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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS RELACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO Y EL PATRÓN DE DESCARGA DE LAS NEURONAS SECRETORAS DE ACOCIL TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE F I S I O L O G Í A PRESENTA J Ju ua an n J Jo os sé é M Ma ar rt tí ín ne ez z H He er rn ná án nd de ez z A S E S O R: Carlos G. Onetti Percello Colima, Col. 1990
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
RELACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO Y EL PATRÓN DE DESCARGA DE LAS NEURONAS SECRETORAS DE ACOCIL
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE F I S I O L O G Í A
PRESENTA
JJJuuuaaannn JJJooosssééé MMMaaarrrtttííínnneeezzz HHHeeerrrnnnááánnndddeeezzz
A S E S O R: Carlos G. Onetti Percello
Colima, Col. 1990
Parte de los resultados de esta tesis fueron presentados en el XXXII Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas y se enviaron para publicación:
Martínez, J.J. y Onetti, C. (1989). Dependencia de las corrientes de potasio con el calcio intracelular en neuronas secretoras de acocil. Memorias del XXXII Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas, Res. 0 78;
Martínez, J.J., Onetti, C.G., García, E. & Hernández, S. Potassium current kinetics in bursting secretory neurons: effects of intracellular calcium.
A mi compañera:
María Luisa
A mis hijos:
Carlos Manuel y Gustavo Adolfo
dos rodilloncitos muy guapos
AGRADECIMIENTOS
A mis profesores.
A la Universidad de Colima y al Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas.
A Carlos Onetti, por su asesoría, paciencia y generosidad durante el desarrollo del trabajo.
A Esperanza García, por su amistad y por sus comentarios críticos.
Al Dr. Miguel Huerta y al Dr. Jesús Muñiz, por su interés en mi formación académica.
A Raúl López, con quien comparto la responsabilidad de ser la primera generación de la maestría.
A mis compañeros de laboratorio Eduardo Pedraza y José Del Río, por su apoya y solidaridad.
A Saúl Hernández, por la elaboración de los programas de cómputo que me permitieron hacer un mejor análisis de los resultados experimentales.
A Juan Carlos Muñoz, por su magnifico trabajo de dibujo y fotografía lo que contribuyo a mejorar la presentación del trabajo.
Al personal técnico que labora en el CUIB, en especial a: Jesús Dueñas, Candelario Uribe, Nieves, Lupita, Maria Elena Martínez y Ezequiel Viera.
I N D I C E
página
PROLOGO.........................................................4
INTRODUCCIÓN....................................................6
Las corrientes de potasio en las neuronas..................8
El rectificador tardío................................8
La corriente transitoria de salida....................9
La corriente de potasio activada por Cal2+.............10
El rectificador anómalo...............................11
Otras corrientes de potasio...........................11
Relación de las corrientes de potasio con la
actividad marcapaso en neuronas..........................
13
Modulación de las corrientes de potasio....................18
Actividad espontánea y corrientes de potasio
en neuronas del OX de acocil.............................
23
OBJETIVOS.......................................................26
MÉTODOS.........................................................27
Preparación................................................27
Sistema de registro........................................30
Métodos de graficación y análisis..........................31
Pipetas....................................................32
Soluciones.................................................32
RESULTADOS......................................................35
1. Caracterización de las corrientes de potasio
en las neuronas del OX de acocil........................
35
Las corrientes de potasio IK e IA........................35
2
Cinética de las corrientes de potasio................... 39
Activación de la IK.................................39
Activación de la IA.................................43
Inactivación de la IA...............................46
2. Relación del patrón de descarga de neuronas
del OX con las corrientes de potasio....................
50
Diferentes patrones de descarga espontánea.............. 50
Características de las corrientes de potasio
y su relación con el patrón de descarga...............
52
Relación del patrón de descarga con la IK................54
Relación del patrón de descarga con la IA................55
3. Dependencia de las corrientes de potasio con
el calcio intracelular..................................
57
Efectos del calcio intracelular sobre el
rectificador tardío...................................
57
Efectos del calcio intracelular sobre el
componente transitorio de la corriente de potasio.....
62
DISCUSIÓN.......................................................68
Separación de dos componentes de la corriente de
Potasio..................................................
69
Cinética de las corrientes de potasio......................69
Características de las corrientes de potasio
y su relación con el patrón de descarga..................
71
Efectos del aumento del calcio intracelular
sobre las corrientes de potasio..........................
72
Importancia fisiológica....................................75
3
RESUMEN Y CONCLUSIONES..........................................78
PERSPECTIVAS....................................................82
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................84
4
P R O L O G O
Hace aproximadamente siete años, y más por curiosidad que
por interés, visité por vez primera el Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas (CUIB). En esa época cursaba el quinto
semestre de la carrera de Medicina y recibí la amable invitación
por parte del Dr. Jesús Muñiz para cumplir dentro de la
Institución el Servicio Social correspondiente a dicha carrera;
invitación que rechacé. El motivo que me hizo denegar tal
deferencia fue mi convicción de servir a la comunidad y en aquel
entonces "servicio" significaba para mí hacer Medicina
Asistencial.
Durante el año en el cual cumplí con el Servicio Social,
conocí las limitaciones a que se enfrenta la práctica médica en
el medio rural. Cuatro años de estudios teóricos realizados en la
Facultad de Medicina y un año de internado en una clínica del
IMSS no fueron suficientes para contestarme las siguientes
preguntas: ¿que terapéutica usar en un paciente que cursa con una
neoplasia terminal? ¿qué puede hacer un glucosado al S% en un
paciente de un año de edad que cursa con una desnutrición de III
grado? ¿cómo prescribir medicamentos a un paciente, si sabemos
que éstos son de baja calidad y que son muchos los efectos
indeseables que ocasionan?. Ante esta situación tomé la decisión
de buscar otras posibilidades de trabajo en las cuales, sin
olvidar la experiencia vivida, pudiera contribuir en algo a
cambiar tal situación. Mis posibilidades eran: hacer
5
Medicina Preventiva o hacer investigación. El CUIB y la
Universidad de Colima me dieron la oportunidad de aspirar a esta
última posibilidad, por lo que me considero afortunado.
Los resultados que se presentan en este trabajo fueron
obtenidos en el laboratorio y bajo la asesoría del Dr. Carlos
Onetti, además de contar con el invaluable apoyo de Esperanza
García.
El trabajo de programación en microcomputadora requerido
para la adquisición y el análisis de información fue realizado
por Saúl Hernández.
Durante los estudios recibí una beca-crédito CONACyT (No. de
registro 055455). Este trabajo fue financiado parcialmente por
donativos otorgados por la D.G.I.C.S.A. de la Secretaria de
Educación Pública (89-01-0149).
INTRODUCCIÓN
6
Se ha reportado la existencia de neuronas que tienen la
propiedad de generar potenciales de acción en forma espontánea; a
estas células se les conoce con el nombre de neuronas marcapaso,
y han sido identificadas en diferentes sistemas neuronales de
invertebrados (Alving, 1968, 1969; Gainer, 1972; Tazaki y Cooke,
1979; Nagano y Cooke, 1987) y vertebrados (Gähwiler y Dreifuss,
1979; Llinás y Yarom, 1981; Andrew y Dudek, 1983; Bourque y
Renaud, 1983).
Las neuronas marcapaso presentan diferentes patrones de
descarga: 1) la descarga tónica que consiste en descargas
repetidas de potenciales de acción a una frecuencia constante, 2)
la descarga fásica que se caracteriza por tener ráfagas de
potenciales de acción y, 3) las células que descargan potenciales
de acción en forma irregular.
Las neuronas marcapaso pueden distinguirse de las que
descargan potenciales de acción sólo en respuesta a una entrada
sináptica excitatoria (controladas) por: 1) el efecto de la
polarización del soma: en las neuronas marcapaso la frecuencia de
descarga disminuye cuando el soma se hiperpolariza, en cambio en
las neuronas controladas la aplicación de corrientes
hiperpolarizantes pequeñas hace más prominentes los potenciales
postsinápticos excitatorios, sin afectar la frecuencia de
descarga (Tauc, 1957) y, 2) por la forma del potencial de acción
(figura 1): en las neuronas marcapaso el potencial de acción es
precedido por una despolarización espontánea gradual, a
diferencia de las
7
espigas generadas sinápticamente que son precedidas por un
potencial postsináptico excitatorio (Alving, 1968)
Figura 1.
A y B: registros del potencial transmembrana de una neurona marcapaso. Nótese: en A, la despolarización lenta del potencial transmembrana durante el intervalo entre espigas y en B, la morfología del potencial de acción. C y D: registros del potencial transmembrana en una neurona controlada. Nótese: en C, la actividad sináptica (indicada con una flecha) y en D, la morfología de una espiga iniciada sinápticamente. Tomada de Alving (1968).
8
LAS CORRIENTES DE POTASIO EN LAS NEURONAS
En las neuronas de moluscos se han descrito diferentes corrientes
de potasio: entre ellas, la corriente del rectificador tardío
(IK), la corriente transitoria de salida (IA), la corriente de
potasio activada por calcio intracelular (IC) y la corriente de
potasio del rectificador anómalo (IR).
A continuación se describen las características de las
cinéticas de activación y de inactivación, curso temporal y
sensibilidad a bloqueadores de las corrientes de potasio arriba
mencionadas.
El rectificador tardío.
Esta corriente fue descrita inicialmente en el axón gigante de
calamar por Hodgkin y Huxley (1952). La IK es una corriente
dependiente de voltaje que se activa a potenciales relativamente
positivos, es bloqueada por el tetraetilamonio (TEA) pero no es
bloqueada por los iones de Co2+, Mn2+ o en presencia de un medio
extracelular carente de Ca2+ (Thompson, 1977). Para identificar a
los canales relacionados con esta corriente, como "rectificadores
tardíos" la corriente macroscópica que pasa a través de estos
canales debe ser semejante a la corriente de potasio descrita por
Hodgkin y Huxley (1952), tanto en su cinética como en su
dependencia del voltaje.
9
La corriente transitoria de salida.
El componente transitorio de la corriente de potasio fue descrito
originalmente por Hagiwara y colaboradores en 1961.
Posteriormente fue analizada por otros autores en células
nerviosas de invertebrados; Archidoris (Stevens, 1969; Connor y
Stevens 1971a y b) y en neuronas de Helix pomatia (Neher y Lux,
1971). Esta corriente también ha sido identificada en sistemas
neuronales de vertebrados (Belluzzi y cols., 1985a). Connor y
Stevens (1971c) concluyeron que la conductancia asociada a la IA
(gA) es distinta a la conductancia asociada a la IK (gK) y que
estos dos componentes de la corriente saliente podían separarse
por las características de sus conductancias: la IA se activa y
se inactiva más rápidamente que la IK, e incluso se inactiva
completamente a valores de potencial a los cuales la IK no se
encuentra apreciablemente activada. La IA se activa cuando, a
partir de potenciales de mantenimiento hiperpolarizados (-90 mV)
se aplican pulsos despolarizantes a potenciales más positivos que
-60 mV.
