su ayuda material y por trasmitirme ese afán incesante por saber, por investigar, por descubrir algo nuevo, por ahcer ciencia.A Florinda por abrir su corazón en el momento preciso, por darme fuerzas para enfrentar las mazqyundades humanas y por hacerme comprender que toda causa tiene su efecto.

A mi suegro que hoy noestá con nosotros, pero que ha estado a mi lado durante todos estos añios, alentándome

con la fuerza de su espíritu.

A mi suegra por ese granito de arena que aportó en este empeño.

A Mariano porque siempre fue participe de todos los desvelos.

A mi hermano y mi cuñada por darme la oportunidad de ver crecer a mis sobrinas.

A mi tía Esperancita y mis primas Alina y Ana por apoyarme cuando las fuerzas me faltaban.

A Roldy por hacer suyo mis problemas y porque supo hacer feliz a mi mami.

A mis amigas Ivette y Luzell por cada momento compartido, por sus consejos oportunos, por su esímulo diario,

por todo el empeño que pusieron en esta obra y por dalre valor a todas mis cosas.

A mis queridas Charo, Rosa y Data por su amistad y por facilitarme el camino para el ligro de esta meta.

Al Dr. Antonio Iraizos y el Msc. Oscar Rulpeiro por satisfacer mis inquietudes y enriqueces mis conocimientos en

le campo de la tecnología farmacéutica.

A Yami, Anita, Degnis, Lili, Aliocha, Grisell y Tamara por esa amistad que surgió entre nosotros y qu espero que

se conserve por siempre.

A cuca y Carradero por todo su apoyo y en especial por cuidar con tanto cariño a uno de mis tesoros.

A Cora por brindarme siempre lo mejor de si para hacer soportable mi estancia en La Habana.

A mi colega Noralis Rodríguez porque gracias a ella comencé lo que hoy culmino.

Al Dr. Enrique Perdomo, el Dr JorgeBertanga, el Dr. Nelson Merino, la Dra. Marta Deas y el Dr. Gregorio Martínez

por escucharme siempre y trasmitirme sus sabias sugerencias.

A la Dra. Alicia Delgado por sus palabras de aliento y el inagotable empeño e interés en la culminación exitosa de

este trabajo que hoy defiendo.

A la Dr. María Antonia Torres Alemán por guiar mis primeros pasos en el campo de la invetigación científica y por

apoyarme siempre en cada tarea que compartí con ella.

A Boris, Arturo y Aniuska por su desiteresada ayuda, su entera dedicación a buena parte de este trabajo por

mantenerme a toda hora la sonrisa entre los labios, a pesar de que no siempre salieron las cosas como esperaba.

A la Dra. Rosario Del Roso y al Msc. Alejandro Garcés por permitirme continuar y culminar este proyecto.

A Matos, Javier, Alejandro, Boly, Fausto, Basem, Yeny, Dulce, y Husam por hacerme recordar que existen cosas

más importantes que psasr por la vida.

A Diusmel, Rainer, Radamé, Nelson, Edelso, Ivan, Yaima, Pedro y Yaima, por brindarme su sonrisa ante cada

desaliento.

A Matos, Ana, Esther, Isaías, Conchitas, Rita, Omar, Alicia, Marino, Juani, Girón, Deybis, Lisette, Augusto, Javier,

Maruchi y Alba porque en cada uno de ellos encontré el auxilio oportuno.

A Carlitos y Ernesto a quienes conocí en los momentos finales de este proyecto, sin embargo llegaron para

quedarse.

A Ortica, Adrián, Marisel y Beba por trasmitirme su alegría y sus atenciones en los momentos más arduos.

A todos los compañeros del Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biológicas por compartir conmigo estos años

intenso trabajo.

A la Dra. Mirtha Casstiñeiras por poner a prueva mis conocimientos y enseñarme el valor de la ética profesional.

Al Dr. eduardo Fernández por demostarme la magnitud de su aprecio.

Al Dr. Osmany Cuesta, al Dr. Armando Cuellar y a la Msc. Nercy Carratalá por sus útiles consejos y sus sabias

recomendaciones.

A Oscar, Obdulia y Rafael porque aunque nada los ató a esta investigación, sus manos estuvieron en muchos de

los ensayos que soportan esta invetigación.

Al Lic. Rubén Castillo por su siempre atenta sonrisa cargada de gentileza y especialmente por ofrecerme su valiosa

ayuda en el procesamiento estadístico de los resultados trasmitiéndome con maestría profesional su experiencia

en este campo.

Al Lic. Jorge Lodos y ak Tec. Dariel Aguiar por sacrificar parte de su tiempo disponible en la realización del análisis

planimétrico de las lesiones evaluadas.

A la Lic: Martha Guerra y la Lic. Leticia Martínez por la calidad del ensayo microbiológico desarrollado

en las etapas de trabajo que fue necesario llevar a cabo el mismo.

A Naylett, Oneida, Liudmila, Sandra, Leonardo, Leonor y Alina de las Mercedes por su ayuda en le

momento preciso.

A Ania, Renato, Villalon, Aurora, Julio, Manuel Collaso y la Dra. Cheyla Romary por dedicar parte de su

tiempo a revisar cautelosamente el documento de tesis y emitir sus valiosas sugerencias, para ellos mis

sinceras gratitud.

A todos mis compañeros del Departamento de Farnaciade la Universidad de Oriente por la confianza

depositada en mi, por la cual hoy hago realidad este sueño.

A todo el personal administrativo que labora enle Instituto de Farnacia y Alimentos y en especial a su

dirección por el respaldo brindado en todos estos años de superación profesional.

A Dra. Celso Suárez Lescay, la Dra. Victoria Frómeta, al Dr. Juan E. Yara, el Dr. Braulio Lima, la Dra.

Niobalis Franco y a todo el personal médico y paramédico de los Servicios de Angiología de los

Hospitales Clínico Quirúrgico Docente``Saturnino Lora``, Hospital Militar`` Joaquín Castillo Duany`` y

Hospital ̀ `Salvador Allende`` por confiar en mí y aceptar dese el primer momento el proyecto de esta

investigación.

A cada uno de los pacientes que facilitaron nuestra labor, a pesar de sus condiciones difíciles de salud.

A todos los quie por un motivo u otro, colocaron pidras en el camino para que este sueño no se hiciera

realidad porque me hicieron comprender que Grande no es el que siempre lleva el triunfo entre las

manos, sino el que jamás se desalienta.

Y no quiero dejar de agradecer de modo especial a todos miscolegas, que como estudiantes colaboraron

con dedicación y responsabilidad en la búsqueda de estos resultados, siendo decisiva su participación

para el logro de mis propósitos, llegue a Odalis, Maislin, Victor, Yanin, Marealis, Marlene, georgina,

Mariela, María Julia, Alina, Martha, Alicia, Rebeca, Monica, Yoagne, hela, ania, Ariel, Keyla, Eliecer,

Irlanda, Yeny, Yasmianis, Ana Mari, Evelyn e Irela, mi más sincera gratitud. A todos Muchas Gracias.

de la región de Manzanillo, para uso clínico en pacientes con Pie Diabético, atendiendo a la ausencia

de una terapia específica para su tratamiento. A tales fines se establece una estrategia de desarrollo

del producto que comprende desde la selección, caracterización y estandarización de la materia

prima y de un sistema medicamentoso adecuado al tipo de lesión hasta la evaluación de su eficacia

y seguridad en el orden experimental.

Se culmina la investigación con un estudio clínico que no solo considera variables de eficacia como

el análisis microbiològico de la lesión, la planimetría y la estadía hospitalaria sino que incluye

también una caracterización sistèmica del estado redox de los pacientes, considerando la

participación de la Especies Reactivas de Oxigeno (ERO) en las complicaciones macroangiopáticas.

Para este ensayo se tomó una muestra de 120 pacientes con pie diabético diagnosticados en los

Servicios de Angiologia del Hospital Clínico Quirúrgico Docente “Saturnino Lora”, el Hospital Militar

“Joaquín Castillo Duany” de Santiago de Cuba y el Hospital “Salvador Allende”de Ciudad de La

Habana, en el período comprendido entre Diciembre de 1996 a Mayo del 2000.

Los resultados demostraron que el propóleos de la región de Manzanillo cumple con los parámetros

de calidad para ser utilizado en forma de crema en el tratamiento del Pie diabético, con seguridad y

ventajas clínicas respecto a la Terapia Habitual, ya que combina sus propiedades antimicrobianas

frente a gérmenes como el Staphylococcus aureus, la Klebsiella y la Pseudomonas aeruginosa

con sus efectos reguladores sistémicos del estado redox celular, alcanzándose en los pacientes una

susceptibilidad a la peroxidación lipidica por debajo de 2460+622 nmol/L, una capacidad

antioxidante mayor del 66,2±10,2 %, con reducción de los hidroperóxidos totales a valores cercanos

a 103,7±17,7 itimol/L, aumento de la superóxido dismutasa por encima de 1460±140 U/L/min y

bajos niveles de Catalasa que no alcanzan el valor de normalidad tomado como referencia

(1000±125 U/L/min); lo cual favoreció la cicatrización de la lesión de los mismos, con reducción de la

estadía hospitalaria, la cantidad y extensión de las amputaciones y la disminución del costo total del

tratamiento con respecto a la terapia convencional entre un 84,8% (con la formulación al 10%) y un

84,3% (con la preparada al 15%).

La Diabetes Mellitus es una causa importante de discapacidad y de muerte. Esta entidad

se encuentra entre las diez principales causas de muerte en nuestro país, ocupando el 7mo lugar

con una tasa de 23, 4 por 100 000 habitantes , perdiéndose 1,1 años de vida potencial po 1000

habitantes de 1-64 años, como consecuencua de esta afección endocrina y sus complicaciones.

Se realiza un estudio con el propósito de disponer de una crema elaborada a partir del propóleos,

SINTESIS

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85 86

INTRODUCCIÓN DESARROLLO Capítulo 1 Revisión Bibliográfica 1.1 Propóleos cubanos. Similitudes y diferencias 1.1.1 Consideraciones generales sobre su composición química 1.1.2 Reportes sobre su actividad antimicrobiana, antioxidante y cicatrizante 1.1.3 Antecedentes de evaluaciones toxicológicas 1.2 Pie diabético. Generalidades 1.2.1 Clasificación 1.2.2 Tratamiento 1.3 Especies Reactivas de Oxígeno y Diabetes mellitus 1.3.1 Especies Reactivas de Oxígeno 1.3.2 Mecanismos de generación e inactivación de ERO 1.3.3 Estrés oxidativo y complicaciones asociadas a la Diabetes mellitus 1.3.4 Mecanismos moleculares y celulares de las complicaciones diabéticas 1.4 Evaluación toxicológica de medicamentos para uso tópico Capítulo 2 Materiales y Métodos 2.1 Preparación de la muestra 2.1.1 Materia prima Propóleos. Control de calidad

2.1.2 Elaboración del extracto blando de propóleos

2.1.2.1 Estandarización de los parámetros de calidad del extracto blando de propóleos2.2 Determinación de la actividad bacteriostática y bactericida in vitro

2.2.1 Comportamiento de la actividad antimicrobiana en el tiempo

2.3 Ensayos toxicológicos

2.3.1 Toxicidad a dosis única oral en roedores y no roedores.

2.3.2 Toxicidad a dosis única dérmica en roedores y no roedores

2.3.3 Irritabilidad dérmica

2.3.4 Irritabilidad oftálmica

2.3.5 Ensayo de Sensibilización

2.4 Ensayo clínico

2.5 Evaluación de la relación Beneficio - Riesgo

2.6 Evaluación de la relación Costo- Eficacia

2.7 Procesamiento estadístico de los resultados

Capítulo 3 Resultados

3.1 Materia prima de propóleos. Control de calidad

3.2 Estandarización de los parámetros de calidad del extracto blando de propóleos 3.3

Actividad antimicrobiana in vitro


3.4 Evaluación toxicológica

3.4.1 Evaluación de la Toxicidad aguda oral y dérmica en roedores y no roedores 3.4.2

Ensayo de Irritabilidad dérmica

3.4.3 Ensayo de Irritabilidad oftálmica


3.5 Resultados del ensayo clínico

3.6 Evaluación de la Relación Beneficio- Riesgo

3.7 Evaluación de la Relación Costo- Eficacia

Capítulo 4 Discusión de los resultados

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87

26252220181716

16

141313108

881

15

PÁGINA

INTRODUCCIÓN

Introducción

1

INTRODUCCION:

El propóleos ha sido siempre una interrogante para la ciencia por sus numerosas

propiedades terapéuticas atribuidas, aún no demostradas totalmente, desde el punto de vista

científico. Se conoce que la composición química del propóleos, responsable de sus acciones

farmacológicas varía de acuerdo a la región geográfica, climática y sobre todo según la fuente

vegetal de que provenga, con incidencias notables en el índice de oxidación directamente

relacionado con el poder antioxidante, de gran importancia para las acciones terapéuticas

asignadas. 1,2

Desde la antigüedad se conocen los efectos, que lo hacen de utilidad en la curación de

heridas y llagas, existiendo numerosos reportes acerca de su capacidad de intensificar la

proliferación epitelial y el crecimiento del tejido de granulación, disminuyendo el número de

neutrófilos en el sitio lesionado con aumento del número de histiocitos.3'5 Además, este

producto forma una película adherente y protectora, en la superficie de la lesión, que suprime

la acción de irritantes externos garantizando el desarrollo de sus acciones sobre la piel

dañada. 6

Otros autores 5’ 7 plantean que este producto mejora la circulación sanguínea y linfática, con

disminución brusca de la permeabilidad de los vasos superficiales afectados, como

consecuencia de sus propiedades antimicrobianas y cicatrizantes que pueden ser responsables

de inhibir los procesos asociados a la formación de peróxidos lipídicos que se generan en las

lesiones ulcerativas. 8 ,12

El empleo de este apifármaco en el tratamiento del pie diabético, hasta el momento no ha

sido objeto de investigación. En la literatura revisada existen reportes del empleo de tinturas y

cremas con bases de absorción oclusivas y de ungüento hidrófilo elaboradas con el propóleos

de la región occidental y central del país en úlceras flebostáticas, sicklémicas, venosas, así

como en gangrenas 13-16, pero no se habla de su uso en el pie diabético, ni tampoco de

evaluaciones con el propóleos de la región de Manzanillo, zona con una rica fuente de este

producto apícola, de muy buena calidad según estudios realizados 17 que caracterizaron desde

el punto de vista físico-químico las principales fuentes de propóleos de diferentes municipios de

la provincia Granma, demostrando con su evaluación que las localidades El Palmar, La

Demajagua y Calicito del municipio de Manzanillo, son las que poseen los mejores propóleos

con los más bajos índices de oxidación.

En estas regiones abunda una flora rica en Mangle rojo, Mangle negro, Campanilla, Júpiter

y en algunas zonas alejadas de la costa crecen especies del género Clusia. De esta vegetación

las abejas recolectan resinas florales para la fabricación de propóleos ,s y se conoce que el

mangle rojo y el negro son ricos en taninos, la campanilla en alcaloides

2

de propiedades hipnóticas, el Júpiter posee sustancias astringentes y drásticas 19 y las

especies del género Clusia son productoras de benzofenonas premiadas 20, que de hecho

pueden estar presentes en esta resina balsámica objeto de estudio. Existen reportes acerca del

uso de las cuatro primeras para la curación de heridas, llagas, úlceras y procesos

inflamatorios 19, así como de las benzofenonas premiadas presentes en las especies del género

Clusia, como antimicrobianas frente a bacterias gram (+) y gram (-) y hongos como la Candida

albicans.20 Estas referencias justifican los diversos usos del propóleos, referidos en la

literatura y es posible que las abejas al usar las resinas de estas plantas transmitan muchas

sustancias biológicamente activas a este producto apícola.

En el mundo, el propóleos se comercializa en múltiples formas farmacéuticas y en nuestro

país existen algunos productos que ya están a la venta: Propolisina (tintura), Viprol (Tabletas),

Propolium (trosciscos), Propolium (jabón medicinal) entre otros, pero no existen cremas con las

dosis y las condiciones idóneas para tratar lesiones en los miembros inferiores, tales como el

pie diabético, afección en la cual la cicatrización se dificulta, debido al descontrol metabòlico y

la infección sostenida, lo que trae consigo una variación en el modo de inda de los pacientes,

ya que ocasiona innumerables bajas laborales por la invalidez parcial o total que produce,

siendo el costo del tratamiento muy elevado por la demora en la cura definitiva de las mismas.

21

La Diabetes y sus complicaciones constituyen uno de los problemas de salud de mayor

incidencia en el orden económico y social, existiendo un consenso, bastante generalizado, en el

sentido de que en esta enfermedad, la hiperglicemia incrementa la producción de ERO

(Especies Reactivas de Oxígeno) 22- 23 mediante la autoxidación de la glucosa 24 y también por

la glicosidación no enzimàtica de proteínas, 25 además los cambios en el metabolismo lipidico

que ocurren, conducen a complicaciones vasculares y a la aparición de las úlceras en las

piernas. 26

Investigaciones epidemiológicas establecen que las úlceras en las piernas son comunes en

países desarrollados en los cuales se ha elevado la población adulta 21; existen referencias de

que en Estados Unidos estas lesiones afectan a cerca de 2,5 millones de personas,

alcanzándose en Suiza y Norteamérica una prevalendo del 1% en la población cercana a los 60

años. 27

En nuestro país, el Instituto Nacional de Angiologia o Cirugía Vascular (INACV) realizó un

censo de amputados, en 1988, en el municipio Cerro, de Ciudad de La Habana y obtuvo que el

1,6 % de los diabéticos de esta localidad han sufrido una amputación y el 76% es portador del

pie diabético. 28

El pie diabético constituye una patología de tratamiento prolongado, muchas veces de

hospitalización y en el peor de los casos de amputación debido a la infección por gérmenes

gram (+) y gram (-), la literatura destaca 28 que esta afección es la consecuencia más temida de

las angiopatías periféricas y responsable de que entre el 40% y el 50% de las amputaciones se

realicen a pacientes diabéticos. La búsqueda de una terapéutica efectiva, económica y segura

introducción

3

para el paciente, afectado por estas lesiones, ha dado lugar a numerosas investigaciones y

actualmente son muchos los medicamentos usados pero pocos los útiles. 29

Los antecedentes antes expuestos y la necesidad de demostrar científicamente la seguridad

y eficacia clínica del propóleos recolectado en la región oriental del país (Manzanillo), en el

tratamiento del Pie Diabético condicionaron la realización de la presente investigación,

estableciéndose una estrategia científica que permitiera caracterizar la actividad

antimicrobiana de este producto apícola, teniendo en cuenta que la terapia habitualmente

empleada para tratar a este tipo de paciente está basada en el uso de antibióticos específicos

para el microorganismo localizado en la lesión y en el control metabòlico del enfermo. Por otro

lado, se tuvo en cuenta la caracterización del estado redox celular de los pacientes, a fin de

conocer y establecer cómo se comportan los mediadores del estrés oxidativo en esta

complicación vascular, en la que desempeñan un papel importante.

De hecho, el uso en la clínica del propóleos para tratar el pie diabético no resulta fácil

porque es un principio activo resinoso y pegajoso, que dispensado en tinturas con vehículo

alcohólico puede irritar dicha lesión, además de ser incomodo su uso para el paciente por el

ardor que puede ocasionar. Por otro lado, las preparaciones semisólidas con base de absorción

oclusiva, no son idóneas para pacientes con pie diabético porque forman un lecho hidrófilo

sobre la piel y no dejan evaporar la humedad, creando un medio favorable para el crecimiento

microbiano, que indiscutiblemente condiciona el empeoramiento. 30'32 y la base de ungüento

hidrófilo que ha sido utilizada para preparar las formulaciones usadas en evaluaciones

clínicas, para pacientes con lesiones en sus miembros inferiores, es una base universal,

extemporánea, con una estabilidad limitada por 15 días y que contiene lauril sulfato, excipiente

irritante para la piel dañada. 30 ,31

Estos inconvenientes condicionaron la elaboración de un sistema medicamentoso, en forma

de crema, que facilitara su empleo teniendo en cuenta que en la lesión en la cual será usado se

requiere de una base emulsionada que garantice la penetrabilidad diadérmica.

Para llevar a cabo las evaluaciones clínicas correspondientes fue necesario que el sistema

medicamentoso, en forma de crema, diseñado a nivel de laboratorio, cumpliera con las

exigencias de calidad y seguridad que permitieran la exposición segura del ser humano a la

misma.

