UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO

Posfolipasas A2 miotóxicas de venenos de serpientes de la familia Viperidae:

caracterización estructural y funcional

Tesis sometida a la consideración del Programa de Doctorado en Ciencias para optar por

el grado de Doctor en Ciencias (Ph.D.)

Yarnileth Angulo Ugalde

Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiología, y Departamento de Bioquíinica,

Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica

Ciiidad Ui~iversitaria Rodrigo Facio

2005

AGRADECIMIE-

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a:

A mi tutor, el Dr. Bruno Lomonte por su gran dedicación, su paciencia extrema,

enseñanza y guía en la realización de esta tesis y por su sincera amistad. En realidad ha sido

una experiencia valiosísima para mi haber trabajado con una persona tan dedicada al trabajo y

sobre todo con una gran capacidad y un enorme amor a la investigación.

A mi asesor, el Dr. José María Gutiérrez por el apoyo que siempre me ha brindado, por

sus enseñanazas y porque su trabajo refleja un espíritu emprendedor y siempre será el gran

maestro y el buen consejero para todos los que hemos trabajado con él.

A mi asesor, el Dr. Alberto Alape por sus excelentes recomendaciones, porque ha sido

para mí un ejemplo maravilloso de lo que es la dedicación y el esfuerzo para alcanzar frutos en

la investigación y en la vida académica.

A mi familia por su apoyo y comprensión por el tiempo que no he dedicado a ellos por

dedicarlo a mi trabajo.

A todos mis compañeros del Instituto Clodorniro Picado, quienes con la colaboración,

apoyo y el trabajo en equipo hacen que la investigación se convierta en una forma de vida y

estímulo.

A los evaluadores del anteproyecto de tesis, el Dr. Edgardo Moreno, el Dr. Esteban

Chaves y la Dra. Ximena Cortés, por sus excelentes recomendaciones.

A mi amiga y compañera Alexandra Rucavado, quien siempre tiene para mí una

excelente sugerencia, y un apoyo incondicional en el trabajo. Gracias amiga.

Al Dr. Luis Diego Calzada y a la Lic. Camen Castro por su apoyo para el ingreso al

Programa de Doctorado en Ciencias.

A los Drs. Lourival Possani, Fernando Zamudio, Timoteo Olamendi y Georgina

Gurrola, del Laboratorio de Proteínas del Instituto de Biotecnologia, UNAM-Cuemavaca,

México, por el apoyo en la secuenciación de la miotoxina II de A. nummifer y en la

producción de péptidos sintéticos y por su cordialidad y amistad que me brindaran en su

laboratorio.

Al Dr. Raghuvir Ami, Leandra Watanabe, Lisandra M. Gava, del Departamento de

Fisica, IBILCE/UNESP R. Cristoviio Colombo, Siio José do Rio Preto, Brazil, por el trabajo

colaborativo en la cristalización de la miotoxina 11 de A. nuntinfler.

A los doctores Jonas Perales, Gilberto Domont y Ana Gisele Neves, así como a Surza

L. Rocha, del departamento de Fisiología e Farmacodiniimica del Instituto Oswaldo Cruz,

Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil, por su apoyo en las investigaciones con el inhibidor de

Didelphis marsupialis, el DM64. Además, quiero agradecerles el carifio, apoyo y excelente

trato que me dieran durante el tiempo que pasé en su laboratorio.

A los coautores de los artículos incluidos en este trabajo, el Dr. Andreimar Soares de la

Universidad de SZo Paulo en Ribeirao Preto, Brazil, al Dr. Wonhwa Cho, Universidad de

Illinois-Chicago, EUA, y al M.Sc Carlos Santamana, Instituto Clodorniro Picado, Universidad

de Costa Rica.

Un agradecimiento a las entidades que financiaron este trabajo de investigación:

Intemational Foundation for Science (IFS), Vicerrectoría de Investigación, Universidad de

Costa Rica, Consejo Nacional para Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONIC1T)-

FORJNVES, Secretaría de Relaciones Exteriores de México (Programa Costa Rica-México),

Embajada de Japón, NeTropica Sweden-Central American network.

Esta tesis esta basada en los siguientes artículos, los cuales son referidos en el texto con

numerales romanos:

(1) Angulo Y, Olamendi-Portugal T, Possani L, Lomonte B (2000). Isolation and

characterization of myotoxin 11 fiom Atropoides (Bothrops) nummfer snake venom, a

new Lys49 phospholipase A2 homologue. The hiternationol Journnl of Biochemistry &

Cell Biology 32, 63-7 1.

(11) Angulo Y, Olamendi-Portugal T, Alape-Girón A, Possani L, Lomonte B (2002) Structural

characterization and phylogenetic relationships of myotoxin 11 fiom Atropoides

(Bothrops) numlnifer snake venom, a Lys49 phospholipase Az homologue. The

Internntional Jozrrnal of Biochemistry & Cell Biology 34, 1268- 1278.

(111) Watanabe L, Gava LM, Angulo Y, Lomonte B, Ami RK (2004) Crystallization of the

Lys49 PLAz homologue, rnyotoxin 11, fiom the venorn of Atropoides nummifer.

Biochimicn et Biophysica Acta 1703, 87-89.

(IV) Lomonte B, Angulo Y, Santamaria C (2003) Comparative study of synthetic peptides

corresponding to region 1 1 5- 129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake

venoms. Toxicorz 42, 307-3 1 2.

(V) Angulo Y, Gutiérrez JM, Soares AM, Cho W, Lomonte B (2005) The myotoxic and

cytolytic activities of dimeríc Lys49 phospholipase A2 homologues are reduced, but not

abolished, by a pH-induced dissociation. Toxicon (en prensa).

(VI) Angulo Y, Lomonte B (2004) Differential susceptibility of C2C12 myoblasts and

myotubes to group II phospholipase Az rnyotoxins fiom crotalid snake venoms. Cell

Biochernistry and Function (en prensa)

(VII) Angulo Y, Lomonte B (2003) Inhibitory effect of fucoidan on fhe activities of crotaline

snake venom myotoxic phospholipases A2. Biochemical Pharmacology 66, 1993-2000.

Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Doctorado en Ciencias, como

requisito parcial para optar por el grado de Doctor en Ciencias (Ph.D.), con énfasis en Ciencias

Biomédicas.

/ " el MacLya Trejos

e del Decano del Sistema de Estudios de Posgrado

r. Bruno Lomonte Vigliotti Director de Tesis

Asesor de Tesis

Dr. Alberto Alape Girón Asesor de Tesis

ama de Doctorado en Ciencias

(A,Cx,&/du C+do C/ M.dT;lilethAngulo Ugalde

Candidata

INDICE

Página

Agradecimientos

Lista de publicaciones

Hoja de aprobación

lndice

Resumen

Abstract

Lista de Cuadros y Figuras

Lista de Abreviaturas

l . Introducción

1.1. Serpientes venenosas y sus venenos

1.2. Importancia médica del accidente ofídico

1.3. Envenenamientos por serpientes de la familia Viperidae

1.4. Toxinas que dañan músculo aisladas de venenos de serpiente

1.5. Fosfolipasas A2 secretadas

1.6. Relación estructura-función en fosfolipasas A2 del grupo 11

1.7. Inhibidores de fosfolipasas A2 del grupo 11

2. Objetivos

3. Materiales y Métodos

4. Resultados

5. Discusión General

6. Conclusiones

7. Perspectivas futuras

8. Referencias

9. Apéndice: publicaciones

v

vi

vii

X

x i i . . .

X l l l

Angulo Ugalde, Yamileth

Fosfolipasas A2 miotóxicas de venenos de serpiente de la familia Viperidae:caracterización

estructural y funcional

Tesis de doctorado en Ciencias, San José, C.R.

Y Angulo U, 2005

81 h: 9 il- 209 ref

RESUMEN

Las miotoxinas tipo fosfolipasa A2 (PLA2) del grupo II se encuentran comunrnente en

venenos de las serpientes de la familia Viperidae. Con la finalidad de comprender las

relaciones entre la estructura y la función de estas proteínas, se han caracterizado bioquímica y

famacológicamente diversas variantes naturales. En la presente tesis se describe una nueva

miotoxina de este grupo, aislada del veneno de Atropoides nummifer de Costa Rica. La

rniotoxina 11 de A. nummifer es un homodimero con subunidades básicas de 121 residuos, y

una masa molecular de 13,789.90 Da por subunidad. Se determino su secuencia completa de

aminoácidos, la cual presenta una alta similitud con PLAzs Lys49 de los géneros

Cerrophidion, Trimeresurus, Bothrops y Agkistrodon, las cuales según el análisis filogenético

divergieron tempranamente de las PLAzs Asp49. Se modeló la estnictura terciaria de la

rniotoxina 11 de A. nummifer con base en las coordenadas de la miotoxina 11 de Cerrophidio~i

gorlmani, observándose solamente pequeñas variaciones entre ambas estructuras. La nueva

miotoxina se cristalizó y se obtuvieron datos de difracción de rayos X a una resolución de 2.32

A. Actualmente se está determinando su estructura tridimensional.

La miotoxina Ii de A. nummifer induce mionecrosis rápidamente después de la

inyección intramuscular en ratón, como se evidencia por un aumento temprano en la actividad

de creatina kinasa en plasma. Además, esta toxina induce edema, y posee acción citotóxica

sobre células de músculo esquelético en cultivo.

Una serie de evidencias identifican el sitio tóxico de las PLA2s Lys49 en la región C-

terminal, donde los arninoácidos que comprenden la secuencia 11 5-129 parecen jugar un papel

central. En este trabajo se evaluó la citotoxicidad y la miotoxicidad de una serie de péptidos

sintéticos correspondientes a la secuencia 1 15- 129 de diferentes miotoxinas Lys49. Los

péptidos variaron en sus actividades, desde los que mostraron una alta toxicidad, hasta los que

no presentaron ninguna. Esto indica que las acciones tóxicas de las miotoxinas Lys49 no

siempre son reproducidas por sus péptidos 115-129 libres. Tal fue el caso del péptido C-

terrninal de la miotoxina 11 de A. nummifer, el cual no indujo citotoxicidad en cultivo, ni

miotoxicidad in vivo. Interesantemente, se encontró que el péptido C-terminal de la miotoxina

Lys49 de Agkistrodon p. piscivorus sintetizado con D-aminoácidos conserva ambas

actividades de su enantiómero natural L, sugiriendo que el mecanismo de toxicidad no

involucra el reconocimiento de un receptorlaceptor proteico en las células musculares.

Recientemente se ha propuesto que el estado dimérico de una PLAi Lys49 es esencial

para su capacidad de romper liposomas, y que esta actividad desaparece cuando la toxina se

disocia en monómeros a pH 5.0. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la disociación inducida por

pH sobre las actividades citotóxica y rniotóxica de cuatro PLA2s Lys49. Ambas actividades

fueron menores a pH 5.0 que a pH 7.2, en concordancia con la propuesta de que el estado

dimérico es relevante para la función. Sin embargo, el hallazgo de que a pH 5.0 estas toxinas

retienen una actividad significativa sugiere que el estado dimérico no es un requerimiento

absoluto para su mecanismo de acción.

Las miotoxinas PLAi del grupo II inducen un efecto citolitico sobre diversos tipos de

células in vitro.En el presente trabajo se demostró que la fusión y diferenciación de mioblastos

a miotubos, induce cambios que hacen que estos sean más susceptibles a los mecanismos

tóxicos de las PLA2s del grupo 11, pero no así a otros agentes citolíticos. Estos cambios

podrían involucrar sitios aceptores de rniotoxinas, que aún no han sido identificados.

Además, en el presente trabajo se investigó el efecto del fucoidan, un polisacárido

natural sulfatado, en las actividades citotóxica y miotóxica de un grupo de miotoxinas PLA2

del gmpo 11. Ambas actividades fueron eficientemente inhibidas por el fucoidan, en todas las

toxinas. La base de esta inhibición parece ser la formación rápida de complejos entre el

fucoidan y las miotoxinas. El fucoidan también inhibió la actividad citolítica de los péptidos

correspondientes a los residuos de diferentes miotoxinas Lys49 (115-129), indicando su

capacidad de interactuar con la región C-terminal de estas toxinas. El fucoidan redujo

significativamente el daño a músculo en ratón, cuando se administró localmente,

inmediatamente después del envenenamiento experimental con veneno crudo de B. asper.

Estos resultados dan base para la realización de futuros estudios sobre el posible uso de

fucanos sulfat ados en el tratamiento de envenenamientos por vipéridos.

Finalmente, se caracterizó la actividad inhibitoria del DM64, una proteína aislada del

suero de DideZphis marstrpialis, sobre las PLAzs rniotóxicas. Se demostró que dicha proteína

es capaz de formar complejos con las miotoxinas PLAi de grupo 11, inhibiendo de esta forma

sus actividades citolíticas in vitro y rniotóxicas in vivo.

Angulo Ugalde, Yamileth

Fosfolipasas A2 miotóxicas de venenos de serpiente de la familia Viperidae:caractenzación

estnictural y funcional

Tesis de doctorado en Ciencias, San José, C.R.

Y Angulo U, 2005

8 1 h: 9 il- 209 ref

ABSTKACT

Myotoxic phospholipases Ai (PLA2s) of the group II are comrnonly found in the

venoms of crotalid snakes. As an approach to understand their stnicture-function

relationships, diverse natural variants, have been characterized, biochemically and

phamacologically. This thesis describes a new myotoxic PLAz homologue, isolated from the

venom of Atropoides numrnifer from Costa Rica. A. numrnifer rnyotoxin 11 occurs as a

homodimer of basic subunits of 121 residues, with a subunit molecular mass of 13,789.90 Da.

Its complete amino acid sequence was determined, showing high similarity to Lys49 PLA2s

from Cerrophidion, Trimeresurus, Bothrops and Agkistrodon species, which form a sub family

of PLAzs that diverged early from Asp49 PLA2s present in the same species, as shown by

phylogenetic analysis. The tertiary structure of the toxin was modeled, based on the

coordinates of Cerrophidion g o h a n i myotoxin 11, showing only minor differences between

both structures. The new toxin was crystallized, and X-ray diffraction data were collected to a

resolution of 2.32 A. Its three-dimensional structure is currently being determined.

A. nummifer myotoxin II induces rapid myonecrosis iipon intramuscular injection in

rnice, evidenced by an early increase in plasma creatine kinase activity. It also induces

signifícant edema, and displays cytolytic activity towards cultured skeletal muscle cells.

Current evidence supports the mapping of the toxic site of the PLAzs to the C-terminal

region, where amino acids comprised within the sequence 115-129 appear to play a central

role in toxicity. This study evaluated the cytotoxic and myotoxic effects of severa1 synthetic

peptides corresponding to the sequence 11 5-129 of different Lys49 inyotoxins. Peptides varied

widely in their activities, raiiging from fully toxic to harmless. These results indicate that the

toxic actions of Lys49 myotoxins cannot always be reproduced by tlieir peptides 115-129.

This was the case of the peptide from A. num~nijer myotoxin 11, wliich was not toxic to

cultured or mature muscle in vivo. Interestingly, the C-terminal peptide of Agkistrodon p.

piscivorus synthesized with D-amino acids retained both activities of the natural L-

enantiomer, suggesting that its mechanism of action does not involve the recogiiition of a

proteic receptor/acceptor site on muscle cells.

Recently, the dimeric state has been proposed to be essential for the Iiposome-

dismpting activity of a Lys49 PLA2, which dissociates into monomers at pH 5.0. Therefore,

this study evaluated the effects of a pH-induced dissociation on the toxic activities of four

Lys49 PLA2s, using biological targets. Both their cytolytic and myotoxic activities were lower

at pH 5.0 than at pH 7.2, in agreement with the proposed functional relevance of their dimeric

state. However, the observation that these proteins still retain a significant toxicity at pH 5.0,

suggests that the dimeric state is not an absolute requirement in their mechanism of action.

Group II PLAz myotoxins exert a cytolytic effect on diverse cell types in vitro.

Previous studies indicate that differentiated myotubes are highly susceptible to this effect. In

this work, it was demonstrated that fusion and differentiation of myoblasts into myotubes

induces changes that render the latter cells more susceptible to the toxic mechanism of group

II PLAz myotoxins, but not to other cytolytic agents. Such changes could involve myotoxin

acceptor sites, which remain to be identified.

The protective effect of fucoidan, a natural sulfated polysaccharide, against the

cytotoxic and nlyotoxic activities of a group of group 11 PLA2 myotoxins was investigated. Al1

of the toxins were efficiently inliibited by fucoidan, in both their cytotoxic and rnyotoxic

effects. The basis for this iiiliibition appears to be the rapid formation of complexes between

fucoidaii and myotoxiiis. Fucoidaii also inhibited the cytolytic activity of peptides tliat

represent the membrane-damaging region (residues 1 15- 129), indicating its ability to interact

with the C-terminal niyotoxic region of these PLA2. Fucoidan significantly inhibited muscle

damage in mice, when administered locally, immediately after experimental envenornation

with cmde venom from B. asper. These results encourage fiirther studies of sulfated fucans as

cornpounds of potential use to improve the treatment of envenomations by crotaline snakes.

Finally, the inhibitory activity of DM64, a protein isolated from tlie seruni of the

mammalian DideZphis mnrstlpinlis, towards myotoxic PLA2s was cliaracterized. It was

deinonstrated that this protein foniis complexes with the group II myotoxins, inhibiting their i>l

vitro cytolytic aild i ~ r vivo myotoxic actions.

LISTA DE CUADROS Y FIGURAS

Cuadro 1 Fosfolipasas Az tipo Lys49 aisladas de venenos de serpiente.

Figura 1 Mecanismo catalitico de las fosfolipasas A*.

Figura 2 Representación esquemática de la estructura tridimensional de las fosfolipasas

A2 del gmpo 11.

Figura 3: Representación esquemática de la estructura dimérica de la miotoxina 11 de B.

asper .

Figura 4 Estr~lctura promedio del fucoidán.

Figura 5 Formación de complejos entre el DM64 y las fosfolipasas A2 del gmpo 11

miotóxicas del veneno de Bothrops nsper.

Figura 6 Formación de complejos entre el DM64 y las fosfolipasas Ai del gmpo 11

miotóxicas.

Figura 7 Ausencia de formación de complejos entre el DM64 y dos hemorraginas de

venenos de serpiente.

Figura 8 Inhibición de la actividad citotóxica in vitro de las fosfolipasas A2 del gmpo II

miotóxicas por el DM64.

LISTA DE ABRIEVXATURAS

ADNc

B S ~

CK

CM-Sephadex

cm DHL

DMEM

OMS

PBS

PEG

PLA2

PLI

RP-HPLC

SDS-PAGE

SFB

UREA-PAGE

ADN copia

bis-sulfosuccinimidil suberato

creatina kinasa

carboximetil-Sephadex

dominios de reconocimiento de carbohidratos

deshidrogenasa láctica

medio de Eagle modificado por Dulbecco

Organización Mundial de la Salud

amortiguador de salina fosfato, pH 7.2

polietilenglicol

fosfolipasa Ai

inhibidor de fosfolipasa

cromatografía líquida de alto desempeño en fase reversa

electroforesis en gel de poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio

suero fetal bovino

electroforesis en gel de poliacrilarnida con urea

l . INTRODUCCION

1.1 Serpientes venenosas y sus venenos

Las serpientes venenosas se clasifican en tres familias: Viperidae, Elapidae y

Colubridae (Campbell y Lamar, 2004; Solórzano, 2004). En Centroamérica existe una gran

diversidad de serpientes, y particularmente en Costa Rica se han descrito 22 especies de

serpientes venenosas, las cuales están distribuidas en una amplia variedad de hiibitats

(Sol órzano, 2004).

Los venenos de serpiente se producen en glándulas exocrinas especializadas, y están

compuestos por una mezcla compleja de moléculas de diferente naturaleza química,

mayoritariamente proteínas, las cuales constituyen más del 70% del peso seco. En un

accidente ofidico estas proteinas pueden causar neurotoxicidad, cardiotoxicidad, alteraciones

en la coagulación sanguinea, hemorragia y mionecrosis. Las toxinas asociadas a estas

diferentes actividades pueden actuar sinérgicamente para inducir un efecto determinado, o

bien algunas piieden inducir más de un efecto (Kini e Iwanaga, 1986b).

Los estudios sobre el origen y evolución de las toxinas de los venenos de elápidos y

vipéridos indican que muchos de los genes de las familias de proteínas encontradas

actualmente en los venenos, fueron reclutados para cumplir una función tóxica muy temprano ,

en la evolución (Fry y Wüster, 2004). Por lo tanto, la composición de proteinas en los venenos

de diferentes gmpos de serpientes nos puede dar una visión de las relaciones evolutivas entre

estas. Por ejemplo, dichos anilisis muestran que las fosfolipasas A2 (PLA2s) de los veiienos de

vipéridos y elápidos no tienen un origen monofilético, ya que las toxinas de vipéridos

presentan una mayor similitud con las PLA2s de tipo sinovial-inflamatorio, mientras que las

toxinas PLAzs de elápidos presentan mayor similitud con las de tipo pancreático (Fry y

Wüster, 2004).

1.2 Importancia médica del accidente ofídico

Los envenenamientos por mordedura de serpiente en humanos constituyen un

problema de salud pública, especialmente en las regiones tropicales del mundo. Según datos

de la Organización Mundial de la Salud (OMS), hace algunas décadas se producían unos

500.000 accidentes por año y unas 30.000 muertes (Swaroop y Grab, 1954). Estimaciones

más recientes sugieren que la magnitud de este problema a nivel mundial podría alcanzar los

2.600.000 accidentes y 125.000 muertes anuales (Chippaux, 1998). En Costa Rica se estima

que unos 500-600 pacientes son atendidos en los centros hospitalarios cada año como

consecuencia de envenenamientos por serpientes, implicando una tasa anual de morbilidad de

aproximadamente 1 5-20 por 100.000 habitantes (Gutiérrez, 1995; Sasa y Vásquez, 2003). La

mortalidad por accidentes ofidicos en Costa Rica ha sido estimada en 0,2 por 100.000

habitantes (Rojas et al., 1 997).

Las mordeduras de serpiente además de ser una causa de mortalidad, en una cierta

proporción de casos pueden dejar a sus víctimas con discapacidades permanentes, debido a la

severidad del daño tisular causado por el veneno de algunas especies (Jorge et al, 1999).

1.3 Envenenamientos por serpientes de la familia Viperidae

Las serpientes de la familia Viperidae (subfamilia Crotalinae) se encuentran

ampliamente distribuídas en América Latina (Campbell y Lamar, 1989), comprendiendo un

gran número de especies que son responsables de la mayoría de envenenamientos en este

continente (Gutiérrez, 1995). Dentro de estas, las especies del género Bothrops son las de

mayor importancia médica (Rosenfeld, 1971 ; Bolaños, 1984; Otero et al., 1992). Atropoides

>zummifer, anteriormente llamada Bothrops nummfler, y conocida comunrnente como "mano

de piedra", es una serpiente terrestre distribuida a lo largo de Centroamérica (Solórzano, 1 989;

Campbell y Lamar, 2004). En Costa Rica se le encuentra en los bosques lluviosos tropicales

(Taylor et al., 1974).

En general, los envenenamientos por serpientes de la familia Viperidae se caracterizan

por causar un daño promineiite al tejido local, incluyendo mionecrosis, hemorragia y edema,

además de poseer una serie de acciones con manifestaciones sistémicas (Rosenfeld, 1971 ;

G~itiérrez y Lomonte, 1989; Otero et al. ,1992). La necrosis de músculo es uno de los efectos

más importantes inducido por estos venenos, con el potencial de dejar secuelas graves, como

pérdida de tejido y discapacidad (Nishioka y Silveira, 1992; Warrell, 1996). Además, las

coagulopatías constituyen uno de los hallazgos más comunes en los envenenamientos por

vipéridos (Hutton y Warrell, 1993). Pruebas de laboratorio como el tiempo de protrombina y

el tiempo de coagulación sanguínea son usadas para evaluar el desarrollo de estos

envenenamientos. Otro efecto fisiopatológico importante en los envenenamientos por

vipéridos es el daño renal agudo, que puede manifestarse como oliguria o anuria, usualmente 6

hr o más después de la mordedura. Esta nefrotoxicidad, junto con las alteraciones

cardiovasculares sistémicas (hipotensión y choque) causadas por los venenos de vipéridos,

constituyen las principales causas de muerte (Nishioka y Silveira, 1992; Otero et al, 2002)

1.4 Toxinas que dañan músculo (miotoxinas) aisladas de venenos de serpiente

Muchas especies de serpientes venenosas secretan toxinas que inducen necrosis de

músculo esquelético (miotoxinas), las cuales contribuyen a digerir la presa y causan un

significativo daño al tejido en los accidentes por envenenamiento en humanos (Harris y

Cullen, 1990). Estas toxinas son muy frecuentes y abundantes en los venenos de vipéridos.

Las miotoxinas de serpientes se han clasificado de acuerdo con sus propiedades

bioquimicas y toxinologicas en: (a) cardiotoxinas de venenos de elápidos, (b) toxinas básicas y

de bajo peso molecular (42-45 aminoácidos) denominadas miotoxinas pequeñas, (c) toxinas

hemorrágicas que inducen daño muscular de forma indirecta, posiblemente asociado a

fenómenos de isquemia, (d) PLAzs neurotóxicas que son también miotóxicas, y (e) miotoxinas

no neurotóxicas con estructura de PLA2.

(a) Cardiotoxjnas

Son un grupo de proteinas básicas de 60-62 residuos de aminoácidos, sin actividad

enzimática y estructuralmente similares a las a neurotoxinas (Dufton y Hider, 1991). Esas

proteinas de membrana activas se han encontrado en los venenos de elápidos incluyendo las

cobras. El nombre de cardiotoxina se origina de la capacidad de estos componentes de

producir daño cardíaco in vitro e in vivo (Harris y Cullen, 1990). Sin embargo, presentan

actividad citolitica en muchos tipos de células.

(b) Miotoxinas pequeñas

El grupo de miotoxinas pequeñas está formado por proteínas básicas compuestas de 42

a 45 residuos de aminoácidos. Ejemplos de estas proteínas son la crotamina de Crotalus

durissus terrzficus y la miotoxina a de Crotalus v. viridis (Laure, 1975; Cameron y Tu, 1977).

(c) Metaloproteinasas hernorragicas con efecto miotóxico

Las toxinas hemorrágicas presentes en los venenos de serpiente de la familia Viperidae

son metaloproteinasas que contienen zinc, con masas que varían entre 20 y 100 kDa, capaces

de inducir un rápido sangrado local (Bjarnason y Fox, 1994). Las enzimas de alto peso

molecular se clasifican como metaloproteinasas con dominios tipo disintegrina y ricas en

cisteína. Estas enzimas tienen una potente actividad proteolítica sobre las proteínas de la

matriz extracelular (Kamiguti et al., 1998). Algunas de estas toxinas ha sido aisladas de los

venenos de serpiente de la familia Vipendae de Costa Rica, como la BaPl y la BaH4 de B.

asper (Gutiérrez y Ovadia, 1998; Franceschi et al., 2000).

(d) Miotoxinas PLAz neurotóxicas

Los venenos de elápidos contienen múltiples toxinas que presentan la capacidad de

actuar sobre la uniOn neuromuscular. Algunas de estas son PLAzs que interfieren

presinápticamente con la liberación de acetilcolina, constituyendo las toxinas más letales de

estos venenos. Dichas PLA2s también ejercen una potente acción miotóxica, por lo que estos

envenenamientos combinan la neurotoxicidad presináptica con la miotoxicidad (Hams y

Cullen, 1990). En los vipéridos también pueden encontrarse algunas PLA2s miotóxicas con

alta neurotoxicidad, tales como la crotoxina del veneno de Crotalus durissus terrificus

(Gutiérrez y Lomonte, 2003).

(e) Miotoxinas PLA2 no neurotóxicas

Las PLA2s de grupo II miotóxicas encontradas en el veneno de serpientes de la familia

Viperidae se pueden clasificar en dos subgrupos principales: unas con un residuo de aspartato

en la posición 49 (Asp49) y otras en las que este residuo ha sido siistituído por una lisina

(Lys49) (Maraganore et al., 1984; Yoshizumi et al., 1990; Liu et al., 1990; Francis et al.,

1991). Sin embargo, algunas toxinas no pueden ser clasificadas en ninguno de estos subgrupos

como la amrnodytina L y la ecarpholina S, dos PLA2s que presentan serina en la posición 49

(Ser49), aisladas de los venenos de Vipera ammodytes (Krizaj et al., 1991) y de Echis

carinatus sochureki (Polgár et al., 1996), respectivamente; y una PLA2 cuya posición 49 es

ocupada por glutamina (Gln49), del veneno de Agkzstrodon blomhoffii ussurensis (Bao et al.,

2005).

Las miotoxinas no neurotóxicas con estructura de PLA2 son componentes muy

abundantes en los venenos de algunas especies de serpientes de la familia Viperidae, que

juegan un papel preponderante en el daño muscular inducido por sus venenos (Gutiérrez y

Lomonte, 1997). La caracterización bioquímica de estas miotoxinas ha demostrado que todas

ellas presentan gran similitud en términos de masa molecular, puntos isoeléctricos y

composición de aminoácidos (Mebs y Samejima, 1986; Lomonte y Gutiérrez, 1989). Sin

embargo, se han encontrado considerables variaciones inter- e intraespecíficas de su estructura

primaria, que podrian dar claves relevantes para delinear los determinantes estructurales de su

toxicidad (Selistre et al., 1996a; Ward et al., 1998).

1.5 Fosfolipasas A2 secretadas

Las PLA2s (EC 3.1.1.4) catalizan la hidrólisis de los glicerofosfolípidos en la posición

sn-2, liberando ácidos grasos y lisofosfolípidos (Kudo y Murakami, 2002). Aunque todas las

PLAzs catalizan esencialmente la misma reacción, sus actividades biológicas pueden variar

notablemente. Por tal razón, el estudio de las relaciones estructura-función en las PLA2s

constituye actualmente un reto desde el punto de vista científico, abordado por numerosos

grupos de investigación.

Las PLA2s extracelulares (o secretadas) son abundantes en las secreciones pancreáticas

de mamíferos y en los venenos de reptiles y artrópodos, donde han adquirido una variedad de

funciones tóxicas a lo largo de la evolución. Además de una acción digestiva, estas enzimas

muestran una serie de actividades biológicas que incluyen neurotoxicidad (Chang et al., 1977;

Bon et al., 1979), miotoxicidad (Mebs y Samejima, 1986; Gutiérrez y Lomonte, 19951,

estimulación o inhibición de la agregación plaquetaria (Gerrad et al., 1993; Yuan et al., 1993),

acciones hernolitica, anticoagulante, hipotensora, cardiotóxica (Fletcher et al., 198 l),

edernatigena (Lloret y Moreno, 1993; Ogawa et al., 1995; Kini, 1997) y bactericida (Páramo et

al., 1998).

Las PLA2s se han clasificado en 11 grupos, con base en sus características estructurales

y su patrón de uniones disulfuro (Six y Dennis, 2000). Las PLAzs de venenos de serpientes de

la familia Viperidae corresponden al grupo 11 de esta clasificación. Estas proteínas poseen

masas moleculares de alrededor de 14 kDa, con 120-124 residuos de arninoácidos, y un patrón

característico de 7 enlaces disulfuro conservados (Ami y Ward, 1996). Algunas PLAzs de

venenos pueden presentarse como monómeros, aunque frecuentemente pueden encontrarse en

estados oligoméricos, por lo general como dímeros (Magro et al., 2003).

La actividad catalítica de las PLA2s secretadas es dependiente de la unión al calcio, el

cual sirve como un cofactor. Los estudios espectroscópicos y cristalográficos han contribuído

significativamente a elucidar el mecanismo catalítico de las PLA2s y se ha demostrado que el

ácido aspártico en la posición 49 (Asp49) es altamente conservado, jugando un papel cnicial

en la estabilización del estado intermedio de transición tetrahédrico en las PLAzs

cataliticarnente activas (Scott et al., 1990a, 1990b, 1992; Scott y Sigler, 1994), en el cual el P carboxilato del Asp49 interacciona con los oxígenos carbonilo de los residuos Tyr28, Gly30 y

Gly32, 2 moléculas de agua y el calcio. Además, en el mecanismo de acción la His48 y el

Asp99 participan en la catálisis ya que la His48 extrae un protón de la molécula de agua, por

lo que la enzima adquiere carga positiva, o sea que realiza el ataque nucleofilico por lo que

dicha carga se estabiliza con uniones de hidrógeno con el Asp99.

Figura 1: Mecanismo catalítico de las fosfolipasas A2 (Scott et al., 1990a)

En un subgrupo de PLAzs originalmente descubierto por Maraganore et al. (1984), se

encontró que el Asp49 es sustituído por lisina. Los análisis de la estructura cristalina de estas

variantes de PLA2s tipo Lys49 han demostrado que el grupo &-amino de la lisina está

localizado en la posición que normalmente ocupa el calcio en las PLA2s Asp49 (Holland et al.,

1990; Scott et al., 1992), eliminándose la acción catalítica de las mismas, sin que estas pierdan

sus actividades biológicas (Rufini et al., 1992; Díaz et al., 1991, 1992; Gutiérrez y Lomonte,

1997; Lomonte et al., 2003a). El Cuadro 1 presenta una lista de las PLA2s tipo Lys49 descritas

en venenos de serpientes.

Las PLA2s de grupo II presentan una alta similitud estructiiral, tanto en sus secuencias

de aminoácidos, como en su estructura tridimensional resuelta mediante difracción de rayos X

(Wery et al., 1991), aún cuando las fuentes de obtención de estas proteínas sean muy

diferentes. Más recientemente, los avances en las técnicas de resonancia magnética nuclear

(NMR) han abierto una alternativa como método complementario para determinar la

estructura tridimensional de las PLA2s en solución.

Muchas de estas miotoxinas están presentes en solución como dímeros, por ejemplo las

miotoxinas II y III de Bothrops asper (Gutiérrez y Lomonte, 1997), las miotoxinas 1 y 11 de

Atropoides rtummifer (Gutikrrez et al., 1986b; Angulo et al., 2000), de B. insularis (Selistre et

al., 1990), aunque algunas otras se han encontrado en forma nionomérica, tanto en solución

como en forma cristalina (Ami et al., 1999). Por otra parte estas proteínas son muy básicas,

por lo que se ha visto que ciertos polianiones como la heparina pueden inhibir su miotoxicidad

y su acción citolítica (Melo et al., 1993; Lomonte et al., 1994a, 1994b).

Las miotoxinas de tipo Lys49 carecen de actividad catalítica, o a lo sumo esta es

extremadamente baja. Al respecto, ha existido una controversia de si la baja actividad

catalítica es debida a una leve contaminación con PLAzs Asp49 (Krizaj et al., 199 1, Polgar et

al., 1996, van den Berg et al., 1988, Scott et al., 1992), o por el contrario, si es una actividad

intrínseca de las PLA2 Lys49 (Liu et al., 1990, Shimohigashi et al., 1995). Las evidencias más

recientes, basadas en el análisis de miotoxinas recombinantes, apoyan fuertemente la primera

posibilidad (Ward et al., 2002). El hallazgo de ácidos grasos en algunas proteínas Lys49 qiie

se han cristalizado, sugiere que estas podrían tener actividad catalítica, pero que la misma se

ve interrumpida por la imposibilidad de liberar el producto, abortando el ciclo catalitico (Lee

et al., 2001). Por tanto, en la práctica, dichas proteínas serían catalíticamente inactivas.

Cuadro 1 : Fosfolipasas A2 tipo Lys49 aisladas de venenos de serpiente.

Serpiente * Proteína Código ' Referencias

Agkistrodon p piscivorus AppK49 PO436 1 Maraganore et al. (1 984) Agkistrodon bilin en tus PLArII * ;k Nikai et al. (1994) A. contortrix laticinctus rniotoxina ACL P49121 Johnson y Ownby (1993); Selistre et al. (1 996b)

Atropoides irumrnifer miotoxina 1 ** Gutiérrez et al. (1 986b) A tropoides rr ummqer miotoxina Ih ** Rojas et al. (2001)

A tropoides numrnger rniotoxina II P82950 Angulo et al. (2000); Angulo et al. (2002) Bothrops nsper rniotoxiiia II P24605 Lomonte y Gutiérrez (1 989); Fraiicis et al (1 99 1)

Bothrops crsper miotoxina IV ** Díaz et al. (1 995) Bothrops asper rniotoxina IVa # Lizano et al. (2001) Bothrops atrox Ba-K49 ** Maraganore et al (1984) Bothrops atrox BaPLA2-1 ** Kanashiro et al. (2002) Bothrops atrox rniotoxina 1 AY43 102 Nuñez et al. (2004) Bothrops jnrarncussu bothropstoxina 1 490249 Homsi-Brandebuxgo et al. (1 988)

Bothrops moojeni rniotoxina I P82114 Lomonte et al. (1990); Soares et al (2000b)

Bothrops moojeni miotoxina 11 491834 Lomonte et al. (1990b); Soa~es et al (3998) Bothrops tzezrwiedi miotoxina E ** Geoghegan et al (1 999) B. neuwiedi pauloerlsis BnSP-7 Q9IAT9 Rodrigues et al. (1998); Soares et al. (2000a) Bothrops pirajai piratoxina 1 P58399 Toyama et al. (1 995, 1998) Bothrops pirajai piratoxina II P82287 Toyarna et al. (1995,2000)

Bothrops pradoi P M - 1 * * Moura-da-Silva et al. (1 99 1 a)

Bo thriechis schlegelii miotoxina 1 P80963 Angulo et al. (1997), Tsai et al (2001) Calloselasma rhodostomn CRV-K49 Q9PVF3 Tsai et al. (2000)

Cerroph idion godnzani miotoxiria 11 P8 1 165 Diaz et al. (1 992); de Sousa et al (1 998) Cerrophidion godmnni PgoK49 Q8UVü7 Tsai et al. (2001) Crotalus ntl-ox Cax-K49 Q8UVZ7 Tsai et al (2001) Ci-otalus m nzolossus C m - K 4 9 ** Tsai et al (2001)

Deinagkistroclon acutus Dac-K49 057385 Wang et al. (19961, Fan et al. (1 999) Deinngkistrodon nctrtus Dac-K49b # Tsai et al. (2001) T~.imerestnals albolabris Tal-K49 ** Tsai et al. (2001)

Trimeresurus jlavoviridis BP-1 P20381 Yoshizumietal.(l990) Trimeresurus flavoviridis B P-II E48188 Liuetal.(1990) Trirnereszlnu graminerns PLA2-V P70090 Nakai et al (1995) Trimeresurtrs grantinezls PLA2-VI1 P70089 Nakashima et al. (1995) T. nzucrosquanzatus TMV-K49 P22640 Wang et al. (1996); Liu et al. (1991) Trinzeresu~ws okinrrverlsis To3 492152 Nobuhisa et al. (1996) Trimeresurus pun iceus Tpu-K49 ** Tsai et al. (2001)

Códigos de identificación en las base de datos SwissProt o GeneBank.

** Secuencias de aminoácidos parciales.

# Secuencias no enviadas a bases de datos.

La proteínas Lys49 poseen una acción miotóxica que se compara cuantitativamente y

cualitativamente con su contraparte, las PLAzs Asp49, que poseen dicha actividad catalítica

(Gutiérrez y Lomonte, 1997). Además, las miotoxinas Lys49 pueden lesionar rápidamente las

membranas biológicas y artificiales por mecanismos independientes de calcio (Gutiérrez et al.,

1986a; Díaz et al., 1991; Rufini et al., 1992; Lomonte et al., 1999b; Ward et al., 1998, 2002;

Ambrosio et al., 2005). Es importante señalar que la región hidrofóbica cercana al C-terminal

de estas miotoxinas, rica en aminoácidos hidrofóbicos y básicos, ha sido considerada como

relevante para su acción de daño a membranas (Lornonte et al., 1994a; Gutiérrez y Lomonte,

1995; da Silva Giotto et al., 1998; Ward et al., 2002; Lomonte et al., 2003b). Sin embargo,

algunas observaciones sugieren además una posible participación de la región N-terminal

(Dijkstra et al., 198 1; Diaz et al., 1991).

Considerando que las miotoxinas Lys49 se han encontrado en los venenos de muchas

especies de vipéridos (Homsi-Brandenburgo et al., 1988; Gutiérrez y Lomonte 1995; Soares et

al., 1998; Ownby et al., 1999; Chijiwa et al., 2000; Tsai et al., 2001), las mismas constituyen

un modelo interesante para estudiar el mecanismo de daño muscular catalíticamente

independiente, y establecer los determinantes moleculares de su toxicidad.

Se ha demostrado que la heparina se une al sitio C-terminal de la miotoxina 11 de

Bothrops asper, neutralizando de esta manera las acciones tóxicas de la proteína (Lomonte et

al., 1 994b). Posteriormente se demostró que el péptido sintético correspondiente a la región

1 15-129 de la PLA;! Lys49 de A. p. piscivorus, reproduce todas las actividades tóxicas de dicha

miotoxina, tanto in vitro como N1 vivo, induciendo mionecrosis (Núñez et al., 2001).

Reforzando esos hallazgos, estudios recientes de mutagénesis dirigida de la PLAz Lys49

bothropstoxina 1 de Bothrops jararacussu, demostraron la relevancia funcional de los residuos

comprendidos en la región C-terminal (Ward et al., 2002; Chioato et al., 2002). Además, los

trabajos usando péptidos sintéticos han demostrado que la actividad citotóxica de las PLA2

Lys49 depende de este sitio efector catiónico/hidrofóbico localizado en la región C-terminal y

que comprende los residuos 1 15-129 (Lomonte et al., 1994b; Calderón y Lomonte, 1998,

1999; Lomonte et al., 2003b; Núñez et al., 2001).