En gasterópodos marinos del género la amplitud de la IA es
dependiente del potencial de mantenimiento y de la magnitud del
pulso de prueba, pero el curso temporal parece ser el mismo a
diferentes potenciales de membrana (Connor y Stevens 1971b). En
Helix pomatia (Neher, 1971) y en el ganglio cervical superior de
rata (Belluzzi y cols., 1985a) el curso temporal de la activación
10
y de la inactivación de la IA son dependientes del potencial de
membrana.
En estudios realizados en neuronas de Tritonia diomedia por
Thompson (1977) mostraron que la IA difiere de la IK en su
sensibilidad a los bloqueadores de canales de potasio y que la
corriente de potasio puede ser separada en sus distintos
componentes por sus diferencias en su sensibilidad a la 4-
aminopiridina (4-AP), al TEA y a los iones de Co2+ o Mn2+. El
componente transitorio de la corriente de potasio es bloqueado
por agregar a la solución externa 3 mM de 4-AP, concentración que
no afecta apreciablemente al rectificador tardío, la IK es
bloqueada al agregar a la solución externa 50 mM de TEA.
La corriente de potasio activada por Ca2+
La IC es una corriente de potasio activada por un aumento en la
concentración intracelular de calcio. Los canales para la IC se
abren y cierran dependiendo de la actividad del calcio en el
citoplasma celular y son dependientes del tiempo y del voltaje. A
concentraciones intracelulares del orden de 10-8 a 10-5 M de Ca2+,
el potencial de reposo es considerado como voltaje de cierre, en
el cual los canales para esta corriente se encuentran cerrados.
Existen diferentes tipos de canales de potasio activados por
calcio que difieren en su conductancia unitaria, en su
sensibilidad a los iones de calcio y en su dependencia del
voltaje transmembranal. En neuronas de
11
Tritonia diomedia, la IC se activa a potenciales positivos, es
bloqueada por agregar 30 mM de CO2+ o Mn2+ al medio extracelular y
es insensible al TEA y a la 4-AP (Thompson, 1977).
El rectificador anómalo.
En contraste con las corrientes de potasio descritas
anteriormente, la corriente del rectificador anómalo disminuye
con la despolarización de la membrana a potenciales más positivos
que el potencial de equilibrio del potasio (EK). En neuronas de
Aplasia la IR tiene las siguientes características: es una
corriente entrante, la conductancia de los canales aumenta con la
hiperpolarización, se activa muy rápido a potenciales más
negativos que el EK su inactivación es rápida e incompleta, se
reduce al disminuir la concentración extracelular de potasio, y
se bloquea al agregar sales de Ba, Cs y Rb al medio extracelular
(Adams y Benson, 1985).
Otras corrientes de potasio
En estudios recientes se ha reportado la existencia de otras
corrientes de potasio como son: la modulada por agonistas
muscarínicos (IM), la modulada por la serotonina (IS), las
corrientes sensibles al trifosfato de adenosina (IATP) y la
corriente de potasio activada por sodio.
La corriente de potasio activada por los agonistas
muscarínicos es una corriente lenta, dependiente del
12
voltaje, que no se inactiva y que se activa a potenciales
hiperpolarizados o cercanos al potencial de reposo. Los canales
que conducen esta corriente son cerrados por la unión de la
acetilcolina a los receptores muscarínicos, esto se ha reportado
en neuronas centrales y en células simpáticas de vertebrados
(Adams y cols., 1983).
En las neuronas sensoriales de Aplysia se ha descrito una
corriente de potasio dependiente de voltaje que contribuye a la
repolarización del potencial de acción y recibe el nombre de
corriente-S (Siegelbaum y cols., 1982). Los canales para la IS
difieren de los del rectificador tardío en que se abren cuando el
potencial de membrana es igual al potencial de reposo de estas
células (-40 mV) y que su cinética de apertura es poco
dependiente del voltaje. La serotonina y algunos neuropéptidos
endógenos producen el cierre de estos canales e induce un
incremento en la duración del potencial de acción (Abrams y
cols., 1984; Siegelbaum y cols., 1986).
Los canales de potasio que son sensibles al trifosfato de
adenosina (KATP) permiten el enlace entre el estado metabólico de
la célula y su excitabilidad (Ashcroft, 1988). En las células
beta del páncreas estos canales se encuentran abiertos en el
potencial de reposo de la célula; el incremento en la
concentración intracelular de ATP, que ocurre como consecuencia
del metabolismo de la glucosa, bloquea los canales KATP. De esta
manera la célula se despolariza y activa los canales de Ca
13
dependientes del voltaje y finalmente, la liberación de insulina
(Ashcroft, 1988). Se ha observado que los canales de la IATP de
diferentes tejidos presentan propiedades distintas, de tal manera
que la conductancia unitaria varía de 50 pS, en células beta del
páncreas, células del corazón y músculo esquelético a más de 150
pS, en tejido cerebral y en músculo liso (Quast y Cook, 1989).
En neuronas de invertebrados (Hartung, 1985) y de
vertebrados (Martín y Dryer, 1989) se ha descrito una corriente
de potasio que es dependiente de la entrada de Na+ a la célula.
Es una corriente igual o más rápida que la corriente transitoria
de salida (IA). Hartung (1985) reportó que la amplitud de la
corriente decrece al reducir la concentración extracelular de
Na+, un efecto semejante se observa al agregar TTX a la solución
del baño. La conductancia unitaria de estos canales en células
del tallo cerebral de embriones de pollo es de 50 pS, para
concentraciones intracelulares de Na+ entre 10 y 100 mM (Martín y
Dryer, 1989).
RELACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO CON LA ACTIVIDAD MARCAPASO
DE LAS NEURONAS
En las neuronas, las corrientes de potasio tienen una acción
principalmente inhibitoria, proporcionando parte de la, corriente
saliente que se opone a las corrientes entrantes de Na+ y Ca2+
activadas durante un estímulo despolarizante. Como resultado de
esto, los canales para el potasio juegan
14
un papel importante en la regulación de la excitabilidad
neuronal. La diversidad de canales de potasio podría tener
relación con los diferentes patrones de descarga que presentan
las células marcapaso.
Diferentes autores han establecido que las corrientes de
potasio en las neuronas tienen una función preponderante en la
regulación de la actividad marcapaso. En particular, las
corrientes IK, IA, IC e IR han sido relacionadas con la modulación
de las descargas espontáneas de potenciales de acción. La
diferencia en su participación como reguladores de la frecuencia
de descarga y de la duración del potencial de acción depende de
su curso temporal y de su cinética de activación y de
inactivación.
La tabla 1 resume las principales características de las
corrientes de potasio mencionadas, y su participación en la
actividad marcapaso.
15
TABLA 1 CORRIENTES DE POTASIO, CARACTERÍSTICAS Y EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD MARCAPASO ------------------------------------------------------------------------------------------ CORRIENTE DE CARACTERÍSTICAS EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD POTASIO PRINCIPALES MARCAPASO. ------------------------------------------------------------------------------------------ RECTIFICADOR TARDIO (IK). 1 DEPENDIENTE DE VOLTAJE. 1 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
2 NO INACTIVA. DE ACCIÓN DETERMINANDO ASÍ SU 3 BLOQUEADA POR TEA (ext.) DURACIÓN.
Y POR TEA, Ca Y Ba (int.) ------------------------------------------------------------------------------------------ CORRIENTE "A" 1 DEPENDIENTE DE VOLTAJE. 1 LATENCIA DE LA PRIMERA ESPIGA (IA). 2 INACTIVA. 2 REGULACIÓN DE LA FRECUENCIA
3 BLOQUEADA POR 4-AP (ext.) DE DESCARGA. Y POR Cs Y TEA (int.). 3 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
DE ACCIÓN? ------------------------------------------------------------------------------------------ ACTIVADA POR CALCIO (IC). 1 ACTIVADA POR CONCENTRA- 1 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
CIONES pM DE Ca INTERNO DE ACCIÓN. 2 LA DEPENDENCIA DE TIEMPO 2 HIPERPOLARIZACIÓN POSTPOTEN-
Y VOLTAJE ESTA CORRELA- CIAL. CIONADA CON LA ENTRADA 3 REGULACIÓN DE LA FRECUENCIA DE CALCIO. DE DESCARGA.
3 BLOQUEADA POR TEA Y Cd 4 TERMINACIÓN DE LAS RÁFAGAS. (ex t.).
------------------------------------------------------------------------------------------ RECTIFICADOR ANOMALO (IR). 1 CORRIENTE ENTRANTE. 1 MANTIENE LA MESETA DURANTE
2 AUMENTO DE SU CONDUCTANCIA EL POTENCIAL DE ACCIÓN. CON HIPERPOLARIZACIÓN 2 REGULA LA FRECUENCIA DE
3 BLOQUEADA POR TEA (int.) DISPARO. Cs Y Ba (ext.)
------------------------------------------------------------------------------------------ Modificada de: Rudy (1988).
16
A continuación se describe la participación, de las
corrientes de potasio que han sido relacionadas con la regulación
de la actividad marcapaso en diferentes preparaciones.
La IK es la corriente que responsable de la repolarización
durante el potencial de acción (Neher y Lux, 1972) Una reducción
en la amplitud de la IK produce un incremento en la duración del
potencial de acción dando como consecuencia un aumento en la
duración del período refractario y un por lo tanto una
disminución de la frecuencia de descarga.
La IA regula la frecuencia de descarga determinando la
latencia de la primera espiga cuando la neurona se activa
espontáneamente o cuando responde a una despolarización sostenida
(Connor y Stevens, 1971c).
La hiperpolarización posterior a cada potencial de acción
reactiva una parte de los canales para la IA. Al ser activada la
IA prolonga el tiempo que tarda la célula en alcanzar el
potencial umbral, prolongando el intervalo entre espigas y
reduciendo la frecuencia de descarga (Connor y Stevens, 1971c).
Las corrientes de potasio dependientes de calcio contribuyen
a la hiperpolarización que sigue a una ráfaga de potenciales de
acción (Kaczmarek, 1988). En las células excitables, la IC es
activada por la entrada de calcio que
17
ocurre durante el potencial de acción. Esta corriente es
responsable en gran medida de la hiperpolarización postpotencial
(Pennefather y cols., 1985) que sigue a una espiga y juega un
papel importante en la modulación de la frecuencia de descarga ya
que aleja a la célula del potencial umbral. En algunas neuronas
contribuye a la repolarización del potencial de acción (Adams y
cols., 1982; MacDermott y Weight, 1982).
