UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

TEMA:

¨ ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR

DEL SHIITAKE (Lentinula edodes) ¨

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO

PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y

FARMACÉUTICO.

AUTORAS:

Berrús Jiménez Helen Ellinor

Segarra Rodríguez Joselyn Daniela

TUTORA:

Q.F. María Elena Jiménez Heinert MS.c

GUAYAQUIL - ECUADOR

2019

xii

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ........................................................................................................... xix

ABSTRACT ........................................................................................................... xx

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

CAPÍTULO I. PROBLEMA ...................................................................................... 2

I.1 Planteamiento del problema ........................................................................... 2

I.2 Formulación del problema .............................................................................. 2

I.3 Justificación e importancia .............................................................................. 3

I.4 Hipótesis ......................................................................................................... 3

I.5 Objetivos ......................................................................................................... 4

I.5.1 Objetivo general ........................................................................................ 4

I.5.2 Objetivos específicos ................................................................................ 4

I.6 Operacionalización de variables ..................................................................... 5

CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO .......................................................................... 6

II.1 Generalidades ............................................................................................... 6

II.2 Tipos de hongos ............................................................................................ 7

II.3 Estructura de la seta ...................................................................................... 8

II.3.1 Sombrero o píleo ..................................................................................... 8

II.3.2 Himenio .................................................................................................... 9

II.3.3 Pie o estípite ............................................................................................ 9

II.3.4 Anillo o velo ............................................................................................. 9

II.3.5 Volva ........................................................................................................ 9

II.3.6 Micelio .................................................................................................... 10

II.4 Clasificación de las setas ............................................................................. 10

II.5 Hongos comestibles..................................................................................... 10

II.6 Características del hongo ............................................................................ 11

II.7 Condiciones de crecimiento ......................................................................... 12

II.7.1 Incubación: ............................................................................................ 12

II.7.2 Browning o formación de micoderma café ............................................. 13

II.7.3 Formación de primordios ....................................................................... 13

II.7.4 Desarrollo del cuerpo fructífero y cosecha ............................................. 14

xiii

II.7.5 Inactivación de los bloques .................................................................... 15

II.8 Taxonomía Lentinula edodes ....................................................................... 16

II.9 Propiedades ................................................................................................. 16

II.10 Hábitat de crecimiento ............................................................................... 17

II.11 Condiciones de crecimiento y desarrollo ................................................... 17

II.11.1 Temperatura ........................................................................................ 18

II.11.2 Humedad ............................................................................................. 18

II.11.3 Luz ....................................................................................................... 18

II.11.4 Aireación .............................................................................................. 18

II.12 Composición nutricional ............................................................................. 19

II.13 Compuestos bioactivos. ............................................................................. 19

II.13.1 β- glucanos .......................................................................................... 20

II.13.2 Polisacáridos ....................................................................................... 21

II.13.3 Lentinan ............................................................................................... 21

II.13.4 Eritadenina ........................................................................................... 21

II.13.5 Quitina y quitosano .............................................................................. 22

II.13.6 Ergosterol ............................................................................................ 22

II.14 Acción farmacológica ................................................................................. 22

II.14.1 Antioxidante ......................................................................................... 22

II.14.2 Antitumoral ........................................................................................... 23

II.14.3 Antiviral ................................................................................................ 23

II.14.4 Efecto hipocolesterolémico y antihipertensivo ..................................... 24

II.14.5 Inmunoestimulante ............................................................................... 24

II.14.6 Antimicrobiana ..................................................................................... 24

CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO .......................................................... 25

III.1 Tipo de Investigación .................................................................................. 25

III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos ................................................. 25

III.2.1 Materiales de laboratorio ...................................................................... 25

III.2.2 Equipos de Laboratorio ......................................................................... 26

III.2.3 Reactivos .............................................................................................. 26

III.3 Muestra ....................................................................................................... 27

III.4 Metodología Experimental .......................................................................... 27

xiv

III.4.1 Evaluación Macro morfológica de la Seta ............................................. 27

III.5 Secado ........................................................................................................ 28

III.6 Molienda ..................................................................................................... 28

III.7 Almacenamiento ......................................................................................... 28

III.8 Parámetros Físico – Químicos .................................................................... 29

III.8.1 Humedad Residual ............................................................................... 29

III.8.2 Cenizas totales ..................................................................................... 30

III.8.3 Cenizas solubles en agua ..................................................................... 31

III.8.4 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ................................................ 32

III.9 Tamizaje Fitoquímico .................................................................................. 32

III.9.1 Ensayo de Sudán.................................................................................. 33

III.9.2 Ensayo de Dragendorff ......................................................................... 33

III.9.3 Ensayo de Mayer .................................................................................. 34

III.9.4 Ensayo de Wagner ............................................................................... 34

III.9.5 Ensayo de Baljet ................................................................................... 34

III.9.6 Ensayo de Borntrager ........................................................................... 35

III.9.7 Ensayo de Liebermann - Buchard......................................................... 35

III.9.8 Ensayo de Catequinas .......................................................................... 36

III.9.9 Ensayo de Resinas ............................................................................... 36

III.9.10 Ensayo de Fehling .............................................................................. 36

III.9.11 Ensayo de Espuma ............................................................................. 36

III.9.12 Ensayo de Cloruro Férrico ................................................................... 37

III.9.13 Ensayo de Ninhidrina .......................................................................... 37

III.9.14 Ensayo de Shinoda ............................................................................. 38

III.9.15 Ensayo de Antocianidinas ................................................................... 38

III.10 Análisis por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas

(CG-EM) ............................................................................................................ 42

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................... 43

IV.1 Evaluación Macromorfológica de las setas ................................................ 43

IV.2 Determinación de los parámetros fisicoquímicos ....................................... 45

IV.2.1 Determinación de Humedad Residual .................................................. 45

IV.2.2 Determinación de cenizas .................................................................... 46

xv

IV.4 Identificación de compuestos por Cromatografía de Gases acoplado a

Espectrometría de Masas (CG/EM). .................................................................. 51

CONCLUSIONES ................................................................................................. 53

RECOMENDACIONES ......................................................................................... 54

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 55

GLOSARIO ........................................................................................................... 62

ANEXOS ............................................................................................................... 66

xvi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Operacionalización de variables ................................................................ 5

Tabla II. Parámetros de Incubación. ..................................................................... 12

Tabla III. Parámetros de formación de micoderma café ....................................... 13

Tabla IV. Parámetros de formación de primordios. ............................................... 14

Tabla V. Parámetros para el desarrollo de cuerpo fructífero y cosecha. .............. 15

Tabla VI. Taxonomía del shiitake .......................................................................... 16

Tabla VII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de

setas de Lentinula edodes ¨desglose¨ ................................................................... 44

Tabla VIII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de

setas de Lentinula edodes ¨consolidado¨ .............................................................. 45

Tabla IX. Resultado de porcentaje Humedad residual de setas de Lentinula

edodes .................................................................................................................. 45

Tabla X. Resultado de porcentaje de Cenizas totales de setas de Lentinula

edodes. ................................................................................................................. 46

Tabla XI. Resultado de porcentaje de Cenizas solubles en agua de setas de

Lentinula edodes ................................................................................................... 47

Tabla XII. Resultado de porcentaje de Cenizas insolubles en ácido de setas de

Lentinula edodes. .................................................................................................. 47

Tabla XIII. Resultados del Tamizaje Fitoquímico de Lentinula edodes ................. 50

Tabla XIV. Resultados de la Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría

de Masas (CG/EM) de Lentinula edodes. ............................................................. 52

xvii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Cuerpo fructífero...................................................................................... 6

Figura 2. Partes de la seta ..................................................................................... 8

Figura 3. Shiitake proveniente de Quito ............................................................... 16

Figura 4. Procedimiento para realizar los extractos .............................................. 39

Figura 5. Ensayos a realizar en los diferentes extractos. ..................................... 40

Figura 6. Ensayos a realizar en los diferentes extractos ...................................... 41

Figura 7. Perfil cromatográfico de hongo seco y triturado .................................... 52

xviii

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Pre tratamiento de la muestra - secado y pulverizado ........................... 66

Anexo 2. Determinación de Humedad Residual ................................................... 67

Anexo 3. Determinación de Cenizas Totales ........................................................ 67

Anexo 4. Extractos ............................................................................................... 67

Anexo 5. Tamizaje Fitoquímico de los extractos Etéreo, Alcohólico y Acuoso ..... 67

xix

¨ ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR DEL

SHIITAKE (Lentinula edodes) ¨

Autores: Helen Ellinor Berrús Jiménez; Joselyn Daniela Segarra Rodríguez

Tutor: Q.F. María Elena Jiménez Heinert M.Sc.

RESUMEN

El shiitake es considerado un macrohongo, compuesto principalmente por proteínas, triterpenos, aminoácidos y polisacáridos, resaltando entre ellos, el lentinan y pleuran los cuales son utilizados en la industria farmacéutica por su abundante actividad biológica. Los hongos comestibles son cada vez más usados, por sus sabores y la cantidad de propiedades que suelen presentar, de tal manera mejoran la salud de los consumidores, así como el shiitake que resalta por sus cualidades consagrándolo como un alimento funcional. En Ecuador son muy pocos los lugares que cultivan el Lentinula edodes y que a pesar de todos sus beneficios no ha sido lo suficientemente expuesto a la sociedad. Realizar la evaluación de la composición química y metabolitos secundarios de la seta del hongo cultivado en Ecuador es el objetivo principal de la investigación y fue comprobado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), tamizaje fitoquímico y parámetros físico químicos como cenizas totales, humedad relativa. La cromatografía permitió verificar los compuestos bioactivos mayoritarios, aminoácidos y entre otros metabolitos. El resultado de la humedad residual fue de 7.48%, cenizas totales 7.3%, cenizas solubles en agua 6.1% y cenizas insolubles en ácido 5.6%, encontrándose dentro de los parámetros normales. Los resultados de la variedad cultivada en Ecuador concuerdan con los resultados reportados anteriormente para el macrohongo cultivado en Asia.

Palabras clave: Lentinula edodes, lentinan, pleuran.

xx

“PRELIMINARY PHARCHEMICAL AND PHYTOCHEMICAL STUDY OF

SHIITAKE (Lentinula edodes)”

Authors: Helen Ellinor Berrús Jiménez; Joselyn Daniela Segarra Rodríguez

Advisor: Q.F. María Elena Jiménez Heinert M.Sc.

