UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE …repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/28389/1/BCIEQ-T-0258...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MODALIDAD: (INVESTIGACIÓN)

TEMA:

COMPROBACIÓN DEL EFECTO CICATRIZANTE DE LOS EXTRACTOS

ETANÓLICO DEL CLADODIO DEL NOPAL (Opuntia ficus indica L) EN

RATONES DE EXPERIMENTACIÓN.

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITOPREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACEUTICO

AUTORES:JENNIFER JOANA GARCÍA DELGADO

THAILÍ ANNABELL PONCE BELTRÁN

TUTOR:Q.F MARIA DEL CARMEN VILLACRES Ph.D

CO-TUTOR:Q.F GLENDA SARMIENTO M.Sc

GUAYAQUIL - ECUADOR

2017

AGRADECIMIENTO

Gracias a Dios por sus bendiciones, y haberme dado el don de la vida, quien

permitió darme sabiduría para lograr alcanzar esta meta.

Agradecida con mis padres por su apoyo incondicional, por demostrarme que

nada es fácil en la vida todo lo bueno merece sacrificio y constancia diaria.

A mi tía María Beltrán por acompañarme en mis primeros años de estudio.

A mi Tutura: Dra. María del Carmen Villacres por sus acertados soportes

académicos en la fase total de mi tesis.

A la Dra. Glenda Sarmiento por ayudarme en el Análisis Farmacológico.

A la Dra. Patricia Manzano por su aporte en el Análisis Cromatográfico.

Al Dr. Oswaldo Pesantes por su gentileza de facilitarme el ingreso al Laboratorio

de Productos Naturales.

A la Dra. Zoraida Burbano por apoyarme en el Análisis del Control de Calidad.

A mí compañera de Tesis Jennifer García por compartir sus valiosos

conocimientos para el desarrollo de nuestro trabajo gracias por ser una gran

amiga. A mi compañero Luis Proaño por ayudarme en la parte de experimentación.

Thailí Ponce Beltrán

AGRADECIMIENTO

Agradezco a Dios por abrirme puertas y oportunidades para llegar a este momento

de mi carrera. A mis padres por apoyo en todo momento, a mi esposo e hijos por

la motivación diaria. A mi tutora Dra Maria del Carmen Villacres y mi co-tutora la

Dra Glenda Sarmiento por los conocimientos otorgados y por estar siempre

prestas a ayudarnos. Al INSPI por la ayuda brindada para la realización de la tesis,

y a los laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas que nos permitieron la

realización de los ensayos.

Jennifer García Delgado

DEDICATORIA

Como siempre, primero Dios, todos mis logros son gracias a las fuerzas y

sabiduría con la que me levanta cada día, por protegerme en cada paso y

mantenerme firme en mis sueños, por ello este momento es dedicado a Él.

A mi madre, mujer luchadora, a mi padre, hombre ejemplar, ambos con su apoyo

constante me han llevado a donde estoy ahora, confiando en mí en cada paso,

animándome a salir adelante, enseñándome los valores necesarios.

A mi esposo, amor de mi vida, por su apoyo incondicional desde el primer

momento hasta el sol de hoy, por sus deseos de verme exitosa y salir adelante

juntos, por su paciencia infinita que me ha permitido llegar a este punto en mi

carrera.

A mis hijos, Román y Mateo, motor de mi vida, razón para salir adelante, se lo

dedico a ellos por los días y noches de ausencia. A la señora Rosa Macías que

fue parte fundamental para lograr mi objetivo.

A personas que me han ayudado en este proceso, mi compañera Thaili Ponce,

amiga de verdad, que siempre entendió mis responsabilidades y se ajustó a mi

tiempo, además a mis amigos, Luis Proaño, Juliana Lema, que de una u otra forma

siempre han estado para ayudarme.

Jennifer García Delgado

DEDICATORIA

Dedico esta tesis con mucho amor a Dios, por la vida y por permitirme

cumplir uno de mis objetivos propuestos.

A mi querida madre Libia Beltrán por ser el pilar fundamental en mi vida,

gracias por tu dedicación y ejemplo, eres la madre que todo hijo desearía

tener que afortunada me siento de ser tu hija nunca me cansare de

agradecerte lo buena que eres te amo. A mi padre Alberto Ponce por estar

siempre apoyándome en cada decisión que he tomado. A mi tía María a

quien quiero como una madre y siempre ha estado pendiente de mí. A mi

abuelita Noemí Rodríguez por ser quien me motiva a nunca rendirme.

Thailí Ponce Beltrán

ÍNDICE

RESUMEN............................................................................................................ I

ABSTRACT ......................................................................................................... II

CAPITULO I......................................................................................................... 1

I. INTRODUCCIÓN.......................................................................................... 1

I.1 PROBLEMA.................................................................................................... 2

I.2 HIPÓTESIS .................................................................................................... 4

I.3 OBJETIVOS ................................................................................................... 4

I.3.1 Generales................................................................................................. 4

I.3.2 Específicos............................................................................................... 4

CAPITULO II........................................................................................................ 5

II. MARCO TEÓRICO....................................................................................... 5

I.1 Nopal..................................................................................................... 5

II.1.1 Descripción taxonómica.................................................................. 5

II.1.2 Taxonomía ..................................................................................... 5

II.1.3 Habitad........................................................................................... 6

II.1.4 Actividad farmacológica.................................................................. 7

II.1.5 Composición química ..................................................................... 9

II.1.5.1 Piel.............................................................................................. 10

II.1.5.2 Cáscara ...................................................................................... 10

II.1.5.3 Pulpa .......................................................................................... 11

II.1.6 Usos Étnomedicinales ....................................................................... 12

II.2 Cicatrices ................................................................................................. 13

II.2.1 Definición........................................................................................... 13

II.2.2 Clasificación del proceso de cicatrización .......................................... 13

II.2.3 Proceso de cicatrización .................................................................... 14

CAPITULO III..................................................................................................... 16

III. METODOLOGÍA ..................................................................................... 16

III.1 Tipo de investigación y técnica................................................................ 16

III.2 Variables de la investigación ................................................................... 16

III.2.1 Variable dependiente ........................................................................ 16

III.2.2 Variable independiente ..................................................................... 16

III.2.3 Variable interviniente ........................................................................ 16

II.2.4 Operacionalización de las variables................................................... 17

III.3 Desarrollo de la parte experimental ......................................................... 18

III.3.1 Recolección de la especie vegetal .................................................... 18

III.3.2 Preparación del material vegetal y obtención de extracto etanólico de

los cladodios de la Opuntia ficus indica L. .................................................. 18

III.3.3 Control de calidad del extracto etanólico del cladodio....................... 19

III.3.3.1 Determinación de las características organolépticas................. 19

III.3.3.2 Determinación del índice de refracción.................................. 19

III.3.3.3 Determinación del pH ............................................................ 20

III.3.3.4 Determinación de la densidad relativa. .................................. 20

III.3.3.5 Determinación de Sólidos totales. ......................................... 21

III.3.3.6 Cuantificación de flavonoides ................................................ 22

III.3.3.7 Determinación de flavonoides................................................ 23

III.3.3.8 Cuantificación de polisacáridos ............................................. 24

III.3.4 Pruebas de control de calidad del cladodio de la muestra

pulverizada. ................................................................................................ 25

III.3.4.1 Determinación del contenido de humedad............................. 25

III.3.4.2 Determinación de cenizas totales .......................................... 26

III.3.4.3 Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico. .... 26

III.3.4.4 Sustancias solubles o extraíbles............................................ 27

III.3.5 Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico

28

III.3.5.1 Ensayo de Shinoda (Flavonoides) ......................................... 28

III.3.5.2 Ensayo de Mayer, Dragendorff y/o Wagner. (Alcaloides)....... 28

III.3.5.3 Ensayo de Liberman- Buchard (Triterpenos Y/O Esteroides) 29

III.3.5.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas) ......................................... 29

III.3.5.5 Ensayo de Fehling................................................................. 29

III.3.5.6 Ensayo de resinas................................................................. 30

III.3.5.7 Ensayo de Baljet (Cumarinas) ............................................... 30

III.3.5.8 Ensayo de Espuma (Saponinas) ........................................... 30

III.3.5.9 Ensayo de Cloruro Férrico (Taninos) ..................................... 30

III.3.5.10 Ensayo de Antocianidinas ..................................................... 31

III.3.5.11 Ensayo de Mucílagos. ........................................................... 31

III.3.6 Parámetros Macromorfológicos .................................................... 31

III.3.7 Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)

................................................................................................................... 31

III.3.7 Evaluación del ensayo pre-clínico: determinación del efecto

cicatrizante ................................................................................................. 33

CAPITULO IV .................................................................................................... 35

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 35

IV.1 Análisis organoléptico.......................................................................... 35

IV.2 Parámetros Macromorfológicos ........................................................... 36

IV.3 Tamizaje fitoquímico............................................................................ 37

IV.4 Humedad............................................................................................. 38

IV.5 Cenizas totales .................................................................................... 39

IV.6 Cenizas insolubles en HCl ................................................................... 40

IV.7 Sustancias solubles............................................................................. 41

IV.8 Densidad ............................................................................................. 42

IV.9 pH........................................................................................................ 43

IV.10 Índice de refracción.......................................................................... 43

IV.11 Solidos totales.................................................................................. 43

IV.12 Cuantificación de flavonoides........................................................... 45

IV.13 Determinación de flavonoides .......................................................... 47

IV.14 Cuantificación de polisacáridos........................................................ 47

IV.15 Efecto cicatrizante del extracto etanólico de la tuna en ratones de

experimentación............................................................................................. 52

V. CONCLUSIONES....................................................................................... 61

VI. RECOMENDACIONES ........................................................................... 63

ANEXOS ........................................................................................................... 67

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I : Clasificación taxonómica de la tuna....................................................... 5

Tabla II Composición química de la Tuna............................................................ 9

Tabla III Composición química de la piel de la tuna........................................... 10

Tabla IV Composición química de la cascara de la tuna.................................... 10

Tabla V composición química de la pulpa de la tuna ......................................... 11

Tabla VI Cuadro de Operacionalización de las variables................................... 17

Tabla VII Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM).................................. 32

Tabla VIII: Evaluación del proceso de cicatrización en cada grupo experimental

mediante la aplicación de cada uno de los materiales. ...................................... 34

Tabla IX: Resultados De Los Caracteres Organolepticos del extracto de los

cladodios de Opuntia ficus indica L.................................................................... 35

Tabla X: Análisis macromorfologico de la Opuntia ficus indica L. ...................... 36

Tabla XI: Resultados del Tamizaje fotoquímico del extracto etanólico del cladodio

.......................................................................................................................... 37

Tabla XII: Resultados de Humedad del cladodio pulverizado y secado............. 38

Tabla XIII: Resultados de Cenizas Totales del cladodio pulverizado y secado.. 39

Tabla XIV: Resultados de Cenizas Insolubles en HCl del cladodio pulverizado y

secado............................................................................................................... 40

Tabla XV: Resultados de Sustancias Solubles de cladodio secado y pulverizado

.......................................................................................................................... 41