Debido a la observación de que dos diferentes péptidos sintéticos correspondientes a la

secuencia 11 5-129 de dos miotoxinas Lys49, son capaces de reproducir las acciones tóxicas

directas de las miotoxinas de la cual son obtenidos (Lomonte et al., 1994b; Núñez et al., 2001)

se propuso como un objetivo de este estudio, investigar si este hallazgo representa una regla

general en las proteínas de la familia PLA2. Para esto, se seleccionó un grupo de secuencias

115-129 de varias rniotoxinas Lys49, y se evaluó las posibles actividades tóxicas de sus

péptidos sintéticos correspondientes, Nt vitro e Nt vivo.

La patogénesis del daño muscular inducido por miotoxinas del género Bothrops ha sido

estudiada por Gutiérrez y colaboradores (1 984a, 1984b, 1986a, 1989). Estas toxinas se unen

inicialmente a la membrana plasmática muscular (sarcolema) y, por un mecanismo aún no

conocido en detalle, inducen un daño rápido a dicha membrana, causando un influjo de calcio

y otros iones, seguido por una hipercontracción de miofibrillas y liberación de los

componentes celulares (Mebs y Ownby, 1990; Ownby, 1990). Las primeras alteraciones

histológicas se evidencian como lesiones en la periferia de las células musculares descritas

como "lesiones delta", las cuales se han observado también en otras patologías musculares

(Mokri y Engel, 1975).

Muchos detalles del mecanismo de acción de las miotoxinas de veneno de serpiente

son aún desconocidos. Existen estudios recientes que demuestran la existencia de receptores

de muy alta afinidad para PLA2s en una variedad de tejidos, que reconocen tanto a las PLAzs

de algunos venenos de serpientes, como a las PLA2s de mamíferos (Lambeau et al., 1989,

1990, 1994, 1995; Krizaj et al., 1991). Sin embargo, aún no se tiene evidencia de que dichos

receptores participen en el mecanismo de acción de las PLAz miotóxicas de grupo 11.

Existe evidencia que indica que las PLAzs miotóxicas actúan primeramente en el

sarcolema, alterando rápidamente la permeabilidad de la membrana, ya sea por un mecanismo

cataliticamente dependiente o bien por uno independiente. Sin embargo, aún se desconoce la

naturaleza del sitio aceptor de la membrana involucrado en este mecanismo, y los detalles de

los eventos moleculares que siguen a la unión de la toxina. Los estudios realizados con una

variedad de líneas celulares en cultivo han mostrado que las PLA2s del grupo I miotóxicas no

son citolíticas, mientras que las del gmpo 11 presentan una fuerte actividad citolitica, que

conelaciona con su actividad miotóxica in vivo (Lomonte et al., 1999b). Algunas de las

miotoxinas del grupo 11 estudiadas en modelos de cultivo celular dentro del subgmpo de

PLAzs Lys49 producen una actividad citolítica similar a la producida por las Asp49,

demostrando que este efecto puede desarrollarse en la ausencia de una actividad enzimática

intrinseca de las miotoxinas (Lomonte et al., 1999b).

En estudios previos se ha observado que los miotubos diferenciados in vitro son

blancos más susceptibles a la actividad citolítica de algunas miotoxinas PLA2 del grupo II

(Bmsés et al., 1993; Bieber et al., 1994; Incerpi et al., 1995; Lomonte et al., 1999b). Esta

observación, surnada a las variaciones de la acci6n citotóxica observadas entre diferentes

líneas celulares, nos lleva a la pregunta: json los miotubos diferenciados más susceptibles que

los mioblastos a la acción de estas miotoxinas, o son los rniotubos intrínsicamente más

susceptibles a cualquier tipo de perturbación de la membrana? Este interrogante se planteó

también como un objetivo del presente estudio.

1.6 Relación estructura-función en PLAzs de grupo 11 miotóxicas

Durante los iiltimos años, se han aislado un número importante de miotoxinas de la

familia de las PLAzs de grupo TI, y su estudio ha permitido progresar en el conocimiento de su

estructura y mecanismo de acción (Gutiénez y Lomonte 1997; Fletcher et al., 1997). La

caracterización bioquirnica de las miotoxinas ha demostrado que estas poseen variaciones

inter- e intra-específicas en la estructura primaria, que podrían señalar los determinantes

moleculares de su toxicidad, observables mediante alineamientos múltiples de secuencias de

aniinoácidos (Selistre et al., 1996a; Ward et al., 1998). Ward y colaboradores (1998), usando

un análisis de secuencia espacial, identificaron 9 residuos altamente conservados en las PLAzs

Lys49, que están agrupados en el sitio activo, en el canal hidrofóbico de unión al sustrato, y en

las regiones de la interfase dimérica, respectivamente.

La estructura de las PLAl de grupo II se caracteriza por poseer una pequeña hélice alfa

N-terminal, y dos hélices alfa largas antiparalelas (hélices 2 y 3, residuos 37-54 y 90-109),

conectados por una región donde se encuentra la denominada ala beta. Los aminoácidos

His48, Asp49, Asp99 y Tyr52 constituyen el sitio catalitico y están localizados en esas dos

hélices largas. Por otro lado, el sitio de unión al calcio está constituido por dos átomos de

oxigeno del carboxilo del Asp49 (residuos 25-33) y el asa de unión al calcio con los

aminoácidos Tyr28, Gly30 y Gly32 y el enlace disulfuro Cys27-Cys44 que produce una

orientación relativa correcta del sitio de unión al calcio en relación con los aminoácidos que

forman el sitio catalitico. Además, estas PLA2s contienen una región C-terminal (Fig. 2) que

comprende los alninoácidos 1 15- 129, con alta densidad de cargas positivas (Arni y Ward,

Figura 2: Representacidn esquem4tica de la estructura tndimensional

de las fosfolipasas Ap de grupo II (Magro et al., 2003).

IA evolución & las P h s ha sido estudiada por Davidson y Dennis (1990), quienes

elaboraron Arboles filogen6ticos derivados de sus secuencias de aminoácidos. Este &ido ha

sido titi1 para clasificarlas en los grupos 1 y 11. Por otro lado, Ogawa y colaboradores (1995)

elaboraron árboles evolutivos construidos con secuencias de ADNc que codifican para el

grupo iI de PLA2. Tanto ias secuencias de aminoácidos como & ADNc, e incluso de ADN

gen6mic0, de más de 180 PLA2 se encuentran disponibles y esta informaci6n ha sido usada en

estudios de comparacidn de secuencias, para predecir los residuos de amindcidos

involucrados en funcioncilidades específicas de estas proteínas (Kini e Iwmaga, 1986a, 1986b;

Kini y Evans, 1987; Tsai y Chang, 1987; Ward et d., 1998; Selistre de Araujo et al., 1996a,

1996b).

Por otro lado, el uso de péptidos sintéticos ha contribuído a la comprensión de la

klaci6n estrucnira-función. Los estudios realiados con el pCptido sintetic0

KKYRYLKPLCKK, correspondiente a la regibn C-terminai de la rniotoxina II de B.usper,

mostraron que reproduce varias actividades de dicha toxina, como la citotoxicidad para Aulas

endotelides y musculares en cultivo (Lomonte et al,, 1 994% m 3 b ) , =tividd b a c h c i h

(Páramo et al., 1998), y la actividad edematígena (Nuñez et al., 2001), y constituye además un

epitopo neutralizante de la actividad miotóxica (Calderón y Lornonte, 1998, 1999). La triple

sustitución de Tyr-+Trp en este péptido aumentó su actividad de daño a membranas y

reprodujo los efectos miotóxicos in vivo (Lomonte et al., 1999a). Otros estudios con péptidos

sintéticos de esta misma región de la PLAz Lys49 de Agkistradon piscivorus han mostrado

hallazgos similares. Sin embargo, los péptidos correspondientes de dos PLA2s Asp49, no

produjeron ningún efecto tóxico in vitro o in vivo, sugiriendo que las miotoxinas Lys49 y las

Asp49 del gnipo 11, podrian presentar diferentes mecanismos de acción miotóxica (Núfiez et

al., 2001).

Otros estudios relevantes para la comprensión del mecanismo estructura-función han

sido realizados por Ward et al. (2002), utilizando técnicas de mutagénesis dirigida en la

bothropstoxina I de Bothrops jararacussu. En estos se determinó que el mecanismo miotóxico

de la miotoxinas Lys49 es independiente del mecanismo catalítico. Se demostró que al

cambiar la Lys49 por Asp49 no se logró recuperar la actividad catalítica, por lo que no solo

ese aminoácido es el responsable de la pérdida de dicha actividad. Además, la mutación del

residuo Lys 122 por Ala1 22, resultó en una disminución de la actividad miotóxica, señalando

así la importancia de la Lys122 en las actividades tóxicas de la proteína.

Las PLA2s Lys49, aún careciendo de actividad catalitica, inducen una conspicua

mionecrosis i~z vivo, así como una serie de efectos in vitvo como la citolisis, la disrupcibn de

liposomas, el bloqueo neuromuscular y la acción bactericida (Lomonte et al, 2003a). Dado que

sus efectos no pueden ser atribuidos a la hidrólisis de fosfolípidos, numerosas investigaciones

se han enfocado en elucidar la base molecular de su toxicidad. Las evidencias basadas en los

estudios con péptidos sintéticos, el mapeo de sitios de interacción con moléculas

neutralizantes, y la mutagénesis dirigida (Lomonte et al., 2003b; Chioato y Ward, 2003)

identifican la región C-terminal de las PLA2s Lys49 como esencial para sus actividades

miotóxica, citolitica, bactericida y de dismpción de liposomas. La fuerte evidencia para un

papel efector de esta región deriva de las siguientes observaciones: (a) algunos péptidos

sintéticos de 13 residuos, que representan la secuencia 115-129 de miotoxinas Lys49, son

capaces de reproducir, aunque con menor potencia, las acciones tóxicas de las proteínas de que

son derivados; (b) los mutantes específicos C-terminales de una PLA2 Lys49 tienen una

toxicidad reducida ; y (c) la región C-terminal constituye un sitio de unión a heparina y esta

unión ulhibe la citotoxicidad y la miotoxicidad de alguna de estas miotoxinas (Lomonte et d.,

1994a, 1994b).

Los estudios estructu~es con la bothropstoxina 1, un hornodimero PLAzs Lys49 del

veneno de B. jaramcussu, han demostrado que esta proteína presenta dos conformaciones, la

fonna "abierta" y la forma "cerrada". Estas difieren en el ángulo formado por los mon6mem.

Basándose en esto, se propuso que la interfase del dimero podría funcionar como una bisagra,

permitiendo un desplazamiento relativo & la regidn C-terminal que podria contribuir a ia

desorganización de la bicapa de fosfoiípidos (da Silva Giotto et al., 1998). Anáiisis

subsiguientes examinaron el efecto de pH en el equilibrio mon6mero-dímero de Ia

bothropstoxina 1, demostrando que el estado didrico de la proteína es esencial para su

capacidad de romper Liposornas, y que la toxina p e d a completamente esta actividad a pH 5.0,

concomitantemente con su disociaci6n a mon6meros (de Oliveira et d., 200 1).

Figura 3 Representacidn esquemhtica de la estructura dimerica de la

miotoxina II de B. asper. La zona oscura representa la regi6n C-terminal

(1 75-129) en cada subunidad. La figura fue generada con el programa

RasMol, con las coordenadas del Protein Data Bank, númem de acceso

1CLP.

Estudios mientes rertlizados por Ambrosio et d. (2005) con tres estructuras cristdinas

monoméricas de la miotoxina PLA2 Lys49 & Agkistrodon confort& laticinctus, revelaron

que la presencia de un ligando (un posible ácido graso) en el sitio activo nominal, induce un

cambio conformacional que expone la superficie hidrofdbica de la regi6n C-terminal. Este

"nudillo hidmfóbico", dado por las cadenas laterales de los residuos Phel2 1 y Phe124, forma

una estructura can6nica entre los residuos 11 8-125, que parece ser comdn a muchas

miotoxinas Lys49. Con base en esto se ha propuesto un mecanismo de acción que involucra la

retención del ácido graso liberado en el sitio activo, lo que provoca un cambio conformacional

en la región C-terminal, lo cual establece una conexión estructural directa entre el sitio activo

de la fosfolipasa y el sitio miotóxico C-terminal (Ambrosio et al., 2005).

En resumen, se han realizado algunos avances significativos en la identificación de las

regiones moleculares de las PLAzs de grupo II que determinan sus actividades tóxicas. Sin

embargo, la comprensión detallada de las actividades requiere de mayores estudios

estructurales que permitan proponer un mecanismo de acción más completo. Un mejor

conocimiento sobre la relación estructura-función de estas toxinas es de suma importancia

para abordar la búsqueda de inhibidores eficientes, sobre una base mas racional.

1.7 Xlihibidores de PkAts de grupo I[I

La relevancia clínica de la mionecrosis en los envenenamientos por serpientes ha

motivado a buscar moléculas neutralizantes (no inmunes) contra las PLA2s miotoxicas,

incluyendo inhibidores naturales de origen animal y vegetal (Nobuhisa et al., 1998; Lizano et

al., 1997, 2000, 2003; Rocha et al., 2002; Deepa y Gowda, 2002; Arruda et al., 2002), que

podrían llegar a complementar la terapia convencional con antivenenos.

puma 1 a

1-3Fkaeúr 4 t so,

Figura 4: Estructura promedio del fucoidán (izquierda), un polisacárido sulfatado extraído

del alga Fucus vesiculosus (derecha).

Algunos glicosarninoglicanos sulfatados como la heparina y el heparán sulfato, inhiben

la actividad citolitica y miotóxica de las PLA2s de Bothrops asper y B. jararacussu (Melo et

al., 1993; Lomonte et al., 1994a, 1994b). Además, se han descrito otros inhibidores de PLA2s

como la 4-alkoxibenzamidina (Aitdafoun et al., 1996). De acuerdo con esto, se decidió

investigar si el fucoidan, un polisacárido su1 fatado complejo extraído del alga Fucus

vesicirlosus, podria inhibir las actividades tóxicas de un grupo de PLA2s rniotóxicas de

venenos de vipéridos. La estructura del fucoidan se ha caracterizado en detalle (Fig.4). La

región central del fucan está compuesta primariamente de un polímero de fucosas unidas por

enlaces a 1-3, con grupos sulfato en la posición 4 del residuo de fucosa. La fucosa también se

une a este polímero para formar puntos de ramificación, uno de cada dos a tres residuos de

fucosas entre la cadena (Patankar et al., 1993; Nishino et al., 1994). Este polisacárido induce

una variedad de efectos biológicos en mamíferos incluyendo la inhibición del reclutamiento de

leiicocitos (Preobrazhenskaya et al., 1997), revascularización del tejido isquémico (Liiyt et al,

2003), agregación plaquetaria (Durig, 1997), contracción del colágeno (Fujimura et al., 2000),

e inhibición de la proliferación de células de músculo liso (Religa et al., 2000). El fucoidan

interactúa con algunos componentes de los sistemas de la coagulación y fibrinolisis, como con

el cofactor 11 de heparina, la antitrombina 111, trombina, plasminógeno glutámico, activador de

plasminógeno de tejido y urokinasa de bajo peso inolecular (Church et al, 1989; Minix y

Doctor, 1997), y posee actividades antimicrobianas (Zapopozhets et al, 1995).

La resistencia de algunos animales a los venenos de serpiente, ya sean estos las

serpientes mismas o bien mamíferos, se ha explicado por la presencia de factores proteicos

neutralizantes en su sangre, que inhiben importantes componentes tóxicos del veneno (Ohkura

et al., 1997; Pérez y Sánchez, 1999; Faure, 2000). Dentro de estos factores se encuentran los

inhibidores de rnetaloproteinasas (factores antihemorrágicos) y los inhibidores de fosfolipasas

(PLIs) (Lizano et al., 1997,2000,2003; Perales y Domont, 2002; Rocha et al., 2002).

Basándose en la comparación de secuencias de aminoácidos, los PLIs plasmáticos se

han clasificado en tres grupos: a, P, y y. Los inhibidores a contienen dominios de

reconocimiento de carbohidratos (CRDs) similares a las lectinas dependientes de cat2 (tipo-

C), así como los receptores de PLA2 tipo M (miisculo) que unen a las PLAzs de gmpo 1 como

las pancreáticas, y de grupo 11. El gmpo de PLIs P contiene repeticiones ricas en leiicina y

poseen un 33% de identidad en la secuencia con las glicoproteínas a ricas en leucina del suero

humano. Finalmente, los inhibidores y poseen un patrón de residuos de cisteína, formando las

agrupaciones de "tres dedos" características del receptor activador de plasminógeno urokinasa

(u-PAR) y de la superfamilia de proteinas Lysó (Ohkiira et al., 1997). El primer PLI

caracterizado fue aislado del plasma sanguíneo de Bothrops asper (Lizaiio et al., 1997) y

denominado BaMIP, una proteína oligomérica acídica de 120 kDa compuesta por 5

subunidades de 23-25 kDa. La secuencia de esta proteína es similar a la de algunos inhibidores

tipo a. El BaMIP inhibe las actividades miotóxicas, edematogénicas y citolíticas de las cuatro

miotoxinas del veneno de B. asper. Además, se han aislado, caracterizado y clonado dos

inhibidores del plasma de Cerrophidion godmani (Lizano et al., 2000), el CgMIP-I y el

CgMIP-11, ambos glicoproteínas con masas moleculares de 110 kDa y 180 kDa

respectivamente. El CgMIP-I específicamente neutraliza las actividades de la miotoxina I de

C. godmani (una PLAz cataliticamente activa), mientras que el CgMIP-11 selectivamente

inhibe las propiedades tóxicas de la rniotoxina 11 de C.godmnni (una PLA2 Lys49,

enzimáticamente inactiva).

Por otro lado, el DM64 se 11a descrito como una proteína antirniotóxica acídica, aislada

del plasma de Didelphis marsupialis, que posee un 15% de glicosilación y una masa molecular

de 63.659 Da. Al clonar dicha proteína se encontró que la secuencia de aminoácidos es

homóloga a la proteina DM43, un inhibidor de metaloproteinasas encontrado en el mismo

animal (Rocha et al., 2002). Como parte del presente trabajo, se estudió la capacidad del

DM64 de interaccionar con distintas PLAzs miotóxicas y neutralizarlas.

En forma general, esta tesis pretende profundizar sobre la estructura (secuencia,

modelaje y cristalización) de una miotoxina PLAz tipo Lys49 (art. 1, II y III), como

herramienta para la comprensión del mecanismo de acción de estas toxinas. También persigue

evaluar y caracterizar a nivel inolecular la interacción de estas toxinas con diferentes

inoléculas que puedan inhibir sus actividades tóxicas (art. VI1 y datos no publicados), y

caracterizar las actividades de un conjunto de péptidos sintéticos correspondientes a su región

C-terminal (art. IV). Además, se aborda la filogenia de estas proteínas con el propósito de

relacionar su estructura y evolución dentro de los distintos géneros y familias de serpientes

(art. 11). También persigue evaluar el papel de la dimerización de estas proteínas en sus

actividades tóxicas utilizando un modelo de células musculares en cultivo (art. V), y el efecto

que posee la diferenciación de dichas células sobre la susceptibilidad al mecanismo de

toxicidad (art. VI).

2. OBJETIVOS

Objetivo General

Analizar algunos aspectos de las relaciones estructura-función y filogenéticas de las

miotoxinas tipo fosfolipasa A2 (PLA2) del gmpo 11.

Objetivos Especificas

2.1 Caracterizar la estructura primaria y tridimensional de la miotoxina II de Atropoirles

nummijer como un nuevo miembro de las miotoxinas tipo Lys49.

2.2 Caracterizar la actividad de péptidos sintéticos correspondientes a la región C-terminal

1 15- 129 de distintas miotoxinas.

2.3 Analizar el papel del estado dimérico de las miotoxiiias tipo PLA2 en sus actividades

citotóxica y rniotóxica.

2.4 Caracterizar la actividad citotóxica de las PLA2s de grupo II sobre células musculares

(C2C12) in vitro, como posible modelo de la función miotóxica de estas proteínas.

2.5 Caracterizar la capacidad de diferentes sustancias (polisacáridos sulfatados e inhibidores

plasmáticos) para inhibir las actividades biológicas de las miotoxinas PLAi de gmpo 11.

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Venenos de serpiente

Se obtuvo el veneno de cada especie de serpiente a partir de al ineiios 15 especíinenes

colectados en Costa Rica y mantenidos en el Instituto Clodomiro Picado. Posteriormente a su

extracción, el veneno fue centrifugado, liofilizado y almacenado A -20" C.

3.2 Aislamiento de miotoxinas tipo PLA2

Estas toxinas se purificaron por crornatografia de intercambio catióninico en

carboximetil-Sephadex C-25. Se disolvieron aproximadamente 500 mg de veneno de la

especie respectiva en amortiguador Tris-HC1 0.05 M, KC1 0.1 M, pH 7.0 y se aplicaron a una

columna de CM-Sephadex (30 x 2.5 cm; Pharmacia), equilibrada previamente con la misma

sol~ición. Posteriormente, para la elución de las proteínas básicas unidas a la columna, se

aplicó un gradiente de KCI de 0.1 M a 0.75 M, a una tasa de flujo de 0.4 rnl/min (Lornonte y

Gutiérrez, 1989). La absorbancia del eluente a 280 nm se midió en forma continua en un

cromatógrafo Bio-Rad.

3.3 Determinación de la pureza (homogeneidad) de toxinas

La homogeneidad de las toxinas se determinó mediante tres criterios: (a) electroforesis

en gel de poliacrilarnida en presencia de duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE; Laemmli,

1970); (b) electroforesis en gel de poliacrilarnida en presencia de urea, usando un sistema de

amortiguador catiónico (UREA-PAGE; Traub et al., 1971); y (c) cromatografia liquida de alto

desempeño en fase reversa (RP-HPLC), usando una columna C4, a un flujo de 1 .O ml/min con

un gradiente de O a 60% de acetonitrilo en 0.1 % de ácido trifluoroacético.

3.4 Determinación de la masa molecular de la miotoxina 11 de Atropoides nurnrnifer

La determinación de la masa rnolecular de la miotoxina 11 de A. nurnmifer se realizó

mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) en un instrumento Voyager System 6255,

en una matriz de ácido sinapínico ( 3 3 dimetoxi-4 hidroxi-sinapinic acid).

3.5 Determinación de la estructura primaria de la miotoxina II de A. nzilnmifer

En primera instancia se determinó la secuencia N-terminal de la proteína en forma

directa, mediante la degradación de Edman. Posteriormente, la proteina se redujo y

carboximetiló, tomando una alícuota de 2 mg de la proteina y disolviéndola en una solución

amortiguadora de Tris-HC1 0.2 M, pH 8.6 con cloruro de guanidina 6 M. Se le añadió una

preparación de ditiotreitol fresca (200 mM) y se incubó por 45 min a 55 "C. Además, se

alquiló la proteina con ácido iodoacético para confirmar las posiciones de las cisteinas.

Para determinar la secuencia completa de aminoácidos de la proteína, se combinó la

degradación de Edman directa (N-terminal) con la de la proteina nativa, reducida y alquilada

en un secuenciador automático. Además, se determinó la secuencia de los péptidos obtenidos

mediante la digestión de la proteína por las siguientes endopeptidasas específicas: arginina-C

de Clostridium histolyticum (digestión en amortiguador Tris-HCl 100 mM, pH 7.6

conteniendo 10 mM de CaClz por 4 hr a 37 "C); proteinasa aspartato-N (digestión en

amortiguador de fosfatos 50 mM, pH 8.0 por 4 hr a 37 "C); lisina-C (digestión en

amortiguador Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 M, pH 6.5 por 3 hr a 37 "C); y quimotripsina

(digestión en amortiguador Tris-HCI 100 mM, pH 8.0 por 4 hr a 37 "C). La purificación de los

péptidos resultantes se realizó en una columna C18 mediante RP-HPLC.

3.6 Modelaje de la estructura tridirnensional de la miotoxina II de A. nuntmifer

Con base en la secuencia completa de aminoácidos, se construyó un modelo de la

estructura tridirnensional de la miotoxina 11 de A. numrnlfer usando como molde geoniétrico

inicial las coordenadas del cristal de la miotoxina 11 de Cerrophidion godmani, obtenidas a

una resolución de 2.8 A (Código lGOD en el Protein Data Bank (Ami et al., 1999), con la

cual muestra un 90.9% de identidad de secuencia. La secuencia de la toxina fue enviada al

servidor Swiss-Model (http:l/www.expas~.cW~p~lb~/~nai~~page.ltn) y la estructura resultante

fue visualizada y analizada con Swiss-PDB Viewer v.3.5 1 (Glaxo-Wellcome Experimental

Research) y W ebLabViewer v.4.0 (Molecular Simulations, Inc.).

3.7 Comparación de secuencias y relaciones filogenéticas de La miotoxina 11 de A.

nrrmnr ver

Para comparar la secuencia de aminoácidos de la miotoxina 11 de A. numrnifer con

otras PLA2s de grupo 11, se realizó un alineamiento múltiple con los programas FASTA

(Pearson y Lipman, 1988) y CLUSTAL W (Higgins et al., 1996) con ajuste de algunas brechas

("gaps"). Los árboles filogenéticos se calcularon usando PROTDIST (Felsenstein, 1995) y el

algoritmo "neighbor-joining" (Saitou y Nei, 1987). El diagrama del árbol fue generado con

DRAWTREE (Felsenstein, 1995).

3.8 Cristalización de la miotoxina II de A. nlrmrnifer

La cristalización de la miotoxina II de A. nummifer fue realizada por un método de

difusión de vapor en gota suspendida, usando platos de cultivo de 24 hoyos. Las pruebas

iniciales de cristalización se realizaron usando la técnica de tamizaje descrita por Jancarik y

I<in (1 991). Posteriormente, las condiciones se refinaron y la forma de cristal iinico se obtuvo

cuando se mezclaron 2 pL de la proteína con un volumen igual de una solución de acetato de

sodio 0.1 M , pH 4.6, PEG 3350 20% y sulfato de amonio 0.2 M. Los datos de difracción de

rayos X fueron colectados a partir de un único cristal (dimensión máxima de 0.3 mm) en el

Departamento de Física de la USP/SZo Carlos. La radiación fue generada por un instrumento

Rigaku RU300 de rotación de ánodo que opera a 50 k v y 100 rnA, equipado con espejos

ósmicos y un detector MAR435 con plato de imagen (MAR Research). Los datos se

colectaron en 78 imágenes usando el método de oscilación con un rango de 1" por imagen. El

cristal difiactó a una resolución nominal de 2.3 A. Los datos de difracción de rayos X fueron

procesados e integrados usando Denzo/Scalepack (Otwinowski y Minor, 1997).

3.9 Actividades enzimáticas y biológicas de las PLA2s grupo II

A. Actividad fosfolipasa: muestras de 0.1 m1 con diferentes concentraciones de toxina se

incubaron con 1 m1 de suspensión de yema de huevo diluida 1:5 en una solución de Tris-

HCI 0.1 M, CaClz 0.01 M, pH 8.5 con 1% de Tritón X-100, por 30 min a 37 "C.

Posteriormente, se extrajeron los ácidos grasos liberados por acción de la enzima y se

titularon de acuerdo con e1 método de Dole (1 956), utilizando NaOH 0.01 8 N y azul de

bromotimol como indicador.

B. Citotoxicidad: la actividad citotóxica se determinó usando una línea celular de

endotelio murino (tEnd) (Bussolino et al., 1991) o bien una línea muscular de ratón

(C2C12) (ATCC CRL-1772). Ambos tipos de células se cultivaron en medio de Dulbecco

Modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 15% de suero fetal bovino (SFB;

Sigma), glutamina 2 mM, acido pirúvico 1 mM, penicilina (1 00 U/ml), estreptomicina (0.1

mglml), y anfotericina B (0.25 pglml), en una atmósfera húmeda con 7% de COI, a 37 "C.

Cuando las células estuvieron confluentes en botellas de 25 cmZ, se disgregaron con una

solución de tripsina (1500 U /ml) con EDTA 5.3 mM, por 5 min a 37 "C. Las células

resuspendidas se sembraron en placas de 96 hoyos, a una densidad aproximada de 1-4 X

lo4 células/hoyo, en el mismo medio. Después de 2 a 4 días, tanto las células tEnd como

los mioblastos C2C12 fueron utilizados directamente, mientras que los miotubos se

obtuvieron mediante la diferenciación de mioblastos por 4 días más, en medio con 1% de

SFB. EI efecto Iítico en dichas células se estimó después de una inciibación de 3 hr con las

toxinas, a diferentes concentraciones, en un volumen final de 150 pl/hoyo, y

posteriormente se deteminó la actividad de la enzima deshidrogenasa lactica (DHL; EC

1.1.1.27) en el sobrenadante.

C. Mionecrosis: se disolvieron diferentes cantidades de toxinas en 50 pL de una solución

amortiguadora de fosfatos (PBS; NaCl 0.12 M, fosfato de sodio 0.04 M, pH 7.2). Las

diferentes soluciones de toxinas se inyectaron en grupos de 4 ratones CD-1 (1 8-20 g), en

el músculo gastronemio derecho. Un grupo de ratones fue inyectado con 50 p1 de PBS,

como control negativo. Después de 3 hr se tomaron muestras de sangre de la cola y se

determinó la actividad de la enzima creatina kinasa (CK; E.C. 2.7.3.2). La actividad de

esta enzima se expresó como U/ml, en donde una unidad corresponde a la fosforilación de

1 nmol de creatina por min a 25°C.

D. Edema: Para determinar el edema producido por las toxinas se inyectó

subcutáneamente diferentes concentraciones de estas disueltas en PBS, a grupos de 4

ratones, en la almohadilla plantar. Después de 1 hr se estimó el edema por el aumento en el

grosor de la pata, el cual fue medido con un caliper de baja presión (Lomoiite et al., 1993).

Un grupo de ratones control recibieron 50 p1 de PBS.

E. Acción antieoagulante: para determinar la acción anticoagulante de la miotoxina II de

A. nur>rniifer, se preparó un plasma de oveja pobre en plaquetas mediante centrifugación de

sangre citratada a 1000 xg, a 5 "C. Para la prueba se utilizó 0.5 m1 de plasma, el cual se

incub6 con diferentes concentraciones de la toxina en PBS, por 10 min a 37°C.

Posteriormente, se añadió 0.1 ml de CaC12 0.25 M y se anotó el tiempo que tarda el plasma

en coagular. Como control de la prueba se incubaron alicuotas de plasma con 0.1 m1 de

PBS y se determinó el tiempo de coagulación de forma idéntica. Las pruebas se llevaron a

cabo por triplicado.

3.1 0 Estudios con péptidos sintéticos

Para realizar el estudio comparativo de los péptidos correspondientes a la secuencia

115-129 de diferentes miotoxinas PLA2 Lys49, estos se sintetizaron mediante la estrategia F-

moc (Walker, 1994) ya sea manualmente en el Instituto Clodomiro Picado, o automáticaniente

por proveedores comerciales (Chiron Inc., o SynPep Inc., EUA). La masa molecular de los

péptidos se estimó por espectrometría de masas y su pureza (295%) se determinó mediante

RP-HPLC analítica. Los péptidos secos se conservaron a -20" C y se disolvieron en PBS, pH

7.2, inmediatamente antes de ser probados para sus actividades biológicas, tales coino

citotoxicidad en células en cultivo y rnionecrosis en ratones.

Para evaluar la actividad tóxica de los péptidos Ni vitro, se realizar011 pruebas de

citotoxicidad sobre mioblastos murinos C2C12, como se describió en el punto 3.8-B. Los

péptidos sintéticos se disolvieron en PBS y se diluyeroii en medio de cultivo. Las células

fueron expuestas a diferentes concentraciones de los péptidos, en un volumen de 150 p1, desde

25 a 150 pghoyo (aproximadamente 580 pM).

3.1 1 Disociación por pH de los dímeros de PLA2s

A. Entrecruzamiento quimico: se prepararon soluciones de 2 pg/pL de las PLA2s en

PBS, cuyo pH se ajustó ya sea a 5.0 o a 7.2. Estas soluciones se incubaron solas, o en

presencia de 2 pg/pL bis-sulfosuccinimidi1 suberato (BS~; Sigma), por 30 iriin a 25 "C.

Posteriormente, las muestras se calentaron a 95" por 5 min en preseiicia de SDS y P-

mercaptoetanol, y se analizaron mediante SDS-PAGE (12%), a lOOV por 2 hr. Las

proteínas se tiñeron con azul de Coornassie R-250.

B. Efecto del pH sobre la actividad citotóxica in vitro: la actividad citotóxica de las

PLAzs se probó a pH 5.0 (DMEM 1% SFB, titulado con ácido cítrico 2,O M) o pH 7.2

(DMEM 1% SFB), a diferentes concentraciones de toxina (5 , 10, 20 y 40 pg) sobre células

C2C12, como se describió en el punto 3.843. Ademas, se probó la acción de dos péptidos

correspondientes a la región C-terminal (residuos 1 15- 129) de la miotoxina 11 de Bothrops

asper (KKYRYYLKPFCKK) y la PLAz Lys49 de Agkistrohn p. piscivurus

(KKYKAYFKLCKK), a una concentración de 150 pg/150 p1 en dichas células.

C. Efecto del pH sobre la actividad miotóxica N1 vivo: la actividad miotóxica de las

PLA2s se evaluó por la inyección de 75 pg/75 pl de cada toxina en PBS a pH 7.2 o pH 5.0,

en el gastronernio, como se describió en el punto 3.9-C.

3.12 Susceptibilidad diferencial entre mioblastos y miotubos de la línea celular C2C12

Se probó comparativamente la citolisis inducida por vanas miotoxinas tipo PLAzs

Lys49 en células C2C12, ya sea como mioblastos no diferenciados o como miotubos. La

diferenciación se obtuvo con medio de cultivo con SFB al 1%. Las toxinas utilizadas en esta

comparación fueron: miotoxinas 1, 11, 111 y IV de B. nsper, miotoxina 11 de C. godmani,

miotoxina 1 y 11 de A. nznninfler, miotoxina 1 de B. schlegelii, PLAz del grupo 111, y melitina

sintética de abeja (Apis rnellifera) (Sima), así como dos péptidos sintéticos (Ba-p115-129,

KKYRYYLKPFCKK y Acl-p115-129, KKYKAYFKFKCKK) derivados de la miotoxina 11 de

B. asper y de la miotoxina de Agkistrodon contortrix laticinctus, respectivamente.

Además, se probaron diferentes agentes líticos inespecíficos tales como los detergentes

neutro (Tritón X-1 OO), aniónico (duodecil sulfato de sodio) y catiónico (cetil-trimetil brornuro

de amonio). Las pruebas de citotoxicidad se realizaron como se describió en el punto 3.9-B,

exponiendo los mioblastos o los iniotubos a diferentes concentraciones de cada agente lítico.

3.13. Efecto inhibitorio del fucoidan

A. Formación de complejos macrornoleculares: se determinó la formación de con~plejos

macron~oleculares entre el fucoidan y las miotoxinas 1, II, 111 y 1V de B. asper mediante

turbidimetria. Se disolvieron 2 pg de cada toxina en 2 m1 de una solución de Tris-KCl 0.01

M, pH 7.0, adicionándole seguidamente alicuotas de 1 p1 de fucoidan (20 mg/ml), para

obtener diferentes proporciones molares de fucoidan/miotoxina. Después de cada adición,

la mezcla se incubó por 1 min antes de leer la absorbancia a 340 nm.

B. Inhibición de la actividad citotóxica NI vitro: las toxinas, ya sea solas o mezcladas

con fucoidan (masa rnolecular 13 5 kDa), a diferentes razones molares, se incubaron por 30

min a temperatura ambiente. Las pruebas de citotoxicidad se realizaron como se describió

en el punto 3.9-B.

C. Inhibición de la actividad citotóxica de péptidos sintéticos: se probó la capacidad

inhibitoria del fucoidan sobre tres péptidos sintéticos liticos correspondientes a la región

C-terminal (secuencia 1 15-1 29) de la miotoxina 11 de B. asper (KKYRYYLKPFCKK), la

PLAz Lys49 de Agkistrodon piscivorus piscivorus (KKYKAYFKLKCKK) y la miotoxina

de A. contortrix laticinctus (KKYKAYFKFKCKK), respectivamente. Estos péptidos solos

(1 00 pg/150 pl), o mezclados con fucoidan a una razón molar de 0.25 (fucoidanípéptido),

se incubaron por 30 tnin a temperatura ambiente y posteriormente se aplicaron a los

cultivos de células C2C12 para probar citotoxicidad, como se describió en el punto 3.9-B.

D. Inhibición de la actividad miot6xica in vivo: la actividad miotóxica de las PLA2s

purificadas y su inhibición fueron probadas en grupos de 4 ratones CD-1 (18-20 g de

peso), después de la inyección intramuscular (en el gastronemio) de 75 pg de cada toxina,

ya sea sola, o preincubada con fucoidan a una razón molar de 1:1, por 30 min a

temperatura ambiente. Los grupos control recibieron una inyección idéntica de 100 p1 de

PBS solo, o fucoidan solo. La miotoxicidad se cuantificó como se describió en el punto

3.9-C.

E. Inhibición de la actividad fosfofipasa Af: se probó el efecto inhibitorio del fucoidan

sobre la actividad fosfolipasa de dos miotoxinas tipo Asp49 (miotoxinas I y 111 de B.

ospeu), preincubándolas con el fucoidan a diferentes razones molares, por 30 min a

temperatura ambiente y probando finalmente la actividad fosfolipasa como se describió en

el punto 3.8-A.

3.14 Efecto inhibitorio de1 DM64

A. Purificación del DM64: el DM64 se purificó como se describe en Rocha et al. (2002).

El suero de Dzdelphis marsupialis fue dializado y centrifugado. Posteriormente, el

sobrenadante se fraccionó en una columna de DEAE-Sephacel (2.6 x 17 cm) equilibrada

con amortiguador de acetato de sodio 0.01 M, pH 3.7. La elución se realizó utilizando un

gradiente lineal de NaCl de 0.15 a 0.5 M, a un flujo de 0.5 ml/min. La fracción del DM64

se precipitó con sulfato de amonio a 80% de saturación, se disolvió en un amortiguador de

fosfato de sodio 0.02 M, pH 7.0 y se dializó. Finalmente, la preparación se centrifugó y el

sobrenadante se fraccionó por cromatografia de afinidad en una columna HitrapB NHS-

activada conteniendo miotoxina 11 de B. asper inrnovilizada, de acuerdo con las

instrucciones del fabricante (Phamacia). La fracción unida se eluyó a un flujo de 1 rnl/min

con amortiguador glicina-HC1 0.1 M, pH 2.7, recolectándose sobre Tris 1.0 M para

neutralizar el pH.

B. Formación de complejos entre el DM64 y las miotoxinas PLAzs grupo 11: la

formación de complejos entre las miotoxinas y el DM64 se analizó por cromatografia de

afinidad, usando una columna Hitrapo NHS-activada conteniendo 1 mg de DM64

imnobilizado, de acuerdo con las instniccioiies del fabricante (Phamacia). Las miotoxinas

(50 pg1100 yl), disueltas en fosfato de sodio 0.02 M, pH 7.0 se aplicaron a la columna y

posteriormente la elución se realizó con glicina/HCl 0.1 M pH 2.7, recolectando con

amortiguador Tris 1.0 M para neutralizar el pH, a una tasa de flujo de 1 ml/min en un

sistema FPLC (Phamacia).

C. Formación de complejos entre el DM64 y hernorraginas: la formación de complejos

entre la atrolisina C de Crotalt<s atrox, o la jararagina de Bothrops jararnca (ambas a 50

pg/100 pl), y el DM64 se analizó por cromatografía de afinidad, usando una columna

HitrapB NHS-activada conteniendo 1 rng de DM64 inniobilizado, como se describió en el

punto anterior.

D. Inhibición de la actividad fosfolipasa A2: se probó el efecto inhibitorio del DM64

sobre la actividad fosfolipasa de dos miotoxinas Asp49 (miotoxinas 1 y 111 de B. nsper),

como se describió en el punto 3.9-A usando el método de Dole. Se incubaron por 30 min a

temperatura ambiente las toxinas (10 pg) solas o preincubadas con DM64 a diferentes

razones molares. Posteriormente, se determinó la actividad enzimatica como se describió

en el punto 3.9-A.

E. Inhibición de la actividad citotóxica in vitro: la actividad citotóxica de las PLA2s

purificadas y su inhibición por DM64 fueron probadas en mioblastos C2C12. Las toxinas

solas, o mezcladas con DM64, se incubaron por 30 min a temperatura ambiente, a

diferentes razones molares. La prueba de citotoxicidad se realizó como se describió eii el

punto 3.9-B.

4. RESULTADOS

4.1 Aislamiento y caracterización de la miotoxina II Atropoides ii~inzmifer

Al fraccionar el veneno crudo de A. nunin~ifev en CM-Sephadex a pH 7.0, se

obtuvieron varias fracciones de componentes básicos, como se muestra en la Fig. la, art. 1. El

pico 5 coirespondió a la miotoxina I descrita previamente por Gutiérrez et al. (1986b) y el pico

4 fue seleccionado para ser posteriormente recromatografiado en las mismas condiciones (Fig.

lb, art. I), y obtener una nueva miotoxina. La miotoxina 11 de A. nummlfer purificada apareció

como una unica banda en el sistema catódico urea-PAGE (Fig. 221, art. 1) y como una banda de

16 D a en SDS-PAGE despúes de la reducción con 2-mercaptoetanol (Fig. 2b, art. 1).

Además, la toxina eluyó como un solo pico en la corrida analítica en el sistema RP-HPLC

(Fig. 3, art. 1). El análisis mediante espectrometría de masas indicó que cada subunidad de la

proteína posee una masa molecular de 13,789.90 Da.

4.2 Actividades biológicas de la miotoxina II de A. rtz~mmifer

La miotoxina 11 de A. numnzfer no presentó actividad fosfolipasa A2 detectable, en

concentraciones hasta de 50 pglrnl, sobre fosfolípidos de yema de huevo y no mostró actividad

anticoagulante, en concentraciones hasta de 800 p g h l , sobre plasma pobre en plaquetas.