ABSTRACT

Shiitake is considered a macrohongo, composed mainly of proteins, triterpenes, amino acids and polysaccharides, highlighting among them, lentinan and pleura which are used in the pharmaceutical industry for its abundant biological activity. Edible mushrooms are increasingly used, for their flavors and the amount of properties they usually present, thereby improving the health of consumers, as well as shiitake that stands out for its qualities, consecrating it as a functional food. In Ecuador there are very few places that cultivate Lentinula edodes and that despite all its benefits it has not been sufficiently exposed to society. Performing the evaluation of the chemical composition and secondary metabolites of the mushroom mushroom grown in Ecuador is the main objective of the research and was verified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), phytochemical screening and physical chemical parameters such as total ashes, relative humidity. Chromatography allowed to verify the majority bioactive compounds, amino acids and among other metabolites. The residual moisture result was 7.48%, total ashes 7.3%, water soluble ashes 6.1% and acid insoluble ashes 5.6%, being within normal parameters. The results of the variety grown in Ecuador coincide with the results previously reported for macrohong grown in Asia.

Keywords: Lentinula edodes, lentinan, pleuran.

1

INTRODUCCIÓN

El shiitake (Lentinula edodes), es un hongo medicinal utilizado para fortalecer el

sistema inmune, muy apreciado en la medicina tradicional china. Desde siglos atrás

los países asiáticos incluyen en su dieta diaria diferentes tipos de hongos, y es

debido a su ingesta que se les atribuye el bajo índice de enfermedades y mejor

calidad de vida. En los monasterios, se llegó a relacionar su longevidad con la

propiedad de dicha seta. Se conoce que algunos budistas vivían más años que

aquellos que no lo consumían.

En la Industria Farmacéutica, se procesa un compuesto derivado del hongo, que

en la actualidad se incorpora a varios tratamientos para diversas enfermedades, por

lo cual se ha incrementado el cultivo en esta década. La producción mundial de

hongos la encabeza el champiñón (Agaricus bisporus), y como segundo está el

shiitake (Lentinula edodes), con un 25%.

En Ecuador en los últimos años, hay un reducido crecimiento en el mercado por

el cultivo de shiitake, y el estudio de parte de algunas empresas para el desarrollo

de medicamentos no ha sido favorable. El hongo crece en un ambiente áspero, se

desarrolla en materiales leñosos o ricos en fibra como los troncos de cierto tipo de

árboles. Para sus producciones de ciclo corto se utiliza otros materiales que tengan

una composición similar, por lo general se usan residuos de la industria maderera,

incorporándole un ambiente natural.

El shiitake sobresale por su olor, color, sabor, textura; posee más proteínas que

los vegetales; se destaca por poseer al polisacárido conocido como lentinan, del

mismo que se ha demostrado características anti-infecciosas y anti-cancerígenas.

Presenta vitaminas del grupo B, que contribuyen al balance metabólico, mejorando

la función del sistema inmune y reduciendo el colesterol (Romero, Martinez, &

Huato, 2015).

2

CAPÍTULO I. PROBLEMA

I.1 Planteamiento del problema

Los hongos han creado desde siempre una gran incertidumbre por la forma de

desarrollarse en el medio ambiente, así como por su diversidad; se destacan por

sus atributos farmacológicos y como alimentos funcionales proporcionando una

buena salud física y reduciendo enfermedades.

La comercialización de hongos comestibles en Norte América, Europa y Asia ha

tenido un gran apogeo debido a su valor nutritivo, entre ellos el shiitake (Lentinula

edodes) que consumido en una dieta normal se lo puede referir como un

nutraceútico, conociendo todos sus beneficios se crea la necesidad de incluirlo en

el mercado ecuatoriano de una manera accesible y económica.

Lentinula edodes es una seta procedente de Asia, además de poseer

propiedades medicinales y alimenticias, sobresalen sus altos contenidos de

proteínas y un componente denominado lentinan el cual es conocido por presentar

características anti infecciosas y anticancerígenas. No se reportan investigaciones

hechas en Ecuador, que profundicen estudios acerca de los metabolitos presentes

en la seta de Lentinula edodes, para poder conocer más de los componentes activos

y sus funciones para el beneficio del ser humano.

I.2 Formulación del problema

¿Presentará la seta del shiitake (Lentinula edodes) cultivado en Ecuador

componentes bioactivos con propiedades medicinales y alimenticias?

3

I.3 Justificación e importancia

Los hongos constituyen una gran fuente de sustancias bioactivas que tienen

diversos usos, por ejemplo, aplicaciones dentro del campo alimenticio y

farmacéutico; el shiitake se muestra como una plataforma viable para la obtención

de proteínas, fibras, polisacáridos, ácidos orgánicos y otras sustancias utilizadas

para la elaboración de medicamentos, siendo la esperanza para el control de

diversas enfermedades que aquejan al hombre moderno.

Lentinula edodes ocupa el segundo lugar de cultivo a nivel mundial, antecedido

por el champiñón blanco (Agaricusbisporus). El shiitake posee metabolitos como la

eritadenina y lentinan que se les atribuye la característica de ser agentes biológicos

para la prevención de ciertos tipos de cáncer, además de tener efecto antioxidante

y disminuir los niveles de colesterol en sangre (Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).

El proyecto es muy importante porque se podrán conocer los componentes

bioactivos de la seta del shiitake (Lentinula edodes) cultivadas en Ecuador, y a su

vez se identificarán los metabolitos secundarios y así en las siguientes

investigaciones se podrían determinar la utilidad farmacológica de estos.

I.4 Hipótesis

El shiitake, cultivado en Ecuador, posee componentes bioactivos beneficiosos

para la salud del ser humano.

4

I.5 Objetivos

I.5.1 Objetivo general

Evaluar la composición química y metabolitos secundarios de la seta ecuatoriana

del shiitake (Lentinula edodes).

I.5.2 Objetivos específicos

Caracterizar fisicoquímica y macro morfológicamente la seta del shiitake

(Lentinula edodes).

Determinar cualitativamente la presencia o ausencia de metabolitos

secundarios mediante tamizaje fitoquímico de la seta del shiitake (Lentinula

edodes).

Identificar los metabolitos secundarios presentes en la seta del shiitake

(Lentinula edodes) por CG-EM.

5

I.6 Operacionalización de variables

Tabla I. Operacionalización de variables

Fuente: Autores.

TIPO VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADOR

Dependientes

Características

macro morfológicas

-Tamaño

-Peso

Unidad de medida

(S.I)

Características

farmacológicas

- Humedad

- Cenizas totales

-Cenizas insolubles en agua

-Cenizas insolubles en ácido

Porcentaje (%)

Metabolitos

secundarios

-Tamizaje fitoquímico

-Perfil cromatográfico

-Pruebas positivas

-Picos

cromatográficos

Independiente Tipo de muestra -Nombre de la especie

-Lugar de cultivo Seta

6

CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO

II.1 Generalidades

Los hongos componen un grupo de seres vivos diferentes a las plantas y los

animales, desde 1969 fueron clasificados en un reino denominado Fungí que

comprende levaduras, mohos y setas (Montes, 2003).

Según (Pacheco, 2013) los hongos son definidos como “macrofungos con un

cuerpo fructífero característico que puede ser tanto epigeo como hipogeo”. Se

denomina hongo al cuerpo fructífero, los cuales producen esporas o también

denominadas células reproductoras, que se encuentran ubicadas debajo del

sombrero (figura 1).

Se debe por su reproducción asexual y se desempeñan únicamente a nivel fe

tejidos. Carecen de clorofila, por lo que su forma de vivir es saprofita; dependiendo

Figura 1. Cuerpo fructífero (Pacheco, 2013)

7

de materia orgánica en descomposición mejorando de esta manera su eficacia y

cultivo (Almendros, 2012).

Lentinula edodes, es conocido con el nombre de shiitake oriundo de China. El

primer lugar donde fue cultivado ocurrió probablemente en la región montañosa de

esta nación, luego fueron introducidas en Japón, que es hoy en día el mayor

productor del hongo (Andrade, 2014).

En la actualidad se cultiva y se considera dentro del grupo de hongos comestibles

de mayor consumo en el mundo. Principalmente consumido en América Latina con

una producción de 86.8%. En Ecuador se reporta pocas investigaciones sobre

cultivos de seta comestible siendo la ciudad de Aloag una de las pioneras en la

implementación de hongos shiitake en el mercado ecuatoriano (Andrade, 2014).

II.2 Tipos de hongos

La seta es la parte comestible del hongo, denominada también como carpóforo,

pero no todos estos organismos poseen setas, por ejemplo, las levaduras. Los

hongos se dividen en cinco grupos: ficomycetes, mixomycetes, ascomycete,

basidiomycetes y deutromycetes, entre los grupos que proporcionan más setas

están los basidiomicetes que se reproducen sexualmente y sus células encargadas

de la producción de las esporas se denominan basidios. El grupo ascomycete puede

tener una reproducción asexual, la cual es frecuente e involucra la producción de

conidióforos. En cuanto a la reproducción sexual desarrolla hifas de la cepa

masculina que origina un anteridio o femenina que produce un ascogonio (Kuhar &

Papinutti, 2013).

8

II.3 Estructura de la seta

Según (Rodríguez, 2011) las setas generalmente constan de las siguientes

partes: micelio, volva, pie, himenio, laminilla, lamina y sombrero las mismas que se

las puede observar en la figura 2.

Figura 2. Partes de la seta (Pacheco, 2013)

II.3.1 Sombrero o píleo

Es la parte carnosa del hongo, suelen tener diferentes formas que van desde

redondeada, sombrilla, plana o ahuecada. En la parte superior puede presentar

verrugas o placas.

9

II.3.2 Himenio

Es la parte reproductora del hongo, es decir donde se desarrollan las esporas, se

encuentra en la parte inferior de la seta, debajo del sombrero, suele encontrarse en

forma de laminillas, tubos, arrugas o venosidades.

II.3.3 Pie o estípite

Se caracteriza por sostener la parte superior del hongo, puede tener las

siguientes formas: grueso, fino, corto, abombado, retorcido o excéntrico, lo cual

permitirá clasificar a las distintas especies.

II.3.4 Anillo o velo

Esta parte suele ser doble, sencillo y caído, su función es proteger el himenio

cuando el hongo esta joven.