Tabla XVI: Resultados de la densidad del extracto etanólico de cladodio ......... 42

Tabla XVII: Lecturas de pH del extracto etanólico de cladodio.......................... 43

Tabla XVIII: Lectura del índice de refracción del extracto etanólico de cladodio 43

Tabla XIX: Resultados de Solidos Totales del extracto etanólico de cladodio ... 44

Tabla XX: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico

.......................................................................................................................... 45

Tabla XXI: Resultado de la cantidad de flavonoides en el cladodio.................. 46

Tabla XXII: Resultados de la determinación de flavonoides utilizando

cromatografía capilar ......................................................................................... 47

Tabla XXIII: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico

.......................................................................................................................... 48

Tabla XXIV: Resultado de la cantidad de polisacárido en el cladodio............... 48

Tabla XXV: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el primer día de evaluación (Día 1). .............................. 52

Tabla XXVI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el segundo día de evaluación (Día 2)............................ 53

Tabla XXVII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el tercer día de evaluación (Día 3). ............................... 54

Tabla XXVIII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el cuarto día de evaluación (Día 4). .............................. 55

Tabla XXIX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el quinto día de evaluación (Día 5)................................ 56

Tabla XXX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el sexto día de evaluación (Día 6)................................. 57

Tabla XXXI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y tamaño

de herida obtenidas en el séptimo día de evaluación (Día 7). ............................ 58

ÍNDICE DE GRAFICOS

Gráfico I: Curva estandar de Flavonoides con sus absorbancias y

concentraciones ................................................................................................ 45

Gráfico II: Curva estándar de Polisacáridos con sus absorbancias y

concentraciones ................................................................................................ 47

I

RESUMEN

Existen estudios del cladodio mencionando diferentes propiedades medicinales

y haciendo énfasis a su efecto cicatrizante. Una preparación en particular dio

resultados satisfactorios mostrando regeneración rápida del tejido e inhibición de

la inflamación. Se realizaron pruebas de control de calidad como humedad,

cenizas totales, cenizas solubles en ácido clorhídrico, sustancias solubles, solidos

totales, pruebas físico-químicas de densidad, pH, índice de refracción y análisis

fitoquímicos encontrando presencia de taninos, flavonoides, alcaloides, cumarinas

y glucócidos. También se determinó la presencia de flavonoides y polisacáridos

del extracto etanólico del cladodio mediante ensayos cualitativos y cuantitativos.

Para la realización del ensayo pre-clínico se formó grupos de tratamiento A

(control negativo), B (control positivo), C, D, E (extracto 10 ul, 20 ul, 30 ul) y F

(etanol 10%). Mediante los resultados de los análisis realizados se comprobó el

efecto cicatrizante del extracto etanólico del cladodio (Opuntia ficus indica L) en

animales de experimentación, dando como resultado la reepitelización y

remodelación de la herida.

Palabras claves: Reepitelización, inflamación, remodelación, polisacáridos,

flavonoides

II

ABSTRACT

Studies examining cladode prove different medicinal properties and they

emphasize its healing effects. One of the first investigations that gave satisfactory

results reports a fast generation of the tissues and the inhibition of inflammation.

The performed quality control addressed factors like humidity, total ash, soluble

ash in hydrochloric acid, other soluble substances, total solids, physical-chemical

density tests, pH, the refractive index and phytochemical analysis found the

existence of tannins, flavonoids, alkaloids, cumarin and carbohydrates. Other than

that, qualitative and quantitative tests proved the presence of flavonoids and

polysaccharides in the extracted ethanol from the cladode. For the pre-clinical trial,

treatment groups were formed: A (negative control), B (positive control), C, D, E

(extract 10 ul, 20 ul, 30 ul) and F (ethanol 10%). The results of the analysis showed

the healing effect of the ethanol extract of the cladode (Opuntia ficus indica L) in

experimental animals, as re-epithelialization and remodeling of the wound were

documented.

Keywords: Re-epithelialization, inflammation, remodeling, polysaccharides,

flavonoids

1

CAPITULO I

I. INTRODUCCIÓN

La medicina tradicional es utilizada desde la antigüedad en diferentes

países a nivel mundial, la OMS apoya el uso de las medicinas tradicionales y

alternativas cuando éstas han demostrado ser útiles para el paciente y su riesgo

es mínimo ha declarado el Dr. LEE Jong-wook, Director General de la OMS. A

medida que aumenta el número de personas que utilizan esas medicinas, los

gobiernos deben exigir garantía acerca de sus beneficios y riesgos que este

posea. (Gutierrez, 2013)

El ser humano puede estar a expensas lesiones en la piel; mediante

estudios e investigaciones el nopal presenta varios beneficios una de ellas en la

cicatrización de heridas proveniente del extracto etanólico de los cladodios de la

Cactáceas. (Medizzine, 2010)

Estudios reportados por Ramírez, (2017) señala que esta especie es rica

en polifenoles, vitaminas, ácidos grasos polinsaturados y aminoácidos; cuyos

compuestos identificados poseen actividades farmacológicas como cicatrizante,

antiinflamatoria, antioxidante, hipoglucémica, antibacterial y neuroprotectora,

entre otros.

En la presente investigación de experimentación se pretende comprobar

el efecto cicatrizante reportado en ratones utilizando el extracto etanólico

proveniente de los cladodios del nopal (Opuntia ficus indica L) reportados de la

especie que crece en las Costa Ecuatoriana.

2

PROBLEMA

Las heridas se conocen como traumatismos mecánicos abiertos producido

por un agente externo en cual actúa de manera agresiva sobre una parte del

cuerpo humano de tal manera supera considerablemente la resistencia por parte

de los tejidos causando una rotura o fisura en la superficie cutánea o mucosa

también puede ser conocida como una lesión caracterizada por una discontinuidad

en el epitelio de revestimiento. (García, 2000)

La cicatriz aparece cuando el tejido o la superficie cutánea que ha sido

afectada por una herida desencadenan una series de procesos de reparación

cutánea por acción natural la cual es inevitable, de esta manera se produce una

alteración macroscópica con la aparición de tejido dérmico fibroso en el área

afectada y como resultado la formación de la cicatriz. (Onmeda, 2017)

Las personas en su vida cotidiana pueden presentar algún tipo de lesión o

herida por ello acuden notoriamente a productos farmacéuticos que pueden ser

administrados por diferentes vías, pero algunas investigaciones realizadas en el

Nopal (Opuntia ficus indica L) afirman que presenta varias acciones

farmacológicas las cuales son de ayuda en distintas afecciones en la salud, la

acción cicatrizante proveniente de los cladodios ayudarían en aquel proceso

debido a la presencia de polisacáridos en su composición. (Medizzine, 2010)

3

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Ayudaría a cicatrizar las heridas el extracto etanólico de los cladodios del

Nopal (Opuntia ficus indica L) en ratones?

JUSTIFICACIÓN

El nopal presenta varios beneficios en la medicina tradicional se lo utiliza

en el tratamiento de quemaduras, edemas, úlcera péptica, especialmente es

utilizado el cladodio que actúa como cicatrizante e inducen un efecto beneficioso

gracias a los polisacáridos de la Opuntia ayudando en la reparación cutánea,

acelerando la reepitalizacion de la lesiones de la piel (Medizzine, 2010)

4

HIPÓTESIS

El extracto etanólico de los cladodios de Opuntia ficus indica L ayudará a

la cicatrización en los animales de experimentación.

OBJETIVOS

Generales

Comprobar el efecto cicatrizante del extracto etanólico del cladodio

(Opuntia ficus indica L) en ratones de experimentación.

Específicos

Obtener el extracto etanolico de los cladodios de Opuntia ficus indica L

Realizar el tamizaje fitoquímico y el control de calidad del extracto

etanólico

Evaluar el efecto cicatrizante del extracto aplicados en ratones de

laboratorio.

Analizar el extracto etanólico por Cromatografía de Gases acoplada a

espectrometría de masa.

5

CAPITULO II

I. MARCO TEÓRICO

I.1 Nopal

I.1.1 Descripción taxonómica

El Nopal (Opuntia ficus indica L) perteneciente a la familia de las cactáceas,

este tipo de plantas carece de hojas nomófilas, es decir que no tiene hojas propias

de la planta, son carnosas y suculentas (permiten el almacenamiento de agua). Él

tallo son planos, ovales de hasta 20 cm de diámetro las cuales están formadas

por segmentos o filocladios; posee dos clases de espinas unas largas - duras y

otras cortas - finas.

Las flores nacen en las en los bordes de los segmentos y pueden presentar

diversos colores como amarillo y rojo. El fruto de color rojo de hasta 5 cm, diámetro

5-7 cm, longitud 5-11cm, peso entre 43-220 g es de forma ovalada, gruesa,

carnosa con abundante semilla. (Ecured, 2012).

I.1.2 Taxonomía

En la Tabla I se detalla la clasificación taxonómica de la siguiente especie:

Tabla I : Clasificación taxonómica del nopal

Clasificación taxonómica

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

6

Orden Caryophyllales

Familia Cactaceae

Género Opuntia

Especie ficus-indica

Nombre científico Opuntia ficus-indica (L.) Mill

Tomado de: (Rodriguez, 2012)

Nombre común: Higo chumbo, tuna de castilla, nopal, tuna cardona, tuna

camuesa, tuna mansa, tuna leonera, tuna amarilla, tuna teca, tuna ranchera, tuna

tapona, tuna palmita, tuna pachona, tuna chavena, tuna duraznilla, tuna

I.1.3 Habitad

El Nopal habita en EE.UU, México, Perú, Ecuador, Bolivia en sus zonas

desiertas y en varios países de América del Sur generalmente, aunque también

habita en otros continentes pero en menor cantidad. Según Benalcàzar, (2015) en

Ecuador la mayor cantidad se encuentra en la Sierra Norte, seguida de Loja,

Tungurahua y Santa Elena, según datos de la Federación de Comunidades

Negras de Imbabura y Carchi .

Entre las condiciones en que esta especie ha sido cultivada exitosamente

se encuentran de 12 a 34°C, con un rango óptimo de 11 a 23°C y con una

precipitación promedio entre 400 a 800 mm. Se desarrolla en suelos sueltos,

arenosos, calcáreos, en tierras marginales y poco fértiles, superficiales,

pedregosos, caracterizándole una amplia tolerancia edáfica, mejor desarrollo lo

alcanza entre los 1.700 a 2.500 msnm (Zarucchi, 1993).

7

I.1.4 Actividad farmacológica

El nopal es una planta que en cuya composición fitoquímica contiene varios

compuestos como polifenoles, vitaminas, ácidos grasos; gracias aquellos

compuestos presentan una gran diversidad de actividades farmacológicas las

cuales son muy beneficiosas en su consumo e investigaciones.

Según Ramírez, (2017) señala que la Opuntica ficus indica (L) presenta las

siguientes actividades farmacológicas:

Actividad antiulcérica: mediante ensayos experimentales las fracciones de

Opuntia han sido utilizadas en el tratamiento de ulceras gástricas y ulceras

inducidas por el consumo de alcohol, siendo el mucilago que ayuda a la

introducción del agente necrotizante en la mucosa gástrica.