Sin embargo, la toxina indujo mionecrosis dosis-dependiente in vivo al ser inyectada

intramusculamente, como se evidenció por el aumento significativo de la actividad de la

enzima CK en plasma a las 3 hrs (Fig. 5a, art. 1). Además, esta toxina presentó un efecto

citolitico importante, tanto en células endoteliales (Fig. 5b, art.1) como musculares C2C12

(Fig. 1, art. VII), en cultivo.

Otra actividad biológica observada para esta toxina fue la capacidad para inducir un

edema significativo en el modelo de la almohadilla plantar del ratón (Fig. 6, art. 1).

4.3 Estructura primaria de La miotoxina 11 de A. nummifev y su comparación con otras

toxinas

Se presentó un reporte inicial de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la

rniotoxina 11 de A. nummifer (Fig. 7, art. 1) con sus primeros 53 residuos. Sin embargo, al

completar y confirmar dicha secuencia, se encontr6 que la posición 53 es ocupada por una

alanina, en lugar de la asparagina reportada inicialmente. Los primeros 53 residuos del N-

terminal se obtuvieron directamente, mientras que el resto de la secuencia proteica se obtuvo

por el traslape de secuencias de los péptidos generados por proteólisis coi1 las enzimas Arg-C,

Asp-N, Lys-C y quimotripsina, como se muestra en la Fig. 1, art. 11. Esta secuencia se

introdujo en la base de datos de Swiss-Prot y se le asignó el número de acceso P82950.

Al aiializar la secuencia de aminoácidos de la miotoxina 11 de A. jztunrnfer, se observó

que esta toxina contiene todos los residuos conservados de las variantes Lys49, iiicluyendo

Leu5, Glnll , Asn28, Arg34, Lys49, Lys53, Thr56, Ser74, Trp77, Lysl l5 y Lys128, además

de los 14 residuos cisteína característicos de las fosfolipasas secretadas del grupo 11. Se

encontró una sustitución conservativa en la posición 108, en donde la mayoría de las variantes

Lys49 tienen Glu, mientras que la miotoxina II de A. nunzrnlfer tiene Asp. Otro hallazgo

interesante se presenta en la posición 86, en donde la inayoría de las pmteíiias Lys49 tienen un

residuo acídico y esta toxina tiene Lys.

Al comparar la secuencia de aminoácidos de esta proteína con las variantes Lys49 y

Asp49, se encontró que su identidad varía entre 90.9 % y 58% con respecto a otras variantes

Lys49, mientras que varia eiilre 58% y 35% con respecto a las variantes Asp49 descritas en la

literatura.

4.4 Análisis filogenético

Un análisis filogenético inicial de 73 secueiicias de PLA2 de grupo II disponibles en las

bases de datos Swiss-Prot y TrEMBL, reveló que las variantes Lys49 constituyen un grupo

monofilético, teniendo una relación estrecha con las PLA2s Asp49 grupo 11. La Fig. 2, art. 11,

presenta un alinearnieilto múltiple de secuencias del grupo de variantes Lys49, el cual fue

utilizado para construir uii árbol filogenético que delinea las relaciones de la miotoxina 11 de

Atropoides nummlfer (PA22.ATRNU) con otras proteinas de la familia de PLA2s (Fig. 3, al?.

11). El árbol filogenético mostró que todas las PLA2s Lys49 son divergentes del gmpo de

variantes Asp49, presentes en las serpientes tanto del viejo mundo (subfamilia Viperinae)

coiiio del nuevo mundo (subfamilia Crotalinae). Además, se observó que las proteínas Lys49

foriiian un grupo más estrechameiite relacionado con las dos variantes Ser49 conocidas

(aminodytina L y ecarpholina S), compartiendo un ancestro común con estas.

Otro aspecto interesante es que la miotoxina II de A. nur,zrnifer y la miotoxina 11 de C.

godmani están muy estrechamente relacionadas, y divergen anteriormente a la rama que

contiene las secuencias de las variantes Lys49 presentes en algunas especies de Bothrops

(Fig. 3, art. 11).

4.5 Estructura tridimensional de la miotoxina 11 de A. nummifer: modelaje y

cristalización

Al comparar las secuencias de la miotoxina 11 de A. nzcmnzlfer con otras mioioxinas

Lys49, se encontró que el mayor porcentaje de identidad lo presentó con la miotoxina 11 de C.

godmani (90.9%). Por lo tanto, se utilizó la estructura tridimensional de esta última proteina

(acceso lGOD en el PDB) (Ami et al., 1999) para modelar la estructura terciaria del

rnonómero de la miotoxina 11 de A. numrnifer, como se muestra en la Fig. 4, art. 11. Se

observasoii solamente muy pequeñas desviaciones en el esqueleto de los átomos de carbono a

en relación con la toxina de C. godmani, con un valor de rmsd de 0.08 A. El modelo obtenido predice que la region C-terminal de la proteína, que combina

residuos catiónicos e hidrofóbicos, está altamente expuesta. La estructura tridimensional de la

región C-terminal, a pesar de ser la región más variable en este grupo de proteínas, se

superpone exactamente al molde de la miotoxina II de C. godmani, ya que son idénticas en

este segmento.

Posteriormente, la miotoxina 11 de A. nummfer pudo ser cristalizada en el laboratorio

del Dr. R. K. Ami, en Brasil. En la Fig. 1, art. 111, se muestra el patrón de difracción de rayos

X de esta proteína, y la fotomicrografla del cristal que difiacta a una resolución de 2.3 A. La

estructura tridimensional final de la toxina está actualmente en proceso de resolverse, a partir

de estos datos de difracción de rayos X.

4.6 Estudios con péptidos sintéticos

El péptido sintético 115-129 de la miotoxina 11 de A. nunzmifer no indujo lisis en las

células musculares C2C12 en cultivo (Fig. 1, art. IV), aún a dosis tan altas como 150 pg/150

pl/lioyo (1 mg/ml). La observación microscópica del cultivo confirmó que se mantuvo la

morfología celular normal. Concordantemeiite, la inyección intramuscular de 250 pg del

péptido 115-129 de A. nummifer en ratones no produjo aumento de la enzima CK en

comparación con los animales control, indicando no tener actividad miotóxica.

Estudios previos han demostrado que la actividad citotóxica en células C2C12 es una

propiedad común a todas las miotoxinas PLAzs de grupo 11 que han sido analizadas en este

sistema y que la prueba in vitro para las iniotoxinas y sus péptidos es más sensible que la

prueba de miotoxicidad in vivo en ratón (Lornonte et al., 1999b; Núñez et al., 2001). La Fig. 1,

art. IV, muestra que los péptidos correspondientes a la región 115-129 de las miotoxinas de

Agkistrorlon contortrix laticinctus (Acla), PLAz Lys49 de A. p. piscivorus (AppK), miotoxina

11 de Bothrops aspev (Basp-TI) y la forma alternativa de esta (Basp-IIF), producen una clara

actividad citotóxica, demostrada por la liberación de LDH dosis-dependiente, y por la

observación directa del dario celular al microscopio. Los péptidos de las dos especies de

Agkistrorlon fueron mas activos que los derivados de B. asper en la prueba.

Por otro lado, los péptidos correspondieiites a la miotoxina II de R. moojelli, (Binoo-

II), bokl~ropstoxiiia 1 de B. jararacussu (Bjsu-1), piratoxina II de B. pir-ajai (Bpir-II),

iiliotoxina II de Atropoides nunzinger (Anu-11), miotoxina 11 de C. godnznni (Cgod-11) y

aminodytina L de Vipera amnznodytes amnzodytes (Vainm), no causaron dafío celular a

concentraciones tan altas como 150 pg/150 plihoyo (1 mg/ml), como lo muestra la Fig. 1, art.

IV. Esto indica que las actividades tóxicas de las proteinas Lys49 no siempre son reproducidas

por sus coirespondientes péptidos sintéticos 115-129.

Adicionalmente a los péptidos correspondientes a las secuencias naturales halladas eii

las iniotoxi~ias, algunos de los péptidos sintéticos evaluados fueron seleccionados para dos

propósitos:

(a) determinar si la actividad citotóxica de los péptidos puede ser atribuída a efectos

inespecíficos de sus numerosos residuos de aminoácidos cargados positivainente. Para ello, se

recombin6 al azar la secuencia de uno de los péptidos liticos (AppK), encontrándose que este

péptido no posee capacidad de dañar las células en cultivo (Fig. 1, art. IV). Lo anterior

demuestra que la secuencia especifica de residuos en el péptido natural AppK, más que su

simple presencia o frecuencia, es el factor que le coiifiere la capacidad de inducir la rnoette de

células en cultivo.

(b) evaluar si los péptidos interactúan con alguna estructura dependiente de su configuración.

Para ello, se sintetizó el péptido AppK con D-amii~oácidos y se probó en células en cultivo.

Este enantiómero "D" mostró claramente citotoxicidad, con una potencia comparable a la de

su contraparte natural "L". (Fig. 1, art. IV). Por lo tanto, esto sugiere fuertemente que el

mecanismo citotóxico del péptido AppK no involucra el reconocimiento de un sitio aceptor

proteico en las células de músculo esquelético C2C12, ya que de ser así su efecto dependería

de la configuración. Entonces, podríamos pensar que posiblemente el mecanismo de acción de

las miotoxinas PLAzs Lys49 tampoco involucra el reconocimiento de un receptor proteico.

La secuencia original de la miotoxina II de B. asper contiene una ~nicroheterogeneidad

en la posición 124, ocupada por Leu o Phe (Francis et al., 1991), por lo que se probaron dos

péptidos de esta toxina, tanto con Leu124 como con Phe124. En ambos casos se observó

idéntica actividad citotóxica (Fig. 1, art. IV), lo cual indica que la presencia de cualquiera de

estos dos residuos no modifica la actividad de estos péptidos. Por otro lado, el péptido de

A-num-II/C.god-II se modificó sustituyendo el Asp 1 1 G de la secuencia original, por Lys 116.

Sin embargo, aún con esta sustitución, el pkptido mantuvo la ausencia de la actividad

citotóxica, indicándo que la introducción de una mayor carga positiva en el péptido C-tenninal

no modifica su actividad.

Por otro lado, al probar el péptido Basp-11-pEM-2 (basado en la secuencia de la

miotoxina 11 de B. asper) que contiene la triple sustitución Tyr+Trp (Lornonte et al., 1999a),

además de las sustituciones Pro-+Ala y Cys+Ala, se encontró que su citotoxicidad es mayor

en comparación con el péptido Basp-11 original, indicando que la presencia de los Trp aumeiita

su capacidad de causar muerte celular. La sustitución de Cys en este péptido se hizo para

evaluar si la posible dirnerización del péptido es necesaria para la actividad tóxica. Sin

embargo, este péptido provocó daño celular, demostrando que la dirnerización no se requiere

para esta actividad (Fig. 1, art IV).

Posteriormente, se evaluó la actividad de los péptidos in vivo inyectando 250 pg/50 pl

intramuscularmente en ratón y estimando la acción rnionecrótica mediante cuantificación de

los niveles de CK en plasma después de 3 hr. Se obtuvo que tanto el péptido AppK, como el

Acla, fueron capaces de producir mionecrosis, con un aumento significativo de los niveles de

CK en plasma (Fig.2, art. IV). Este hallazgo demuestra que la región 11 5-129 de la PLAz K49

de A. contortrix laticinctus constituye un sitio miotóxico, en concordancia con las

observaciones previas con la PLAz Lys49 de A. p. piscivoms (Núñez et al., 2001). Ambos

péptidos difieren solamente en la posición 123 (Leu en AppK y Phe en Acla), mostrando que

esta diferencia en la secuencia no causa un cambio drástico en la actividad tóxica de los

péptidos. Apoyando los resultados obtenidos in vitro, el péptido con secuencia al azar de

AppK no produjo miotoxicidad en ratón, mientras el péptido enantiomérico AppK-D fue

claramente miotóxico (Fig. 2, art. IV). Finalmente, el péptido correspondiente a la región C-

teminal de la miotoxina II de B. asper, que fue citotóxico iu vitro, no indujo miotoxicidad in

vivo (Fig. 2, art. IV).

4.7 Efecto del pH sobre las actividades tóxicas de PLAzs Lys49 diméricas

Estudios previos demostraron que la miotoxina Lys49 dimérica de B. jnrnracussz~

(bothropstoxina 1) se disocia en monomeros a pH 5.0, concomitantanente con una pérdida

completa de sil capacidad para dañar bicapas artificiales. La transición en la estructura

cuatemaria de miotoxinas inducida por pH se apoya en los análisis eletroforéticos después de

la incubación con iin acoplante homobifuncional, el bis-sulfosuccinirnidil suberato (BS~). Este

reactivo une los grupos arnino separados hasta por 11.4 A a la forma estable de unión

covalente arnida, en reacciones intra - e intemoleculares. La Fig. 1, art. V, muestra la

estabilización covalente de la forma dimérica de la miotoxina II de B. asper causada por el

B S ~ a pH 7.2, mientras que a pH 5.0 solamente se observa la forrna rnonornénca. Los

resultados indican que el estado dimérico se favoreció a pH 7.2, y que a pH 5.0 se obtiene una

disociación a monómeros, como se describi6 originalmente por de Oliveira et al. (2001).

El efecto citolitico de las iniotoxinas PLA2s Lys49 sobre inioblastos C2C12 se redujo

cuando ambos fueron incubados a pH 5.0. (Fig. 2, art. V). La toxina que presentó la mayor

diferencia en su actividad a los diferentes pH fue la PLA2 Lys49 de A. p. piscivovirs. La

incubación de cultivos control con medio solo a pH 5.0 no causó daño celular en el período de

tiempo utilizado, tanto en la evaluación por liberación de DHL, como en la observación al

microscopio.

Interesantemente, los péptidos correspondientes a la región C-terminal p-AppK49 de

Agkislvodon p piscivom y p-Ba-mt II de B. aspeu, que se probaron en cuanto a su actividad

citolitica en células C2C12, mostraron un efecto citolítico significativamente más bajo a pH

5.0 que a pH 7.2 (Fig. 3, art. V).

Los experimentos in vivo en ratones mostraron que el daño muscular producido por

miotoxinas preincubadas a pH 5.0 es significativamente menor que el producido por las

mismas preincubadas a pH 7.2. (Fig. 4, art. V).

4.8 Susceptibilidad diferencial entre mioblastos y rniotubos de la líuea celular C2C12

Dentro de las condiciones de cultivo descritas, una alta proporción de mioblastos

C2C12 se fusionaron a miotubos en pocos dias, después de bajar la concentración de SFB en

el medio a 1%. La morfología de las células utilizadas, mioblastos y miotubos, se muestra en

la Fig. 1, art. VI. Las curvas dosis-respuesta muestran que el efecto citolítico de las miotoxinas

PLA2s giupo 11 probadas, eii todos los casos, fue significativamente niayor en iniotubos

diferenciados que en mioblastos (Fig. 2, art. VI). Las diferencias en la susceptibilidad a la lisis

fueron más evidentes a dosis submáximas de la miotoxina (5-10 pg por hoyo),

correspondientes a una concentración de proteína de aproximadamente 2-4 pM.

En contraste con las PLA2s del grupo 11 n~iotóxicas de serpientes, la PLA2 del veneno

de abeja (grupo III), y la melitina, mostraron actividad citolitica similar en mioblastos y en

iiiiotubos, resultando en curvas de dosis-respuesta superpuestas (Fig. 3, art. VI). Sirnilarmente,

los tres tipos de detergentes probados (neutro, aniónico o catiónico) causaron el mismo efecto

Mico en ambos tipos de cultivos celulares (Fig. 4, art. VI). Por otro lado, los dos péptidos

sintéticos correspondientes a la región C-terminal de las miotoxinas PLAzs Lys49 de B. asper

y A. c. laticinctus, respectivamente, fueron significativamente más tóxicos en miotubos que en

mioblastos (Fig. 5, art. VI), reproduciendo en este sentido el coinportamiento de sus proteínas

originales.

4.9 Efecto inhibitorio del fucoidan

Al probar el efecto del fucoidan sobre la actividad citotóxica de miotoxiiias PLAL se

encontró inhibición para todas las miotoxinas probadas, con algunas ligeras variaciones

cuantitativas entre ellas. Las miotoxinas 11 y IV de B. asper y iniotoxinas 1 y 11 de A.

rizlmmífer, miotoxinas I y II de C. godnzani y niiotoxina I de B. scizlegelii se ii~hibieron

coinpletamente por preincubación con el fucoidan, mientras que la actividad de las miotoxinas

1 y 111 de B.asper se redujo en 50-65% en una relación molar de 1: 1 (Fig. 1, art. VII). La

capacidad inliibitoria del fucoidan sobre las miotoxinas se evaluó mediante la liberación de

DHL, lo cual fue consistente con las observaciones al microscopio de la morfología de las

células en cultivo. El fucoidan por sí solo, a la coiicentración miixima utilizada en

experimentos de inhibicibn, no alteró la morfología celular, ni causó liberación de DHL.

La rniotoxina II de B. nsper fue seleccionada para estudiar el curso en el tiempo del

efecto inhibitorio del fucoidan sobre la actividad citotóxica iut vitro. Como se muestra en la

Fig. 2, art. VII, la acción del fucoidan fue muy rápida, con una completa inhibición de la

toxina con una preincubación de 5 min a temperatura ambiente, antes de aplicar la riiezcla al

cultivo celular.

Los resultados anteriores coinciden con la formación rápida de complejos

macromoleciilares entre el fucoidan y las miotoxinas 1, 11, III, y 1V de B. nsper observados por

pruebas de turbidimetría. La adición de ft~coidan a esas toxinas en soi~ición provocó iin

aumento rápido de turbidez a 340 mn, iridicarido la fonnación de complejos insolubles. Esos

complejos generaron una turbidez máxima a uiia razón molar de aproximadaniente 0.13

(fucoidan/iniotoxina), y posteriormente se redisolvieron por uiia adición gradual de exceso de

polisacárido (Fig. 3, art. VII).

El posible sitio de interacción del fucoidan eii las iniotoxinas PLA2 se investigó con

una prueba de unión competitiva a una fase sólida con iniotoxina 11 inniovilizada, en donde el

f~~coidan causó una reducción significativa en la unión de antic~ierpos de conejo hacia la

región C-terminal 11 5-129 de la miotoxina 11 de B. iisper (Fig. 4, arl. VII). Además, usando

tres péptidos sintéticos citoliticos correspondientes a la región 115-129 de diferentes PLA2s

iiiiotóxicas en pruebas de citotoxicidad, se mostró que el fucoidan iiihibió la acción litica eii

los tres casos (Fig. 5, art. VI1).

Por otro lado, usando dos PLA2s tipo Asp49 de R. nsper (miotoxiiias I y III), se probo

la posible inhibición de su actividad catalitica por el fucoidaii. Cuando el fucoidan fue

incubado con esas toxinas a razones molares mayores de 2:l (fucoidaii/miotoxina), su

actividad PLA2 fue idéntica a la de las toxinas control incubadas sin fucoidan, evidenciando

que su actividad enzirnática no fue iiiliibida.

En otro conjunto de experimentos, se examinó la iiihibición de las miotoxinas PLAz

por fucoidan iil vivo, por estimación de los niveles de CK plasmática en ratón. Los datos

resumidos en la Fig. 6, art. VI1 muestran una clara reducción en la CK plasinática inducida

por todas las toxinas probadas, después de su incubación con fucoidan a una razón molar de

1 : 1. Aunque hay algunas leves diferencias cuantitativas entre las toxinas, las inhibiciones

variaron entre 70 y 95%. Ademis, el fucoidan inhibió la accióii miotóxica del veneno crudo de

B. nsper, en los experimentos con preincubación (Fig. 6, art. VII). La inyección del fucoidan

por sí solo no produjo aumentos de los valores de CK en plasma, en comparación con los

animales control que recibieron una inyección de PBS solo.

Finalmente, el posible efecto protector del fucoidan fue evaluado en pruebas de

administración independiente, en las que el polisacárido fue inyectado localmente,

inmediatamente después de una inyección intrarnuscular de veneno de B. asper. cii ratón. La

administración del fucoidan redujo significativamente la mionecrosis, resiiltando eri valores de

CK que corresponden a aproximadamente 50% del grupo que recibió veneno solo (Fig. 7, art.

VI1). Sin embargo, un incremento en tres veces la dosis de fucoidan administrada i ~ r situ (de

90 a 270 pg) no mejoró el nivel de protección.

4.1 O Efecto inhibitorio del DM64

La unión entre el DM64, una proteína plasmática de Didelphis r~inrszipialis, y las

miotoxinas 1, 11, III y IV de B. asper, I y 11 de A. nummifer, 11 de C. godmnrii, piratoxina y

bothropstoxinas I y 11, evaluada mediante cromatografia de afinidad, se muestra en las Figs. 5

Y 6-

0 2 4 6 8 1 0 O 2 4 6 8 1 0 1 2

Fracciones

Figura 5: Formación de complejos entre el DM64 y las PLA2s del grupo It miotóxicas del

veneno de Bofhrops asper. Los análisis se realizaron en una columna de afinidad NHS

~ i t rap" con DM64 inmobilizado. Las isoformas de 8. asper (50 pgJ100~il) miotoxinas I (A),

II (B), 111 (C), y IV (D) fueron aplicadas a la columna, y eluídas con amortiguador de glicina-

HCI 0.1 M, pH 3.0.

O -

0 2 4 6 8 1 0 O 2 4 6 8 1 0 1 2

Fracciones

Figura 6: Formación de complejos entre el DM64 y las fosfolipasas A, del grupo II

miotóxicas. Los análisis se realizaron en una columna de afinidad NHS Hitrapm con

DM64 inmovilizado. Las miotoxinas I (A) y II (B) de Atropoides nummifer, miotuxina II de

Cerrophidion godmani (C), piratoxina i de Bothrops pirajai (D), bothropstoxina I de B.

jararacussu (E) y bothropstoxina II d e 8. jararacussu (F) (50 pg/iOO id), fueron aplicadas

a la columna, y eluídas con amortiguador de glicina-HCI O 1 M, pH 3.0.

Mediante el mismo método de afinidad, el DM64 no formó complejos con dos

hemorraginas, la atrolisina C de Crotalus atrox y la jararagina de Botltrops jarartrcn (Fig. 7),

indicando que esta proteina posee selectividad para las iniotoxinas de estos venenos, pero no

para Las metaloproteinasas hemorrágicas.

O 2 4 6 8 1 0 O 2 4 6 8 1 0 1 2

Fracciones

Figura 7 : Ausencia de formación de complejos entre el DM64 y dos hernorraginas de

veneno de serpiente. El análisis con las hemorraginas (50 pgfI00yl) atrolisina de

Crotalus atrox (A) y jararagina de Bothrops jararaca ( B ) se realiz6 en una columna de

afinidad NHS ~ i t r ap " con DM64 inmovilizado.

El efecto inhibitorio del DM64 sobre la actividad citotóxica de las PLAzs miotóxicas

de serpieiites de la familia Viperidae, se probó a diferentes proporciones molares

DM64/iriiotoxina. En los mioblastos C2C12 en cultivo, se presentó variabilidad eii la

capacidad de inhibición del DM64 con las diferentes miotoxinas probadas. Sin embargo, en

todos los casos se obtuvo una buena inhibición a tina proporción molar de 1:l (Fig. 8). Por

otra parte, el DM64 no fue capaz de inhibir la actividad fosfolipasa de dos miotoxinas Asp49

probadas (iniotoxinas 1 y 111 de B. aspev).

o O 00 O25 O 50 O 75 1 O0 1 25

Razón molar DM64 1 rniotoxina

Figura 8: Inhibición de la actividad citotóxica in vitro de las fosfolipasas A2 del grupo ll

miotóxicas por el DM64. La citotoxicidad fue determinada por la fiberación de LDH en

mioblastos de músculo esquelético C2C12, 3 hr después de la exposición a miotoxinas

(15 pg) solas, o preincubadas con DM64 a las proporciones molares indicadas.

Miotoxinas I (O), II (A), III (O) y IV (e) de B. asper, miotoxina I I de Atropoides nummifer

(A), y miotoxina 1 1 de Cerrophidion godmani (m). Cada punto representa el promedio I

SO de tres determinaciones.

5. DISCUSIÓN GENERAL

En este estudio se purificó y caracterizó una nueva miotoxina tipo PLA2 del veneno de

Atropoides numrnifer. La proteína se obtuvo de manera homogénea, de acuerdo con los

criterios utilizados: urea-PAGE catódico, SDS-PAGE y RP-HPLC. Las electroforesis en gel

de poliacrilamida nos indican que la rniotoxina II de A. iiirmnzifer es un homodíinero de

subunidades básicas. Mediante secuenciación, se determiiió que cada subunidad consta de 121

aminoácidos, con una masa molecular de 13,789.90 Da por unidad, detenninada en un

espectrómetro de masas. Esta proteína presenta actividad citolitica in vitro, así como como

actividad miatóxica e inductora de edema in vivo. Estas actividades biológicas soii

ciialitativamente y cuantitativamente similares a las descritas para otras PLA2s blsicas de los

venenos de serpiente de la familia Viperidae, que incluyen la capacidad de inducir: (a) una

rápida necrosis de músculo esquelttico en el sitio de la inyección, (b) un irunediato aumento

de la permeabilidad de la microvasculatura local y ( c ) un rápido efecto citolítico in vitro.

La secuencia de aminoácidos de la miotoxina 11 de A. nirnzmlfer muestra que es una

PLA2 tipo Lys49, con la estructura típica del grupo IIA de esta familia de proteínas. Esta

toxina tiene una alta identidad de secuencia con otras PLA2 Lys49 aisladas de especies de

Cerrophidion, Trirneresurzís, Bothrops y Agkistrorlon . Iiit eresantemente, el árbol fi log enéti co

constniído con 24 PLAzs de grupo 11 en este estudio, muestra que las variantes Lys49 se

encuentran más cercanamente relacionadas con las PLA2s Ser49 de vipéridos del viejo mundo

de los géneros Vipera y Echis, sugiriendo un ancestro común que se separó después de su

divergencia de las PLAzs Asp49. El análisis detallado de los genes que codifican las PLA2s

Asp49 y Lys49 de las especies asiáticas de Trimeresurus demuestra que estas presentan u11

mecanismo de evolución acelerada (Ogawa et al., 1992; Nakashima et al., 1995; Nobuhisa et

al., 1996). Se desconoce aíin el valor adaptativo de una rápida evolución de las miotoxinas del

grupo IIA Asp49, activas catalíticamente, a las miotoxinas Lys49 o Ser49, inactivas

catalíticamente. Los estudios con un número de miotoxinas básicas Asp49 y Lys49 aisladas de

varias especies de Bothrops muestran una potencia y espectro de actividades tóxicas muy

similares (Gutiérrez y Lomonte, 1997), indicando que este cambio no está relacionado con una

mayor toxicidad.

La miotoxina 11 de A. nummijer muestra una relación filogenética cercana con la

miotoxina 11 de C. godmnni, también distribuida en América Central, y con las isoforrnas

Lys49, BP-1 y BPII, aisladas de la serpiente asiática T. flnvovirirlis. Esta separación relativa

del p i p o formado por las PLAz Lys49 de las especies de Bothvops de Arnérica Central y

Suramérica (Le. miotoxina II de B. nsper, miotoxiiia I de B. moojeni, bothropstoxiiia I de B.

jararacussu y piratoxina 11 de B. pirrjai), mostrada en el árbol filogenético, refleja la división

taxonómica que propuso el cambio del género Bothrops al nuevo género Atropoides (Wennan,

1992).

La alta identidad en la secuencia de la miotoxina 11 de A. nurnmfer con la miotoxina 11

de C. godmani permitió la constmccii>n de un modelo confiable de la estructiira tridirnensjonal

de la proteina. La diferencia entre ambas proteínas es mínima, con un msd de 0.08 A en el

esqueleto de carbonos alfa. Aíin en la región C-terminal, que muestra la mayor variabilidad en

las diferentes PLAi Lys49 (Lomonte et al., 2003b), la estructura predicha de la rniotoxina II de

A. nummlfer es virtualmente superponible a la proteina de C. gorlrnnni.

La región C-terminal es de interés particular en las variantes Lys49, ya que como lo

mostraron estudios previos con pbptidos sintéticos de 13 aminoácidos correspondientes a los

residuos 115-129, esta región reproduce las actividades de lesión directa a inernbrana en el

caso de dos miotoxinas de este grupo: rniotoxiiia II de B. nsper (Lomonte et al., 1994a) y la

Lys49 de Agkistroclori p. piscivorus (Nuñez et al., 2001). Interesanteinente, el péptido 1 1 5- 1 29

de la miotoxina 11 de A. nummEfer no muestra efectos tóxicos en las células de músculo en

cultivo o el tejido muscular N1 vivo. Por lo tanto, esta PLA2 Lys49 es un caso en donde las

acciones tóxicas de la molécula completa no son reproducidas por el péptido C-terminal libre.

Dado que la región 1 15- 129 de la miotoxina 11 de A. ntlmmfler es idéntica a la de la miotoxina

II de C. godmani, la presente observación puede ser extrapolada también a esta proteína. Sin

embargo, tales hallazgos no necesariamente excluyen la participación de la región C-terminal

de la miotoxina II de A. nurnrnifev o de la miotoxina II de C. goclmarii, en el mecanismo tóxico

de esas proteínas, pues podría ser que el péptido libre 115-129 no necesariamente esté

adoptando una conformación adecuada para la acción tóxica en estos casos.

Los aminoácidos que difieren entre los péptidos que representan la región 1 15-129 de

diversas PLAzs Lys49 se indican en el Cuadro 1, art. 11. Estos varían desde el no tóxico de la

miotoxina 11 de A. nummifer/miotoxina II de C. god~~zani, el péptido moderadamente tóxico de

la miotoxina 11 de B. asper y el péptido más potente de la PLAzs Lys49 de A. p. piscivorus.

Aunque hay una diferencia en la carga neta positiva en estos tres péptidos (+5, +6, +7

respectivamente) que podria correlacionar con su capacidad tóxica, ello no parece ser

suficiente para explicar las variaciones en la actividad tóxica, ya que aunque el péptido 115-

129 de la miotoxina II de B. nspev aumentó la potencia tóxica en un orden de magnitud

después de sustituir tres residuos de Tyr por Trp, no se alteró su carga neta positiva (Lomoiite

et al., 1999a).

Algunos de los péptidos sintéticos estudiados (AppK y Acla) pueden expresar la alta

actividad citotóxica y miotóxica propia de sus proteínas correspondientes, otros solamente

reproducen el efecto citotóxico in vitro (Basp-11, Basp-II-F) y otros no tienen ningún efecto

tóxico detectable (Bmoo-11, Bjsu-UBpir-11, Anum-II/Cgod-11). La aparente discrepancia entre

la actividad citolítica in vitro del péptido Basp-11, y su ausencia de toxicidad in vivo, podria ser

explicada por una mayor sensibilidad de la prueba citotóxica en comparación con la prueba de

iniotoxicidad (Lomonte et al., 1999a, Núñez et al., 2001). Podriamos asumir que el número de

sitios blanco para los péptidos sea significativamente más bajo en el modelo de cultivo celular,

que en la masa de tejido muscular in vivo, por lo que el péptido podría concentrarse a altas

densidades en la superficie de las células en cultivo, en contraste con la dispersión que

probablemente ocurre a lo largo de las fibras musculares in vivo.

Por otro lado, la ausencia de las actividades tóxicas para algunos péptidos estudiados,

no excluye la posible participación de la secuencia 115-129 como una región tóxica de sus

correspondieiites PLAzs Lys49. Desde una perspectiva evolutiva, es claro que las miotoxinas

PLA2 Lys49 constituyen un grupo filogenéticamente relacionado (Fig. 3, art. II), por lo que no

se esperaría que hubiera un desarrollo marcadamente diferente de las regiones activas en

diferentes especies de serpientes. La evidencia directa de toxicidad por los péptidos 115-1 29

de algunas de las PLA2s Lys49, sugiere que esta región puede también jugar un papel central

en el mecanisnio tóxico de otros miembros de esta familia de proteínas. Sin embargo, las

razones por las cuales algunos péptidos no muestran actividad no están claras aún. Una posible

explicaci~n podria ser que algunos péptidos libres en solución, adopten una conformación

alterada, desfavorable para el mecanismo tóxico. El segmento 1 15-129 forma una asa en la

región C-telminal de las rniotoxinas Lys49 (Ami y Ward, 1996), pero la conformación de 10s

péptidos libres correspondientes no ha sido estudiada aún. Además, la participación de otras

regiones (adyacentes o distantes) en el mecanismo tóxico no debe excluirse.

Independientemente de estas razones, se propone que la observación positiva de toxicidad

directa por un péptido C-terminal particular demuestra que esta región está involucrada en el

mecanismo de toxicidad, pero lo opuesto no necesariamente es verdadero, es decir, un

resultado negativo necesariamente no excluye la participaciiin de esta región. En apoyo a esta

idea, en estudios con mutantes de la bothropstoxiria I recombinante de B. jnmraczrsszr se

demostró claramente una ftinción relevante de los residuos 1 15-125 en las acciones tóxicas de

esta proteína (Chioato et al., 2002), a pesar de que los presentes resultados mostraron que el

pCptido 1 15- 129 de esta toxina fue inactivo.

En el presente estudio se demostró que tanto la actividad citotóxica de varias PLAzs

Lys49 iu vitvo, como su actividad miotbxica in vivo se reducen, aunque no se eliminan, a pH

5.0, en comparación con su actividad a pH 7.2. Dado que se ha demostrado que a pH 5.0

ocurre una disociación de las formas diméricas de estas toxinas (de Oliveira et al., 2001), los

resultados apoyan la idea de que la disociación puede reducir la capacidad de alterar la

membrana plasmática, originalmente propuesta por de Oliveira et al. (2001). Sin embargo, en

contraste con los hallazgos de dichos investigadores usando liposomas como blanco, los

resultados con mioblastos en cultivo demuestran que la acción tóxica de las PLA2s Lys49 se

reduce a pH 5.0, pero 1x0 se elimina. Los anklisis estnicturales realizados con la bothropstoxina

1 sugieren un cambio de la estructura cuateniaria entre las conformaciones "abierta" y

"cei~ada" (da Silva Giotto et al., 1998), lo cual podría jugar un papel en la capacidad de las

miotoxinas Lys49 para desorganizar la bicapa de fosfolípidos, usando la región C-terminal

como un sitio efector. Una posibilidad adicional, pero no mutuamente excluyente, es que la

mayor actividad de los dímeros pueda estar relacionada a una unión más eficiente a aceptores

de membrana, con una mayor avidez de una interacción divalente, comparada con la afinidad

de unión inonovalente de los monómeros individuales.

En los experimentos zn vivo en ratones, en donde se demostró que el daño tisular por

miotoxinas preincubadas a pH 5.0 es significativamente menor que el producido por las

mismas toxinas a pH 7.2, se debe considerar que dentro de esas condiciones, podria ser que las

soluciones inyectadas sean rápidamente amortiguadas a pH fisiológico. Es posible que las

iniotoxjnas Lys49 ingresen al tejido muscular a pH 5.0 en un estado monomérico, y puedan

unirse a su blanco sarcolemal antes de que ocurra una reasociación completa del dimero,

explicando así la baja actividad tóxica observada in vitro. Sin embargo, estas observaciones Nz

vivo son más dificiles de interpretar que los resultados obtenidos con cultivos celulares, en

donde el pH del medio puede ser controlado en los experimentos.

Interesantemente, los péptidos correspondientes a la región C-terminal de Agkisírodo~i

p. piscivorus (p-AppK49) y de B. asper (p-Ba-mt II) también mostraron el mismo fenómeno

en las células C2C12, con un menor efecto a pH 5.0. Estos péptidos cortos no tienen una

estnictura cuaternaria. La reducción en la actividad citolitica de los péptidos a pH 5.0 no

puede ser atribuida a variaciones en el grado de protonización de los grupos laterales de la

cadena (que afecten su conformación o su interacción con la membrana plasmática del

inioblasto), ya que si nos basamos en el conocimiento de los valores de pK de los gnipos

amino y carboxilo presentes en su secuencia, no se cambiaría la carga neta al disminuir el pH

de 7.2 a 5.0. Por lo tanto, es posible especular que la estructura blanco en la membrana celular

podn'a ser alterada por la disminución de pH, o que el aumento extracelular en la

concentración de protones pueda tener un efecto protector contra la permeabilización de

membrana. El fenómeno de protección de membranas mediado por protones ha sido

previamente demostrado para algunas moléculas citolíticas (Bashford et al., 1989; Rostovtseva

et al., 1994). Los resultados permiten concluir que el estado djmérico de las PLA2s Lys49

puede jugar un papel importante, aunque no esencial, en el mecanismo de rniotoxicidad

mediado por la región C-terminal.

Se ha propuesto como un útil modelo in vitro para estudiar el mecanismo iniotóxico de

las PLAzs del grupo II, a los cultivos celulares de niioblastoshniotubos de músculo

esquelético. En dichas células, este efecto correlaciona con la actividad de daño muscular

observada in vivo (Bnisés et al., 1993; Incerpi et al., 1995; Lomonte et al., 1999b). En este

estudio se investigó si la fusión y diferenciación de rnioblastos C2C12 conduce a una mayor

susceptibilidad hacia la acción citotóxica de las PLA2s del grupo 11 miotóxicas.

Se observó claramente una susceptibilidad aumentada de los miotubos usando un

grupo de rniotoxinas de serpiente, incluyendo variantes Asp49 y Lys49. Además, otro tipo de

proteínas cuya acción rniotóxica ha sido documentada, como la PLAi del veneno de abeja

(grupo 111) y el péptido catiónico melitina (Ownby et al., 1997), afectaron a ambos tipos de

células en cultivo de la misma forma. El uso de varios detergentes también mostró un efecto

citolitico similar en mioblastos y miotubos, por lo que la susceptibilidada aumentada de los

miotubos a las PLAzs del gmpo II no puede ser atribuida a la posibilidad de una capacidad

menor de esas células para hacer frente a perturbaciones generales de la homeostasia de la

membrana. Por tanto, la diferenciación de mioblastos en miotubos debe conducir a cambios

que favorezcan la acción de las miotoxinas PLA2 del gmpo 11. Estos cambios podnan

involucrar la expresión de un mayor número, o de un tipo de alta afinidad, de sitios aceptores

para las PLAzs miotóxicas en la membrana plasmhtica. Sin enibargo, la posible participación

de procesos intracelulares que ocurren después de la fusiOn de los mioblastos, podría también

jugar un papel y no puede exluirse por ahora.

La selectividad del efecto miotóxico de las PLA2s de gmpo II in vivo se ha atribuido a

la existencia de sitios de unión específicos en la membrana plasmática de las células de

músculo esquelético, pero su naturaleza es completamente desconocida. Se han identificado

aceptores proteicos de alta afinidad para PLAzs neurotóxicas activas presinápticamente, en

tejido neurona1 (Lambeau et al., 1989; Krizaj y Gubensek, 2000). Por otro lado, una proteína

de membrana rnultidominio de 180 KDa, conocida como receptor tipo M, se ha caracterizado

como un sitio de unión para algunas PLA2s del gmpo 1 en músculo esquelético (Lambeau et

al., 1990). Sin embargo, no hay ninguna evidencia reportada a la fecha que involucre a los

receptores tipo M en el efecto rniotóxico de las PLA2s de gmpo 11.

Alternativamente, las miotoxinas PLA2s del gmpo II podrían actuar reconociendo

lipidos de membrana, como glicerofosfolípidos o glicolipidos, que estén diferencialmente

expresados, o diferencialmente agrupados en dominios lipidicos o en balsas (rcfls), eii los

mioblastos y los miotubos. Algunas observaciones sugieren que los fosfolípidos cargados

negativamente podrian ser aceptores importantes para el mecanismo rniotóxico de estas

proteinas (Diaz et al, 2001). En particular, la actividad citolitica demostrada por un péptido

sintético derivado de la PLA2 Lys49 de Agkzstrodun p.pzscivoru, preparado con D-

aminoacidos (art. IV), sugiere fuertemente que el mecanismo de acción de esas miotoxinas no

involucra el reconocimiento de un sitio aceptor proteico en células musculares. Este fenómeno

de susceptibilidad diferencial indica que el sistema de cultivo celiilar mioblastos/miotubos

podria ser un excelente modelo para detectar los cambios fenotípicos que aparecen en esa

transición pudiendo ser estos los "aceptores" de las PLA2s.

En las últimas décadas, se ha reportado un número creciente de iiihibidores de PLAzs

rniotóxicas de venenos de serpiente, como proteínas plasmiticas animales (Nobuhisa et al.,

1998; Lizano et al., 2000; Rocha et al., 2002), polisacáridos (Melo et al., 1993; Lomoiite et al.,

1994b) y componentes de plantas (Mahanta y Mukherjee, 2001; Deepa y Gowda, 2002). Con

el avance gradual de la comprensión sobre los determinantes moleculares y los mecanismos de

acción de las miotoxinas, el hallazgo de inhibidores eficientes podría aprovecharse para el

desarrollo de tratamientos complementarios a la seroterapia durante los envenenamientos

ofidicos en el fiituro.

El descubrimiento de las PLA2s Lys49 enzimáticamente inactivas en los venenos de

crotálidos (Maraganore et al., 1984, Maraganore y I-Ieinrikson, 1986), ha impulsado las

investigaciones para delinear el sitio tóxico en estas proteínas. La evidencia existente indica

que la región C-terminal de las variantes Lys49, que combina aminoácidos catiónicos e

hidrofóbicos, constituye un sitio determinante para su actividad miotóxica (Lomonte et al.,

1 494a, 2003; Núñez et al., 2001, Calderón y Lomonte, 1998; Chioato et al., 2002; Ambrosio et

al., 2005). Por tanto, las moléciilas poliaiiiónicas con la capacidad de unirse a este sitio tóxico

coiistituyen candidatos racionales para la evaluación de su actividad inhibitoria de la

rniotoxicidad.