II.3.5 Volva

Se encuentra presente en ciertas setas en su fase de crecimiento, tiene parecido

a una capucha, es el resto del velo que cubre algunas especies en el instante de

fructificar, puede quedarse sobre el sombrero en forma de verrugas, en el borde en

forma de cortina, en el pie en forma de anillo y en la base del pie como volva.

10

II.3.6 Micelio

Parte del hongo formado por un filamento filiforme de característica microscópica

y delgada que reciben el nombre de hifas. Pueden presentar septos, si los tabiques

están ausentes se lo denomina micelio continuo.

II.4 Clasificación de las setas

Se clasifican según la forma de alimentarse, entre ellas resaltan, las setas

parásitas que viven a costas de organismos como animales, plantas, insectos e

incluso otros hongos, ocasionando daños. Las setas simbióticas son las que se

alimentan por asociación con distintos organismos vivos y por último las saprófitas

son aquellas que viven sobre materia orgánica en descomposición. Además, existen

setas de diversa utilidad, por ejemplo, comestibles, venenosas o tóxicas y

alucinógenas (Rodríguez, 2011).

II.5 Hongos comestibles

Los hongos representan una gran biodiversidad, y son organismos que muestran

cualidades importantes utilizadas como alimentos e incluso en la elaboración de

antibióticos. En la actualidad los hongos son considerados fundamentales en la

dieta, ya que proporcionan numerosos nutrientes, vitaminas, fibras, proteínas,

incluso son libres de colesterol, siendo así que son utilizados en medicina

tradicional. Se ha comprobado los beneficios en algunas enfermedades como por

ejemplo en el tratamiento de Parkinson, hipertensión, Alzhéimer, además participan

en reducir la probabilidad de cáncer por sus atributos antitumorales. Debido a todas

sus propiedades se incluyen en suplementos dietéticos (Valverde, Hernández, &

Paredes, 2015).

11

Los hongos comestibles son una gran fuente de proteínas entre ellas destacan

la valina, leucina, ácidos aspárticos y glutamina. La composición química que

contenga una seta depende de las características de crecimiento, cosecha, post

cosecha, condiciones de almacenamiento y procesamiento. Algunos de los

azúcares presentes en Lentinula edodes son: manitol 23.3g y trehalosa 13.22g, la

especie Pleurotus ostreatus; presenta 0.01g de fructosa, 0.54 g de manitol y

trehalosa 4.42g (Valverde, Hernández, & Paredes, 2015).

Dentro de los hongos comestibles destaca el shiitake por sus características

organolépticas con increíbles propiedades medicinales y alimenticias, además de

ser utilizado como sustrato al emplear los residuos agrícolas y forestales, en general

posee más proteínas, vitaminas, aminoácidos y minerales que los vegetales. Por

estas cualidades de la seta su producción ha ido incrementando, alcanzando así el

segundo lugar en la escala de producción de hongos medicinales y comestibles del

mundo (Romero, Martinez, & Huato, 2015).

II.6 Características del hongo

El sombrero del shiitake va desde 5 a 12 cm de ancho, tiene un umbón color

castaño claro. La parte superior del sombrero está cubierta por escamas

blanquecinas, de manera simultánea las laminillas nacen y se desarrollan juntas, de

forma libre. El pie del hongo se caracteriza por ser corto y cubierto por escamas

fibrosas, el anillo puede ser de color blanquecino o castaño claro; el sombrero tiene

la característica de ser firme, además de poder secarse y rehidratarse fácilmente

(Ancco, 2013).

Los cuerpos fructíferos tienen acción terapéutica debido a los compuestos

bioactivos que presenta. A nivel mundial solo el 6% de la diversidad fúngica ha sido

estudiado a pesar de existir una extensa gama de hongos comestibles que pueden

12

ser añadidos a la dieta diaria y ser consumidos con seguridad (Estrada & Bautista,

2016).

II.7 Condiciones de crecimiento

Según (Villegas, 2007) para un buen crecimiento del hongo se encuentran las

siguientes etapas y parámetros:

II.7.1 Incubación:

Entiende desde el primer día de la inoculación hasta que se note la presencia de

ampollas en las bolsas o “popcorning” y los primeros indicios de coloración café,

parámetros que se indican en la tabla II.

Tabla II. Parámetros de Incubación.

PARÁMETROS

pH inicial 5.5 -5.6 Concentración

de CO2

>10000

ppm

Temperatura

de

incubación

21-27°C Intercambio de

aire fresco

0-1 volumen

de aire/hora

Humedad

relativa 95-100%

Requerimiento

de luz 50 - 100 Lux

Duración 25 - 30 días

OBSERVACIÓN: Antes de la fructificación el

requerimiento de luz puede descender a 35 - 45 Lux.

Fuente: Autores.

13

II.7.2 Browning o formación de micoderma café

El browning inicia cuando se adhiere el sustrato y el metabolismo empieza a

contrarrestar junto con la temperatura del núcleo. Se diferencia por la formación de

ampollas seguido por una coloración café responsables de impedir la deshidratación

del bloque (Stamet & Chilton, 1893) .

Las condiciones para la formación de micoderma se detallan en la tabla III.

Tabla III. Parámetros de formación de micoderma café

PARÁMETROS

Temperatura 10-21°C

Humedad

relativa > 90


Concentración

de CO2 < 1000 ppm

Requerimiento

de luz 50 -100 Lux

Fuente: Autores.

II.7.3 Formación de primordios

Comprende desde el popcorning hasta la existencia de los primeros primordios.

Antes del popcorning se produce un choque térmico, sumergiendo los bloques de

agua a 5-16ºC durante 12 a 24 horas o reduciendo la temperatura ambiental (o

enfriándolos a 4-8ºC durante 12-24 horas, en nevera (Stamet & Chilton, 1893).

14

Los indicadores para la formación de primordios se encuentran descritos en la

tabla IV.

Tabla IV. Parámetros de formación de primordios.

PARÁMETROS

pH inicial 4.2 - 4.6 Concentración

de CO2 < 10000 ppm

Temperatura

10-16°

(frio)

16 -21°C

(caliente)

Intercambio

de aire fresco

4-7 volumen

de aire/hora

Humedad

relativa 95-100%

Requerimiento

de luz

500 - 2000

Lux


Fuente: Autores.

II.7.4 Desarrollo del cuerpo fructífero y cosecha

En la tabla V se exponen los parámetros para el proceso de crecimiento del

cuerpo fructífero del hongo y cosecha.

15

Tabla V. Parámetros para el desarrollo de cuerpo fructífero y cosecha.

PARÁMETROS

Duración 5 -8 días Concentración

de CO2 < 1000 ppm

Temperatura

16 -18°C

(frio)

21 -27°C

(cálido)

Intercambio

de aire fresco

4-8 volumen

de aire/hora

Humedad

relativa 60 - 80%

Requerimiento

de luz

500 - 2000

Lux

OBSERVACIÓN: Niveles de luz por debajo de 500 Lux

causan elongación del estípite

Fuente: Autores

La cosecha ocurre cada 2 a 3 semanas durante 8 a 12 semanas y muchas veces

hasta 16 semanas.

II.7.5 Inactivación de los bloques

Abarca desde el primer día de cosecha hasta cuando se forma una capa café de

células muertas en el bloque.

Temperatura: 21-25ºC

Humedad relativa: 30-50%

Duración: 7-10 días

16

Figura 3. Shiitake proveniente de Quito

II.8 Taxonomía Lentinula edodes

El shiitake (figura 3) es descrito como un macrohongo basidiomiceto clasificado

taxonómicamente por (Pegler, 1983) en la tabla VI.

Tabla VI. Taxonomía del shiitake

Fuente: Autores

II.9 Propiedades

La presencia de polisacáridos, flavonoides, triterpenos y otros compuestos hacen

que los hongos comestibles sean considerados como alimentos funcionales. La

cultura asiática lo destaca como nutraceútico, se lo utiliza como droga según lo

reporta la farmacopea oriental. Se destacan diversos metabolitos presentes en el

micelio y el cuerpo fructífero atribuyéndoles actividades antivirales, antitumorales,

antiparasitarias, reguladoras de presión sanguínea y antinflamatorias. El estípite y

el píleo contiene lentinan que dispone de propiedades inmunoestimuladoras y

CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Reino Fungí

División Basidiomycota

Clase: Basidiomycetes

Subclase: Agaricomycetidae

Familia: Agaricaceae

Género: Lentinula

Cepa: Lentinula edodes

https://es.wikipedia.org/wiki/Reino_(biolog%C3%ADa)

https://es.wikipedia.org/wiki/Fungi

https://es.wikipedia.org/wiki/Clase_(biolog%C3%ADa)

https://es.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9nero_(biolog%C3%ADa)

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Lentinula&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/wiki/Especie

17

anticancerígenas, el shiitake posee quitina, ergosteroles y eritadenina los cuales

hacen que un alimento sea enriquecido a nivel medicinal y nutricional (Estrada &

Bautista, 2016).

II.10 Hábitat de crecimiento

Los hongos necesitan materia viva y muerta para su crecimiento y desarrollo,

adquieren sus nutrientes por el crecimiento en materia orgánica muerta denominada

saprófitos, crecen en asociación con otros organismos (simbióticos) y con daño a

otros organismos (patógenos o parasíticos). Lentinula edodes se desarrolla sobre

diferentes especies de madera en descomposición. Se cultiva ampliamente en Asia

Oriental, pero no en zonas frías ya que su temperatura óptima se encuentra

alrededor de 24°C (De Turris, 2013).

El ciclo de vida de L. edodes posee la fase vegetativa y reproductiva; cuando las

esporas de la seta se desarrollan en un ambiente oportuno da paso a la formación

del micelio seguido de la aparición de primordios hasta llegar a la segregación de

nuevas esporas para que dé inicio a un nuevo ciclo (Zavatela, 2015).

II.11 Condiciones de crecimiento y desarrollo

Distintos factores físicos, además de nutricionales afectan el crecimiento y

desarrollo del shiitake (Rodriguez, 2013).

18

II.11.1 Temperatura

La temperatura óptima esta alrededor de los 25ºC para la correcta producción de

metabolitos secundarios como es el polisacárido lentinan derivado del micelio de la

seta, que se reporta útil en el tratamiento de ciertos cánceres (Rodriguez, 2013).