A tales fines nos planteamos la siguiente:

El propóleos procedente de Manzanillo, incorporado a una crema, mantiene su actividad

antimicrobiana y favorece el balance redox sistèmico, siendo seguro, efectivo y económico en el

tratamiento del pie diabético

Para corroborar la hipótesis antes formulada nos trazamos los objetivos siguientes:

Objetivo general:

Demostrar la seguridad y eficacia clínica, en términos de actividad antimicrobiana y

introducción

Hipótesis:

4

regulación sistèmica del estado redox celular, así como las ventajas económicas de una crema

elaborada a partir del propóleos de la región de Manzanillo, en pacientes con pie diabético.

Objetivos específicos:

1. Realizar la estandarización de los parámetros de calidad del extracto blando de

propóleos como materia prima

2. Establecer la actividad bacteriostática y bactericida in vitro del producto evaluado

3. Realizar los estudios de toxicidad exigidos por las agencias regulatorias, que permitan

la utilización clínica, de forma segura del propóleos de la región de Manzanillo.

4. Evaluar las propiedades antimicrobianas, antioxidantes y cicatrizantes de la nueva

formulación en pacientes diabéticos, con lesiones en sus miembros inferiores

5. Establecer la relación Beneficio/Riesgo y Costo/Eficacia de la terapia propuesta en el

estado fisiopatolàgico analizado.

Novedad científica:

Se desarrolla por primera vez, un estudio con el propóleos de la región de Manzanillo,

dirigido al uso en el humano, a partir de la definición de su aplicación farmacoterapéutica que

comprendió: selección de la materia prima, caracterización, estandarización, incorporación de

ésta a un sistema medicamentoso definido, determinación de su seguridad y eficacia y la

demostración, de estos atributos en el orden clínico. También por primera vez, se realiza un

análisis de Beneficio Riesgo y de Costo Eficacia de la terapia

Introducción

propuesta y se lleva a cabo la caracterización antioxidante prooxidante de pacientes con pie

diabético sometidos a esta terapia farmacológica.

Aporte teórico: La investigación desarrollada aporta básicamente nuevos conocimientos

teóricos acerca del probable mecanismo de acción del propóleos, que lo hacen efectivo en el

tratamiento del pie diabético, estableciendo la relación entre el control glicémico, la generación

de ERO y la eliminación del germen de la lesión, como requisitos indispensables para el éxito

de la terapia con este apifármaco.

El trabajo de tesis, también avala sobre bases científicas el uso del propóleos, en crema, en

pacientes con pie diabético demostrando su eficacia a través de un estudio clínico controlado,

en el cual se caracteriza el estado redox sistèmico de los mismos y se demuestra la

participación de mediadores del estrés oxidativo en esta afección.

Aporte práctico social: El documento de tesis establece parámetros de calidad para la

materia prima y el extracto blando de propóleos de la región de Manzanillo, adecuadamente

estandarizados, que avalan su utilización como principio activo en preparaciones

farmacéuticas, además demuestra con rigor científico que el sistema medicamentoso utilizado

para llevar a cabo las evaluaciones es seguro y mantiene e incrementa el espectro de acción

antimicrobiano del principio activo por lo que puede ser estudiado como nueva forma

farmacéutica para su futura venta y comercialización en el mercado.

Se establece además la relación Beneficio/Riesgo cuantificada a través de un modelo

matemático y la relación Costo/Eficacia de la nueva terapia propuesta, para el tratamiento del

Pie Diabético, demostrándose que la crema de propóleos al 10% y al 15% reduce en un 84,8% y

en un 84.3% respectivamente el costo total del tratamiento de un paciente con respecto a la

terapia habitual.

Los resultados de la investigación desarrollada han sido objeto de publicaciones en revistas

nacionales y extranjeras, así como presentados en eventos y constituyen las bases científicas

que sustentan la solicitud de patente: Crema a base de propóleos para el tratamiento del

pie diabético con número de solicitud: 2002-0310 presentada en Ciudad de La Habana a los

9 días del mes de Diciembre del 2002 en las oficinas de la OSPI. (Anexo no. 1)

A continuación relaciono las publicaciones en el tema y los eventos en los que han sido

presentados los resultados del presente estudio:

PUBLICACIONES DEL TEMA:

1. Bermúdez IB, Suárez CL, Megret RD, Rodriguez N. Ulceprol una alternativa en el

tratamiento de las lesiones en los miembros inferiores. Parte I. Revista OFIL 1996, 6(4):215-

218. España.

2. Bermúdez IB, Reyes IH, León OS. Actividad antioxidante, antimicrobiana y cicatrizante

Introducción

5

6

asociada a la terapia con propóleos. Revista Cubana de Farmacia 1998. Suplemento Especial

32: 215-218. Cuba.

3. Bermúdez IB, Suárez CL. Beneficios clínicos de la crema Ulceprol según la procedencia

del propóleos utilizado en su elaboración. Revista OFIL 1999, 9(3): 49-53. España.

4. Bermúdez IB, León OS, García GS. Farmacotoxicología del propóleos de la región de

Manzanillo. Revista Cubana de Farmacia 2000 Suplemento Especial 34: 521-522 Cuba.

5. Bermúdez IB, Reyes IH, León OS. Evaluación de la actividad antioxidante del propóleos

de la región de Manzanillo. Provincia Granma. Cuba. Revista Bioquímica 2000, 25(3): 69-74.

México.

6. Bermúdez IB, García GS, Piloto AA, Valdivieso AG. Evaluación de la irritabilidad dérmica,

oftálmica y el efecto sensibilizante de la crema Ulceprol. Anuario de Toxicología. Cuba, (en

prensa)

7. Bermúdez IB. Frómeta VR, Suarez CL. Eficacia terapéutica de la crema Ulceprol.

Resultados de un estudio multicéntrico. Revista OFIL. España.(en prensa)

8. Bermúdez IB, García GS, Piloto AA, Valdivieso AG. Evaluación de la toxicidad aguda oral

y dérmica en roedores y no roedores del propóleos de la región de Manzanillo. Revista

Brasilera de Toxicología. Brasil, (en prensa)

9. Bermúdez IB, León OS, Reyes IH, Suarez CL, Frómeta VR, Franco NP. Clinical advantage

in the diabetic foot of the Cuban propolis collected in the Manzanillo area. Phytother Res. (en

prensa)

10. Bermúdez IB, León OS, Reyes IH Cellular redox state in diabetic foot patients. Revista

Diabetologia. Austria, (en prensa)

11. Reyes IH, Bermúdez IB, León OS, Pérez YG. Mecanismos oxidativos asociados a la

farmacoterapia con propóleos. Revista Cubana de Farmacia 2003 Suplemento Especial 37.

ISSN 0034-7515.

12. Bermúdez IB. Suárez CL, Frómeta VR, Franco NP, Otero YS, Torreblanca SS. Beneficio

riesgo y costo eficacia de la terapia con propóleos en el pie diabético. Revista Cubana de

Farmacia 2003 Suplemento Especial 37. ISSN 0034-7515.

EVENTOS:

1. IX Jomada Provincial de la Sociedad Cubana de Farmacia. Santiago de Cuba. Cuba.

Octubre 1994.

2. IX Forum de Ciencia y Técnica. Evento Provincial. Santiago de Cuba. Cuba. Octubre

1994.

3. X Forum de Ciencia y Técnica. Evento de Base. Santiago de Cuba. Cuba. Octubre

1995.

4. VI Seminario de Ciencia y Técnica. Labor 95. Teatro Heredia. Santiago de Cuba. Cuba.

Diciembre 1995.

5. VII Congreso de la Sociedad Cubana de Farmacia. IV Taller Internacional del Profesional

Introducción

7

Farmacéutico. III Taller Internacional de Sistemas Avanzados de Administración de

Medicamentos. Palacio de las Convenciones. Ciudad de La Habana. Cuba. Octubre 1998.

6. I Congreso Internacional Farmacología 98. Centro de Eventos Ortopédicos. Complejo

Ortopédico Internacional "Frank País". Ciudad de La Habana. Cuba. Octubre 1998.

7. II Jomada Científica Provincial de Angiología y Cirugía Vascular. Hospital Clínico Quirúrgico

Docente "Saturnino Lora". Santiago de Cuba. Cuba. Octubre 1998.

8. Generalización de Calidad de los Servicios Farmacéuticos. Hospital Infantil Norte "Juan de

la Cruz Martínez Maceira Santiago de Cuba. Cuba. Diciembre 1999.

9. III Jornada de Farmacia Clínica. CIMEQ. Ciudad de La Habana. Cuba. Mayo 2000.

10. IV Encuentro Iberoamericano sobre las Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias. Palacio de

las Convenciones. Ciudad de La Habana. Cuba. Junio 2000.

11. XIII Forum de Ciencia y Técnica. Evento Provincial. Santiago de Cuba. Cuba. Septiembre

2000. RELEVANTE.

12. CUBAFARMACIA 2002. VIII Congreso de la Sociedad Cubana de Farmacia. V Taller

Internacional del Profesional Farmacéutico. V Encuentro Iberoamericano sobre las Ciencias

Farmacéuticas y Alimentarias. Palacio de las Convenciones. Ciudad de La Habana. Cuba.

Octubre 2002.

13. II Conferencia Interamericana de Farmacia y Nutrición. Hotel Nacional. Ciudad de La

Habana. Cuba. Marzo 2003.

Introducción

DESARROLLO

Capítulo no. 1 Revisión bibliográfica

8

CAPÍTULO 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 Propóleos cubanos. Similitudes y diferencias

1.1.1 Consideraciones generales sobre su composición química

El propóleos es un producto balsámico resinoso natural colectado por las abejas a partir de

diferentes resinas de las plantas y potencializado por enzimas segregadas por sus glándulas

salivales lo cual le confiere propiedades terapéuticas muy valiosas. 33,34

La composición química del propóleos varía de acuerdo a la región geográfica, sobre todo

según la fuente vegetal de donde provenga dado el hecho básico, de que la abeja elabora el

propóleos de acuerdo a sus necesidades y a la disponibilidad de fuentes de materia prima en el

sitio donde habita, 1 además ella no siempre msita los mismos árboles en la búsqueda de las

resinas que requiere para la elaboración del propóleos y atendiendo a la ubicación ecológica de

la colmena y el entorno de su vivienda que condiciona la infección microbiana de la misma, ella

extrae las resinas de las plantas con propiedades antimicrobianas específicas para combatir

dicho proceso infeccioso; 3S- 36 por lo que internacionalmente se ha demostrado que será muy

difícil encontrar 2 colmenas que produzcan propóleos idénticos, aún cuando estén ubicadas en

la misma zona geográfica; es aún más significativo que los propóleos de las distintas partes de

la colmena, no tengan exactamente la misma composición química .1,2

Sí resulta bueno aclarar que estas variaciones no están dadas por la diversidad de los

elementos que están presentes en su composición, que básicamente se mantendrán estables,

sino en las cantidades de cada uno de ellos presentes en cada muestra. 37

Este producto no es una sustancia definida, por lo que no tiene una fórmula química; de ahí

que se considere una resina constituida por una mezcla de sustancias distintas que pueden

aislarse por medio de solventes3- 38 De modo general los propóleos se caracterizan por tener un

40-80% de resinas y bálsamos aromáticos, 13-50% de ceras, 4,5-15% de aceites esenciales y un

5-11% de granos de polen ricos en minerales simples 3

La literatura reporta 39- 40 que se han identificado más de 150 componentes en los propóleos

de Europa y América del Norte de los cuales los flavonoides son los constituyentes principales.

Sin embargo, en Venezuela, solo han sido detectadas trazas de flavonoides en las muestras

correspondientes a las áreas templadas y los principales componentes encontrados son

benzofenonas polipreniladas.41

9

Al respecto existen referencias 42, 43 acerca de que el propóleos obtenido de zonas tropicales

no posee como componentes mayoritaños flavonoides los cuales abundan fundamentalmente en

el propóleos europeo.

En Cuba, la composición química de los propóleos ha sido estudiada por prestigiosos

colectivos que han establecido su relación con la vegetación predominante, en cada región del

país. 2,7,44,45 Estudios desarrollados, 44 a distintas muestras de propóleos rojo y pardo

recolectadas en diferentes localidades de nuestro país, demostraron que en el primero

predominan las quinonas y en el segundo los triterpenos y esteroides.

En Nuevitas, Camagüey se llevó a cabo una investigación con el propóleos de la región

costera; aislándose y caracterizándose una benzofenona premiada como principal componente,

de peso molecular 502, muy activa como antimicrobiana, antifúngica y citostàtica in vitro. 20- 36

Al respecto existen reportes 20 acerca de la abundancia de estas benzofenonas en los propóleos

cubanos que hasta el momento han sido estudiados.

Investigaciones desarrolladas 44 a otras muestras procedentes de San José, Los Palos, Nueva

Paz, Melena del Sur, Topes de Collantes y Holguín permitieron aislar y caracterizar 4 productos:

- Una mezcla de ácidos carboxílicos de cadena larga

- El acetato de B amirina, un triterpenoide pentaciclico que no presenta

actividad antimicrobiana 2

- Una benzofenona premiada

- El flavonoide naringenina

Estudios recientes 44 han determinado la presencia en muestras de otras localidades de

triterpenoides pentacíclicos, del tipo de las amirinas: como triterpenoles, ésteres, el flavonoide

naringenina, sesquiterpenoides y ácidos grasos saturados.

Sobre el propóleos de la región de Manzanillo, no se han efectuado hasta el momento

evaluaciones clínicas que demuestren su eficacia farmacológica, pero si se conoce que esta zona

oriental cuenta en las localidades El Palmar, La Demajagua y Calicito con una rica fuente de

este producto apícola de muy buena calidad, que se considera esté relacionado con la flora de

estos territorios en las que abunda el Mangle rojo, el Mangle negro, la Campanilla blanca, el

Júpiter y en algunas regiones alejadas de la costa crecen especies del género Clusia; de esta

vegetación las abejas recolectan resinas florales para la fabricación de propóleos 18 y se conoce

que el mangle rojo y el negro son ricos en taninos, la campanilla en alcaloides de propiedades

hipnóticas, el Júpiter posee sustancias astringentes y drásticas19 y las especies del género

Clusia son productoras de benzofenonas premiadas, 45 que de hecho pueden estar presentes en

esta resina balsámica objeto de estudio.

Existen reportes acerca del uso del Mangle en poblaciones aisladas de origen primitivo, en la

cura de heridas, en la tuberculosis, la lepra, las hemorragias y las disenterías; la Campanilla

para las inflamaciones de las piernas y en el tratamiento de las úlceras rebeldes; el Júpiter para

curar la estomatitis, la hinchazón y las irritaciones l9- 46 y las benzofenonas premiadas presentes

en las especies del género Clusia son de utilidad como antimicrobianas 20 frente a bacterias

gram (+) y gram (-), así como a hongos como la Candida albicans.

Las referencias anteriormente expuestas apuntan hacia el criterio de que el propóleos cubano

Capítulo no1 Revisión bibliográfica

Capítulo no.1 Revisión bibliográfica

10

es heterogéneo y que sus componentes fundamentales varían en dependencia de la zona en que

éste ha sido recolectado.

No obstante, se maneja entre los prestigiosos colectivos científicos del mundo que las

propiedades terapéuticas atribuidas a esta sustancia se conservan independientemente del sitio

geográfico de procedencia de las muestras sometidas a ensayos, ya que las respuestas logradas

en las investigaciones llevadas a cabo coinciden plenamente. 7 47

En nuestro país se han desarrollado numerosos estudios con muestras de propóleos

recolectadas en diversas regiones con la finalidad de demostrar las propiedades farmacológicas

atribuidas, muchas de las cuales ya han sido extrapoladas a la clínica para el tratamiento de

numerosas afecciones, demostrándose la utilidad de esta sustancia en la terapéutica.

A continuación referiremos los resultados de algunos estudios llevados a cabo en nuestro

país, a propóleos de diferentes localidades que nos permitirán establecer semejanzas y

diferencias en cuanto a su actividad farmacológica. Como es conocido al propóleos se le

atribuyen una gama de propiedades terapéuticas, pero solo haremos referencia a los resultados

que se han obtenido en la evaluación de la actividad antimicrobiana, antioxidante y cicatrizante.

1.1.2 Reportes sobre su actividad antimicrobiana, antioxidante y cicatrizante

Las primeras referencias de investigaciones sobre las propiedades antimicrobianas del

propóleos cubano datan de 1984; 48 estos estudios condicionaron el planteamiento de que los

extractos de propóleos presentan mayor actividad frente a las cepas gram (+) ya que se obtuvo

una marcada inhibición del crecimiento de las mismas (>80%), alcanzándose en las gram (-) una

inhibición de un 11,8% a un 71,4%.

Sin embargo, en 1990 49- 50 se demostró que la Escherichia coli y Pseudomonas

aureaginosa son sensibles a muestras de propóleos procedentes de colmenas cercanas a los

mangles del municipio Mariel de la provincia de La Habana, siendo el valor medio de la

concentración mínima bactericida (CMB) de 10,8 mg/ml.

Este resultado también fue obtenido con muestras de propóleos recolectadas en la región

costera de Nuevitas, provincia de Camagüey, siendo la Escherichia coli sensible a

concentraciones superiores a 0,0125 mg/ml. 44

Por otro lado, en 1993 51 y en 1995 52- 53 se realizaron evaluaciones microbiológicas al

propóleos rojo colectado en Artemisa, Los Palos y Nueva Paz que mostraron efecto

antimicrobiano a una concentración de 5 mg/ml frente a Staphiloccocus aureus,

Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli y a 2,5 mg/ml frente a Staphiloccocus

epidermidis.

Relacionado con la actividad antioxidante de esta sustancia, en 1994 11 el Departamento de

Bioquímica Clínica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de Cuba trabajó con


11

extractos etanólicos de 2 tipos de propóleos cubano: R obtenido en Baracoa (Guantánamo) y P

recolectado en Pinar del Río, los cuales exhibieron efectos semejantes frente a diferentes

especies de radicales oxigenados que se generaron por reacciones químicas específicas.

Estos investigadores reportan que la quimioluminiscencia amplificada por luminol producida

por el anión superóxido, generado en la reacción de la xantina-xantina oxidasa, fue inhibida en

un 50% por 5 /.ig/ml de propóleos R y 9,5 /ug/ml de propóleos P y en cuanto al radical alcoxilo

se obtuvo que 0,6 ¡ig/ml de ambos propóleos inhibían la quimioluminiscencia del mismo en un

50%.

En un estudio en tejido de hígado de ratón con Salmonellosis 54 se obtuvo que la peroxidación

lipídica desarrollada en las células hepáticas se estabilizó con la administración continua de

propóleos, estas propiedades inhibidoras de la peroxidación lipídica y antioxidantes fueron

también descritas en 1998 55 por un colectivo de investigadores que evaluaron el efecto

hepatoprotector del propóleos rojo cubano y plantearon que el mismo es debido al poder

antioxidante de esta sustancia.

En cuanto al efecto cicatrizante del propóleos existen reportes 56 de estudios en ratas con

lesiones tisulares, sometidas a tratamientos con tintura de esta sustancia, en las que se observó

un proceso de reparación tisular ya que al cuarto día la costra superficial de los animales

lesionados era más pequeña, la inflamación había cedido y el resto de la piel estaba sana.

También existen referencias 57 de un estudio desarrollado con miel propolizada y tintura de

propóleos en quemaduras que demostró que el primero aventaja al segundo porque no causa

irritación y facilita la eliminación de la costra pero ambos mantienen la asepsia, permiten la

rápida cicatrización e inhiben los procesos oxidativos que ocurren en la zona donde el tejido se

ha necrozado.

Todas estas acciones farmacológicas atribuidas a este producto apícola y demostradas

preclínicamente han condicionado el empleo clínico del propóleos cubano para el tratamiento de

pacientes con lesiones en los miembros inferiores, que presentan dificultades para su

cicatrización.

En 1988 13 se desarrolló la evaluación del propóleos procedente de distintas localidades de

Ciudad de La Habana, en forma de tintura, en pacientes con úlceras y gangrenas en las

extremidades inferiores, alcanzándose un 59% de cicatrización y un 100% de evolución

satisfactoria en las gangrenas secas.