En el presente estudio se evaluó la capacidad neutralizante del fucoidan, un

polisacárido sulfatado, extraído del alga FUCLIS vesic~los~s. Aunque comparten algunas

propiedades con heparina, los fiicanos sulfatados constituyen moléculas polianiónicas

alternativas, con un amplio espectro de perfiles famacológicos (Mourao y Pereira, 1999).

Usando un grupo de miotoxinas PLAi purificadas de diferentes venenos de vipéridos, se

demostró que el fucoidan inhibe eficieiiteinente sus efectos citotóxico (in vitro) y miotóxico

( in vivo). Mas aún, en el caso de dos variantes Asp49 activas cataliticamente, el fucoidan

inliibió sus accioiies tóxicas sin afectar su capacidad de hidrolizar fosfolipidos. Este resultado

ejernplifica la disociación entre toxicidad y catálisis en la familia de las miotoxinas tipo Asp49

gmpo 11, reportadas en diversos estudios previos (Lomonte et al., 1992, 1994; Gutiérrez y

Lomonte, 1997; Soares et al., 2001).

El mecanismo de inhibición del fucoidan hacia las miotoxinas PLA2 se basa en la

formación rápida de complejos, probablemente mediada por interacciones electrostáticas

multivalentes entre los sulfatos aniónicos del polisacárido y los numerosos residuos catiónicos

de las toxinas, que tienen un punto isoeléctrico básico. La formaci0n de complejos unidos

reversiblemente se evidenció por análisis de turbidimetria, en donde las propiedades de

dispersión de luz de las mezclas fucoidadmiotoxina varían de acuerdo con las proporciones

relativas de esos dos componentes, resultando en una típica curva de absorbancia en forma de

campana.

El posible sitio de unión del fucoidkn en las miotoxinas se investigó usando péptidos

sintéticos que representan la región de daño a membrana (residuos 115-129) para tres de las

toxinas (Lonioiite et al., 2003b). El fucoidán claramente inhibió la actividad citolítica de los

tres péptidos sintéticos, demostrando su capacidad para interaccionar con la región miotbxica

C-terminal de esas PLA2s. Esta conclusión también es apoyada por los datos de competencia

de unión entre los anticuerpos contra la región 115-129 de la miotoxina II de B. nsper y el

fucoidan: la unión de dichos anticuerpos a la toxina irnovilizada se redujo significativamente

en presencia del fucoidan.

Por su naturaleza polianiónica común con la heparina, el fucoidán podria actuar de un

modo similar (Lomonte et al., 1994b). Sin embargo, la densidad de cargas negativas en un

esqueleto de polisacárido no es el único factor que determina la capacidad de interaccionar con

las miotoxiiias. Por ejemplo, se ha observado que la unión del condroitín sulfato y el dermatán

sulfato a la miotoxina II de B. asper es mas débil que la unión del heparán sulfato, aunque este

último es menos sulfatado (Lomonte et al., 1994b). Esto indica que los distintos esqueletos de

los polisacáridos poseen influencia para una interacción óptima coii las proteínas. Lin et al.

(1999), al caracterizar la interacción entre la heparina y una PLA2 de grupo 1 del veneno de

Nnja >ligricollis, hallaron que participan tanto las fuerzas electrostAticas como las no

electrostáticas.

Se evaluó la capacidad del fucoidán para inhibir el daño a niúsculo, administrándolo

localmente, inmediatamente después del envenenamiento con veneno crudo de B. aspeu. Bajo

dichas condiciones, la inyección de fucoidán disminuye parcialmente la mionecrosis inducida

por el veneno, a un nivel de aproximadamente 50% de los animales no tratados. Sin embargo,

es importante señalar que no necesariamente es adecuado extrapolar los resultados obtenidos

en ratón con los de un accidente ofídico en humanos, ya que el envenenamiento en ratón se

desarrolla muy rápidamente.

Una limitación importante del desarrollo de cualquier inhibidor efectivo clínicamente

para las miotoxinas es la rapidez dramática con que estas proteínas afectan el mUsculo

esquelético, como se ha observado por técnicas de microscopía intravital (Lomonte et al.,

1994~). El alto peso molecular del fucoidan (135kDa) podría también ser un factor que podría

limitar su distribución y difusión en los tejidos. La caracterización de los fragmentos de

fucoidaii de baja masa, o de diferentes tipos de fucanes sulfatados obtenidos de una variedad

de fuentes naturales (Mourao y Pereira, 1999), podria ser de interés en este sentido.

El DMú4, una proteina plasmática acidica de Diclelphis rnarszlpinlis, tiene la capacidad

de forn~ar complejos con las diferentes PLA2s iniotóxicas probadas. Sin embargo, iio es capaz

de hacerlo con las metaloproteinasas hemorrágicas. Esto indica que el DM64 es uiia proteína

con interacción especifica hacia las rniotoxinas, que es capaz de inhibir su actividad, lo que

insta a realizar estudios para encontrar el sitio de interacción, que contribuyan al

esclarecimiento del mecanismo de esta inhibición.

6. CONCLUSIONES

6.1 La miotoxina II de Atropoides ~iummifer es una PLAz de tipo Lys49, hornodirnérica, con

subunidades básicas de 121 aminoácidos y una masa molecular de 13,789.90 Da por unidad.

Su secuencia tiene un alto porcentaje de identidad con otras proteínas de esta familia, halladas

en venenos de serpientes de los géneros Cerrophidion, Tri~neresurus, Bofhrops y Agkistrodon.

Sus actividades biológicas incluyen citotoxicidad in vitro así como miotoxjcidad e inducción

de edema in vivo.

6.2 La miotoxina II de A. nummfer posee una relación filogenética cercana con la miotoxina

11 de C. gohan i . El análisis filogenético muestra que las PLA2s Lys49 divergeii de las Asp49,

y que las primeras se encuentran más relacionadas con las PLA2s Ser49.

6.3 La región C-terminal de las PLAzs Lys49 miotóxicas juega un papel importante en su

mecanismo de acción. Algunos péptidos sintéticos correspondientes a esta región reproducen

los efectos tóxicos de las correspondientes miotoxinas, mientras otros no lo hacen, coino es el

caso del péptido 115-129 de la miotoxina 11 de A. nunimger.

6.4 El estado dimérico de las PLA2s Lys49 puede jugar un papel importante, aunque no

esencial, en el mecanismo de miotoxicidad mediado por la región C-terniiiial.

6.5 Las células musculares en cultivo constituyen un modelo útil para estudiar el mecaiiisnio

miotóxico de las PLAzs del grupo 11. La diferenciación de mioblastos C2C12 aumenta la

susceptibilidad a la acción citotóxica de estas proteínas, siendo esto una característica

especifica para este grupo de miotoxinas, ya que otros agentes liticos se coiiiportan de la

misma manera en rnioblastos que en miotubos.

6.6 El fucoidan posee un efecto inhibitorio sobre las PLA2s miotóxicas, forinaiido coinplejos

que involucran el reconocimiento de la región C-terminal. Su capacidad neutralizante podría

ser de interés terapéutico, aunque se requieren más estudios para buscar formas de lograr una

mayor distribución y una mayor difusión en tejidos.

6.7 La proteitia plasmática DM64 de Didelphis marsupinlis interactúa aparentemente en forma

especifica con las PLA2s miotóxicas, inhibiendo su toxicidad. Por tanto, podría ser un buen

modelo para ser caracterizado a nivel molecular, con el fin de delinear los sitios de interacción

entre anibos componentes. Esto podría ser útil para comprender la relación estructura-función

de estas toxiiias, así como para la búsqueda de moléculas inhibidoras con fines terapéuticos.

7. PERSPECTIVAS FUTURAS

Este trabajo de investigación plantea la necesidad de nuevas lineas de trabajo referente a :

1. Estudios para la búsqiieda de posibles aceptores en la membrana plasmática de

miotoxinas PLAz del grupo 11, a traves de estudios con microscopía electrónica,

fluorescencia y con el uso del modelo de células in vitro de miotubos C2C12.

2. Estudios que permitan detallar el papel de la región C-terminal de las Lys49 en la

disrupción de membranas.

3. Estudios sobre los efectos intracelulares de las miotoxinas PLA2 del grupo II

(mecanismos de movilización con el calcio intracelular, o ingreso de calcio a través de

la membrana plasmática, uso de inhibidores de síntesis de gangliósidos u otros lipidos

de membrana y reguladores de la actividad metabólica).

4. Estudio de los efectos de inhibidores de estructura química similar al fucoidan pero de

menor tanialio y con una mayor capacidad de distribución en los tejidos.

5 . Estudios para la caracterización de los sitios de interacción entre el DM64 y las

miotoxinas PLAz del gmpo 11, con la finalidad de aumentar el conocimiento de la

relación estructura-función de estas miotoxinas.

Aitdafoun M, Mounier C, Heymans F, Binisti C, Bon C, Godfroid 35 (1996) 4-Alkoxybenzamidines as

new yotent phospholipase A2 inhibitors. Biochem. Pharmacol. 5 1,737-742

Ambrosio AL, Nonato MC, Selistre de Araujo H, Ami R, Ward RJ, Owiiby CL, de Souza DI-IP,

Garratt RC (2005) A moleciilar mechanisrn for Lys49 phospholipase A2 activity bascd on ligand-

induced confonnational change. J. Biol. Chem. 280, 7326-7335.

Angulo Y, Chaves E, Alape A, Rucavado A, GutiCrrez JM, Lomonte B (1997) lsolation and

characterization of a myotoxic phospholipase Az from the venorn of the arboreal snake

Bothriechis (BotJirops) schlegelii from Costa Rica. Archs. Biochem. Biophys. 339, 260-266.

Angulo Y, Olamendi-Portugal T, Possani LD, Lomonte B (2000) Jsolation and characterization of

myotoxin JI from Atropoides ~ií{mrnijier snake venom, a new Lys49 phospholipase A2

homologue. h t . J. Biochem. Cell Biol. 32,63-71.

Angulo Y, Olamendi-Portugal T, Alape-Giron A, Possani LD, Lomonte B (2002) Structural

characterization and phylogenetic relationships of myotoxin JI from Atropoitles (Bothrops)

nurnmifer snake venorn, a Lys49 phospholipase A2 homologue. Int. J. Biochem. Cell Biol 34,

1268-1278.

h g u l o Y, Lomonte B (2003) Inhibitory effect of fucoidan on the activities of crotaline snake venorn

myotoxic phospholipases A*. Biochem. Phannacol. 66, 1993-2000.

Angulo Y, Lomonte B (2004) Differential susceptibility of C2C12 myoblasts and myot~ibes to g r o ~ ~ p II

phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms. Cell Biucherii. Fznzctioti (en prensa).

Angulo Y, Gutiérrez JM, Soares AM, Cho W, Lomonte E3 (2005) The myotoxic and cytolytic activities

of dimeric Lys49 phospholipase A? homologues are reduced, but not abolished, by a pH-induced

dissociation. Toxicon (en prensa).

Ami RK, Gutiérrez JM (1993) Crystallization and preliminary diffiaction data of two myotoxins

isolated from the venoms of Borhrops asper (terciopelo) and Bothrops tizli>i,~iifer (iumping

viper). Toxicon 31, 1061-1064.

Ami RK, Ward RJ (1 996) Phospliolipase A?: a structurai review. Toxicon 34, 827-84 1.

Ami RK, Ward RJ, Gutién-ez JM, Tulinsky A (1995) Crystal structure of a calciurn-independent

phospholipase-like myotoxic protein from Bofhrops asper venom. Acta Cryst D 5 1, 3 1 1-3 17.

Alni RK, Fontes MRM, Barberato C, Gutiérrez JM, Díaz-Oreiro C, War-d RJ (1999) Crystal structure

of myotoxin II, monomeric Lys49-phospholipase Ai homologue isolated from the venom of

Cerrophidiort ( h t h o p s ) god~unni. Archs. Biochem. Biophys. 366, 177-1 82.

A m d a EZ, Silva NMV, Moraes RAM, Melo PA (2002) Effect of surarnin on rnyotoxicity of some

crotalid snake venoms. Braz. J. Med, Biol. Res. 35, 723-726.

Bao Y, Bu P, Jin L, Hongxia W, Yang Q, An L (2005) Purification, characterization and gene cloning

of a novel phospholipase A2 fiom the venom of Agkistrodon blomhuffii zrssrirensis. Int. J.

Biochem. Cell Biol. 37, 558-565.

Bashford CL, Rodrigues L, Pasternak CA (1989) Protection of cells against nlernbrane damage by

haemolytic ageiits: divalent cations and protons act at the extracellular side of the plasma

membrane. Biochim. Biophys. Acta 983, 56-64.

Bjamason JB, Fox JW (1994) Hemorrhagic metallopoteinases from snake venoms. Pharmacol Ther

62, 325-372.

Hiebex AL, Ziolkowski C, d'Avis YA (1994) Rattlesnake toxins alter developrnent of rnuscle cells in

culture. Ann. N.Y. Acad. Sci.710, 126-145.

Bolaños R (1 984) Serpientes, Venenos y Ofidismo en Centroamirica. Editorial Universidad de Costa

Rica, San José, 136 pp.

Bon C, Changeux JP, Jeng TW, Fraerikel-Conrat 11 (1979) Post-synaptic effects of crotoxin and its

isolated subunits. Eur. J. Biochem. 99,47 1-48 1.

Brusés JL, Capaso J, Katz E, Pilar G (1993) Specific in vitro biological activity of snake venom

myotoxins. J. Neurochem. 60, 1030-1042.

Bussolino F, De Rossi M, Sica A, Colotta F, Wang JM, Bocchietto E, Padura IM, Bosia A, Dejana E,

Mantovani A (199 1) Murine endotheliotna cell lines transformed by polyoma middle T oncogene

as target for and producers of cytokines. J. Imrnunol. 147,2 122-2 129.

Calderón L, Lomonte £3 (1 998) hmunochemical characterization and role in toxic activities of region

115-129 of myotoxin 11, a Lys49 phospholipase A2 from Bofhrops asper snake venom. Archs.

Biochem. Biophys 358,343-350.

Calderón L, Lomonte B (1999) lnhibition of the myotoxic action of Buthrops rrsper myotoxin II in

mice by imniunization with its synthetic peptide 115-129. Toxicon 37, 683-687.

Cameron D, Tu A.T (1977) Characterization of myotoxina from the venom of prairie rattlesnake

(Cmtalus viriclis vil-idis). Biochemistry 16,2546-2553.

Campbell J, Lamar W (1 989) The venomous reptiles of Latin America. Comell University Press, New

York, N Y .

Campbell J, Lamar W (2004) The venomous Reptiles of the Western Hemisphere. Cornell University

Press, Vol 1,I- 476.

Campbell J, Lamar W (2004) The venomous Reptiles of the Western Hemisphere. Comell University

Press, Vol 11, 477- 774.

Cintra ACO, Marangoni S, Oliveira B, Giglio JR (1993) Bothropstoxin-I: arnino acid sequence and

function. J. Prot. Chem. 12,57-64.

Chang CC, Lee CY, Eaker D, Fohlman J (1977) The presynaptic neuromuscular blocking action of

taipoxin, A comparison with P-bungarotoxin and crotoxin. Toxicon 15,571 -576.

Chijiwa T, Deshimaru M, Nobuhisa 1, Nakai M, Ogawa T, Oda N, Nakashima K, Fukumaki Y,

Shimohigashi Y, Hattori S, Ohno M (2000) Regional evolution of venom-gland phospholipase

Az isoenzymes of Trimer-esurzrs flavoviridis snakes in the Southwestern islands of Japan.

Biochern. J. 347,491 -499.

Chioato L, de Oliveira AHC, Ruller R, Sá JM, Ward RJ (2002) Distinct sites for myotoxic and

membrane-damaging activities in the C-terminal region of a Lys49-phospholipase A2. Biochem.

J. 366, 97 1-976.

Chioato L, Ward RJ (2003) Mapping stnictural determinants of biological activities in snake venotn

phosphoíipases A2 by sequence analysis and site directed mutagenesis. Toxicon 42, 869-883.

Chippaux JY (1 998) Snake-bites: appraisal of the global situation. Bull. W.H.O. 76, 5 1 5-524.

Church FC, Meade JB, Treanor RE, Whinna HC (1989) Antithrombin activity of fucoidan. J. Biol.

Chem. 264,3618-3623.

da Silva Giotto MT, Garratt RC, Oliva G, Mascarenhas YP, Giglio JR, Cintra ACO, de Azevedo WF,

Arni RK, Ward R (1998) Crystallographic and spectroscopic characterization of a rnolecular

hinge: confomational changes in bothropstoxin 1, a dirneric Lys49-phospholipase A2

hornologue. Proteins 30,442-454.

Davidson FF, Dennis EA (1990) Evolutionary relationships and implication for the regulation of

phospholipase A2 from snake venom to human secreted forrns. J. Mol. Evol. 3 1,228-238.

de Azevedo WF, Ward RJ, Canduri F, Soares AM, Giglio JR, Ami RK (1998) Crystal structure of

piratoxin-1: a calcium-independent, rnyotoxic phospholipase A2-homologue from Bothrops

pivajai venom. Toxicon 36, 1395-1406.

de Azevedo WF, Ward RJ, Gutiérrez JM, Arni RK (1999) Stnicture of a Lys49-phospholipase A2

hornologue isolated from the venom of Bothrops nurnmfer (jumping viper). Toxicon 37, 371 -

3 84.

de Oliveira AHC, Giglio JR, Andriao-Escarso SH, Ito AS, Ward RJ (2001) A pH-induced dissociation

of the dimeric form of a lysine 49-phospholipase A2 abolishes caz'- independent membrane

damaging activity. Biochemistry 40,691 2-6920.

de Sousa MV, Morhy L, Arni RK, Ward RJ, Diaz C, Gutiérrez JM (1998) Amino acid sequence of a

rnyotoxic Lys49-phospholipase A2 homologue from the venom of Cerrophidion (Bothrops)

godmani. Biochim. Biophys. Acta 1384,204-208.

Deepa M, Gowda TV (2002) Purification and characterization of a glycoprotein inhibitor of toxic

phospholipase from Withania sornnifea. Archs. Biochem. Biophys. 408,42-50.

Dennis EA (1994) Diversity of group types, regulation, and function of phospholipases A2. J. Biol.

Chem. 269, 13057-1 3060.

Díaz C, Gutiérrez JM, Lomonte B, Gene JA (1991) The effect of myotoxins isolated from Bothrops

snake venorns on rnultilamellar liposornes: relationship to phospholipase A2, anticoagulant and

myotoxic activities. Biochim. Biophys. Acta 1070,455-460.

Diaz C, Gutiérrez JM, Lomonte B (1992) Isolation and characterization of basic myotoxic

phospholipases A2 fiom Bothrops god~nani (Godman's pit viper) snake venorn. Archs. Biochem.

Biophys. 298, 235-1.42.

Diaz C, Lomonte B, Zamudio F, Gutiérrez JM (1995) Purification and characterization of myotoxin

N, a phospholipase A2 variant, from Bothrops asper snake venom. Nat. Toxins 3,26-3 1 . Diaz C, León G, Rucavado A, Rojas N, Schroit AJ, Gutiérrez JM (2001) Modulation of the

susceptibility of human erythrocytes to snake venom myotoxic phospholipases A*: role of

negatively charged phospholipids as potential membrane binding sites. Archs. Biochem.

Biophys. 39 1,56-64.

Dijkstra BW, Kalk KH, Hol WG, Drenth. J (1 98 1) Structure of bovine pancreatic phospholipase A2 at

1.7 A resolution. J. Mol. Biol. 147, 97-1 23.

Dole VP (1956) A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.

J. Clin. Invest. 35,150-154.

Dufton MJ, Hider RC (1983) Classification of phospholipases A2 according to sequence: evolutionary

and pharmacological implications. Eur. J. Biochem 137, 545-55 1.

Dufton MJ, Hider RC (1991) The stnicture and pharmacology of elapid cytotoxins. In Snake Toxins

(Harvey, A.L., Ed), pp 259-302. New York, Perganlon Press.

Durig J, Bruhn T, Zurborn KH, Gutensohn K, Bruhn HD, Beress L (1997) Anticoagulant fucoidan

fractions frorn Fucus vesiculosus induce platelet activation in vitro. Thrornb. Res. 85,479-491.

Fan CY, Qian YC, Yang SL, Gong Y (1999) cDNA cloning and sequence analysis of Lys-49

phospholipase A2 from Agkistrodon acutus. Genet. Anal. Technol. Appl 1 5 , 1 5-1 8.

Faure G (2000) Natural inhibitors of toxic phospholipases A2. Biochimie 82, 833-840.

Felsenstein J (1995) PHYLIP (Phylogeny inference package) version 3.57~. University of Washington,

Seattle.

Fletcher JE, Rapuano BE, Condrea E, Yang CC, Rosenberg P (1981) Relationship between catalysis

and toxicological properties of three phospholipases Ai from elapid snake venoms. Toxicol.

Appl. Pharmacol. 59,375-382.

Fletcher JE, Selistre de Araujo HS, Ownby CL (1997) Molecular events in the myotoxic action of

phospholipase, in: RM Kini (Ed), Venom Phospholipase A2 Enzymes: Structure, Functíon and

Mechanism, John Wiley and Sons, Chicester, U.K. pp 455-497.

Franceschi A, Rucavado A, Mora N, Gutiérrez J.M (2000) Purification and characterization of BaH4, a

hmorrhayic metalloproteinase fmm the venom of the snake Bothrops asper. Toxicoii. 38, 63-77.

Francis B, Gutiérrez JM, Lomonte B, Kaiser 11 (1991) Myotoxin 11 from Botlirops nsper (terciopelo)

venoin is a lysine-49 phospholipase A2. Archs. Bjochem. Biophys. 284, 352-359.

Fry BG, Wüster W (2004) Assembling an arsenal: origin and evolution of the snake venom proteome

inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences. Mol. Biol. Evol. 21, 870-883.

Fry BG (2005) From genome to "venome": molecular origin and evolution of the snake venom

proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins.

Genome Res. 15,403-420.

Fujirnura T, Shibuya Y, Moriwaki S, Tsukahara K, Kitahara T, Sano T, Nishizawa Y, Takema Y

(2000) Fucoidan is the active component of Ftrcus vesiculosus that promotes contraction of

fibroblast-populated collagen gels. Biol. Pharm. Bull. 23, 1 1 80-1 1 84.

Geoghegan P, Angulo Y, Cangelosi A, Diaz M, Lomonte B (1999) Characterization of a basic

phospholipase A?-hornologue myotoxin isolated from the venom of the snake Bothrops

neuwiedii (yarará chica) from Argentina. Toxicon 37, 1735-1 746.

Gerrad JM, Robinson P, Narvey M, McNicol A (1993) Increased phosphatidic acid and decreased

lysophospliatidic acid in response to thrornbin is associated with inhjbition of platelet

aggregation. Biochem.Cel1. Biol. 7 1,432-439.

Gutiérrez JM (1995) Clinical toxicology of snakebite in Central America. Iii: Meier J, White J, editors.

Handbook of Clinical Toxicology of Animal Venorns and Poisons. Boca Raton: CRC Press, p.

645 -665.

Gutién-ez JM, Chavec F (1980) Efectos proteolitico, hemorrágico y mionecrótico de los venenos de

serpientes costarricenses de los géneros Bothrops, Crotalus y Lachesis. Toxicon 1 8, 3 15-32 1.

Gutiénez JM, Lomonte B (1989) Local tissue damage induced by Bothrops snake venoms: a review.

Men~. hs t . Butantan 5 1, 21 1-223.

Gutiérrez JM, Lomonte B (1995) Phospholipase A, myotoxins from Bothrops snake venorns. Toxicon

33, 1405-1424.

Gutiéi~ez JM, Lomonte B (1997) Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake venoms, in R.M.

Kini, Ed., Venom phospholipase Ai enzymes: structure, function, and mechanisrn, John Wiley &

Sons, England, pp. 321-352.

Gutiérrez JM, Lonlonte B (2003) Efectos locales en el envenenamiento ofidico en América Latina, in:

Anirnais Peqonhentos no Brasil: biologia, clínica e terapeutica dos acidentes, Sarvier Editora,

Siio Paulo, Brasil, pp.3 10-323.

Gutiérrez .M, Ovadia M (1 998) Bothrops asper hemorrhagic proteinases BaH 1 and BaPl . In: Barret,

A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F.(Eds), Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press,

London, PP. 1295-1 297.

Gutiénez JM, Ownby CL (2003) Skeletal muscle degei~eration induced by venom phospholipases AZ:

insights into the mechanisms of local and systemic rnyotoxicity. Toxicon 42, 9 15-93 1 .

Gutiérrez JM, Ownby CL, Odell GV (1984a) Isolation of a myotoxin from Bothrops mper venom:

partial characterzation and action on skeletal muscle. Toxicon 22, 115-128.

Gutiérrez JM, Ownby CL, Odell GV (1984b) Pathogenesis of myonecrosis induced by crude venom

and a myotoxin of Borhrops asper. Exp. Molec. Pathol. 40, 367-379.

Gutiérrez JM, Lomonte B, Chaves F, Moreno E, Cerdas L (1986a) Phamacological activities of a toxic

phospholipase AL isolated from the venom of the snake Bothr.ops asper. Comp. Biochem.

Physiol. 84C, 159-1 64.

Gutiérrez JM, Lomonte B, Cerdas L (1986b) Isolation and partial characterization of a myotoxin from

the venom of the snake Bothrops nurnrnifer. Toxicon 24, 885-894.

Gutiérrez JM, Chaves F, Gené JA, Lomonte B, Camacho 2, Schosinsky K (1989) Myonecrosis induced

in mice by a basic myotoxin isolated from the venom of the snake Bothrops nuinmifer (jumping

viper) from Costa Rica. Toxicon 27,735-746.

1-larris JH, Cullen MJ (1 990) Muscle necrosis caused by snake venoms and toxins. Electron Microsc.

Rev. 3 , 183-21 f .

Henrikson RL (1991) Dissection and sequence analysis of phospholipase A2. Meth. Enzymol. 197,

201-215.

Higgins DG, Thompson JD, Gidson TJ (1996) Using CLUSTAL for multiple sequence alignments.

Meth. Enzynlol. 266, 383-402.

Holland DR, Clancy LL, Muchmore SW, Ryde TJ, Einspahr HM, Finzel BC, Heinrikson RL,

Watenpaugh KD (1 990) The crystal struchire of a lysine 49 phospholipase A2 from the venom of

the Cottonmouth snake at 2.0 A resolution. J. Biol. Chem. 265, 17649-17656.

Homsi-Brandeburgo MI, Queiroz LS, Santo-Neto H, Rodrigues-Simioni L, Giglio JR (1988)

Fractionation of Bothrops jamracussu snake venom: partial chemical characterization and

biological activity of bothropstoxin. Toxicon 26,G 1 5 -627.

Hutton RA, Warrell DA (1993) Action of snake venom components on the haemostatic system. Blood

Reviews 7, 176-1 89.

lncerpi S, de Vito P, Luly P, Rufini S (1995) Effect of ammodytin L fiom Vipera arnr>zodytes on L-6

cells from rat skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta 1268, 137- 142.

Jancarick J, Kim SH (1 991) Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.

J. Appl. Crystallogr. 24,409-41 1.

Joiinson EK, Owiiby CL (1993) Isolation of a myotoxin fiom the venom of Agki.rir-orlorz contor.lrAii

laticinctus (broad-banded copperhed) and pathogenesis of myonecrosis induced by it in mice.

Toxicon 3 1,243-245.

Jorge MT (1999) Prognostic factors for amputation in the case of envenoming by snakes of the

Bothrops genus (viperidae). Annals of Tropical Medicine & Parasitology 93,401-408.

Kaiser 11, Gutiérrez JM, Plummer D, Aird SD, Odell GV (1990) The amino acid sequence of a

myotoxic phospholipase fiom the venom of Bothrops asper. Archs. Biochem. Biophys. 278,

3 1 9-325.

Kamiguti AS, Zuzel M, Theakston RDG (1998) Snake venom rnetalloproteinases and disintegrins:

interactions with cells. Braz. J. Med. Biol. Res. 31,853-862.

Kanashiro MM, Escocard RCM, Petretski JH, Prates MV,Alves EW, Machado OLT, Dias da Silva W,

Kipnis TL (2002) Bochemical and biological properties of phospholipases A2 isolated from

Bothrops atrox snake venom. Biochem. Pharmacol64,1179-1186.

Kini RM, Iwanaga S (1986a) Structure-function relationships of phospholipases. 1: prediction of

presypnatic neurotoxicity. Toxicon 24, 527-541.

Kini RM, Iwanaga S (1986b) Structure-function relationships of phospholipases. 11: charge density

distribution and the myotoxicity of presynapticaly neurotoxic phospholipases. Toxicon 24, 895- .

905.

Kini M, Evans HJ (1987) Structure-function relationships of phospholipases. The anticoagulant

region of phospholipases AZ. J. Biol-Chem. 262, 14402-14407.

Kini RM (1 997) Phospholipase A2 -a complex rnultifunctional protein puzzle. In Venom Phospholipase

A2 Enzymes: Smicture, Function and Mechanism, Kini RM (ed); John Wiley & Sons: England;

1-28.

Kini RM (2003) Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom phospholipase

A2 enzymes. Toxicon 42, 827-840.

Krigaj 1, Bieber AL, Ritonja A, GubenSek F (1 99 1) The primary smicture of ammodytin L, a myotoxic

phospholipase A2 homologue fiom Vipera ammodytes venom. Eur. J . Biochem. 202, 1 165-1 168.

Kri&aj 1, GubenSek F (2000) Neurona1 receptors for phospholipases A2 and P-neurotoxicity. Biochimie

82, 807-8 14.

Kudo 1, Murakami M (2002) Phospholipase A2 enzyrnes. Prostagl. Lipid Med. 68, 3-58.

Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage

T4. Nature 227, 680-6235,

Lambeau G, Lazdunski M (1999) Receptors for a growing family of secreted phospholipases A?.

Trends Pharmacol. Sci. 20, 1 62-1 70.

Lambeau G, Barhanin J, Schweitz H, Qar J, Lazdunski M (1989) Identification and properties of very

high affinity brain membrane-binding sites for a neurotoxic phospholipase from the Taipan

venom. J. Bjol. Chem. 264, 1 1503-1 15 10.

Lambeau G, Schrnid-Alliana A, Lazdunski M, Barhanin J (1990) Identification and purification of a

very high affinity binding protein for toxic phospholipases A2 in skeletal muscle. J. Biol. Chem.

265,9526-9532.

Lambeau G, Ancian P, Barhanin J, Lazdunski M (1994) Cloning and expression of a mernbrane

receptor for secretory phospholipases A*. J. Biol. Chern. 269, 1 575- 1578.

Lambeau G, Ancian P, Nicolas J-P, Beiboer SHW, Moinier D, Verheij H, Lazdunski M (1995)

Structural elements of secretory phospholipases A2 involved in the binding to M-type receptors.

J. Biol. Chem. 270, 5534-5540.

Laure C (1 975) The primay stnicture of crotamine. Hoppe- Seyler's 2. Physiol.Chem. 356, 21 3-2 15.

Lee WH, da Silva Giotto MT, Marangoni S, Toyama MH, Polikarpov 1, Ganat RC (2001) Structural

basis for low catalytic activity in Lys49 phospholipase A2 -a hypothesis: the crystal smicture of

piratoxin 11 cornplexed to fatty acid. Biochemistry 40,28-36.

Lin YH, Lee SC, Chang PY, Rajan PK, Sue SC, Wu WG (1999) Heparin binding to cobra basic

phospholipase Ai depends on heparin chain length and amino acid specificity. FEBS Lett. 453,

395-399.

Liu SY, Yoshimmi K, Oda N, Ohno M, Tokunaga F, Iwanaga S, Kihara H (1990) Yurification 2nd

amino acid sequence of basic protein 11, a lysine-49 phospholipase A2 with low activity, fronl

Trimeresunrsflavoviridis venorn. J. Biochem. 107,400-408.

Lizano S, Lomonte B, Fox JW, Gutiérrez JM (1997) Biochemical characterizatíon and

pharmacological properties of a phospholipase A2 myotoxin inhibitor from the plasma of the

snake Bothrops asper. Biochem. J. 326, 853-859.

Lizano S, Angulo Y, Lomonte B, Fox JW, Lambeau G, Lazdunski M, Gutiérrez JM (2000) Two

phospholipase A2 inhibitors from the plasma of Cerr-ophidion (Bothrops, godwani which

selectively inhibit two different group II phospholipase A2 myotoxins from its own venom:

isolation, rnolecular cloning, and biological properties. Biochern. J. 346, 63 1-639.

Lizano S, Domont G, Perales J (2003) Natural phospholipase A2 myotoxin inhibitor proteins from

snakes, rnammals and plants. Toxicon 42,963-977.

Lloret S, Moreno JJ (1993) Oederna forrnation and degranulation of mast cells by phospholipase Ai

purified from porcine pancreas and snake venoms. Toxicon 3 1,949-956.

Lomonte B, Gutiérrez JM (1989) A new muscle damaging toxin, myotoxin 11, from the venorn of the

snake Bothrops asper ( terciopelo). Toxicon 27, 725-733.

Lonlonte 13, Gutiérrez JM, Furtado MF, Otero R, Rosso JP, Vargas O, Cannona E, Rovira ME (1 990)

Isolation of basic myotoxins from Boilirops i~toojeni and Bothrops atrox snake venom. Toxicon

28, 1137-1 143.

Lomonte B, Gutiérrez JM, Ramírez M, Díaz C (1 992) Neutralization of rnyotoxic phospholipases A2

from the venorn of the snake Bothrops asper by rnonoclonal antibodies. Toxicon 30,239-245.

Lomonte B, Tarkowski A, Hanson, LA (1993) Host response to Bothrops asper snake venom: analysis

of edema fomation, inflarnrnatory cells, and cytokine release in a mouse model. Inflammation

17, 93-105.

Lomonte B, Moreno E, Tarkowski A, Hanson LA, Maccarana M (1994a) Neutralizing interaction

between heparins and myotoxin 11, a Lys 49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake

venom. Identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic

peptides and molecular rnodeling J. Biol. Chem. 269,29867-29873.

Lomonte B, Tarkowski A, Bagge U, Hanson LA (1994b) Neutralization of the cytolytic and rnyotoxic

activities of phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom by glycosaminoglycans of the

hepariní heparan sulfate family. Biochem. Pharmacol. 47, 1509-1 51 8.

Lomonte B, Tarkowski A, Hanson LA (1994~) Broad cytolitic specificity of myotoxin 11, a Lysine 49

phospholipase A2 of Botlir-ops asper snake venom. Toxicon 32, 1359-1 369.

Lomoiite B, Pizarro-Cerdá J, Angulo Y, Gorvel JP, Moreno E (1999a) TyreTrp-substituted peptide

1 15- 129 of a Lys49 phospholipase A2 expresses enhanced membrane-damaging activities and

repi-oduces its in vivo myotoxic effect. Biochim. Bioyhys. Acta 1461, 19-26.

Lomoiite B, Angulo Y, Rufini S, Cho W, Giglio JR, Ohno M, Daniele JJ, Geoghegan P, Gutiérrez JM

(1999b) Comparative study of the cytolytic activity of myotoxic phospholipases A2 on rnouse

endothelial (tEnd) and skeletal muscle (C2C12) cells in vitro. Toxicon 37, 145-158.

Lonioiite B, Angulo Y, Calderón L (2003a) An overview of lysine-49 phospholipase A2 myotoxins

from crotalid snake venoms and their stnichiral determinants of myotoxic action. Toxicon 42,

885-90 1.

Lornonte B, Angulo Y, Santamaría C (2003b) Comparative study of synthetic peptides conesponding

to region 1 15-129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake venoms. Toxicon 42, 307-

312.

Luyt CE, Meddahi A, Ho-Tin-Noe B, Colliec-Jouault S, Guezennec 3, Louedec L, Prats H, Jacob MP,

Osborne-Pellegrin M, Letourne~lr D, Michel JB (2003) Low-molecular weight fucoidan

promotes therapeutic revascularization in a rat model of critica1 hindlimb ischemia. J. Pharmacol.

Exp. Ther. 305,24-30.

Mago AJ, Soares AM, Giglio JR, Fontes MRM (2003) Crystal structures of BnSP-7 and BnSP-6, two

Lys49-phospholipases A,: quaternary structure and inhibition mechanism insights. Biochcm.

Biophys. Res. Comm. 3 1 1 ,7 13-720.

Mahanta M, Mukherjee AK (2001) Neutralisation of lethality, myotoxicity and toxic enzymes of Nnja

kaouthia venom by Mimosa pudica root extracts. J . Ethnopharm. 75, 55-60.

Manc~lso LC, Correa MM, Vieira CA, Cunha OAB, Lachat JJ, Selistre de Araujo HS, Ownby CL,

Giglio JR (1 995) Fractionation of Bothrops pirojai snake venom: isolation and characterization

of piratoxin-1, a new myotoxic protein. Toxicon 33, 61 5-626.

Maraganore JM, Heinrikson RL (1986) The lysine-49 phospholipase A2 from the venom of

Agkistr-odon piscivorus piscivorus. Relation of str-ucture and function to other phospholipases A,.

J. Biol. Chem. 261,4797-4804.

Maraganore JM, Merutka G, Cho W, Welches W, Kezdy FJ, Heinrikson RL (1984) A new class of

phospholipase A2 with lysine in place of aspartate 49. J. Biol. Chem. 259, 13 839-1 3843.

Mebs D, Samejima Y (1986) Isolation and characterization of myotoxic phospholipases A2 from

crotalid venoms. Toxicon 24, 393-404.

Mebs D, Ownby CL (1 990) Myotoxic components of snake venoms: their biochernical and biological

activities. Pharinac. Ther. 48,223-236.

Melo PA, Homsi-Brandeburgo MI, Giglio JR, Suarez-Kurtz G (1993) Antagonism of the myotoxic

effect of Bothrops jarnrnc~sszi venom and bothropstoxin by polyanions. Toxicon 3 1,285-29 1.

Minix R, Doctor VM (1997) Interaction of fucoidan with proteases and inhibitors of coagulation and

fibrinolysis. Thromb. Res. 87,419-129.

Mokri D, Enyel AG (1975) Duchenne dystrophy: electron microscopic fjndings pointing to a basic or

early abnormality in the plasma membrane of the muscle fiber. Neurology 25, 1 11 1-1 120.

Moiira-da-Silva AM, Desmond H, Laing G, Theakston RDG (1991) Isolation and comparison of

myotoxins isolated fi-om venoms of different species of Bothrops snakes. Toxicon 29,713-723.

Moura-da-Silva AM, Paine MJI, Diniz MRV, Theakston RGD, Crampton JM (1995) The molecular

cloning of a phospholipase A2 from Bothrops jararacussu snake venom: evolution of venom

group 11 phospholipase A2's may irnply gene duplications. J. Mol. Evol. 41, 174-179.

Mourao PAS, Pereira M (1999) Searching for altematives to heparin: sulfated fucans from marine

invertebrates. Trends Cardiovasc. Med. 9,225 -232.

Murakami M, Ami RK (2003) A structure based rnodel for liposome disruption and the role of

catalytic activity in myotoxic phospholipase A2s. Toxicon 42, 903-91 3.

Nakashima K, Nobuhisa 1, Deshimaru M, Nakai M, Ogawa T, Shimohigashi Y, Fukumaki Y, Hattori

M, Sakaki Y, Hattori S, Ohno M (1995) Accelerated evolution in the protein-coding regions is

universal in crotalinae snake venom gland phospholipase A2 isozyrne genes. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 92, 5605-5609.

Nikai T, Komori Y, Ohara A,Yagihashi S, Ohizumi Y, Sugihara H (1994) Characterization and amino-

terminal sequence of phospholipase A*-11 from the venom of Agkistrodon bilineafus (comnion

cantil). Int. J. Biochem. 26,43-48.

Nishino T, Nishioka C, Ura H, Nagumo T (1994) Isolation and partial characterization of a novel

amino sugar-containing fucan sulfate from cornmercial Fzrcus vesictrlosus fucoidan. Carbohydr.

Res. 255,213-223.

Nishioka SA, Silveira PVP (1992) A clinical and epiderniologic study of 292 cases of lance-headed

viper bite in a Brazilian teaching hospital. Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 805-8 10.

Nobuhisa 1, Nakashima K, Deshirnaru M, Ogawa T, Shimohigashi Y, Fukumalu Y, Sakaki Y, Hattori

S, Kihara H, Ohno M (1996) Accelerated evolution of Trimeresurus okinavensis venom gland

phospholipase A2 isozyme-encoding genes. Gene 172,267-272.

Nobuhisa 1, Chiwata T, Fukumaki Y, Hatton S, Shimohigashi Y, Ohno M (1998) Stnictural elements

of Trimeresurus flavoviridis serum inhibitors for recognition of its venom phospholipase A2

isozymes. FEBS Lett. 429, 385-389.

Núíiez C, Angulo Y, Lomonte B (2001) Identification of the myotoxic site of the Lys49 phospholipase

Ai from Agkistrodon piscivorus snake venom: synthetic C-terminal peptides frorn Lys49, biit not

from Asp49 myotoxins, exert membrane-damaging activities. Toxicon 39, 1587-1 594.

Núñez V, Arce V, Gutiétrez JM, Lomonte B (2004) Isolation, characterization, and molec~~lar

cloning of rnyoioxin 1, a Lys49 phospholipase A, frorn tlie venom of the snake Bolhrops rztrox

from Meta, Colombia. Toxicon 44,914 01.

Ogawa T, Oda N, Nakashima K, Sasaki H, Hattori M, Sakaki Y, Kihara H, Ohno M (1 992). Unusually

high conservation of unhanslated sequences in cDNAs for Triule>-rsur.tis flavovii-irlis

phospholipase A2 isozymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8557-8561.

Ogawa S, Kitajima M, Nakashima K, Sakaki Y, Ohno M (1995) Molecular evolution of group II

phospholipases AZ. J. Mol. Evol. 4 1, 867-877.