II.11.2 Humedad

La humedad relativa se encuentra entre el 95 a 100%, dentro de este porcentaje

el hongo se desarrolla de manera óptima, aunque los valores pueden variar

dependiendo de las etapas de crecimiento. Un contenido de 50-75% de la humedad

del sustrato facilita el desarrollo del micelo (Arango, 2013).

II.11.3 Luz

Los hongos son organismos no fotosintéticos, micelios del shiitake han sido

cultivados en la oscuridad para obtener un crecimiento óptimo. Sin embargo la luz

podría inducir el origen de los primordios en ciertas especies, además de ser

necesaria para el desarrollo de otras etapas del órgano reproductor de esporas

(Rodriguez, 2013).

II.11.4 Aireación

El shiitake es un organismo aerobio, por lo cual es sumamente significativo tener

el nivel de oxígeno apropiado para sembrar los micelios. El crecimiento vegetativo

podría aumentar cuando el nivel de dióxido de carbono aumenta levemente, como

19

pasa normalmente en áreas confinadas debido a las actividades respiratorias del

micelio (Ancco, 2013).

II.12 Composición nutricional

Se ha reportado que el píleo tiende a tener más beneficios nutricionales y

organolépticos, sin embargo, existe información de otras propiedades beneficiosas

en el estípite, causado por sus diversos compuestos bioactivos como son la quitina,

β-glucanos, eritadenina, ergosteroles, y ácidos grasos, además de altos niveles de

fibra. La fibra alimentaria insoluble favorece la función intestinal, consigue aumentar

el bolo fecal, optimizando el peristaltismo, su parte soluble tiende a tener

propiedades beneficiosas asociadas con el rol en la función fisiológica humana

como la disminución del nivel de colesterol y de la presión sanguínea, también

previene los problemas gastrointestinales y actúa protegiendo la aparición de

diferentes tipos de cáncer (Kvammen, 2018).

El shiitake tiene bajo índice calórico, alto nivel proteico, posee vitaminas del grupo

B y elevadas cantidades de riboflavina y niacina; definitivamente con un perfil de

altas propiedades nutricionales. El consumo de esta seta ayuda a contrarrestar el

desarrollo de enfermedades en las personas (Martinez, Sobal, Morales, & Martínez,

2014).

II.13 Compuestos bioactivos.

La variedad de la especie, sustrato, el cultivo, procesamiento y las condiciones

de almacenamiento son algunos de los factores que afectan la concentración de los

compuestos. Ligninas, triterpenos y polisacáridos, son los metabolitos presentes

20

que poseen la particularidad de dar al hongo su propiedad medicinal (Barros,

Ferrerira, & Queirós, 2007).

Los extractos acuosos y metanólicos del shiitake presentan compuestos fenólicos

los cuales se caracterizan por su elevada capacidad antioxidante. Otros de los

compuestos presentes son las ligninas, polímeros que se encuentran en las paredes

celulares del L. edodes con la característica antiviral, capaz de impedir en cierta

manera el avance del VIH (Rosero, 2015).

El valor nutricional del shiitake es sumamente elevado debido a que contiene 18

aminoácidos incluyendo los esenciales, además de contener concentraciones de

Na, Ca, Mg, Mn y P, etc. El perfil lipídico del L. edodes evidencia concentraciones

de ácido palmítico, ergosterol, dihidroxicolecalciferol y ácido linoleico. El shiitake

posee niveles menores de lípidos saturados y mayor cantidad de poliinsaturados

(Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).

II.13.1 β- glucanos

Los β- glucanos son los compuestos bioactivos de la fibra que se encuentran

presentes en los hongos, estos compuestos se encargan de estimular la respuesta

inmune, además son hipoglucémicos, antioxidantes y anticancerígenos. También

contienen beneficios medicinales, incrementan la producción de insulina, participan

en la disminución de colesterol y LDL en sangre. El L. edodes en su cuerpo

fructífero posee el lentinan, que es un β- glucano; el cual inhibe la proliferación de

células cancerígenas en animales (Mendiola, 2017).

21

II.13.2 Polisacáridos

La pared celular del hongo, es el sitio que presenta mayor bioactividad, ahí se

encuentran la celulosa, quitina y β-glucanos estos polisacáridos presentan mayor

actividad antitumoral, antiviral e inmunomoduladora (Castro, 2018).

En la actualidad, en Japón se han desarrollado productos farmacéuticos

demostrados con éxito a partir de las setas del shiitake, un polisacárido como el

lentinano que se administra por inyección para prolongar la vida de pacientes con

cáncer gástrico y carcinoma colorrectal (Ancco, 2013).

II.13.3 Lentinan

Es el polisacárido con mayor presencia en el hongo Lentinula edodes (shiitake).

A la configuración de las moléculas de glucosa en estructura de hélice del lentinan

se le atribuye la actividad biológica. Este polisacárido fue aislado por primera vez

en el año de 1970, en donde se comprobó que sus acciones como antitumoral e

inmunomoduladora eran mejores que las de otros hongos comestibles (Yan, 2012).

II.13.4 Eritadenina

Es un derivado acíclico de la adenosina, metabolito secundario presente en el

shiitake, que cumple la actividad de reducir los niveles de colesterol en sangre, este

efecto se ha estudiado en animales de experimentación, comprobando que una

dieta de hongo fresco es eficaz en disminuir el colesterol sérico (Rivera, Albarracín,

& Lares, 2017).

22

II.13.5 Quitina y quitosano

Gran porcentaje de quitina se encuentra en el estípite del hongo seco y molido.

Esta parte, que actúa como base del sombre o píleo del shiitake es abundante en

quitina fúngica; además el estípite se usa para preparar quitosano que al igual que

la quitina poseen atributos biológicos como biocompatibilidad, biodegradabilidad,

propiedades curativas a heridas y actividades antimicrobianas y hemostáticas

(Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).

II.13.6 Ergosterol

El estípite y el píleo del Lentinula edodes contienen ergosterol el cual es precursor

de la vitamina D, teniendo esta un papel importante en la absorción del calcio y

mineralización de los huesos. Los hongos al ser la única fuente no animal y no

alimenticia pueden proveer cantidades esenciales de vitamina D2 que es la principal

forma dietética. Se ha demostrado que al exponer el shiitake a la radiación UV, esta

cumple una valiosa función ya que el ergosterol de la pared celular del hongo se

transforma en pre vitamina D, que después se isomeriza térmicamente resultando

finalmente la vitamina D2 (Cardwell & Bornman, 2018).

II.14 Acción farmacológica

II.14.1 Antioxidante

Debido a las múltiples propiedades que presentan los hongos, la población ha

visto bastante interesada por consumo, su poder antioxidante es gracias al selenio,

tocoferoles, compuestos fenólicos, ergotioneína, carotenoides, entre otros. Se ha

encontrado mediante investigaciones que existen en la afinidad entre la facultad de

23

captar radicales libres y los fenoles, estos compuestos son los que tienen la

capacidad antioxidante. Los hongos al ser fuente de polisacáridos cooperan a

aumentar los sistemas de defensa contra daños oxidativos (Castro, 2018).

El selenio es indispensable en los procesos antioxidantes del cuerpo humano,

desempeñándose como un componente no proteico del glutatión peroxidasa,

estimulando las funciones de α-tocoferol y así beneficiando a los mecanismos de

reparación del DNA. La ergotioneína es un aminoácido presente en las setas

conocido como un antioxidante in vivo protector de las células contra el daño

oxidativo (Yan, 2012).

II.14.2 Antitumoral

El shiitake posee lentinan, que es un polisacárido antitumoral. Estudios

epidemiológicos comprueban que el consumo de setas con esta actividad

farmacológica reduce el riesgo de padecer tumores, ensayos en ratas albinas

señalan la inhibición de tumoraciones en un 80 a 100% (Wasser, 2011).

II.14.3 Antiviral

Se ha demostrado que extractos del shiitake en conjunto con zidovudina (AZT)

un medicamento que es utilizado para el tratamiento del VIH, suprime la expresión

del antígeno del virus más fuerte que aquellos que solo eran tratados solo con AZT

in vitro (Martínez, 2010).

24

II.14.4 Efecto hipocolesterolémico y antihipertensivo

Los ensayos en ratones que fueron alimentados con shiitake y una dieta rica en

lípidos, evidenciaron la reducción de los niveles de colesterol; así también se

comprobó el descenso de la presión sanguínea en ensayos con ratones hipertensos

(Martínez, 2010).

II.14.5 Inmunoestimulante

Los hongos comestibles poseen la capacidad de estimular el sistema inmune. El

micelio es una de las partes que contiene sustancias con efecto inmunoestimulante,

los polisacáridos con estructuras de terpenos, β- glucanos y lectinas, podrían usarse

como potenciadores para atenuar la inmunosupresión provocada por quimioterapia

(González, 2018).

II.14.6 Antimicrobiana

La mayoría de los compuestos presentes en las setas son usados como

antibacterianos y fungicidas en productos alimenticios. (Hassegawa, 2014) Indica

que: “Los extractos aislados del Lentinula edodes se muestran activos frente a

algunas bacterias como Streptococcus spp., Actinomyces spp., Lactobacillus spp. y

Porphyromonas spp.”

25

CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO

III.1 Tipo de Investigación

Este estudio fue experimental y de tipo exploratorio, debido a que en el Ecuador

el shiitake no goza de una comercialización abundante, por el desconocimiento de

sus propiedades y beneficios para la salud.

III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos

III.2.1 Materiales de laboratorio

Matraces Erlenmeyer 250 ml, 100 ml

Pipetas Graduadas 2 ml, 5 ml y 10 ml

Beakers 50 ml, 100 ml y 250 ml

Agitadores de Vidrio

Embudos

Espátulas

Probetas 250 ml

Papel filtro

Crisoles

Cápsulas

Papel filtro libre de cenizas

Pinza para crisoles

Desecador

Lápiz graso

Regla

Papel aluminio

26

Vidrio de Reloj

Piseta

Matraz Aforado

Rejilla de Asbesto

Gradilla

Tubos de Ensayo

Capilares

III.2.2 Equipos de Laboratorio

Estufa

Balanza analítica

Mufla

Reverbero

Cromatógrafo

III.2.3 Reactivos

Éter Etílicos

Metanol

Agua destilada

Etanol

Reactivo de Dragendorff

Reactivo de Wagner

Reactivo de Bouchardat

Reactivo de Mayer

Cloruro Férrico 5%

Reactivo de Benedict

27

Reactivo de Fehling A y Fehling B

Hidróxido de Sodio 10%

Anhídrido Acético 6%

Ácido Clorhídrico 20%

Reactivo de Baljet

Reactivo de Borntranger

Reactivo de Ninhidrina

Reactivo de Shinoda

Reactivo de Sudan III y Sudan IV

III.3 Muestra

El material vegetal usado fue el hongo fresco shiitake (Lentinula edodes) y se

recolectó en la Granja Orgánica Intiwasi, de la Comuna Tumbaco, ciudad de Quito,

Pichincha, Ecuador, el 3 de febrero del 2019, época de invierno. El hongo se

encontró en condiciones normales de temperatura 24 - 25°C para su recolección.