Actividad antiinflamatoria: Opuntia presenta la actividad analgésica y

antiinflamatoria debido a la presencia de metabolito B-sitosterol en la fruta o

mucilago de la tuna.

Actividad neuroprotectora: esta actividad se la confiere porque en su

composición presenta los flavonoides quercetina, dihidroquercetina, y quercetina

-3 metil- éter.

Actividad antiviral: principalmente el extracto de cladodio de Opuntia ayuda

en la inhibición de multiplicación intracelular del NA y RNA virus como el virus de

la influenza, herpes simple, virus del herpes equino.

Actividad hipoglucemiante: mediante la realización de algunos estudios y

ensayos experimentales el jugo de Opuntia disminuye los niveles de superóxido

8

dismutasa, glutatión reducido, colesterol HDL, hemoglobina, proteína y glicógeno

hepático de esta manera llevando a niveles normales.

Actividad hepatoprotectora: los extractos de Opuntia presentan gran ayuda

como protector si existiese un daño hepático este ensayo fue realizado en ratas.

Actividad anti daño renal: en los ensayos preclínicos se demostró que los

extractos de las flores y frutos de Opuntia presenta un efecto moderado en el

incremento de diuresis y natriuresis.

Actividad antioxidante: la caracterización de los extractos atomizados y su

potencial farmacéutico de Opuntia se demostró la actividad antioxidante,

inhibitoria de tirosina, antimicrobial y fotoprotectiva.

Actividad protectiva: la acción de esta actividad se encuentra relacionada

debido a la presencia del mucilago y pectina ayudando en la acción citoprotectiva

contra ulceras.

Actividad cicatrizante: el extracto metanólico proveniente de los cladodios

de la Opuntia presenta un efecto benéfico en la curación de las heridas debido a

la presencia de polisacáridos que ayudan a la reparación cutánea acelerando la

reepitalizacion de la heridas y lesiones de la piel (Medizzine, 2010).

9

I.1.5 Composición química

La composición química del nopal va a variar según varios factores como la

variedad de la planta, el tipo de cosecha, el tiempo de cosecha y varios factores

que cambian las concentraciones de los componentes de la misma. (Esquive,

2004)

Tabla II Composición química de la Tuna

Tomado de: (Terán et al, 2015)

10

I.1.5.1 Piel

En la Tabla III se muestran las características químicas de la piel del fruto

del Nopal la cual no es caracterizada con frecuencia ya que no se utiliza como

forma de consumo y por la dificultad que conlleva la separación de la pulpa. Las

pencas tienen una cantidad considerable de agua y minerales.

Tabla III Composición química de la piel del Nopal.


I.1.5.2 Cáscara

En la cáscara del fruto del nopal es donde se encuentra la mayor cantidad

de vitamina C que en las demás partes del fruto. Lo que se indica en la Tabla IV.

Además son ricas en sales minerales de Fosforo, Hierro, Calcio.

Tabla IV Composición química de la cascara del nopal.


11

I.1.5.3 Pulpa

Posee multiples vitaminas sobresaliendo el ácido ascorbico, riboflavina,

niacina, carotenos. Compuestos con actividad antioxidante tales como

flavonoides, betalainas, entre otros. Además de varios oligoelementos y alcaloides

como el indol. En la Tabla V podemos observar las características químicas del

fruto de la tuna:

Tabla V composición química de la pulpa del nopal


Varios estudios revelan la importancia de los polisacáridos en procesos de

cicatrización debido a que actúan sobre el sistema inmunológico aumentando la

actividad fibroblastos, ayudando a que el proceso de reepitelizacion se acelere y

a su vez la fase de remodelación celular.

El nopal presenta polisacáridos en gran cantidad, especialmente el

cladodio, a s vez también presenta glucósidos de flavonol que cumplen la misma

acción. (Arauza, 2011)

Un polisacárido llamado quitin-polisacárido extraído de la quitina

(componente principal de las paredes celulares de los hongos). Que presenta un

gran poder antioxidante y puede realizar un notable poder de cicatrización sobre

las heridas abiertas, incluso como sustituto artificial de la piel según la bibliografía

12

pero aun no demostrado experimentalmente. Las propiedades de este

polisacárido sobre la cicatrización se dan acortando el tiempo o mejorando las

heridas o ulceraciones crónicas, utilizadas por vía tópica o en diversas

presentaciones. (Heilemann, 2013)

I.3.1 Usos Étnomedicinales

El Nopal por sus múltiples beneficios sobre la salud es bien usando desde

varios años, unos de sus usos importantes es en el tratamiento de problemas

renales mediante la infusión de sus hojas mediante administracion por vía oral,

mientras que sus frutos son utilizados por vía tópica formando cataplasmas al

calentarlos en hornos y colocándola en la zona afectada.

Según Rodríguez, (2012) por cada 100g de pulpa comestible aporta 1,3 g

de proteínas, 6,8 g de fibras, 0,1 g de grasas, 17 mg de fósforo, 2,7 mg de hierro,

220 mg de Vitamina A, 0,03 mg de Vitamina B1, 0,04 mg de Vitamina B2, 0,4 mg

de niacina, 16 mg de Vitamina C y 29 calorías.

Además desde épocas precolombinas existen reportes de que los cladodios de la

Opuntia ficus indica L han sido utilizados por su actividad cicatrizante.

Varios estudios afirman que desde hace muchos años la opuntia ha sido

consumida debido a la cantidad de nutrientes que posee y los beneficios sobro el

organismo, por otro lado hoy en día esos estudios se han ampliado, confirmando

todas las creencias sobre la variedad de propiedades beneficiosas del nopal.

(Guzmán & Chávez, 2007)

13

I.3 Cicatrices

I.3.3 Definición

Las cicatrices son conocidas como alteraciones permanentes de la

apariencia dérmica debidas a un daño infligido a la piel las cuales se encuentran

asociadas con el proceso natural de reparación de la zona afectada, ocurre

cuando se reemplaza la piel dañada, la misma que presenta un aspecto de tejido

grueso, la mayoría de las veces blanquecino, fibroso, se forma en el proceso

de cicatrización de las heridas y su objetivo es sustituir al tejido corporal original

que ha sido dañado. (Onmeda, 2017)

I.2.2 Clasificación del proceso de cicatrización

La clasificación puede hacerse en función de diversos criterios.

Cicatrización normal: Es el proceso que deja una cicatriz con apariencia

normal, es decir, con un color semejante a la piel que la rodea, plana, lineal

y flexible. Además, no afectará a la integridad anatómica ni funcional de la

zona afectada.

Cicatrización patológica: Es el proceso que, a diferencia de la

cicatrización normal, sí puede afectar a la integridad anatómica y funcional

de la zona afectada. Este tipo de cicatrización se puede subdividir, a su

vez, en dos tipos, según el grado que alcance:

Excesiva. Se caracteriza por un exceso de cicatrización, es decir,

hay un exceso de tejido cicatricial causado por un aumento de la

celularidad y de la gran actividad de los fibroblastos

14

Insuficiente. Se caracteriza por un déficit de tejido cicatricial por ello

se comporta que las heridas acaben siendo crónicas y en muchos

casos inestables.

Cicatrización inestética: Es parecida a la cicatrización normal, ya que el

proceso de cicatrización es normal, no hay cicatrización excesiva ni

insuficiente, pero en este caso, la ubicación, dirección o técnica de

reparación no tiene buenos resultados y en la gran mayoría de casos será

necesario que se requiera de la cirugía para mejorar su aspecto.

Cicatrización ideal: Es aquella en la que no queda cicatriz externa y en la

que la integridad anatómico funcional no se ve afectada. Este tipo de

cicatrización, en humanos, únicamente se da en la cicatrización fetal.

I.1 Proceso de cicatrización

Es un proceso natural que ocurre en el cuerpo el cual va dirigido a

regenerar los tejidos de la dermis y epidermis que han sufrido una herida. Es un

proceso complejo que se divide en varias fases o etapas (Herranz & Santos,

2012):

Fase inflamatoria. Se caracteriza por un aumento de vascularización y

formación de la costra superficial debido a la llegada de plaquetas y células

inflamatorias a la zona dañada. Es decir, debido a la coagulación, se forma

un tapón que finalmente evolucionará dando lugar a la costra.

Fase proliferativa o fibroproliferativa. Se empieza a regenerar la zona

afectada a consecuencia del acumulo de fibrina y colágeno. El colágeno

es una proteína que genera el organismo y es la encargada de rellenar y

cerrar los defectos de continuidad de la piel.

15

Remodelación. Fase final del proceso de cicatrización, en la que se

produce una reabsorción del colágeno. Esta fase es lenta y suele alargarse

más de un año desde el inicio del proceso de cicatrización.

16

CAPITULO II

II. METODOLOGÍA

II.1TIPO DE INVESTIGACIÓN Y TÉCNICA

El estudio es de tipo experimental, diseño con post prueba y grupo control

en ratones que se realizaron en el Bioterio de la Universidad de Guayaquil de la

Facultad de Ciencias Químicas.

II.2Variables de la investigación

II.2.1 Variable dependiente

Tiempo del efecto cicatrizante

II.2.2 Variable independiente

Concentración del extracto

Tamaño de la herida

II.2.3 Variable interviniente

Condiciones ambientales

17

II.2.4 Operacionalización de las variables.

Tabla VI Cuadro de Operacionalización de las variables

Variable Conceptualización Indicador

Dependiente Tiempo del

efecto

cicatrizante

Lapso de duración en

el que se desarrolla

una acción o suceso.

Días

Independiente Concentración

del extracto

Es el alcance o

relación que hay entre

la cantidad de soluto y

la cantidad de

disolvente o disolución.

mg/ml

Tamaño de la

herida

Dimensiones físicas. Cm

Interviniente Condiciones

ambientas

Son los factores

externos ya sean físico

o químicos que se

encuentran descubierto -----------------------

-

Elaborado por: (García & Ponce, 2017).

18

II.3Desarrollo de la parte experimental

II.3.1 Recolección de la especie vegetal

El nopal se recolecto en la Universidad de Guayaquil en la Facultad de

Ciencias Químicas que se encuentra cultivada en las áreas verdes de dicha

facultad, posteriormente se realizó la recolección de los cladodios, que fueron

llevados a la Facultad de Ciencias Naturales para su respectiva clasificación

taxonómica y descripción botánica.

II.3.2 Preparación del material vegetal y obtención de extractoetanólico de los cladodios de la Opuntia ficus indica L.

Para la obtención del extracto etanólico de los cladodios del nopal en base

la selección de la materia prima de óptima calidad, siguiendo los siguientes pasos:

Al cladodio del Nopal se realizó una visualización en cuanto a sus

características organolépticas, color, aspecto y textura.

Luego se realizó un lavado y desinfección de la materia prima.

Se procedió a retirar la corteza del cladodio.

La muestra se la introdujo en la estufa a una temperatura de 60°C por 4

días.

Se trituro.

Se pulverizo.

Se pesaron 50 g de muestra pulverizada y se colocó 150ml de etanol 96%.