Ohkura N, Okuhara H, Inoue S, Ikeda K, Hayashi K (1997) Purification and characterization of three

distinct types of phospholipase A2 inhibitors from the blood plasma of the Chinese mamushi,

Agkistrodon blornhoffii siniticus. Biochern. J . 325,527-53 f .

Otero R, Tobon GS, Gómez LF, Osorio R, Valderrama R, Hoyos D, Uweta JE, Molina S, Arboleda JJ

(1 992) Accidente ofidico en Antioquia y Chocó. Aspectos clínicos y epidemiológicos (marzo de

1989-febrero de 1 990). Acta Méd. Colombiana 17, 805-8 10.

Otero R, Gutiérrez J, Mesa MB, Duque E, Rodriguez O, Arango JL, Gómez F, Toro A, Cano F,

Rodríguez LM, Caro E, Martínez J, Cornejo W, Gómez LM, Uribe FL, Chrdenas S, Núfiez V,

Díaz A (2002) Complications of Bothrops, Porthidium, and Bothriechis snakebites in Colombia.

A clinical and epidemiological study of 39 cases attended in a university hospital. Toxicon 40,

1107-1114.

Otwinowski 2, Minor W (1997) Processing of X-ray difraction data collected in oscillation mode.

Meth. Enzymol. 276, 307-326.

Ownby CL (1990) Locally acting agents: myotoxins, hemorrhagic toxins and demonecrotic factors.

In: Handbook of Toxinology (Shier WT, Mebs D, Eds), pp 60 1-654. Dekker, New York.

Ownby CL, Powell JR, Jiang MS, Fletcher JE (1997) Melittin and phospholipase Ai from bee (Apis

rnellifera) venom cause necrosis of murine skeletal muscle in vivo. Toxicon 35,6740.

Ownby CL, Selistre de Araujo HS, White SP, Fletcher JE (1999) Lysine 49 phospholipase Ai proteins.

Toxicon 37,411-445.

Páramo L, Lomonte B, Pizarro-Cerdá J, Bengoechea JA, Gorvel JP, Moreno E (1998) Bactericidal

activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2 from Bothrops asper snake venom:

synthetic Lys49 myotoxin 11-(115- 129)-peptide identifies its bactericidal region. Eur. J

Biochem. 253,452-461.

Patankar M, Oehninger S, Bamett T, Williams R, Clark G (1993) A revised structure for fucoidan may

explain some of its biological activities. J. Biol. Chern. 268,2 1770-2 1776.

Pearson WR, Lipman DJ (1 988) Improved tools for biological sequence comparisons. Proc Natl.

Acad. Sci. USA 85, 2444-24448.

Perales J, Domont GB (2002) Are inhibitors of metalloproteinases, phospholipase A, and myotoxins

members of the innate irnrnune system? Perspectives in Molecular Toxinology (Ménez A, ed),

pp 435-456. John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK.

Pereira MF, Novello JC, Cintra ACO, Giglio JR, Landucci ET, Oliveira B, Marangoi~i S (1998) Tlie

amino acid sequence of bothropstoxin 11, an Asp-49 myotoxin fiom Botkrops ja,-al-aczlssu

(Jararacucu) venom with low phospholipase A2 activity. J. Protein Chem. 17, 3 8 1 -386.

Pérez JC, Sánchez EE (1999) Natural protease inhibitors to hernorrhagins in snake venoms and their

potential use in medicine. Toxicon 37, 703-728.

Pólgar J, Magnenat EM, Peitsch MC, Wells TNC, Clemetson KJ (1996) Asp-49 is not absolute

prerequisite for the enzymic activity of low-Mr phospholipases Az: purification, characterization

and computer modelling of an enzymically active Ser-49 phospholipase AI, ecarpholin S, from

the venom of Echfs carinattrs sochureki (saw- scaled viper). Biochem. J. 3 19, 961-968.

Preobrazhenskaya ME, Berman AE, Mikhailov VI, Ushakova NA, Mazurov AV, Semenov AV, Usov

AI, Nifantev NE, Bovin NY (2003) Fucoidan inhibits leukocyte recruitment in a model

peritoneal inflammation in rat and blocks interaction of P-selectin with its carbohydrate ligand.

Biochem. Mol. BioI Int. 43,443-45 1.

Religa P, Kazi M, Thyberg J, Gaciong 2, Swedenborg J, Hedin U (2000) Fucoidan inhibits smooth

muscle cell proliferation and reduces mitogen-activated protein kinase activity. Eur. J. Vasc.

Endovasc. Surg. 20,4 1 9-426.

Rocha SLG, Lomonte B, Neves-Ferreira AGC, Trugilho MRO, Junqueira de Azevedo ILM., Ho PL,

Domont G, Gutiérrez JM, Perales J (2002) Functional analysis of DM64, an antimyotoxic protein

with imrnunoglobuljn-like shvcture from Didelphis rnnrsupialis semm. Eur. J . Biochem. 269,

6052-6062.

Rodrigues VM, Soares AM, Mancin AC, Fontes MRM, Homsi-Bandeburgo MI, Giglio JR (1998)

Geographic variations in the composition of myotoxins from Bothrops rieuwiedi snake venoms:

biochemical characterization and bological activity. Comp. Biochem . Physiol 12 1 , 2 15-222.

Rojas G, Bogarín G, Gutiérrez JM (1 997) Snakebite mortality in Costa Rica. Toxicon 35, 1639-1 643.

Rojas E, Saravia P, Angulo Y, Arce V, Lomonte B, Chavez JJ, Velásquez R, Thelestan M, Gutiérrez

JM (200 1) Venoms of the crotaline snake Atropoides nurnrnifer (jumping viper) frorn Guatemala

and Honduras: comparative toxicological characterization, isolation of a myotoxic phospholipase

Az homologue and neutralization by two antivenoms. Comp. Biochem. Physio1.C 129, 15 1 - 162.

Rosenfeld G (1 971) Symptomatology, pathology and treatment of snake bites in South America, in: W

Bucherl, EE Buckley, Eds, Venomous animals and their venorns, vol. 2, Academic Press, New

York, pp. 345-403.

Rosenberg P (1990) Phospholipases. In: Hnndbook of Toxinology (Shier, W.T. and Mebs, D., Eds.).

New Yoi-k, Marcel DeMcer, pp.67-277.

Rostovtseva TK, Bashford CL, Lev AA, Pasternak CA (1994) Triton channels are sensitive to divalent

cations and protons. J. Mernbr. Biol. 14 1, 83-90.

Rufini S, Cesaroni P, Desideri A, Farias R, Gubensek F, Gutiérrez JM, Luly P, Massoud R, Moreno R,

Pedersen JZ (1 992) Calcium ion independent membrane leakage induced by phospholipase-like

myotoxins. Biocheinistry 3 1, 12424- 12430.

Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for constructing phylogentic

trees. Mol. Biol. Evol. 4,406-425.

Sasa M, Vázquez S (2003) Snakebite envenomation in Costa Rica: a revision of incidence in the

decade 1990-2000. Toxicon 41, 19-22.

Scott DL, White SP, Otwinowski Z, Gelb HG, Sigler PB (1990a) Interfacial catalysis: the mechanism

of phospholipase AZ. Science 250, 154 1 - 1546.

Scott DL, White SP, Otwinowski Z, Gelb HG, Sigler PB (1990b) Crystal structure of bee-venom

phospholipase Az in a complex with a transition state analogue. Science 250, 1563-1566.

Scott DL, Achari A, Vida1 JC, Sigler PB (1992) Crystallographic and biochemical studies of the

(inactive) Lys-49 phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon piscivorus piscivorus. J .

Biol. Chem. 267,22645-22657.

S C O ~ DL, Sigler PB (1994) Structure and catalytic rnechanism of secretory phospholipases A2. Adv.

Protein. Chem. 45,53-88.

Selistt-e HS, Queiroz LS, Cunha OAB, de Souza GEP, Giglio JK (1990) Isolation and characterization

of hemorragic, myonecrotic and edema-inducing toxins from Bothl-ops insularis Cjararaca ilhoa)

snake venom. Toxicon 28,261 -273.

Selistre de Araujo HS, White SP, Ownby CL (1996a) Sequence analysis of Lys49 phospholipase A2

myotoxins: a highly conserved class of proteins. Toxicon 34, 1237- 1242,

Selistre de Araujo HS, White SP, Ownby CL (1996b) cDNA cloning and sequence analysis of a

lysine-49 phospholipase A2 myotoxin from Agkistrodo~z contoitrix laticinctus snake venom,

Archs. Biochem. Biophys. 326,2 1-30 .

Shimohigashi Y, Tani A, Matsumoto H, Nakashima K, Yamaguchi Y, Oda O, Takano Y, Karniya H,

Kishino J, Arita H, Ohno M (1 995) Lysine-49-phospholipases A2 h m Tri~~zeres~msflavoviridis

venom are membrane-acting enzymes. J. Biochem. 1 1 8, 1037- 1044.

Six DA, Dennis EA (2000) The expanding superfarnjly of phospholipase A2 enzymes: classification m

and characterization. Biochim. Biophys. Acta 1488, 1-1 9.

Soares AM, Rodrigues VM, Homsi-Brandeburgo MI, Toyama MH, Lombardi FR, Arni RK, Giglio JR

(1998) A rapid procedure for the isolation of the Lys-49 myotoxin 11 from Bothrops nzoweni

(caissaca) venom: biochemical characterization, crystallization, myotoxic and edematogenic

activity. Toxicon 36, 503-5 14.

Soares AM, Guerra-Sá R, Borja-Oliveia C, Rodrigues VM, Rodrigues-Simioni L, Rodrigues V, Fontes

MR, Lomoiite B, Gutiérrez JM, Giglio JR (2000a) Stiuctural and functional characterization of

BnSP-7, a Lys49 myotoxic phospholipase A2 homolog~~e from Bothiops lrerrwiedi pauloensis

venom. Archs. Biochem. Biohys. 378,201-209.

Soares AM, Andriao-Escarso S, Angulo Y, Lomonte B, Gutiérrez JM, Marangoni S, Toyama MH,

Arni RK, Giglio JR (2000b) Structural and functional characterization of myotoxin 1, a Lys49

phospholipase Ai homologue from Bothrops rnoojeni (Caissaca) snake venom. Archs. Biochem.

Biophys. 373, 7-15.

Soares AM, Andriiio-Escarso SH, Bortoleto RK, Rodrigues-Simioni L, Ami RK, Ward RJ, Gutiérrez

JM, Giglio JR (200 1) Dissociation of enzymatic and pharmacological properties of piratoxins-1

and -111, two rnyotoxic phospholipases A2 fkom BotJzrqs pircljai snake venoin. Archs. Biochem.

Biophys. 387, 188-1 96.

Soares AM, Fontes MRM, Giglio JR (2004) Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake

venoms: structure-function relationship. Curr. Org. Chem. 8, 1677-1 690.

Solorzano A (1989) Distribución y aspectos reproductivos de la mano de piedra, Bothrops nurnmijer.

(Serpentes: Viperidae), en Costa Rica. Rev. Biol. Trop. 37, 133-1 37.

Solórzano A (2004) Serpientes de Costa Rica: distribución, taxonomía e historia natural, 791 pp. San

José, Editorial InBio.

Sousa MV, Morhy L, Ami RK, Ward RJ, Díaz C, Gutiérrez JM (1998) Amino acid sequence of a

myotoxic Lys49-phospholipase A2 homologue from the venom of Cerrophidion (Bothrops)

godrlztrni. Biochim. Biophys. Acta. 1384, 204-208.

Swaroop S, Grab B (1954) Snakebite rnortality in the world. Bull. W.H.O. 10,35-76.

Taylor R, Flores A, Flores G, Bolaños R (1974) Geographical distribution of Viperidae, Elapidae and

Hydrophiidae in Costa Rica. Rev. Biol. Trop. 21, 383-397.

Toyarna MH, Soares AM, Vieira CA, Novello JC, Oliveira B, Giglio JR, Marangoni S (1998) Amino

acid sequence of piratoxin-1, a myotoxin from Bothrops pirajai snake venom, and its biological

activity after alkylation with p-brornophenacyl bromide. J. Protein Chem. 17, 7 13-7 17.

Toyama MH, Soares AM, Wen-Hwa L, Polikarpov 1, Giglio JR, Marangoni S (2000) Amino acid

sequence of piratoxin-11, a myotoxic lys49 phospholipase A2 homologue frorn Bothrops pirujui

venom. Biochimie 82,245-250.

I'raub P, Mizushima S, Lowry CV, Nonlura M (1 97 1) Kecoristitution of ribosomes fiom subriboson~al

components. Meth. Enzymol. 20, 39 1-404.

Tsai I.H, Chang T (1987) Toxicity domain in presynaptically toxic phospholipase A2 of snake venom.

Biochim. Biophys. Acta 9 16, 94-99.

Tsai 11, Wang YM, Au LC, Ko TP, ChenW, Chu YF (2000) Phospholipases A2 f?om Cullosellusrna

r-hodo.r~onin venom gland. Cloning and sequencing of 10 of the cDNAs, three-dimensional

modelling and chemical modification of the major isozyme. Eur. J. Biochem 267,6684-6691.

Tsai IH, Chen YH, Wang YM, Tu MC, Tu AT (2001) Purification, sequencing, and phylogenetic

analyses of novel Lys-49 phospholipases A2 frorn the venoms of rattlesnakes and other pit vipers.

Archs. Biochem. Biophys. 394,236-244.

van den Bergh CJ, Slotboom AJ, Verheij HM, de Naas G (1988) The role of aspartic acid-49 in the

active site of phospholipase A2. A site-specific rn~ltagenesis study of porcine pancreatic

phospholipase A2 and the rationale of the enzymatic activity of [lysine49Jphospholipase A, from

Agkistrodon piscivor.t~s piscivorus venom. Eur. J. Biochern. 1 7, 3 5 3 -3 5 7.

Wang YM, Wang JH, Pan FM, Tsai M (1996) Lys-49 phospholipase A2 homologs from venoms of

Deinagkistrodon acutus and Trimeresurus rnucrosquamatus have identical potein sequence.

Toxicon 34,485-489.

Ward RJ, Rodrigues-Alves A, Ruggiero Neto J, Arni RK, Casat-i G, (1998) SequenceSpace analysis of

Lys49 phospholipases A2: clues towards identification of residues involved in a novel

mechanism of membrane damage and in myotoxicity. Prot. Engin. 1 1,285-294.

Ward M, Chioato L, de Oliveira AHC, Ruller R, Sá JM (2002) Active-site mutagenesis of a Lys49-

phospholipase A2: biological and membrane-disrupting activities in the absence of catalysis.

Biochem. J. 362, 89-96.

Warrell DA (1996) Clinical features of envenoming frorn snake bites. In: Bon, C., Goyffon, M. (Eds.),

Envenomings and their treatment, Fondation Marcel Mérieux, Lyon, pp. 63-76.

Watanabe L, Gava LM, Angulo Y, Lomonte B, Arni RK (2004) Crystallization of the Lys49 PLA2

homologue, rnyotoxin 11 from the venom of Atropoides nummifer Biochim. Biophys. Acta 1703,

87-89.

Werman S (1992) Phylogenetic relationships of Central and South American pitvipers of the genus

Bothrops (sensu lato): cladistic analyses of biochemical and anatomical characters. In: Biology of

the Pitvipers (Campbell, J. and Brodie, E.D., Eds.). Selva Tyler, Texas, 467 pp.

Wery JP, Schevitz RW, Clawson DK, Bobbitt JL, Dow ER, Gamboa G, Goodson T, Hermann RE!,

Kramer RM, Mc Clure DB, Mihelich ED, Putrnan LE, Sharp JD, Stark DH, Teater C, Warrick

W, Jones ND (1991) Structure of recombinant human rheumatoid arthritic synovial fluid

phospholipase Az at 2.2 A resolution. Nature 352,79-82.

Yoshizumi K, Liu SY, Miyata T, Saito S, Ohno M, Iwanaga S, Kihara H (1990) Purification and arnino

acid sequence of basic protein 1, a Lysine-49 phospholipase A2 with low activity, from the

venom of Ti-irnereszlrus flavoviridis (Habu Snake). Toxicon 28,43-54.

Yuan Y, Jackson SP, Mitchell CA, Salem HH (1993) Purification and characterization of a snake

venom phospholipase As: a potent inhibitor of plaquelet aggregation. Thromb. Res. 70,47 1-481.

Zapopozhets TS, Besednova NN, Loenko IN (1995). AntibacteriaI and immunomodulating activity of

fucoidan. Antibiot. Khimioter. 40, 9-1 3.

APEND

ARTICULO

Tfic Ititernalional Journal of Biochernistry Sr Ccll Biology 32 (2000) 63-71 www clscvicr corii/locatc/ijbcb

Isolation and characterization of myotoxin TI from Atropoides (Bothrops) nummifer snake venom, a new Lys49

phospholipase A2 homologue

Yamileth Anguloa7 b, Timoteo Olarnendi-Portugalc, Lourival D. Possanic, Bruno Lomonteay*

"Instituto Clodomiro Picrrdo. Fncirllnd de Microbiologícl, Escuelcr de Medicina, Universidncl de Casrn Rica, Scln Josi, Corra Riccr b~rpcrrtciniento clr Bioqlrir~licn, Esct~elcr de Medicina, Univevrid(~~í (le COSICI Rica, So11 JoF~, Co.~tcl R ~ c ~ I

'Df>parrn~ent o/ Molccukar Recognilion ar~d Strlr~ tirral Biology, Instifitto de Biote~nolo~ín, Ncrtional Autonnmnir.~ Uriivcrsity ?/ Mexico. Cir~rnnvclca, Me x i ~ o

Rcccivcd 1 1 March 1999; acccptcd 9 July 1999

Abstract

Myotoxic phospholipases A2 of class I I are commonly found in the veiloms of crotalid snakes As an approach to iinderstanding their structure-activity relationship, diverse natural variants have been characterized biochemically and pharmacotogicatly. This study describes a new myotoxic phospholipase A2 homologue, isolated frorn the venom of Atropoides (Bothrops) nurnrnjfer from Costa Rica. A . tiuntmifer myotoxin 11 is a basic protein, with an apparent subunit molecular mass of 16 kDa, which migrates as a dimer in sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under nonreducing conditions. It is strongly recognized by antibodies generated against Bothrops nsper myotoxin 11, by enzyme-immunoassay. The toxin induces rapid myonecrosis upon intrarnuscular injection in mice (evidenced by an early increase in plasma creatine kinase activity), and significant edema in the footpad assay It also displays cytolytic activity upon cultured murine endothelial cells The toxin (up to 50 pg) has no detectable phospholipase Ai itctivity on egg yolk phospholipids, and does not show an anticoagulant cffect on sheep platelct- poor piasma in vitro N-terminal sequence determinñtion (53 amino acid residues) dcmonstrnted that A ntrmmifrt myotoxin I I is 21 riew Lys49 variant of the family of myotoxic, class 11 phospholipases A2 Sequence co~nparison with othei phospllolipases A2 revealed Asn53 a s a novel substitiition In addition, this myotoxin is the first Lys49 variant prescnting Asn in its N-terrninus Consequently, these finditigs suggest that neither Ser1 or Lys53, usually found in this faniily of proteins, are essential alnino acid residues for their myotoxjc, cytolytic, or edema-inducing eflects 0 1999 Elsevier Science Ltd Al1 rights reserved

Keyivorrl~ Snakc vcnom; Myotoxin; Phospholipasc A?; Atropoidl:~ n~tn~nli/ i~r; Rotl1rop.r

* Coi rcspoi,ding author Fax: -t. 506-292-0485 E-n~ail crtlnriw hlomonte@>cariari ucr ac cr (B. Lomontc)

1357-2725/99/5 - sce froiit rnattcr O 1999 Elsevier Scicncc Ltd Al1 rights tcscrvcd PII: S 1357-2725(99)00099-O

1. Introduction

Snake bite envenomations in Latin America are caused most frequently by species of the genus Bothrops [1,2] In addition to systemic alterations, these envenomations are character- ized by prominent local tissue darnage including myonecrosis, hemorrhage and edema [3]. Acute rnuscle darnage induced by these venoms is caused mainly by basic phospholipases A2 (PLA2s) which initialty affect the integrity of the plasma n~embrane of rnuscle cells 141.

During the last years, severa1 myotoxins fronl Bothrops venoms have been isolated, and some progress has been made towards iinderstanding their structure, mechanism of action, and pathogenesis of myonecrosis [4,5]. The class 11 PLA2 myotoxins found in the venoms of crotalid snakes can be divided into two groilps, namely, those with an aspartic acid residue at position 49 (Asp49) and those in which a lysine substitutes a t this position (Lys49). Although the Lys49 proteins lack (or may have extremely low) catalytic activity, they display myotoxic activity comparable to that of Asp49 counterparts, both quantitatively and qualitat- ively [4]. Biochemical characterization of myotox- ins has demonstrated considerable inter- and intraspecific variations of primary striicture, which niight provide relevant clues for delineat- ing their niolecular determinants of toxicity [6,7] Tlierefore, the search for new niyotoxin variants in the natural biodiversity, and their striictiiral and pharrnacological characterization, are of in terest.

Arropoirles nunlri~ifer (previously Bothrops nimz-

nz@r) is distributed in the tropical rain forests of Costa Rica [8], and its venom induces drastic local effects, including myonecrosis [93. From this venom, a myotoxin was previously purified and pharmacologically characterized [lo, 1 11. The toxin described in this study, named niyotoxin 11, represents a second isoform present in A . nzrnznti- fer venom, belonging to the tys49 family of class 11 PLA2.

2. Materials and methods

A. rzrrmrnfir venom was a pool obtained from more than 15 specimens collected in Costa Rica. After centrifi~gation, venom was lyophilized and stored at -20°C. Sampies of 500 mg were dis- solved in 0.05 M Tris-HC1, 0.1 M KCI, pH 7.0 buffer, and applied to a CM-Sephadex C-25 (Pharmacia) colunin (30 x 2.5 cm), equilibrated with the same buffer. After coltecting unbound proteins, a linear gradient from 0.1 M (400 ml) to 0.75 M KCI (500 ml) was used to elute basic fractions, a t a Aow rate of 0.4 ml/min [12]. Peak 4 screened positive for niyotoxic activity, and was selected for further analyses It was rechro- n-iatographed identically, dialyzed against water, and 1yophiIized.

2.2. Homogeneity

Protein homogeneity was assessed by (a) poly- acrylamide gel eiectrophoresis in the presence of sodium dodecylsuffate (SDS-PACE) [13f, (b) PAGE in the presence of urea, using a cathodic buffer system [14], and (c) reverse-phase high per- formance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column, eluted at 1.0 ml/min with a gradi- ent from O to 60% acetonitrile in 0 1% trifluor- oacetic acid, using a Waters instrument.

Prior to sequence deterrnination, A . riunlmfer myotoxin 11 was reduced and carboxymethylated as described 11 53. The automatic Edman degra- dation procediire was used with a Beckman sequencer, model L F 3000.

Sarnples of 0.1 ml, containing either 6, 12, 25 or 50 pg of toxin, were incubated with 1.0 m1 of egg yolk suspension (diluted 1:5 in 0.1 M Tris- HC1, 0.01 M CaC12, pH 8.5 buffer) containing 1 % Triton X-100, for 30 min at 37°C. Then, the

Y Attgtrlo ~l al / Tlie Intcrnnlioncil Joinncrl o j Biocfier,~is/ry & Cell Biology 32 (2000) 63-71 65

free fatty acids were extracted and titrated according to tlie method of Dole [16]

O

2.5. Myotodxic irctivity

The toxin (either 20, 40 or 80 pg), dissolved in c:

50 pl of 0.12 M NaCl, 0.04 M sodium phosphate, m

pH 7.2 buffer (PBS), was injected into groups of 2 - four Swiss mice (18-20 g body weight), in their right gastrocnemius muscle. A control group

O0 '", received 50 111 of PBS. After 3 h, bIood sarnples I 1 I I I 1

O 50 100 150 200 250 300 were collected from the tail, and the plasma cre- atine kinase (CK; E C. 2.7.3.2) activity was deter- mined by a colorimetric assay (Sigma No. 520). Activity was expressed as U/ml, one unit corre- sponding to the phosphorylation of 1 nmol of creatiiie per min at 25OC. In addition to CK ac- tivity measurements, formalin-fixed muscle tissue s;imples were obtained from the injected site after 24 h, and processed for histological evaluation of muscle damage, usirig toluidin blue-stained sec- tions.

2.6. Arzf icuagrrlnrrt (lc tivity

Platclet-poor plasma from sheep was prepared by centrif~iging citrated blood twice a t 1000 x g, at 5°C. For the assay, 0.5 m1 of plasma was incu- bated with toxin (either 1.2, 2.5, 5, 10, 20, 40 or 80 ~ig) dissolved in O 1 m1 of PBS, for 10 min at 37°C. Then, O 1 m1 of O 25 M CaCI2 was added, and the coagulation time recorded. As a control, plasma aliquots were iiicubated with O 1 mi of PBS, and the coagulation tin.ie determined identi- cally.

2 7 . Ecieina-forrnirrg nctivity

Groups of four mice (18-20 g) received a sub- cutaiieous injection of toxin (either 5, 25 or 50 pg), dissoIved in 50 p1 of PBS, in their right foat- pad. After 1 h, edema was estinlated by nieasur- ing the increase in footpad thickness witli a low- pressure spring caliper [17]. Control mice received 50 p1 of PBS.

Elution volume (ml)

Fig l . lsolation of Atropnide.9 ntrmmifer myotoxin II by ion- exchatige chromalography on CM-Scphadex C-25. (a) Eliition pattern of crude venom (500 mg) equitibrated with O 1 M Tris-HC1, 0.1 M KCI, pH 7.0 buffer, and elutcd with a linear gradieiil (G, indicatcd by the arrow) towards O 75 M KCI, pH 7 O buffer (b) Rcchromatography of peak 4 from (a) on tbc CM-Sephadex column (30 x 2 5 cm)

An enzyme immunoassay was utilized to test antigenic cross-reactivity between A. numrnifer myotoxin 11 and B. nsper myotoxin 11. Each toxin (0.4 pg/l00 p1 PBS) was adsorbed onto ImmuIon-2 microplates (Dynatech) overnight. After five washings with 0.05 M Tris, 0.15 M NaC1, 20 pM ZnC12, 1 mM MgC12, pH 7.4 buf- fer, plates were blocked with 150 1~lJwell of PBS containing 2% BSA, for 1 h. After decanting, 100 pl/welI of varying dilutions of rabbit anti- serum to B. crsper inyotoxin II was incubated fol I h, followed by five washings, and by 100 pl/ well of anti-rabbit immunoglobulin conjugated to aikaline phosphatase (Sigma, 1:2000) for 1 h. Color was developed with p-njtroplien ylpho- sphate and recorded at 410 nrn on a Dynatech MR 5000 microplate reader. As a control, nor- mal rabbit serum was assayed in paralleí

Cytutoxic activity was determined as pre- viously described [18,19], using the murine endo- thelial cell line tEnd. Cytolysis was estimated

Y At~giilo el al / Tlze Interricrtiotinl Jotrnirrl (lf Bio~lzv17ii~try & Cvll Binlog~~ 32 (2000) 63-71 67

O 20 40 60 80

Myotoxin (pg)

Fig. 5 Myotoxic and cytolytic activitics of A~ropoides ntrmmi- /kr rnyotoxin II (a) Plasma crcatine kinase (CK) activity 3 h after thc intramuscular injection of myotoxin in the gastrocna mius o€ mice Each point represents the mcan IT S D. of four animals (b) Lactic dchydrogcnase (LDH) rcleasc to supcr- natarits of cndothelial cell cultures, 3 h aftcr cxposurc to niyo- toxin (pglwcll) Valiics are exprcssed rclative to cultiircs exposed lo O 1% Trítoti X-100 (100%) or culture mcdiurn (0%). Each point represents the mean + S D. of duplicate cul- tures.

further characterization, and rechrornatographed iinder the same conditions (Fig. 1 b). This protein appeared as a single band in cathodic urea- PAGE (Fig. 2a), as well as a single 16 kDa band in SDS-PAGE, after reduction with 2-mercap- toethanol (Fig 2b). By analyticaI RP-HPLC, the piirified toxin eluted as a single peak (Fig. 3). This myotoxin was strongly recognized by rabbit antibodies genera ted against B. asper myo toxin 11, by enzyme-immunoassay (Fig. 4).

A . nurnmifer myotoxin 11 (up to 50 pg) had no detectable PLA2 activity on egg yolk phospholi- pids, and did not show an anticoagulant activity (up to 80 pg) on sheep platelet-poor plasma (data iiot shown). Iii vivo, the toxin induced dose-dependent myonecrosis upon i.m, injection, as evidenced by the significant increase in plasma CK activity at 3 11 (Fig, 5a). Histological evalu-

-

-

-

-

I I I 1 I

O 6 12 18 24

Time (hr)

Fig 6 Edcma-forming activity of Atropoides nirtr~ntij>r inyo- toxin 11 in mice Time-course of thc incrcase in footpad thick- ncss induccd by thc injeclion of 5 pg (a), 25 ~ i g (A) iir 50 ktg (V) of myotoxin, or phospliatc-biiKc~ed salinc alonc (e), rc- spectively, by subcutaneous route Each point represcnts the nicaii 3- S D of four animals

ation of formalin-fixed muscle tissue (iiot shown) confirmed the myotoxic effect. 111 addition, injec- tion of A . ntrrnikzifer myotoxin 11 iri the footpad, at doses as low as 5 pg, jnduced significant edema, which was of immediate onset (Fig. 6). A clear cytolytic effect was observed upon incu- bation of myotoxin II with cultured endothelial cells (Fig. 5b).

The results of automatic sequencing of ~ediiced and alkylated toxin indicated that Ihe protein was horiiogenoiis, and aii iriieqiiivocal sequence for the first 53 aiiiino acid residues at the N- terminal scgincnt was obtaiiied Fig 7 shou~s this sequence in coinparison with other rela tcd myo- toxic PLAzs The 1iighest identity (88 7%) was observed with Cet r-ophillia~i goiijncrr~i myotoxiii 11. identity scores were hjgher in cornpalison to Lys49 (> 77%) than to Asp49 (< 64%) myotox- ins (Fig. 7)

The purification and characterization of a new myotoxic PLA2-homologue from the venom of A. nul?znz$er are presented. Previous repurts

68 Y Angrrln rt o1 / T/IC Int~rnatioricrl Joirr,rnl of' Biochernis~ry & Crll Biology 32 (2000) 63-71

Anum- 11 NLYQLWKMlLQETGKNAnPSYGFYECNCGVGSRGKPKDATDRCCHKCCY b identity

Cgod-II S M Y . . . . . . . . . . e . ..V a . . . ~ . . L ~ ~ . . . * . # . . . . . * , . . * - . a * . . . . . . K Brnoo- 1 J. S . F E + G . . . . . - . . . . P . K ...V. t....-+GG+..*-..+--.y.......

Basp-11 S . F E . G ..a...v...P+K..*A....b..LG...ttttt+*--y....,. . K B j su-¡ S . F E . G .....-....P.K...A A......LG*#.-~*-.+*..Y..*.+, D K ~ f l ~ - b ~ I S.V ....-.F...--E..KN*.L LL....LLR.. . . . * . . * S . . y h h a - a . .K Ac1 -K4 9 S.LE.G+ ..........IT . . .S. . . . . . w . H . , Q . . . . . . . . . . . . . . . . . K B a t r S.VE.G ~ . . . . . . . ~ . P L T . . . ~ . . . . . . . . H . . H ~ ~ ~ ~ D . ~ ~ ~ ~ Y ~ ~ ~ ~ ~ ~ App-K49 SVLE.G . . . . . . . . ...IT...Sm.....WwH..Q......---.-.~.. .K Abil PLA-11 S.LE.G*** ....*.I.IT. ~*SSS..W.H..W-H..R~...

Rsch- 'I SM.E.G.+..L..-....T..IA., Basp-IV S.VE.G..........PVT-..A. B j SU-1 1 D.W.WGQ. . - K . . . . ~ P F . Y Y T T . . . Y . . ~ - . .KV Bjsu-PLA D.W.FGQ ..+K..*.LPF.Y-TT...Y..W WGQ.Q......*..*..D-..GK Vam-S4Cj SVIEFG . . . Q E . . D . - P L T . . S . . . . ~ . . ~ . . - - - . - - s * . . AK Basp-111 S-IEFA ...-E..KRLPF.Y*TT.. T Y ..W-GQ.Q-....*----..D*m.GK App- D4 9 ..F.FE.L.KKM.. .SGMLW.SA...Y..W W G Q . R R R R R . . . . . . . . ~ - * ~ G ~

Fig. 7 N-terminal sequcnce o f Atropoides numrnfer myotoxin 11 compared to related myotoxic class 11 phospholipascs A? Amino acids idcntical to thc A riumniijkr myotoxin 11 sequcnce (first 53 residues; Anum-11) are represcnted by dots. Sequences correspond lo: Cgod-11, C goclmcrni myotoxiri 11 (291; Bmoo-11, B moojeni myotoxin II [30); Basp-11, B cisper rnyotoxin 11 [21]; Bjsu-1, B jc~rcrr- acltssu bothropstoxin 1 [3 I 1; Tflv-bpI, Trir?ieresitrrrs Jclvoviridis basic protein 1 [32]; Acl-K49, Agkistrodon conlnrrrix lclticincttrs myo- toxiii [6]; Batr, B nrrox PLA? [33J; App-K49, A piscivorur piscivorus K49 PLAz [27]; Abil PLA-11, A hilinecrtu~. basic PLA? (341; Bsch-1, B schlegelii myotoxin 1 [35]; Basp-IV, B nsper myotoxin IV [36]; Bjsu-11, B jcircrraciiwir bothropstoxin 11 [37]; Bjsu-PLA, B jrrrarocrrssu PLA? [38J; Vamm-S49, Vipera errnniodyte~ S49 PLAp [39]; Basp-111, B cisper myotoxin 111 [40]; App-D49, A pirci- vorirs p i ~ ~ i v o r i t ~ D49 PLAz [27]

described a myotoxin of this venom [lo, 1 11, here referred to as rnyotoxin 1. Cation-exchange chro- matography at pH 7.0 confirmed the presence of several basic proteins in A . iiurnm!:fer venom, in addition to myotoxin 1 (peak 5). The slightly less basic peak 4 screened positive for myotoxic ac- tivity, and was further rechromatographed Tt Inay correspond to the 'peak IV myotoxin' rcported earlier by Brusés et al 1201, who studied its in vitro cytolytic effcct towarcls rnuscle cells, neurons and íibroblasts. Our purified protein appeared homogeneous by severa1 analytic cri- teria, including cathodic urea-PAGE, SDS- PAGE, RP-HPLC, and N-terminal sequence de- terrnination, and was named A. nummfer myo- toxin 11. It showed a strong antigeníc cross- reactivity with B. asper nlyotoxin 11, a well characterized Lys49 PLA2 hornoiogue [12,2 1,221.

GeI etectrophoresis indicated that A. rzttnznziJer inyotoxin 11 occurs as a dirner, with an apparent subunit molecular mass of 16 kDa after re- duction Stable hornodimers in solution have

been observed in myotoxins isolated from Borhrops spp. venoms [lo, 12,231, but highly hom- ologous myotoxins fronl Agkistrodon spp occur- ring as monomers have also beeii described [6].

The pharmacological activities of A. ntrmm$er rnyotoxin T I are qualitatively and qilantitatively similar to tliose described for other basic PLA2 from crotalid snake venoms [4], and include the ability to induce. (a) rapid skeletal muscle necro- sis at the site of injection, (b) an irnrnediate increase of local microvascular permeability, and (c) rapid in vitro cytolysis. The latter effect has been observed using several cell types as targets [18,24], and emerges as a common attribute of class 11 myotoxic PLA2s, both of the Asp49 and the Lys49 types [ 191

Enzyrna tically active Asp49 myotoxins fre- quently display potent an ticoagulan t effect jn

vitro, probably reIated to the hydrolysis of plasma phospholipids [4] In the case of A . iztrm- mfer myotoxin TI, the iack of an anticoagulant effect is in agreeinent with the lack of PILA2 ac-

tivity observed. Botli findings suggested that this inyotoxin would be a Lys49 PLA2 hon~ologue. This was confirnied by N-terminal sequencing, which additionally showed the high homology (in their first 53 residues) between A. ritmzm$er myo- toxin 11 and several retated Lys49 myotoxins from the genera Bolhrops, Agkistrodon, and Trinieresurus. Structural and pharmacological data on the family of class 11 PLA2 myotoxins is expanding rapidly, and should lead to a better uriderstanding of their mechanism of action, gradually being iinraveled [4,5,25,26]. Comparison of the N-terminal sequence of A. ntlrnrnifer rnyo toxin I I wi th o ther PLA2s reveaied one novel arnino acid substitution, at position 53 (Asn), which is occupied by a Lys in atl other Lys49 PLA2s described to date. 1n addition, this niyotoxin is the first Lys49 variant presenting Asn in its N-terminus. This position is occupied by Ser in a11 other Lys49 PLA2s, and Asnl has only been previously found in Asp49 PLA2s such as t he Agkistrotloiz piscivorzcs piscivorzis D49 enzyme 1271, and the human class 11 secreted PLA2 [28] Since A nlrninzij2r inyotoxin II dis- plays a toxic/pharmacological activity profile common to that of class II myotoxic PLAZs, our rcsults suggest that neither Ser1 or Lys53 are essential amino acid residues for myotoxic, cyto- toxic, or edema-inducing effects of this family of toxins.

Acknomlcdgernents

This work was supported by Grants from the Interna tional Founda tion for Science (F/2766- 1), Secretaria de Relaciones Exteriores de México, Bilateral Scieiltific Cooperation Program Costa Rica-Mexico (302CR046), Vicerrectoría de Investigación, University of Costa Rica (741-98- 5 18), and Consejo Nacional para f nvestigaciones Científicas y Tecnológicas (CONIC JT, 98-0 13- FO) of Costa Rica

Refercnccs

[ I ] G Roscnfetd, Syrnptomatology, pathology and treat-

ment of snakc bites in South America, in: W Buchcrl, E.E Bucklcy (Eds ). Vcnonious Animals and Thcir Venoms, 2, Acadcmic Prcss, Ncw York, 1971, pp 345- 403

[2] R Bolaños, Vcnenos y Ofidismo cn Ccntroamkrica, Editorial Universidad de Costa Rica, San José, 1984

[3j R Otero, G S. Tobon, L F Gómez, R Osorio, R Valderrama, D Hoyos, J E Urrcta, S MoIina, J J Arboleda, Accidcntc ofidico cn Antioquia y Choci, Aspectos clínicos y cpidcmiológicos (marzo de 1989-feb- rcro de 1990), Acta Méd Colonibiana 17 (1992) 05-810

[4] J M GutiErrcz, B. Lomontc, Phospholipnse A? niyotox- ins from Bothrope snakc vcnoms, in: R.M Kini (Ed ), Venom Phospholipase A* Enzymcs: Striicture, Function and Mechanism, John Wilcy and Sons, Cliiccstcr, UK, 1997, pp. 321-352.

153 3 E. Flctcher, H S Selistrc dc Araujo, C L Owiiby, Molccular evcnts in the myotoxic action of phospho- lipascs, in: R M Kini (Ed ), Venom Phospholipasc A2 Enzymes: Structure, Function and Mechanisin, John Wilcy and Sons, Chiccstcr, UK, 1997, pp 45-97

[6] H S. Sclistre de Arat~jo, S P Whitc, C L Ownby, cDNA cloning and sequence analysis of a lysine-49 phospholipasc A? myotoxin from Agkisttodo~r corirorfrix ki1ricinctu.e snakc venom, Arch Biochcni Biophys 326 (1996) 21-30

[7] R J Ward, A Rodrigues Alvcs, J Ruggicro Ncto, R K Arni, G Casari, A ScqucnceSpace analysis of Lys49 phospholipascs A*: clues towards idcntification of resi- ducs involvcd in a novct mechanism of mcmbrane damagc and in myotoxicity, Prot Eng 1 1 (1998) 285- 294

[8] R Taylor, A Florcs, G Florcs, R Bolaños, Gcographical distribution of Vipcridae, Elapidae and Hydrophiidac in Costa Rica, Rcv Biol Trop. 21 (1974) 383-397

[9] J M Guliérrez, F Chavcs, Efccios proteolitico, hemor- tágico y mionccrótico dc los vcncnos dc scrpierites cost- arriccnscs dc los géiicros BolArop.~, Ctotalirs y Ladiesis, Toxicon 18 (1980) 31 5-321

[lo] J M Gutiérrcz, B Lomontc, L Cerdas, IsoIatroii and partial charactcrization of a myotoxin from thc vcnoln of thc snake Bothrop riiinin~f~~r, Toxicon 24 (1986) 885- 894

[11] J M. GuiiErrcz, F Chavcs, J A GenC, B Lomonic, Z Camacho, K Schosinsky, Myonccrosis induccd by a basic myotoxin isolatcd from t11c vcnom of thc snake Bothrop~ nummifer (jumping vipcr) frorn Costa Rica, Toxicon 27 (1989) 735-746

[12] B Loniontc, J M Gutiérrez, A new ~nuscle damaging toxin, myotoxin 11, fiom tlie venom of the snake Bothrops asper (terciopelo), Toxicon 27 (1 989) 725-733

[13] U K Lactnmti, Clcavagc of structural protcins during the asscmbly of the head of bactcriophagc T4, Naturc 227 (1970) 680-685

[14] P Traub, S Mizushima, C V Lowry, M Nomura,

Reconstitiition of ribosomcs froin subribosomal com- poncnts, Mcth Enzymol 20 (1971) 391417

[15] B M Martiii, E Carbonc, A Yatani, A M Brown, A N Ramirez, G B Gurrola, L D Possani, Amino acid sequencc and physiological characlerization of toxins from thc venom of thc scorpion Centruroides limpicltrs teromntius Hoffmann, Toxicon 26 (1988) 785-794

[16] V.P. Dole, relation between nonestenfied fatty acids in plasma and the metabolisrn of glucose, J. Clin Invesi. 35 (1956) 150-154.