La contribución de la IR a la corriente neta de membrana es
pequeña para potenciales de membrana (Vm) entre 5 y 35 mV más
positivos que el EK. Esto es muy importante porque en condiciones
fisiológicas el EK es mas negativo que el Vm. A potenciales entre
-80 y -50 mV, la curva corriente voltaje (I-Em) en estado estable
pasa cerca del eje de voltaje. Estos valores de Vm son
subumbrales para las corrientes de potasio dependientes de
voltaje. Las corrientes que se activan a estos valores de voltaje
no afectan al potencial de acción por sí mismas, pero controlan
el patrón de su generación durante las ráfagas, específicamente
durante el intervalo entre ráfagas. Un pequeño aumento en la
corriente saliente puede desplazar a la curva I-Em del
rectificador anómalo más cerca o sobre el eje de voltaje (véase:
Adams y Benson, 1985).
Aunque las corrientes IM, IS, IATP y la corriente de potasio
activada por sodio, hasta el momento no han sido
18
relacionadas directamente con la actividad marcapaso, podrían
participar en la modulación de la frecuencia y duración de los
potenciales de acción.
MODULACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO
Las características electrofisiológicas de las neuronas están
determinadas por el cierre y la apertura de los canales fónicos
en la membrana plasmática. Una vez que los canales han sido
sintetizados e incorporados a la membrana, su cinética de
activación y de inactivación no necesariamente permanece
constante sino que pueden ser moduladas por el potencial de
membrana, por neurotransmisores y por procesos intracelulares
(Kaczmarek, 1988). Algunos autores han reconocido la existencia
de un mecanismo de control por compuestos intracelulares como el
calcio (Meech, 1978).
A continuación se describe la modulación de las corrientes
de potasio que se han relacionado con la regulación de la
actividad marcapaso.
A partir de evidencias recientes se ha sugerido que las
propiedades del rectificador tardío en el axón gigante de calamar
son moduladas por una reacción dependiente de ATP, esto puede ser
por una fosforilación del canal. En axones en los cuales se ha
dializado el medio interno, la adición de ATP a la solución
intracelular origina un cambio en la
19
dependencia al voltaje y en la cinética de activación y de
inactivación de la IK (Kaczmarek, 1988). Después del tratamiento
con ATP la corriente, activada por despolarizaciones grandes de
la membrana, se incrementa en amplitud y se activa más
lentamente.
La aplicación de neurotransmisores, la manipulación de
sistemas de segundos mensajeros y la inyección de proteínas
cinasas al interior celular, en diferentes sistemas neuronales,
producen una disminución en la amplitud de la IA acompañada por
cambios en la velocidad de su inactivación (Kaczmarek, 1988).
Las neuronas "bag" (en forma de bolsa) de son células
neurosecretoras que en su potencial de reposo no presentan
actividad espontánea. Se despolarizan y descargan potenciales de
acción en forma repetitiva durante 60 minutos en respuesta a un
estimulo breve. Esta descarga posterior es modulada por el
incremento de la concentración intracelular de monofosfato
cíclico de adenosina (AMPC) La aplicación de forscolina (un
activador de la ciclasa de adenilato) y de R020-1724 (un
inhibidor de la fosfodiesterasa) reducen la amplitud de la IA y
aceleran el proceso de la inactivación. Los procesos de
activación y de inactivación en estado estable no son alterados
por estos fármacos. Se ha sugerido que estos cambios en la
cinética de inactivación de la IA pueden explicar la capacidad de
las neuronas "bag" de
20
Aplysia para descargar potenciales de acción en forma repetitiva
después de aplicar estímulos (Strong, 1984).
Los distintos tipos de canales para el potasio activados por
el calcio intracelular son aparentemente regulados por segundos
mensajeros a través de diferentes vías como son: el AMPC, la
subunidad catalítica de la proteína cinasa dependiente de AMPC
(proteína cinasa A), así como por proteína cinasa C (Kaczmarek,
1988).
En experimentos realizados en neuronas intactas de Helix
pomatia, se ha encontrado que estos canales son regulados por la
proteína cinasa A. La adición de 0.1 µM de proteína cinasa A a la
solución interna aumenta la amplitud de la IC durante la
despolarización de la membrana celular (DePeyer y cols., 1982).
En canales reconstituidos en bicapas lipídicas, la
aplicación de proteína cinasa A en presencia de ATP, produce un
incremento en la probabilidad de apertura de estos canales (Ewald
y cols., 1985). Estos resultados sugieren que la regulación de
estos canales por la proteína cinasa A ocurre directamente por la
fosforilación del canal.
La IR aumenta por los neurotransmisores que actúan a través
de segundos mensajeros como el AMPC. La serotonina (Benson y
Levitan, 1983; Lotshaw y cols., 1986) aumenta la IR en neuronas
R15 de Aplysia. Hay evidencias de que dicho efecto es mediado por
un incremento en los niveles de AMPC
21
(Drummond y cols., 1980; Benson y Levitan, 1983; Levitan y cols.,
1987). Más aún la hiperpolarización entre ráfaga que ocurre al
agregar serotonina a neuronas R15 de Aplysia es mediada por AMPC
(Drummond y cols., 198O).
La activación de la ciclasa de adenilato, la inhibición de
la fosfodiesterasa, y la aplicación de análogos no hidrolizables
de AMPc incrementan la IR (Kramer y Levitan, 1988).
Los efectos de la despolarización sobre la IR se deben
específicamente a la entrada y a la acumulación de calcio
intracelular durante una descarga en ráfaga espontánea o inducida
por pulsos despolarizantes, que inactiva a la IR (Kramer y
Levitan, 1988).
El aumento del calcio intracelular producido por
despolarizaciones repetidas suprime la respuesta de la IR a dosis
pequeñas de serotonina, esto sugiere que el calcio interfiere con
la activación dependiente del AMPC de la IR, el calcio reduce la
concentración de AMPC por la activación de fosfodiesterasas
sensibles a calcio/calmodulina (Kramer y cols., 1988). Por otra
parte, la inhibición de la fosfodiesterasa suprime la
inactivación dependiente de calcio de la IR (Kramer y cols.,
1988). Con la técnica de radioinmunoanálisis se ha observado que
la concentración de AMPC aumenta en los somas de neuronas R15 de
Aplysia que han tenido largos periodos de hiperpolarización, lo
que no ocurre después de una ráfaga, esto apoya la hipótesis de
que la entrada de calcio reduce la concentración de AMPC (Kramer
22
y cols., 1988). Asimismo, se ha concluido que la inactivación de
la IR dependiente de calcio se debe a la interacción entre el Ca
intracelular y el metabolismo del AMPc, y que la estimulación de
una fosfodiesterasa dependiente de calcio/calmodulina contribuye
a la inactivación de la IR (Kramer y cols., 1988).
Los efectos de la despolarización sobre la IR son bloqueados
por la sustitución del calcio del medio extracelular, agregando
3mM de Mn2+ para bloquear los canales de calcio o inyectando un
quelante de Ca2+ (EGTA) (Kramer y Levitan, 1988). En resumen, la
IR es modulada en direcciones opuestas por dos segundos
mensajeros intracelulares: es aumentada por el AMPC y es
inactivada por Ca2+ intracelular.
En resumen, en las neuronas marcapaso las corrientes de
potasio participan en el control de la duración y la frecuencia
de los potenciales de acción. Además, pueden ser moduladas por
neurotransmisores y segundos mensajeros intracelulares. En
particular el calcio que entra a la célula con cada potencial de
acción durante una ráfaga (Gorman y Thomas, 1978), inactiva a las
corrientes de potasio del rectificador tardío (Heyer y Lux, 1976;
Hofmeir y Lux, 1981) y del rectificador anómalo (Kramer y
Levitan, 1988).
23
ACTIVIDAD ESPONTÁNEA Y CORRIENTES DE POTASIO EN NEURONAS DEL OX
DE ACOCIL
Las neuronas del sistema órgano X-glándula sinusal (OX-GS) de los
crustáceos decápodos son células secretoras que descargan
potenciales de acción producidos por estimulación (Iwasaki y
Satow, 1971) o en forma espontánea (Nagano y Cooke, 1987).
En el OX de acocil pueden diferenciarse tres grupos
neuronales con base en el patrón de descarga espontánea,
similares a los descritos en otras preparaciones: 1) neuronas que
disparan en forma regular; 2) irregular y; 3) en ráfagas (Onetti,
1989). En las neuronas del OX de acocil se han identificado dos
componentes de la corriente de potasio: un componente transitorio
rápido que se inactiva (figura 2D), al cual se le ha denominado
IA y que se bloquea con 4-AP (figura 2E), y un componente lento
que no se inactiva (figura 2A), al cual se le conoce como IK o
rectificador tardío y que se bloquea con TEA (figura 2C).
Sin embargo, dichos componentes de la corriente de potasio
en las neuronas del OX no han sido caracterizados completamente,
en particular en lo referente a las cinéticas de activación y de
inactivación, ni se ha estudiado su modulación por segundos
mensajeros (en particular por Ca2+ intracelular).
El propósito del presente trabajo de tesis fue estudiar: a)
la cinética de activación y de inactivación de
24
la IA y de la IK en las neuronas del OX de acocil, b) su posible
relación con los diferentes patrones de descarga y, c) el efecto
del calcio intracelular sobre la cinética de dichas corrientes.
25
Figura 2.
Registros de corrientes de potasio, en una neurona axotomizada, en respuesta a pulsos despolarizantes, aplicados cada 3 s, a potenciales de membrana de -40, -28, -16, -4 y 8 mV. Potencial de mantenimiento: -50 mV (A y C), -90 mV (B, D y E). Solución de la pipeta: K/Ca 5 x 10-9. Los registros (A y B) fueron obtenidos prefundiendo la preparación con una solución carente de sodio, (C y D) añadiendo 20 mM TEA a la solución sin Na y E añadiendo 20 mM de TEA y 2 mM de 4-AP a la solución sin sodios. Barra de calibración vertical: 3 nA (A, B, C y D) y 0.6 nA (E). Tomada de Onetti (1989).
OBJETIVOS
26
Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron los
siguientes:
1) Estudiar la cinética de las corrientes de potasio en
las neuronas del OX de acocil, en particular la del
rectificador tardío (IK) y de la corriente transitoria
de salida (IA)
2) Relacionar las características de la cinética de
activación y de inactivación de dichas corrientes, con
el patrón de descarga.
3) Estudiar la dependencia de la IK y de la IA, con la
concentración intracelular de calcio.