Similar trabajo fue desarrollado en los Servicios de Angiología y Cirugía Vascular del Hospital

Provincial de Sancti Spíritus, en 60 pacientes con lesiones abiertas. En esta ocasión pudo

comprobarse que el propóleos y la miel de abeja poseen un alto poder cicatrizante, causan pocas

reacciones adversas y eliminan gran cantidad de microorganismos de las lesiones en poco

tiempo. 14

De 1988 a 1989 se acometió un estudio en 30 pacientes con úlceras flebostáticas a los que se


12

le aplicó una crema de propóleos con base de ungüento hidrófilo y una pincelada del mismo al

2%, elaboradas en el Hospital “Freyde de Andrade”, que al ser ensayada, demostró la eficacia

cicatrizante de esta sustancia y no así su efecto antibactenano. 15

Por otro lado, en el poblado La Fe se hicieron estudios en pacientes con úlceras venosas

(varicosas-post flebíticas) por el método ciego aleatorio, a los cuales se le aplicó una crema de

propóleos al 3% con base de ungüento hidrófilo y placebo. De esta prueba se derivó que este

producto es eficaz como cicatrizante, que tiene parcial efecto antimicrobiano y que sólo provoca

un bajo número de efectos indeseables. 16

También existen referencias 58 de investigaciones en el Hospital “Salvador Allende” de

Ciudad de La Habana con una crema de propóleos con base de ungüento hidrófilo en pacientes

con lesiones tróficas, obteniéndose una evolución satisfactoria en los mismos, en un menor

tiempo que el requerido con el tratamiento tradicional en el 86,7% de los pacientes tratados; el

estudio arrojó que en todos los casos los esfacelos se desprenden de la segunda a la tercera

cura, cambiando la coloración de la lesión a partir de la 3ra o 4ta cura con la aparición del tejido

de granulación en el 70% de los casos a partir de este momento, siendo evidente la epitelización

entre el 8vo y el lOmo día en el 88% de la muestra.


1.1.3 Antecedentes de evaluaciones toxicológicas:

En nuestro país se han desarrollado estudios toxicológicos a muestras de propóleos de

diferentes regiones del país, al respecto la literatura destaca que el uso oral y subcutáneo del

propóleos en dosis de lml/kg de peso e intraperitonial de 0,5 a 10ml/kg en ratones blancos, así

como de 10 a 40ml/kg en conejos puede ocasionar una intoxicación aguda. 7 Evaluaciones

llevadas a cabo en 1986, al propóleos recolectado en el Norte de Nuevitas en ratones OFI de

ambos sexos, con un peso entre 18-20g por vía oral, demostraron que este producto no es tóxico

a dosis de 2000mg/kg.59

En 1988 se estudió la posible acción irritante de una solución hidroalcohólica al 60% de

propóleos suministrada en forma de pinceladas sobre la piel rasurada de conejos, no siendo

detectado ningún índice de acción irritante.60

La toxicidad a dosis repetida fue ensayada en 1989 en ratones, ratas y Hámster por vía oral,

durante 6 meses, demostrándose que el propóleos cubano evaluado no provocó daños hísticos

en los órganos analizados, ni efectos teratógenos. 61

La literatura también reporta 62 el gran poder ábsortivo de las radiaciones UV del espectro

electromagnético que presenta el propóleos, alcanzándose el máximo valor a la A=320 nm

comportamiento apropiado para su uso como protector solar; así como que los estudios de

fototoxicidad lo clasifican como débilmente fototóxico y capaz de proteger en gran medida la piel

frente a radiaciones ultravioletas tanto de la zona A del espectro como de la B, cualidad que

aumenta proporcionalmente con la concentración que se emplee.

1.2 Pie diabético. Generalidades

En nuestro país las investigaciones desarrolladas hasta el momento, a propóleos de

diferentes regiones, especialmente de la zona occidental y central, abogan por la utilidad de este

apifármaco como antimicrobiano y antioxidante, propiedades estas que pueden ser de utilidad

para tratar al pie diabético, ya que en esta afección la cicatrización se retarda por el descontrol

metabòlico y la infección, sin embargo no se cuenta con una forma farmacéutica adecuada para

estos fines. Sobre esta base establecimos la necesidad de buscar información actualizada

acerca de esta afección y las estrategias actuales de tratamiento de la misma, con finalidad de

precisar el curso de la investigación.

El pie es en los diabéticos, la encrucijada donde confluyen las complicaciones de orden

neurològico (secundarias a una neuropatía), isquémicas (secundarias a la angiopatía) e

infecciosas, de forma que la enfermedad vascular (pie isquémico) o la neuropatía (pie

neuropàtico), o ambos conjuntamente, llevan la responsabilidad de los problemas que es posible

apreciar en el pie diabético. 63

13


14

Es conocido que uno de cada cuatro pacientes con úlceras en las piernas es diabético, siendo

la zona afectada el pie en el 24 % y las piernas en el 1%, existiendo un consenso entre

especialistas acerca de que toda lesión que se localiza en este sitio, aunque obedezca a variados

mecanismos etiopatogénicos, se define clínicamente como pie diabético y suele ser un fenómeno

tardío en la vida del paciente como consecuencia de un control inadecuado de la glicemia en

sangre durante varios años.64

La presencia y prevalencia de estas lesiones en el pie del diabético se asocia a diversos

factores entre los que cabe destacar la edad del paciente, el tiempo de evolución de la

enfermedad, la presencia de neuroangiopatía, el sexo masculino y el control metabòlico de la

enfermedad. 65~69

Básicamente en el enfermo diabético como consecuencia de las alteraciones metabólicas,

fundamentalmente la hiperglicemia, se produce una afectación neuropàtica y angiopática que

desencadena trastornos en el pie por afectación sensitivo motora y en mayor medida isquémica,

dando origen a un pie de riesgo. 70

Existe universalmente un acuerdo en cuanto a que la isquemia, la neuropatía y la infección

son los factores determinantes principales en la aparición de las úlceras así como, con alta

frecuencia, más de uno de estos factores, y en ocasiones los tres, participan en su producción. 71

1.2.1 Clasificación

De lo expresado anteriormente se desprende la siguiente clasificación:

Pie isquémico: La lesión inicial es una úlcera o gangrena isquémica que puede acompañarse de

un componente infeccioso. Existen pacientes que presentan insuficiencia arterial y pie doloroso

sin lesiones manifiestas, aunque sí tienen ausencia de pulsos, pies fríos, prolongación del tipo

de repleción venosa y rubor intenso cuando el pie está en posición baja. A pesar del compromiso

vascular el dolor está siempre ausente, no existen lesiones abiertas y los pulsos pedios y tibiales

posteriores pueden estar presentes. Su expresión clínica es en forma de úlcera isquémica y

gangrena isquémica. 71

Pie neuropàtico: Se caracteriza por una sensibilidad pobre y una buena circulación,71 de hecho

no puede olvidarse que el pie neuropàtico conlleva muchas veces a la existencia de

deformidades que van desde el dedo en martillo, hallux valgus y alteraciones de los arcos

plantares que forman la cúpula, hasta la hiperqueratosis, úlcera perforante y articulación de

Charcot. Los síntomas más destacados son el dolor, que va desde una sensación sorda o de

desasosiego hasta la de quemazón o calambre y las parestesias con sensación de frialdad,

entumecimiento, quemazón, hormigueo o sensaciones raras (pisar algodón).72

Finalmente el pie neuropàtico e isquémico del diabético puede experimentar una infección.

Muchos son los argumentos científicos que fundamentan esta tendencia, que parece anclada a


15

nivel celular y en relación con una función leucocitaria alterada y con la destrucción intracelular

de gérmenes igualmente debilitados. Mientras el individuo sin diabetes responde a la infección

con inflamación, incremento del flujo sanguíneo y emigración de leucocitos, un diabético

responde desarrollando trombosis vascular y necrosis. 69 Una vez que ha empezado la infección,

sea un pie neuropàtico, sea un pie isquémico, la morbilidad y mortalidad se incrementan

deforma significativa (Figura no.l).

1.2.2 Tratamiento

En el tratamiento de estas lesiones se han ensayado un gran arsenal de medicamentos y

aunque se cree que la profilaxis es la mejor, cuando ya está establecida la lesión hay que actuar

deforma enérgica. 73

Se han utilizado: Antibióticos por vía parenteral como las Penicilinas, los Aminoglucósidos y

las Cefalosporinas y por vía oral las Tetraciclinas y el Cloranfenicol. El tratamiento antibiótico en

inicio es empírico, pues la selección del antimicrobiano o la combinación de los mismos se basa

en el conocimiento de la microbiología de las lesiones a través de la prevalencia de

microorganismos patógenos obtenidos en cortes periódicos que son realizados a los mismos. 74

Las curas locales son muy utilizadas para lograr la limpieza, la desinfección y la

cicatrización, los fomentos de permanganato de potasio al 2 %, ácido acético al 0,7 % y suero

salino isotónico tres o cuatro veces al día durante 20 minutos, permiten remover las costras y

escaras promoviendo la epitelización y se acompañan de diversos productos tales como:

Nitrofurazona, Sulfadiacina de plata, Neomicín, Neobatín, Gentamicina, ungüento de enzimas

proteolíticas, Nitrato de plata al 0,25 % entre otras. 75

Para favorecer la cicatrización se han usado diversas técnicas y sustancias como: Tisoacril,

Dermocer, Duoderm o Granuflex, el Factor de Crecimiento de origen plaquetaño 73, la

Ketanserina tópica 76, la exposición al ozono y la electroterapia. 77

Por otro lado, es necesario el control metabòlico riguroso usando pautas móviles de insulina,

ajustando las dosis según controles de glicemia capilar cada seis horas, subcutánea o en

perfusión continua venosa. Una vez controlado el cuadro, se volverán a ajustar las pautas

estándar de insulina o hipoglicemiante oral según los requerimientos de cada paciente. 65


16

Cuando existe neuropatía, además del control metabòlico es necesario valorar terapéuticas

encaminadas al mecanismo etiopatogénico de la afección y hasta el momento los mejores

resultados se han obtenido con los inhibidores de la aldosa reductasa, que producen un bloqueo

de la vía de los polioles, alcanzándose las ventajas terapéuticas más significativas con el

Sorbinil, con el que se demostró un retraso en la aparición de las alteraciones neurofisiológicas,

un incremento en la velocidad de conducción nerviosa y en la reparación de las fibras

mielínicas,78 sin embargo fue detenido su uso por reacciones adversas hipertensivas entre el 3 y

el 10% de la población.79

Otro medicamento lanzado al mercado como inhibidor de la aldosa reductasa fue el

Tolrestat, que parecía ser muy efectivo en las pruebas iniciales y fue lanzado al mercado en

1989, retirándose en 1996, debido a su baja eficacia;80 tal fue el caso también del Ponalrestat

detenido por ausencia de clara eficacia en la retinopatía y la neuropatía diabética 81 y

actualmente se encuentran en fase de ensayo clínico el Epalrestat (aprobado en Japón), el

Zopolrestat y el Zenarestat. 82,83

Como puede observarse existe una gran variabilidad en cuanto a la entrada y salida de

medicamentos para el tratamiento del pie diabético y la amputación sólo es indicada cuando

han fallado las medidas para controlar los gérmenes que atacan la lesión, cuando aparece

gangrena o cuando la infección fulminante amenaza la vida del paciente. 84

Se conoce que el pie diabético es una complicación de la diabetes mellitus y que en esta

afección metabòlica, predomina fundamentalmente un estado de hiperglicemia capaz de

incrementar la producción de ERO, de ahí la necesidad de buscar información actualizada

acerca de las novedades científicas en este campo que nos permitan establecer una estrategia

científica para evaluar el propóleos, producto apícola al que se le atribuyen propiedades

antioxidantes, pero se desconoce aún el mecanismo por el cual, esta sustancia ejerce sus

efectos.

1.3 Especies Reactivas de Oxígeno y Diabetes Mellitus

1.3.1 Especies Reactivas de Oxígeno

En la biosfera, el más importante receptor de electrones (ej es el oxigeno molecular (O2), el

cual en virtud de su naturaleza birradicalaria fácilmente acepta un par de electrones dando

lugar a una serie de especies reducidas llamadas ERO.

Las ERO son los átomos, iones y moléculas con uno o más electrones no pareados en el

orbital más externo y las moléculas derivadas del oxígeno que tengan alta capacidad reactiva.

Las ERO más importantes son:

• Radical anión superóxido O2

17

• Radical hidroperoxil HO2

• Peróxido de hidrógeno H2O2

• Radical hidroxilo OH

• Radical peroxilo RO2

• Oxígeno singlete ‘02

• Oxido nítrico NO

• Ácido hipocloroso (HOCL)

Estas entidades desempeñan determinadas funciones pero cuando su producción excede la

capacidad antioxidante del organismo se produce una ruptura del equilibrio entre los sistemas

generadores y secuestradores de ERO hacia la producción descontrolada de las mismas y se

inicia una cascada de reacciones radicalarias que conllevan al estrés oxidativo y por

consiguiente al daño de los tejidos con el desarrollo de diversos estados fisiopatológicos. 85- 86

1.3.2 Mecanismos de generación e inactivación de ERO

La vía fundamental de generación de ERO es la reducción del oxígeno a agua, en los tejidos

vivientes, que puede proceder por dos rutas:

- Durante la fosforilación oxidativa a nivel del citocromo mitocondrial, mediante la acción del

complejo citocromo oxidasa, enzima mitocondrial, que genera el 95% del oxígeno consumido en

los tejidos, donde éste se convierte en agua por reducción tetravalente sin la producción de

ningún intermediario y sí de ATP.

- El 5% restante del oxígeno sale de esta cadena oxidativa y se transforma, por la ruta de

oxidación univalente, en intermediados tóxicos.

El O2- constituye el primer metabolito de la cascada de reacciones radicalarias. Se forma en

la célula animal tanto por vía enzimàtica como no enzimàtica. La vía enzimàtica comprende

ciertas reacciones redox con la participación de enzimas entre las cuales las más conocidas son

la xantina oxidasa y NADPH oxidasa y la vía no enzimàtica se trata de reacciones de ciclaje

redox de diversos xenobióticos. 87 88

Este radical se forma a partir de la molécula de oxígeno en presencia de una cantidad de

energía suficiente que le permita adquirir un electrón suplementario, su reactividad es débil pero

puede penetrar en las membranas biológicas y causar daños a blancos específicos.


18

Capítulo no.1 revisión bibliográfica

Una vez formado el radical anión superóxido se produce su dismutación, lo cual puede

proceder espontáneamente o puede ser catalizado por la enzima Superóxido dismutasa (SOD)

El primer paso en esta transformación se produce cuando el O2' se combina para formar el

HO2 -, estructura intermediaria radicalaria que participa en la formación del H2O2 La segunda

ERO de la cascada es el H2O2, éste puede formarse también por la vía enzimàtica y no

enzimàtica. La transformación enzimàtica se produce por acción de la enzima SOD a partir del

radical O2 . Esta dismutación puede ocurrir deforma espontánea, aunque menos eficientemente,

y la segunda es a partir del ácido ascòrbico utilizando el cobre y el oxígeno molecular.

El H2O2 formado, por acción de la SOD, es eliminado por la catalasa y por la glutation

peroxidasa (GSX -PX). Ambas enzimas son intracelulares.

La catalasa se encuentra localizada en los peroxisomas y desempeña un papel rector cuando

existe una superproducción de H2O2. La GSX -PX juega un papel más importante cuando no

existe superproducción de H2O2 y se encuentra tanto en el citosol como en la mitocondria. El

H2O2 formado no es una especie radicalaria, sin embargo, es un sustrato para la formación de

otras especies, altamente reactivas y muy tóxicas, como el radical OH 85

El OH se genera a través de la reacción de Haber-Weiss catalizada por hierro 89 y constituye

otra ERO que, sin lugar a dudas, resulta ser el más nocivo y peligroso para la célula, por ser

este el más poderoso oxidante capaz de reaccionar con cualquier molécula biológica vecina,

oxida a ciertos residuos aminoácidos de las proteínas, a las bases purímcas y pirimidínicas de

los ácidos nucleicos, causando por lo tanto inactivación de enzimas y estallidos del ADNfácido

desoxirribonucleíco), desencadena la cascada de peroxidación lipidica, esta peroxidación de

ácidos grasos polinsaturados de las membranas celulares ocasiona escape de fluidos,

rompiendo el equilibrio de las funciones secretoras de la membrana y los gradientes iónicos

transmembranales. 90

1.3.3 Estrés oxidativo y complicaciones asociadas a la Diabetes Mellitus

La Diabetes Mellitus es un trastorno caracterizado por una serie de complicaciones

relacionadas con el estrés oxidativo. En esta afección metabòlica, debido a la pérdida de la

homeostasis de la glucosa, predomina fundamentalmente un estado de hiperglicemia capaz de

incrementar la producción de especies reactivas (ERO, hidroxialdehídos, productos finales de la

glicosilación avanzada, etc) por la vía de la autoxidación de la glucosa y por la

vía no enzimàtica de glicosilación de proteínas, alterando de esta forma las funciones celulares

y generando un daño oxidativo a nivel de las membranas, además se producen algunas

alteraciones en la estructura y función de proteínas circulares y estructurales que son

Capítulo no. 1 Revisión biliográfica

19

glicosiladas, siendo estas en gran medida las responsables de las complicaciones que se

producen en esta enfermedad. 91

Este trastorno endocrino se asocia con reacciones redox, particularmente de oxidación

catalizadas por metales de transición, los cuales se hallan incrementados en el plasma en esta

enfermedad, por otro lado también aparecen o aumentan sustancias como el malondialdehído,

los dienos conjugados y sustancias reactivas del ácido tiobarbitúnco 89 92 que dan una medida

de la peroxidación lipidica presente en esta afección metabòlica, lo que evidencia la relación

entre la diabetes mellitus y el estrés oxidativo.

Existen reportes acerca de que las ERO causan ruptura del ADN y este daño activa las poli

(ADP-ribosa) sintetasa, las que eliminan el NAD+ celular, 93 cofactor necesario para la enzima

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en la ruta glucolítica, de manera que se produce la

inhibición de la glicólisis y de los componentes de la cadena transportadora de electrones a nivel

mitocondrial, disminuyendo por lo tanto el ATP intracelular; 94 tales efectos provocan la

disfunción de las células fi del páncreas afectándose por tanto la secreción de insulina y

manifestándose la hiperglicemia característica de la diabetes mellitus.

Por otro lado, el exceso de glucosa provoca que los grupos amino libres de las proteínas

reaccione lentamente con azúcares reducidos como la glucosa por la reacción de glucosilación o

reacción de Maillard, en la que no solo participa la glucosa sino otros monosacáridos

(glicosilación). Las bases de Schiff formadas por esta reacción experimentan un reordenamiento

intramolecular lento que la transforman en un compuesto más estable (cetoamina, fructosamina

o productos de Amadori). Los productos de Amadori o fructosamina subsecuentemente se

degradan hasta compuestos más reactivos que el azúcar a la hora de reaccionar con los grupos

aminos de las proteínas para formar los productos finales de la glicosilación avanzada (PFGA),

que son irreversibles y se encuentran asociados con proteínas estructurales de larga vida como

la colágena 9S, elastina, mielina, actina y miosina 96

Los productos iniciales (cetoaminas o fructosaminas) y los PFGA afectan las propiedades de

las proteínas, los primeros modifican la carga eléctrica, la solubilidad y la movilidad y los

segundos generan puentes que unen una cadena polipeptídica con otra, modificándose la

estructura original de las mismas, que una vez modificadas comprometen las funciones propias

de la estructura o tejido del que forman parte 97 98, lo cual puede jugar un importante papel en

las complicaciones a largo plazo de la diabetes. 91

Por otro lado, la glicosilación no enzimàtica de las proteínas y la autoxidación de la glucosa

pueden atenuar las defensas antioxidantes endógenas mediante la glicosilación de las enzimas

secuestradoras de ERO, por lo que estos procesos juegan un papel importante en el estrés

oxidativo que se produce en la diabetes mellitus. 99


20

1.3.4 Mecanismos moleculares y celulares de las complicaciones diabéticas

Mecanismos de dis función vascular inducidos por la hiperglicemia:

Muchos factores de riesgo han sido identificados en pacientes diabéticos responsables del

desarrollo de complicaciones microvasculares y macrovasculares, siendo la hiperglicemia una de

las más importantes.

Los mecanismos propuestos para explicar los efectos adversos de la hiperglicemia son

múltiples, pero de ellos cuatro teorías son las que actualmente se manejan en la clínica:

1. Vía de los polioles.

2. Alteraciones redox

3. Activación diacilglicerol proteinquinasa.

4. Glicosidación no enzimàtica.

Una de las teorías más antiguas es la vía de los polioles de gran trascendencia en las

complicaciones diabéticas.100 El metabolismo de la glucosa por esta vía se basa en dos

reacciones:

1. La reducción de la glucosa a sorbitol por la aldosa reductasa

Esta reacción utiliza NADPH (fosfato de dinucleótido de adenina nicotinamida reducido) como

donador de hidrógeno y favorece una disminución del cociente NADPH/ NADR.