Se trabajó con una cantidad de ciento cincuenta setas seleccionadas por su

semejanza en diámetro, los defectuosos fueron descartados.

III.4 Metodología Experimental

III.4.1 Evaluación Macro morfológica de la Seta

La descripción macro morfológica se realizó a simple vista. Se muestrearon y

evaluaron cincuenta de las ciento cincuenta setas, según el método indicado en la

Norma Militar Estándar 105E, a los cuales se les efectuaron mediciones de diámetro

28

con ayuda de un vernier y se determinó el peso de cada hongo empleando una

balanza Mettler Toledo AL 204, se analizó la forma y coloración respectiva.

Se calculó la media, desviación estándar y coeficiente de variación.

III.5 Secado

Luego de la evaluación macro morfológica de la seta se procedió a esparcirlos

en papel aluminio para realizar el secado en la estufa Memmert, en un tiempo de 48

horas a 40°C, según lo citado en (Nollet, 2008).

III.6 Molienda

Una vez seca la muestra, se procedió a molerla en un molino de cuchilla hasta

obtener un polvo grueso.

III.7 Almacenamiento

Se almacenó en frascos de vidrio de boca ancha con tapa rosca, a una

temperatura promedio de 25°C para su posterior análisis.

29

III.8 Parámetros Físico – Químicos

III.8.1 Humedad Residual

El procedimiento está basado en la metodología descrita por (Miranda & Cuéllar,

2001).

Se empleó el método gravimétrico, de la muestra de laboratorio, con el grado de

trituración que determina la norma específica. Se pesó 2g con desviación permisible

de 0.5 mg y se transfirieron a una cápsula de porcelana previamente tarada y

desecada a 105 ºC hasta masa constante; seguidamente se desecó a 105 ºC

durante 3h. La cápsula se colocó en la desecadora donde se dejó enfriar a

temperatura ambiente y se pesó, colocándose nuevamente en la estufa durante 1h,

volviéndose a pesar, hasta obtener una masa constante.

Los resultados se obtuvieron por la siguiente expresión:

Hr = 𝑀2−𝑀1

𝑀2−𝑀 𝑥 100

Donde:

Hr = pérdida en peso por desecación (%)

M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)

M1 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)

M = masa de la cápsula vacía

100 = factor matemático para el cálculo

30

III.8.2 Cenizas totales


2001).

Se determinó la masa de no menos de 2.0 g ni más de 3.0 g de la porción de

ensayo pulverizada y tamizada con una desviación permisible de 0.5 mg en un crisol

de porcelana, previamente tarado. Se procedió a incinerar en una mufla a una

temperatura entre 550 - 600°C hasta obtener un residuo de color blanco o grisáceo

(3 a 4h aproximadamente). Se depositó el sistema (crisol-muestra) en un desecador,

para que se enfríe a temperatura ambiente y se volvió a pesar, repitiéndose el

proceso por duplicado hasta que no difirieran en más de 0.5 mg por g (masa

constante).


CT = 𝑀2−𝑀

𝑀1−𝑀 𝑥 100

Donde:

CT = porcentaje de cenizas totales en base hidratada.

M = masa del crisol vacío (g)

M1 = masa del crisol con la porción de ensayo (g)

M2 = masa del crisol con la ceniza (g)

100 = factor matemático para los cálculos

31

III.8.3 Cenizas solubles en agua


2001).

A las cenizas totales obtenidas previamente, se le añadió 20 ml de agua. El crisol

se tapó y se hirvió suavemente a la llama del mechero por 5 minutos. La solución

se filtró a través de un papel de filtro libre de cenizas. El papel filtro con el residuo

se transfirió al crisol inicial, se carbonizó en un mechero y luego se incineró en una

mufla a 500 - 650ºC, por 3 horas. Posteriormente se colocó en una desecadora y

cuando alcanzó la temperatura ambiente se pesó.


Ca = 𝑀2−𝑀

𝑀1−𝑀 𝑥 100

Donde:

Ca = porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada

M2 = masa del crisol con las cenizas totales (g)

Ma = masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g) M1 = masa del crisol

con la muestra de ensayo (g)

M = masa del crisol vacío

100 = factor matemático

32

III.8.4 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico

Para la determinación de sustancias minerales insolubles en ácido clorhídrico se

utilizó igualmente el método gravimétrico para las cenizas totales y estas se

disolvieron en 3 ml de HCL al 10%. Se calentó en baño hirviente por 5 minutos.

Posteriormente se filtró cuantitativamente a través de papel filtro libre de cenizas

inmediatamente el crisol y el filtro se enjuagaron con agua caliente; a continuación,

se colocó el filtro en el crisol y se procedió a incinerar. El procedimiento se realizó

por triplicado. Los valores obtenidos se sustituyen en la ecuación:

% 𝑑𝑒 𝐶. 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 á𝑐. =Nx100

𝑃

Donde:

N: g de cenizas insolubles de la muestra

P: g de la muestra

III.9 Tamizaje Fitoquímico

Estudio fitoquímico de Lentinula edodes (shiitake)

Identificación de Metabolitos Secundarios por Tamizaje Fitoquímico

El tamizaje fitoquímico fue realizado a la seta; previamente secada y pulverizada,

según procedimiento descrito por (Miranda & Cuéllar, 2001).

33

Se utilizó un sistema de extracción sucesiva de solventes de polaridad creciente

(menor a mayor polaridad); sobre la misma seta, para obtener que cada metabolito

fuera extraído correctamente, según su selectividad por el disolvente empleado.

La droga cruda se extrajo sucesivamente con éter etílico, etanol y agua, para

obtener los extractos los mismos que se pueden observar en el anexo 4; a los cuales

se les realizaron diferentes ensayos detallados en él anexo 5; los ensayos

realizados a la muestra de seta se detallan a continuación:

III.9.1 Ensayo de Sudán

Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos; para ello,

a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añadió 1 ml de una

solución diluida en agua del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calentó en baño de

agua hasta evaporación del solvente. Se consideró positivo si en el resultado

obtenido aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o

en las paredes del tubo de ensayo.

III.9.2 Ensayo de Dragendorff

Este ensayo es útil para distinguir en un extracto la presencia de alcaloides; para

ello, si la alícuota del extracto estuvo disuelta en un solvente orgánico, este se

evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 ml de ácido clorhídrico al

1% en agua. Si el extracto fue acuoso, a la alícuota se le añadió 1 gota de ácido

clorhídrico concentrado (se calentó suavemente y se dejó enfriar hasta acidez). Con

la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, añadiendo 2 gotas del reactivo de

Dragendorff, si hubo opalescencia se consideró (+), turbidez definida (++),

precipitado (+++).

34

III.9.3 Ensayo de Mayer

Se procedió de la misma forma descrita anteriormente, hasta obtener la solución

ácida. Se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y filtró. Luego se

agregó 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer, si se observó opalescencia (+),

turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).

Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres,

estos sólo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia la

reacción debe ser (++) o (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+) puede

provenir de una extracción incompleta de bases primarias secundarias o terciarias.

III.9.4 Ensayo de Wagner

Se partió igual que en los casos anteriores hasta obtener la solución ácida. Luego

se añadió 2 gotas del reactivo y se clasificó los resultados de la misma forma.

III.9.5 Ensayo de Baljet

El ensayo de Baljet ayuda a identificar cualitativamente, compuestos con

agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos

lactónicos pueden dar positivo al ensayo. Para ello, si la alícuota del extracto no se

encontraba en alcohol, se debió evaporar el disolvente en baño de agua y

redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 ml). En estas condiciones se

adicionó 1ml del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de

coloración (++) o precipitado rojo (+++) respectivamente.

35

III.9.6 Ensayo de Borntrager

Reconoce quinonas en un extracto vegetal. Para ello; si la alícuota del extracto

no se encontraba en cloroformo, se debió evaporar el solvente en baño de agua, y

el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Luego se adicionó 1 ml de hidróxido

de potasio al 5% en agua, se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo hasta

su ulterior separación. Se consideró positivo, si la fase acuosa alcalina (superior) se

coloreó de rosado (++) o rojo (+++).

III.9.7 Ensayo de Liebermann - Buchard

Evidencia la presencia de triterpenos y/o esteroides; por ambos poseer un núcleo

del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello; si

la alícuota del extracto no se encontraba en cloroformo, se debió evaporar el

solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Luego se

adicionó 1 ml de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayo,

se dejó resbalar 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar, considerándose

un ensayo positivo el cambio rápido de coloración:

Rosado-azul muy rápido

Verde intenso-visible rápido

Verde oscuro-negro final de la reacción

Observación: A veces el ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy

pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente

ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos

compuestos.

36

III.9.8 Ensayo de Catequinas

Para ello se tomó; con la ayuda de un capilar, una gota de la solución alcohólica

obtenida y se la aplicó sobre un papel de filtro. Sobre la mancha se aplicó una

solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la

luz UV, indicó un ensayo positivo.

III.9.9 Ensayo de Resinas

Para detectar este tipo de compuesto se adicionó a 2 ml de la solución

alcohólica, 10 ml de agua destilada. La aparición de un precipitado indicó un ensayo

positivo.

III.9.10 Ensayo de Fehling

Este ensayo declara la existencia de azúcares reductores. Para ello; si la alícuota

del extracto no se encontraba en agua, se debió evaporar el solvente en baño de

agua y el residuo redisolverse en 2 ml de agua, luego se adicionó 2 ml del reactivo

y se calentó la mezcla en baño de agua por 5 minutos. El ensayo se consideró

positivo si la solución se coloreó de rojo o apareció precipitado rojo.