MÉTODOS
27
Preparación:
Los experimentos se realizaron en neuronas del OX de acociles
Procambarus clarkii adultos, machos y hembras, fuera de la época
de muda. Para obtener la preparación se practicó la ablación del
tallo ocular, el cual se colocó en una caja de Petri que contenía
solución salina normal (tabla 3). Se retiró el exoesqueleto que
cubre el tallo ocular y se extirparon los músculos y el tejido
conectivo que cubren la región donde se encuentra el OX. De esta
manera los cuerpos neuronales del OX quedaban expuestos y podían
observarse al microscopio (figura 3B). En algunos de los
experimentos se cortó el tracto OX-GS, el corte se realizó en la
región proximal a los somas neuronales en el sitio que se indica
en la figura 3A con una flecha.
Una vez obtenida la preparación se colocó en la parte
central de una cámara de lucita de tres compartimientos, con un
volumen total de 1 ml. Los compartimientos estaban conectados
entre sí, lo que permitía el flujo de soluciones entre ellos,
como se muestra en el esquema de la figura 4A. La preparación fue
prefundida con la solución salina normal durante 30 minutos antes
de efectuar las mediciones experimentales.
Los experimentos se realizaron a la temperatura de 22 a 24
ºC.
28
Figura 3.
A: Esquema del sistema neurosecretor del tallo ocular de acocil mostrando las principales estructuras anatómicas: OX, tracto axónico y glándula sinusal. La flecha indica el sitio donde se cortó el tracto en algunos experimentos. B: Microfotografía de los cuerpos neuronales de un OX de acocil expuestos después de la disección del tejido conectivo que los cubre. Tomadas de Onetti (1989).
29
Figura 4.
A: Esquema de la cámara de perfusión. La preparación se colocaba en el compartimiento central. B: Esquema del dispositivo de registro: I/V, convertidor corriente a voltaje; Rf, resistencia de retroalimentación (100 MΩ); a, amplificador de ganancia variable; Im=V/aRf, medición de la corriente transmembranal; Vm, potencial de mantenimiento; VCOM, pulsos comandados por el estimulador; Vm, medición del potencial de membrana; A/D, convertidor analógico a digital. Tomadas de Onetti (1989).
30
Sistemas de registro:
1). Se realizaron registros del potencial de membrana con la
técnica convencional de microelectrodos utilizando un
amplificador de alta impedancia de entrada (DAGAN 8100), que
permitía la aplicación de pulsos de corriente a través del mismo
electrodo. La caída de voltaje ocasionada por el paso de
corriente por el microelectrodo podía restarse de la diferencia
de potencial transmembranal con un amplificador diferencial
("puente").
2). Se registró la corriente transmembranal y el potencial
de membrana con la técnica de fijación de voltaje en células
completas o "whole-cell clamp" (Hamill y cols., 1981), tanto en
la configuración de fijación de voltaje como en la configuración
de fijación de corriente. Para ello se utilizó un amplificador
construido en la Universidad de Colima (Onetti, 1989) basado en
el diseño de Sigworth (1983). Las señales de corriente se
corrigieron restando las corrientes de fuga y la corriente
capacitiva. La figura 4B muestra el esquema del dispositivo
experimental utilizado.
3). Las señales de voltaje y de corriente se filtraron
utilizando un filtro pasabajas tipo Bessel de cuatro polos
(Frequency Devices), a las frecuencias de corte (-3dB) de 0.05,
1.2 y 3.2 kHz. Las señales restadas, filtradas y amplificadas se
adquirieron en una microcomputadora (IBM-AT), utilizando un
convertidor analógico-digital de 12 bits (TECHEN), a 50, 2500 y
10000 muestras por segundo.
31
4). Los pulsos de voltaje y de corriente se aplicaron
utilizando un generador de pulsos programable basado en una
microcomputadora (Rockwell AIM65). Las curvas I-Em en estado
estable, en la configuración de fijación de voltaje se obtuvieron
mediante la aplicación de rampas de voltaje utilizando un
"generador de rampas" analógico comandado por el generador de
pulsos. El generador de rampas fue diseñado por el Ing. Gilberto
Ornelas y construido en la Universidad de Colima (Onetti, 1989).
Métodos de graficación y análisis:
Las figuras fueron hechas en un graficador (Hewlett Packard
ColorPro). Los trazos de corriente contienen 512 puntos.
La densidad de corriente fue determinada dividiendo la
amplitud de la corriente por la capacidad de membrana (Cm) en vez
de considerar el área de l a superficie celular. Para medir Cm se
aplicó un pulso de voltaje de 10 mV. La capacidad de membrana se
calculó a partir de la ecuación: Cm=It/V, donde "It" corresponde
al área del transiente capacitivo y V a la amplitud del escalón
de voltaje (10 mV).
Las cinéticas de activación y de inactivación fueron
analizadas de acuerdo con las ecuaciones de Hodgkin y Huxley
(1952).
El ajuste de los datos experimentales se realizó usando el
método de mínimos cuadrados para modelos no lineales, con la
rutina "Patternsearch" (Colquhoun, 1971) escrita en
32
lenguaje Turbo-Pascal en una microcomputadora (IBM-AT) por Saúl
Hernández, en la Universidad de Colima.
Pipetas:
Los microelectrodos utilizados para registro intracelular se
fabricaron con tubos capilares de 1.2 mm de diámetro con
filamento interior (AM System). Para fabricarlos se utilizó un
estirador vertical (David Kopf) y se llenaron con una solución de
KCl 3M. Las resistencias de los microelectrodos utilizados fueron
del orden de 30 MΩ. Las pipetas para los experimentos de fijación
de voltaje y de corriente fueron construidas con tubos capilares
para hematocrito (S/P, 1.1 1.2 mm diámetro interno). Estas
pipetas fueron llenadas con las soluciones cuya composición se
muestra en la tabla 2. El valor de la resistencia de las pipetas
fue de 0.8 a 1.2 MΩ. La resistencia del sello entre las pipetas y
la membrana fue mayor que 10 GΩ.
Soluciones:
La composición de las soluciones internas y las externas se
muestran en las tablas 2 y 3, respectivamente. Las soluciones
internas se filtraron utilizando membranas con poros de 0.22 µm
(MILLIPORE GS-type).
La concentración de calcio en el citoplasma de células
animales se encuentra entre de 10-8 y 10-5 M (Baker y cols., 1970;
Rasmussen, 1970). Por esta razón se consideró como
33
bajo calcio a la solución interna K/Ca 10-8 y como alto calcio a
la solución K/Ca 10-6.
TABLA 2: Composición de las soluciones internas (en mmol/l)
-----------------------------------------------------------------
K/Ca 10-8 K/Ca 10-6
KCl 216 209
MgCl2 2 2
CaCl2 0.5 5
EGTA 5.5 5.5
HEPES 10 10 -----------------------------------------------------------------
El pH de estas soluciones se ajustó a 7.2
Suponiendo una constante de unión Ca-EGTA de 107, la [Ca] de
las soluciones fue de 10-8 y de 10-6 mol/l, respectivamente.
34
TABLA 3: Composición de las soluciones externas (en mmol/l)
-----------------------------------------------------------------
Normal O-Na/Cd O-Na/Cd/TEA
NaCl 200 -- --
KCl 5.4 5.4 5.4
CaCl2 13.5 13.5 13.5
MgCl2 2 -- --
HEPES 10 -- --
TRIS-HCl -- 208 188
CdCl2 -- 2 2
TEA-Cl -- -- 20 -----------------------------------------------------------------
El pH de estas soluciones se ajustó a 7.4.
RESULTADOS
CAPITULO 1
35
CARACTERIZACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO EN LAS NEURONAS DEL
OX DE ACOCIL.
LAS CORRIENTES DE POTASIO IK E IA
Se registraron las corrientes de potasio en las membranas de las
neuronas axotomizadas, con el medio intracelular dializado con
una solución que contenía una concentración de calcio de 10-8
mol/l (tabla 2) y prefundiendo la preparación con solución O-
Na/Cd (tabla 3). Para ello, a partir de potenciales de
mantenimiento de -50 y -100 mV se aplicaron pulsos
despolarizantes cada 3s, con una duración de 160 ms, a diferentes
potenciales de membrana entre -62 y 22 mV. La figura 5 muestra
registros representativos de las corrientes obtenidas en una
célula axotomizada. Se observa que el pico de corriente aumenta
en cada caso cuando se lleva a la célula a potenciales más
positivos. La corriente saliente (IK) obtenidas a partir de un
potencial de mantenimiento de -50 mV (figura 5a) tenían un curso
temporal sigmoidal y no inactivaban apreciablemente. El umbral de
activación de la IK fue de -38.4 ± 3.5 mV (media ± desviación
estándar, n=5). En la figura 5B se muestran registros obtenidos a
partir de un potencial de mantenimiento de -100 mV, donde pueden
observarse dos de los componentes de la corriente saliente (IK e
IA). El componente tardío (al final del pulso) era prácticamente
el mismo que el que se obtuvo cuando el potencial de
mantenimiento era de -50 mV (figura 5A). Debido a que la IA se
encuentra inactivada a -60 mV, potencial al
36
cual la lK aún no se activa, es posible obtener el componente
transitorio neto (IA) si se restan los trazos de corriente de la
figura 5A de los correspondientes de la figura 5B (5B - 5A). El
resultado de la resta se muestra en la figura 5C. Puede
observarse que la IA, obtenida de esta manera, se activaba
rápidamente, alcanzaba un máximo para luego decaer
exponencialmente en pocos milisegundos. El umbral de activación
de la IA fue de -52.2 ± 4.3 (n=5). La figura 6 muestra las
relaciones entre la corriente al pico y el potencial de membrana
para los dos componentes de la corriente de potasio: IK e IA.
Entre de -50 y 22 mV para la IA y entre -35 y 22 mV para la IK,
el pico de corriente se incrementa a medida que se despolariza la
membrana.
37
Figura 5.
Registro de corrientes salientes (trazos inferiores de A y B) en una neurona axotomizada del OX, en respuesta a pulsos despolarizantes (trazos superiores) a -26, -14, -1, 10 y 22 mV. Potencial de mantenimiento: -50 mV (A) y -100 mV (B). Los registro mostrados en C resultan de restar trazo a trazo los registros A y B (A y B). Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de la pipeta: K/Ca-10-8.
38
Figura 6.
Relaciones I-Em de la corriente saliente transitoria IA (círculos blancos) y de la corriente tardía IK (círculos negros). En ambos casos se midió el valor máximo de la corriente. Las líneas punteada y continua fueron ajustadas a ojo. Los puntos representan el valor promedio de 4 neuronas. Las barras representan el error estándar de la media. Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de las pipetas: K/Ca-10-8.
39
CINÉTICAS DE LAS CORRIENTES DE POTASIO.
Activación de la IK.