Se mantuvo macerada la muestra por 7 días.

Se filtró la muestra. (Carrasco, 2012)

19

II.3.3 Control de calidad del extracto etanólico del cladodio.

II.3.3.1 Determinación de las características organolépticas.

Determinación del olor.- Se toma una tira de papel secante de

aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de largo y se introduce un extremo

en un vaso de precipitación donde se encentra la muestra de ensayo. Se huele y

se determina si corresponde con la característica del producto.

Determinación del color.- Se colocó en tubo de ensayo limpio y seco la

muestra etanolica para observar el color y su transparencia y la presencia de

partículas que nos va a otorgar una apreciación sobre la turbidez de la muestra.

II.3.3.2 Determinación del índice de refracción.

Se coloca sobre el prisma una gota de agua destilada con la ayuda de una

varilla de vidrio que no tenga cantos agudos, se ajusta el equipo seleccionado la

zona del espectro visible que aparece en la línea límite del campo visual, luego

se coloca una gota del extracto etanolico del nopal sobre el prisma, cerrando el

termoprisma y se procede a enfocar la luz por medio del espejo, para que de esta

manera la luz incida sobre la apertura de entrada del prisma de medición y resulte

de igual forma que con el agua.

Para la expresión de los resultados se deben realizar tres lecturas y

calcular el promedio de las mismas. Dos o más lecturas no deben diferir en más

de 0.002. Si las determinaciones no se efectúan a la temperatura de referencia se

emplea la fórmula siguiente:

Nd25 = Ndt + 0.00044 (t-25)

20

Donde:

Nd25 = índice de refracción a 25 °C.

Ndt = Valor leído en la escala del aparato a la temperatura.

T = valor de la temperatura a que se realiza la medición (°C).

0.00044 = factor de correlación por Grados Celsius.

Los valores se aproximan hasta las milésimas (Carrasco, 2012)

II.3.3.3 Determinación del pH

La acidez o la alcalinidad de las soluciones etanòlicas se caracterizan por

el valor del índice de hidrógeno, es decir el valor el pH. Se trata de un índice

numérico utilizado para expresar la mayor o menor acidez de una solución en

función de los iones hidrógenos. Se calcula utilizando la ecuación: (Carrasco,

2012) = − log [H+ ]a [H+ ] = Actividad de los iones hidrógeno.

II.3.3.4 Determinación de la densidad relativa.

La densidad relativa es la relación entre masa de un volumen de la

sustancia a ensayar a una temperatura de 25°C y la masa de un volumen igual de

agua a igual temperatura que es equivalente al peso específico. Inicialmente se

pesa el picnómetro vació y secos 2° C y llénese con el extracto etanolico del nopal,

mantener a 25 °C (±1°C) durante 15 min y ajústesele el líquido al nivel empleado,

si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso secar exteriormente el

picnómetro.

21

Se pesa cuidadosamente el picnómetro con el extracto y se repite la

operación con el agua destilada a 25 °C, después de limpio el picnómetro.

Expresión del resultado:

25 = 1 −2 −Donde:

M1 = peso del picnómetro con la muestra (g)

M2 = peso del picnómetro con el agua (g)

M = peso el picnómetro vacío (g)

Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra.

II.3.3.5 Determinación de Sólidos totales.

Se denomina solidos totales a la masa que varía al exponer el extracto

etanolico del nopal al fenómeno de evaporación y secado en la estufa del residuo,

debido a la perdida a través de calor de sustancias volátiles.

Se procede llevando 5.0 mL del extracto a una cápsula previamente tarada

a 105 °C en la estufa, se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté

aparentemente seco. Luego este residuo se lo coloca en la estufa y se deja hasta

peso constante. Retiramos la cápsula de la estufa y la colocamos en una

desecadora hasta temperatura ambiente: La cantidad de sólidos totales,

expresado en %, R, se calcula por la siguiente fórmula;

= − ∗ 100

22

Donde:

Pr = masa de la cápsula más el residuo (g).

P == masa de la cápsula vacía (g).

V = volumen de la porción de ensayo.

100 = Factor matemático para el cálculo.

II.3.3.6 Cuantificación de flavonoides

Curva estándar de flavonoides – Quercetina

Pesar 20 g de Quercetina y llevar a volumen de 25 ml con metanol

(concentración 800 ug/ml) Solución madre de la misma solución tomar

2,5 ml, llevar a volumen final de 25 ml con metanol (concentración 80

ug/ml) Dilución primaria.

De la dilución primaria tomar 0.250 ul, 0.350 ul, 0.450 ul, 0.550 ul, 0.650

ul, 0.750 ul, agregar los reactivos cromóforos (200 ul Acetato de potasio

1M, 200 ul Nitrato de Aluminio 10%) llevar a volumen final en un matraz de

10 ml con etanol 96%.

Se debe leer a los 40 minutos una vez colocado la primera alícuota de

Nitrato de Aluminio.

Leer en el espectrofotómetro a 415 nm, usando como blanco Etanol 96 %

Muestra pulverizada de cladodio

Se realiza por triplicado, pesar 1g de la muestra agregando 10 ml de Etanol

96 % en un tubo de ependorff, colocar en el vortex por 3 minutos, filtrar, el filtrado

se deposita en un matraz de 25 ml y el residuo que se encuentra en el papel filtro

se coloca nuevamente en el tubo de ependorff con 10 ml de Etanol 96 %, llevar al

vortex durante 3 minutos y filtrar en el mismo matraz llevando a volumen final de

25 ml con Etanol 96 % (Solución A). Realizar el mismo procedimiento para las

réplicas B y C.

23

De las réplicas realizadas tomar 500 ul y agregar los reactivos cromóforos

(200 ul Acetato de potasio 1M, 200 ul Nitrato de Aluminio 10%) llevar a volumen

final en un matraz de 10 ml con etanol 96%.

Se debe leer a los 40 minutos una vez colocado la primera alícuota de

Nitrato de Aluminio.

Leer en el espectrofotómetro a 415 nm, usando como blanco Etanol 96 %

II.3.3.7 Determinación de flavonoides

Mezclar 1g del cladodio en polvo con 10ml de metanol por 5 min en un

baño de agua (60ºC).

Tomar 5ml de la solución y concentrar hasta sequedad. Colocar 2ml de

agua y 10ml de acetato de etilo, agitar por 10 min. Separar la fase de etil acetato

y concentrar hasta obtener un volumen de 1ml.

Usar el concentrado para la cromatografía. Se aplica 10ul del concentrado

en una placa cromatografica de silica gel 60F254 con la ayuda de un capilar. Dejar

secar después de cada aplicación Se introduce la placa en la cuba cromatográfica,

hasta que el solvente recorra la ¾ partes de la placa. Retirar de la cuba y dejar

secar para luego observar en una lámpara de UV 365nm. Revelara la placa y dejar

secar, y anotar los Rf.

Sistema de solventes: acetato de etilo, cloroformo (2:1)

Expresión del resultado:

=

24

II.3.3.8 Cuantificación de polisacáridos

Curva estándar de polisacáridos – Glucosa

Pesar 100 mg de glucosa y disolver en un matraz de 100 ml (SoluciónMadre)

Posteriormente de la solución madre tomar 2 ml y llevar volumen en un

matraz de 25 ml (Dilución primaria)

De la dilución primaria tomar en diferentes tubos de ependorff: 1ml, 0.750

ml, 0,5 ml, 0,25 ml, 0,125 ml con 1 ml de fenol 5 % y 4 ml ácido sulfúrico

concentrado.

Leer en el espectrofotómetro a 400 nm , usando como blanco 1 ml agua

destilada, 1 ml fenol 5% y 4 ml ácido sulfúrico.

Muestra pulverizada de cladodio

Se realiza por triplicado, pesar 0,5g de la muestra pulverizada de cladodio

llevar a reflujo con agua destilada a un volumen de 100 ml durante dos horas

En matraces de 250 ml , filtrar y separar el residuo al mismo se realiza un

lavado con agua caliente con 30 ml y posteriormente con 30 ml ( volumen de 60

ml ) y se enraza a 250 ml con agua destilada (Solución A). Realizar el mismo

procedimiento para las réplicas B y C.

De cada una de las réplicas realizadas tomar 1 ml y colocar en tubos de

ependorff con 1 ml de fenol 5% y 4 ml de ácido sulfúrico concentrado (por la

paredes del tubo lentamente), posteriormente se lleva a baño María (40°C) dejar

enfriar.

Leer en el espectrofotómetro a 400 nm, usando como blanco 1 ml agua

destilada, 1 ml fenol 5% y 4 ml ácido sulfúrico.

25

II.3.4 Pruebas de control de calidad del cladodio de la muestrapulverizada.

II.3.4.1 Determinación del contenido de humedad

Pesar 2 g. ± 0.5 mg del cladodio crudo y transportarlos a un pesa filtro

tarado anteriormente, secar a 100 °C por 3 horas. La pesa filtro se colocó en un

desecador hasta alcanzar temperatura ambiente y se pesó; colocándose

nuevamente en la estufa durante 1 hora y se repitió el procedimiento hasta masa

constante. El ensayo se realizó por triplicado.

Cálculos:

% = 2 − 1 ∗ 100Donde:

H = Porcentaje de Humedad

M = masa de la muestra de ensayo (g).

M1= masa del pesa filtro con la muestra desecada (g)

M2 = masa del pesa filtro con la muestra de ensayo (g).

100=factor matemático para los cálculos.

26

II.3.4.2 Determinación de cenizas totales

Pesar entre 2.0 g a 3.0 g del cladodio pulverizado y tamizado en un crisol

de porcelana anticipadamente tarado. Caliente suavemente el polvo del cladodio

aumentando la temperatura hasta carbonizar y posteriormente incinere en un

horno mufla a una temperatura de 500-550 ºC, durante 2 horas. Enfriar el crisol en

una desecadora y pesar, repitiéndose hasta masa constante. Al enfriar el crisol el

residuo es de color blanco o casi blanco.

Expresión de los resultados.

= M2 − M1 − × 100C = porcentaje de cenizas totales en base hidratada.

M = masa del crisol vacío (g)

M1= masa del crisol con la porción de ensayo (g)

M2= masa del crisol con la ceniza (g)

100= factor matemático para los cálculos.

Los valores se aproximan hasta las décimas.

II.3.4.3 Determinación de cenizas insolubles en ácido clorhídrico.

Al residuo del ensayo de cenizas totales se añadió de 15 a 20 mL de HCl

10%. Tapar la capsula y llevar a ebullición suavemente directo a la llama durante

5 minutos. La solución obtenida se filtró a través de papel filtro libre de cenizas

determinadas o declaradas. Se lavó el residuo con agua caliente hasta que

muestre negativo la prueba con AgNO3 0.1N. El papel con el residuo se transfirió

a la cápsula inicial, se carbonizó e incineró en un horno mufla a 500-550 °C,

durante 2 horas. Posteriormente se enfrió en el desecador hasta temperatura

ambiente y se pesó. Se repite el procedimiento hasta obtener masa constante.

27

Expresión de los resultados:

% = M1 − M21 − × 100B= porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada.