III.9.11 Ensayo de Espuma

Indica la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. Para

ello; si la alícuota no se encontraba en agua, previamente se diluyó con cinco veces

su volumen en agua y se agitó la mezcla fuertemente durante 5 minutos. El ensayo

37

se consideró positivo si apareció espuma en la superficie del líquido, de más de 2

mm de altura y persistió por más de 2 minutos.

III.9.12 Ensayo de Cloruro Férrico

Manifiesta compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. En extracto

alcohólico, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. Para ello, a una alícuota

del extracto alcohólico se le adicionó 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al

5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9% en agua). En extracto

acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. Para ello, a una alícuota

del extracto, se le añadió acetato de sodio para neutralizar, y tres gotas de una

solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Un ensayo positivo

puede dar los siguientes resultados:

Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.

Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.

Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotanicos.

III.9.13 Ensayo de Ninhidrina

Demuestra la existencia o ausencia de aminoácidos libres y/o aminas en general.

Para ello, se tomó una alícuota del extracto en alcohol, si el extracto se encontraba

en otro solvente orgánico, se mezcló con 2 gotas de solución al 2% de ninhidrina en

agua y se calentó la mezcla por 5 minutos en baño de agua. El ensayo se consideró

positivo si se desarrolló un color azul violáceo.

38

III.9.14 Ensayo de Shinoda

Evidencia la presencia de flavonoides en un extracto vegetal. Si la alícuota del

extracto se encontraba en alcohol, se diluyó previamente con 1 ml de ácido

clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico, después de la

reacción se esperó por 5 min, se añadió 1 ml de alcohol amílico, se mezclaron las

fases y se dejó reposar hasta su separación. Si la alícuota del extracto se

encontraba en agua, se procedió de igual forma, a partir de la adición del ácido

clorhídrico concentrado.

El ensayo se consideró positivo si el alcohol amílico se coloreó de amarillo, naranja

carmelita o rojo (intensos).

III.9.15 Ensayo de Antocianidinas

Para ello se calentó 2 ml del extracto etanólico por 10 minutos con 1 ml de ácido

clorhídrico concentrado. Se dejó enfriar y se adicionó 1 ml de agua y 2 ml de alcohol

amílico, luego se agitó y se dejó en reposo hasta la separación de sus fases. El

ensayo se consideró positivo porque se desarrolló un color rojo a marrón en la fase

amílica.

A continuación, se presenta el esquema para realizar los extractos (figura 4), y

los procedimientos empleados en el tamizaje fitoquímico en las figuras 5 y 6.

39

Fuente: Autores

30 – 50 g de material vegetal

Extraer con 90 – 150 ml de éter etílico por maceración durante

48 horas a temperatura ambiente.

Filtrar

Extracto Etéreo

Medir volumen y

calcular concentración.

Residuo sólido

Secar y pesar

Extraer con 3 veces el peso del residuo en volumen con etanol por

maceración durante 48 horas.

Filtrar

Residuo sólido

Secar y pesar

Extracto Alcohólico

Medir volumen y


Extraer con 3 veces el peso del residuo en volumen con agua destilada por

maceración durante 48 horas.

Filtrar

Residuo sólido

Secar y pesar

Extracto Acuoso

Medir volumen y


Figura 4. Procedimiento para realizar los extractos

40

Figura 5. Ensayos a realizar en los diferentes extractos.

Fuente: Autores

Extracto Etéreo

Dividir fracciones

5 ml

Ensayo de Sudán

(Aceites y grasas)

6 ml

(dividir en 3 porciones)

Ensayos de Dragerndorf, Mayer y Wagner

(Alcaloides)

5 ml

Ensayo de Baljet

(Lactonas y Coumarinas)

5 ml

Ensayo de Liebermann -Buchard

(Triterpenos - esteroides)

Extracto Acuoso

Dividir fracciones

6 ml

(dividir en 3 porciones)

Ensayos de Dragerndorf, Mayer y Wagner

(Alcaloides)

2 ml

Ensayo de Fehling

(Az. reductores)

2 ml

Ensayo de Cloruro Férrico

(Taninos)

2 ml

Ensayo de espuma

(Saponinas)

2 ml

Ensayo de Mucilagos

1 - 2 gotas

Ensayo de Principios amargos

41

Figura 6. Ensayos a realizar en los diferentes extractos

Fuente: Autores

Extracto Alcohólico

Dividir fracciones

1 ml Ensayo de Catequinas

2 ml Ensayo de Resinas

2 ml Ensayo de Fehling

(Az. reductores)

2 ml Ensayo de Baljet

(Lactonas)

2 ml Ensayo de Lieberman - Buchard

(Triterpenos y/o esteroides)

2 ml Ensayo Espuma

(Saponinas)

2 ml Ensayo de Cloruro Férrico

(Fenoles y taninos)

2 ml Ensayo de Ninhidrina

(Aminoácidos)

2 ml Ensayo de Borntrager

(Quinonas)

2 ml Ensayo de Shidona

(Flavonoides)

2 ml Ensayo de Antocianidina

6 ml

(Dividir en 3 porciones)

Ensayos de Dragendorff, Mayer y Wagner

(Alcaloides)

42

III.10 Análisis por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de

masas (CG-EM)

En el análisis del polvo seco del shiitake (Lentinula edodes) se utilizó para la

identificación de compuestos las siguientes condiciones de trabajo:

Se utilizó 2 mg de polvo seco de shiitake, el mismo que fue derivatizado con 120

µl del reactivo BSTFA (N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida). Esta mezcla se la

dejó reaccionar durante 2 horas a 80°C en baño de agua.

Posteriormente el sobrenadante se colocó en un vial de vidrio previo a la inyección

mediante CG-EM.

La detección de compuestos se efectuó por cromatografía de gases acoplado a

espectrometría de masas (CG-EM) en un equipo marca Agilent Technologies

(Sistema 7890ª GC y 5975C inert XL MSD con detector de triple eje. Se empleó una

columna DB-5MS (30 m de longitud x 0.25mm de diámetro interno) y 0,25

micrómetros de espesor de película utilizando helio (He) como gas de arrastre en

un flujo de 1,2 ml/min.

Se inyectó 2ul de muestra derivatizada en modo Splitless. La temperatura de

inyección fue de 70°C, la temperatura del horno se mantuvo en 70°C por 2 min y se

incrementó hasta 300°C a 5°C/min con un tiempo de espera de 6 min. La

temperatura de line a de transferencia fue de 300°C y la temperatura del detector

fue de 230°C. Los compuestos fueron identificados mediante comparación con los

espectros de masas de la biblioteca del equipo: Wiley, 9na edición y NIST 2011. El

rango de screening empleado fue de 40-600 u.m.a con un voltaje de

electroionización de 70 Ev. Todas las condiciones cromatográficas se especifican

en forma de reporte generado por el equipo.

43

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IV.1 Evaluación Macromorfológica de las setas

La seta posee un sombrero de color castaño claro u oscuro con tonos rojizos con

un himenio de color blanquecino y un tronco beige rodeado de un anillo efímero de

color blanquecino a castaño claro. La forma del sobrero es asimétrica de 5-12 cm

de ancho, seguido del tallo corto y central.

En la evaluación morfológica de la seta se consideró su diámetro, peso y el color

de las superficies externas e internas, obteniendo un promedio de 6,14 cm de ancho

y 18,16 g para el peso.

Se realizó un análisis estadístico en comparación de los parámetros en estudio,

cuyos resultados son desglosados en la tabla VII y el consolidado estadístico se

detalla en la tabla VIII.

44

Tabla VII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de setas de Lentinula edodes ¨desglose¨

Fuente: Autores.

PARÁMETROS

# Intensidad de Color

ANCHO (cm) PESO (g) Exterior (Castaño claro u oscuro) Interior (Blanco o beige)

1 Castaño oscuro Beige 4,30 21,88 2 Castaño oscuro Beige 6,20 15,78 3 Castaño oscuro Beige 5,50 14,02 4 Castaño claro Blanco 6,70 12,91 5 Castaño claro Blanco 6,50 25,49 6 Castaño claro Blanco 5,70 24,13 7 Castaño claro Blanco 6,90 15,50 8 Castaño claro Blanco 6,40 22,63 9 Castaño claro Blanco 5,90 24,35

10 Castaño claro Blanco 6,00 28,53 11 Castaño claro Blanco 6,50 13,90 12 Castaño claro Blanco 6,40 18,95 13 Castaño oscuro Beige 4,40 11,19 14 Castaño claro Blanco 4,60 9,44 15 Castaño claro Blanco 6,70 16,81 16 Castaño claro Blanco 4,90 19,74 17 Castaño claro Blanco 4,40 12,86 18 Castaño claro Blanco 5,60 16,89 19 Castaño oscuro Beige 6,20 23,33 20 Castaño claro Blanco 5,80 8,50 21 Castaño claro Blanco 5,60 31,51 22 Castaño oscuro Beige 5,50 13,87 23 Castaño oscuro Beige 6,90 20,14 24 Castaño oscuro Beige 7,60 22,94 25 Castaño oscuro Beige 4,70 13,53 26 Castaño claro Blanco 6,60 25,25 27 Castaño oscuro Beige 6,60 8,85 28 Castaño claro Blanco 5,50 12,44 29 Castaño claro Blanco 6,40 33,64 30 Castaño oscuro Beige 6,50 17,26 31 Castaño oscuro Beige 5,70 18,35 32 Castaño oscuro Beige 6,00 11,57 33 Castaño oscuro Beige 5,90 25,27 34 Castaño claro Blanco 6,70 21,40 35 Castaño oscuro Beige 6,20 23,37 36 Castaño oscuro Beige 7,20 24,83 37 Castaño oscuro Beige 7,40 19,17 38 Castaño oscuro Beige 6,40 17,31 39 Castaño claro Blanco 6,20 10,50 40 Castaño claro Blanco 7,20 20,57 41 Castaño claro Blanco 8,00 14,92 42 Castaño claro Blanco 7,00 13,48 43 Castaño oscuro Beige 6,40 16,75 44 Castaño oscuro Beige 6,20 19,69 45 Castaño oscuro Beige 6,90 16,25 46 Castaño claro Blanco 5,90 17,67 47 Castaño claro Blanco 7,20 15,00 48 Castaño claro Blanco 4,90 17,39 49 Castaño oscuro Beige 6,20 8,43 50 Castaño claro Blanco 5,80 20,02

PROMEDIO 6,14 18,16

DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0,842 5,839

COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 13,72% 32,14% VARIANZA 0,709 34,093

45

Tabla VIII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de setas de

Lentinula edodes ¨consolidado¨

CÁLCULOS ESTADISTICOS (N=50)

PARÁMETROS Promedio Desviación Estándar (SD)

Varianza Coeficiente de Variación

(CV)

Seta completa

Ancho 6,14 cm 0,842 0,709 13,72%

Peso 18,16 g 5,839 34,093 32,14%

Fuente: Autores

IV.2 Determinación de los parámetros fisicoquímicos

IV.2.1 Determinación de Humedad Residual

En la determinación de humedad residual del polvo de Lentinula edodes se

presentó una variación de valores con un promedio de 7,48%, resultado que se

encuentra dentro de los parámetros permitidos para este tipo de productos de

acuerdo con la norma Codex STAN 38-1981 citada por (Torres, Ocampo,

Rodríguez, & Chang, 2017), para el polvo de hongos comestibles desecados debe

ser máximo 9% m/m (tabla IX).