El componente transitorio de la corriente de potasio se encuentra
inactivada a un potencial de membrana de -50 mV, por lo tanto si
se fija el voltaje a ese nivel y se aplican pulsos
despolarizantes es posible obtener la IK no contaminada por la
IA.
Para el análisis de la cinética de activación de las
corrientes de potasio se utilizaron las ecuaciones de Hodgkin y
Huxley (1952). Si se supone que la IK no inactiva a los
potenciales de membrana estudiados, esta corriente puede ser
descrita por una ecuación de la forma:
IK = IK∞ [1-exp (-t/ϒn>]N..........................(1),
donde IK∞ es la amplitud de la corriente a tiempos prolongados y
ϒn es la constante de tiempo de activación.
Los registros de corriente obtenidos a potenciales de
membrana entre -26 y 22 mV como los de la figura 5A, fueron
ajustados con la ecuación (1). Se probaron diferentes valores
para N y se obtuvo el mejor ajuste para N=4.
Los valores de gK se calcularon a partir de:
gK = IK/(V-EK)....................................(2),
donde EK = -92 mV es el potencial de inversión de IK calculado a
partir de la ecuación de Nernst y V es el potencial de membrana.
De esta manera, se calculó el valor promedio experimental de las
gK de 4 neuronas para cada potencial de membrana. La relación gK-
Em en estado estable puede ser descrita por la ecuación de
Boltzmann:
40
gK = GK1+exp[(VO-Em)k*]-1.........................(3),
donde GK es la conductancia máxima de la membrana asociada a la
IK, VO es el potencial al cual se encuentra el valor medio de la
conductancia, V el potencial de membrana y k*=zF/RT; donde z es
la valencia de la compuerta de activación de IK, F la constante
de Faraday, R la constante de los gases y T la temperatura
absoluta. Ajustando la ecuación (3) a los valores experimentales
de gK se encontró: GK=0.357 mS/µF, Vo=-6.9 mV y K*=0.1037 mV-1; es
decir, z=2.62. La figura 7 muestra la gK como una función del
potencial de membrana así como la curva de ajuste.
La activación en estado estable (n∞) en función del
potencial de membrana se obtuvo suponiendo que nO=O a un
potencial de membrana de -50 mV. Así,
n∞ = [IK∞/(V-EK)]1/4(GK)-1/4..........................(4).
La figura 8 muestra los valores de n∞ y de la constante de
tiempo de activación como funciones del potencial de membrana, en
la misma neurona presentada en la figura 5.
41
Figura 7.
Dependencia de voltaje de las conductancias gA (círculos blancos) y gK (círculos negros). Los valores de gK y gA fueron calculados a partir de: gK,A = I/(V-EK,A). Las líneas punteada y continua corresponden al ajuste de los datos experimentales a la ecuación de Boltzmann, para gA y gK respectivamente. Las barras representan el error estándar de la media obtenida de 4 neuronas diferentes. Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de las pipetas: K/Ca 10-8.
42
Figura 8.
Activación en estado estable (n8, círculos negros) y constante de tiempo de activación (TAUn, círculos blancos) de la IK como funciones del potencial de membrana (Em) en una neurona (la misma de la figura 5). Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de las pipetas: K/Ca 10-8.
43
Activación de la IA.
Connor y Stevens (1971b) describieron en neuronas de moluscos al
componente transitorio de la corriente de potasio, como el
producto de la cinética de activación y de inactivación; estos
procesos son independientes entre sí. Por lo tanto, la corriente
puede ser descrita por la ecuación:
IA = K[1-exp(-t/ϒm)]Nexp(-t/ϒh)..................(5),
donde k es un factor de escalamiento y ϒm y ϒh son las constantes
de tiempo de activación y de inactivación respectivamente. Como
se describió anteriormente (figura 5C) las corrientes obtenidas a
diferentes potenciales de membrana se ajustaron utilizando la
ecuación (5). El mejor ajuste se obtuvo para N=4.
Para cada potencial de membrana, se ajustó el decaimiento de
la IA a una función exponencial simple (figura 1OC). La función
de ajuste se extrapoló al inicio del pulso de prueba para obtener
la amplitud instantánea de la IA (I0). Con los valores de lo
obtenidos a potenciales de membrana entre -62 y 22 mV, se
calcularon los valores de gA utilizando la siguiente ecuación:
gA = IO(V-EA).....................................(6),
donde V es el potencial de membrana y EA=-89 mV el potencial de
inversión medido para IA (datos no presentados). De esta manera
se obtuvo el promedio de gA a partir de los registros de
corrientes de 4 neuronas diferentes. Dichos promedios se
ajustaron con la ecuación de Boltzmann (ecuación 3),
44
obteniéndose los siguientes valores: GA=0.924 mS/µF, VO=-7.0 mV.
y K*=O.O689 mV-1 (z=1.74). La figura 7 muestra la relación gA-Em y
la curva de ajuste.
Si se supone que mO=O y hO=1, a un potencial de
mantenimiento de -100 mV, y que h∞=O a potenciales más positivos
que -40 mV, entonces m8 puede ser obtenido a partir de la
ecuación:
m∞ = [IO/(V-EA)]1/4(GA)-1/4.......................(7).
En la figura 9 se muestran los valores de m∞ y de la constante de
tiempo de la activación como funciones del potencial de membrana,
en la misma neurona representada en la figura 5.
45
Figura 9.
Activación en estado estable (m∞, círculos negros) y constante de tiempo de activación (TAUm, círculos blancos) de la IA como funciones del potencial de membrana (Em). Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de las pipetas: K/Ca 10-8.
46
Inactivación de la IA.
El estudio del curso temporal de la inactivación de la corriente
transitoria se realizó bloqueando el rectificador tardío, por
agregar TEA (20 mmol/l) al medio extracelular. La inactivación en
estado estable fue estudiada condicionando a la membrana de la
neurona durante tres segundos a diferentes potenciales de
mantenimiento (Vm) y aplicando pulsos de prueba (PP)
despolarizantes (a 0 mV) como se ilustra en la figura 10A. Se
midió el pico de la corriente durante los pulsos de prueba y se
construyó la gráfica de la amplitud relativa (con respecto al
valor máximo) de la corriente al pico (1/Imáx) en función del
potencial de mantenimiento. La figura 11 muestra el valor
promedio de la inactivación en estado estable como una función
del potencial de membrana. Dichos valores promedio se ajustaron a
una distribución de Boltzmann, de la forma:
h∞ = 1+exp[(V-Vh)k*]-1............................(8),
donde Vh es el punto medio de la inactivación en estado estable y
k*=zF/RT; en este caso z representa la valencia de la compuerta
de inactivación de la IA. A partir del ajuste se obtuvo: Vh=-85.3
mV y k*=D.1532 mV-1 (z=3.87).
La constante de tiempo de la inactivaciún fue obtenida
ajustando el decaimiento de la IA a una exponencial simple
(figura 10C). La figura 11 muestra los valores de las constantes
de tiempo de la inactivación a diferentes potenciales de membrana
obtenidos en la misma neurona representada en la figura 10C.
47
Para estudiar el curso temporal de la inactivación de la IA
a potenciales más negativos, es decir cuando la IA no se activa,
se utilizó un protocolo similar al desarrollado por Neher en 1971
(figura 10B). Tanto el desarrollo (figura 10B1) como la
desaparición (figura 10B2) de la inactivación fueron estudiados
midiendo el pico de corriente durante el pulso de prueba
(usualmente a 0 mV) a diferentes tiempos después de llevar a la
neurona a los potenciales condicionantes (VM) comprendidos en el
intervalo de -45 a -120 mV. Las constantes de tiempo para estos
procesos se obtuvieron ajustando a una exponencial simple el
valor del pico de la corriente en función del tiempo. En la
figura 11 se muestran los valores de las constantes de tiempo
(n=3) del desarrollo y de la desaparición de la inactivación en
función del potencial de membrana.
48
Figura 10. A: Registros de corriente (trazos inferiores) y protocolo de pulsos (trazos superiores) utilizados para estudiar la inactivación en estado estable. B: Registros de corriente (trazos 2 y 4) y protocolos de pulsos (trazos 1 y 3) utilizados para estudiar el desarrollo (2) y la desaparición (4) de la inactivación, respectivamente. Vm: potencial de mantenimiento, VM: potencial condicionante y PP: pulso de prueba. C: Registros de corrientes, obtenidos con el protocolo mostrado en la figura 5C, graficados en una escala de tiempo más expandida para ilustrar el resultado del ajuste de la caída de la corriente a una exponencial simple (trazos superpuestos). Solución de la pipeta: K/Ca-10-8. Solución de perfusión: A y B, O-Na/Cd/TEA, C, O-Na/Cd.
49
Figura 11.
Inactivación en estado estable (I/Imáx, triángulos negros) y constantes de tiempo (TAU) del desarrollo (círculos negros) y de la desaparición (círculos blancos) de la inactivación y del decaimiento (cuadros negros) de la IA. Los datos se obtuvieron con los protocolos mostrados en la figura 10. Las barras representan el error estándar de la media obtenida de tres neuronas. La línea continua que pasa a través de los triángulos negros resulta del ajuste de los datos experimentales a la ecuación 8 (véase en el texto). La línea a través de los datos correspondientes a TAU se ajustó a ojo.
CAPITULO 2
50
RELACIÓN DEL PATRÓN DE DESCARGA DE NEURONAS
DEL OX CON LAS CORRIENTES DE POTASIO.
DIFERENTES PATRONES DE DESCARGA ESPONTÁNEA
Se registró el potencial de membrana en los somas neuronales del
OX utilizando las técnicas de microeléctrodos intracelulares y de
registro en célula completa (whole-cell clamp) en la
configuración de fijación de corriente. La figura 12 muestra los
registros de potencial de membrana obtenidos en 6 células
diferentes. Los registros de la figura 12A fueron obtenidos con
microelectrodos en tres células que presentaban actividad
espontánea: regular (trazo superior), irregular (trazo medio) y
en ráfagas (trazo inferior). La figura 12B muestra registros de
potencial de membrana obtenidos con la técnica de fijación de
corriente en célula completa en tres neuronas que presentan
actividad espontánea: regular (trazo superior), irregular (trazo
medio) y en ráfagas (trazo inferior).
51
Figura 12.
Registros del potencial de membrana obtenidos con microeléctrodos (A) y con la técnica de "whole-cell clamp" en la configuración de fijación de corriente (B), en los somas de 6 neuronas con actividad espontánea. Solución de perfusión: Normal. Solución de las pipetas (B): K/Ca-10-8.
52
CARACTERÍSTICAS DE LAS CORRIENTES DE POTASIO Y SU
RELACIÓN CON EL PATRÓN DE DESCARGA.