M = masa de la capsula tarada (g).

M1=masa de la capsula con la porción de ensayo (g).

M2= masa del crisol con la ceniza (g).

100= factor matemático.

Los valores se aproximan hasta las décimas.

II.3.4.4 Sustancias solubles o extraíbles

Realizar el ensayo por triplicado, tomar 5 g de cladodio en polvo, utilizando

agua y mezcla hidroalcohólica al 90 %. Las muestras se agitaron en un agitador

magnético por un tiempo de 6 horas.

Los cálculos se realizaron según:

. 500.100(100 − )Ss: sustancias solubles (%)

R: residuo de la muestra (g)

M: masa de la muestra (g)

H: humedad residual (%)

500 y 100: factores matemáticos para el cálculo

28

II.3.5 Identificación de metabolitos secundarios por tamizajefitoquímico

Los procedimientos que se consideraran para la realización del tamizaje o

screanning fitoquìmico serán tomados de (Carrasco, 2012).

II.3.5.1 Ensayo de Shinoda (Flavonoides)

Se coloca 20 ml del extracto en un tubo de ensayo se agrega de dos a tres

virutas de magnesio y unas gotas de ácido clorhídrico concentrado observe el

cambio de coloración de rojo a magenta. Si se trata de un extracto acuoso, a la

alícuota se le añade 1 gota de HCl concentrado. Identificación: Rojo: presencia de

flavonoides; Rosa intenso: presencia de flavonas. (Carrasco, 2012)

II.3.5.2 Ensayo de Mayer, Dragendorff y/o Wagner. (Alcaloides)

Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la presencia

de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente

orgánico, se debe evaporar 2 mL del extracto etanolico del cladodio en baño de

agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua,

añadiendo 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si hay opalescencia se considera

(+), turbidez definida (++), precipitado (+++).

Ensayo de Mayer: Evaporar 2 mL del extracto etanolico del cladodio en

baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en

agua, añada una pizca de cloruro de sodio en polvo, agite y filtre. Añada 2 ó 3

gotas de la solución reactiva de Mayer, si se observa opalescencia (+), Turbidez

definida (++), precipitado coposo (+++).

Ensayo de Wagner: Se parte de la solución ácida, añadiendo 2 ó 3 gotas

del reactivo, clasificando los resultados de la misma forma, que en el ensayo de

Ensayo de Mayer.

29

II.3.5.3 Ensayo de Liberman- Buchard (Triterpenos Y/O Esteroides)

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en

baño de agua y el residuo disolverse en 1mL de cloroformo. Añadir 1mL de

anhídrido acético y mezclar. Por la pared del tubo de ensayo colocar 2-3gotas de

H2SO4 concentrado sin agitar. Un Cambio rápido de coloración supone un

resultado positivo.

Observar: Rosado – azul muy rápido; Verde intenso- visible aunque

rápido; Verde oscuro-negro-final de la reacción. Para realizar este ensayo no

puede haber agua en el medio de reacción pues ésta con el ácido sulfúrico

reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente. (Carrasco, 2012)

II.3.5.4 Ensayo de Borntrager (Quinonas)

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en

baño de agua y el residuo disolverse en 1mL de cloroformo. Agregar 1mL de

hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco al 5 %. mezclar las fases y

dejar en reposo hasta su posterior separación. Observar: Positivo cuando la fase

acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado (++), rojo (+++).

II.3.5.5 Ensayo de Fehling.

Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores.

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y evaporar el solvente en baño de

agua y el residuo redisolverse en 1-2 mL de agua. Añadir 2 mL del reactivo y se

calienta en baño de agua 5-10 minutos. Se considera positivo cuando la solución

se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.

30

II.3.5.6 Ensayo de resinas

Para detectar este tipo de compuestos se añade a 2mL del extracto

etanolico del cladodio, 10mL.de agua destilada. Observar: Positivo la aparición de

un precipitado.

II.3.5.7 Ensayo de Baljet (Cumarinas)

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio, luego aicionar 1ml del

reactivo. Observar: Positivo cuando aparece una coloración o precitado de color

rojo (++ y +++).

II.3.5.8 Ensayo de Espuma (Saponinas)

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y diluir con 5 veces su

volumen en agua, agitar la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos. El ensayo

se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2

mm de altura y persistente por más de 2 minutos. (Carrasco, 2012)

II.3.5.9 Ensayo de Cloruro Férrico (Taninos)

Tomar 2 mL del extracto etanolico del cladodio y agregarle 3 gotas de una

solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio

al 0.9% en agua). Observar: Positivo Coloración rojo-vino compuestos fenólicos

general. ; Coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos; Coloración

azul, taninos tipo pirogalotánicos.

31

II.3.5.10 Ensayo de Antocianidinas

Permite conocer en los extractos vegetales la presencia de estas

estructuras de secuencia C6C3-C6 del grupo de los flavonoides. Tomar 2 mL del

extracto etanolico del cladodio y calentar durante 10min, con 1mL., de HCl

concentrado. Enfriar y añadir 1mL., del agua y 2mL., de alcohol amílico. Agitar y

esperar a la separación de las 2 fases. Observar: Positivo la aparición de color

rojo a marrón en la fase amílica

II.3.5.11 Ensayo de Mucílagos.

Se toma una alícuota del extracto de agua se enfría a 0 – 5 ° C y si la

solución toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo. (Carrasco, 2012)

II.3.6 Parámetros Macromorfológicos

Se toman muestras de las hojas, pétalos, frutos, y corteza y a continuación

se consideran forman y tamaño las cuales serán observadas en el estereoscopio.

II.3.7 Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas(CG-EM)

Se trata de una técnica combinada que asocia el poder de discriminación

y la sensibilidad que posee un cromatógrafo de gases con la especificidad que

aporta una técnica espectroscópica. Aporta datos espectrales altamente

específicos de las distintas sustancias presentes en una mezcla compleja sin

necesidad de aislarlos previamente. (UNODC, 2012)

El extracto obtenido se inyectan al cromatógrafo de gases acoplado a un

detector selectivo de masas para su identificación.

32

Tabla VII Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM)

Condiciones de funcionamiento de la (CG-EM)

Cromatógrafo de gases Agilent 7890ª

Detector Agilent 5975 (Avondale, Pa, USA)

Temperatura: 300º C

70 eV en modo de barrido (“scan”)

100 a 400 unidades de masa.

Columna HP-5ms de 25 m de largo (0,25 mm

de diámetro y 0,25 µm de espesor de

película).

Gas portador Helio de grado electrónico

Condiciones del horno Temperatura inicial: 100º C por 3 min,

incrementándose 8º C por minuto

hasta una temperatura final de 250° C

manteniendo por 10 min

Temperatura del inyector 250º C

Elaborado por: (García & Ponce, 2017)

Según la información de (UNODC, 2012) la identificación se consigue

comparando el tiempo de retención y el espectro de masa de la sustancia

analizada con los de un patrón de referencia. Todas las sustancias identificadas

33

mediante GC-MS de las que informe el encargado del análisis deben compararse

con un espectro de masas reciente del patrón de referencia apropiado,

preferiblemente obtenido con el mismo instrumento y en las mismas condiciones.

Las bibliotecas de espectros de masas que pueden adquirirse en el mercado o los

espectros generados por el usuario solo deben utilizarse con fines de referencia

II.3.8 Evaluación del ensayo pre-clínico: determinación del efectocicatrizante

Estudios realizados en piel demuestran la eficacia y rapidez en la

utilización del método de punch o técnica de sacabocado la cual permite que el

corte a realizar sea de una medición exacta. (Chile, 2014)

El presente estudio es de tipo experimental y grupo de control de ratones

que se realizó en el bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad

de Guayaquil. Se utilizó como material vegetal el extracto etanólico de los

cladodios del Nopal, como producto farmacéutico se utilizó B - sitosterol (Mebo)

nombre comercial.

Para el ensayo pre clínico se realizaron 6 grupos de experimentación, cada

uno con 6 animales dando un total de 36 ratones. Se mantuvieron a los ratones

en jaulas de metal (30x45 cm) a 22°C. Su alimentación se mantuvo balanceada

con alimento de conejo, agua clorada y periodos de Luz/oscuridad.

Se rasuro la mitad del tercio superior del lomo, se mantuvieron un tiempo

de 24 horas para observar si no se presentaban irritaciones.

Los ratones se mantuvieron en ayunas previo a la aplicación de la

anestesia con Quetamina dosis 50mg/kg + maleato de acepromazina. Para

proceder a realizar el corte se utilizó un sacabocado de 0,5 cm de longitud, con la

ayuda de tijeras pequeñas se cortó la piel. Posteriormente se aplicó el tratamiento

cada 24 horas durante 7 días (Gallardo, 2015).

34

Tabla VIII: Evaluación del proceso de cicatrización en cada grupo experimental

mediante la aplicación de cada uno de los materiales.


GRUPO TRATAMIENTO Volumen (ul)/Concentración(mg)

A Control

negativo

Con herida sin tratamiento

B Control positivo MEBO (0.25 % β- Sitosterol) 20 / 0.05

C Extracto 1 Opuntia 10 / 0,1457

D Extracto 2 Opuntia 20 / 0,2914

E Extracto 3 Opuntia 30 / 0,4371

F Vehículo Etanol 10 % 10 / 10

35

CAPITULO III

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.1 Análisis organoléptico

Tabla IX: Resultados de los caracteres organolepticos del extracto de los

cladodios de Opuntia ficus indica L.

PARÁMETRO OPUNTIA

Aspecto Liquido

Color amarillo verdoso

Olor característico

Sabor Dulce


Los resultados que se encuentra en la Tabla IX sobre las características

organolépticas del extracto coinciden con los expuestos en la bibliografía y

presentan similitud con los estudios descritos según (Carrasco, 2012) en los

cuales el aspecto es liquido por tratarse de un extracto. Su color hace referencia

al del cladodio que es color verde y su sabor es dulce debido al porcentaje de

azucares presentes.

36

III.2 Parámetros Macromorfológicos

Tabla X: Análisis macromorfologico de la Opuntia ficus indica L.


En la Tabla X se describen los parámetros macromorfológico los cuales presentan

cierta similitud según (Carrasco, 2012), de los órganos vegetales de la Opuntia ficus

indica L.

Parámetros

Macromorfológicos

Arbusto

Segmentados terminales

verdes

Aplanados 20-30 x 8-15cm

Angostos – obovados

Aereolas 2-3mm

Espinas 1cm

Flores5cm con petaloides rojizos

amarillentos

Fruto7 x 5.5 cm amarillento al

madurar.

37

III.3 Tamizaje fitoquímicoTabla XI: Resultados del Tamizaje fotoquímico del extracto etanólico del cladodio

Ensayo Metabolito Tuna resultados

Dragendorf Alcaloides +++

Mayer Alcaloides -

Wagner Alcaloides ++

Cloruro férrico Taninos ++

Shinoda Flavonoides +

Resinas -

Antocianinas -

Quinonas -

Espuma Saponina -

Bouchardatt Triterpenos y/o

esteroides

-

Cumarinas +++

Glucósidos ++

Glucósidos

cardiotónicos

++


+++: ALTA EVIDENCIA

++: EVIDENCIA.