Tabla IX. Resultado de porcentaje Humedad residual de setas de Lentinula edodes

CÁPSULAS

MASA DE CÁPSULAS

VACIAS (m)

GRAMOS DE

MUESTRA (g)

MASA DE CÁPSULA + MASA

DE MUESTRA

(M2)

CÁPSULA +

MUESTRA DESECADA

(M1)

% DE HUMEDAD RESIDUAL

1 20,339 2,238 22,577 22,416 7.15

2 30,174 2,238 32,412 32,242 7.60

3 24,067 2,217 26,284 26,128 7.00

4 21,689 2,220 23,909 23,730 8.00

5 33,160 2,230 35,390 35,226 7.40

6 33,868 2,128 35,996 35,831 7.70

x̄ HUMEDAD RESIDUAL 7.48

DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0.37

COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 4.9

Fuente: Autores.

46

IV.2.2 Determinación de cenizas

La determinación de cenizas es un parámetro de calidad para observar el

porcentaje de minerales que se encuentran en la muestra de ensayo; se realizaron

en seis crisoles, obteniendo un porcentaje promedio de 7,3% valor que está dentro

del límite permitido (6,9% - 10,5% en base seca) de acuerdo a (Manzi, Gambelli,

Marconi, Vivanti, & Pizzoferrato, 1999) valores que se indican en la tabla X.

Los datos de los crisoles del 1 al 3 se utilizaron para cenizas solubles en agua

obteniendo un promedio de 6,12% (tabla XI) y del 4 al 6 para cenizas insolubles en

ácido con un promedio de 5,66% (tabla XII); presentado un mayor porcentaje de

cenizas solubles en agua que insolubles en ácido debido a que es mayor la

diferencia en peso entre las cenizas totales y el residuo; después del tratamiento

con agua.

IV.2.2.1 Cenizas totales

Tabla X. Resultado de porcentaje de Cenizas totales de setas de Lentinula edodes.

CRISOLES

MASA DE CRISOL VACIO

(M)

GRAMOS DE

MUESTRA

MASA DE CRISOL + MUESTRA

(M1)

CRISOL + MUESTRA

DESECADA (M2)

% DE CENIZAS TOTALES

1 25,143 2,498 27,641 25,315 6.9

2 26,836 2,499 29,335 27,014 7.1

3 27,033 2,448 29,480 27,211 7.2

4 27,835 2,481 30,316 28,028 7.7

5 28,223 2,454 30,677 28,409 7.6

6 28,493 2,486 30,978 28,671 7.1

x̄ % CENIZAS TOTALES 7.3



Fuente: Autores

47

IV.2.2.2 Cenizas solubles en Agua

Tabla XI. Resultado de porcentaje de Cenizas solubles en agua de setas de Lentinula edodes

CRISOLES

MASA DE CRISOL CON CT

(M2)

MASA DE CRISOL CON Ca

(Ma)

MASA DE CRISOL + MUESTRA

(M1)

MASA DE CRISOL

VACIO (M)

GRAMOS DE

MUESTRA

% DE CENIZAS

SOLUBLES EN AGUA

1 25,315 25,176 27,641 25,143 2,498 5.58

2 27,014 26,859 29,335 26,835 2,499 6.19

3 27,211 27,049 29,480 27,033 2,448 6.58

x̄ % CENIZAS SOLUBLES EN AGUA 6.12



Fuente: Autores

IV.2.2.3 Cenizas insolubles en Ácido

Tabla XII. Resultado de porcentaje de Cenizas insolubles en ácido de setas de Lentinula edodes.

CRISOLES

GRAMOS DE

MUESTRA (P)

CRISOLES CON

CENIZAS TOTALES

CRISOLES CON

CENIZAS INSOLUBLES

GRAMOS DE CENIZAS

INSOLUBLES DE LA

MUESTRA (N)

% CENIZAS INSOLUBLES

EN ÁCIDO

4 2,481 28,028 27,888 0,140 5.64

5 2,455 28,409 28,269 0,140 5.71

6 2,485 28,671 28,531 0,140 5.64

x̄ % CENIZAS INSOLUBLES EN ÁCIDO 5.66



Fuente: Autores

IV.3 Tamizaje fitoquímico

La evaluación de los parámetros de calidad continuó con el tamizaje fitoquímico

realizado en la seta del shiitake.

48

Se pudo observar que L. edodes presenta una diversidad de compuestos donde

se evidencia potencial farmacológico. Se verificó la presencia de alcaloides en los

tres extractos mediante los ensayos de Dragendorff y Wagner pese a que los

alcaloides no son característicos del shiitake; es importante resaltar que en estos

ensayos se pueden producir falsos positivos si en los extractos hay presencia de

compuestos con agrupamiento lactónico como por ejemplo la 2 – pirrolidinona; 2 -

piperidona o abundantes azúcares (Pereira & Vega, 2014).

En el ensayo de Liebermann – Buchard tanto en el extracto etéreo como en el

extracto alcohólico se demostró reacción positiva en compuestos como triterpenos

y/o esteroides, mostrando una coloración rápida desde rosado-azul hasta verde

oscuro-negro en donde se dio fin a la reacción.

La presencia de resinas en el extracto alcohólico puede atribuirse a los diferentes

tipos de sustratos utilizados para el desarrollo y crecimiento del hongo ya que este

metabolito no es propio del shiitake (Valenzuela & Saavedra, 2009).

En el ensayo de Cloruro Férrico se demostró la presencia de fenoles en los

extractos acuoso y alcohólico; por otro lado, el ensayo de Shinoda para el extracto

alcohólico y acuoso reconoció la existencia de flavonoides.

El ensayo de ninhidrina en el extracto alcohólico se mostró positivo, demostrando

así que el espécimen posee aminoácidos; para la determinación de aceites y grasas

se empleó el ensayo de Sudán indicando que la muestra contiene estos metabolitos.

Para el análisis de azúcares reductores se cumplió con el ensayo de Fehling

exponiendo la ausencia de estos compuestos, pese a que estudios realizados por

49

(Ramos, 2015) indica que el shiitake presenta mayores niveles de azucares tales

como fructosa, manitol y trehalosa; probablemente se evidencia un falso negativo,

resultado que puede deberse a que el grupo carbonilo que da el poder reductor se

encuentra combinado y no pueda presentar esta reacción (Rojas & Ontaneda,

2018).

Así mismo los ensayos como Baljet, Brorntrager, espuma, catequinas y

antocianidinas mostraron resultados negativos en los diferentes extractos;

resultados que se presentan a continuación en la tabla XIII.

50

Tabla XIII. Resultados del Tamizaje Fitoquímico de Lentinula edodes

ENSAYOS METABOLITOS EXTRACTOS

ÉTER ACUOSO ALCÓHOLICO

Ensayo de Dragendorff

Alcaloides + + +++

Ensayo de Wagner

Alcaloides +++ ++ +++

Ensayo de Mayer

Alcaloides - + +

Ensayo de Liebermann -

Buchard

Triterpenos y/o Esteroides

+ +

Ensayo de Brorntrager

Quinonas - -

Ensayo de Baljet

Agrupamientos lactónicos y coumarinas

- -

Ensayo de Fehling

Azúcares reductores

- -

Ensayo de Resinas

Resinas +

Ensayo de Cloruro Férrico

Fenoles y taninos

+ +

Ensayo de Catequinas

Catequinas -

Ensayo de Espuma

Saponinas - -

Ensayo de Shinoda

Flavonoides + +

Ensayo de Antocianidinas

Antocianidinas -

Ensayo de Ninhidrina

Aminoácidos +++

Ensayo de Sudán

Aceites y grasas

+++

Leyenda: (+) coloración, (++) turbidez, (+++) precipitado, (-) negativo, n/a (rojo).

Fuente: Autores

51

IV.4 Identificación de compuestos por Cromatografía de Gases acoplado a

Espectrometría de Masas (CG/EM).

En este análisis se realizó la corrida del sobrenadante de la muestra derivatizada;

por medio de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas se

encontraron como compuestos mayoritarios: galactitol; ácido n-hexadecanoico;

ácido 9, 12 octadecadienoico (z-z); ácido octadecanoico; trehalosa; ácido fosfórico

y xilitol; los mismos que son detallados en la tabla XIV, ordenados según el tiempo

de retención de manera ascendente, los mismos que se pueden visualizar en la

figura 7.

Comparando los resultados del tamizaje fitoquímico con los compuestos

identificados por CG/EM, se puede afirmar, que el resultado positivo en el ensayo

de Sudán para compuestos grasos puede estar relacionado con el ácido n-

hexadecanoico (ácido palmítico), ácido 9, 12 octadecadienoico (ácido α-linolénico);

ácido octadecanoico (ácido esteárico), mientras que xilitol, trehalosa y galactitol son

azúcares reportados en investigaciones preliminares realizadas por otros autores

sobre los componentes bioactivos del Lentinula edodes.

52

Tabla XIV. Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de Masas (CG/EM) de

Lentinula edodes.