A fin de estudiar la relación entre las corrientes de potasio y
las descargas espontáneas de potenciales de acción, se registró
el potencial de membrana en neuronas completas (no axotomizadas)
en la configuración de fijación de corriente, cuando la
preparación se prefundía con solución normal (tabla 3). De esta
manera se identificó el patrón de descarga (figura 12B) y
posteriormente se cambió a la configuración de fijación de
voltaje y, en solución O-Na/Cd (tabla 3), se registraron las
corrientes salientes manteniendo a la neurona a un potencial de
membrana de -50 mV (figura 13A). A continuación se prefundió la
preparación con la solución O-Na/Cd/TEA (tabla 3) y se
registraron las corrientes salientes en respuesta a pulsos
despolarizantes a partir de un potencial de mantenimiento de -100
mV (figura 13).
La curva de la inactivación de la IA en estado estable fue
obtenida en respuesta a pulsos despolarizantes de igual magnitud
aplicados cada 3s a partir de diferentes potenciales de
mantenimiento, como se muestra en la figura 10A, cuando la
preparación era prefundida con la solución O-Na/Cd/TEA (tabla 3).
Se consideraron, con base a la actividad espontánea, dos
grupos neuronales: I) células que descargaban en ráfaga y II)
células que no descargaban en ráfaga.
53
Figura 13
Registros de corrientes salientes, en una neurona no axotomizada en respuesta a pulsos despolarizantes. Solución de perfusión: O-Na/Cd (A) y O-Na/Cd/TEA (B). Solución de la pipeta: K/Ca-l0-8.
54
Relación del patrón de descarga con la IK
Para la IK, se midieron el umbral de activación y la conductancia
a O mV, en 16 neuronas no axotomizadas. No se encontraron
diferencias significativas, en dichos parámetros, entre las
neuronas del grupo I (n=6) y del grupo II (n=10). Para comparar
las medias se utilizó la prueba "t" de Student.
La tabla 4 resume los valores de los parámetros de
activación del rectificador tardío encontrado en esos dos grupos
neuronales.
TABLA 4
PARÁMETROS DE LA ACTIVACIÓN DE LA IK
-----------------------------------------------------------------
GRUPO I (n=6) GRUPO II (n=10)
MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S.
-----------------------------------------------------------------
UMBRAL DE
ACTIVACIÓN -45.0 ± 0.5 -44.5 ± 1.6 0.75<p<0.80 (*)
(mV)
-----------------------------------------------------------------
gK (nS) 26.5 ± 9.1 25.6 ± 17.7 0.80<p<0.90 (*)
a O mV
-----------------------------------------------------------------
(*) Probabilidades de la distribución "t" de Student.
55
Relación del patrón de descarga con la IA
Para estudiar la dependencia de voltaje de la corriente
transitoria, en relación con el patrón de descarga, se midieron:
el umbral de activación, la conductancia a O mV, el punto medio
de la inactivación en estado estable (Vh) y la constante de
tiempo del decaimiento de la IA a O mV (TAUdec). Para medir TAUdec
se ajustó sólo la primera fase de la caída de la corriente a una
exponencial simple, porque, los registros se hicieron en neuronas
no axotomizadas y aparecía un componente de corriente tardío (al
final del pulso) debido probablemente a la falta de control de
voltaje en regiones alejadas del soma neuronal (véase la figura
13B).
Utilizando la prueba "t" de Student, no se encontraron
diferencias significativas, en ninguno de los parámetros
mencionados, entre las neuronas del grupo I (n=6) y del grupo II
(n=10).
La tabla 5 resume los valores de los parámetros de
activación y de inactivación encontrados en estos dos grupos.
56
TABLA 5
PARÁMETROS DE ACTIVACIÓN E INACTIVACIÓN DE LA IA
-----------------------------------------------------------------
GRUPO I (n=6) GRUPO II (n=10)
MEDIA ± D.S. MEDIA ± D.S.
-----------------------------------------------------------------
UMBRAL DE
ACTIVACIÓN -61.7 ± 0.8 -59.1 ± 7.5 0.75<p<0.80 (*)
(mV)
-----------------------------------------------------------------
gA (nS) 89.7 ± 35.9 71.2 ± 26.1 0.80<p<0.90 (*)
a O mV
-----------------------------------------------------------------
Vh (mV) -71.6 ± 10.3 -73.5 ± 9.0 0.60<p<0.70 (*)
-----------------------------------------------------------------
TAUdec (ms) 53.7 ± 34.7 38.2 ± 11.3 0.80<p<0.90 (*)
a O mV
-----------------------------------------------------------------
(*) Probabilidades de la distribución "t" de Student.
CAPITULO 3
57
DEPENDENCIA DE LAS CORRIENTES DE POTASIO CON EL
CALCIO INTRACELULAR.
Los resultados mostrados hasta el momento sugieren que en las
neuronas del OX, las cinéticas de las corrientes de potasio IK e
IA en condiciones de bajo calcio intracelular no difieren entre
las células que descargan ráfagas de potenciales de acción y las
que no lo hacen. Sin embargo en otras preparaciones se ha
encontrado que la concentración intracelular de calcio aumenta
después de cada potencial de acción durante una ráfaga,
produciendo la inactivación de las corrientes de potasio del
rectificador tardío y del rectificador anómalo. Por esta razón se
estudiaron los efectos del aumento en la concentración
intracelular de calcio sobre las cinéticas de las corrientes de
potasio en neuronas axotomizadas. Para ello las células se
dializaron con una solución que contenía calcio a una
concentración de 10-6 mol/l (tabla 2) y se registraron las
corrientes de potasio como se describió anteriormente.
EFECTOS DEL CALCIO INTRACELULAR SOBRE EL RECTIFICADOR TARDÍO.
Durante los pulsos de prueba, la corriente del rectificador
tardío se activaba más rápidamente que en condiciones de bajo
calcio, alcanzaba un máximo y luego decaía lentamente hasta
alcanzar la mitad de su amplitud en aproximadamente 0.55 s, a 16
mV. La figura 14A muestra registros de corrientes salientes, a
tres potenciales de membrana
58
diferentes, en una neurona en condiciones de alto calcio
intracelular (10-6 mol/l) y en otra célula a una concentración
intracelular de calcio menor (1O-8 mol/l). Los trazos fueron
escalados y superpuestos para su comparación. En este caso, no
fue posible ajustar los registros de corrientes al modelo de
Hodgkin y Huxley. Por lo tanto, la gK obtenida en condiciones de
alto calcio intracelular, se calculó a partir de los valores
obtenidos de la medición de la corriente al pico utilizando la
ecuación (2), en 4 neuronas a diferentes potenciales de membrana.
Los valores promedio de gK (n=4) se ajustaron con la ecuación de
Boltzmann (ecuación 3). Las relaciones gK-Em, obtenidas en bajo y
en alto calcio intracelular, se ilustran en la figura 15.
59
Figura 14.
Registros de corriente saliente, IK (A) e IA (B) obtenidos de dos neuronas con diferente concentración intracelular de calcio, 10-8 mol/l y 10-6 mol/l (trazos señaladas con un punto), a los potenciales de membrana indicados. Los registros de corriente se escalaron a su valor máximo y se sobrepusieron para su comparación. Solución de perfusión: O-Na/Cd.
60
Figura 15.
Relaciones gK-Em obtenidas en bajo (círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio intracelular. Las barras representan la desviación estándar de la media obtenida de 4 neuronas diferentes en cada caso. Las curvas (línea punteada, bajo calcio; línea continua, alto calcio) son los resultados de los ajustes de los datos experimentales a la ecuación 3 (véase en el texto). Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: O-Na/Cd.
61
En la tabla 6 se resumen los valores de los parámetros de
activación de la IK obtenidos a partir de los ajustes con la
ecuación de Boltzmann, en condiciones de bajo y alto calcio
intracelular.
TABLA 6: EFECTOS DEL CALCIO SOBRE LA ACTIVACIÓN DE IK
-----------------------------------------------------
BAJO Ca ALTO Ca
-----------------------------------------------------
GK (mS/µF) 0.357 0.327
VO (mV) -6.9 -10.2
z (*) 2.62 2.55
-----------------------------------------------------
(*) z=k*RT/F.
62
EFECTOS DEL CALCIO INTRACELULAR SOBRE EL COMPONENTE
TRANSITORIO DE LA CORRIENTE DE POTASIO.
Cuando se aumentó la concentración de calcio intracelular (10-6
mol/l) aumento el valor al pico de la IA, que se alcanzaba en un
tiempo menor. No se encontraron cambios significativos en la
constante de tiempo de activación (ϒm) y la IA decaía más
rápidamente que en condiciones de bajo calcio a todos los
potenciales de membrana estudiados. La figura 14B muestra
registros superpuestos de la corriente-A de dos neuronas en
condiciones de alto y bajo calcio intracelular, a tres
potenciales de membrana diferentes. Los registros fueron
escalados a su valor máximo, para comparar el curso temporal de
la activación y de la inactivación.
Efectuando el mismo análisis que se utilizó para bajo calcio
intracelular, se obtuvo la relación gA-Em para la media de los
valores obtenidos de 4 neuronas en condiciones de alto calcio
intracelular. Del ajuste con la ecuación de Boltzmann se
obtuvieron los siguientes valores: GA=1.567 mS/µF, VO=3.9 mV y
K*=0.0673 (z=1.70). En la figura 16 se muestran las relaciones gA-
Em en bajo y en alto calcio intracelular, así como las curvas
obtenidas con la ecuación de Boltzmann.
63
Figura 16.
Relaciones gA-Em obtenidas en bajo (círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio intracelular. Las barras representan la desviación estándar de la media obtenida de 4 neuronas diferentes en cada caso. Las curvas (línea punteada, bajo calcio; línea continua, alto calcio) son los resultados de los ajustes de la ecuación 3 a los datos experimentales (véase en el texto). Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: O-Na/Cd.
64
Para el estudio de los procesos de inactivación se
utilizaron protocolos similares a los que se muestran en las
figuras l0A y 10C. La curva de inactivaciún en estado estable con
una concentración de alto calcio interno fue menos "inclinada" y
se desplazó hacia potenciales más positivos con respecto a bajo
calcio. Los valores de los parámetros de inactivación en estado
estable en condiciones de alto calcio fueron: Vh=-75.O mV y
k*=0.0899 mV-1 (z=2.27). La figura 17 muestra las curvas de
inactivación en estado estable obtenidas en bajo y en alto calcio
intracelular.
La constante de tiempo de la inactivación (ϒh) de la I A en
alto calcio fue menor que la obtenida en bajo calcio para todos
los potenciales de membrana estudiados. Para potenciales de
membrana entre -32 y 22 mV, la ϒh fue 53 ± 8% menor en
condiciones de alto calcio en relación al valor obtenido en bajo
calcio. En la figura 18 se muestran las relaciones entre ϒh y el
potencial de membrana obtenidas en dos células representativas en
condiciones de bajo y alto calcio intracelular.