2. El sorbitol es oxidado a fructosa por la enzima sorbitol deshidrogenasa

Esta reacción usa NAD+(dinucleótido de adenina nicotinamida) como aceptor de hidrógeno y

favorece el incremento del cociente NADH/NAD*. 101

Normalmente el metabolismo de la glucosa por esta vía eleva los niveles de sorbitol, dando

lugar a un aumento en la captación de agua por las células debido a la capacidad osmótica del

mismo, generándose edema que causa isquemia y daño neurològico, a su vez el sorbitol actúa

como inhibidor competitivo del mioinisitol disminuyendo este último y la ATPasa Na*/K\

activándose la proteinquinasa C (PKC) con aumento de la fosfolipasa A2 y el incremento de

prostaglandinas vasodilatadoras en varios, pero no en todos los tejidos blancos del daño

hiperglicémico. 102'105


El segundo mecanismo propuesto involucra la alteración del cociente NADH/NAD* que refleja

el estado redox de la célula. Esta teoría postula que un incremento en el NADH causa mayores

problemas a los que ocasiona el aumento de metabolitos oxidativos; ya que se producen

cambios en la fluidez y permeabilidad vascular y también se incrementa el precursor del

diacilglicerol por inhibición de la reacción del gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. Pero una

posible limitación de esta teoría es el hecho de que el potencial de oxidación - reducción inducido

por la reacción de la aldosa reductasa puede no ser suficiente para alterar el cociente

NADH/NAD* de la célula porque menos del cinco porciento de la glucosa es metabolizado por

esta vía. Por lo que se hace necesario desarrollar estudios en animales y en el hombre que

permitan medir los niveles de NADH/NAD+ intracelulares para confirmar esta hipótesis.106

El tercer mecanismo (Figura no. 2) plantea que los niveles elevados de glucosa incrementan

la síntesis del diacilglicerol en las células vasculares y este activa un sistema de traducción

importante, la vía de la PKC.107

Múltiples estudios han mostrado que la hiperglicemia y la diabetes disminuyen la actividad

de la ATPasa Na*/K* en los nervios periféricos y vasculares.108 El mecanismo por el cual la

hiperglicemia inhibe esta enzima no está claro, pero existen reportes recientes 107 acerca de que

la misma es inhibida debido a la activación de la PKC con el subsecuente incremento de la

actividad de la fosfolipasa A¿ producto a la fosforilación de ésta. La activación de la fosfolipasa

A2 aumenta la producción de ácido araquidónico y los niveles de prostaglandina E2 los cuales

han sido reportados como inhibidores de la ATPasa Na*/K*. Además se ha planteado que la

activación de la PKC por hiperglicemia puede regular la expresión genética de muchas proteínas

incluyendo la involucradas en la contractibilidad vascular localizadas en la membrana basai.

I09’110

Existen planteamientos 111 acerca de que los niveles elevados de glucosa pueden disminuir

la expresión de la calmodulina, proteína que interactúa con la misma y la actina en células del

músculo liso vascular para regular la contractibilidad vascular (Figura no. 2).

El cuarto mecanismo asociado a las disfunciones vasculares por hiperglicemia es el que

involucra la modificación acelerada no enzimàtica de macromoléculas, debido a la glucosa y

otros azúcares, para formar los PFGA.

Existen tres mecanismos generales por los cuales la formación de PFGA puede causar

cambios patológicos. n2'1,5

1- Formación rápida intracelular de PFGA por glucosa, fructosa y muchos de los intermediarios

derivados de esta vía metabòlica altamente reactiva los que pueden directamente alterar la

función de las proteínas.

21

23

2- Los PFGA pueden alterar vías de traducción involucrando ligandos de la matriz extracelular.

3- Los PFGA pueden alterar la expresión genética a través de la interacción con receptores celulares específicos de los PFGA.

La producción de ERO inducida por la hiperglicemia puede ser una consecuencia común de

muchos de los mecanismos planteados. La autoxidación de los azúcares y los productos de la

glicosidación no enzimàtica producen ERO, así como, el incremento de los niveles de NADH

activa enzimas oxidativas y el aumento de PKC se conoce que regula y activa varios NADP

oxidasas por lo que son necesarios estudios que permiten aclarar los diversos mecanismos

celulares propuestos a través de los cuales la hiperglicemia puede inducir ERO y determinar si

ellas son las responsables de la disfunción vascular que se produce. 116,117

Varios reportes 1,8 han demostrado que en la Diabetes mellitus se produce un marcado

decremento en un número de mecanismos de defensa antioxidante, esto incluye al glutation, la

SOD, el ácido ascòrbico, el ácido úrico y la vitamina E; por lo tanto, si al propóleos se le

atribuyen propiedades antioxidantes marcadas, resulta adecuado evaluarlo en el pie diabético,

en el que la capacidad antioxidante del paciente está disminuida.

Bajo estas premisas y teniendo en cuenta que la sustancia a evaluar es una resina

balsámica cuya aplicación tópica se dificulta por la pegajosidad y de hecho la ausencia de

extendibilidad; se hace necesario elaborar un sistema medicamentoso que permita llevar a cabo

las evaluaciones biológicas, dicho sistema debe ser inocuo para poder ser ensayado en seres

humanos, pues no existe en la actualidad un modelo animal adecuado de pie diabético, siendo

obligado desarrollar las pruebas en el hombre y para ello existen regulaciones que a

continuación abordaremos.

1.4 Evaluación toxicológica de medicamentos para uso tópico:

El conocimiento de la toxicidad de las sustancias sólo puede obtenerse además de las

predicciones teóricas, por dos vías: estudios retrospectivos de casos de intoxicación y ensayos

experimentales. 119

El objetivo fundamental de los ensayos toxicológicos es determinar el daño a los tejidos

biológicos, por lo que la sustancia debe administrarse desde un nivel tan bajo que no provoque

daño alguno hasta dosis adecuadas que se consideren suficientes para causar un efecto nocivo.

De esta forma se impone el desarrollo de dichos estudios, donde los resultados serán sin lugar a

dudas lo más importante, que permitirá dar una validación toxicológica de la sustancia

investigada, de lo que depende su utilización o rechazo. ,2ü

Un estudio riguroso de un agente con fines terapéuticos exige el cumplimiento de las

exigencias normadas y reguladas internacionalmente por la OECD y la ISO para su registro y

postenor uso en la práctica médica.

Teniendo en cuenta, que el producto elaborado es para uso tópico en pacientes con pie

diabético, fue indispensable someter el mismo a los ensayos en la primera barrera, en los

cuales es necesario llevar a cabo los siguientes estudios:

A. Toxicidad a dosis única:

Primer paso lógico en la evaluación toxicológica de un medicamento y permite establecer su

capacidad tóxica tras una sola dosis dentro de las 24h o por administraciones repetidas en


24

intervalos cortos. 1I9‘ 120

La vía de administración seleccionada, clasifica el tipo de estudio de toxicidad a dosis única

y de forma general se recomiendan como mínimo 2 vías, incluyendo siempre la vía tópica 121 y

utilizar la clasificación tóxica aguda (CTA). 122

Esta clasificación establece dosis prefijadas de 25, 200 y 2000 mg/kg y son empleados 3

animales por sexo para cada dosis. En dependencia de la mortalidad encontrada con el nivel de

dosis inicial, se determina si es necesario ensayar un segundo nivel de dosis y en

circunstancias excepcionales un tercer nivel de dosis. La sustancia se clasifica según las

siguientes categorías:

Dosis < 25 mg/Kg ..........................Muy tóxico.

25< Dosis < 200 mg/Kg ................ Tóxico.

200< Dosis < 2000 mg/Kg ............. Dañino.

Dosis > 2000 mg/Kg ...................... Prácticamente inocuo 122

B. Toxicidad local:

Donde se incluyen los siguientes ensayos:

Ensayos de irritación: Diseñados con el objetivo de determinar el peligro potencial de una

exposición aguda a irritantes, sustancias químicas, medicamentos y cosméticos ya sean

naturales o sintéticos a los que el hombre rutinariamente está expuesto de modo accidental o

intencional y que tienen contacto con membranas mucosas y piel.

Irritación primaria dérmica: Este tipo de ensayo se desarrolla si la sustancia a ensayar

presenta una toxicidad aguda dérmica menor de 2000mg/kg, 2 < pH < 11.5 y sea irritante o

corrosiva por su relación estructura actividad. 123

Irritación primaria oftálmica: Para desarrollar este ensayo el producto debe tener un 2 - pH

< 11.5, el ensayo de irritabilidad dérmica debe ser negativo y en los ensayos in vitro que se

lleven a cabo la sustancia evaluada no debe ser ni corrosiva, ni irritante severo.

Ensayos de sensibilización

1- Sensibilización:

Se lleva a cabo a todos aquellos productos que tienen contacto con la piel, se basa en

determinar el efecto sensibilizante de una sustancia al ponerse en contacto con la piel, siendo

las mismas capaces de desarrollar después de la reacción de desafío, reacciones eritematosas,

edematosas o de formación de escaras y están mediadas por mecanismos inmunológicos. 124

2- Ensayos de Fotosensibilización

La Fotosensibilización es un proceso en el cual la luz inducida provoca reacciones anormales

a nivel de la piel, por la conjugación con sustancias químicas 125

Los ensayos de Fotosensibilización se realizan en aquellos productos de uso tópico que por


25

su estructura química pueda conjugarse con la luz solar o inducida, dando lugar a

reacciones anormales en la piel y se clasifican en:

❖ Ensayos de Fototoxicidad:

La fototoxicidad está definida como una respuesta no inmunológica de la piel ante un

fármaco o químico fotoactivo, inducido por la luz. Las reacciones fototóxicas pueden aparecer en

cualquier individuo después de la exposición a una cantidad de energía radiante de longitud de

onda apropiada y una adecuada concentración del agente inductor y en dependencia del mismo

el cuadro clínico puede variar, siendo los síntomas tempranos: sensaciones de quemazón,

picazón y dolor, así como respuestas adversas que ocurren pocas horas después de la

exposición y que pueden incluir la aparición de eritema, edema, hiperpigmentación, erupción

vesicular y descamación en el sitio de exposición, ya en las etapas tardías.

Los productos naturales por lo general son mezclas complejas, cuyos ingredientes activos

pueden producir reacciones fototóxicas al combinarse con la luz ultravioleta, de ahí la necesidad

de desarrollar este tipo de ensayo para poder definir si la sustancia evaluada puede o no ser

usada en el humano.126

❖ Ensayos de Fotoalergia:

La fotoalergia es la reacción de la piel a las radiaciones ultravioletas y/o visible producida

por agentes químicos sobre bases inmunológicas 127 Los ensayos de fotoalergia son de gran

importancia en las pruebas toxicológicas, pues nos dan criterio acerca de respuestas

exageradas del ser humano ante un producto determinado.


Capítulo 2 Materiales y Métodos

26

CAPITULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación estuvo encaminada a demostrar la eficacia terapéutica del

propóleos de la región de Manzanillo en pacientes con pie diabético, partiendo de las conocidas

propiedades antimicrobianas y antioxidantes de esta sustancia que pueden jugar un papel

importante en el cierre de estas lesiones.

Se consideró que el propóleos de la región de Manzanillo tiene un índice de oxidación bajo y

en su composición química pueden estar presentes compuestos fenólicos como, las benzofenonas

premiadas, debido a la vegetación predominante en la zona donde es recolectado, dichas

benzofenonas pueden ser las responsables de las propiedades antimicrobianas y antioxidantes

atribuidas a este producto apícola

Se tuvo en cuenta además, que en el paciente diabético como consecuencia de las

alteraciones metabólicas, fundamentalmente la hiperglicemia, se produce una afectación

neuropàtica y angiopática que desencadena trastornos en el pie por afectación sensitivo motora

y en mayor medida isquémica, dando origen a una lesión ulcerosa. Este tipo de lesión

generalmente sufre infección por las condiciones antes expuestas y es necesario tratarla con

antimicrobianos específicos para los gérmenes que en ellas crecen. Los gérmenes detectados con

mayor frecuencia en estas lesiones son: Staphylococcus aureus. Klebsiella pneumoniae.

Enterobacter aerógenes, Pseudomona aeruginosa y Escherichia coli.

El propóleos es muy eficaz frente a estos microorganismos según los estudios desarrollados

por numerosos investigadores en muestras de la región occidental y central48 53 y además esta

sustancia forma una película adherente y protectora, en la superficie de la lesión, que suprime

la acción de irritantes externos garantizando el desarrollo de sus acciones sobre la piel dañada.

6

Resulta importante destacar que este producto apícola es altamente soluble en alcohol y

soluble en disolventes con tendencia a la apolaridad, características estas que lo hacen

liposoluble, lo cual favorece el ataque del mismo a bacterias gram (-), ya que las mismas poseen

una membrana externa hidrofóbica, que solo puede ser atravesada por medicamentos

liposolubles, este criterio se confirma en la literatura revisada donde se reportan las

propiedades antimicrobianas del propóleos, no solo frente a gérmenes gram (+), sino también

frente a gram (-). 48 Por otro lado se conoce la actividad antioxidante de esta sustancia 1 S 4 } 55

que al combinarse con la antimicrobiana, la convierten en un compuesto adecuado para tratar al

paciente diabético con úlceras en sus miembros inferiores.

Ahora bien, los productos empleados en formulaciones medicinales para pacientes con este

tipo de lesión son sistemas emulsionados, prefiriéndose los de tipo oleoacuosos por su fácil

extendibilidad, por ser lavables, por su suavidad y por su penetrabilidad diadérmica, ya que

otros tipos de sistemas, por ejemplo: los sistemas emulsionables que contienen lanolina, no

resultan factibles, porque los mismos forman una capa oclusiva, que absorbe agua, creando un

medio favorable para el crecimiento microbiano que indiscutiblemente condiciona el

empeoramiento del paciente diabético con úlceras en los miembros inferiores. 30, 31, 32, 128

Por todo lo anteriormente expuesto, se seleccionó una formulación semisólida de tipo crema

con base emulsionada aceite en agua para desarrollar las evaluaciones biológicas

correspondientes, especialmente demostrar que la forma farmacéutica diseñada no modificaba

la potencia antimicrobiana, ni antioxidante del principio activo.

Para elaborar el sistema medicamentoso seleccionado fue imprescindible la estandarización

de la materia prima y del extracto blando, teniendo en cuenta que el propóleos varía de acuerdo

a la región geográfica, sobre todo según la fuente vegetal de donde provenga.

2.1 Preparación de la muestra

2.1.1 Materia prima Propóleos. Control de Calidad

Para la elaboración del extracto blando se utilizó propóleos materia prima, suministrado por

el sectorial de Salud Pública de la región de Manzanillo, provincia Granma. Para el estudio se

tomaron nueve lotes recolectados en dicha región, en los meses:

Lote 001 Enero-Febrero 1996

Lote 002 Marzo-Abril 1996

Lote 003 Agosto-Septiembre 1997


Lote 005 Abril-Mayo 1999

Lote 006 Agosto-Septiembre 1999

Lote 007 Enero-Febrero 2000


Lote 009 Noviembre-Diciembre 2000

A todos estos lotes se le determinaron los parámetros de calidad según lo especificado, para

el propóleos bruto en la Norma Técnica de Tintura de Propóleos de 1992 del Laboratorio

Biológico y Farmacéutico. 129

Los parámetros analizados fueron los siguientes:

• Especificaciones organolépticas: Se analizaron los parámetros de aspecto, color y

olor a cada uno de los lotes en estudio según Norma Técnica. 129

• Especificaciones físico-químicas:

Consistencia: Este ensayo se realizó a cada lote objeto de análisis realizando la evaluación

visual y a través del tacto según Norma Técnica.129

Contenido de impurezas mecánicas: Se analizaron 3 réplicas de cada lote en estudio y se

procedió según Norma Técnica. 129 Los cálculos se realizaron según la siguiente ecuación:

C


27


28

Donde:

a = Peso del papel de filtro con impurezas, en gramos (g) b = Peso inicial del papel de filtro (g) c =

Peso de la muestra tomada para cada análisis (g)

X = Contenido de impurezas mecánicas (%)

Contenido de ceras: Se analizó este parámetro utilizando 3 réplicas para cada lote según

Norma Técnica. 129 Los cálculos se registraron mediante las ecuaciones siguientes:

c

Donde:

Y = Contenido de mezclas mecánicas y ceras (%) a = Peso del papel de filtro con mezclas

mecánicas y ceras (g) b = Peso inicial del papel de filtro (g) c = Peso de la muestra tomada para

el análisis (g)

Z(%) = Y -X

Donde:

Z = Contenido de ceras (%)

Y = Contenido de mezclas mecánicas y ceras (%)

X = Contenido de mezclas mecánicas (%)

Determinación cualitativa de compuestos flavonoides: Se tomaron 3 réplicas de cada lote

y se llevó a cabo la evaluación utilizando para el primer ensayo hidróxido de sodio al

20% (NaOH) y para el segundo acetato de plomo al 10% (PbAc) según la metodología descrita en

la norma establecida. 129

La prueba resulta positiva si se observa la aparición de una coloración de anaranjada a

amanillo rojiza frente al NaOH y de un precipitado amarillo verdoso a verde pálido con el PbAc.

Determinación del número yódico: A todos los lotes se les realizaron 3 réplicas y se llevó a

cabo la determinación mediante la titulación con Tiosulfato de sodio 0,1 N hasta la decoloración

de la solución según los procedimientos establecidos por la norma. 129 Los cálculos se realizaron

a partir de la ecuación:

Donde:

0,01269 = constante de relación del yodo

a = cantidad de la solución de Tiosulfato de sodio 0,1 N empleada en la titulación de la prueba

control (mi)

b = cantidad de solución de Tiosulfato de Sodio 0,1 N empleada en la titulación de la muestra

(ml)

0,05 = muestra de propóleos (g)

Determinación del índice de Oxidación: Se realizaron 3 réplicas a cada lote y se procedió

según norma 129 utilizando permanganato de potasio 0,1 N para medir el tiempo de disipación

del color rosado de la solución evaluada.

2.1.2 Elaboración del extracto blando de propóleos

Comprobada la calidad de la materia prima se procedió a elaborar el extracto blando, según

el método descrito por Cuellar y colaboradores en 1987, 44 el cual se muestra en el Anexo no.2.

Partiendo de los lotes de propóleos bruto se prepararon respectivamente, los lotes de extracto

blando igualmente clasificados.

2.1.2.1 Estandarización de los parámetros de calidad del extracto blando de

propóleos:

Se determinaron los siguientes parámetros:

Características organolépticas: A cada lote de extracto blando se les realizó las evaluaciones

sensoriales de aspecto y olor, según la NRAG 1129/ 1994. 130

29


30

Determinación del contenido de sólidos totales: Para la realización de este ensayo se procedió como

indica la NRAG 1129/1994 ¡30. Se analizaron 3 réplicas para cada lote y los resultados se expresaron a

partir de la siguiente ecuación:

M

Donde:

S.T. = Contenido de sólidos totales (%)

Pi = Peso de la cápsula de porcelana con la muestra seca (g)

Pj = Peso de la cápsula de porcelana (g)

M = Peso de la muestra (g)

Determinación del contenido de impurezas mecánicas: Se realizaron 3 réplicas a todos los

lotes y se empleó la técnica descrita para este ensayo en la NRAG 1129/1994. 130 Los cálculos

se efectuaron según la ecuación descrita en la página 27.

Determinación de la actividad antibacteriana: Este ensayo fue realizado a cada lote según

la NRAG 1129/1994. 130

Para obtener el inoculo fue preparada una suspensión en medio caldo triptona de soya, del

microorganismo Staphylococcus aureus ATCC 25923 (a partir de tubos de agar nutriente con

18-24 horas) e incubada hasta alcanzar fase logarítmica de desarrollo, ajustándose la

concentración al patrón 4 de la escala de Me Farland (1,2 xlO 9 cel/ mi) para trabajar el método

de difusión y al patrón 0,5 (1,5x10 8 cel/ mi) para el método de dilución.

Para evaluar la actividad antibacteriana se adicionaron 2,5 mi de medio agar nutriente (capa

base) a cada placa de Petri y posteriormente 8 mi del medio con el inoculo adecuado (capa

semilla: 3,3 mi del inoculo fueron adicionados por cada 100 mi de agar nutriente). Una vez seca

la superficie agarizada, se horadaron pocilios de 8 mm de diámetro y se añadieron 100 ¡uL de

las muestras, exponiéndose la placa a 4°C durante 3 horas. Finalmente se incubó 24 horas a

37°C. La lectura fue el resultado de la media aritmética de 6 réplicas y 2 experimentos y se

realizó determinando el tamaño de los halos de inhibición (solo la zona trasparente). Se

emplearon controles de solvente y antibiótico (Gentamicina 100 U/ml)

Determinación del pH: Se evaluó el pH de cada lote. El equipo utilizado (Peachímetro CG- 824,

SCHOTT) se calibró antes de cada medición con soluciones buffer de pH = 4 y pH = 7. Se

analizaron 3 réplicas.