[17] B. Lomonte, A. Tarkowski, L A Hanson, Host re- sponse to Bo~hrops nsper snake venom: analysis of cdcrna formation, inflammatory cells and cytokine rcleasc in a mouse model, Inflammation 17 (1993) 93- 105

[ l B ] B Lomonte, A. Tarkowski, L A. Hanson, Broad cytoly- tic specificity of myotoxin 11, a lysine-49 phospholipase Al of Bothrops nsper snake venom, Toxicon 32 (1994) 1359-1369.

[19] B Lomonte, Y. Angulo, S Rufini, W Cho, J R. Giglio, M Ohno, J J . Daniclc, P Geoghegan, J.M Gutiérrez, Comparative study of the cytolytic activity of myotoxic phospholipases A2 on moiise cndothelial (tEnd) and skcletal muscle (C2C12) ccils in vitro, Toxicon 37 (1999) 145-158

1201 J L Brusés, J Capaso, E Katz, G Pilar, Spccific in vitro biological activity of snake vcnom myotoxins, J. Neurochcm. 60 (1993) l030-1042

1211 B Francis, J M Gtitiérrcz, B Lomonte, I J Kaiser, Myotoxin 11 from Bothrops mper (terciopelo) venom is a lysine-49 phospholipase A?, Arcl-i Biochem. Biophys 284 (1991) 352-359.

[22] R K Arni, R J- Ward, J.M. Gutiérrez, A. Tulinsky, Crystal strucrure of a calcium-indepcndent phospho- lipasc-likc myotoxic protein from Bofhrops nsper venom, Acta Cryst D 51 (1995) 31 1-317.

[23) M T da Silva Giotro, R C Garratt, G. Oliva, Y P Mascarenhas, J R. Giglio, A C O Cintra, W F. de Azcvcdo, R K Arni, R Ward, Crystallographic and spccttoscopic characterization of a moIecular hinge: conformational changcs in bothropst oxin I , a dimeric Lys49-phospholipase A? homologue, Proteins 30 (1998) 442-454

[24] J E Flctchcr, M Hubcrt, S J Wicland, Q H Gong, M S Jiang, Similarities and difiercnces in mcchanisms of cardiotoxins, mcllitin and other myotoxins, Toxicon 34 (1996) 1301-1311

[25] B Lomonte, E. Morcno, A Tarkowski, L A Hanson, M. Maccarana, Ncutrafzing interaction betwccn hepar- ins and myotoxin 11, a Lys49 phospholipasc A? from Bothrops cisper snake venon]: identification of a heparin- binding aad cytolytic toxin rcgion by the use of syn- thetic pcptides and moleciilar modeling, J Biol Chem 269 (1994) 29867-29873.

[26] L Calderón, B. Lolnontc, Immunochcn~ical characteriz- ation and rolc in toxic activities of rcgion 115-129 of inyotoxin 11, a Lys49 phospholipase A? from Bofhrops

rlsper snake venoni, Arch Biochcm Biophys 358 (1998) 343-350

[27] J M Maraganorc, R L Hcinrikson, The lysine-49 phos- pholipase A? from the venom of Agkistrodon piscivorus pisrivorzrs. Relation of structiire and function to othcr phospholipases Al, J Biol. Cliern 261 (1986) 4797- 4804.

[28] R M Kramer, C. Hession, B Johansen, G. Naycs, P McGray, E P Chow, R. Tizard, R B Pepinsky, Structure and propertics of a human nonpancreatic phospholipase A2, J. Bio1 Chem. 264 (1989) 5768-5775

[291 M V. de Sousa, L Morhy, R K Arni, R J Ward, C Diaz, J M. Gutiérrcz, Amino acid sequence of a myo- toxic Lys49-phospholipase Ap homotogue from the venom of Crrrophidion (Bothrops) gndmcrni, Biochim Biophys. Acta 1384 (1998) 204-208

1301 A M. Soares, V.M. Rodriguez, M 1. Homsi- Brandeburgo, M H. Toyama, F.R Lombardi, R K Arni, J R. Giglio, A rapid proccdure for the isolation of the Lys-49 myotoxin 11 from Bothrops rnoojeni (caissaca) vcnom: biochemical characterization, crystallization, myotoxie and edematogenic activity, Toxicon 36 (1998) 503-5 14

[31] A C . 0 Cintra, S Marangoni, B Oliveira, 5 R Giglio, Bothropstoxin-1: amitio acid sequence and function, J Prot. Chem 12 (1993) 57-64

[32j K. Yoshizumi, S Y Liu, T. Miyata, S Saita, M Ohno, S Iwanaga, H. Kihara, Purification and amino acid scqucnce of basic piolein 1, a lysine-49 phospholipase A, with low activity, from the venom of Trimeresurus flavoviridis (Habu snake), Toxicon 28 (1990) 43-54

[33] J M Maraganore, G Mcrutka, W Cho, W Welches, F J Kezdy, R L. Heinrikson, ncw class of phospho- Iipases A2 with lysine in place of aspartate 49, J Biol Chem 259 (1984) 13839-13843.

[34] T. Nikai, Y Komori, A Ohara, S. Yagihashi, Y Ohizumi, H. Sugihara, Characterization and amino- terminal scqiiencc of phospholipase A,-11 from the venom of Agkisirodon hilinenrirs (common canti\), Int .i Biochcm 26 (1994) 43-48

[35] Y Angulo, E. Chavcs, A Alape, A Rucavado, J M Gutiérrez, B Lomonte, lsolation and characterization of a niyotoxic phospholipasc A2 from the vcnom of thc arboreal snake Bothtieclris (Botlrrops) schlegelii from Costa Rica, Arch. Biochem Biophys 339 (1997) 26& 267

1361 C. Díaz, B. Lomonte, F. Zamudio, J M Giitiérrez, Purification and charactcrization of myotoxin IV, a phospholipase A2 variant, from Bothrops crsper snakc venom, Nstt Toxins 3 (1994) 26-31

[37] M F. Pereira, J C Novello, A C O Cintra, J R. Giglio, E T. Landucci, B Oliveira, S . Mararigoni, The atnino acid sequence of bothropstoxin-11, an Asp-49 myotoxin from Bothrops j~rorilcttssic Cjararacucu) vcnom with low phospholipase A2 activity, J Prot. Chem 17 (1998) 381-386.

[38] A M. Moura-da-Silva, M J.I. Paine, M R V Diniz,

R D G Thcakston, J M Cranipton, Tbe molccular pholipase A2 hon~ologitc from Yipcrrl m r m o ~ l y ~ e . ~ cloning of o phospholipasc A2 froni Borhroj~s jcrrarn- vcnom, Eur J Biochcm 202 ( 1 991) 1 165-1 168 . . citssrr snakc venom: cvolution of vcnorn group I I phos- [40] I 1 Kaiser, J M Gutikrrcz, D Plummer, S D Aird, pliolipase Azs may in~ply gcnc duplícations, J Mol Evo1 41 (1995) 174-179 G V. Odell, Thc an~ino acid seqiictice of a myoloxic

[39J 1 Krizaj. A L Bicbcr, A. Ritonja, F. GubenSek, Thc phospholipase from thc venom of Bothrops asprr, Arch

prirnary skructiire of amrnodylin L, a myotoxic phos- Biochem Biophys 278 (1990) 3 19-325

ARTICULO 11

PERGAMON The Tntemationai Journal of Biochemistry & CeIl Biology 34 (2002) 1268-1278 www elscvicr corn/iocatc/jjbcb

Structural characterization and phylogenetic relationships of myotoxin II from A tropo ides (Bothrops) nummifer snake

venom, a Lys49 phospholipase A2 homologue

Yamileth Angulo Timoteo Olamendi-Portugal ', Alberto ~ l a ~ e - ~ i r ó n " ~ , Lounval D. Possani ', Bruno Lomonte

a Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, Sari José, Costa Rica Departamento de Bioquímica, Esctrela de Medicina, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica

Deparhnent of Molecular Recognition and Structural Biology, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Atrt6noma de México, Cuernavacu, Mexico

Received 12 February 2002 ; received in revised form 30 March 2002 ; accepted 17 April2002

Abstract

In order to analyze its structure-function relationships, the complete amino acid sequence of myotoxin II from Atropoides (Bothrops) numrnifer from Costa Rica was determined This toxin is a Lys49-type phospholipase A2 (PLA2) homologue, devoid of catalytic activity, stnicturally belonging to class IIA. In addition to the Asp49 -+ Lys change in the (inactive) catalytic center, substitutions in the calcium-binding loop suggest that its fack of enzymatic activity is due to the loss of ability to bind caz+. The toxin occurs as a homodimer of basic subunits of 121 residues. Its seqtience has highest similarity to Lys49 PLA2s from Cerrophidion, Trinreresurus, Bothrops and Agkistrodon species, which form a subfamily of proteins that diverged early from Asp49 PLA2s present in the same species, as shown by phylogenetic analysis. The tertiary structurc of the toxin was modeled, based on the coordinates of Cerrophidion godmalzi myotoxin 11. Its exposcd C-terminal region 115-129 shows severa1 differences in comparison to the homologous seqiiences of other Lys49 PLA2s, i e. from Agkístrodon p. piscivorus and Bottzrops asper. Region 1 15-129 of the latter two proteins has been implicated in myotoxic activity, on the basis of the direct membrane-damaging of their corresponding synthetic peptides. However, peptide 1 15-1 29 of A nummfer- myotoxin 11 did not exert toxicity upon cultured skeletal muscle cells or rnature muscle in vivo, Differences in severa1 amino acid residues, either critica1 for toxicity, or influencing the conformation of free peptide 1 15-129 from A. ntlmmifer rnyotoxin 11, may account for its Iack of direct membrane-damaging properties. O 2002 Elsevier Science Ltd Al1 rights reserved.

Keywords. Snake venom; Myotoxin; Phospholipase A2; Atropoides nuntmifer; Bothrops

1. Introduction tribute to prey digestion and cause significant tissue damage in accidentally envenomed humans 11 J. A

Numerous snake species secrete toxins that induce rnajority of myotoxins are basic phospholipases Az skeletal rnuscle necrosis (rnyotoxins), which con- (PLA2; EC 3.1.1.4) [2], which have been classified

into groups IB (from Elapidae/Hydrophidae) or IIA * Corresponding author Fax: +506-292-0485 (from CrotalidaeNiperidae), on the basis of their pri- E-mail address. blomonte@cariari ucr ac.cr (B. Lomonte) mary structure and disulfide bond pattern [3,4]. The

1357-2725/02/$ - see front matter O 2002 Elsevier Science Ltd Al1 rights reserved. PII: S 1357-2725(02)00060-2

Y Angulo et al. /The hternational Jourrtal of Biochenlistry & Cell Biology 34 (2002) 1268-1278 1269

group IIA PLAzs are further divided into two major subgroups, namely, those with an aspartic acid residue at position 49 (Asp49 PLA2s) and those in which a lysine substitutes this position (Lys49 PLAzs), A third, rninor subgroup has been described in which the Asp49 residue is substituted by Ser, in the cases of ammodytin L, a myotoxic/neurotoxic PLA2 from Yipera ammodytes ammodytes [5] , and ecarpholin S, a platelet-aggregating PLA2 from Echis carinatus sochureki 16 J.

Many observations indicate that the Asp49 PLA2 myotoxins are catalytically active, whereas, the Lys49 PLA2 homologues are either catalytically inactive, or might display very low levels of enzymatic activ- ity. It is still unclear whether the activity observed in Lys49 PLA2 preparations should be attributed to contarninant Asp49 PLA2s [5-8 ] or, alternatively, be considered intrinsic [9,1 O]. In spite of their striking difference in PLAz activity, Lys49 myotoxins have molecular weights, isoelectric points, amino acid se- quences, and inmunochemical properties that are sim- ilar to those of their Asp49 counterparts, and induce skeletal muscle alterations that are histopathologi- cally indistinguishable from those caused by the latter [ l l:I2].

Protein or cDNA sequences of toxic PLA2s have been compared as an approach to predict the amino acid residues involved in specific effects within this functionally diverse protein family. In the case of my- otoxic group 11 PLA~s, biochemical characterization has demonstrated considerable inter- and intra-specific variations of primary structure, which might provide relevant clues for delineating their molecular determi- nants of toxicity [13,14]. Therefore, the structural and pharmacological characterization of novel myotoxic PILA2 isoforms found in the tropical biodiversity has been of interest over the recent years, for the purpose of solving their complex structure-function relation- ships.

Alropoides numrnfer (previously Bothrops num- rnifer) is a terrestrial snake distributed along the cen- tral American isthmus, commonly known as "jumping viper" or "mano de piedra" [15]. Its venom causes severe tissue damage, which involves hemorrhage, edema, and myonecrosis [ 1 6 J. Two myotoxic PLA2s have been punfied from this venom. A. nurnrnifer myotoxin 1 was characterized as a basic, dimeric, cat- alytically inactive PLA2, suggesting that it belongs

to the Lys49 subgroup [ 1 7,183. Although this toxin has been crystallized, with preliminary X-ray diffrac- tion data reported at 2.3-2.4 A resolution [19,20], its complete amino acid sequence is lacking. A second isoform, A. nurnrnfer myotoxin 11, was subsequently isolated and characterized as a new Lys49 PLA2 variant, according to its N-terminal amino acid se- quence [21]. In this report, the complete primary structure, phy Iogenetic relationships, 3D model, and properties of synthetic C-terminal peptide 1 15-1 29 of A. numrnlyer myotoxin 11 are presented.

2. Materials and methods

2.1. Isolation of A. numm fer myotoxin 11

A. numrnfer venom was a pool obtained from more than 15 specimens collected in Costa Rica. Myotoxin II was purified by cation-exchange chromatography on carboxymethyl-Sephadex C-25 (Pharmacia), as described [21]. Homogeneity was assessed by poly- acrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE) f223, urea-PAGE for basic proteins [23], and reverse-phase high per- formance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column (Vydac), eluted at 1 .O ml/min with a gradi- ent from O to 60% acetonitrile in 0.1% TFA, using a model 6OOE Waters instrument.

2.2. Reduction and carboxymethylation

An aliquot (usually 2 rng of myotoxin 11) was dis- solved in 1 m1 of 0.2 M Tris-HCl buffer, pH 8.6, containing 6 M guanidine chloride plus 1 mglml of EDTA. One drop of 1-octano1 was added and the solution purged with a stream of nitrogen for IOmin. Freshly prepared dithiothreitol (200mM) was added to a final concentration approximately 10 times higher than that of the expected thiol groups of the protein, and incubated for 45 min at 55 "C. Alkylation with iodoacetic acid (at 10-fold excess to the thiol groups available) was thereafter conducted in the same buffer 0.2M Tris-HCI, pH 8.6. The protein was then desalted on a Biogel P30 column (Bio-Rad) previously equilibrated with 20% acetic acid, eluted with the same solvent, and lyophilized [34].

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2.3. Digestion with arginine-C, aspartate-l\r lysine-C and chyrnotrypsin proteinases

The reduced and carboxymethylated protein was digested with severa1 endopeptidases (Boehringer- Mannheim, Gerrnany). About 0.5-1 .0 rng of reduced and alkylated toxin were incubated with the following endopeptidases at a ratio of 20: 1, and incubated in the buffers and times indicated: Clostridium histulyticum arginine-C (100mM Tris-HC1 buffer, pH 7.6, con- taining lOmM CaC12, for 4 h at 37 "C); aspartate-N proteinase (50mM phosphate buffer, pH 8.0, for 4 h at 37 "C); lysine-C (50 mM Tris-HC1, I M EDTA buffer, pH 6.5, for 3 h at 37 OC); and chyrnotrypsin (100mM Tris-HC1 buffer, pH 8.0, for 4 h at 37°C). Purification of the resulting peptides was performed by HPLC on a reverse-phase C18 colurnn (Vydac, Hisperia, CA), previously equilibrated with 0.12% trifluoroacetic acid (TFA) in water and run with a linear gradient from this solution (solution A) to 60% solution B (acetonitrile in 0.10% TFA), for 60 min, at a flow rate of 1 ml/min.

2.4. Amino acid sequence

The complete amino acid sequence determina- tion of myotoxin II was carried out by a combina- tion of direct Edman degradation, using a Millipore 6400/6600 automatic sequencer with native and re- duced and alkylated protein, plus the sequencing of rnany sub-peptides obtained by speci fic endopeptidase cleavage, as mentioned in the previous section. Po- sitions of cysteines were al1 confirmed by the identi- fication of the carboxymethylated residues. Once the sequence was completed, isoelectric point and molecular weight o£ the protein were calculated us- ing the Compute pI/MW tool at ExPASy (http://ca. expasy.osgltools/pi_tool.htiitl) [25].

A model of the 3D structure of A. nummlifer myo- toxin II was constructed, using as a starting geometry the crystal coordinates of Cerrophidion godmani my- otoxin 11 obtained at 2.8A resolution (Protein Data Bank code 1GOD; [Zh]), which shares 90.9% se- quence identity. The toxin sequence was submitted to the Swiss-rnodel server (http:li'www e~pasy.~h/spdb\l/

rnainpagc.htn-il), and the resulting structure file was examined with Swiss-PDBViewer v.3.5 1 (Glaxo Well- come Experimental Research) and WebLabViewer v.4.0 (Molecular Simulations Inc.).

2.6. Sequence alignrnents and phylogenetic analyses

Similarity searches for A. nummfer myotoxin II were performed using FASTA [27] , and amino acid sequences were aligned using the program CLUSTAL W E281 with a few gap adjustments. Phylogenetic trees were calculated using PROTDIST [29] and the neighbor-joining algorithm [3O], and the tree dia- grams were generated with DRAWTREE 1291.

2.7. Peptide 115-129 synthesis

The 13-mer peptide KNYKIYPKPLCKK, corre- sponding to residues 105-1 17 of A. nummifer myo- toxin 11 (referred to as 115-129 in the numbering system of Renetseder et al. [31]) was synthesized using F-moc strategy, with free amino and carboxyl endings (Mimotopes, Australia). Its molecular mass (I623.0), as estimated by mass spectrometry, was in agreement with the theoretical value (1623.1), and its final purity was 97% by RP-HPLC analysis. The pep- tide was kept dry at -20 "C, and dissolved in 0.12 M NaCl, 40 mM sodium phosphate (PBS), pH 7.2, irn- mediately before being tested for pharmacological activities.

2.8. Pharmacological activities

The ability of peptide 1 15-1 29 of A. nurnmifer myo- toxin 11 to induce cytolysis of C2C 12 skeietal muscle cells in culture was evaluated as previously described [32], using the release of lactic dehydrogenase (EC l . 1.1.27) after 3 h, as a marker of irreversible cell dam- age. A. nummifer peptide 115-129 was tested at con- centrations up to 150 pg/well(l mg/ml). A. nummijier whole myotoxin II or a synthetic peptide 1 15-1 29 of B. asper myotoxin 11 were utilized as positive controls for cytotoxicity. Assays were canied out in duplicate cultures, in two independent experiments. In addition, the in vivo effect of peptide 115-129 upon mature skeletal muscle was evaluated by its jntramuscular injection (up to 250 yg in 100 pl of physiologic saline)

Y Angttlo et al /The Internationul Joirrnul of Biocheniístry Le Cell Biology 34 (2002) 1268-1278 127 1

into the gastrocnemius of mice (1 8-20 g body weight; n = 3), and subsequent detennination of plasma creatine kinase (EC 2.7.3.2) activity after 3 h [ 3 3 ] , Control animals received a similar injection without peptide.

3. Results

The amino acid sequence of A. nummifer myotoxin 11 is as shown in Fig. f . The first 53 residues were determined by direct N-terminal sequencing, whereas, overlapping peptides generated by proteolysis with Arg-C, Asp-N, Lys-C and chymotrypsin proteases allowed cornpletion of the primary structure of this toxin (Fig. 1). Most of the peptides obtained from enzymatic cleavage with endopeptidases were se- quenced, although Fig, 1 only includes the results of peptides needed for unequivocally positioning the futl

sequence, for clarity. The calculated molecular weight and pI of A. nummfer myotoxin II are 13,712 and 8.7, respectively. The sequence was subrnitted to the SwissProt database, and assigned the code P82950.

The amino acid sequence of A. nzrmmifer myotoxin II contains all the conserved residues of Lys49 vari- ants, including Leu5, Glnl 1 , Asn28, Arg34, Lys49, Lys53, Thr56, Ser74, Trp77, Lysll5, Lys122 and Lys128, and al1 14 Cys residues (Fjg. 2). Position 53 had been earlier reported as Asn [21], and is here conected to Lys. A conservative substitution is found at position 108, where most Lys49 variants have Glu, while A. nzlrnmifer rnyotoxin II has Asp. How- ever, at position 86 (Fig. 2), where most Lys49 proteins have an acidic residue, this toxin has Lys. The sequence identity of this toxin with other Lys49 variants ranged from 90.9 to 58.0%, whereas, the sequence identity with Asp49 enzymes ranged from 58.0 to 35.0%.

5 1 O 15 20 25 Asn Leu Tyr Gln Leu Trp Lys Met IIe Leu Gln Glu Thr Gly Lys Asn Ala Ala Pro Ser Tyr Gly Phe Tyr Gly -----------------*------------------------------------- N-terminus------------------------------------------------------------

30 35 40 45 50 Cys Asn Cys Gly Val Gly Ser Arg Gly Lys Pro Lys Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe Val His Lys Cys Cys ---------------------------------N-terminus-k-------------L-----------------------------------------L---------------L-----------

SS 60 65 70 75 Tyr Lys Ala Leu Thr Asp Cys Ser Pro Lys Thr Asp Ser Tyr Ser Tyr Ser Trp Lys Asp Lys Thr Ile Val Cys -m------------ / D ----------- /

80 85 90 95 100 Gly Lys Asn Asn Pro Cys Leu Lys Gln Glu Cys Glu Cys Asp Lys Ala Val Ala Ile Cys Leu Arg Asp Asn Leu ---------------"--*---4----------DDD------------------------------ / ---- -- - K-- -- -- --- --- -- - -- --- - ---

105 110 115 120

Asp Thr Tyr Asn Lys Asn Tyr Lys Ile Tyr Pro Lys Pro Leu Cys Lys Lys Ala Asp Asp Cys -------------------- / K- ---------m- /

Fig 1. Amino acid sequence of A. nurnmger myotoxin 11. The first 53 amino acid residues were determined by direct seqiiencing by Edman degradation from the N-terniinus Overlapping peptjdes were generated by enzyrnatic cfeavage of the toxin with the following proteinases: (D) aspartate-N, (R) arginine-C, (K) lysine-C, and (C) chymotrypsin, as described in Sectioii 2

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An initial phylogenetic analysis of 73 class 11 PLA2 sequences available at SwissProt and TrEMBL databases revealed that the Lys49 variants constitute a monophyletic group, having a closer relationship with a subset of class II Asp49 PLA2s (not shown). A multiple sequence alignment of that subset and the Lys49 variants (Fig. 2) was utilized to build a phylogenetic tree, delineating the relationships of A. nurrzmifer myotoxin II (PA22-ATRNU) with other proteins of the PLA2 family (Fig. 3). The tree indi- cates that al1 Lys49 PLA2s are divergent from Asp49 counterparts present in old world (Viperidae) and new world (Crotalidae) snakes, and shows that Lys49 vari- ants are more closely related to the two known Ser49 variants (ammodytin L and ecarpholin S), sharing a common ancestor with them. A. nummger myotoxin 11 and C. godmani myotoxin II are closely related, and diverged before the branch which contains the sequences of the Lys49 variants present in several Bothrops species (Fig. 3) .

The highest protein similarity for A. nzrmmifer my- otoxin 11 was obtained with C. godmani myotoxin 11 (90.9% identity). Based on the crystal structure of the latter, a model of the tertiary structure of A. nzcm- mger myotoxin 11 monomer was constructed (Fig. 4). Only very small deviations from the C. godmani toxin a-carbon atorns were predicted (total rmsd = 0.08 A). The model indícates that the C-terminal region of the A. nummiJer protein, combining cationic and hy- drophobic residues, is highly exposed, in similarity with the structures of Lys49 PLA2s so far character- ized. The 3D structure of the C-terminal region, which

is the most variable in this group of proteins, appears virtually superimposable to that of the C. godmani my- otoxin 11 template (backbone rmsd = 0.08 A). The se- quence 1 1 5-1 29 is 100% identical between these two proteins.

Interestingly, the free synthetic peptide 1 1 5-1 29 of A. nummlfer myotoxin 11 did not induce cell lysis in the assay utilizing C2C12 cells (Table i), even at doses as high as 150 pglwell (1 mg/ml). Microscopic observation of the cultuxes confirmed the lack of mor- phological celI alterations. In this assay, A. nzrmrnijier myotoxin II caused 40 f 5% toxicity at 10 pglwell, and 102 f 4% toxicity at 20 pglwell, while the syn- thetic peptide 1 15-129 of B. asper myotoxin 11 in- cluded as a control, reached 93 -t 6% toxicity at the dose of 100 pglwell. On the other hand, the i.m. in- jection of 250 kg of A. nurnmifer peptide 1 15-129 in mice did not increase plasma creatine kinase values, in cornparison to control animals, indicating its lack of rnyotoxic activity (data not shown).

4. Discussions

The amino acid sequence of myotoxin II from A nummifer snake venom shows that it is a PLA2 homo- logue of the Lys49-type, which belongs to the struc- tural class IIA of this protein family. It was previously reported that this myotoxin lacks enzymatic activity [21], explained by the critica1 substitutions in both the (inactive) catalytic center of the rnolecule (Asp49 -+ Lys), and the calcium-binding loop, precluding its

Fig. 2. Sequence alignment of A nzrrnnlifer myotoxin 11 with other Lys49 variants and a subset of Asp49 phospholipases A2 from viperid/crotalid venoms. Sequence numbering at the top refers to [3I]. Accession numbers in trEMBL (tr) or SwissProt (sp) databases are indicated on the Iefi. Residues conserved arnong the Lys49 variants are printed against a black background Residues conserved in al1 sequences are indicated by an asterisk at the top. Positions conserved in al1 sequences are printed against a gray background: FA-ATRNU, A nummger myotoxin 11 (present study); PAX-TRIOK, Trimeresurus oht~avensis K49; PA2BWTRIMU, Trinzeresilnrs mucrosquamrrfta K49; PAZHAGKPI, Agkistrodon p piscivorus K49; PA2M-AGKCL, Agkistrodon con2ortrix lnficinctrts K49; PA2B_TRIFL, Ti.i~nerestt- rus Jlavoviridis basic protein-I; PA22-CERGO, Cerrophidion godmani myotoxin 11; PAZ-BOTAS, Bothrops asper K49; PAZ-BOTMO, Bothrops moojeni myotoxin-1; PA22_BOTAS, Bothrops osper rnyotoxin 11; PAZ-BOTPI, Bothrops pirujui piiatoxin 11; PAZ-BOTJA, Bothrops jararacussu bothropstoxin 1; PAAGKAC, Agkistrodon acuius K49; PAY-TRIGR, Trimeresurus grarninezrs K49; PA25-TRIGA, Trimeresurus gramineus PLA2-V; PAW-TRIGR, Triniereslrnrs gramineus PLA2-V'; PA2N_ECHCA, Echis cannntus ecarphoiin S; PA2L_VIPAA, Vipera a~nmodytes ammodytin L; PAZ-TRIMU, Trirneresttrus mucrosquariiutus D49; PA23_AGMP, Agkistrodon halys pullus agkistrodotoxin; PA2C_CRODU, Crotalus durissus terr$cus crotoxin subunit B; PA2B-CRODU, Crotalus durisslrs terr[ficus crotoxin subunit B'; PA2N-CROSS, Crotalus scutulutus scutztlatus mojave toxin subunit B; PA2C_VIPAA, Kperu antnroclyres crrnmodytes ammody- toxin C; PA2A-VIPAA, Kpercr nntmoílyfes ammodytes amrnodytoxin A; PA2B_VIPAA, fipera ummorlytes mnrnodytes ammodytoxin B; PA21 BOTAS, Bothrops asper myotoxin 111; PA21 -BOT.JR, Bothrops jurar~zctrsstr D49; PA2 1 -AGKHA, Agkistrodon halys bkornllofi D49; PAZX-TRIFL, TrimeresurtcsJnvoviriciis PL-X; PA2Y_TRIFL, Trintereslir~rs flavovir-idis PL-X'; PAZ1 -BOTJA, Bothrops jm-umca BJ-PLA2; PA21+TRIFL, Trinteres~trus flavoviridis isozyine 1; PAZ-TRIFL, Trir~rerestvtrs flavoviridis Amami-Oshima PLA2.

ir PAJTRNU Ir PAX-TRIOK sp PA2B-TRIMU sp PAZH-AGKPI sp PADMJGKCL sp PA20-TRIFL sp PA22-CERtO ir PAZ-BOTAS V PAZ-BOTMO sp PM2-BOTAS t' PALBOTPI tr PAZ-BOTJA b P A - I G U C tr PAY-TRlGR sp PA25,TRIQA tr PAW-TRIGR sp PA2N-ECHCA rp PA2LVIPAA r PAZ-TRIMU sp PA23JGKHP sp PA2C-CRODU sp PA25-CRODU sp PA2N-CROSS sp PAiC-VIPAA sp PA2A-VIP.44 sp PA28-VIFA4 Sp PA21-BOTAS sp PA21-BOTJR sp P.421-AGKHA sp PA2XTRIFL sp PMY-TRIFL sp Pul-BOTJA SP PA21-TRIFL P PAZTAIFL

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E L 0 E F G O F R Q F N a F N Q F N a F N E F G E F G E F G E F A Q F G O F R Q F R O F R a F G Q F E Q F E

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- . - G C K - - - . . - Q C D . - - - - G C D . . . - - - G C N - - - . Q C N - - - . - . G C N - - .

1 D

Y T - Y Y P N F W - C K G D Y K - V Y L R F K - C K G V E Y N N Y R K S R - C I E E Y M - F Y R D S K - C T E T Y M - F Y P D S R - C R E P Y M - F Y P D S R - C R G P Y M - F Y P D S R - C R G P Y R - N Y P D I L - C K E E Y R - N Y P D F L - C K K E Y M - Y Y P D F L - C K K E Y M - A Y P D L L - C K K P Y M - A Y P D V L - C K K P Y M - A Y P D I L - C S S K Y M - T F P D I F - C T D P Y M - T F P D I F - C T D P Y - W C Y Q A K N - C O E E K Y W R Y P A S N - C Q E D K Y W R Y P A S N - C D E D

1274 Y Anglrlo et al /The ln~ernationnl Jolirnul of Biochenzistry & Cell Biology 34 (2002) 1268-1278

ability to bind the caz+ cofactor. This toxin occurs as a honlodimer of basic siibunits of 121 amino acid residues, displaying cytoiytic activity in vitro, as well as myatoxic and edema-forming activities in vivo E2 13.

The toxin has highest sequence identity to other Lys49 PLA2s from Cerrophidion, Trimeresurus, Bothrops and Agkistrodon species. PhyIogenetic anal- yses indicate that the Lys49 PLA2s form a subfamily of proteins that diverged early from that of Asp49 PLA2s present in the venoms of the same species. A higher seqiience identity exists between Lys49 PLA2s isolated from the venoms of different genera, than be- tween the Lys49 and the Asp49 PLA2 isoforms found in a single species, as observed by Francis et al. [34]. Interestingly, the phylogenetic tree constnicted with a group of 34 class IIA PLA2s in the present study, places the Lys49 variants in closer relationship with the Ser49 PLA2s from the old world genera Epera and Echis, suggesting a common ancestor that branched after their divergente from the ancient Asp49 PLA2s. DetaiIed analyses on the genes encoding Asp49 and Lys49 PLA2s of Asian Trimeresurus species have disclosed an accelerated evolution mechanism [35--371, The adaptive value of the fast evolution from catalytically-active, class IIA myotoxic Asp49 PLA2s, to catalytically-inactive, and still myotoxic, Lys49 or Ser49 PLA2s is ciirrently unknown, Studies with a number of basic Asp49 and Lys49 PLA2 myotoxic isoforms isolated from various Bothrops species have shown that their potency and spectrurn of toxic activ- ities are similar [ l 11, making it unlikely that the latter would have evolved to acquire enhanced toxicity.

A. numrnqer myotoxin II shows the dosest phy- logenetic relationships with myotoxin 11 of C. god- ntani, aiso distributed in Central America, and with the Lys49 PLA;! isoforms, BP-1 and BP-11, fiom the Asian pit viper T Jiavoviridis. Its relative sepa- ration from the cluster formed by Lys49 PLA2s of both Central American and South American Both- rops species (í.e. B. asper myotoxin II, B. moojeni myotoxin 1, B. jararacussu bothropstoxin 1, and B. pirajai piratoxin 11) in the phylogenetic tree, would be in agreement with the taxonomical division that proposed the change from its forrner genus Bothrops to the new genus Atropoides [3 81.

The high sequence identity of A. nurnrnifer my- otoxin 11 with C. godmani myotoxin IJ allowed the construction of a reliable modef of the 3D stmcture of the forrner. The predicted stmcture of the toxin monomer follows almost identically that of the tem- plate protein, with an rmsd for a-carbon atoms of 0.08 A. Even at the C-terminal region, which shows greatest sequence variability among different Lys49 PLA2s, the predicted stmcture of A. nummfer my- otoxin 11 is virtually superimposable to that of the C. godmani protein, due to their high identity. The C-terminal region is of particular interest in Lys49 variants, as previous studies have shown that synthetic í 3-mer peptides corresponding to residues 1 15-1 29 exert direct rnembrane-darnaging activities in the case of two myotoxins of this group: B. asper myotoxin IT 1393 and Agkistrodon p. piscivorus Lys49 PLA2 [333. Since the sequence 1 1 5-1 29 of A. nzrrnrnifer myotoxin TI showed several differences with those myotoxins,

Table 1 Sequence 115-129 of A nurnrnifer myotoxin II compared to other myotoxic Lys49 phospholipases A2 for which corresponding synthetic peptides display toxic activiíy

Myotoxic PLA2 Residue numbeP Peptide References toxicityb

115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 128 129 - - - -- - -- -. -

A p piscivorus Lys49 PLA2 M K Y K A Y F K L K C K K High E331 B asper myotoxin 11 K K Y R Y Y L K P L C K K L o w [33,J I ] A nrinrmijkr myotoxin 11 K N Y K I Y P K P L C K K None Present

study

"esidue nurnbering according to [ L i 11; identical residues in the three proteins are shown in bold. Synthetic peptide 1 15- 129 of A p piscivortrs Lys49 PLAz causes half-maximal cytotoxicity at approximately 12 pgíwell (-45 pM)

iipon C2C12 cells in vitio, and induces myonecrosis in mice. Synthetic peptide 115-129 of B asper myotoxin 11 displays lower cytotoxic activity (half-maximal effect at -250 pM), and does not induce myonecrosis in vivo. No toxic effects were recorded after testing synthctic peptide 115-129 of A nuninliJer myotoxin II under the same assay conditions (as described in Scction 2), either in cell culture or in vivo.

Y A~rgulo et al. /Tire /nlernational Journul of Biocheniistry & Cell Biology 34 (2002) 1265-1278

r PAZ CAEEL 0UfgTOl.l P PAZ0 VlPAA

PA2C VlPAA

PA2A VIPAA

PA21 BOTAS

PA21 BOTJR

FA23 AGKH P

PA2C CRODU

PA2B CRODU

PA2N CROSS

PAZ1 AGKHA

PA2X TRlFL

PA2Y TRIFL

PAZ TRIMU

PA21 BOTJA

PA21 TRlFL

PAZ TRlFL

PA2L VIPAA

PA2N ECHCA

PAX TRIOK

PA28 TRlMU - PA2H AGKPl - PA2M AGKCL

PA AGKAC

I PAY TRlGR

PAW TRlGR

PA25 TRlGA - b PA2B TRlFL

PA ATRNU

b PA22 CERGO

b PAZ BOTMO

i PAZ BOTAS

P PA22 BOTAS - PAZ BOTPl

PAZ BOTJA

Fig 3. Phylogenetic tree relating A nummfer myotoxin TI to other Lys49 variants from viperid venoms, and a subset of Asp49 phospholipases Az; the prirnary structures (legends as described in Fig. 2) were aligned with the program CLUSTAL W, and the tree was built with PROTDIST, using the sequence of Cuenorhabditis elegans PLA2 as an outgroup. The length of branches is proportional to the mutational distance

it was of interest to evafuate the possible pharrnaco- skeletal muscle cells or mature muscle tissue in vivo. logical activities of its corresponding synthetic pep- Therefore, this Lys49 PLA2 presents a case where the tide. Interestingly, the peptide 1 15-129 ofA. nunzmi$er toxic actions of the whole moIecule are not reproduced myotoxin TI was devoid of toxic effects upon cultured by its free C-terminal peptide. Moreover, since the

Fig. 4. The 3D model of A. nummger myotoxin 11. The rnodel was built with the Swiss-model server, based on the structure of C. godmani myotoxin 11 (PDB code IGOD), which shares 90.9% sequence identity: (A) ribbon representation of the A nummifer myotoxin 11 model; (B) a-carbon backbone representation (gray) showing the amino acid side-chains of the cationichydrophobic region 1 15-1 29 (black).

region 1 15-1 29 of A. numrnifer myotoxin 11 is iden- tical in C. godmani myotoxin II, the present observa- tions can also be extrapolated to the latter protein.

As summarized in Table 1, severa1 arnino acids differ between the non-toxic peptide 115-129 of A. numrnifer rnyotoxin 11 (and C. godmani rnyotoxin 11), the moderately toxic homologue peptide of B. asper rnyotoxin II, and the more potent peptide of A. p. pis- civorus Lys49 PLA2. AIthough there is a difference in the net positive cbarge of these three peptides (+5, +6, +7, respectively) that would appear to correlate with their toxic ability, the net charge alone should not be sufficient to explain the variations in toxic activity. In support of this assumption, it was earlier demon- strated that peptide 11 5-129 of B. asper myotoxin II increases its toxic potency by one order of magnitude after substituting its cluster of three Tyr residues by Trp, without altering its net positive charge of +6 [41)].

The lack of direct toxic effects of peptide 1 15-1 29 of A. numrnifer myotoxin 11, which is in contrast to the activity of corresponding peptides of two other Lys49 myotoxins 133,391, may oríginate on differences in amino acid residues that could either be critica1 for the toxic mechanicm itself, or that could significantly influence its free confonnation in solution. There- fore, the present findings do not necessarily exclude a participation of the C-terminal region of A. num- mfer myotoxin 11 (and C. godmani myotoxin II) in

the toxic mechanism exerted by these proteins. It should strictly reflect that their free segment 1 1 5-1 29 is unable to mimick the actions of the whole toxins. Further analyses and approaches will be necessary to conclusively establish whether the C-terminal region of A. numrnifer myotoxin II (and C. godmani my- otoxin 11) is involved in their toxicity, as would be expected in the light of evidence obtained with the Lys49 myotoxins of B. asper [3943] and A. p. pis- civorus 1331 venoms, or if other molecular regions are responsible for their toxic actions.

Acknowledgements

We thank the International Foundation for Sci- ence (F/2766-1), Secretaria de Relaciones Exteri- ores de México, Bilateral Scientific Cooperation Program Costa Rica-Mexico (302CR046), Vicer- rectoría de Investigación, University of Costa Rica (VI-741-99-269), and Consejo Nacional para In- vestigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT 98-013-FO) of Costa Rica, for supporting these stud- ies. We also acknowledge the technical assistance of Dr. Fernando Zamudio duxing amino acid sequence determination. This work was perforrned in partial fulfillment of the doctoral degree of Y. Angulo at the University of Costa Rica.

I: Angulo et u1 /The Internationul Journal of Biocheniistry & Cell Biology 34 (2002) 1268-1278 1277

References

[ l ] J B. Harris, M J Cullen, Muscle necrosis caused by snake venoms and toxins, Electron Microsc Rev. 3 (1 990) 183-2 1 1

[2] P. Rosenberg, Phospholipases Handbook of Toxinology, in: W T. Shíer, D. Mebs (Eds ), Marcel Dekker, New York, 1990, pp. 67-277.

[3] R K. Arni, R J. Ward, Phospholipase A2-a structura1 review, Toxicon 34 (1 996) 827-841.

[4] D.A. Six, E A. Dennis, The expanding superfamily of phos- pholipase A2 enzymes: cfassification and characterization, Biachim. Biophys. Acta 1488 (2000) 1-19

[ S ] 1. Krizaj, A L. Bieber, A Ritonja, F. GubenSek, The prirnary structure of ammodytin L, a myotoxic phospholipase A2 homologue from Vipera ammodytes venom, Eur. J Biochem 202 (1991) 1165-1 168.

[6] J. Polgár, E.M. Magnenat, M.C. Peitsch, T.N C Wells, K J Clemetson, Asp-49 is not an absolute prerequisite for the enzymic activity of Iow-Mr phospholipases A2: purification, characterization and computer modelling of an enzymically active Ser-49 phospholipase A2, ecarphoiin S, from the venom of Echis carinatus sochureki (saw-scaled viper), Biochem J 319 (1996) 961-968.

[y] C.J. van den Bergh, A.J Slotboom, H.M. Verheij, G . de Haas, The role of aspartic acid-49 in the active site of phospholipase A2 A site-specific mutagenesis study of porcine pancreatic phospholipase A2 and the rationale of the enzymatic activity of [Iysine-491 phospholipase A2 from Agkístrodon piscivorus piscivorus venom, Eur. J. Biochem 17 (1988) 353-357.

[8] D L Scott, A Achari, J.C. Vidal, P B Sigler, Crystallographic and biochemical studies of the (inactive) Lys-49 phospho- lipase A2 from the venom of Agkiskodon piscivonts piscivorus, J Biol Chem. 267 (1992) 22645-22657

191 S.Y. Liu, K Yoshizumi, N. Oda, M Ohno, F. Tokunaga, S Iwanaga, H Kihara, Purification and amino acid sequence of basic protein 11, a Lysine-49 phospholipase A2 with low activity, from fiimeresurus Jlavovi~idis venom, 3 Biochein 107 ( 1 990) 4 0 M 0 8

[lo] Y Shimohigashi, A Tani, H Matsumoto, K. Nakashirna, Y Yamagucbi, O. Oda, Y. Takano, H Kamiya, J Kishino, H Arita, M. Ohno, Lysine-49-phospholipases A2 from Trinie- resurusflavoviridis venom are membrane-acting enzymes, J Biochem. 1 18 (1 995) 1037-1044.