65
Figura 17.
Inactivación en estado estable de la IA en bajo (círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio intracelular. Las barras representan la desviación estándar de la media obtenida de 3 neuronas diferentes. Las curvas (línea punteada, bajo calcio; línea continua, alto calcio) son los resultados de los ajustes de la ecuación 8 a los datos experimentales (véase en el texto). Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: O-Na/Cd/TEA.
66
Figura 18.
Constantes de tiempo de inactivación (TAUdec) de la IA en dos neuronas diferentes en condiciones de bajo (círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio intracelular, a diferentes potenciales de membrana. Las líneas punteada y continua fueron ajustadas a ojo. Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: O-Na/Cd.
67
En la tabla 7 se resumen los valores de los parámetros de
activación y de inactivación de la IA, en bajo y alto calcio
intracelular, los cuales fueron obtenidos a partir de la ecuación
de Boltzmann.
TABLA 7: EFECTOS DEL CALCIO SOBRE LA IA
-----------------------------------------------------------------
ACTIVACIÓN INACTIVACIÓN
BAJO Ca ALTO Ca BAJO Ca ALTO Ca
-----------------------------------------------------------------
GA (mS/µF) 0.924 1.567 ----- -----
VO,Vh (mV) -7.0 3.9 -85.3 -75.0
z (*) 1.74 1.70 3.87 2.27
-----------------------------------------------------------------
(*) z=k*RT/F.
DISCUSIÓN
68
Separación de dos componentes de la corriente de potasio.
En el presente estudio se muestra que en las neuronas del OX de
acocil, pueden ser separados dos corrientes de potasio, IK e IA,
con base en su dependencia del tiempo y del voltaje, en forma
similar a lo descrito en otras preparaciones: Anisodoris (Connor
y Stevens, 1971b), Helix pomatia (Neher, 1971) y neuronas del
ganglio cervical superior de la rata (Belluzzi y cols., 1985a y
b).
Los resultados mostrados en este trabajo confirman las
propiedades del rectificador tardío y de la corriente transitoria
de potasio reportadas previamente (Onetti, 1989, Dnetti y cols.,
1990). El componente rápido y transitorio (IA) de la corriente
saliente es semejante al descrito en varias especies de moluscos
(Hagiwara y cols., 1961; Stevens, 1969; Connor y Stevens, 1971b;
Gola y Romey, 1971; Neher, 1971) y de vertebrados (Belluzzi y
cols., 1985a). El componente lento (IK) es semejante al
rectificador tardío descrito por otros autores (Hodgkin y Huxley,
1952; Connor y Stevens, 1971a; Thompson, 1977; Belluzzi y cols.,
1985b).
Es importante señalar que los pulsos condicionantes (a -100
mV) aplicados para reactivar parte de los canales de la IA no
modificaron la amplitud ni el curso temporal del rectificador
tardío, lo que permitió obtener la IA pura restando los trazos de
la corriente obtenidos a un potencial de mantenimiento de -50 mV
de los correspondientes obtenidos a -100 mV. Otra manera de
obtener la IA sería agregando TEA (20 mM) al baño, para bloquear
69
el rectificador tardío, con el inconveniente de que el bloqueo no
es total y depende del potencial de membrana (Onetti, 1989).
Cinética de las corrientes de potasio
En este trabajo se muestra que, en las neuronas del OX, la
conductancia de los canales del rectificador tardío puede ser
descrita por la ecuación de Hodgkin y Huxley (1952): gK = GKn4. La
conductancia en estado estable (como una función del potencial de
membrana) puede ser descrita por una distribución de Boltzmann
para una partícula única con una valencia efectiva de 2.62. La gK
alcanza un valor máximo de 0.357 mS/µF a un potencial de membrana
cercano a 40 mV. La constante de tiempo de la activación de la IK
es dependiente de voltaje; los valores encontrados fueron de 17.5
a 0.9 ms para potenciales de membrana entre -20 y 22 mV. Estos
datos son similares a los reportados en neuronas simpáticas de la
rata (Galvan y Sedlmeir, 1994; Belluzzi y cols., 1985b), de la
rana toro (Adams y cols., 1982) y en las neuronas piramidales del
hipocampo (Segal y Barker, 1984). El rectificador tardío del OX
no se inactiva apreciablemente durante un pulso de 160 ms. Sin
embargo, otros autores han reportado un decaimiento de la
corriente del rectificador tardío durante despolarizaciones
prolongadas (Heyer y Lux, 1976; Thompson, 1977; Aldrich y cols,
1978; Adams y cols. 1982).
Los resultados presentados en este trabajo muestran que, en
neuronas del OX, la gA puede ser descrita como un
70
producto de los parámetros de activación e inactivación, por la
ecuación: gA=GAm4h. Ambos procesos son dependientes del tiempo y
del voltaje. Tanto la activación como la inactivación en estado
estable de la gA pueden ser descritas por distribuciones de
Boltzmann para partículas únicas con valencias de 1.74 y 3.87,
respectivamente. La gA alcanza un máximo de 0.924 mS/µF a
potenciales de membrana más positivos que 50 mV. La IA presenta
una fase de subida sigmoidal y un decaimiento exponencial. La
constante de tiempo de activación de la IA es dependiente del
voltaje, los valores obtenidos fueron de 3.5 a 1.5 ms para
potenciales entre -32 y 22 mV. En diversas preparaciones se han
reportado valores que varían entre 2 y 20 ms (Rudy, 1988). En
somas neuronales de Anisodoris, Connor (1980) reportó un valor de
la constante de tiempo de activación de 3 ms para todos los
potenciales de membrana. En los axones de crustáceos, los valores
varían entre 3.4 y 1.6 ms para potenciales entre -80 y 20 mV
(Connor, 1980). En neuronas del OX, el punto medio de la
inactivación en estado estable se encuentra a potenciales de
membrana alrededor de -85 mV. En otras preparaciones se ha
calculado el punto medio de la inactivación en estado estable de
la IA; así, en neuronas del ganglio simpático de rata se reportó
un valor de -78 mV (Belluzzi y cols. 19B5a), -65 mV en el Helix
pomatia (Neher, 1971) -75 mV en Anisodoris (Connor y Stevens,
1971c) y -65 mV en Tritonia (Getting, 1983). Las constantes de
tiempo de la inactivación de la IA en las neuronas del OX, variaron
71
entre 125.5 y 9.3 ms para potenciales de membrana entre -32 y 22
mV. Para potenciales de membrana entre -60 y -40 mV, los valores
de la constante de tiempo del desarrollo de la inactivación
fueron de 869 a 162 ms, y para la desaparición de la
inactivación, entre -120 y -70 mV, fueron de 62.3 a 347 ms. Estos
valores de las constantes de tiempo del desarrollo y la
desaparición de la inactivación son semejantes a los obtenidos
por Neher (1971) en neuronas de Helix pomatia.
Características de las corrientes de potasio y su relación con el
patrón de descarga.
Los diferentes patrones de actividad eléctrica en las neuronas
del OX de acocil reportados en este trabajo, son similares a los
reportados previamente por Onetti (1989).
El umbral de activación y la conductancia en estado estable
(a O mV) del rectificador tardío de las células del grupo I (que
descargan en ráfagas) es prácticamente el mismo que para las
células del grupo II (que no descargan ráfagas). El umbral de
activación, la conductancia en estado estable a O mV, el punto
medio de la inactivación en estado estable y la constante de
tiempo del decaimiento de la IA no fueron significativamente
diferentes entre las neuronas de los grupos I y II.
Aunque las mediciones realizadas para comparar las
diferencias entre las neuronas de ambos grupos se efectuaron en
células que no fueron axotomizadas, lo que dificulta la
72
medición de dichos parámetros, los resultados presentados
permiten sugerir hasta este momento que la cinética de activación
de la IK e IA y la cinética de inactivación de la IA, en bajo
calcio intracelular, no difieren entre las neuronas del OX con
diferentes patrones de actividad.
Efectos del aumento del calcio intracelular sobre las corrientes
de potasio.
Para estudiar los efectos del aumento de la concentración
intracelular de calcio sobre la cinéticas de las corrientes de
potasio IK e IA se utilizó una solución interna que contenía
calcio a una concentración de 10-6 M. Dicha concentración se
encuentra dentro de los valores fisiológicos. Hofmeir y Lux
(1981) encontraron que l a concentración de Ca2+ intracelular
medida con microelctrodos a cierta distancia de la membrana
aumentaba de un valor menor que 3x10-7 M en reposo a 10-6 M al
aplicar pulsos despolarizantes y estimaron que en las
proximidades de la cara interna de la membrana celular la
concentración de Ca2+ podría elevarse hasta alcanzar un valor de
30x10-6 M después de un pulso de voltaje de 20 ms de duración.
En el presente estudio se muestra que el calcio intracelular
modula la cinética de las corrientes de potasio en las neuronas
del OX de acocil, acelerando los procesos de inactivación. En
condiciones de alto calcio intracelular se observa una
considerable inactivación de la IK durante los pulsos de prueba
(50% del pico de corriente en 550 ms a
73
16 mV, veáse figura 14A) que no aparece en bajo calcio
intracelular. La inactivación de las corrientes de potasio
dependientes de voltaje por el Ca2+ intracelular y por otros
cationes divalentes ha sido descrita en diferentes células
(Eckert y Lux, 1977; Matsuda y cols., 1987; Kramer y Levitan,
198B). El estudio de la modulación del componente lento de la
corriente de potasio por el calcio intracelular en diferentes
preparaciones ha generado resultados opuestos; en axón gigante de
calamar los cambios en la concentración intracelular de calcio no
alteran la corriente del rectificador tardío (Begenisich y Lynch,
1974), mientras que en neuronas de Helix pomatia, la inyección de
calcio intracelular reduce la corriente neta de salida y
especialmente la del rectificador tardío (Heyer y Lux, 1976). Por
otro lado, se ha sugerido que el aumento en la concentración
intracelular de calcio que ocurre durante un tren de impulsos en
las neuronas de Helix aspersa, incrementa la conductancia para el
potasio (Meech y Standen, 1975) Sin embargo, el incremento del
calcio intracelular en neuronas del OX de acocil no afecta la
conductancia máxima ni la valencia efectiva de la compuerta de
activación de la corriente del rectificador tardío. Estas
observaciones sugieren que el calcio intracelular a una
concentración de 1 µM no es suficiente para activar alguna
posible conductancia a potasio dependiente de calcio.