31

Determinación del índice de Oxidación: Se realizaron 3 réplicas a cada uno de los lotes en

estudio según el método descrito para el propóleos bruto, en la Norma Técnica de la Tintura de

propóleos. 129

Determinación del contenido de fenoles totales: Este ensayo se realizó por triplicado a

cada lote en estudio. Se procedió según el método descrito por Villalón C. en 1998 131 para la

determinación de fenoles totales en extractos de propóleos. El método se fundamenta en la

reacción de los iones férricos, que se generan en el medio por la reacción del ferrocianuro con

cloruro férrico, estos iones interactúan con los grupos fenólicos de la sustancia evaluada, basta

que la molécula tenga un OH. o grupo fenólico para que se desencadene la reacción.

El porcentaje de fenoles totales, en el extracto blando analizado, referido por cada 1 OOg de

propóleos en base seca, se determinó a partir de la siguiente ecuación:

Donde:

A.M = Absorbancia de la solución muestra

A.P = Absorbancia de la solución patrón de ácido gálico

PS = Peso del ácido gálico (g)

PM = Peso de la muestra (g)

v = Contenido o pureza de ácido gálico en la sustancia de referencia (%)

S.T = Sólidos totales (%)

Los intervalos de confianza para los parámetros de calidad evaluados, tanto a la materia

prima como al extracto blando júeron calculados a través del programa Statistica versión 6.0.

Una vez estandarizado el extracto blando, el Colectivo de Investigadores del Laboratorio de

Tecnología Farmacéutica del Departamento de Farmacia de la Universidad de Oriente llevó a

cabo un estudio de compatibilidad con los excipientes candidatos de la formulación y luego

elaboró el sistema medicamentoso aplicando un diseño factorial 32; la formulación óptima

seleccionada fue preparada al 10% y al 15% por el método de fusión 31

Se tomaron testigos que fueron sometidos a estudios tecnológicos, por el Laboratorio de

Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Oriente, y microbiológicos por el Departamento de

Infección Hospitalaria del Laboratorio de Higiene y Epidemiología de Santiago de Cuba y por el

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM)

de Ciudad de La Habana, los resultados de dichas evaluaciones se muestran en el Anexo no. 3.

El producto sometido a ensayo se conservó protegido de la luz, a una temperatura de 25 C,

en potes plásticos de 25 g aptos para contener productos de consumo humano.

La selección de las concentraciones referidas anteriormente se fundamentó en los criterios de

la literatura consultada que a continuación se refieren:

En 1994 se desarrollaron estudios en 62 perros con quemaduras y heridas traumáticas


32

tratados con ungüento al 10%, elaborado a partir del propóleos recolectado en la región de

Nuevitas, dichos estudios demostraron la eficacia de este producto apícola, al favorecer

el crecimiento del tejido de granulación y la epitelización.132

También existen referencias del uso de una crema al 2% elaborada con propóleos de la región

occidental del país, con base ungüento hidrófilo, en 30 pacientes con úlceras flebostáticas, que

mostró eficacia cicatrizante pero no efecto antibacteriano 15 y el empleo de la formulación al 3%

en úlceras venosas (varicosas postflebíticas) que permitió obtener un efecto antibacteriano

parcial, con un bajo número de reacciones adversas.16

En 1978 se llevaron a cabo pruebas clínicas en pacientes con quemaduras y úlceras en las

piernas que recibieron tratamiento con ungüento de propóleos europeo elaborado a diferentes

concentraciones de un 5% a un 20%, alcanzándose los mejores resultados en preparaciones al

10%.133

Sin embargo, en 1989 se reportó la aplicación de un ungüento al 30% a base de propóleos

recolectado en la región Occidental, en 35 pacientes con micosis superficial y úlceras en las

piernas que desarrollaron reacciones adversas a los 15 días de tratamiento, siendo necesario

suspender la aplicación.6 Al respecto Asis en 1979 refirió la eficacia sobre la piel de

formulaciones de propóleos preparadas del 5% al 10% siendo las del 20% al 30% irritantes 33 y

Braileanu en 1970 planteó que para la piel, las tinturas elaboradas con este apifármaco por

debajo del 10% no resultan eficaces, siendo las preparadas al 20% y al 30% irritantes.134

Este planteamiento fue confirmado en 1989 al detectarse la aparición de exantema populoso

generalizado después de la aplicación de un ungüento de propóleos al 20% en pacientes con

quemaduras.4

Ahora bien, antes de someter el propóleos de la región de Manzanillo a una evaluación

clínica, se desarrolló un estudio de la actividad antioxidante in vitro del mismo, en el cual se

obtuvieron importantes efectos antioxidantes por encima de un 70% de inhibición de la

peroxidación lipídica, pero este efecto no fue dependiente de la dosis ,J ’ y se conoce la

importancia que tiene en el orden farmacológico que las acciones del fármaco sean dosis

dependientes; de ahí que la atención en los ensayos preclínicos se centrara en las propiedades

antimicrobianas muy importantes para las complicaciones diabéticas y no se



reflejaran los resultados en relación con el estado redox, pero sí se consideró el mismo, al

evaluar clínicamente al paciente, ya que muchas de las técnicas in nitro utilizadas en

evaluaciones preclínicas son interferidas por las características de la sustancia evaluada.

El propóleos es una resina pegajosa, oscura y soluble en alcohol, en la que se mezclan

varias sustancias biológicamente activas, por lo que cabe la posibilidad que esta halla sido la

causa de los resultados obtenidos en la evaluación preclínica, de ahí que se decidiera ensayar

este producto en pacientes con pie diabético neuroinfeccioso, que sabemos es una patología

muy relacionada con el estrés oxidativo, teniendo en cuenta además los reportes en literatura

acerca de las propiedades antioxidantes del propóleos de otras regiones del país y que la clínica

es la mejor vía para demostrar los efectos de los fármacos en el humano.

2.2 Determinación de la actividad bacteriostática y bactericida in vitro

En este ensayo se tuvo en cuenta la necesidad de evaluar el propóleos de la región de

Manzanillo, partiendo de los antecedentes de que esta sustancia varía su composición química

de acuerdo a la región geográfica de procedencia, sobre todo según la fuente vegetal que

predomine en la misma. Por otro lado resulta indispensable demostrar que la potencia

antimicrobiana de este apifármaco se conserva en el sistema medicamentoso diseñado para su

futuro empleo en la práctica clínica, es por ello que esta evaluación se llevó a cabo no solo para

la crema, sino también para el extracto blando, ya que existen reportes de estudios

desarrollados 136 a una crema cosmética a base de propóleos, elaborada al 0,25%, que no

mostró actividad antimicrobiana frente al Staphylococcus aureus y se recomendó aumentar

la concentración del principio activo, si se deseara obtener dicha propiedad.

La evaluación se llevó a cabo por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

(CIDEM) de Ciudad de La Habana y por el Departamento de Infección Hospitalaria del

Laboratorio de Higiene y Epidemiología de Santiago de Cuba que llevaron a cabo la siguiente

metodología:

Preparación de la muestra: El extracto blando de propóleos fue disuelto en etanol absoluto,

de forma tal que se lograra una concentración de sólidos totales entre 3% y 5% similar a lo

descrito en la Norma Ramal de la Agricultura 1129 de 1994. ,J"

A partir del extracto blando de propóleos (75% de sólidos totales) se preparó una solución

madre que contenía 0,53 mi de dicho extracto en 10 mi de etanol absoluto (4/6 de sólidos

totales) y se realizaron diluciones con dicho solvente para alcanzar las concentraciones de 20;

10,5; 2,5; 2; 1,25; 0,6; 0,2 y 0,02 mg/ml.

En el caso de las cremas evaluadas se prepararon soluciones de trabajo de 100 mg/ mi,

disolviendo 1 g de crema en 10 mi de etanol absoluto, a partir de la cual se realizaron diluciones

en agua destilada para alcanzar las concentraciones de 50; 25; 12,5; 6,25; 5; 3,12; 1,6; 0,5 y

0,05 mg/ml.

33


34

Metodología seguida:

Se empleó el método de las diluciones seriadas en medio de caldo triptona de soya. 137 138 y

se utilizó una batería integrada por 7 microorganismos controles:

Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 25923

Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) ATCC 12228

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853

Escherichia coli (E. coli) ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) ATCC 10033

Proteus vulgaris (P. Vulgaris) ATCC 13315

Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) ATCC 13088

A partir de cada uno de ellos se prepararon suspensiones que se incubaron hasta alcanzar

la fase de desarrollo logarítmica ajustándose la concentración al patrón 0,5 de la escala de Me.

Farland.

Los tubos que contenían las diluciones de las muestras se enfrentaron a los microorganismos

controles incubándose a 37°C para determinar visualmente a las 24 h la concentración mínima

inhibitoria (CMI) del crecimiento, evaluada por la presencia de turbidez en los tubos.

En los casos en los que se observó inhibición se tomaron alícuotas de 5 piL y se sembraron

en medios agarizados específicos libres del agente antimicrobiano, para lo cual se empleó el

agar Voges Thonson, agar CLED, agar de Cetrimide o agar Me. Conkey en dependencia del

microorganismo en cuestión.

El inoculo empleado fue de 105 ufe/mi y como el etanol absoluto se utilizó como disolvente

del extracto blando se llevó a cabo de modo paralelo una serie blanco. Se aplicó neutralizante

(suero inactivado al 10%) que es de gran utilidad para eliminar el efecto de detergentes,

antisépticos, etc.

Se tomó como CMI la menor concentración que inhibió el desarrollo in vitro de las bacterias y

como concentración bactericida mínima (CBM) la menor concentración que produjo un daño letal

sobre la célula microbiana en estudio. 139


Una vez conocida la actividad antimicrobiana de la crema de propóleos frente al

Staphylococcus aureus, se tomaron muestras de las cremas al 10% y al 154) a diferentes

tiempos (O, 30, 90, 180, 360 días) y se determinó según la NRAG 1129/1994 130 si se mantenía

la sensibilidad de esta bacteria al sistema medicamentoso diseñado, en los distintos tiempos

evaluados.

2.3 Ensayos toxicológicos

Partiendo de la aplicación terapéutica de la crema elaborada para desarrollar el estudio de

eficacia y según lo establecido por la OECD (1996) 140 en un estudio de toxicidad a dosis limite,

siempre deben considerarse, todas las vías de administración por las que pudiera ser utilizado,

el medicamento que se evalúa. De forma general se recomiendan como mínimo

2 vías, incluyendo siempre una que garantice los niveles sistémicos.

Teniendo en cuenta las características del propóleos, que es insoluble en agua y soluble en

alcohol, se escogió como vía que garantizara los niveles sistémicos, la vía oral.

Los biomodelos se llevaron a cabo según los procedimientos normalizados por la OECD en

1996 140 y las normas ISO de 1999; 124 los animales utilizados en los mismos, se mantuvieron en

cuarentena según los procedimientos normalizados de laboratorio con un ciclo de luz/oscuridad

de 12h, temperatura controlada (22± 1°C) y humedad (50±5%), con acceso al agua y comida

suministrados ad libitum.

En la tabla no. 1 se describen las características fundamentales de cada uno de los ensayos

realizados, en cuanto al tipo y cantidad de animales empleados, el sexo, las sustancias

administradas y la dosis.

2.3.1 Toxicidad a dosis única oral en roedores y no roedores

Los animales se seleccionaron al azar, se pesaron y se agruparon en el caso de los roedores

a razón de 5 ejemplares por caja, diferenciados por sexo e identificados individualmente y por

grupos: (I) control y (II) tratado ; y los no roedores fueron agrupados e identificados

individualmente. A todos los animales en estudio se les retiró el alimento 18 h antes de la

administración y se utilizó el etanol al 30% para evitar la muerte del animal; en ambos casos se

empleó la vía oral utilizando una cánula intragástrica y teniendo en cuenta no excederse de 2 mi

(roedores) y 10 mi (no roedores) como volumen total por esta vía, el suministro de agua se

mantuvo ad libitum.

Bajo estas condiciones y teniendo en cuenta que una sola dosis no puede ser administrada

en los animales no roedores debido al peso y a la concentración del producto que no puede

aumentarse debido a la baja solubilidad de éste en agua, se determinó aplicar la dosis en 5

tomas de 10 mi cada una (V=50 mi) cada 2 h para este grupo. 1


35

Tabla no.l Descripción de los ensayos toxicológicos realizados

Ensayo Tipo de

animales

Total de

animales

Sexo Peso Sustancia

administrada

Dosis

Toxicidad a

dosis única

oral

Roedores:

Ratas

Sprague

Dawley

No

roedores:

Conejos

Chinchila

20

6

Hembras y

Machos (10

de cada

uno)

Hembras

180±10g

2,22±1 kg

Tratados:

Tintura de

propóleos

C=100

mg/ml

Control:

Etanol al

30%

2000mg/kg

Toxicidad a

dosis única

dérmica

Roedores:

Ratas

Sprague

Dawley

No

roedores:

Conejos

Nueva

Zelandia

20

6

Hembras y

Machos (10

de cada

uno)

Machos

220±10g

2,22±lkg

Tratados:

Tintura de

propóleos C=

100 mg/ mi

Control:

Etanol al 30%

Tratados:

Tintura de

propóleos C=

860 mg/ml

Control: Etanol

al 90%

2000mg/kg

Irritabilidad

dérmica No

roedores

Conejos

Fi

3 Machos 1,8 kg Crema al 15% 0,5g de

Crema de

propóleos al

15%

Irritabilidad

oftálmica No

roedores

Conejos

Fi

3 Machos 1,8 -2 kg Crema al 10%

Crema al 15%

0,lg de la

crema de

propóleos al

10% y al

15%

Sensibilidad No

roedores

Curíeles

Hartley

20 Hembras y

Machos (10

de cada

uno)

>250±4g Crema de

propóleos al

2%

0,5g

37

La observación de los animales se ejecutó a las 6 y 12 h posteriores al tratamiento, sobre la

base de las manifestaciones que se refieren en el Anexo no.4. A las 24 horas después del

tratamiento se registró el número de animales muertos por grupo, practicándose la necropsia, el

examen macroscópico y las valoraciones histopatológicas según procedía. 141

Los sobrevivientes fueron regresados a sus jaulas para la observación en los 14 días

subsiguientes, controlando su peso corporal a los 7 y 14 días. 128‘ 140 y las manifestaciones

expresadas en el anexo referida anteriormente, anotándose las mismas en el modelo habilitado

al efecto, con una frecuencia no menor de 3 veces por semana. Al término de los 14 días se tomó

el peso de todos animales y se realizó la necropsia a los mismos.

2.3.2 Toxicidad a dosis única dérmica en roedores y no roedores

Para este ensayo los animales se seleccionaron al azar y se pesaron, los roedores se

agruparon a razón de 5 animales por caja, diferenciados por sexo e identificados

individualmente y por grupos y los no roedores fueron agrupados e identificados

individualmente; el afeitado de los mismos se llevó a cabo 24 horas antes del ensayo,

ejecutando el mismo en el lomo en un área equivalente aproximadamente a un 10 % de la

superficie total del cuerpo (3x4).123

Con una jeringuilla se aplicó el producto y se colocó una gasa en la superficie de aplicación

que fue cubierta con esparadrapo hipoalergénico atado deforma segura a la piel.

La sustancia en estudio se dejó en el sitio de aplicación por 24 h, tiempo después del cual la

cubierta fue removida y el agente residual fue eliminado por lavado con la ayuda de una

almohadilla de gasa, empleando jabón y agua templada. A los animales se le controló el peso

corporal con una frecuencia no menor de 3 veces, anotando el mismo en el modelo habilitado al

efecto.

Teniendo en cuenta que la vía de administración es dérmica se incluyeron como signos y

síntomas de toxicidad retardada los que aparecen en el Anexo no. 5, los cuales fueron anotados

en el modelo adecuado.

2.3.3 Irritabilidad Dérmica

La prueba de Irritabilidad Dérmica se realizó en un área aproximada de 6 cm2 de la piel; la

cual se cubrió con una gasa y se mantuvo sostenida a la misma mediante el empleo de un

esparadrapo hipoalergénico. Transcurridas 4 h de la aplicación única de la sustancia en

ensayo, se retiraron los parches, la zona se limpió con agua destilada y se secó con algodón

estéril.

El día antes del ensayo se depilaron los animales en la región dorsal, buscando siempre

aquellas zonas en las cuales el pelo tiende a demorar en aparecer. Las observaciones se


38

efectuaron a la 1, 24, 48 y 72 h de retirado el parche y los posibles daños se determinaron

según lo referido en el Anexo no. 5 y se anotaron en los modelos habilitados al efecto.

Todos los animales fueron ubicados en cubículos individuales. El cálculo del índice de

Irritación Primario (I.I.P) se efectuó sumando todas las observaciones de los días 2, 3 y 4,

dividiéndolas por el número de observaciones realizadas. El valor obtenido se comparó con la

categoría de respuestas referidas en el Anexo no. 6 para clasificar el producto y de esta forma

determinar su aprobación o rechazo.124’142 ,43

2.3.4 Irritabilidad Oftálmica

Para desarrollar este ensayo, no más de 24 h antes del inicio del mismo, se revisaron

rigurosamente todas las estructuras oculares (córnea, iris, conjuntiva) para de esta manera

descartar los animales que pudieran constituir falsos positivos.

La crema de propóleos al 10 % y al 15 % (0,1 g) se aplicó en el fondo del saco conjuntival del

ojo derecho, permaneciendo cerrado por espacio de 15 seg. En el ojo izquierdo no se aplicó

producto alguno, tomándose a manera de control.

Las observaciones se realizaron a la 1, 24, 48 y 72 horas después de la aplicación única del

material en estudio. Se aplicó una gota de Fluoresceína Sódica al 2% para de esta forma

visualizar mejor el posible daño corneal.

Todas las observaciones realizadas en las estructuras oculares fueron registradas en los

modelos habilitados al efecto. Se emplearon los parámetros referidos en el Anexo no. 7 para

graduar las afectaciones que se presentaron y para la evaluación de los resultados se tomó en

cuenta el sistema de clasificación que muestra el Anexo no. 8

El cálculo del I.I.O se determinó mediante la suma de todas las observaciones que se

encontraron en las tres estructuras analizadas (córnea, iris y conjuntiva), en los tiempos que se

prefijaron y este valor se dividió entre 12, el resultado obtenido fue el I.I.O. ' "


Este ensayo se llevó a cabo según las normas ISO establecidas en 1999. El día antes del

ensayo se depiló la región dorsal del animal, inmediatamente debajo del área escapular en una

zona de 4 x 4. El día de la prueba se revisaron los animales con la finalidad de detectar daños

en la piel y si estos se presentaban, se eliminaban los animales afectados, luego de la

inspección se inyectó por vía intradérmica en la zona derecha 0,1 mL del adyuvante completo de

Freund diluido 1:1 en cloruro de sodio al 0,9 %. El mismo día, pero en leí zona izquierda, se hizo

también una aplicación tópica de 0,5 g de la sustancia en ensayo por 48 h. La superficie tratada

fue de 4 cm2 para ambos grupos.

La crema de propóleos ensayada se elaboró al 2 % dado a que en este tipo de ensayo se

utiliza la mayor concentración que no produzca irritación a la piel; esta concentración se

determinó mediante la aplicación de diferentes concentraciones de la formulación (2%, 8%, 10%,


39

15%), al inicio del ensayo, en 4 curíeles jóvenes, adultos, sanos, de la línea Hartley, con un peso

mayor de 250+4 g.

Se efectuaron exámenes macroscópicos después de la remoción del parche, evaluándose el

desarrollo de eritema y edema de acuerdo a su grado utilizando los modelos establecidos y el

sistema de clasificación que se muestra en el Anexo no. 9. Los días 2, 4, 7,9, 11 y 14 en la zona

derecha se hizo aplicación tópica por 48 h de 0,5 g de la sustancia sobre una superficie de 4

cm2.

Los días del 16 al 27 los animales se mantuvieron en reposo, o sea, no se aplicó tratamiento

alguno. El día 28 se hizo una aplicación tópica oclusiva por 48 h sobre un área de 4 cm2 de 0,5g

de la sustancia de ensayo en el flanco derecho (también depilado el día antes) tanto para los

animales sometidos a ensayo como para los controles, que recibieron en el flanco izquierdo el

vehículo.

Se observaron los animales a las 24, 48 y 72 h; después de la remoción del parche se

graduaron las reacciones para eritema, edema y formación de escaras para cada sitio tratado y

en cada intervalo de tiempo. La lectura tomada a la hora no se tuvo en cuenta.