RESULTADOS

COMPUESTO FÓRMULA TIEMPO DE RETENCIÓN

(min)

ABUNDANCIA Unidades (%

Área ± DE)

Ácido fosfórico H3PO4 12.780 3.76 ± 0.16

Xilitol C5H12O5 23.803 9.25 ± 0.13

Galactitol o dulcitol C6H14O6 28,235 44.43 ± 0.63

Ácido hexadecanoico C16H32O2 30.313 1.21 ± 0.09

Ácido 9,12-octadecadienoico

C18 H32O2 33.251 1.76 ± 0.04

Ácido octadecanoico C18 H36O2 33.880 2.28 ± 0.09

Trehalosa C12H22O11 41.672 11.30 ± 1.57

Fuente: Autores.

Fuente: Autores.

10.00 15 .00 20 .00 25 .00 30 .00 35 .00 40 .00 45 .00 50 .00

5e+07

1e+08

1 .5e+08

2e+08

2 .5e+08

3e+08

3 .5e+08

4e+08

4 .5e+08

5e+08

T ime-->

Abundanc e

T IC: SH A1.D \ da ta .ms

Figura 7. Perfil cromatográfico de hongo seco y triturado

53

CONCLUSIONES

La evaluación macromorfológica mostró un resultado promedio de 6.14 cm

para el ancho del sombrero y 18.16 g para el peso de la seta; en la caracterización

fisicoquímica se obtuvieron resultados con una media de: 7,48% para humedad;

7,3% cenizas totales; 6,12% cenizas solubles en agua y 5,66% cenizas insolubles

en HCl valores que se encuentran dentro de los rangos aceptables.

Se demostró la existencia de metabolitos secundarios mediante la realización

del tamizaje fitoquímico siendo los flavonoides, aminoácidos y aceites los

compuestos con mayor presencia.

De acuerdo a los datos obtenidos del análisis del perfil cromatográfico, se

identificó la composición química del shiitake (Lentinula edodes) obteniendo 7

compuestos mayoritarios destacando entre ellos los aminoácidos y el polialcohol

derivado de la galactosa denominado galactitol con una abundancia de 44.43 ± 0.63.

54

RECOMENDACIONES

Realizar un método de extracción adecuado para identificar el componente

lentinan.

Identificar metabolitos con otras técnicas cromatográficas (HPLC).

Comparar químicamente setas del hongo shiitake de diferentes lugares del

país.

Reforzar y ampliar los estudios en la seta ecuatoriana del shiitake para

comprobar si posee todos los componentes bioactivos atribuidos.

55

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62

GLOSARIO

Alzheimer: Enfermedad progresiva que afecta a la memoria y otras

importantes funciones mentales.

Anteridio: Estructura sexual masculina que produce los anterozoides. En

algas y hongos son unicelulares (salvo las Charophyceas), en el resto de los

vegetales presenta una envoltura de células estériles cubriendo el tejido

esporógeno.

Ascogonio: Cuerpo fructífero de las Ascomicetas donde se originan los

ascos.

Ascomycete: Definición genérica que identifica a los Ascomycetes cuyo

cuerpo frutal es un cleistotecio. Entre ellos existen especies sésiles y estipitadas,

superficiales, de crecimiento semiinmerso en el sustrato o completamente inmerso.

Basidiomycetes: Hongos que se reproducen por basidiosporas, las cuales

se forman en unas estructuras claviformes llamadas basidios.

Basidios: Es una estructura microscópica productora de esporas encontrado

en los himenóforos de los cuerpos fructíferos de los hongos basidiomicetos.

Castanea: Género de plantas de la familia de las fagáceas, nativas de las

regiones templadas del hemisferio norte, conocidas comúnmente como castaños.

Clorofila: Es el pigmento fotorreceptor responsable de la primera etapa en

la transformación de la energía de la luz solar en energía química.

Cuerpo fructífero: Es comúnmente se llama “hongo”, son los cuerpos

fructíferos de los mismos, encargados de producir las esporas cuya función es la

reproducción sexual.

Elaeocarpus: Es un género botánico de plantas perteneciente a la familia

Elaeocarpaceae.

Eritadenina: Compuesto químico que se encuentra en los hongos shiitake.

Es un inhibidor de la S-adenosil-L-homocisteina hidrolasa (SAHH) y tiene actividad.

Fase reproductiva: Son todas las etapas por las que atraviesa la planta una

vez que supera la fase vegetativa y entra en producción.

63

Fase vegetativa: Corresponde a una de las fases de desarrollo de las

plantas. Esta fase se refiere a la fase de crecimiento de la planta hasta que ésta

alcanza el estado reproductivo, corresponde así a la fase juvenil.

Ficomycetes: Clase de hongos (Phycomycetes) unicelulares saprófitos o

parásitos de plantas o de animales. Los Ficomicetes, llamados comúnmente

hongos-alga.

Hifas: Son las unidades estructurales de la mayoría de los hongos, sobre

todo en los filamentos. Presentan tabiques transversales en forma de número

regular, con un poro de comunicación en el centro, son hifas septadas.

Inmunomoduladores: Sustancia que actúa regulando el sistema inmune,

mediante el aumento o la disminución de la capacidad de producir anticuerpo.

Lentinan: Polisacárido termolábil del shiitake, que tiene actividad

antitumoral.

Levaduras: Hongo unicelular que produce enzimas capaces de provocar la

fermentación alcohólica de los hidratos de carbono. No posee micelios.

Lithocarpus: Es una especie de roble nativo de Japón perteneciente a la

familia de las fagáceas.

Macrofungos: Se refiere a hongos de gran tamaño, aquellos que podemos

ver a simple vista.

Mixomycetes: Grupo taxonómico de hongos, frecuentes sobre madera, con

dos fases en su ciclo de vida, un vegetativo móvil, constituido por un plasmodio

(masa de protoplasma desprovista de pared celular), y otra reproductora, fijo al

sustrato, formada por los esporangios.

Mohos: Son organismos microscópicos que viven en la materia animal o

vegetal. Poseen un micelio vegetativo.

Nutracéutico: Sustancias químicas o biológicas activas que pueden

encontrarse como componentes naturales de los alimentos o adicionarse a los

mismos. Se presenta en una matriz no alimenticia (píldoras, cápsulas, polvo, etc.),

y que, administrada en dosis superior a la existente en esos alimentos, presume un

efecto favorable sobre la salud, mayor al que posee el alimento normal.

64

Organismo aeróbico: Se denomina aerobios a los organismos que

necesitan del oxígeno para vivir o a los procesos que lo necesitan para poder

desarrollarse.

Parkinson: Trastorno del sistema nervioso central que afecta el movimiento

y suele ocasionar temblores.

Periodo de incubación: Es el intervalo de tiempo entre la invasión por un

agente y la aparición de los primeros signos o síntomas.

Polisacáridos: Son moléculas largas compuestas por un número variable de

unidades de glucosa unidas entre sí.

Primordios: Es el estado rudimentario en que se encuentra un órgano en

formación, usualmente protegido en el interior de una yema en las espermatofitas.

Quercus: Es un género de árboles perteneciente a la familia de las fagáceas.

Reino Fungí: Designa a un taxón o grupo de organismos eucariotas entre

los que se encuentran los mohos, las levaduras y los organismos productores de

setas.

Reproducción asexual: Forma de reproducción que se produce sin la fusión

de células sexuales, sino por otros medios, como la fisión o la gemación.

Saprofito: Que se alimenta de materia vegetal o animal muerta.

Sésil: Sentada, carente de peciolo en el caso de las hojas o de pedúnculo o

pedicelo en las flores.

Seta: Nombre genérico con que se designa a cualquier hongo cuya forma

consiste en un sombrero sostenido por un pie.

Shiitake: Es una seta con potencial comestible y medicinal que pertenece al

Reino Fungí.

Simbiosis: Asociación de dos seres de distinta especie en la que ambos

resultan beneficiadas.

Sustancias bioactivas: Componentes de los alimentos que influyen en la

actividad celular y en los mecanismos fisiológicos y con efectos beneficiosos para

la salud.

Sustrato: Un sustrato de cultivo es un medio material en el que se

desarrollan las raíces de las plantas, limitado físicamente en su volumen, aislado

65

del suelo para impedir el desarrollo de las raíces en el mismo y capaz de

proporcionar a la planta el agua y los elementos nutritivos que demande, y a las

raíces el oxígeno necesario para su respiración.

Zidovudina: Fue el primer medicamento antirretroviral (ARV), aprobado

en 1987 como un medicamento indicado para personas con infección por VIH por

su efecto en la supresión de la replicación viral.

66

ANEXOS

Ilustración 1 Hongos Receptados enviados desde Quito

Ilustración 2 Hongo Shiitake fresco

Ilustración 3 Secado en Estufa a 40°C Ilustración 4 Muestra Pulverizada después

del secado

Anexo 1. Pre tratamiento de la muestra - secado y pulverizado

67

Ilustración 5 Cantidad en gramos de espécimen utilizado

Ilustración 6 Muestra en el desecador

Anexo 2. Determinación de Humedad Residual

68

Ilustración 7 Crisol previamente pesado

Ilustración 8 Incineración de la muestra

Ilustración 9 Muestra en la mufla previo al desecador.

Anexo 3. Determinación de Cenizas Totales

69

Ilustración 10 Extracto Etéreo

Ilustración 11 Extracto Alcohólico Ilustración 12 Extracto Acuoso

Anexo 4. Extractos

70

Extracto Etéreo

Ilustración 13 Sudan III Positivo

Ilustración 14 Baljet Negativo

Ilustración 15 Liebermann Buchard

Positivo

Ilustración 16 Wagner (+++)

Ilustración 17 Mayer ( - )

Ilustración 18 Dragendorff ( + )

Anexo 5 Tamizaje Fitoquímico de los extractos Etéreo, Alcohólico y Acuoso

71

Ilustración 19 Espuma: Alcohol y Acuoso Negativo

Ilustración 20 Fehling en: Alcohol y Acuoso Negativo

Ilustración 21 Dragendorff Acuoso (+) y Alcohólico (+++)

Ilustración 22 Wagner Acuoso (++) Alcohólico (+++)

72

Ilustración 24 Mayer Acuoso (+) Alcohólico (+)

Ilustración 25 Shinoda Acuoso (+) Alcohólico (+)

Ilustración 26 Resina extracto Alcohólico (+)

Ilustración 27 Antocianidinas extracto Alcohólico (-)

Ilustración 28 Catequinas Extracto Alcohólico (-)

Ilustración 29 Ninhidrina extracto Alcohólico (+++)

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