[111 J M. Gutiérrez, B. Loinonte, Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake venoms, in: RM. Kini (Ed.), Venom phospholipase A2 enzymes: structure, function, and mecha- nism, Wiley, England, 1997, pp. 321-352.

[12] J.E. Fletcher, H.S. Selistre de Araujo, C L. Ownby, Mofecufar events in the myotoxic aclion of phospholipases, in: R.M. Kini (Ed ), Venom phospholipase A2 enzymes: stmcture, function, and mechanism, Wiley, England, 1997, pp 455-497.

[13] H.S Selistre de Araujo, S P. White, C L Ownby, cDNA cloning and sequence analysis of a lysine-49 phospholipase A2 myotoxin from Agkistrodon contortrix laticinctus snake venom, Arch. Biochem. Biophys 326 (1996) 21-30

[14] R J Ward, A. Rodrigues Alves, 3 Ruggiero Neto, R K Ami, G. Casari, A sequence space analysis of Lys49 phospholipases

AZ: clues towards identification of residues involved in a novel mechanism of mernbrane dainage and in rnyotoxicity, Protein Eng i 1 (1 998) 285-294

[15] A. Solórzano, Distribución y aspectos reproductivos de la mano de piedra, Bothrops nunimifer (Serpentes: Viperidae), en Costa Rica, Rev. BioI. Trop 37 (1989) 133-1 37

[lb] J.M Gutiérrez, F. Chaves, Efectos proteolítico, hernorrágico y mionecrótico de los venenos de serpientes costarricenses de los géneros Bothrops, Crotalws y Lachesis, Toxicon 18 (1980) 315-321.

1171 J.M. Gutiérrez, B. Lomonte, L. Cerdas, IsoIation and partial characterization of a myotoxin from the venom of the snake Borhmps numrnijer, Toxicon 24 (1 986) 885-8 94.

[la] J M. Gutiérrez, F Chaves, J A. Gené, B. Lomonte, Z Camacho, K. Schosinsky, Myonecrosis induced by a basic myotoxin isolated from the venom of the snake Bathrops nummifer (jumping viper) from Costa Rica, Toxicon 27 (1989) 735-746.

[19] RK. Arni, J.M Gutiérrez, CrystaHization and prelirniiiary diffraction data of two myotoxins isolated from the venoms of Borhrops asper (terciopelo) and Bothrops numrnifer Cjumping viper), Toxicon 3 1 (1993) 1061-1064

[20] W.F. de Azevedo, R J Ward, J.M Gutiérrez, R K Ami, Structure of a Lys49-phospholipase A2 homologue isolated from the venom of Bothrops nunimifer Cjumping viper), Toxicon 37 (1999) 371-384.

[21jY Angulo, T. Olamendi-Portugal, L D Possani, 3 Lomonte, lsolation and characterization of myotoxin II from Atropoides (Bothrops) nunimifer snake venom, a new Lys49 phospholipase A2 homologue, Int J. Biochem Cell Biol. 32 (2000) 63-7 1.

[22] U K. Laernmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1 970) 680-685.

[23] P Traub, S. Mizushima, C.V. Lowry, M. Nomura, Recons- titution of ribosomes from subribosomal components, Method EnzyrnoI 20 (1971) 391-404

[24] B M. Martin, E Carbone, A Yatani, A M Brown, A N. Ramírez, G B Gurrola, L D Possani, Amino acití sequence and physiological characterization of toxins from the venom of the scorpion Centruroides linlpidus tecomanus Hoffmann, Toxicon 26 (1988) 785-794

[25] B Bjellqvist, G J. Hughes, C Pasquali, N. Paquet, F Ravier, J -Ch. Sanchez, S. Frutiger, D.F Hochstrasser, The focusing positions of polypeptides in imrnobilized pH gradients can be predicted from their amino acid sequences, Electrophoresis 14 (1993) 1023-1031.

[263 R IIK Arni, M R M Fontes, C. Barberato, 3 M Gutikrrez, C. Díaz-Oreiro, R J Ward, Crystal structure of inyotoxin 11, a monomeric Lys49-phospholipase A2 homologue isolated from the venorn of Cerrophidion (Bothrops) godmani, Arch. Biochem Biophys 366 (1999) 177-1 82

[27] W R. Pearson, D J Liprnan, Improved tools for biological sequence comparisons, Proc Natl. Acad Sci U S A 85 (1 988) 2444-24448

1281 D G Hjggins, J D Thornpson, T J Gidson, Using CLUSTAL for multiple sequence alignments, Method Enzynlol 266 (1 996) 383-402

1278 Y Angulo et u1 /The Internatianal Journul of Bioc/ternistry & Cell Biology 34 (2002) 1268-1278

1291 J. Felsetistein, PNYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3 57c, Department of Genetics, University of Washington, Seattle, 1995.

1301 N Saitou, M Nei, The neighbor-joining method: a new method for constnicting phylogentic trees, Mol Biol. Evo1 4 (1987) 406-425

[31] R. Renetseder, S. Brunie, B.W Dijkstra, J. Drenth, P.B. Sigler, A comparison of the crystal structures of phospholipase Al from bovine pancreas and Crotulus atrox venom, J Biol Chem. 260 (1985) 1 1627-1 1634.

1321 B Lomonte, Y Angulo, S Rufini, W. Cho, J.R Giglio, M. Ohno, J.J. Daniele, P. Geoghegan, J.M. Gutiérrez, Comparative study of the cytolytic activity of myotoxic phos- pholipases A2 on rnouse endothelial (tEnd) and skeletal muscle (C2C12) cells in vitro, Toxicon 37 (1999) 145-158.

1331 C E. Núñez, Y. Angulo, B. Lomonte, Identification of the myotoxic site of the Lys49 phospholipase A2 from Agkism- don piscivorus piscivorus snake venom: synthetic C-terminal peptides from Lys49, but not from Asp49 myotoxins, exert mernbrane-damaging activities, Toxicon 39 (2001) 1587-1594

[34] B. Francis, J M Gutiérrez, B. Lomonte, 1 Kaiser, Myotoxin 11 from Bothrops asper (Terciopelo) venom is a lysine-49 phos- pholipase A2, Arch. Bioehem. Biophys. 284 (1991) 352-359.

[35] T Ogawa, N Oda, K. Nakashima, H. Sasaki, M. Hattori, Y. Sakaki, H Kihara, M. Ohno, Unusually high conservation of untranslated sequences in cDNAs for Trimeresurus flavoviridis phospholipase A2 isozymes, Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 89 (1992) 8557-8561.

[36] K Nakashima, 1 Nobuhisa, M. Deshimaru, M Nakai, T Ogawa, Y. Shimohigashi, Y Fukumaki, M. Hattori, Y Sakaki, S Hattori, M Ohno, Accelerated evolution in the protein-coding regions is universal in crotalinae snake venom gland phospholipase A2 isozyme genes, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 92 (1 995) 5605-5609

[37] 1. Nobuhisa, K. Nakashima, M. Deshimam, T. Ogawa, Y. Shimohigashi, Y Fukumaki, Y Sakaki, S Hattori, H Kihara, M. Ohno, Accelerated evolution of Trinzeresurus okinavensis venom gland phospholipase A2 isozyme-encoding genes, Gene 172 (1 996) 267-272.

[38] S Werman, Phylogenetic relationships of central and south Amerícan pitvipers of the genus Bothrops (sensu lato): cladistic analyses of biochemical and anatomical characters, in: J. Campbell, E D. Brodie (Eds.), Biology of the Pitvipers, Selva Tyler, TX, 1992, 467 pp

[39] B. Lomonte, E. Moreno, A. Tarkowski, L.A Hanson, M Maccarana, Neutralizing interaction between heparins and myotoxin 11, a Lys-49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom Identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic peptides and molecular rnodeting, J Biol. Chem 269 (1994) 29867-29873

[40] B. Lomonte, J. Pizarro-Cerdá, Y. Angulo, JP. Gorvel, E. Moreno, Tyr-+Trp-substituted peptide 115-129 of a Lys49 phospholipase A2 expresses enhanced membrane-damaging activities and reproduces its jn vivo myotoxic effect, Biochim Biophys Acta 1461 (1999) 19-26.

[41] L. Calderón, B. Lomonte, Immunochemical characterization and role in toxic activities of region 1 15-129 of myotoxin 11, a Lys49 phospholipase A2 from Buthrops asper snake venom, Arch Biochem. Biophys 358 (1 998) 343-350.

[42] L. Calderón, B Lomonte, Inhibition of the myotoxic action of Bothrops asper myotoxin 11 in mice by immunization with its synthetic peptide 115-129, Toxicon 37 (1999) 683-687

[43] L Páramo, B Lomonte, J Pizarro-Cerdá, J A Bengoechea, J P. GorveI, E Moreno, Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A:! from Bothrops asper snake venom: synthetic Lys49 myotoxin II-(115-129)-peptidc identifies its bactericidal region, Eur J Biochem 253 (1998) 452-46 1

CULO

ELSEVIER

Available online a t www.sciencedirect.com

scILNcE @ D I A E O i e

Biochimica et Biophysica Acta 1703 (2004) 87-89

DIOCtIIMICA IX iI1OPtIYSICA ACTA

http://www elsevier corn/locnte/bba

Short crystallization paper

Crystallization of the Lys49 PLA2 homologue, myotoxin 11, fi-om the venom of Atropoides nummifer

Leandra Watanabea, Lisandra M. Gavaa, Yamileth ~ n ~ u l o ~ ~ ' , Bmno ~ornon te~ , Raghuvir K. ~ r n i ~ . *

"Department of Physics, IB/LCE/UNESe R Cristovüo Colornbo 2265, Sfio José do Rio Preto, SF: CEP 15054-000, Rrazil b~nstituto Clodorniro Picado, Facultad de Microbiologia, San José, Costa Rica

cDepartamento de Bioquímica, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica

Received 25 May 2004; rcceived in revised fom 9 September 2004; accepted 10 September 2004 Available online 18 September 2004

Abstract

Myotoxin 11, a Lys49 catalytically inactive phospholipase A2 homologue from Atropoides nummifer venom, was purified, characterized and crystallized. The crystals belongs to the tetragonal system, space group P432i2, with unit cell parameters (a=b=68 66 and c=63.87 A). Diffraction data were collected to a resoliition of 2.32 A. The crystal structure is currently being determined using molecular replacement techniqiies O 2004 Elsevier B.V. All rights rcserved.

Keyrvords Myotoxin; Snake venom; Phospholipase A2; Lysine-49; X-ray diffraction

1. Introduction

Atropoides nirrnnillfei- (previously Bothrops nummfer) is a crotalid snake species distributed along the Central Arnerican isthmus [ I ] , and frequently found in the tropical rain forests of Costa Rica [2]. As characteristic of crotalids, its venom induces drastic local effects, including hemorrhage, inflammation, and myonecrosis [3]. The latter effect is mainly caused by a group of basic phospholipase A2 (PLA2) homologues, such as myotoxins 1 [4,5] and 11 [6a,b], previoiisly isolated fiom this venom These two toxins belong to the Lys49 family of catalyti- caIly inactive PLA2s [7,8], which cause irreversible damage to skeletal muscle fibers through a yet poorly unders tood rnechanism.

A. nz~mnzifei- myotoxin 1 has been crystallized, and the structure has been reported at 2.4-A resolution [9,10]; however, since the amino acid sequence has not been

* Coiiesponding alithor Te1 tfax: -t-55 17 22 1 2247 E-rnnil address arni@df.ibilcc unesp.br ( R K Arni)

determined, accurate stnrcttiral data are unavailable. The complete sequence of A. nurnnzi$er n~yotoxin 11 has been determined (SwissProt code P82950) [6b], and this toxin has been well characterized in terms of its biological activities [6a].

It has been proposed that the C-terminal region corre- sponding to amino acids 95-1 17 includes the rnyotoxic site of Lys49-PLA2s [ l 1-1 31, and some synthetic peptides representing this sequence are capabIe of reproducing the toxic actions of their corresponding proteins [8,15]. How- ever, an interesting feature of A. ntimmrfer myotoxin 11 is that its C-terminal synthetic peptide KNYKNPKPLCKK (sequence 1 15-1 29 in the numbering system of Renetseder et al. [14] which is based on the structural similarity to pancreatic PLA2 or amino acids 95-1 17 using the linear numbering scheme) is devoid of direct toxic effects in vitro and in vivo [6b3, in contrast to hornologous synthetic peptides of some related Lys49 PLAz myotoxins [12,15]. Therefore, in-depth structural studies of A nummifer myotoxin 11 may provide valuable information to clariQ the molecular basis of toxicity in this family of PLA2 homologues.

1570-9639/$ - see front rnatter O 2004 Elsevier B V Al1 rights reserved doi: I 0 10 1 6/j bbapap 2004 09 006

8 8 L Nhtonabe et nl / Biochirnica et Biop~~ysica Acta 1703 (2004) 87-89

2. Materials and methods

2.1 Isolition of A nummifer myutoxin II

A. nunzmijkr venom was a pool obtained from more than 15 specimens collected in Costa Rica Myotoxin 11 was purified by cation-exchange chromatography on carboxy- methyl-Sephadex C-25 (Pharmacia), as described [&J. Homogeneity was assessed by polyacrylamide gel electro- phoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS- PAGE) [16], urea-PAGE for basic proteins [17j, and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column (Vydac), eluted at 1.0 rnl/rnin with a gradient fiom 0% to 60% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid, using a model 600E Waters instrument.

2 2 Crystallization and X-ray analysis

A lyophilized sample of myotoxin 11 was dissolved in distilled water at a concentration of 10 mg ml-'. Crystal- lization was performed by the hanging-drop vapour-diffu- sion method using 24-well tissue culture plates. Initial tria1.s were carried out using a crystallization screening technique similar to that described by Jancarik and Kim [181. Typically, 1-pL drops of protein solution were mixed with an equal volume of the screening solution and equilibrated over 1 mL of the latter as reservoir solution. The conditions were refined by trial-and-error, and the single crystal f o m was obtained when a 2-pL protein droplet was mixed with an equal volume of reservoir solution consisting of 0.1 M sodium acetate (pH 4.6), 20% PEG 3350 and 0.2 M amrnonii1n.i siilfate (jnset Fig. 1). The crystal of myotoxin 11

Table 1 X-my diffraction data collection statistics of A ritrrnrnfer rnyotoxin 11 crystal

Space group P432 2

Unit Cell parainetcrs (A) u=6=68 66 and c=63 87 Resolution of data set (A) 300-2 3 Percentage solvent (%) 54 83 Number of observations 37,306 Nuinber of iinique reflections 12,626 R ,,,,, ('/o)" (2.40-2.32) 7 6 (50.3) Completeness (%) (2.40-2 32) 96.6 (99 2) V , (A3 ~ a - ' ) 2 74 Number of molecules per asymmetric unit 2 (Ila(I)) (outermost shell) 13 97 (1 98)

" R,,,,,,=~lZ(h)i-(I(h))[a(l(h)i); I(h) is the observed intensity of the i I h rneasutement of reflection h and (I(h)) is the mean intensity of reflection h calculated after scaling

was transferred to a mother-Iiquor solution containing 15% glycerol and was flash-fiozen.

Three-dimensional X-ray diffraction data were collected from a single crystal (maximum dimension of 0.3 mm) at the Department of Physics (USPISio Carlos). Cu KCY radiation was generated by a Rigaku RU300 rotating anode generator operating at 50 kVand 100 mA and equipped with Osmic mirrors. The diffraction intensities were measured utilizing a MAR345 imaging plate detector (MAR Research). The diffraction data were collected in 78 irnages using the oscillation method range of lo per image. The crystal diffracted to a nominal resolution of 2.3 A (Fig. 1). The X-ray diffraction data were processed, scaled and integrated using DenzoIScalepack [19]. Data-processing statistics are presented in Table 1.

3. Results and discussion

The crystal diffiacted to 2.3 A and beiongs to the space group P4,2,2, with unit-cell parameters (a=b=68.66 A and c=63.87 A) as judged fiom autoindexing and consideration of the systematically absent reflections (Tabfe 1). Assurning that there are two rnolecules of myotoxin 11 in the asymmetric unit, a Matthews parameter value [20] of 2.7

Da-' was obtained, corresponding to a solvent content of 54.8%, values that are wjthin the expected range for typical protein crystals. Processing of the 37,306 measured reflections led to 12,626 unjque refiectjons with an R,,,,,, of 7.6% for the data at 2.3-A resolution.

The crystal structure has been deterrnined using molec- ular replacement techniques as impIemented in the program AMoRe [21] and using a homology-based model for rnyotoxin 11 which was obtained from the crystal stnicture of the Lys49 PLA2 fiom the venom of Cerrophidiorr (Bothrops) godmani (PDB code lGOD [22]) which shares

Fig l . X-ray diffraction pattern obtained using a MAR 345 imaging plate 9 1% sequence identity. Data in the resolution range 20-3.5

detector Photomicrograoh of the cnstals used for X-ray diffraction A Were used. A solution obtained for the rotation and G. 4

experiments (inset) translation functions for the two molecules in the asym-

metric unit, resulting in a final correlation coefficient of 53.9% and R-factor of 48.8% afler rigid-body refinement iising data in the same resolution range. The refinement of the stnrcture is currently in progress.

Acknowledgrnen ts

Financia1 support by FAPESPBMOLBNet, CAPES/ DAAD, CNPq, FUNDUNESP, NeTropica network, and CONICIT (FV-058-02) is gratefu1Iy acknowledged. LMG is recipient of a CNPq fellowship and LW is recipient of a FAPESP fellowship. Part of this work was performed in fulfillment of the doctoral degree of Y. Angulo at the University of Costa Rica.

References

[l] A. SoIórzano, Distribución y aspectos reproductivos de la mano de piedra, Bothrops nummifer (Serpentes: Viperidae), en Costa Rica, Rev. Biol. Trop 37 (1989) 133- 137.

[2] R. Taylor, A. Flores, G . Flores, R. Bolaños, Geographical distribution of Viperidae, Elapidae and Hydrophiidae in Costa Rica, Rev. Biol. Trop. 21 (1974) 383-397.

[3] J.M Gutiérrez, F. Chaves, Efectos proteolítico, hemorrágico y inionecrótico de los venenos de serpientes costarricenses de los géneros Bothrops, Crotalus y Lachesis, Toxicon 18 (1 980) 3 15-32 1.

[4] J.M. Gutiérrez, B. Lomonte, L. Cerdas, Isolation and partial characterization of a inyotoxin from the venom of the snake Bothrops nummifer, Toxicon 24 (1986) 885-894.

[5] J M Gutiérrez, F. Chaves, J A. Gené, B. Lomonte, Z Camacho, K. Schosinsky, Myonecrosis induced by a basic myotoxin isolated fiom the venom of the snake Bothrops nummger (jumping viper) from Costa Rica, Toxicon 27 (1989) 735-746.

[6] (a) Y Angulo, T. Olamendi-Portugal, L.D. Possani, B. Lornonte, Isolation and characterization of myotoxin 11 from Atropoides (Bothrops) nummifer snake venoin, a new Lys49 phospholipase A2 homologue, Int J Biochem. Cell Biol 32 (2000) 63-71;

(b) Y. Angulo, T Olamendi-Portugal, A. Alape-Girón, L D Possani, B Lomonte, Stmctural characterization and phylogenetic relation- ships of myotoxin II from Atropoides (Bothrops) trummifer snake venom, a Lys49 phospholipase As homologue, Int. J. Biochern. Cell Biol. 34 (2002) 1268- 1278.

[7] R K Ami, R J. Ward, Phospholipase Az-a structural review, Toxicon 34 (1996) 827-841.

181 B Lomonte, Y Angulo, L. Calderón, An overview of Lysine-49 phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms and their

structural detertiiitiants of tnyotoxic action, Toxicon 42 (2003) 885 - 90 1

[9] R K Ami, J M Gutiérrez, Crystallization and preliiniiiaiy cliffraction data of two myotoxins isolated from thc venoms of Bothrops usper (terciopelo) and Botlirops nlcmmifer (jumping viper), 'Toxicon 31 (1993) 1061-1064

f 103 W F. de Azevcdo, R J Ward, J M Gutitnez, R K Arni, Stnicture of a Lys49-phospholipase A2 homologue isolated frorn the venom of Bothrops nunrmfer Cjurnping viper), Toxicon 37 (1999) 371 -384

[l 11 B. Lomonte, E Moreno, A Tarkowski, L A Hanson, M Maccaiana, Neutralizing interaction between heparins and myotoxin 11, a Lys-49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom Identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by thc use of synthetic peptides and inolecular modeling, J Biol Chem 269 (1994) 29867-29873.

E121 C.E. Nitñez, Y Angulo, B. Lomonte, Identification of the myotoxic site of the Lys49 phospholipase A2 from Agkistrodon piscivorus yiscivonts snake venom: synthetic C-terminal peptides froin Lys49, but not from Asp49 myotoxins, exert membrane-damaging activities, Toxicon 39 (2001) 1587- 1594.

1131 L. Chioato, A H.C. de Oliveira, R. Ruller, J M. Sá, R J Ward, Distinct sites for myotoxic and membrane-damaging activities in the C- terminal region of a Lys49-phospholipase A2, Biochein J 366 (2002) 97 f -976.

[14) R. Renctseder, S. Brunie, B W Dijkstra, J Drenth, P B Sigler, A comparison of the crystal stnictures of phospholipase A2 from bovine pancreas and Crotalus atrox venom, J Biol Chem. 260 (1985) 11627- 11634

[15] B Lomonte, Y. Angulo, C Santaniaria, Comparative stiidy of synthetic peptides corlesponding to region 115-129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake venoms, Toxicon 42 (2003) 307-3 12.

[16] U K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

1173 P Traub, S. Mizushima, C V Lowry, M Nomura, Reconstitiition of ribosomes from subribosornal components, Methods Enzyrnol 20 (1971) 391-404

[18] J Jancarick, S.H. Kim, Sparse matrix sampling: a screening inethod for crystallization of proteins, J. Appl Crystallogr 24 (1991) 409-41 1.

[19] Z. Otwinowski, W Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation modc, Methods Enzymol 276 ( 1997) 307 - 326

[20] B W, Matthews, Solvent content of protein crystals, J Mol Biol 33 (1 968) 49 1 -497

[21] J. Navaza, Collaborative Comptitational Project, Nlirnber 4 "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallogaphy", Acta Crystallogr , A 50 (1994) 760-763.

[22] R K Ami, M R M Fones, C Barberato, J M. Gutierrez, C Diaz, R.J. Ward, Crystal structure of myotoxin 11, a monomeric Lys49- phospholipase A2 homologue isolated from the venom of Cerro- phidion (Bothrops) godmani, Arch. Biochein Biophys 366 (1999) 177- 182

ARTICULO

Toxicon 42 (2003) 307-31 2

Comparative study of synthetic peptides corresponding to region 1 15 - 129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2

from snake venoms

Bruno ~ o m o n t e ~ * * , Yamileth ~ n ~ u l o ~ ? ~ , Carlos Santarnaríaa "Facultad de Microbiología, bisiituro Clociorniro Picado, Utiiversicforl rle Costa Rico, San José, Costa Rico

h~epartame~rro de Bioquínrico, Escuela de Medicitia, Uriiversidad de Costa Rica, Sarz .Tos&, Costo Rico

Received 1 April 2003; nccepted 12 June 2003

Abstract

Lys49 phospholipase A2 homologues constitute a group of catalytically-inactive proteins, present in the venoms of many crotalid snakes, which induce rnyonecrosis Current evidence supports the mapping of their toxic site to the C-terminal region, where amino acids comprised within the sequence 115- 129 appear to play a central role in toxicity This study evaluated the possible toxic effects of several synthetic peptides coriesponding to the sequence 115- 129 of different Lys49 inyotoxins, using in vitro cytotoxicity and in vivo myotoxicity assays Peptides varied widely in their activities, ~anging fioni fully toxic to harmless Thus, the toxic actions of Lys49 myotoxins cannot always be reproduced by their free pcptidcs 1 15- 129 Peptides from Agkistrodon p. piscivo~us (AppK) and A contorttix laticinctus Lys49 myotoxins exerted both cytotoxicity and myotoxicity Random scrainbling of peptide AppK resulted in complete loss of toxicity, demonstrating that its specific sequence of residues, rather than theír simple presence or frequency, confers its ability to daniage muscle Peptide AppK synthcsized with D-amino acids retained botli activities of the natural 1--enantiomer, suggesting that its inechanism of action does not involve the tecognition of a proteic receptor/acceptor site on muscle cclls, but possibly the binding to other structuies, such as negatively-charged membrane phospholipids O 2003 Elsevier Ltd. Al1 rights reserved

Keywords: Myotoxin; Snake venorns; Phospholipase A2; Synthetic peptidcs; Cytotoxicity

Muscle necrosis is a dramatic effect induced by a variety of snake venoms, potentially leading to permanent sequelae such as tissue loss and disability (Nishiokíi and Silveira. 1992; Waii cll, 1996). Veiioms of snakes within thc family Crotaiidae possess a number of basic phospholipases A2 (PLA2; EC 3.1 1.4) which have a prominent role in the pathogenesis of myonecrosis (Mcbs oticl (1wiil)y. l990), These rnyotoxic PLA2s are classified as group IlA, on the basis of their primary structure and disulfidc bond patteln (Six anll Llcniiis 2000) Within the group HA PLA? myotoxins, there is a subgroup of catalytically-inactive variants (or PLA2 homologues), first discovered in

* Corresponding nuthor Fax: +506-292-0485 E-niail atidress: blomonte@cariari ucr ac cr (B Lornonte)

the venom of the North American water mocassin Agkistrodon p. piscivorus, in which the conserved Asp at position 49 is replaced by Lys (Mninganoie el al , 1083; hlaiag;~noie :ind FIeini iksnri, 1986: Scott e t nl 1992) Such 'Lys49 myotoxins' have been subsequently found in the venoms of many crotalid species (Hu~iisi-U~aritlcburgo et al . 1088: Cj~t jEr lcz aiid Lomonre, 1995: Soales ct al 109S; Owiihy c t id., 1990; Chijiwii ct al , 2000; Thoi et al . 2001) The Lys49 PLA2 myotoxins constitute an inteiesting model for the study of catalytically independent mechanisms of muscle darnagc, and several strategies have been utilized to determine their inolecular deterininants of toxicity 1 ,nnionrc ct al ( 1993) first described that hepatin binds to a site comprising residues 115- 129 of the Lys49 inyotoxin II from Bothrops osper, resulting in the neutralization of its

0041-0101/03/$ - see front mütter O 2003 Elsevier lJtd A11 rights rcservcd tloi: I O 1016/S0041-0101(03)00149-1

308 B. hniotite et al. / Tuxicori 42 (2003) 307-3 12

toxic actions Moreover, it was reported that the synthetic peptide 115- 129 of this protein mimics its cytotoxic effects in vitro (Loiiionte et i d , 1994; Núlirz et al . 2001) Further studies with B asper myotoxin 11 confirmed the functional relevance of region 1 1 5 - 1 2 9 for its toxic activities (C¿ilderón and Lonlonce, 3!)98. 1999; Piramo ct al . 1998; 1,oiiionrc cr al . 1999a). More recently, it was demonstrated that a synthetic peptide corresponding to region 1 15 - 129 of A. p piscivonts Lys49 PLA2, induces a full pattern of myonecrosis in vivo, reproducing al1 the toxic activities of this protein (Núñez et al . 2001) In agreement with these findings, recent site-directed mutagenesis studies of the Lys49 PLA? bothropstoxin 1, from Bothrops jararacussu, demonstrated the functional relevance of residues com- prised within its C-terminal region (Warcl c~ 211, 2002; Chioato ct a1 . 2002)

The observation that two different synthetic peptides, conesponding to thc sequence 115-129 of two Lys49 myotoxins, respectively, are capable of exeiting direct toxic actions (to~iiontc ct ril . 19'34; NLíiic7 ct al.. 2001) , prolnpted the present study, aiming to iiivestigate if this would represent a general rule for proteins within this PLA2 fainily Therefore, a group of sequences 115-129 frorn various Lys49 myotoxins was selected, and the possible toxic activities of their corresponding synthetic peptides were comparatively evaluated, in vitro and in vivo.

The peptides studied are described in T:tble I They were synthesized using Fmoc strategy (W¿ilkci, IC)C)4), either iiianually in our laboratory, or automatically by coiiiinercial

Table 1 Synthetic pcptides 115- 129 of Lys49 inyotoxic phospholipases Al

providers (Chiron Inc., or SynPep Inc , USA). Their final purity was at least 95% by RP-HPLC analysis, and their observed mass spectrometry values corresponded to their expected formula values. In addition to the natural sequences of peptides 115- 129 of the different myotoxins studied, some of the peptides correspond to rnodified sequences, seIected to assess specific issues ('l'able 1) .

In order to evaluate the toxic activity of the different peptides in vitro, a cytotoxicity assay using the C2C12 murine myoblast cell line (ATCC CRL-1772) as a target was perforrned (Lomoiitr et a l . 199C)b). Three hours after exposure to the peptides, celI darnage wrts quantified based on the reiease of lactacte dehydrogenase (LDH) to supernatants, determined by a colorimetric procedure (Sigma No, 500) Previous studies have shown that cytotoxic activity towards C2C 12 ce1ls is a common property of al1 class 11 myotoxic PLA,s analyzed to date, and that this in vitro assay for myotoxins and myotoxin- derived peptides is more sensitive than the in vivo myotoxicity assay performed in mice (Loiiionte et u1 , 199%: Níiñez et al , 200 1) . Synthetic peptides were dissolved in 0.12 M NaCI, 0.04 M sodium phosphate, pH 7 2 buffer (PBS) immediateiy before the experiments, and diluted in culture medium. Then, cells were exposed to different peptide concentrations, in a volume of 150 p1, ranging from 25 to 150 pglwell (approximately 9 5 - 580 pM)

As summarizecl in Fig 1 . peptides corresponding to region I 15 - 129 of Agkistrodari cor~tortrix laticinctus

studied

Lys49 rnyotoxidsnake species

K49 phospholipase A? Agkistruriuti piscivorus piscivorrrs K49 phospholipase Al Agkistruclotr piscivorus pis6 ivorlrs K49 phospholipase A? Agkistrorlon piscivorrts piscivor us ACL myotoxin Agkistrorlorz corrlortrix /oficirictus Myotoxin II Borhrups asper Myotoxin 11-alternative forrn" Burlirops asper Myotoxin 11-modified Botllrops asper Myotoxin II Bothrops moojeni Bothropstoxin 1 and piratoxin 11 Buthrcps jrirat acirssu iind B pirajai Myotoxin 11 Atropoides tiunimifer ttnd Cert ophidion goclnicrrii Myotoxin 11-tnodifred Atropoides rlitmnzifer Amrnody tin L~ Vipero ~lrtlnio(Iyte~ ittnnlodytcs

Sequence 1 15- 129

KKYKAYFKLKCKK

LKFKYKKACKKYK

KKYKAYFKLKCKK

KKYKAYFKFKCKK

KKYRYYLKPLCKK KKY RYYLKPFCKK

KKWRWWLKALAKK KKYRYNYLKPFCKK KKYRYHLKPFCKK

KNYKIYPKPLCKK

KKYKIYPKPLCKK

KKYKVYLKFKCKG

Peptide code Protein referente

APPK M:~I ag:iiiciic 311d Hciiil ikson ( 1986)

AppK (scramblecl) -

AppK (all-D) -

Acla

Basp-11 Basp-11-F

Basp-11-pEM-2 - Brnoo-II Soares rt al ( 1 908) Bjsu-11Bpir-11 Cintra ct a1 (1993) zind

'roy;1111;1 et al (2(H)O) Anum-l11Cgod-11 Angiilo ct al. 12002) aiid

clc Sotis:~ ct :i1 ( 1998) Aniim-I11Cgod-Il (mod) -

" A microheterogeneity ai position 124 of either Lcii/Phe was described. This protein is íi Ser49 variant of PLAI with myotoxic activity

o APPK O AppK (scrambled)

A AppK (atl-D) v Acia O Anum-11 / Cgod-ll O Anum-ll / Cgod-H (mod)

Pe ptide (pg/well)

Fig 1 Evaluation of the in vitro cytotoxic activity of synthetic peptides corresponding to the seqtience 115- 129 of Lys49 phospholipase A2 myotoxins, towards C2C12 skeletai muscle cells Cell dainage was quantified by the rclcase of lactate dehydrogenase (LDH), 3 h after exposure to 25- 150 pg of peptides, in 150 p1 of rnedium (95-580 KM) Each point represents mean -t- SD of triplicate cultures Peptide abbreviations are dcscribed in f;ihlr: I

myotoxin (Acla), A p. piscivorus Lys49 PLA2 (AppK), B. nsper myotoxin 11 (Basp-II), and its alternative natural form (Basp-11-F), respectively, displayed a clear cytotoxic activity, demonstrated by the dose-dependent release of LDH, and by microscopical observation of cell darnage Peptides from the two Agkistrodon species were more active than those dcrived from B nsper in this assay (Iiig 1). Although the cytotoxic activity of peptides AppK and Basp- 11 has beeii repoited (Loinonte ct al , f 993: Núiieíi ei al . 700 1 ), they were included here for comparative purposes. On the other hand, peptides corresponding to B. nroojeni myotoxin 11 (Bmoo-Il), B. jararacussu bothropstoxiri 1 (Bjsu-1)lB. yirajai piratoxin 11 (Bpir-II), Atropoides nummi- fer myotoxin II (Anum-1I)ICerropltidion godmarzi myotoxin 11 (Cgod-111, and Vipera ammodytes anznzodytes ammodytin L (Vaniin), did iiot cause cell damage, at concentiations as Iiigli as 580 pM (150 pglwell; I;ig. 1)

The most active peptide, AppK, was sefecred to assess two specific questions by the use of variants. in order to evaluate if the cytotoxic activity of this peptide could be attributed to a non-specific effect of its numerous positively- charged amino acid residues, its sequcnce was scrambled at

randoin, as specified in T;ible I . Peptide AppK-scrambled was unable to damage the cell cultures (Fig 1), demonstrat- ing that the specific seqiience of residues in the natural AppK peptide, rather than their simple presence or frequency, is the factor that confers its ability to damage muscle cells in culture. In order to evaluate if peptide AppK acts upon the cell cuitures by recognizing a configiiration- dependent structure (such as a proteic receptorlacceptor site), an analogous peptide synthesized with D-amino acids (AppK all-D; Tiible 1) was tested This D-enantiomer was clearly cytotoxic, with a potency comparable to that of its natural L-counterpart (Fig. l ) , strongly suggesting that the cytotoxic rnechanism of peptide AppK does not involve the recognition of a proteic acceptor site on the C2C12 skeletal muscle cells. This observation, if relevant to the whole parent molecule, would indicate that the mechanisin of action of myotoxic Lys49 PLA2s may not involve the recognition of PLA2 receptor proteins (L,ariihe:i\i aiid Lazcfiiiiski, 1999), but possibly the binding to negatively charged menibrane phospholipids (Díaz et ;iI . 2001)

The sequence of B. asper myotoxin 11 was originally reported with a microheterogeneity at position 124.

occupied by either Leu or Phe (Fraiicis et al . I9!)L). Since previous studies with peptide 115- 129 of this toxin (Basp- 11) have been performed with Leu124, the alternative peptide form with Phel24 (Basp-11-F) was tested, observing that it also has cytotoxic activity (Fig 1) Thus, a LeuPhe exchange at position 124 of this peptide does not affect its toxic ability On the other hand, a modified peptide (Anum- IIICgod-11-mod; Tiible I ) in which AsnlI6 of the original sequence of Anum-IIICgod-11 was changed to Lys116, as an attempt to restore this relatively conserved positive residue among many Lys49 myotoxins, did not show cytotoxic activity (Fig. 1). Finally, a modified peptide (Basp-11-pEM- 2) based on the sequence of B. asper myotoxin 11, was evaluated in the cytotoxicity assay. This peptide contains a previously characterized triple Tyr* Trp substitution (Loiriolitt: cf 31 , 1090¿1), in addition to the substitutions Pro -. Ala and Cys -. Ala ('l'ul~le I ) The lack of Cys in Basp-11-pEM-2 allowed to evaluate if the possible covalent dimerization of this peptide (that might occur due to intermolecular oxidation of Cys residues), would be necessary for its toxic activity Peptide Basp-11-pEM-2 exerted cell damage (Fig l), demonstrating that dimeriza- tion is not required for its cytotoxic activity.

The activity of peptides was subsequently evaluated in vivo, by injecting 250 pg/50 p1 intramuscularly in mice, and assessing myonecrosis through quantification of the plasma creatine kinase (CK) activity after 3 h (Sigma No 520). This dose was selected according to previous studies of myotoxin-derived peptides (I,oiriontc c t al . IY99a; Níi i ic~ ct a l , 2001) Results showed that, in addition to peptide AppK, peptide Acla was also capable to exert a full myotoxic activity, significantIy increasing plasma CK levels in vivo (Fig 2) This finding dernoiistrates that the region 1 15 - 129 of A contortrix latici~ictus Lys49 PLA, encloses its myotoxic site, in agreement with previous observations with A p. piscivorus Lys49 PLA2 (Núñcz et ii1 , 2001). Both peptides differ only at one position, namely, Leu123 in AppK vs. Phe123 in Acla, showing that this LeuíPhe exchange (in similarity with the Leu124Phe124 exchange of peptides Basp-1IíBasp-11-F) does not cause drastic changes in toxic activity.

fn agreement with results obtained in vitro, peptide AppK-scrambled was devoid of myotoxicity in mice, whereas AppK-all-D was clearly myotoxic (Ilg 3). Thus, the same conclusions on (a) the specific toxic effect of the natural AppK sequence, and (b) the lack of a stereoisomer- sensitive receptor requirement in its toxic mechanism, also apply to the in vivo situation, which involves fully differentiated skeletal muscle fibers as targets.

Peptides other than those of Agkistrodon species, including the B. asper myotoxin 11-derived peptides that were cytotoxic in vitro, did not induce myotoxicity in vivo (Fig 7) . Thus, these results show that the toxic activities of the Lys49 PLAz proteins cannot always be reproduced by their corresponding synthetic peptides 1 15- 129. Such peptides may express the full myotoxic and cytotoxic

AppK (scrambled)

AppK (all-D)

Acla

Baspll

Basp-ll-F

Varnm

Plasma CK actkity (Ulml)

Fig 2. Evaluation of the in vivo myotoxic activity of synthetic peptides corresponding to the sequence 115- 129 of Lys49 phospholipase A2 myotoxins, in mice. Skeletal muscle necrosis was quantified by detemining plasma creatine kinase (CK) activity, 3 hr after i m injection of 250 pg of peptides, in 50 y1 of PBS Each bar represents mean it SD of three animals PBS: phosphate- buffered saline, pN 7 2 Peptide abbreviations are described in Tnble 1.

activity of the parent protein (i e AppK and Acla), only a weaker cytotoxic effect in vitro (Basp-11, Basp-11-F), or no detectable toxic effects at a11 (Bmoo-11, Bjsu-IIBpir-11, Anum-IVCgod-11) The apparent discrepancy between the in vitro and in vivo activities of the B asper myotoxin 11- derived peptides might be explained by a higher sensitivity of the cytotoxicity assay, in cornparison to the in vivo myotoxicity test, as suggested earlier (Lomonte et a l , 1999a: Núñez et i ~ 1 , 2001). It may be assumed that the number of target sites for :he peptides should be significantly lower in the cell culture model, than in the larger mass of muscle tissue in vivo. This would aliow the peptides to concentrate at higher densities on the surface of the cultured cells, in contrast to a dispersion along the large muscle fibers

Finally, should the observed Iack of toxic activities, for several of the peptides studied, exclude the possible participation of sequence 115-129 as a toxic region of their corresponding Lys49 PLA2s? From an evolutionary perspective, it would seem unlikely that the Lys49 PLA2 myotoxins, forrning a closely related phylogenetic group (Angirlo ct al.. 3002). would have developed markedly different active regions in different snake species. The direct evidence of toxicity exerted by synthetic C-terminal peptides of some Lys49 myotoxins (i e. from B asper (Loniontc ct al , t 904), A p. piscivor~ds (Núiícz cr al , 200 1 ), and A. c laticirictus (present work)) suggests that this region might also play a central role in the toxic mechanism of other members of this piotein family. But this would have to be evaluated through other experimental approaches, in

each particular case, due to significant sequence variations in the C-terminal region of these proteins. The reasons for the lack of activity of severa] peptides 115-129 are presently ~inclear. A possible explanation could be that, free in solution, some peptides might adopt an altered conformation, unfavorable for the toxic mechanism. The segment 115-129 forrns a loop at the C-terminal rcgion of the Lys49 myotoxins (Aiiii and Waid. 1996), but confor- mation of the corresponding free peptides in solution would have to be determined. In addition, the participation of other protein regions (adjacent or distant) in the toxic mechanism cannot be excluded. Independently of the reasons, it is proposed that, while a positive observation of direct toxicity by a particular C-terminal peptide demonstrates the involvement of its conesponding protein region in the toxic mechanism of action, the opposite is not necessarily true, ¡.e. a negative result does not exclude the participation of the corresponding protein region in toxicity In support of this proposal, recent studies with recombinant B jarar- acussu bothropstoxin 1 mutants clearly demonstrated the functional relevante of residues within the sequence 115- 125 in the toxic actions of this protein (Chioato et aI., 2002). Yet, in the present work, its free synthetic peptide 115- 129 was unable to mirnic the actions of the whofe toxin. Therefore, even for the Lys49 PLA2 myotoxins whose synthetic peptides 1 15- 129 tested negative in this study, the possibility of the involvement of their C-terminal regions in toxicity remains still open to evaluation by other exper- imental approaches.