El cálculo se realizó dividiendo el total de los animales que presentaron sensibilidad entre el

total del grupo (% de animales sensibilizados) y se comparó el resultado obtenido con lo

establecido por Draize (Anexo. 10) 143<145

Basándonos en las referencias expuestas en el capítulo de la Revisión bibliográfica y

teniendo en cuenta que los resultados de las evaluaciones toxicológicas desarrolladas en la

presente investigación coinciden con estudios realizados a propóleos cubanos de otras regiones

del país 59> 60, así como el criterio acerca de que el propóleos cubano es heterogéneo, pero que

su variabilidad no está dada por la diversidad de los elementos presentes en el mismo, sino por

la cantidad de cada uno de ellos; 140 se decidió por razones económicas, no llevar a cabo los

estudios de fototoxicidad, ni fotoalergia, ni tampoco las evaluaciones de toxicidad a dosis

repetida, que son exigencias para el registro del medicamento pero no para evaluaciones

clínicas, siempre que la literatura refiera ensayos con el producto objeto de estudio.61 62

2.4 Ensayo clínico

Una vez cumplimentadas las exigencias de seguridad establecidas por los organismos

reguladores se procedió a iniciar la evaluación de la eficacia del sistema medicamentoso

diseñado para estos fines, a través de un ensayo clínico que se llevó a cabo según la

Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial (Guía de Recomendaciones médicas

para la Investigación Biomédica en humanos, adoptada por la 18 Asamblea Médica Mundial en

Finlandia, Junio de 1964, enmendada por la 52 Asamblea General en Edimburgo, Escocia,

Octubre del 2000) y en correspondencia con las regulaciones establecidas en nuestro país por el

CECMED, una vez emitida la aprobación por esta entidad regulatoria; clasificándose el mismo

en fase II tardía, cerrado, a doble ciegas, controlado, estratificado según el tamaño de la lesión

y multicéntrico, con un diseño experimental de comparación interindividual o en grupos

paralelos.


40

Para lograr el doble ciego se establecieron las siguientes condiciones: todos los

medicamentos utilizados se colocaron en frascos plásticos iguales, aptos para contener

productos de consumo humano; la cura de la lesión se llevó a cabo por personal que no

intervenía en la evaluación de los resultados del ensayo; se cuidaba que antes del pase de

visita, la lesión estuviera lavada, para ello se ponían fomentos durante 20 min, de esta forma el

médico evaluaba, sin conocer que tratamiento recibía el paciente y luego se llevaba a cabo la

curación por el personal seleccionado; el paciente sabía que estaba en un ensayo clínico, pero

no conocía la forma farmacéutica que se estaba aplicando, pues la Terapia habitual estaba

constituida por cremas y ungüentos de diferentes tipos: Nitrofurazona (Amarñlla, untuosa),

Factor de crecimiento epidérmico (Blanca, cremosa), Sulfadiacma de plata (Blanca, cremosa), y

Neomicina (Transparente, untuosa).

El tamaño muestral de 40 pacientes para cada grupo experimental, calculado a través del

sistema MEDSTAT versión 2,1 de 1989, se obtuvo partiendo de una tasa de curación de un 20%

con la terapia habitual, para obtener al mes de tratamiento con la formulación ensayada una

tasa de curación de un 60%, con un error de tipo I de 0,05 y una potencia para encontrar

diferencias entre los grupos de 0,2 con un 99% de confiabilidad.

Se incluyeron en el ensayo 120 pacientes atendidos en los Servicios de Angiología del

Hospital Clínico Quirúrgico Docente "Saturnino Lora , el Hospital Militar Joaquín Castillo Duany

" de Santiago de Cuba y el Hospital Salvador Allende de Ciudad de La Habana con pie

diabético, en el período comprendido entre Diciembre de 1996 a Mayo del 2000.

La muestra estuvo constituida por 70 mujeres y 50 hombres cuyas edades oscilaban entre

28 y 74 años, dividiéndose la misma en tres grupos experimentales.

Grupo A: Voluntarios enfermos tratados con la crema de propóleos al 10 /o (n-40)

Grupo B: Voluntarios enfermos tratados con la crema de propóleos al 15 % (n=40)

Grupo C: Voluntarios enfermos tratados con la terapia habitual (n=40).

La estratificación del tamaño de la lesión se llevó a cabo estableciendo la definición de

úlceras pequeñas y úlceras grandes según criterio del facultativo:

Úlceras pequeñas: Lesión con área <,10 cm2 y perímetro < 10 cm

Úlceras grandes: Lesión con área > 10 erri2 y perímetro > 10 cm

Para establecer la eficacia de la crema se utilizaron criterios clínicos, el análisis

microbiològico de la lesión y los indicadores bioquímicos, estableciendo:

Variables principales:

• Análisis microbiològico de la lesión

• Determinación en suero de indicadores bioquímicos

• Planimetría

Estas variables fueron estudiadas del siguiente modo:

Análisis microbiològico de la lesión: Permitió evaluar el efecto antimicrobiano de la crema, para

ello se tomaron muestras de la lesión, antes de tratar al paciente con la terapia propuesta para

el ensayo y una vez que el especialista determinaba la mejoría notable.

Esta evaluación fue realizada por el laboratorio clínico de los hospitales en los que se llevó a

cabo el ensayo, aplicando la técnica microbiològica para muestras de secreciones referida en el

Manual de Normas Técnicas de Microbiología Clínica y Sanitaria de estos laboratorios,147 y el


41

test de difusión en disco por el método de Kirby Bawer para determinar la resistencia y

sensibilidad antimicrobiana de los gérmenes patógenos.

Determinación en suero de indicadores bioquímicos: Constituyó un importante indicador del

efecto antioxidante del producto, para evaluar el mismo se tomaron muestras de sangre del

paciente, antes de iniciar el tratamiento y una vez que el especialista determinaba la curación

del mismo, para medir la Susceptibilidad a la peroxidación lipidica o Potencial de peroxidación

(SPOX) de éste y su Capacidad antioxidante.

Planimetría: Variable que dio criterio cuantitativo de cicatrización de la lesión que incluye área y

perímetro de la lesión y velocidad de cicatrización, como la variación de ambos parámetros en

función del tiempo y se evaluó mediante la toma de impresión en acetato para realizar el cálculo

del área y perímetro de la lesión por planimetría digital computarizada a través del paquete

procesador de imágenes DIGIPAT SYSTEM, EICISOFT (La Habana, Cuba). Este procedimiento

se ejecutó antes de aplicar al paciente el tratamiento y cada 10 días, al ser sometido éste a

evaluación por el especialista.

Variables secundarias:

• Evolución clínica de la lesión

• Determinación en suero de otros indicadores bioquímicos

Estos indicadores permitieron explicar los efectos antioxidantes del producto y el control

metabòlico del paciente, para ello se tomaron muestras de sangre en los 2 momentos señalados

anteriormente y se determinaron los niveles de Glucosa, Contenido relativo de Fructolisina

(CRF), Productos Reactivos del Ácido Tiobarbitúrico (PRATB), SOD, CAT, Hidroperóxidos totales

(HT), Fosfolipasa A2 (PLA2), Albúmina y Grupos sulfhidrilos no proteicos o Glutation (SH). • Duración del tratamiento

Se tomó el tiempo de duración de cada uno de los tratamientos en cada grupo experimental,

teniendo en cuenta las categorías establecidas para determinar la evolución final de la lesión,

emitida por el especialista, que a continuación relacionamos:

> Empeorado: Paciente que presentó reacciones perilesionales con aumento del tamaño de la

lesión al terminó del tratamiento o en el transcurso del mismo.

> Igual: Paciente que finalizó el tratamiento con los mismos síntomas y signos de la lesión.

> Mejorado: Paciente que al terminar el tratamiento presenta úlcera de menor tamaño, bordes

activos y fondo limpio.

> Curado: Paciente que finalizó el tratamiento sin lesión.

Variables de seguridad:

• Reacciones adversas

Se estableció la recogida de información sobre todo efecto adverso que apareciera, para ello

el médico debía registrar esta información en la planilla de reporte de reacción adversa (Anexo

no. 11), lo más explícitamente posible, describiendo la intensidad y la dosis del tratamiento

necesaria para aliviar los síntomas detectados. Para determinar la intensidad se tuvo en cuenta

la siguiente clasificación:

> Ligera: No requiere de medicación.

> Moderada: Cede con la medicación aplicada

> Severa: No cede con la medicación aplicada


42

La reacción adversa que se presentó se identificó, teniendo en cuenta los resultados

obtenidos en estudios precedentes i4S‘,5°, por lo que todo cuadro de prurito, irritación,

enrojecimiento y edema durante el tratamiento con la crema de propóleos se atribuyó a dicha

medicación.

Al presentarse el cuadro de reacción adversa se suspendió de inmediato la aplicación del

producto responsable de la misma y se realizó por el especialista las indicaciones terapéuticas

necesarias de acuerdo con la forma de presentación de la misma.

Como conducta se siguió la aplicación de un antihistamínico durante 7 días y el leimcio de la

cura de la lesión con otra medicación, considerándose este evento como criterio de salida. Acto

seguido se abrió el código para este paciente de manera que el médico


conociera el tipo de tratamiento que recibía y se llenaron los datos que al respecto se recogen en

la planilla para estos fines (Anexo no. 12). La incidencia detectada se comunicó al farmacéutico

de cada centro hospitalario que se encargó de hacer los trámites correspondientes para estos

casos, enviando la planilla establecida al Centro Piloto de Farmacovigilancia de la Provincia y a

la Consultoría del Centro Provincial de Toxicología.

Variables de control:

. Edad

. Sexo

. Raza

. Antecedentes patológicos (AP)

. Situación laboral

. Nivel de instrucción

. Tratamientos anteriores (TA)

. Tratamientos concominantes

. Tipo de Diabetes

. Tiempo de evolución de la enfermedad (TEE)

. Hábitos de vida

Controlados a través de la anamnesis farmacológica (Anexo no. 13) y recogidos en planilla

diseñada para estos fines (Anexo no. 12)

Método de asignación aleatoria:

Para formar los distintos grupos de tratamiento, los pacientes se asignaron de acuerdo a su

ingreso al hospital, haciendo coincidir su número de inclusión de forma aleatoria con la letra del

frasco que contenía el tratamiento, de la siguiente manera: IB - 2A - 3C - 4A - 5B - 6C y así

sucesivamente hasta completar cada grupo, de manera que el número total de pacientes en

cada uno fuera igual (n=40). El listado estuvo en poder de una enfermera y no fue manejado por

los investigadores.

Los criterios de inclusión, exclusión y salida, previos al ensayo, se refieren a continuación:

^ Criterios de inclusión: Pacientes hospitalizados o ambulatorios, de ambos sexos, cualquier

raza, menores de 75 años con diagnóstico positivo de pie diabético, que no consuman

bebidas alcohólicas y no fumen, que no hayan recibido suplementos vitamínicos ni

antioxidantes en los tres meses anteriores al inicio de este ensayo y que otorguen su

consentimiento para participar en el mismo.

'y Criterios de exclusión. Pacientes que no acepten ser incluidos en el ensayo, que no cumplan

con los criterios de inclusión y que presenten hepatopatias, nefropatías, linfangitis o

gangrenas, eczemas, urticarias, problemas de tiroides y asma bronquial, así como, aquellos

alérgicos a las abejas, picaduras de éstas y productos apícolas. Se excluyen las mujeres

embarazadas para evitar complicaciones durante este periodo.

> Criterios de salida: Pacientes que abandonen voluntariamente el ensayo, que presenten

reacciones adversas que puedan agravar su lesión, así como, aquellos que fallezcan y que


43

44

por causas ajenas a su enfermedad no cumplan los requisitos del tratamiento.

Procedimiento:

En la captación de los pacientes, se procedió a la recolección en historia clínica de sus datos

a través de la planilla correspondiente, la realización de la anamnesis farmacológica y el

llenado de la planilla de consentimiento (Anexos no. 12, 13, 14)

Para el estudio fue necesario medir la variable nivel de instrucción ya que la misma permitía

enfocar la anamnesis farmacológica para que el paciente la comprendiera y de esta forma se

obtenía información valiosa para el estudio, que no haya sido comunicada al facultativo y por

otro lado la situación laboral dio criterio de los hábitos de vida del enfermo que podían influir en

su estado de salud.

El tratamiento se realizó bajo la hospitalización del pacientes y se continuó en régimen

ambulatorio si, después de los 30 días de tratamiento, el especialista emitía el criterio de

mejoría, o se llevaba a cabo de forma ambulatoria. La curación fue ejecutada por personal

adiestrado que no intervenía en la evaluación de los resultados, cuando el paciente se

encontraba hospitalizado y por el personal de enfermería del consultorio médico de cada

paciente si este era ambulatorio.

El seguimiento de los pacientes hospitalizados se realizaba diariamente por el especialista,

anotando los cambios que se producían, así como, las manifestaciones de los enfermos sobre

los síntomas y estado general. Cada 10 días el especialista realizaba la valoración general del

paciente según los criterios establecidos para determinar la evolución final de la lesión y se

realizaba la anamnesis farmacológica para mantener controlados los requisitos del tratamiento,

su eficacia y las variables de seguridad y de control, en el caso de los pacientes atendidos

ambulatoriamente se garantizaba que cada 10 días fueran evaluados por el especialista, a

través de consulta previamente coordinada, para que el

estudio fuera homogéneo.

Los frascos con el tratamiento eran entregados al Médico de la Familia de cada paciente que

era atendido ambulatoriamente, con las orientaciones correspondientes en el método, para ello

se realizaba un contacto previo con el mismo que asegurara la calidad y continuidad del

ensayo.

Para llevar a cabo la cura de la lesión se procedía al lavado de las manos del personal que

ejecutaba la misma, toda la manipulación se realizaba con guantes, pinzas y materiales

previamente esterilizados; la torunda de algodón, así como, el aplicador se cambiaban para

cada paciente, de manera que no se contaminara el producto ni la lesión de los pacientes.

Para prevenir reacciones de intolerancia, se aplicaba en los pacientes la formulación en un

sitio alejado de la lesión, manteniendo la misma por 24 horas. Una vez concluido dicho período

se observaba la evolución y se determinaba el inicio o no del tratamiento.

La crema se aplicaba una vez al día en los grupos Ay B siguiendo el método descrito por

varios autores ¡si-is3t se aplicaba al paciente fomentos de suero fisiológico durante 20 minutos

antes de ser curado con la crema, con la finalidad de limpiar la lesión eliminando el tejido

muerto y la costra, lo cual facilita la formación del tejido de granulación y promueve la


45

epitelización. A continuación se secaba la lesión con torunda estéril y se aplicaba una fina capa

de la crema en el sitio afectado, cubriendo la lesión con apósitos y vendajes que se mantenían

durante 24 horas para contribuir a una mejor regeneración epitelial.

El grupo C recibía la terapia habitual, también 1 aplicación diaria, la cual se llevaba a cabo

con fomentos de Suero fisiológico al 0,9% o Permanganato de potasio al 2% o Ácido bórico al

0,5% o Ácido acético al 0,75% durante 20 minutos y crema de Nitrofurazona o Sulfadiacina de

Plata o Neomicina o Factor de Crecimiento según criterio médico, siguiendo la metodología

expuesta para los grupos Ay B.

Los pacientes que lo requerían recibían el tratamiento establecido por vía oral o parenteral

para controlar su enfermedad de base (Diabetes), siendo supervisada dicha terapia por el

personal de enfermería o por algún familiar en caso de pacientes ambulatorios.

El tratamiento se interrumpía si el enfermo desarrollaba linfangitis, gangrenas, eczemas,

lesiones dermatológicas, cualquier manifestación alérgica de etiología no precisada o

presentaba reacciones adversas propias del producto tales como prurito, enrojecimiento,

inflamación y edema.

Se estableció como evolución positiva del paciente, cuando éste mostraba una lesión libre de

microorganismos, con disminución del 60% del área y el perímetro de la lesión con respecto al

valor obtenido antes de iniciar el tratamiento, una susceptibilidad a la peroxidación lipídica por

debajo de 2460±622 nmol/L y una capacidad antioxidante mayor del 66%

Para aquellos pacientes en los que no se alcanzó respuesta, se descodificó su número de

áleatorización y se les brindó la oportunidad de continuar su tratamiento con la terapia

establecida, según criterio del médico, realizándose su seguimiento por consulta.

Criterios de evaluación de la respuesta:

Éxito terapéutico:

Se considerò éxito terapéutico si el 60% de los pacientes involucrado en el estudio, tratados

con la crema de propóleos, tenían una evolución positiva y si esta mejoría era al menos en un

20% superior a la obtenida en el grupo tratado con la terapia habitual. Fracaso terapéutico:

Cuando más del 40% de los pacientes tratados con propóleos no presentaban una evolución

positiva y la lesión mostraba reacciones perilesionales o profundización de la misma, con

aparición de esfacelos o incremento de la secreción, tardanza en la aparición del tejido de

granulación, o se mantuvieran los mismos signos o síntomas motivo de ingreso.

Técnicas utilizadas para medir los indicadores bioquímicos:

Para medir los indicadores bioquímicos se extrajeron de los pacientes muestras de 5 mi de

sangre total, a las 8:00 am después de 12 horas de ayuno, las mismas se centrifugaron en una

centrífuga SIGMA 2K-15 a 1800 r.min1. durante 20 min. El suero fue dividido en 11 partes y

conservado a -20°C hasta el momento de la determinación individual.

Se utilizaron variables bioquímicas de referencia para establecer comparaciones con las

obtenidas en la muestra poblacionál evaluada. Los valores de referencia normales fueron

tomados de 60 pacientes supuestamente sanos con edad, sexo y raza similar a la de la

muestra poblacionál objeto de investigación y de reportes de la literatura científica.154


46

1- Glucosa: Las concentraciones de glucosa fueron determinadas por el método colorimétrico

de la glucosa oxidasa, utilizando el juego de reactivos Rapigluco ® comercializado por la EPB “

Carlos J. Finlay” (Ciudad de La Habana. Cuba) que se fundamenta en lo siguiente:

La glucosa presente en la muestra reacciona enzimàticamente, formándose un complejo

coloreado que se cuantifica espectrofotométricamente a 505 nm. ,ao

Glucosa + O2 ----------- ► Acido glucónico + H2O2

H2O2 + 4 aminofenona ------- ► Quinonaimina + H2O

Las concentraciones fueron estimadas por el método de los mínimos cuadrados a partir de

los valores de absorbancia de 5 patrones de concentración conocida con la finalidad de

establecer la curva de mejor ajuste para interpolar. Los valores se expresaron en mmol/L.

2- CRF (Producto de Amadori): La Fructolisina (proteina del suero glicosilada) es precursora

de los PTGA. Su contenido relativo se determina por la reducción que estos originan sobre el

indicador nitrobluetetrazolium (NBT) dando lugar a un compuesto

coloreado formazano. La cantidad de Fructolisina se monitorea por los cambios de absorbancia

a 530 nm en los siguientes 10 minutos. 156 El CRF se calculó del siguiente modo: CRF= D02 - DO1

Donde:

DO2 = Densidad óptica de la lectura 2 a los 10 min DOi = Densidad óptica de la lectura 1 al

inicio

Los valores de Fructolisina fueron corregidos con el contenido de albúmina y se expresaron

en unidades de ADO. min1. 157

Fructosamina = (Fructosamina/Albúmina) x Albúmina promedio

3- PRATB: Los PRATB se forman por la ruptura de ácidos grasos polinsaturados y constituye

un índice adecuado para determinar la magnitud de las reacciones de peroxidación lipídica

(POL). Esta determinación se basa en la reacción que ocurre entre los lipoperóxidos presentes en

la muestra y el ácido tiobarbitúrico, utilizado en la solución reactivo, como sustrato en dicha

reacción. Los PRATB se liberan de la misma y rinden un compuesto coloreado que absorbe a

535 nm. La solución reactivo contenía 15 g de Ácido Tricloroacético (TCA), 375 mg de Ácido

tiobarbitúrico (ATB) en 100 mL de HCl 0,25 N. 158 160

Los cálculos se llevaron a cabo según la siguiente fórmula:

C = DO/1,56 x 10 4 nmol/L

Donde:

C= Concentración de PRATB DO= Densidad óptica

1,56 x 10 4 = Coeficiente de extinción

4- SPOX: Esta técnica se basa en inducir los procesos de peroxidación lipídica en el suero del

paciente incubado por 24h a 37°C por catálisis con Cu 2*(2 mM) para conocer el balance entre

factores prooxidantes y antioxidantes sobre la base de la formación de PRATB antes y después

de la inducción de dicho proceso. Los valores obtenidos se expresaron en nmol/L.

154

Para los cálculos se restó para cada muestra el valor de la determinación de PRATB


47

correspondiente a las 24 h con la determinada a las O h.

5• Capacidad antioxidante: Para llevar a cabo este ensayo se utilizó el homogenado de

cerebro de rata que es rico en fosfolípidos, estos sufren procesos peroxidativos (catalizados

o no por metales) que se pueden medir por el incremento de los niveles de PRATB durante el

proceso. Al colocar la muestra biológica, podemos conocer si esta inhibe o no los procesos

peroxidativos de los fosfolípidos y determinar así su capacidad antioxidante.