+: BAJA EVIDENCIA

−: NEGATIVO

38

La Tabla XI se expresan los metabolitos secundarios que se analizaron en

el extracto de los cladodios, de los cuales dieron positivos: alcaloides, flavonoides,

taninos, cumarinas y glucósidos (glucósidos cardiotónicos)

Lss pruebas de Wager, Mayer y Dragendorff, nos permiten identificar la

presencia de alcaloides en el extracto alcohólico. En este caso no se considera la

presencia de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, pues éstos solo se

encontrarán en el extracto acuoso. Por otro lado el ensayo de Cloruro Férrico dio

positivo para taninos, apoyando la hipótesis que pressentan propiedades

astringentes, hemostáticas, antisépticas y tonificantes según la bibliografía.

En la Tabla XI se observa un resultado positivo para el ensayo de Shinoda

que se traduce en la presencia de flavonoides en el extracto vegetal. Estos

flavonoides serían los componentes que ayudarían al proceso de cicatrización por

sus múltiples propiedades biologicas. Para el ensayo de cumarinas se observó

alta evidencia, especialmente Isorhamnetin 3 O- glucósidos que se trata de un

glucósido de flavonol. (YGARTUA, 1978)

III.4 Humedad

Tabla XII: Resultados de Humedad del cladodio pulverizado y secado

OPUNTIA

REPLICA 1 3,15 %

REPLICA 2 3,60 %

REPLICA 3 3,40 %

TOTAL 3,38 %

D.S 0,16 %

C.V 4,60 %


39

En la Tabla XII se detalla el porcentaje de humedad de los cladodios secos

y molidos con un resultado óptimo y gracias a esto se puede mantener conservado

por mayor tiempo, evitando la proliferación bacteriana. A pesar de que es una

planta con alto porcentaje de humedad, se trata de una planta que se descompone

lentamente, por su largo periodo de vida útil.

III.5 Cenizas totales

Tabla XIII: Resultados de Cenizas Totales del cladodio pulverizado y secado

OPUNTIA

REPLICA 1 23,45 %

REPLICA 2 23,20 %

REPLICA 3 23,40 %

TOTAL 23,35 %

D.S 0,10 %

C.V 0,43 %


Las cenizas en un producto generalmente son consideradas como un

índice de calidad o adulteración si estas se encuentran en valores elevados por el

contenido de minerales o compuestos inorganicos. Se conoce como cenizas

totales a los sólidos filtrables que pueden ser solubles en ácido clorhídrico o

insoluble en el mismo.

El resultado de cenizas totales expuestos en la Tabla XIII se encuentran

por encima de los valores referenciados citados por la OMS que es <12%. Esto

40

nos indica la posible presencia de minerales o compuestos orgánicos que pueden

interferir en la acción farmacológica que se desea demostrar.

III.6 Cenizas insolubles en HCl

Tabla XIV: Resultados de Cenizas Insolubles en HCl del cladodio pulverizado y

secado

OPUNTIA

REPLICA 1 5,65 %

REPLICA 2 5,60 %

REPLICA 3 6,60 %

TOTAL 5,95 %

D.S 0,43 %

C.V 7,28 %


Las cenizas insolubles en ácido clorhídrico otorgan una estimación de la

digestibilidad de un alimento, entre ellas tenemos ciertos minerales estables como

quelatos o no digestibles como el sílice. Este ensayo se realizó por triplicado para

evidenciar la reproducibilidad que nos otorga resultados más confiables.

41

III.7 Sustancias solubles

Tabla XV: Resultados de Sustancias Solubles de cladodio secado y pulverizado

OPUNTIA

REPLICA 1 6,49 %

REPLICA 2 6,29 %

REPLICA 3 6,93 %

TOTAL 6,57 %

D.S 0,24 %

C.V 3,67 %


En la Tabla XV se observa el porcentaje de sólidos solubles que

representan la cantidad de azúcares en especial sacarosa que se encuentra en la

muestra. El valor encontrado de 6,57% es una cantidad alta lo que va a provocar

un valor elevado de Grados Brix y densidad ya que estas son pruebas físicas que

demuestran la presencia de sólidos solubles

42

III.8 Densidad

Tabla XVI: Resultados de la densidad del extracto etanólico de cladodio

OPUNTIA

REPLICA 1 0,850 g/ml



TOTAL 0,813g/ml

D.S 0,035 %

C.V 4,249 %


En La Tabla XVI presenta los resultados de la densidad realizado en el

extracto etanólico proveniente del cladodio de Opuntia con un valor de 0,813 g/ml.

Este parámetro fue realizado por triplicado para asegurar la reproducibilidad del

ensayo. No se han encontrado datos pertinentes para realizar su comparación lo

que pone de manifiesto el valor de la densidad como nobel y unico del presente

estudio de investigación; se incluyeron además la desviación estándar y

coeficiente de variación el mismo debe tener un valor ≤ 10%.

43

III.9 pH

Tabla XVII: Lecturas de pH del extracto etanólico de cladodio

MUESTRA RESULTADO T°C

Opuntia 6.02 24.9


El resultado de la Tabla XVII detalla el valor de la lectura del pH en el

extracto etanólico de Opuntia con una valor de 6.02 a una temperatura de 24.9 °C.

Es conocido que el pH de la piel está comprendido entre 4.5 – 5.9. Para

tratamientos a nivel de piel se necesita productos tópicos comprendidos entre 5 –

7. (Orlandi, 2014) De esta manera, el valor del pH del presente estudio puede ser

usado en la piel.

III.10 Índice de refracción

Tabla XVIII: Lectura del índice de refracción del extracto etanólico de cladodio

MUESTRA I.R DETERMINADA I.R CORREGIDA

Opuntia 1,3639 1,364


La Tabla XVIII indica el valor de la lectura del índice de refracción del

extracto obteniéndose como resultado 1,3639. No se ha encontrado datos

preliminares de esta variable, por lo que se pone en manifiesto el valor del índice

de refracción del presente estudio es nuevo y único; este tipo de parámetro se lo

utiliza con el fin de verificar si existe alguna adulteración.

III.11 Solidos totales

44

Tabla XIX: Resultados de Sólidos Totales del extracto etanólico de cladodio

OPUNTIA

REPLICA 1 0,46 %

REPLICA 2 0,42 %

REPLICA 3 0,38 %

TOTAL 0,42 %

D.S 0,03 %

C.V 6,35 %


En la Tabla XIX se presentan los resultados de sólidos totales del extracto

etanólico de Opuntia ficus indica con un valor de 0,42 %. Este ensayo fue realizado

por triplicado para asegurar la reproducibilidad el ensayo, se incluye además la

desviación estándar y el coeficiente de variación que debe ser ≤ 10 %. Este tipo

de ensayo sirve para conocer la cantidad de materia disuelta en un solvente. Estos

resultados son nuevos y únicos al estudio, ya que no se han encontrado datos

preliminares.

45

III.12 Cuantificación de flavonoides

Tabla XX: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico

MUESTRA ABSORBANCIAS 415 nm

OPUNTIA 0,041 0,041 0,04


0

0,035

0,077

0,110,14

0,1770,206

y = 0,0402x - 0,0026R² = 0,9992

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5 6

ABSO

RB

AN

CIA

415

nm

CONCENTRACIÓN ug/mL

CURVA STANDAR QUERCETINA - FLAVONOIDE

Gráfico I: Curva estándar de Flavonoides con sus absorbancias y concentraciones

46

Tabla XXI: Resultado de la cantidad de flavonoides en el cladodio

OPUNTIA

REPLICA 1 54,23 mg/100 g cladodio



TOTAL 53,81 mg/100 g cladodio

D.S 0,55 %

C.V 1,03 %


En la Ilustración 1 señala los valores de las absorbancias y

concentraciones en la curva estándar de flavonoides utilizando la quercetina como

patrón. La gráfica tiene un valor R² = 0,9992 indicando que la curva tiene una

linealidad apropiada entre cada uno de los puntos que se interceptan.

Los resultados en la Tabla XX obtenidos mediante la lectura en el

espectrofotómetro presentan valores comprendidos entre 0.04 – 0.041. Utilizando

la curva de la Ilustración 1 se puede determinar la concentración de flavonoides

que en este caso indican una concentración entre 1 – 2 ug/ml.

La Tabla XXI detalla la cantidad de flavonoide que se encuentra en el

cladodio de la Opuntia ficus indica con un valor de 53,81 mg/100 g cladodio. Este

resultado nos da a conocer que la Opuntia posee en los cladodios una cierta

cantidad de flavonoides los cuales ayudan en la cicatrización el cual es de suma

importancia en el presente estudio de investigación.

47

III.13 Determinación de flavonoides

Tabla XXII: Resultados de la determinación de flavonoides utilizando

cromatografía capilar

MUESTRA

FRENTE DE LA MUESTRA FRENTE DELSOLVENTE

Rf

A B C D A B C D

OPUNTIA 1 cm

2,8

cm 7 cm 13,5 cm 15,6 cm 0,06 0,18 0,45 0,87


Los resultados en la Tabla XXI señala un ensayo de flavonoides por

cromatografía capilar en sálica gel detecto la presencia de 4 flavonoides no sabe

con exactitud el tipo de flavonoides que se encuentra separados debido a la

ausencia de flavonoides patrón durante la realización del ensayo; pero se utilizó

solventes (fase móvil) que sirven para determinar los flavonoides; teniendo en

cuenta la ubicación de las manchas en la cromatografía aquellas que se

encuentran en la parte superior es de menor peso molecular y los de la parte

inferior de mayor peso molecular.

III.14 Cuantificación de polisacáridos

0 0,0110,124

0,334

0,561

0,813y = 0,0106x - 0,0623

R² = 0,9865

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90ABSO

RB

AN

CIA

400

nm

CONCENTRACIÓN

CURVA STANDAR POLISACÁRIDO

Gráfico II: Curva estándar de Polisacáridos con sus absorbancias y concentraciones

48

Tabla XXIII: Lectura de las absorbancias utilizando el método espectrofotométrico

MUESTRA ABSORBANCIAS

OPUNTIA 0.800 0.802 0.800


Tabla XXIV: Resultado de la cantidad de polisacárido en el cladodio

OPUNTIA




TOTAL 1457,08 mg/100 g cladodio

D.S 6,29 %

C.V 0,43 %


En el grafico 2 se indican los valores de las absorbancias y

concentraciones en la curva estándar de polisacáridos. Esta gráfica se obtuvo R²

= 0,9865, indicando que la curva tiene una linealidad apropiada entre cada uno de

los puntos que se interceptan.

La reacción de polisacáridos dio valores comprendidos entre 0.800 –

0.802. Utilizando la Ilustración 2 se calcula que los cladodios de la Opuntia

contienen una elevada concentración.

49

Los resultados de la Tabla XXIV detalla la cantidad de polisacárido que se

encuentra en el cladodio de la Opuntia ficus indica con un valor de 1457,08 mg/100

g cladodio. Este resultado indica que la Opuntia posee en los cladodios

abundantes polisacáridos y se estima que este tipo de metabolito secundario que

ayuda como inmunomulador.