El aumento de la conductancia máxima del componente
transitorio (GA) en presencia de alto calcio intracelular
74
(de 0.9 a 1.5 mS/µF) sin cambio en la valencia de la compuerta de
activación, puede ser debido al desplazamiento positivo de la
curva de inactivación (10.3 mV); es decir que, en condiciones de
alto calcio se encontraría una mayor proporción de canales
disponibles para ser activados que los que se encuentran en bajo
calcio para los mismos potenciales de membrana. Otra posibilidad
es que el aumento del calcio intracelular desenmascare una
población de canales con cinética semejante a los canales "A".
Varios autores han reportado en diferentes tipos celulares
(véase, Rudy, 1988), corrientes dependientes de calcio
intracelular similares a la IA.
Por otro lado, la inactivación de los canales para la IA por
calcio intracelular y por otros segundos mensajeros ha sido
estudiada en algunas preparaciones. En fotorreceptores de
Hermissenda, la disminución en la amplitud y la aceleración de la
cinética de inactivación de la IA pueden ser causadas por
despolarizaciones prolongadas y por el influjo de calcio (Alkon y
cols., 1982).
En neuronas "bag" de Aplysia se ha reportado que la
forscolina, un activador de la ciclasa de adenilato, disminuye la
constante de tiempo de la inactivaciún de la IA, pero no afecta
el proceso de activación ni el de inactivaciún en estado estable
(Strong, 1984).
Los cambios en las corrientes de potasio, producidos por un
aumento en la concentración intracelular de calcio, reportados en
el presente trabajo pueden ser debidos a
75
modificaciones de la compuerta de inactivación más que a cambios
en los procesos de activación. Tales modificaciones pudieran ser
el resultado de la unión del calcio a un sitio específico de la
compuerta de la inactivación o a cambios en el estado de
fosforilación de los canales de potasio, mediados por cinasas o
fosfatasas dependientes de calcio.
Sin embargo, como en las neuronas de moluscos (Strong,
1984), la IA en el OX puede ser registrada durante mucho tiempo
dializando el interior celular sin sufrir una disminución
importante en su amplitud, esto sugiere que el mantenimiento de
esta corriente no requiere de la activación continua de una
cinasa.
Importancia fisiológica.
En las neuronas de moluscos, los potenciales de acción
repetitivos dan como resultado la inactivación del rectificador
tardío; asimismo, los pulsos de voltaje repetidos que inactivan a
la IK producen un aumento en la duración del potencial de acción
(Aldrich y cols., 1979). La IA parece ser la corriente
predominante que determina la duración del intervalo entre los
potenciales de acción, ya que: 1) se encuentra parcialmente
inactivada al potencial de reposo, 2) parte de esa inactivación
desaparece durante la hiperpolarización posterior al potencial de
acción y 3) el curso temporal de la despolarización lenta durante
el intervalo entre espigas está determinado por la amplitud y
76
la cinética de activación y de inactivación de la IA (Connor,
1978).
De los resultados presentados en este trabajo se sugiere que
los diferentes patrones de descarga de las neuronas del OX, no se
deben a diferencias en las cinéticas de los canales de potasio,
sino que el calcio libre intracelular, al modificar la
inactivación de las corrientes de potasio, regularía la duración
y la frecuencia de los potenciales de acción. En particular en
las células que descargan ráfagas, el calcio que entra durante
cada potencial de acción produciría: 1) la inactivación del
rectificador tardío, aumentando la duración de la siguiente
espiga, 2) el desplazamiento de la curva de inactivación en
estado estable de la IA a potenciales de membrana más positivos,
lo que quitaría parte de la inactivación de esa corriente
"permitiendo" su participación en los potenciales de acción y 3)
la disminución de la constante de tiempo de inactivación de la
IA, acortando el retardo del siguiente potencial de acción. Este
proceso podría ser acumulativo hasta el final de la ráfaga.
En neuronas del OX, se ha observado un aumento progresivo en
la duración del potencial de acción y un incremento en la
frecuencia de descarga durante una ráfaga (datos no presentados).
Estas observaciones concuerdan con las modificaciones de la
cinética de las corrientes de potasio observadas al aumentar el
calcio intracelular.
77
Si bien el calcio intracelular parecería modular la cinética
de las corrientes de potasio, se desconocen los mecanismos que
regulan su concentración.
Aunque en el presente trabajo sólo se describen dos
corrientes de potasio en relación al patrón de descarga, no puede
descartarse la participación de otras corrientes de potasio como
se ha descrito en diferentes preparaciones neuronales.
RESUMEN Y
CONCLUSIONES
78
En las neuronas del OX de acocil, pueden separase dos corrientes
de potasio : corriente del rectificador tardío (IK) y corriente
transitoria (IA), con las siguientes características:
1) La IK se activa a potenciales más positivos que -40 mV y no se
inactiva apreciablemente para valores del potencial de membrana
entre -40 y 22 mV.
2) La conductancia de los canales del rectificador tardío puede
ser descrita por la ecuación: gK = Gkn4, donde "n" representa el
parámetro de activación.
3) El proceso de activación de la IK es dependiente de voltaje.
Las constantes de tiempo de activación fueron de 17.5 a 0.9 ms
para potenciales de membrana entre -20 y 22 mV.
4) La conductancia en estado estable de la IK puede ser descrita
por una distribución de Boltzmann:
gK = GK1+exp[(VO-V)zF/RT]-1, para una partícula única con una
valencia efectiva z de 2.62, conductancia máxima GK de 0.357
mS/µF y VO de -6.9 mV.
5) No existen diferencias significativas en el umbral de
activación ni en la conductancia (a O mV) de la IK entre las
neuronas que descargan en ráfagas y las que no lo hacen.
79
6) Al aumentar la concentración intracelular de Ca2+ (de 10-8 a 10-6
M) no se modifican apreciablemente la GK (0.327 mS/µF) ni la
valencia (2.55); mientras que el punto medio de la activación en
estado estable se desplaza a potenciales más negativos (-10.2
mV).
7) La IA se activa a partir de potenciales más negativos que -50
mV y se inactiva totalmente a potenciales más positivos que -50
mV.
8) La gA puede ser descrita como el producto independiente de los
parámetros de activación y de inactivación, por la ecuación:
gA=GAm4h, donde "m" representa el parámetro de tiempo de
activación y "h" el de inactivación.
9) Los procesos de activación y de inactivación de la IA son
dependientes del tiempo y del voltaje. Las constantes de tiempo
de la activación de la IA varían entre 3.5 y 1.5 ms para
potenciales entre -32 y 22 mV. Las constantes de tiempo del
desarrollo de la inactivación varían entre 669 y 9.3 ms para
potenciales de membrana entre -60 y 22 mV; y para la desaparición
de la inactivación varían entre 62.3 y 869 ms, para potenciales
de membrana entre -120 y -60 mV.
10) La activación de la gA en estado estable, puede ser descrita
por una distribución de Boltzmann para una
80
partícula única con valencia de 1.74, GA de 0.924 mS/µF y VO de -
7 mV.
11) La inactivación de la gA en estado estable, puede ser
descrita por una distribución de Boltzmann:
h∞ = (1+exp[(V-Vh)zF/RT]-1, con z de 3.87 y Vh de -85.3 mV.
12) No existen diferencias significativas en el umbral de
activación, en la conductancia (a O mV), en el punto medio de la
inactivación en estado estable ni en la constante de tiempo de la
inactivación de la IA entre las neuronas que descargan en ráfagas
y las que no lo hacen.
13) Al aumentar la concentración intracelular de Ca (de 10-8 a 10-6
M) no se modifica apreciablemente la valencia de la compuerta de
activación de la IA (1.70); mientras que la valencia de la
compuerta de la inactivación disminuye (2.27), la GA aumenta un
69% (1.567 mS/µF) y los puntos medios de activación e
inactivación en estado estable se desplazan a valores de
potencial más positivos (3.9 y -75 mV, respectivamente).
14) Al aumentar la concentración intracelular de Ca (de 10-8 a 10-6
M), las constantes de tiempo de la inactivación de la IA se
reducen en aproximadamente un 53% a potenciales de membrana entre
-32 y 22 mV.
81
De los resultados presentados en este estudio se puede
concluir lo siguiente:
1) Las propiedades cinéticas de las corrientes de potasio en las
neuronas del OX de acocil, son semejantes a las reportadas por
otros autores para la corriente del rectificador tardío y para la
corriente transitoria de potasio en otras preparaciones
neuronales.
2) La cinética de activación de la IK e IA y la cinética de la
inactivación de la IA, en bajo calcio intracelular, no son
determinantes para la generación de los diferentes patrones de
actividad de las neuronas del OX de acocil.
3) El calcio intracelular puede modular la duración y la
frecuencia de los potenciales de acción en las neuronas del OX de
acocil, en particular en las neuronas que tienen la capacidad de
descargar ráfagas de potenciales de acción, acelerando los
procesos de inactivaciún de las corrientes de potasio (IK e IA).
PERSPECTIVAS
82
El sistema neurosecretor OX-GS del acocil y en particular
las neuronas del OX constituyen un excelente modelo para el
estudio de los fenómenos involucrados en la actividad marcapaso y
su correlación con la secreción de hormonas.
Con el fin de entender mejor la importancia fisiológica de
este acumulo de neuronas y de los diferentes patrones de descarga
que presentan, es conveniente profundizar en el estudio de los
factores que se encuentran relacionados con su actividad
electrofisiológica.
Se sabe que existe una estrecha relación entre la cinética
de las corrientes de potasio y la morfología de los potenciales
de acción espontáneos, por lo que los cambios en la cinética de
estas corrientes dan como resultado cambios en el patrón de
descarga.
En el OX del acocil sólo se han reportado dos componentes de
la corriente saliente, pero no se puede descartar la posibilidad
de que en estas células participen otras corrientes salientes en
la modulación de la actividad eléctrica.
Por otro lado es probable que las hormonas peptídicas que
libera el sistema OX-GS puedan modular las corrientes de potasio
de las propias neuronas del OX.
El estudio de la modulación de las corrientes por segundos
mensajeros puede realizarse manipulando los principales sistemas
de proteínas cinasas como son la proteína cinasa C, las cinasas
dependientes de nucleótidos cíclicos y/o las cinasas dependientes
de calcio/calmodulina.
83
El estudio de la cinética de estas corrientes y de su
modulación puede complementarse con el estudio de la cinética de
los canales unitarios que permitan establecer los mecanismos de
acción de los diferentes agentes moduladores.
A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo
y de los obtenidos por otros autores en diferentes preparaciones,
se sugieren al menos tres líneas de estudio:
1. Estudiar otras corrientes de potasio y su relación con el
patrón de descarga.
2. Estudiar la modulación de la cinética de las corrientes
de potasio por neurotransmisores, segundos mensajeros y hormonas.
3. Estudiar la cinética y modulación de canales unitarios de
potasio.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
84
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