48

Preparación del homogenado: Se tomaron 10 ratas machos Sprague Dawley con un peso de

250-300 g, adultas, con su correspondiente certificado de calidad, suministradas por

CENPALAB.

Los animales se dejaron en ayunas 24 h antes del sacrificio, llevando a cabo éste por

dislocación cervical. El cerebro fue extraído mediante cirugía y se lavó con solución

amortiguadora fosfato salina (PBS) pH=7 helado.

Por cada 3,2 g de cerebro se añadieron 12,8 mL de PBS pH=7 helado y se homogenizó 10

min a 1000 r.min1 posteriormente se centrifugó a 4 °C durante 15 min a 5000 r.min', se congeló

a - 20 °C hasta el momento de la determinación. Por cada 2,5 mL de homogenato se añadieron

7,5 mL de PBS pH=7 a temperatura ambiente utilizándose esta solución en los ensayos.

a- Autoxidación espontánea: La peroxidación transcurre con la intervención de las enzimas y

el hierro del medio. El medio de reacción contenía 1 mL del homogenado de cerebro y 10 piL de

la muestra o de PBS en el caso del control.

b- Autoxidación catalizada por hierro exógeno: Al medio se le adiciona 50 piL de FeCL3

C=100 mM, 50 piL de ácido ascòrbico C=100 mM (indicador de la reacción) y 10 ¡iL de la

muestra o de PBS como control. En ambos casos se incubó durante 60 min y luego se tomaron

400¡iL para determinar los PRATB.

Los resultados se reflejaron como % de actividad antioxidante (AA) y se calcularon según la

fórmula siguiente:

6- SOD: La determinación de la actividad de la SOD se realizó por el método de inhibición del

pirogállol en medio básico, I6J| 162 generándose en dicho medio Oz', de esta forma la reacción

radicalaria se propaga acelerando la autoxidación del pirogállol cuya forma oxidada absorbe la

luz a 420 nm. La presencia de un secuestrador de radicales superóxido en el medio, como la

SOD, inhibe la autoxidación al evitar las reacciones de propagación. Por convenio se tomó 1U de

SOD como la cantidad de enzima que inhibió en un 50% la reacción de autoxidación del

pirogállol a 25°C y pH= 8,2

La actividad de la SOD se calculó según la siguiente fórmula.

U/L/min = | [(ADOm/ADOb) 100J - 100 \

Donde:

U/L/min = Actividad de SOD

ADOm: Diferencia de densidad óptica de la muestra A4 = 100 x 1-

ADOb: Diferencia de densidad óptica del blanco

7- CAT: La presente técnica se fundamenta en el seguimiento de la variación de densidad

óptica a 240 nm que tiene lugar durante la descomposición del H2O2 por la CAT.161

La actividad de la CAT se calcula a través de la siguiente ecuación:

AE= (VT/ 0,1 mL xl cmx A DO) x 1000 AE= ADOx 30x1000

Donde:

AE (U/L/min) = Actividad de CAT VT- Volumen total 3 mi 0,lml = Cantidad de muestra lcm=



49

Ancho de la cubeta ADO= Variación de la densidad óptica

8- HT: La captura de HT se midió mediante la determinación cuantitativa colorimétrica de esta

ERO utilizando el ensayo basado en la oxidación del hierro ferroso a hierro férrico por H2O2 en

condiciones ácidas:

Fe 2++ H2O2 ----- ► Fe 3+* OH + OH

El enlace del hierro férrico con el indicador naranja xilenol (3,3- bis [ N, N-di(carboxy metil) -

aminometil ]-o-cresolsulfonphthálein,sál sódica) forma un complejo coloreado estable que puede

medirse a 560 nm. 163- 164

Fe 3++ XO ---- ► Fe2** XO

Se prepararon para el ensayo 500 ¡xL de la solución reactivo la misma contenía: 250/.iL de

Ri[( NH4) 2Fe SO4 x 6 H2O C=25 mM y H2SO4 C=2,5 M] y 25 mi de R2 (Sorbitol C=100 mM y

naranja xilenol C=125 mM en agua). Todas las muestras fueron incubadas a 37°C y se midió la

concentración de HT a las 24 h después de la reacción.

La concentración de HT se determinó aplicando la siguiente fórmula:

[ ] HT ]iM= DO x 100 pM/0,138

[ ]HTpM = DO x 724,6

Donde:

[ ] HT = Concentración de HT DO = Densidad óptica

0,138 = Densidad óptica del patrón de concentración conocida 100 yM = Concentración del

patrón

9- PLA2: La PLA2 actúa sobre los fosfolípidos y provoca la liberación de lisofosfolípidos y ácidos

grasos. Estos últimos producen una acidificación del medio que origina disminución en la

absorbancia de la solución sustrato a 578 nm 1« Se empleó como sustrato lecüina de yema de

huevo (Merck. Alemania).

Se determina, la hidrólisis espontánea del sustrato leyendo la absorbancia de dicha solución

a tiempos de 30s y 90s, luego se calcula el factor de proporcionalidad (E) añadiendo 30 UL de

HCL (0,1N) a 1,5 mi de solución sustrato leyendo la absorbancia a los 30s y luego se resta este

valor de absorbancia al obtenido para el sustrato antes de adicionar HCL, finalmente se

determinò la actividad enzimàtica de la muestra añadiendo 0,1 mi del suero sanguineo a 1,4 mi

de solución sustrato, leyendo la absorbancia a los 30s y 90s

La actividad enzimàtica se calculó como sigue:

A E= ( ( VT/ Ex lem x 0.1 mi) ADO) 1000

A E= 68181 xADO

Donde:

AE= Actividad enzimàtica

VT= Volumen total (1.5 mi)

E= factor de proporcionalidad (0.22)

1 cm = Grosor de la cubeta

0,1 mi = Volumen de la muestra (0,05 mi)

ADO= Diferencia de densidad óptica

ADO = Amuestra - Ad

50

Donde:

Amuestra = Ab 30s muestra-Ab 90s muestra

Ad = Ab 30s (sustrato) - Ab 90s (sustrato)

Donde:

Amuestra = Diferencia de densidad óptica de la muestra

Ad = Diferencia de densidad óptica del sustrato (Hidrólisis espontánea)

Cálculo del factor de proporcionalidad:

E=Ab 30s (sustrato) - Ab 30s (sustrato)

0,15< E < 0.3 Si esto se cumple, el valor de E que se debe utilizar para el cálculo de la actividad

enzimàtica es de 0,22

10- Albúmina: La medición de albúmina en suero se basa en su unión cuantitativa con el

indicador 3,3', 5,5' tetrabromo m cresol sulfontaleina (verde de bromocresol BGG). El complejo

albúmina verde de bromocresol presenta una absorción máxima a 578 nm.1 La concentración

de albúmina se calcula del siguiente modo:

Concentración de albúmina = A muestra/ A patrón x Concentración del patrón

Donde:

A muestra = Absorbancia muestra A patrón = Absorbancia patrón

11 SH: La muestra se precipitó con ácido Tricloroacético al 10% p/v más EDTA iaj y el

sobrenadante se hizo reaccionar con el reactivo de Ellman’s (ácido 5,5' Ditiobis (2 nitrobenzoico)

para rendir un compuesto coloreado que absorbe a 412 nm. >67- 168 Estos grupos fueron

cuantificados utilizando la curva patrón de GSH (glutatión) mediante interpolación de la densidad

óptica obtenida para cada muestra. Se utilizaron patrones de GSH de concentraciones conocidas

(100-150 mg/L). Los resultados se expresaron como mg/L de GSH.

2.5 Evaluación de la relación beneficio-riesgo

El cálculo de la relación beneficio-riesgo de cada tratamiento, se llevó a cabo según el criterio de

diversos autores; I69'170 utilizando un modelo matemático que permitió cuantificar esta relación, la

cual fue modificada de acuerdo a nuestras condiciones experimentales.

Relación beneficio-riesgo:


51

Descripción de las variables asociadas al beneficio:

Bi - Duración del tratamiento, con evolución satisfactoria con evolución no satisfactoria - O

10- 20 días = 20

21-30 días = 10 más de

30 días = 5

Se partió del hecho que un tratamiento con evolución satisfactoria, en un periodo de 10 a 20

días constituye un criterio de beneficio significativo, en este tipo de paciente, con

dificultad en la cicatrización

B'2 - Sensibilidad del germen aislado a la terapia.

O- 10% = o 11 -

30% = 5

31-60% =10 más de 61 % = 20

Se estableció que más de un 61% de sensibilidad al germen aislado constituye un criterio de

probada eficacia pues el paciente responde con la cura de su lesión.147 B3 - Evolución clínica.

Curado = 20

Mejorado =10 Igual

= 5

Empeorado o fallecido = O

Se partió de las categorías establecidas para determinar la evolución final de la lesión, emitida por

el especialista y que fueron descritas anteriormente.

B4 - Capacidad antioxidante

más de un 66% = 20 26%-65% =

10 11%-25% = 5 0-10% = O

Se tuvo en cuenta para establecer la puntuación, los reportes de la literatura 154 acerca de la

actividad antioxidante medida en pacientes sanos (n=25) y pacientes diabéticos (n=38) que alcanza

valores de 66,2± 10,2% en los primeros y 66,7± 10,8% en los segundos. Por lo que todo paciente con

más de un 66% de capacidad antioxidante se le asigna el mayor puntaje establecido para dicha

variable.

Descripción de variables asociadas al riesgo:

Ri - Resistencia del germen aislado a la terapia, más de

61 % = 20 31% -60%= 10 11% - 30 %

= 5 0%-10%= O

Se consideró que más de un 61% de resistencia del germen aislado a la terapia no permite la cura

de la lesión por lo que se le asigna la máxima puntuación. 147 R2 - Susceptibilidad a la peroxidación

lipídica. más de 7401 = 20 4931- 7400 = 10 2471 - 4931 = 5

0 - 2470 = O


52

Se tomó como criterio de máxima puntuación una susceptibilidad a la peroxidación lipidica mayor

de 7401 nmol/L teniendo en cuenta que la literatura reporta 154 valores por debajo de 2460 nmol/L ±

622 en pacientes sanos (n=25).

R3 - Velocidad de disminución del área.

No disminución = 20 0.01 -

0.15= 10 0.16-0.30= 5

más de 0.31 = O

Se sustenta en los resultados obtenidos en nuestra población partiendo del tamaño de la lesión,

antes de recibir el tratamiento y una vez concluido el mismo.

Ri - Velocidad de disminución del perímetro de la lesión.

No disminución = 20 0,01 -

0,15= 10 0,16-0,30= 5

más de 0,31 = O

El resultado final se cuantificó a través de la relación beneficio-riesgo, la cual se calculó en cada

uno de los tratamientos aplicados al paciente, teniendo en cuenta que:

❖ Si B/R < 1, el tratamiento produce mayor riesgo que beneficio.

❖ Si B/R = 1, el tratamiento tiene igual probabilidad de producir un beneficio o un riesgo.

❖ Si B/R > 1, el tratamiento produce mayor beneficio que riesgo.

Para conocer la eficacia de las terapias ensayadas, se empleó el resultado de la relación beneficio-

riesgo en los tres tratamientos aplicados en la muestra sometida a estudio. Para ello se estableció el

número relativo a través del cálculo de las razones matemáticas correspondientes y la resultante de

ellas se compararon entre sí.171

Nr= TB/TR

Donde:

NR = Número relativo

TB = Total de tratamientos beneficiosos

TR = Total de tratamientos riesgosos

La probabilidad de que un paciente estuviera sometido a una terapia riesgosa o beneficiosa con los

tratamientos aplicados 171 se calculó a través de la relación:

Cantidad de pacientes que no curaron

Pr - ------------------------------------------------

Cantidad total de pacientes evaluados Cantidad de pacientes que curaron

Pb = ----------------------------------------------------------------------------------------

Cantidad total de pacientes evaluados

Pr = Probabilidad de producir un riesgo.

Pb = Probabilidad de producir un beneficio.


53

2.6 Evaluación de la relación costo eficacia

Para el análisis de la relación costo eficacia, se partió de un tipo de evaluación económica muy

similar: el análisis costo efectividad, cuya única diferencia con la seleccionada para la presente

investigación, es el nivel de efectos que tiene en consideración, que refleja condiciones reales para la

intervención médica.172’ 173

En este estudio, la unidad de beneficios en términos de salud que se desea obtener es la eficacia,

que es una medida del efecto o resultado de una tecnología o procedimiento médico concreto

utilizando condiciones ideales. En la presente investigación se parte de un ensayo clínico en fase III,

cuyo objetivo es evaluar la eficacia y seguridad del propóleos en el pie diabético por comparación con

las alternativas disponibles, por esta razón la evaluación se desarrolla de modo controlado, ya que se

utiliza la aleatorización, la técnica a doble ciego, se establecen criterios de inclusión y exclusión, dosis

bien definidas y duración fija del tratamiento; aspectos estos que no se tienen en cuenta cuando la

unidad de beneficio es la efectividad. 174

El costo de las formulaciones objeto de estudio, al 10% y al 15% cuando son elaboradas en el

dispensario de los servicios farmacéuticos de los hospitales seleccionados, para llevar a cabo la

presente investigación, se calculó en moneda nacional y se obtuvo utilizando las ecuaciones

matemáticas tomadas de la literatura revisada. ' 7S~'78 El costo total fue calculado según la siguiente

expresión:

Ct = Mp + Im + E + St + D Donde:

Ct— Costo total

Mp= Costo de materiales

Im= Costo de insumos de materiales de limpieza E=

Energía St— Salario D= Depreciación


Al costo total de las formulaciones objeto de estudio obtenido, se le adicionó un 5% de merma, la cual

fue calculada del siguiente modo: $2.00 ------ 100%

x-------------------- 5% x = $0.1

El modo en que fueron calculadas cada una de las variables de la ecuación se describe a

continuación:

> Mp = Costo de materiales Mp =

Ii + h + .................... In

I = C x P

I = Importe C =

Cantidad P =

Precio

El importe de cada uno de los materiales empleados en la elaboración de las formulaciones objeto

de evaluación se relacionan en las Tablas no.2 y no.3. Para calcular el costo de insumos de

materiales de limpieza se utilizaron los datos expresados en la Tabla no. 4 y se procedió según las

siguientes ecuaciones:

> Im = Costo de insumos de materiales de limpieza Im =X,

+ X2 + .... Xn

X = Pz/Cd

X = Insumos de materiales de limpieza

Pz = Precio cuando el insumo de materiales es utilizado en un día Cd =

Cantidad de departamentos de la farmacia

El cálculo del costo del alcohol, al no consumirse un litro diano, sino sólo 10 mi para la limpieza

de los utensilios empleados en la elaboración de las cremas, se efectuó de la siguiente forma:

1000 mi ------ $12,248

10 mi ------ y

Y = Precio de 10 mi

Y =0,12248

En cuanto a la vida útil estimada se hizo corresponder la misma con su precio para establecer a

cuánto equivale este valor cuando el insumo de materiales es utilizado en un día por ejemplo:

30 días ------- $0,50

54


Tabla, no. 2 Costo de materiales para 100 g de crema de propóleos al 10% Descripción U.M. Cantidad Precio ($) Importe ($)

Propóleos Kg 0,01 0,0625 0,000625

Monoestearato de glicerilo Kg 0,003 1,64 0,00492

Tnetanolamina L 0,00336 0,34 0,0011424

Propilenglicol L 0,00515 1,16 0,005974

Ácido Esteárico Kg 0,012 1,42 0,01704

Propil Parabeno Kg 0,00002 3,628 0,00007256

Metil Parabeno Kg 0,00018 3,06 0,00018

Costo total ( Mp) 0,0303839 * 0,03

Tabla no. 3 Costo de materiales para 100 g de crema de propóleos al 15% Descripción U.M. Cantidad Precio ($) Importe ($)

Propóleos Kg 0,015 0,09375 0,001406

Monoestearato de glicerilo Kg 0,003 1,64 0,00492

Tnetanolamina L 0,00336 0,34 0,0011424

Propilenglicol L 0,00515 1,16 0,005974

Ácido Esteárico Kg 0,012 1,42 0,01704

Propil Parabeno Kg 0,00002 3,628 0,00007256

Metil Parabeno Kg 0,0002 3,06 0,00018

Costo total ( Mp) 0,0311669 *0,03

Tabla no.4 Costo de insumos de materiales de limpieza Descripción U.M. Cantidad

Vida útil

Estimada

Precio ($) Pz($) (X) Insumo ($)

Escoba U 1 1 mes 0,50 0,01667 0,00277

Trapeador u 1 6 meses 1,00 0,00556 0,000926

Frazada u l: 1 mes 0,80 0,02667 0,00444

Alcohol mi 10 24 horas 0,12248 0,005103 0,005103

Total (Im) 0,013239

56

Teniendo en cuentas que las farmacias tienen de modo general seis departamentos se utiliza la fórmula X = Pz/Cd y se obtiene el insumo descrito en la tabla anterior.

Para el caso del alcohol, como 10 mi se consumen en una hora, se procede de la siguiente manera:

Y como los 10 ml se emplean en un sólo departamento de la Farmacia, que es donde se elabora

la crema, el valor del importe se obtiene dividiendo Pz entre 1.

En la tabla no. 5 se reflejan los parámetros empleados para calcular el costo estimado de energía

utilizando las siguientes ecuaciones:

> E = Energía

E = Tku>/día x Vk.iv Tkw/día = Ckw/h x h Tkw/ día = Total de kw/ día Vkw = Valor de kw en

pesos Ckw/h = Consumo de energía kw/h h = Cantidad de horas

El cálculo de los costos de salario se llevó a cabo según se muestra a continuación:

> St = Salario St = Sb + Se

St = Salario total Sb = Salario básico Se = Salario complementario Sb = Salario en 1 h = Salario

diario/ 8horas Se = Sb x 0,0909 Seguridad Social: 14 % de St Sb = $ 7,125/8 horas = $

0,89/horas Se = $ 0,89/horas x 9,09 % = $ 0,08 St = (Sb + Sc)x 14 %

St = ($ 0,89 + $ 0,08) x 14 % = 0,14

En el caso del cálculo de la depreciación los parámetros que se tuvieron en cuenta aparecen

reflejados en la Tabla no. 6 y las ecuaciones empleadas fueron las siguientes, y D = Depreciación D =

DI + D2 + D3


Tabla no. 6 Depreciación

Tabla no. 5 Costo estimado de energía Descripción Cant

Valor de 1

kw/h ($)

Consumo

kw/h

Cantidad

de horas

Total

Kw/día

Costo de

energía

E ($ )

Ventilador 1 0,09 0,042 24 1,008 0,09072

Lámpara 40 w 1 0,09 0,020 24 0,48 0,0432

Balanza digital 1 0,09 0,052 0,0035 0,00018 0,00002

Termostato 1 0,09 0,032 24 0,768 0,06912

Mezcladora 1 0,09 0,047 0,014 0,000658 0,00006

Total 0,20312

Medios básicos U.M. Cantidad Precio Tasa (T)

%

D

Balanza digital U 1 2300,75 20 1,28

Termostato U 1 532,35 10 0,15

Mezcladora U 1 723,55 9 0,18

Total 1,61

58

D = Depreciación

P = Precio T =

Tasa

Una vez obtenido el costo total de las cremas de propóleos objeto de estudio, se calculó el

costo total del tratamiento para un paciente ingresado en el Servicio de Angiología, de cada uno

de los hospitales investigados, a través de la siguiente expresión matemática:

Costo total del tratamiento = Cm x Tt

Donde:

Cm = Costo medio diario del tratamiento hospitalizado Tt

= Tiempo medio de tratamiento hospitalizado

Para calcular el costo medio diario del tratamiento se partió del valor de éste en un paciente

hospitalizado en el servicio de Angiología por día, sin recibir medicación (atención médica y

estadía hospitalaria) durante el período de la investigación (Diciembre 1996 a Mayo 2000), el

cual se obtuvo a partir de los datos suministrados por el Departamento de Contabilidad de los

hospitales seleccionados para este ensayo, a dicho dato se le adicionó el costo de la

formulación propuesta de acuerdo a la siguiente ecuación:

Cm = Cp + Ct

Cp = Costo del paciente hospitalizado sin recibir medicación

Ct = Costo total de la formulación evaluada

En relación con el costo total del tratamiento para la terapia habitual se procedió de modo

similar, pero el dato de costo medio del tratamiento hospitalizado utilizado fue el suministrado

por el Departamento de Contabilidad de cada hospital, que incluye costo de atención médica,

estadía hospitalaria y medicamentos utilizados.