III.13 Compuestos orgánicos presentes en el extracto delcladodio de la Opuntia ficus indica mediante el análisiscromatografico.

Tabla XXV. Compuestos detectados por cromatografía de gases acoplado amasas en el extracto etanólico de Opuntia ficus indica

Pico#

tr Compuesto %abundancia

1 8.763 Propanoic acid 0.305 12.266 3,7-Dioxa-2,8-disilanonane 0.106 13.018 2-Butenedioic acid 0.237 13.332 Butanedioic acid 0.508 13.735 Propanoic acid9 14.329 2-Butenedioic acid 0.1311 15.367 2,3-Dimethyl-4-

trimethylsilyl0.20

13 17.791 Butanedioic acid 0.3317 19.732 1-Dodecan 0.2118 20.094 5-(p-Bromophenyl)-

7,11,11-trimethy0.10

23 21.149 ARABINONIC ACID 0.29

2,3,5-TRI-O-TRIMETHYLSILYL-ARABINOJasmonoyl glutamic aci

24 21.306 Lyxofuranose 0.11RibofuranoseArabinofuranose

25 21.434 Arabinopyranose 0.7226 21.656 Dodecanoic acid 0.1127 22.081 Ribofuranose 0.16

Lyxofuranose

50

2-azathianthrene28 22.676 Levoglucosan 0.2129 22.886 Xylose 0.25

Per(trimethylsilyl)-D-lyxose30 23.369 5-(p-Bromophenyl)-

7,11,11-trimethy0.35

33 24.016 alpha.-D-Xylopyranose,1,2,3,4-te

0.51

D-ArabinopyranoseD-Xylose

35 24.232 D-Ribo-Hexonic acid, 3-deoxy-2,5,6

0.47

2-Butene-1,4-diol, 2,3-dibromo

40 25.036 1,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha 3.2543 25.753 3-Bromo-5-ethoxy-4-

hydroxybenzalde3.80

7-Isopropenyl-1,4a-dimethyl-4,4a,51,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha

44 25.864 Tetradecanoic acid,trimethylsilyl

0.22

51 27.560 Ethyl 2,3,4,6-tetrakis 0.1352 27.799 D-Allofuranose 0.44

TalofuranoseD-Galactofuranose

53 28.318 Jasmonoyl 0.4155 28.644 alpha.-D-Glucopyranose 0.28

alpha.-D-MannopyranoseD-GALACTOSE

58 29.734 Methanonorandrost 6.1861 31.430 Methanoazulene 0.0962 31.535 Heptadecanoic acid 0.1563 32.660 Octadecadienoic acid 1.1764 32.788 Oleic acid 5.9865 32.911 Octadecenoic acid 1.77

Oleic acid74 36.554 Octadecanoic acid 1.36

Eicosanoic acid78 37.440 HEXOPYRANOSE 0.3380 37.690 3-Bromo-5-ethoxy-4-

hydroxybenzalde0.15

84 38.174 thyl-11-methylene 0.4087 38.506 D-Altrose 0.8594 39.596 Docosanoic acid 0.60100 40.663 Mannobiose 0.29

51

103 41.094 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde

0.18

106 41.450 METHYBUTYRYL 0.60109 42.429 Kokoononol 0.53

Tetracosanoic acidTRIMETHYLSILYL ESTEROF TETRACOSAN

111 45.087 Hexacosanoic acid 0.51Tetracosanoic acidTRIMETHYLSILYL ESTEROF TETRACOSAN

112 46.264 Cholesterol trimethylsilylether

0.56


0.10


0.12

119 48.625 .beta.-Sitosterol trimethylsilyl 1.21Endogenous 24S-EthylcholesterolEthylcholesterol trimethylsily

Los compuestos que se detectaron con mayor abundancia fueron:Methanonorandrost (6.18%), Oleic acid (5.98%), 3-Bromo-5-ethoxy-4-hydroxybenzalde (3.80%), 1,4a.beta.-Dimethyl-5-alpha (3.25%),Octadecenoic acid (1.77%), beta.-Sitosterol trimethylsilyl, (1.21%) yArabinopyranose 0.72.

52

III.15 Efecto cicatrizante del extracto etanólico de la tuna en ratonesde experimentación.

PRIMER DÍA:

Resultados obtenidos del ensayo pre-clínico (efecto cicatrizante) del

extracto etanólico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de

experimentación (Tabla XXV).

Tabla XXVI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el primer día de evaluación (Día 1).

*Letras iguales en la columna no presenta diferencia significativa entre los grupos.


En el primer día se realizó el corte produciendo la herida en la piel de los

ratones. Al momento del corte se observó un 100% de inflamación, humedad y el

tamaño de la herida fue de 0,5 cm y sin formación de costra.

GRUPOPARAMETROS

p>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

cmTamaño herida

AControl negativo

100 0 100 0,5 A

BControl positivo

100 0 100 0,5 A

COpuntia 10 ul

100 0 100 0,5 A

DOpuntia 20 ul

100 0 100 0,5 A

EOpuntia 30 ul

100 0 100 0,5 A

FEtanol 10 %

100 0 100 0,5 A

53

SEGUNDO DÍA:

A partir de este día se observó que los animales tratado con el extracto

etanólico del cladodio de Opuntia ficus indica presentaron humedad redcida e

inclusive algunos animales presentaron formación de costra. El tamaño de la

herida se mantuvo constante pero se observaron diferencias en el nivel de

inflamación.

Tabla XXVII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el segundo día de evaluación (Día 2).



Del análisis estadístico se pudo obtener que el porcentaje que presentaron

los grupos fueron: Humedad: A (80 ± 7,1), B (82 ± 6,8), presenta diferencias

significativas entre grupos, D (65 ± 5,5), E (63 ± 5,2). En tanto que los grupos

tratados con el extracto se encuentran significativamente disminuidos en relación

GRUPO

PARAMETROSp>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

cmTamaño herida

AControl

Negativo80 ± 7,1 0 73 ± 8,2 0,5 A, D, A, -

BControlPositivo

82 ± 6,8 0 75 ± 8,4 0,5 A, D, A, -

COpuntia 10 ul

73 ± 5,2 15,8 ± 2,0 60 0,5AB, C, B,

-

DOpuntia 20 ul

65 ± 5,5 18 ± 2,6 55 ± 5,5 0,5BC, B, B,

-

EOpuntia 30 ul

63 ± 5,2 21 ± 2,0 53 ± 5,2 0,5 C, A, B, -

FEtanol 10 %

77 ± 12,1 0 60 ± 6,3 0,5 A, D, B, -

54

a los grupos controles. En tanto que de costra no presenta diferencia entre los

grupos. A y B (0), C (15,8 ± 2,0), D (18 ± 2,6), E (21 ± 2,0), F (0). En cuanto a

inflamación: A (73 ± 8,2), B (75 ± 8,4), C (60), D (53 ± 5,2), E (53 ± 5,2), F (60 ±

6,3); siendo el tamaño herida para todos los grupos de (0,5).

TERCER DÍA:

Tabla XXVIII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el tercer día de evaluación (Día 3).

GRUPOPARAMETROS

p>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

cmTamaño herida

AControl negativo

65 ± 5,5 13 ± 2,7 62 ± 4,1 0,5A, D,

A, A

BControl positivo

67 ± 8,2 12 ± 2,6 65 ± 5,5 0,5A, D,

A, A

COpuntia 10 ul

53 ± 5,2 23 ± 2,7 35 ± 5,5 0,4BC, B,

B, C

DOpuntia 20 ul

48 ± 4,1 25 ± 3,2 30 ± 6,3 0,4C, AB,

B, C

EOpuntia 30 ul

47 ± 5,2 27 ± 2,6 27 ± 4,1 0,4C, A,

B, C

FEtanol 10 %

57 ± 5,2 16 ± 2,0 60 0,5 ± 0,1B, C,

A, B




los grupos fueron: Humedad: A presento (65 ± 5,5), B (67 ± 8,2); C (53 ± 5,2), D

(48 ± 4,1), E (47 ± 5,2), F (57 ± 5,2). En tanto que la costra se observó diferencia

entre los grupos de control A, B y los de tratamiento. En cuanto a la inflamación:

55

A presento (62 ± 4,1), B (65 ± 5,5), C (35 ± 5,5), D (30 ± 6,3), E (27 ± 4,1), F (60);

siendo el tamaño de la herida A y B (0,5), C, D, E, (0,4), F (0,5 ± 0,1).

CUARTO DÍA:

Tabla XXIX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el cuarto día de evaluación (Día 4).

GRUPO

PARAMETROSp>q

0,05%

Humedad%

Costra%

Inflamacióncm

Tamaño herida

AControl negativo

52 ± 4,1 23 ± 2,7 43 ± 5,2 0,5A, C,

B, A

BControl positivo

53 ± 5,2 18 ± 2,6 48 ± 4,1 0,5A, D,

A, A

COpuntia 10 ul

28 ± 2,6 63 ± 5,2 22 ± 4,1 0,4C, B,

C, C

DOpuntia 20 ul

24 ± 2,0 67 ± 5,2 18 ± 2,6 0,4D, AB,

CD, C

EOpuntia 30 ul

22 ± 2,6 70 17 ± 2,6 0,3D, A,

D, C

FEtanol 10 %

48 ± 2,6 23 ± 5,2 41 ± 4,1 0,4B, C,

B, B




los grupos fueron: Humedad: A (52 ± 4,1), B (53 ± 5,2), C (28 ± 2,6), D (24 ± 2,0),

E (22 ± 2,6), F (48 ± 2,6). En tanto que la costra: A (23 ± 2,7), B (53 ± 5,2), C (63

± 5,2), D (67 ± 5,2), E, (70), F (23 ± 5,2). En cuanto a la inflamación: A (43 ± 5,2),

B (48 ± 4,1), C (22 ± 4,1), D (18 ± 2,6), E (17 ± 2,6), F (41 ± 4,1); siendo el tamaño

de la herida A, B, C (0,5), D (0,4), E (0,3), F (0,4).

56

QUINTO DÍA:


extracto etanolico del cladodio de Opuntia ficus indica en ratones de

experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXIX).

Tabla XXX: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el quinto día de evaluación (Día 5).

GRUPOPARAMETROS

p>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

cmTamaño herida

AControlnegativo

28 ± 2,7 42 ± 4,1 27 ± 5,2 0,4 A, C, B, B

BControlpositivo

35 ± 5,5 33 ± 5,2 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 A, C, A, A

COpuntia 10 ul

13 ± 2,6 87 ± 5,2 11 ± 2,0 0,3 B, A, C, C

DOpuntia 20 ul

10 88 ± 6,9 8 ± 2,4 0,3 ± 0,1B, A, C,

CD

EOpuntia 30 ul

9 ± 3,8 88 ± 4,1 7 ± 2,6 0,3 ± 0,1 B, A, C, D

FEtanol 10 %

24 ± 2,0 50 23 ± 5,2 0,4 A, B, B, B


Elaborado por: (García & Ponce, 2017


los grupos en cuanto Humedad tienen diferencia los grupos A, B, F, con los del

tratamiento de opuntia C, D, E. En tanto que la costra: A (42 ± 4,1), B (33 ± 5,2),

C (87 ± 5,2), D (88 ± 6,9), E (88 ± 4,1), F (50). En cuanto a la inflamación: A (27 ±

5,2), B (0,5 ± 0,1), C (11 ± 2,0), D (8 ± 2,4), E (7 ± 2,6), F (23 ± 5,2); siendo el

57

tamaño de la herida A (0,4) B (0,5 ± 0,1), C (0,3), D (0,3 ± 0,1), E (0,3 ± 0,1), F

(0,4).