El cálculo del tiempo medio de tratamiento del paciente hospitalizado que recibió la

formulación objeto de evaluación, así como la terapia habitual fue calculado a partir de los 120

pacientes ensayados, seleccionando todos aquellos con criterio de curado, teniendo en cuenta

que si a los 30 días de recibir medicación egresaba del centro hospitalario con criterio de

mejorado, se seguía el mismo hasta su curación en servicio ambulatorio con ingreso domiciliario

con la finalidad de no introducir sesgos en la investigación. Por lo tanto se tomó como unidad de

eficacia a medir todo caso curado partiendo de los porcentajes de eficacia obtenidos como caso

curado en cada alternativa de tratamiento. % de eficacia terapia al 10% = 72.5%, % de eficacia

terapia al 15% = 67.5%, % de eficacia terapia habitual = 20%.


59

Finalmente el costo total del tratamiento calculado se relacionó con la eficacia alcanzada en el estudio clínico realizado,

a través de la siguiente expresión:

Costo total del tratamiento

RCE = ------------------------------------

Eficacia del tratamiento

Donde:

RCE = Relación costo eficacia

El valor obtenido se comparó con el de la terapia que habitualmente es utilizada para el tratamiento de la afección objeto

de estudio, determinando cuál es la mejor relación costo eficacia para valorar las ventajas económicas de la nueva

formulación, m iso

2.7 Procesamiento estadístico de los resultados

El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo del modo siguiente:

❖ Revisión de los datos para detectar puntos aberrantes /butliers^

❖ Análisis descriptivo para calcular la media y la desviación estándar para cada grupo experimental

❖ Ensayo de homogeneidad de varianza de Levene

❖ Ensayo de comparación múltiple de medias de Students Newman Keuls, para procesar los indicadores del control

de calidad a la materia prima y al extracto blando de propóleos.

❖ Prueba hipótesis para media por T students para procesar estadísticamente la variable peso, en los ensayos

toxicológicos.

•> Análisis de regresión correlación lineal utilizando el GRAPHAD INPLOT versión 3,01 para caracterizar la velocidad de

cicatrización de la lesión de los pacientes.

pendientes, área, perímetro, período de tratamiento y mediadores del estado redox obtenidos en cada grupo

experimental.

❖ Test de Chi cuadrado para caracterizar la población seleccionada, analizar los porcentajes de curación en cada

terapia aplicada, así como, el comportamiento de la evolución clínica en cada servicio sometido a ensayo,

estableciendo un nivel de significación para p<0,05. CCAPITULO 3 RESULTADOS

3.1Materia prima Propóleos. Control de calidad

Las investigaciones cubanas relativas a la composición química del propóleos confirman la variabilidad y

heterogeneidad de este producto apícola. 20- «-m £n nuestro país la recolección de este tipo de sustancia en una

determinada región, se lleva a cabo uniendo los propóleos de todas las colmenas, sin tener en cuenta un área específica, lo

cual puede incrementar la heterogeneidad y diversidad del mismo-, de ahí la necesidad de llevar a cabo el control de

calidad de esta materia prima y su estandarización, para su uso en el sistema medicamentoso diseñado para las

evaluaciones biológicas.

Los resultados obtenidos en la evaluación de los diferentes lotes de propóleos estudiados (001-009) mostró lo siguiente:

Especificaciones organolépticas: Masa sólida en pedazos sueltos sin comprimir, no homogéneas, con impurezas

mecánicas y ceras, algo terrosa.

Color: Pardo

Olor: Característico a resinas y bálsamos Especificaciones físico-químicas:

Consistencia: De 20°C a 4CPC pegajosa

Menos de 20°C pegajosa, dura.

En la tabla no. 7 se muestran los resultados de las determinaciones de los restantes indicadores de calidad de cada lote

Capítulo 2 . Material y Métodos

57

de propóleos materia prima estudiado y los intervalos de confianza para cada uno de ellos.

3.2 Estandarización de los indicadores de calidad del extracto blando de propóleos

La complejidad en la composición c¡uímica del propóleos, obliga al tecnòlogo que diseña una forma terminada con este

producto apícola, a caracterizar y controlar la calidad de dicho principio activo, es por ello que una vez comprobado, que los

lotes de propóleos cumplían con las exigencias especificadas en la norma, se elaboraron los lotes correspondientes de

extracto blando, para su incorporación al sistema medicamentoso diseñado para llevar a cabo la evaluación biológica y se

realizó la estandarización de sus parámetros de calidad, cuyos resultados aparecen referidos a continuación.

■ Especificaciones organolépticas:

Aspecto: Líquido muy viscoso de color ámbar oscuro y con brillo

Leyenda: Los valores se representan como la media ± desviación estándar. Letras diferentes

indican significación estadística para p<0,05 entre lotes dentro de la misma columna. (Ensayo

de comparación múltiple de medias de Students Newman Keuls)

INT: Intervalo de confianza. (Cálculo según programa Statistica versión 6.0)

Color: Ámbar oscuro Olor: Característico

■ Especificaciones microbiológicas: Presencia de un halo de inhibición trasparente

frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 Se observó que el tamaño del halo de

inhibición de crecimiento fue de 23 mm2 para el extracto blando y de 20 mm2 para la

Gentamicina

Respecto a los controles de solvente no se obtuvieron halos de inhibición de crecimiento

alrededor de los pocilios. No obstante, debe tenerse en cuenta la posibilidad real de

evaporación de los mismos lo que no ocurrió con la Gentamicina, cuya solución de trabajo se

Lotes Impurezas

mecánicas (%)

Contenido de

ceras (%)

Compuestos

flavonoides

Número yódico (%) índice de

oxidación (seg)

001 7,34 ± 0,15 a 21,27 ±0,06° No responde 43,57± 0,04 a 8,11 ± 0,07a

002 3,41 ± 0,01 b 20,95 ± 0,05a No responde 49,09 ± 0,03 b 6,32 ± 0,08 b

003 5,49 ± 0,07 « 25,62 ± 0,24 b No responde 47,36 ±0,46? 7,93 ±0,la

004 3,74 ± 0,36 b 20,84 ± 0,22 a No responde 49,93 ± 0,73 d 6,73 ± 0,33 b

005 8,37 ± 0,24 d 24,32 ± 0,06' No responde 40,93 ±0,04* 11,57 ±0,08?

006 4,49 ± 0,04 e 20,52 ± 0,05 a No responde 49,36 ± 0,04 d 6,43 ± 0,1 b

007 6,92 ± 0,02 í 22,01 ± 0,56 d No responde 41,78 ± 0,09 f 9,61 ±0,ld

008 3,64 ± 0,44 b 20,54 ± 0,06 a No responde 49,53 ± 0,03d 6,46 ± 0,08b

009 10,42 ±0,18 9 25,72 ± 0,06b No responde 38,86+ 0,13 9 20 ± 0,18 e

Norma < 30% < 45% Positivo >35% < 30seg

INT 3,2-8,7 20,4-24,9 No responde 40,8 - 50,4 4,3 - 14,2

Capítulo 3. Resultados

60

61

preparó en agua destilada.

En la tabla no. 8 se representan los resultados de la evaluación de los restantes

indicadores de calidad a los diferentes lotes de extracto blando de propóleos y los intervalos de

confianza para cada uno de ellos.

Una vez estandarizado el extracto blando se procedió a elaborar el sistema medicamentoso

óptimo, a partir de los lotes recolectados en los meses de Marzo y Abril (002, 004, 008)

teniendo en cuenta los resultados de los estudios de preformulación, tomándose testigos para

llevar a cabo las evaluaciones tecnológicas requeridas que son detalladas en el Anexo no.3

3.3 Actividad antimicrobiana in vitro:

En las tablas no. 9, 10 y 11 se muestran los resultados de la evaluación de la actividad

antimicrobiana del extracto blando y la crema de propóleos a diferentes concentraciones.

Como puede observarse el extracto blando de propóleos mostró actividad frente al

Staphylococcus aureus y al Staphylococcus epidermidis y no frente a los gram (-). Para

ambos microorganismos la CMI coincidió con la CMB (0,2 y 0,6 mg/ml, respectivamente).

De modo similar las cremas no fueron activas frente a los gram (-), ni tampoco al

Staphylococcus epidermidis, siendo sólo efectivas contra Staphylococcus aureus. La

CMI y la CMB también coincidieron siendo de 3 mg/ mL para la crema al 10% y de 0,5

mg/mL para la crema al 15%.

Nótese que para concentraciones de 0,2 mg/L de extracto blando, aún hay actividad

microbiológica, la cual debió manifestarse en las concentraciones correspondientes (0,02 mg/L

crema al 10% y 0,03 mg/L crema al 15%), sin embargo, esta se comienza a manifestar a

concentraciones 156 y 16 veces superiores en el sistema medicamentoso.


Tabla no. 8 Resultados de los indicadores de calidad evaluados a los diferentes lotes de extracto blano de propóleos de la región de Manzanillo.

8 Resultados de los indicadores de calidad evaluados a los diferentes

Leyenda: Los valores se representan como la media ± la desviación estándar. Letras diferentes indican

significación estadística para p<0,05 entre lotes dentro de la misma columna. (Ensayo de comparación

múltiple de medias de Students Newman Keuls)

INT: Intervalo de confianza. (Cálculo según programa Statistica versión 6.0)

Lotes Sólidos totales

(%)

Impurezas

mecánicas

(%)

pH índice de

oxidación (seg)

Fenoles totales (%)

001 76,17 ± Ia 0,9± 0,18a 4,19 ±0,1 Ia 4,82 + 0,65a 8,16 ± 0,29a

002 81,31+ 0,21 b 0,8± 0,36a 4,15± 0,22 a 4,11 ± 0,52a 10,81 ± 0,63b

003 76,22± 0,37a 0,9± 0,04 a 4,21± 0,37a 4,41 ± 0,16a 8,21 ± 0,33 a

004 80,56± 0,59b 0,85±0,31a 4,17± 0,28 a 4,19 ± 0,08a 10,16 ±0,1'

005 75,26± 0,27a 0,8± 0,25a 4,19+ 0,14a 8,29 ± 0,07b 7,75 ± 0,52 d

006 76,62± 0,72 a 0,9± 0,01a • 4,13± 0,02 a 4,05 ± 0,27a 8,62 ± 0,43a

007 76,85± 0,14 a 0,9± 0,11a . 4,3± 0,36 a 8,41 ± 0,87b 7,38 ±0,lld

008 80,33± 0,66 b 0,9± 0,01a .4,14 ± 0,03a 4,14 ± 0,23a 10,74 ± 0,51 b

009 78,02± 0,09 c 0, 7± 0,03 a 4,5± 0,08a 16,12 ±0,87* 6,01 + 0,44«

Norma

70-85% 1% - - >4 %

INT 75,4 - 86,4 0,77-0,93 4,08-4,35 2-10,99 6,8-10,5

Tabla no. 9 Actividad antimicrobiana del extracto blando de propóleos

Microorganismos Concentración mg/ml

20 10 5 2,5 2 1,25 0,6 0,2 0,02

S. aureus - - - - - - - - +

S. epidermidis - - - - - - - + +

P. aeruginosa + + + + + + + + +

E. coli _L + + + + + + + +

K. pneumoniae + + + + + + + + +

P. vulgaris + + + + + + + +

E. aerogenes + + + + + + + + +

Tabla no. 10 Actividad antimicrobiana de la crema de propóleos al 10% Microorganismos Concentración mg/mL

50 25 12,5 6,25 5 3,12 1,6 0,5 0,05

S. aureus - - - - - - + + +

S. epidermidis + + + + + + + + +

P. aeruginosa + + + + + + + + +

E. coli + + + + + + + + +

K. pneumoniae + + + + + + + + +

P. vulgaris + + + + + + + + +

E. aerogenes + + + + + + + + +

62

Leyenda: + Crecimiento

Tabla no. 11 Actividad antimicrobiana de la crema de propóleos al 15% Microorganismos Concentración mg/ml

50 25 12.5 6.25 5 3.12 1.6 0.5 0.05

S. aureus - - - - - - - - +

S. epidermidis + + + + + + + + +

P. aeruginosa + + + + + + + + +

E. coli + + + + + + + + +

K. pneumoniae + + + + + + + + +

P. vulgaris + + + + + + + + +

E. aerogenes + + + + + + + + +

- Ausencia de crecimiento

63


64


Al evaluar la actividad antimicrobiana de la crema de propóleos a ambas concentraciones

frente al Staphylococcus aureus se observó que en los diferentes tiempos (O, 30, 90, 180,

360 días) se mantenía la misma, lo cual demostró que el semisólido evaluado conserva su

efecto antibiótico al año de elaborado.

3.4 Evaluación toxicológica

Atendiendo a las propiedades antimicrobianas de las cremas de propóleos al 10% y al 15%

respectivamente y considerando que la vía de administración en el humano sería la tópica,

resultaba indispensable caracterizar estas cremas en el orden toxicológico, a partir de las

exigencias establecidas por la Oficina del Registro Sanitario

3.4.1 Evaluación de la Toxicidad Aguda Oral y Dérmica en roedores y no roedores

Durante los 14 días que duró la prueba, no se encontraron afectaciones clínicas en ninguno

de los animales atribuibles al producto, dado a que los signos clínicos observados el primer día

de la prueba se presentaron tanto en el grupo tratado como en el control, para ambas especies.

En las tablas 12, 13, 14 y 15 se muestra el comportamiento del peso corporal en los días O, 7 y

14 de ambas experiencias para las especies roedoras y no roedoras.

Como puede observarse se produce aumento de peso significativo para p<0,05 en los

animales de todos los grupos experimentales tanto hembras como machos en los tiempos / y 14

en relación con el inicio del experimento.

Sin embargo, en la especie no roedora (Tabla no. 13) el incremento del peso para el grupo

tratado fue significativo para p<0,05 en los tiempos 7 y 14 con respecto al inicio del estudio; no

así para el grupo control en el que este aumento no mostró significación estadística.

Relacionado con el ensayo de toxicidad aguda dérmica, en la tabla no. 14 se destaca la

elevación significativa para p<0,05 del peso de los machos tratados en los tiempos 7 y 14 con

respecto al inicio del experimento, mientras que el grupo control y las hembras tratadas

aumentaron de peso pero dicho aumento solo fue significativo al compararse el día 14 con el

inicio de la experiencia.

En la tabla no. 15 se destaca como aumenta el peso de la especie no roedora en el ensayo

de la toxicidad aguda dérmica. Nótese que este comportamiento no resulta significativo desde el

punto de vista estadístico para p<0,05

Tabla no. 12: Peso corporal(g) en el tiempo de la especie roedora en el

toxicidad aguda oral.

Leyenda: Los valores se representan como la media ± la desviación estándar Letras

diferentes indican diferencias significativas para p<0.05 del peso del animal en el tiempo (O,

7,14 días) para “ControV’y “Tratados”. (Prueba hipótesis para media por T students)

Tabla no. 13: Peso corporal (g) en el tiempo para la especie no roedora en el ensayo de

toxicidad aguda oral


diferentes indican diferencias significativas para p<0.05 del peso del animal en el tiempo (O,

7, 14 días) para “ControV’y “Tratados”. (Prueba hipótesis para media por T students)

GRUPO TIEMPO (días)

0 7 14

1- Control (n=20)

Hembras (n=l 0)

Machos (n=l 0)

185 ± 3,2 a

189,8 ± 3,9 a

202,1 ± 9,8 b

225,8 ± 8,8 b

215,2 ± 8,6 h

236,5 ±8b

11- Tratados

(n=20) Hembras

(n=l 0) Machos (n-

10)

182.2 ± 3,7 a

186.2 ± 4,6 a

222,7 ± 7,8 b

196,1 ±8b

233,7 ± 4,7 b

226,1 ± 10,9 b


0 7 14

I- Control (n=3) 260 ± 0,2 a 303 ± 0,4 a 330 ± 0,3 a

II- Tratados (n-3) 257 ±0,1 a 287 ±0,1 b 313 ± 0,2 c

65

Tabla no. 12: Peso corporal (g) en el tiempo de la especie roedora en el ensayo de toxicidad aguda oral.

Tabla no. 4: Peso corporal (g) en el tiempo de la especie roedora en el ensayo de toxicidad aguda dérmica

icde Grupoicidad aguda dérm a.


diferentes indican diferencias significativas para p<0.05 del peso del animal en el tiempo

(O, 7, 14 días) para “Control”y “Tratados”. (Prueba hipótesis para media por T students)

Tabla no. 15: Peso corporal (g) en el tiempo de la especie no roedora en el ensayo de

toxicidad aguda dérmica.


iguales indican que no hubo diferencias significativas en el peso del animal con el tiempo

(O, 7, 14 días) para “ControV’y “Tratados”. (Prueba hipótesis para media por T students)

0 7 14

I- Control (n=20)

Hembras (n=l 0)

Machos (n=l 0)

228,6 ±3,8°

219,2 ±1,7«

233,9 ±3,1 °

240,4 ±15,1°

239.3 ± 4,8 b

249.3 ± 22,7 b

II- Tratados (n=20)

Hembras (n=l 0)

Machos (n=l 0)

230,2 ±'5,8°

219,6 ±2,9°

236,1 ± 8,4 •

242,5 ±8b

246.7 ± 8,75 b

269.8 ±5,7'


0 7 14

I- Control (n=3) 187 ±0,1 a 197 ±0,1 a 207 ±0,1 °

II- Tratados (n=3) 190 ± 0,2 a 200 ±0,1° 207 ±0,1 a

66

Grupo Tiempo (días)

3.4.2 Ensayo de Irritabilidad Dérmica

En esta experiencia se trabajó solo con la crema al 15% porque es la que posee mayor

contenido de sustancia irritante, de las 2 formas farmacéuticas que fueron ensayadas en la

clínica, si al 15% no se observa irritación dérmica, puede suponerse que allO% tampoco se

desarrollará la misma.

En esta evaluación, el día del ensayo, y durante los tres días posteriores se efectuaron

lecturas de la piel para eritema, edema y escaras según el sistema de evaluación referido en el

Anexo no. 5, sin observar en ninguna de las lecturas efectuadas alteraciones de índole

entematosas, edematosas, ni la aparición de escaras. Tampoco se presentaron signos clínicos en

los animales sometidos a prueba, por lo que el índice de Irritación Primario para la crema al 15 %

es de 0-0, lo cual cataloga a la sustancia como potencialmente no irritante para la piel, según la

escala establecida en la literatura revisada. 123

3.4.3 Ensayo de Irritabilidad Oftálmica

En la Tabla no. 16 se presentan las afectaciones que se encontraron en las distintas

estructuras estudiadas en las diferentes lecturas realizadas a la crema al 15 %, asi como, el

índice de Irritación Ocular.

Como puede apreciarse se presentaron alteraciones en la conjuntiva, materializadas en la

aparición de eritemas y secreciones en todos los animales durante las primeras 48 horas del

ensayo. La evaluación que recibe esta estructura al finalizar la prueba es de 38 puntos.

En el Iris se apreciaron daños a profundidad, iritis marcada y fotofobia durante el primer día

de la prueba. La evaluación para el mismo es de 30 puntos.

Por otra parte también resultó dañada la Córnea, lo cual se evidencia por la tinción que se

realiza con Fluoresceína Sódica al 2%, alcanzando esta estructura 291 puntos.

El índice de Irritación Ocular fue de 29,9 por lo que la crema de Propóleos al 15% se clasifica

como moderadamente irritante según lo establecido en la literatura.

67

Capítulo 3 . Resultados

Al obtenerse un aumento de este parámetro en todos los grupos de ambas especies sin diferencias entre tratados y controles puede afirmarse que el producto ensayado no afecta el incremento normal del peso de los animales.

Las muestras tomadas de los órganos seleccionados no mostraron afectaciones desde elpunto de vista macroscópico, por lo que se decidió no tomar las mismas para el procesamiento histopatológico y en la piel no se observó daño alguno por lo que tampoco se tomaron muestras de la misma.

Tabla no. 16: Evaluación de la Irritabilidad Oftálmica de la crema al 15%

Los valores descritos indican el grado de afectación de cada estructura según sistema de

evaluación establecido por la OECD en 1992

Los valores descritos indican el grado de afectación de cada estructura según sistema de

evaluación establecido por la OECD en 1992

HORAS ESTRUCTURAS OBSERVADAS

CONJUNTIVA IRIS CORNEA

1 20 30 240

24 14 0 46

48 4 0 5

72 0 0 0

SUMA 38 30 291

TOTAL: 359

INDICE DE IRRITACION OCULAR: 29,9

Tabla no. 17: Evaluación de la Irritabilidad Oftálmica de la crema al 10%.

HORAS. ESTRUCTURAS OBSERVADAS.

CONJUNTIVA. IRIS CORNEA.

1 22 30 240

24 88 0 30

48 4 0 0

72 0 0 0

SUMA 34 30 270

TOTAL: 334

INDICE DE IRRITACION OCULAR: 27,8

68

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