SEXTO DÍA:



experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXX).

Tabla XXXI: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el sexto día de evaluación (Día 6).




los grupos fueron: Humedad: A (8 ± 2,7), B (10), C, D, E (0), F (5). En tanto que la

costra: A (60), B (55 ± 5,5), C, D, E, F (65 ± 5,5). En cuanto a la inflamación: A (8

± 2,6), B (13 ± 2,6), C, D, E (0), F (8 ± 2,7); siendo el tamaño de la herida A (0,3 ±

0,1), B (0,4 ± 0,1), C (0,3 ± 0,1), D (0,3 ± 0, 05), E (0,2), F (0,3).

GRUPO

PARAMETROSp>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

cmTamaño herida

AControl negativo

8 ± 2,7 60 8 ± 2,6 0,3 ± 0,1 B, C, B, A

BControl positivo

10 55 ± 5,5 13 ± 2,6 0,4 ± 0,1 C, D, A, A

COpuntia 10 ul

0 100 0 0,3 ± 0,1 D, A, C, B

DOpuntia 20 ul

0 100 0 0,3 ± 0, 05 D, A, C, B

EOpuntia 30 ul

0 100 0 0,2 D, A, C, C

FEtanol 10 %

5 65 ± 5,5 8 ± 2,7 0,3C, B, B,

AB

58

SEPTIMO DÍA:



experimentación que se encuentran descritos en la tabla (XXXI).

Tabla XXXII: Promedio de porcentajes de inflamación, costra, humedad y

tamaño de herida obtenidas en el séptimo día de evaluación (Día 7).

GRUPOPARAMETROS

p>q0,05

%Humedad

%Costra

%Inflamación

CmTamaño herida

AControl negativo

0 88 ± 4,1 0 0,3 ± 0,1 -, B, -, -

BControl positivo

0 85 ± 5,5 5 0,3 -, C, -, -

COpuntia 10 ul

0 100 0 0,2 ± 0,1 -, A,-,-

DOpuntia 20 ul

0 100 0 0,1 ± 0,1 -, A, -, -

EOpuntia 30 ul

0 100 0 0,1 -, A, -, -

FEtanol 10 %

0 90 0 0,2 -, B, -, -



59


los grupos fueron: Humedad: A, B, C, D, E, F (0). En tanto que la costra: A (88 ±

4,1), B (85 ± 5,5), C, D, E (100), F (90). En cuanto a la inflamación: A (0), B (5),

C, D, E, F (0); siendo el tamaño de la herida A (0,3 ± 0,1), B (0,3), C (0,2 ± 0,1), D

(0,1 ± 0,1), E (0,1), F (0,2).

60

Discusión

El proceso de cicatrizaciónnormal implica ue en la parte inicial de la

inflamación se produce una extensión de la zona vascularizada con formación de

la costra superficial debido a la presencia de plaquetas y células inflamatorias en

la zona lesionada; y formación de un tapón (costra) producto de la coagulación.

Por otro lado, esta zona se regenera por la presencia de fibrina y colágeno (fase

proliferativa). El colágeno es reabsorbido y el proceso de remodelación puede ser

lento que en ocasiones puede tardar años. (Arauza, 2011)

En la data del dia 1 y 2 se observa la fase inflamatoria debido a la

presencia de histaminas, las cuales resultan en mayor humedad en la herida.

Posteriormente la presencia de tromboxanos y prostaglandinas permite que haya

mayor inflamación en todos los grupos de experimentación, pero aun no hay

formación de costra debido a la ausencia de fibroblastos que ayudan a la

cicatrización. (Senet, 2008)

La formación de costra fue notable a partir del dia 3 entre los grupos

tratados con Opuntia, debido a la presencia de fibroblastos que se dirigen al tejido

dañado (herida). Este desarrollo coincide con estudios anteriores, donde se

observó que las histaminas conjuntamente con los factores inflamatorios

disminuyeron totalmente. La formación de costra indica que existe una igualación

e los niveles de producción y degradación del colágeno. (Quiroga et al, 2013).

En la tabla XXVIII se observó que los grupos A y B presentan inflamación

y humedad a diferencia del grupo de aplicación C , D, E no hay presencia de

histaminas y la formación de costra llega al 50%, el grupo F tiene menor formación

de costra, no hay formación de fibroblastos por tal motivo el tamaño de la herida

no ha disminuido a comparación de la agrupación con el extracto del cladodio.

En la tabla XXIX se observó humedad en las heridas de los grupos de

aplicación, la costra en los grupos de Opuntia (C, D, E) han alcanzado el 100%

debido a que existe una igualación de los niveles de producción y degradación de

colágeno empezando la regeneración del tejido, ya que los fibroblastos dan paso

61

a los miofibroblastos que en unión a la actina hacen que los bordes de la herida

empiecen a contraerse. En cuanto a inflamación se presentó un 40% en el grupo

B es decir, que aún están presentes tromboxanos y prostaglandinas.

El tamaño de la herida va disminuyendo de manera progresiva de 0,5 a 0,3

cm a parti del dia 3 para los grupos de Opuntia. La cicatrización natural en el

grupo del control negativo empieza a partir del día 5, en este momento los

miofibroblastos son atraídos por la fibronectina y factores de crecimiento que se

desplazan para alcanzar los bordes de la herida, los fibroblastos depositan

colágeno en la herida para reforzarla, en esta etapa el cierre de la herida se da

con mayor rapidez debido a la presencia de los miofibroblastos. (Alonso, 2014)

IV. CONCLUSIONES

Se obtuvo el extracto etanolico del nopal (Opuntia ficus indica L) por

maceración, las caracteristicas sobre los factores organolépticos se encuentran

62

dentro de los parámetros establecidos en comparación con estudios antes

realizados, al igual que los resultados del control de calidad, los cuales nos indica

que el extracto se encuentra en condiciones aptas para realizar esta investigación.

Los valores de pH, índice de refracción y densidad se consideraron únicos debido

a inexistencia de datos preliminares.

Los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico evidenciaron la

presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, taninos, flavonoides,

cumarinas y glucósidos. Por otro lado, la cuantificación de flavonoides y

polisacáridos confirmo una mayor presencia de polisacáridos (1457,08 mg/100 g

cladodio) a diferencia de los flavonoides (53,81 mg/100 g cladodio).

Se comprobó experimentalmente el efecto cicatrizante que posee el

extracto del nopal (Opuntia ficus indica L) posee actividad cicatrizante pues al

realizar el estudio preclínico en diferentes grupos de tratamiento se logró observar

la disminución del tiempo de cicatrización ya que al segundo día de aplicación

hubo formación de costra, reducción de humedad, de inflamación debido a la

presencia de polisacáridos y flavonoides que ayudan en la aceleración de la

reepitelizacion de la zona y a la remodelación de los tejidos.

Se identificaron varios metabolitos del extracto etanolico de los cladodio

de Opuntia por medio del análisis cromatografico acoplado a masas.

63

V. RECOMENDACIONES

Realizar un gel que contengan los principios activos de cladodio de Opuntia

ficus indica que brinde acción antiinflamatoria – cicatrizante, cumpliendo los

diferentes controles de calidad, garantizando la seguridad en su aplicación.

Realizar ensayos de toxicidad a diferentes dosis del extracto del cladodio

(Opuntia ficus indica L) para la identificación de posibles reacciones adversas.

Elaborar formas farmacéuticas a partir del cladodio que cumplan con las

normas de BPM (Buenas Prácticas de Manufactura) y control de calidad

garantizando seguridad y eficacia para los consumidores.

Realizar estudios en las diferentes variedades de especie para la

cuantificación de polisacáridos presentes en los cladodios

64

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67

ANEXOS

TRATAMIENTO DE LOS CLADODIOS PARA REALIZAR EL EXTRACTO ETANOLICO

Recoleccion demuestra

Desespinado del cladodio Eliminacion de la corteza

Cortes pequeños delcladodio

Introducir la muestra en laestufa

Muestra seca

Triturado del cladodioseco

Pulverizado de la muestraseca

Tamizado

68

Muestra pulverizada ytamizada

Macerado etanolico de lamuestra pulverizada

Filtrado del maceradoetanolico

TAMIZAJE FITOQUÍMICO

Medicion del indice de refraccion y pH del extracto etanolico de los cladodios

Refractometro Indice de refracción Toma de Ph

69

Análisis Organoleptico Cumarinas Triterpenos

Antocianinas Quinonas Bouchardaf

Glucocidos Taninos Shinoda

70

Mayer Wagner Dragendorf

Resinas Saponinas

71

Solidos totales Cenizas totales

Filtrado de las cenizas con HCl Cenizas despues de la mufla

Sustancias solubles

La muestra luego de pasar 6 horas con elagitador magnético se lo dejo reposar 24

horas.

Filtrado de la muestra que estuvo enreposo

72

Cuantificación de polisacáridos

Pesada de la muestra Refrujo de la muestra con aguadestilada

Filtrado de la muestra Lectura en el espectrofotometro

Solidos totales

5ml del extracto de opuntia Evaporado y secado en la estufa

73

Cuantificación de flavonoides

Pesada Agitación vortex Muestradespués delvortex

Filtrado de muestra

Lectura en el espectrofotometro

74

Determinación de flavonoides

Aplicación de la muestra en la silica gel Muestra aplicada encromatografía de capa fina

Lectura de cromatografía de capa fina

75

Ensayo Pre- clínico en ratones de experimentación

Ratones rasurados Aplicación de anestesia

Corte de la piel Medicion de la herida

76

Grupo A: Cicatrización natural

Día 1 Día 2 Día 3

Día 4 Dia 5 Día 6

Día 7

77

Grupo B: Control positivo B – sitosterol



Día 7

78

Grupo C: Extracto etanolico 10ul



Dia 7

79

Grupo D: Extracto etanolico 20 ul



Día 7

80

Grupo E: Extracto etanolico 30 ul



Día 7

81

Grupo F: Alcohol al 10%



Dia 7

82

Perfil cromatografico del extracto etanolico de Opuntia ficus indica

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

1e+08

2e+08

3e+08

4e+08

5e+08

6e+08

7e+08

8e+08

9e+08

Time-->

Abundance

TIC: OPUNTIA 1.D\data.ms

83

Documento de la donación del material biológico

84

Resultados de la clasificación taxonomica realizada en el herbario de laFacultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE …repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/28389/1/BCIEQ-T-0258...

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