Acknowledgements

We thank Drs Georgina GurroIa and LourivaI Possani (Instituto de Biotecnología, UNAM-Cuernavaca, Mexico), for expert advice with peptide synthesis; Dr Igor Krizaj (Josef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia) for providing purified Vipera ammodytes ammodytin L (as parent protein of peptide Vamm); and Javier Núñez, Xinia Porras, and Rodrigo Chaves for excellent laboratory support Financia1 aid was received from Vicerrectoría de Investigación, University of Costa Rica (VI-741-99-269), International Foundation for Science (F/2766-2), Consejo Nacional para Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT 98- 013-FO), the Embassy of Japan in Costa Rica. and NeTropica Swedish-Central American Network for Research and Training (G-02) This work was performed in partial fulfillment of the doctoral degrce of Y. AnguIo at the University of Costa Rica.

Angulo. Y . Olamendi-Portugal, T.. Alape-Giron, A , Possani, L D . Lomonte. B ,2002. Stnrctural characterization and phylogenetic relationships of myotoxin 11 from Atrupoides (Borhrops)

nurnnli$er snake venom, a Lys49 phospholipase A2 hoinologiie Int J. Biochem Cell Biol 34, 1268- 1278

Arni, R K , Ward, R J , 1996. Phospholipase A?-a structural review Toxicon 34, 827 -84 1.

Calderón, L . Lomonte, B , 1998 Immunochemical characterization and roie in toxic activities of region 115- 129 of inyotoxin 11, a Lys49 phospholipase A? frorn Bothrops asper snake venom Arch. Biochern Biophys. 358, 343-350

Calderón, L , Lomonte. B . 1999 Inhibition of the myotoxic action of Bothrops nsper myotoxin 11 in mice by immunization with its synthetic peptide 115-129 Toxicon 37, 683-687

Chijiwa, T., Deshimm, M , Nobuhisa, l . Nakai, M , Ogawa, T , Oda, N , Nakashima, K., Fukurnaki, Y., Shimohigashi, Y., Hattori. S , Ohno, M ,2000. Regional evolution of venom-gland phosphoIipase A2 isoenzymes of Trimeresurus j7(ivoviridis snakes in the southwestern islands of Japan Biochein J. 347, 49 1-499

Chioato, L , de Oliveira, A H.C., Ruller, R , S á , J M , Ward, R J , 2002 Distinct sites for myotoxic and membrane-dainaging activities in the C-terminal region of a Lys4Pphospholipase A2 Biochern .J 366, 97 1-976.

Cintra, A C O , Marangoni, S , Oliveira, B . GigIio, J R , 1993 Bothropstoxin-1: amino acid sequence and fiinction J Protein Chem 12,57-64

Díaz, C , León, G , Rucavado. A . Rojas, N . Schroit, A J , Gutiérrez, J M , 2001. Modulation of the susceptibility of human erythrocytes to snake venom myotoxic ph~spholipiises A?: role of negatively charged phospholipids as potential membrane binding sites Arch Biochem Biophys. 391, 56-64.

Francis, B . Gutiérrez, J M , Lomonte, B , Kaiser, 1 1.. 1991 Myotoxin II from Botlzropsasper (terciopelo) venom is a lysine- 49 phospholipase A? Arch Biochem Biophys 284, 352-359

Gutiérrez, J.M, Lomonte. B . 1995 Phospholipase A? niyotoxiiis from Borhrops snake venoms Toxicon 33, 1405- 1424

Homsi-Brandeburgo, M I , Queiroz. L S , Santo-Neto, H , Rodri- gues-Simioiii, L . Giglio, J R , 1988. Früctionation of Bothrops jararnc~rssu snake venom: partial chemical characterization and biological activity of bothropstoxin Toxicon 26, 615-627

Krizaj, 1, Bieber, A L , Ritonja, A., Gubensek, F , 1991 The prirnary structure of ammodytin L, a myatoxic phosphofipase A? homologue from Vipera ammodytes venom Eiir J Biochem. 202, 1165-1168.

Lambeau, G , Lazdunski, M , 1999 Receptors for a growing family of secreted phospholipases A2 Trends Pharmacol Sci 20, 162-170

Lomonte, B . Moreno, E , Tarkowski, A . Hanson, L A , Maccarana, M . 1994 Neiitraliziiig interaction between heparins and myotoxin 11. a Lys-49 phospholipase A2 from Burh~ops mper snake venorn identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic peptides and molecular modeling. J. Biol Chein 269, 29867-29873.

Lomonte, B.. Pizarro-Cerdíí, J , Angulo, Y., Gorvcl, J P . Moreno, E.. 1999a Tyr + Trp-substituted peptide 115- 129 of n Lys49 phospho1ipnse A2 expresses enhanced membrane-diimagiiig activities and reproduces its in vivo myotoxic effect Uiochiin Biophys Acta 1461, 19-26

Lomonte, B , Angulo, Y , Rufiiii, S , Cho, W. Giglio, J R , Ohno, M , Daniele, J J . Geoghegan, P . Gvtiérrez, 3 M , 1999b Comparative study of the cytolytic activity of inyotoxic phospholipases A? on rnouse endothelial (tEnd) and skeletal miiscJe (C2C12) cells in vitro Toxicon 37, 145- 158

Maraganore, J M , Heinrikson, R.L. 1986. The lysine-49 phospho- lipase A2 from the venom of Agkistrodon piscivorus piscivunts Relation of structure and function to other phospholipases A? J Dio1 Chein 261. 4797-4804.

Maraganore. J M . Merutka, G.. Cho, W., Welches, W., Kézdy, F: J , Heinrikson, R L., 1984 A new class of phospholipases Az wjth lysine ín place of aspartate 49 J. Biol. Chem 259, 13839- 13843.

Mebs, D . Ownby, C L , 1990. Myotoxic cornponents of snake venoms: their biochemical and biological activities Pharmacol Ther 48,223-236.

Nishioka, S A., Silveira. P V P , 1992. A clinical and epidemiologic study of 292 cases of lance-headed viper bite in a Brazilian teaching hospital Am J. Trop. Med Hyg. 47. 805-8 10

Núñez, C E , Angulo, Y , Lomonte, B , 2001. Identification of the rnyotoxic site of the Lys49 phospholipase A2 from Agkistrodon piscivorus piscivorus snake venom: synthetic C-terminal peptides from Lys49. but not from Asp49 tnyotoxins, exert membrane-damaging activities. Toxicon 39. 1587- 1594

Ownby. C L . Selistre de Ara~ijo, H S . White, S P., Retcher, J E . 1999 Lysine 49 phospholipase A2 proteins Toxicon 37, 41 1-445.

Páramo, L. Lomonte, B , Pizarro-Cerdá, J . Bengoechea, J A , Gorvel. J P , Moreno, E . 1998 Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2 froin Bothrops nsper snake venom: synthetic Lys49 myotoxin IL(l15- 129)-peptide identifies its bactericidal region. Eur. J. Biochem 253, 452-461.

Scott, D.L. Achari, A , Vidal, J C , Sigler, P B., 1992 Crystal- lographic and biochemical studies of the (inactive) Lys-49 phospholipase A2 from the venom of Agkisrrodotz piscivorcrs piscivorus J Biol Chem 267, 22645-22657.

Selistre de Araujo, H S . White, S P., Ownby, C.L. 1996 cDNA cloning and sequence analysis of a lysine-49 phospholipase A?

myotoxin from Agkistrodon co?itortrix laticitictus snake venom Arch Biochein Biophys 326, 21 -30.

Six, D A., Dennis. E A , 2000 The expanding superfamily of phospholipase A2 enzymes: classification and characterization Biochim Biophys Acta 1488, 1- 19.

Soares, A M., Rodrigues, V.M., Homsi-Brandeburgo, M I , Toyarna, M H . Lombardi, F R , Ami, R K , Gigtio. J R , 1998 A rapid procedure for the isolation of the Lys-49 rnyotoxin II from Bothrops moojetri (caissaca) venom: biochemical charac- terization, crystallization. myotoxic and edematogenic activity. Toxicon 36.503-514

de Sousa, M V . Morhy, L., Arni, R K . Ward, R J . Díüz, C , Gutiérrez, J M , 1998. Amino acid sequence of a myotoxic Lys49-phospholipase A2 homolog~ie from the venom of Cerrophidion (Bothrops) godnmzi Biochini Biophys Acta 1384,204-208

Toyama, M H , Soares, A M . Wen-Hwa. L , Polikarpov, 1, Giglio, J R , Marangoiii, S ,2000 Amino acid scqiience of piratoxin-11. a myotoxic lys49 phospholipase A? hornologue froiii Botlzrnps pirrzjni venom Biochimie 82 , 245-250

Tsai, 1 H , Chen. Y H , Wang, Y M . Tu, M C . Tu, A T , 2001 Purification, sequencing, and phylogenetic annlyscs of novel Lys-49 phospholipases A2 frorn the venoms of rattlesnakes and other pit vipers Arch Biochein Biophys. 394, 236-244

Walker, B , 1994 Solid-phase peptide synthesis In: Wisdom, G B , (Ed). Peptide Antigens. a Practica1 Approach. IRL Press, Oxford, pp 27-81

Ward. R J., Cliioüto, L , de Oliveira, A.H.C. Ruller, R , Si , J M . 2002. Active-site mutagenesis of a Lys4Pphospholipase A*: biological and membrane-dismpting activities in the absence of catalysis. Biochem J 362. 89-96

WarreIl. D A , 1996 Clinical fcatures of envenoming froin snnke bites In: Bon, C , Goyffon, M. (Eds ), Envenoinings and Their Treatrnent, Fondation Marcel Mérieux, Lyon, pp 63-76

ELSEVIER Toxicon xx (xxxx) 1-6 60 www elsevier coi~~/locate/toxicon 6 1

62 63

Myotoxic and cytolytic activities of dimeric Lys49 65 64

phospholipase A2 homologues are reduced, but not abolished, 66 67

by a pH-induced dissociation 68 69 70

Yamileth ~ n ~ u l o " ' ~ ~ * , José María Gutiérreza, Andreimar M. Soaresc, 7 1

Wonhwa chod, Bruno Lomontea 72 73

"Fucult~d de Microbiología, Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica, Sun José, Costa Rica 74 b~epartumet~to cit. Bioguírnicu, Escuela de Meúicina, Universidad de Costa Rica, San Jo~é, Costa Rica 75

"Departumertto de At~úlises Clínicas, Toxicol6gicas e Bromatológicas, Fuculdade de Ciencias FarmucEuticus 76 de Ribeirüo Preto, Universidade de Seo Paulo, Ribeirüo Preto, SP, Brazii

d~epartrnent of Chemistry, University of Illinois at Chicugo, Cbicago, 115, USA 77

78 Received 3 February 2005; revised 30 March 2005; accepted 31 March 2005

Abstract

Lys49 phospholipase A2 (PLA2) homologues are myotoxic proteins devoid of catalytic activity. Their toxic determinants rnap to the C-terminal region 1 15-129, which plays an effector role in membrane damage. The dimeric state was reporte6 to be essential for a Lys49 PLA2 which lost its fiposome-dismpting activity after dissociating into monomers at pH 5.0. This study, evaluated the effects of a pH-induced dissociation on the toxicity of four Lys49 PLA2s, using biological targets instead. Both their cytolytic and myotoxic activities were lower at pH 5.0 than at pH 7.2. However, in contrast with experiments using artificial bilayers, toxic effects upon biological targets were not abolished at pH 5.0. Importantly, C-terminal synthetic peptides of two Lys49 PLA2s also showed Iower cytolytic action at pH 5.0 than at pH 7.2, indicating that factors other than the dirnerictmonomeric state of the proteins may also be involved in these differences of toxicity. Results support the view that the dimeric state of Lys49 PLA2s could play an enhancing, although not essential role, in their C-terminal region-mediated rnechanism of rnyotoxicity. O 2005 Published by Elsevier Ltd.

Keywords. Snake venoin; Myotoxin; Pbospholipase A2; Dimeric protein; Muscle

1. Introduction

Crotaline snakes (family Viperidae, subfamily Crotali- nae) are widely distributed in America (Campbell and Larnar, 1989), being responsible for the majority of snakebite envenomations in this continent (Gutiéi-rez, 1995). Their

" Correspwnding author. Address: Facultad de Microbiología, Instituto Clodomiro Picado, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica Te1 : $506 229 0344; fax: +506 292 0485.

E-rnnil aíldress- yangulw@icp iicr ac cr (Y Anguio)

0041-0101/$ - see front matter O 2005 Published by Elsevier Ltd doi:lO 1016/j toxicon 2005 03 025

venoms induce prominent local tissue alterations, among which acute muscIe damage, i.e. myonecrosis, is comrnoii (Guti érrez and Lomonte, 2003). The most important myotoxic cornponents in crotaline venoms are phospho- lipases A2 (PLA2; EC 3.1.1.4), ubiquitous enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 position of glyceropho- spholipids (Kudo and Murakami, 2002). In snake venoms, PLAzs have evolvedinto potent toxins with diverse activities, such as neurotoxicity, myotoxicity, anticoagulant, hypoten- sive, cardiotoxic, edema-inducing (Kini, 2003), and bacteri- cidal (Páramo et al , 1998) effects.

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PLA2s have becn classified into eleven groups (Six alid insights into the functional role of their dimeric state i i i the Deiiiiis, 2000), amorig which the enzymes from snake mechanism of rnuscle damage. veiionis belong to groups 1 (elapid PLA2s) and 11 (viperid PLA2s). The latter are further, divided into two main subgroups, namely catalytically-active enzymes pi esenting 2. Materials and methods a conserved aspartic acid residue at position 49 (Asp49 PLA2s), or homologues with Iysine substituting at this position (Lys49 PLA2s) (Maraganore et al., 1984) which are catalyticaily-inactive (Scott et al., 1992; Lee et al., 2001; Ward et al., 2002).

Despite their lack of enzyrnatic activity, the Lys49 PLAz homologues induce conspicuous rnyonecrosis in vivo, as weli as a series of in vitro effects such as cytolysis, liposome disruption, neuromuscular blockade, and bactericidal action [reviewed by Loinonte et al. (2003b), and Soares et al. (2004)l. Since, their effects cannot be attributed to phospholipid hydrolysis, a number of investigations have focused on the elucidation of the molecular basis of their toxicity. Evidence based on studies with synthetic peptides, mapping of interaction sites with neutralizing molecules,

2.1. Isolation of Lys49 PLA, myotoxins

Lys49 myotoxins were purified from their corresponding crude venoms by cation-exchange chromatography as described for Bothrops asper myotoxin 11 (Lomonte and Gutiérrez, 1989), Atropoides nummifer myotoxin II (Angulo et al., 2000, 2002), B. jararacussu bothropstoxin 1 (Andriao-Escarso et al., 2000), and Agkistrodott p, pisci- vorus (Maraganore et 1 , 1984), respectively. Toxin homogeneity was assessed by urea-PAGE for basic proteins (Traub et al., 1971), and by RP-HPLC on a C4 colurnn (25 X 4.6 mm; Vydac), eluted at 1.0 mLfrnin with a gradient from O to 60% acetonitrile in 0.1 % trifluoroacetic acid (v/v), using an Agilent 1 100 system.

and site-directed mutagenesis [see reviews by Lomonte et al. (2003b) and Chioato and Ward (2003)], identified the 2.2' Chernical cross-'inking

C-terminal region of Lys49 PLA2s as essential for their myotoxic, cytolytic, bactericidal, and liposome-disrupting activities. The strongest evidence for a key efiector role of this region derives from (a) the observation that severa1 13-mer synthetic peptides, representing rhe sequence 115-129 of Lys49 myotoxins, are capable of reproducing, albeit with lower potency, the toxic actions of their parent moIecules (Lomonte et al., 1994, 1999a, 2003n; Núñez et a l , 2001); and (b) the demonstration that specific C-terminal mutant; of a Lys49 PLAz display reduced toxicity (Chioato et al., 2002).

Structural studies on bothropstoxin 1, a homodimeric Ly s49 PLA, homologue from Bothrops jnrnracussis venom, demonstrated that this protein presents two conformations, 'open' and 'closed' forrns, which differ in the angle formed by the monomers. On this basis, it was proposed that the dimer interface might function as a hinge, allowing a relative displacement of the C-terminal region that would contribute to disorganization of phosphoiipid bilayers (da Silva Giotto et al., 1998). Subsequent analyses examined the effect of pH on the monomer-dimer equilibrium of bothropstoxin 1 (de Oliveira et al., 2001), leading to the conclusion that the dirneric state of the protein was essential for its ability to disrupt liposomes, since the toxin completely lost this activity at pH 5.0, concomitantly with its dissociation into monorners. Therefore, the present study, was uridertaken to assess if the dimeric state is functionally relevant for the toxic activities of Lys49 PLA2s upon biologically relevant targets. The effects of a pH-induced dissociation on the cytolytic and rnyotoxic activities of four Lys49 myotoxins, as well as of two C-terminal synthetic peptides, using C2C12 myoblast ceils in vitro, and rnature skeletal rnuscle in vivo, respectively, were evaluated to gain

Solutions of 2 lg/pL of purified PLA2s in phosphate- buffered saline (PBS; 0.12 M NaCI, 0.04 M sodium phosphate), either at pH 5.0 or 7.2, were incubated done or in the presence of 2 pg/pL bis-(sulfosuccinimidy1) suberate (BS~; Sigma Chemical Co., USA) for 30 rnin at 25 "C. Then, al1 samples were heated at 95 "C for 5 min in the presence of SDS and [3-mercaptoethanol, and analyzed by SDS-PAGE using 12% gels, at 100 V for 2 h. Proteins were visualized by Coomassie blue R-250 staining.

-- - 2.3. Cytolytic activity in vitro 202

203

The cytotoxic activity of PLA2s was assayed at either pH 204 5.0 or 7.2, on rnurine C2Ci2 skeletal muscfe myoblasts 205 (ATCC CRL-1772) grown in 96-well plates, as described 206 (Lomonte et al., 1999b). Myotoxins were dissolved in assay 207 medium ar the corresponding pH, which consisted of either 208 DMEM supplemented with 1 % fetal calf serum at pH 7.2, or 209 the same solution previously titrated with 2 M citric acid to 210 pH 5.0. Myotoxins were incubated at roorn ternperature for 21 1 30 min, and then added to the cell cultures (after aspirating 212 their growth medium) in a total of 150 pL/well, containing 213 doses of 5, 10,20 or 40 pg. After 3 h of incubation at 37 "C, 214 lactate dehydrogenase (LDH; EC 1.1.1.27) released to 21 5 supernatants was determined by a kinetic assay (Wiener 216 LDH-P UV). Reference controls for O and 100% cytolysis 21 7 consisted of cells incubated with medium alone, or medium 218 containing 0.1 % Triton X- 100, respectively . Assay S were 21 9 carried out in triplicate. 220

Two synthetic peptides, corresponding to the bioactive 221 C-terminal sequences 115-129 of B. asper myotoxin JI 222

(KKYRYYLKPFCKK; (Lomonte et al., 1994)) or 223 A. p. piscivorus Lys49 PLA2 ( K K Y K A Y F K L K C K K ; 224

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(Núñez et al., 2001 )), respectively, were also evaluated for pH 7.2 pt i 5 O NR 281 cytolytic activity. These peptides (150 pg/150 1iL) were M - - 282 dissolved in assay media of either pH 7.2 or 5.0, as described

r - - L

283 , 6$*~: ? above, and applied to the myoblast cultures for deterrni-

9 4 a 284

nation of cell fysis. , .:*A 285 1 67

286 1

2.4. Myvtoxic activity in vivo f 43 287

Myotoxic activity of the PLA2 homologues was evaluated by determining the plasma activity of creatine kinase (CK; EC 2.7.3.2) in groups of four CD-1 mice (18-20 g body weight), after an intramuscular injection of 75 pg of each toxin in 75 pL of PBS, either at pH 7.2 or 5.0, in the gastrocnemius. The toxins were preincubated in each solution for 30 min at roorn temperature, before injection. Control groups received an identical injection of pH 5.0 or 296 7.2 buffer, respectively. After 3 h, blood sampies were Fig. I . Coomassie-stained SDS-PAGE (1 2%) comparing the 297

chemical cross-linking of Bohrops asper myotoxin II by 13s3 collefted into he~afinized c a ~ i l l a r ~ tubes, and plasma CK dunng incubation at pH 7.2 or 5.0. Toxin samples were incubaled jn

298 activity was by a kinetic assay (CK-NAC ' ' 9 the presence (+) or absence (-) of BS), at the indicatcd pH vahes. 299

~ i e n e r ) . ~c t i v i t y was ex~ressed as U/L (1 unit defined as and then reduced with 2-rnercaptoethanol at 95 'C and analyzed A 300 [he amount of enzyme producing 1 of NADH/min at small proportion of covalently stabilized rnyotoxin 11 dirner is 301 30 "C). obtained at pH 7 2 (arrow), but not at pH 5.0. MolecuIar weight 302

msirkers (M) are indicated at the left. For comparison, the migration 303 of dimeric myotoxin II under non-reducing conditions is shown to 304 the right (m).

The pH-induced dissociation of rnyotoxins was sup- 307

ported by electrophoretic analysis after their incubation with 308 the homobifunctional cross-linker bis-(sulfosuccinirnidyl) suberate (BS~), which links primary amino groups separated by up to 11.4 A to form stable amide bonds, in both intra- and intermolecular reactions (Staros, 1982). Fig. 1 shows a representative gel with B. nsper myotoxin II under reducing conditions, where B S ~ covalently linked a proportion of the dimeric form at pH 7.2, whereas at pH 5.0 only the manomeric form was observed. Similar results were observed with the other myotoxins (not shown). Thus, chemical cross-Iinlung results with the Lys49 myotoxins here studied, are in agreement with previous spectroscopic and electrophoretic evidence showing that the dimeric state is favored at pH 7.2, while dissociation into monomers occurs at pH 5.0 (de Oliveira et al., 2001).

When the four Lys49 PLA2s were tested on C2C12 myoblasts in vitro, a significantly lower cytolytic effect was observed at pW 5.0 than at pH 7.2 in al1 cases, at various toxin concentrations (Fig. 2). The highest difference in activity under these two conditions was found for the Lys49 PLA2 homologue from A. p. piscivorus. Incubation of control cultures with assay medium alone at pH 5.0 did not cause cell damage in the time period utilized, as evaluated by both LDH release and microscopical observation.

l n similarity wi th resul ts obtained with their parent proteins, when the synthetic C-termino1 peptides were assayed against C2C12 cells, their cytolytic effect was also significantly lower at pH 5.0 than at pH 7.2 (Fig. 3). In

Myotoxin (pg) 327 328

Fig. 2. Effect of pH on the cytolytic activity of Lys49 phospholipase 329 Az myotoxins upon C2C12 skeletal muscle myoblasts in vitro. 330 Cytotoxicity was determiiied by the release of lactate dehydrogen- 33 ase (LDH) to cell supernatants, 3 h after exposure to variable amounts of toxins at pH 7.2 ( m ) or 5.0 (0). (A) Bothrops usper

332

myotoxin 11; (B) Atropoides numtni$er myotoxin 11; ( C ) Bothrops 333

jurarucussu bothropstoxin 1; (D) recornbinaiit Agkis troh p 334 piscivorus Lys49 PLA2 Each point represents mean+SD of 335

vivo experirnents performed in rnice to assess muscle triplicate cultures. 336

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Fig. 3 Effect of pH on the cytolytic activity of synthetic peptides corresponding to the C-terminal regions (sequcnce 115-129) of Bohtrups asper myotoxin 11 (p-Ba-mt-11; 150 pg1150 pL) and Agkisirorlon p piscivorus (p-AppK49; 150 pg1150 pL), upon C2C12 skeletaI muscle myoblasts in vitro. Cytotoxicity was determined by the release of jactate dehydrogenase (LDH) to cell supernatants, 3 h after exposure to peptides at pH 7 2 (filted bars) or 5 0 (empty bars). Each bar represents meanf SD of triplicate cultures.

An mt-ll

Ba mt-ll

PBS

O 1000 2000 3000 4000 5000

Plasma CK (U/L)

Fig. 4 Effect of pH on the myotoxic activity of Lys49 phospholipases A2 in mice. Toxins (75 pg/50 pL) were injected intramuscularly, at pH 7.2 (filled bars) or 5.0 (empty bars), as described in Section 2 After 3 h, plasma creatine kinase (CK) levels were detennined, and cxpressed as U/L. Control groups received vehicle alone (phosphate-buffered saline; PBS) at pH 7.2 or 5 0. BthTx-I, B. jarlirncussu bothropstoxin-1; An mt-11, Atropoirles nicmrnifer myotoxin 11; Ba mt-11, Bothrops asper myotoxin 11; PBS, phosphate-buffexed saline. Each bar represents rnean-1- SD of four animals

dainage also evidenced that myotoxins preincubrtted at pH 5.0 before injection induced a significantly weakei- effect than those incubated at pH 7.2, as estimated by determiiiing plasma CK levels (Fig 4).

4. Discussion

Lys49 PLAzs characterized to date occur as homodimers (Lee et al., 2001; da Silva Giotto e& al., 1998; Arni et a1 , 1995; de Azevedo et al., 1998,1999; Magro et al., 2003) and few cases, where these proteins have been crystallized as monomers might be related ío the use of acidic pH conditions (Arni et al., 1999). A previous study, demon- strated that bothropstoxin-1, a dimeric Lys49 myotoxin from B. jarartrcrrssu, dissociates into monoiners at pH 5.0, concomitantly with a complete loss of its ability to disrupt artificial bilayers (de Oliveirü et al., 2001). In the present work, the functional consequences of such pH-induced dissociation were further assessed, using a set of four punfied Lys49 PLA2 myotoxins acting upon skeletal muscte cells and mature muscle tissue as biologically relevant targets.

Results support the view that the dimeric state of the Lys49 myotoxins may contribute to their toxic mechanism, in agreement with the conclusions of de Oliveiia et al (2001), since the biological effects here, evaluated were higher at pH 7.2 than at pH 5.0. However, in contrast with findings using liposomes as targets (de Oliveira et al., 200 1), our data using cultured rnyoblasts deinonstrate that the toxic action of Lys49 PLA2s is not nbolished at pH 5.0. This would imply that a dimeric state is not an absolute requirement in the muscle-damaging mechanism of Lys49 PLA2 myotoxins, with rnonomers stil1 being able to exert cell darnage. Moreover, results of paralle1 experiments with synthetic peptides in the pi-esent work open additionai interpretations for findings obtained with their parent 429 proteins, because these short peptides do not have a 430 quaternary structure. The lower cytoly tic activity of 43 1 peptides at pH 5.0 cannot be attributed to variations in the 432 degree of protonation of side chain groups which could 433 affect their interaction with the plasma rnembrane. This 434 possibitity can be ruled out on the basis of the known pKa 435 values of arnino and carboxy groups yresent within these 436 peptides, which should not change their net charge by 437 lowering the pH from 7.2 to 5.0. Therefore, it is conceivable 438 to consider that pH 5.0 could instead alter acceptor 439 structures on the cell rnembrane, or that the increased 440 extracellular proton concentration may have a protective 441 effect against mernbrane permeabjlization. While the former 442 possibility is only speculative, because the acceptor 443 structures for Lys49 PLA,s are still unknown (Lornonte 444

et al., 2003b), the Iatter phenomenon of proton-mediated 445 mernbrane protection has been previously dernonsti ated 446

for several cytolytic molecules (Bashford et al., 1989; 447 Rostovtseva et nl , 1994) Thus, despite the fact that a low 448

TOXCON 2482-201512005-1 3; 1 1-SWAPNA-14882GXML MODEL 4 - pp ! -6

Kudo, I., Murakarni, M , 2002 Phospholipase Az enzyrnes. Ptostaglaiidins Other Lipid Mediat. 68, 3-58.

Lec, W H , de Silva Giotto, M T , Marangoni, S., Toyama, M H , Polikarpov, 1, Ganat. R C , 2001 Structural basis for low catalyiic activity in Lys49 phospholipase Az-a hypothesis: the crystal stiucture of piratoxin 11 cornplexed to fatty acid. Biocheiuistr y 40, 28-36

Lomonte, B., Gutiérrez, J M., 1989 A new muscle damaging toxiri, myotoxin TI, from the venoln of the snake Bothrops asper (terciopelo). Toxicon 27, 725-733

Lomonte, B , Moreno, E , Tarkowski, A , Hanson, L A , Maccarana, M , 1994. Neutrafizing interaction between heparins aiid myotoxin II, a Lys-49 phospholipase A2 from Bothrops nsper snake venom: identification of a heparin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic pcptides and molecular modeling. J. Biol Chein. 269, 29867-29873.

toinonte, B , Pizarro-Cerda, J., Angulo, Y , Gorvel, J P., Moreno, E , 1999a. Tyr -tTrp-substituted peptide 1 15-129 of a Lys49 phospholipase A2 expresses enhanced inembrane- dainaging activities and reproduces its in vivo myotoxic effect. Biochim Biophys. Acta 146 1, 19-26.

Lonionte, B , Angulo, Y , Rufini, S., Cho, W , Giglio, J R , Ohno, M , Daniele, J.J., Geoghegan, P , Gutiérrez, J.M., 1999b. Comparative study of the cytolytic activity of inyotoxic phospholipases A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal muscte (C2C12) cells in vitro Toxicon 37, 145-158

Lomonte, B , Ang~ilo, Y , Santamaría, C , 2003a. Coinparative study of synthetic peptides corresponding to region 115-129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from siiake venoms. Toxicon 42,307-3 12

Lomonte, B , Anguio, Y , Calderón. L . 2003b. An overview of lysine-49 phospholipase A2 myotoxins frorn crotalid snake venonis and their structural determinants of myotoxic action Toxicon 42, 885-901

Magro, A.J, Soares, A M , Giglio, 3 R , Fontes, M.R.M. 2003 Crystal structures of BnSP-7 and BiiSP-6, two Lys49-pho- spholipases A2: quatcrnary structure and inhibition mechanisin insights Biochein Biophys Res Commun. 31 1, 7 13-720.

Maraganore, J M , Merutka, G , Cho, W , Welches, W , Kezdy, F J , Heinnkson, R L , 1984 A new class of phospholipases A2 with lysine iri place of aspartate 49. 3 Biol Chein 259, 13839- 13843

Núñez, C E , Angulo, Y , Lomonte, B., 2001 Identification of the myotoxic site of the Lys49 phospholipase A2 froin Agkistroclori pis~ivorns p i s c i i ~ r w snake venon-i: synthetic C-terminal peptides from Lys49, but not from Asp49 myotoxins, exert membrane-damaging activities. Toxicon 39, 1587- 1594

Páramo, L , Lomonte, B., Pizarro-Cerdá, J., Bengoechea, f A , Gorvel, J.P , Moreno, E , 1998. Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2 from Bothrqx usper snake venom: synthetic Lys49 myotoxin Ii (1 15-129)-peptide identifies its bactericidal region. Eur. J. Biochem. 253,452-461.

Rostovtseva, T.K., Bashford, C.L., Lev, A.A, Pasternak, C A , 1994 Triton channeIs are sensitive to divalent cations and protons. J. Membr. Biol. 141, 83-90

Scott, D.L., Achari, A , Vidal, J.C., Sigler, P.B , 1992. Crystal- lographic and biochemical studies of the (inactive) Lys-49 phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon piscivorus piscivunts J B iol. Chem. 267, 22645-22657.

Six, DA., Dennis, E.A., 2000. The expanding superfamily of phospholipase A2 enzymes: ciassification and cha acterization 637 Biochim. Biophys. Acta 1488, 1-19 63 8

Soares, A M , Fontes, M R.M., Giglio, 3 R., 2004 Phospholipase A2 639 myotoxins from Rothrops snake venoms: structure-function 640 relationship. CUIT Org. Chem. 8, 1677- 1690

Staros, J V , 1982 N-hydroxysuIfosuccinimide active esters: bis(N- 64 1

hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are 642

hydrophilic, mernbrane-irnpcrrneant. protein cross-linkers Bio- 643 cheinistry 21, 3950-3955 644

Traub, P , Mizushima, S , Lowry, C V , Nomura, M., 1971 645 Reconstitution of ribosomes from subribosomnl components. 646 Methods Eiizymol. 20, 39 1-417. 647

Ward, R.J., Chioato, L., de Oliveira, A H C , RuIIer, R , Sá, J M , 648 2002. Active-site mutagenesis of a Lys49-phospholipase A2: 649 biological and membrane-disrupting activities in the absence of 650 catalysis Biochem 3 . 362, 89-96

65 1

7'0XCON 2482-20/5/2005-13: 11-SWAPNA-148824-XML MODEL 4 - pp 1-6

CEI-I, HlOCHEMIS 1 KY ANII FUNC'I ION

Cell Biocheln F l l ~ t ~ t (in press) Published online in Wiley Intei-Science (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1027/cbf 1208

Differential susceptibility of C2C 12 myoblasts and myotubes to group 11 phospholipase A2 rnyotoxins from crotalid snake venorns

Yümileth ~ n ~ u l o ' ? ~ and Bruno ~omonte ' * ' I/istituto Clodotniro Picado, Fcicultacl de Microbiologícr, Urtiversiliad (le Costa Rica, San José, Cosfa Rica '~epnrt(urzento (le Bioqzrárica, Esc.ltela de Medicina, Universidad de Cosfa Rica, Sarz José, Costn Riccr

Group 11 phospholipase A2 (PLA2) rnyotoxins isolated from Viperidaelcrotalidae snake venoms induce a rapid cytolytic effect upon diverse cell types in vitro. Previous studies suggested that this effect could be more pronounced on skeletal muscle myotubes than on other cell types, including undifferentiated myoblasts This stitdy utilized the rnurine skeletal miis- cle C2C12 cell line to iiivestigate whether diffcrentiated rnyotubes are more susceptible than inyoblasts, and if this chaiac- teristic is spccific for thc group 11 niyotoxic PLA2s. The release of lactic dehydrogenase was quantified as a measure of cytolysis, 3 h aftcr ccll expnsure to dif'ferent group 11 PLA2s purified froni Bothrops cisper, Atropoides n~a>unifer, Cerrophi- dion gadfnatti, and Bothr-iechis schlegelii vcnoms. In üddition, susceptibility to lysis induced by synthetic mefittin and group 111 PLA2 fsoni bcc (Apis rnellifer-ci) venoin, as well as by aiiionic, cationic, and neutral detcrgents, wris comparatively eval- uated on the two cultures Myotubes were significantly more susceptible to group 11 PLA2 myotoxins, but not to the othcr agcnts tcstcd, undcr the s:imc conditions. Moieovcr, the increased siisceptibility of lnyotubes over niyoblasts was also demonstrated with two cytolytic synthetic peptides, derived from the C-terminal region of Lys49 PLA2 myotoxins, that reproduce the action of their parerit proteiils. These results indicate that fusion and differeiitiation of myoblasts into myo- tubes induce changes that render these cells more susceptible to the toxic niechanism of groiip 11 PLA2 rnyotoxins, but not to general perturbations of mernbrüne hoineostasis. Such changes are likcly to involve myotoxin acceptor site(s), whicti iernaiii(s) lo be identificd. Copyright KJ 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

KEY WORDS-niyoblast; myotiibe; skeletal muscle; phospholipase AZ; myotoxin; snake venom

INTRODUCTJON

Phospholipases A2 (PLA2; EC 3.1.1.4) are major com- ponents of snake venoins that have acquired a variety of toxic activities during evolution, including myo- toxic, neurotoxic, cytotoxic, anticoagulant, and il~flammatogenic effects. ' " Two structural groups of PLA2s have been ctistinguished in snake venoms: those from species of the Elapidae farnily belong to group 1, which also includes the pancreatic PLAzs of inammals, whereas those from ViperidaelCrotali-

* Coircspondcnce to: Di B. Lomonte, Instituto Clodomiio Picado, Faciiltad (le Miciobiología, Univcisidad dc Costa Rica, San José, Costa Rica Fax: (+506) 292-0485 E-mi l : bloiiionte@carixi.ucr ac cr

dae are classified as group IJ, together with rnamrna- lian secreted inflammatory P L A ~ S . ~ . ~

Skeletal muscle necrosis is a drastic and frequent consequence of ~nakebites.%~otoxic PLAzs have been shown to play a rnain role in the pathogenesis of this effect, inducing a commoii pattern of degenera- tive effects leading to cell death.'"' Current evidence indicates that PLA2 myotoxins act prirnarily on the sarcolemrna, rapidly altering its permeability by either catalytically-dependent or -independent mechan- isms. 'o-'2 Howevei; the nature of the nlernbrane acceptor site(s) jnvolved in these niechanisrns, and the detailed molecular events that follow toxin bind- ing, are still unknown.

Studies using a variety of cell liiies in culture have shown that myotoxic group 1 PLAzs are not cytolytic,

Copyiight (. f i 2005 John Wilcy & Soiis, Ltd.

Keceii~ed 17 Augu~t 2004 Xeilisecl4 October 2004

Accepted 14 Octobe~ 2004

DIFF;EREN'I'IAI, SUSCEFIJBII,IrrY OF MYORLASTS A N D M Y O I U13I:S

exposed to variable anlounts of the different inyotoxic/cytolytic agents (purified groiip II nlyotoxic PLA2s, syiithetic peptides, detergents, group 111 bee venom PLA2, and synthetic melittin), in order to gen- erate dose-respanse curves. A11 agents were diluted in DMEM containing 1% FCS, and added to the cells (xnyoblasts or myotubes) after aspirating their med- ium, in a total volume of 15Opl per well. After 3 h of incubation at 37"C, supernatant aliquots were obtairied for quantification of Iactate dehydrogenase (LDH; EC 1.1.1.27) released into the mediurn, using a colorinietric end-point procedure (Sigma N0500). Reference controls for O and 100% cytolysis consisted of medium done or mediurn containing 0.1% (vlv) Triton X-100, respectively. A11 assays were carried out in triplicate.

RESULTS

Under the culture conditíons described, a large pro- portion of C2C12 myoblasts fused into myotubes within a few days of lowering the FCS concentration in the nieclium to 1%. The morphology of cells uti- lizecl as targets in this stiidy, rnyoblasts and inyotubes, is shown in Figure 1. Dose-response curves showed that the cytolytic effect of the diffesent group 11 myo- toxic PLA2s tested, in al1 cases, was significantly higher on differentiated myotubes than on rnyoblasts, as summai-ized in Figure 2. Differences in susceptibil- ity to lysis were more evident at submaximal doses of inyotoxin, i.e. 5-10pg per well, corresponding to approximate protein concentrations of 2-4 PM (Figure 2).

In contrast to the group 11 PLA2 myotoxins from snakes, both the bee venoin group 111 PLA2 and melit- tin had similar cytolytic activities on inyoblasts and myotubes, resulting in nearly superimposable dose- response curves (Figure 3). 111 similarity with these two rnyotoxic proteins from bee venom, al1 three types of detergents tested (neutral, anionic, or cationic) caused the same Iytic effect on both types of cell cul- tures (Figure 4). On the other hand, the two synthetic peptides corresponding to the C-terminal regions Lys49 myotoxic PLA2s from B. asper and A. c. lati- cinctus, respectively, were significantly more toxic to myotubes than to ~nyoblasts (Figure 5), thus mimicking the action of the whole proteins. Figure l . Light microg~aphs showing the cell morpliology of

iindiffeletitiated C2C12 myoblasts (A), and differentiated myotubes (B) utilizcd as iargets in the expcriments Aii cxainple of the

DISCUSSION cytolytic effect induced on niyoblasts after exposiire to the C-terminal synthetic peptidc (scquence 1 15-1 29) r>I A~kistrocloii

The use of skeletal iniiscle myobIasts/myotubes as lar- ronrorrrix lutici>rc~trs inyotoxin (100 ~ i g per well) is shrnvvn in C gets for group II PLAzs has been proposed as a usefiil ir1 vitro rnodel to study their inyotoxic mecllanisrn(s),

Copyiight O 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

Figure 2 Comparison oC the cytolytic activify of diffeierit grorip 11 phospholipasc A2 myotoxins on C2C 12 myoblasts (e) or myotubes ( O ) (A) Bothrops íispet rnyotoxjii 1; ( R ) R nsper n~yotoxin 11; (C) R. aspej myotoxin 111; (D) H iiqwr myoioxiii IV; (E} Atropoirfes tzummifer myotnxin 1; (F) A nirrtlin(fir inyotoxin 11; (G) Cerr.opki~lliori godt~tarii iiiyotoxin JI; ( H ) Rntlrr-iechis ~rlzlegelii myotoxin T Cytolysis was estimated by the release of lrictic dehydrogenase (LDI I ) into siipcrnataiits aftcr 3 h Maxiiiial inyotoxin doses (20 pg per well) coi respond to approx in~ate proteiri coiicetitrations of 8 Eacli point Jepresents niean f SD of triplicatc cultures

as it correlates with the muscle-dainagiiig activity observed in v i i ) ~ . ~ " ' ~ ~ ' ~ ~ h i s study investigated whether the fusiori and differentiation of C2C12 myo- blasts, renders them more susceptible to the cytolytic actiorl of gi-oup 11 inyotoxic PLA2s

An ii~creased susceptibility of the myotubes was clearly observed using a panel of eight different snake myotoxins, including both Asp49 PLA2 and Lys49 PLA2 variants. Interestingly, other types of proteins for which myotoxic action has been documentecl, such as the bee venom (group 111) PLA2, and the cationic peptide me~itt in, '~ affected botli iypes of cells iii cul-

Apis PLA2 (kglwell)

O 1 2 3 Apis melitt in (pglwell)

Figure 3. Co~i~paiison of the cytolylic activity of Apis rnelliJern groiip 111 phospholipasc A2 (A) and synthetic rnelittir~(B) o1.i C2C12 inyoblasts (e) oi myotubes (0) Cytolysis was esti~nated by \he release of lactic dehyclrogeriase (LDH) into supe1 natants after 3 h. Eacli point rcpiesenis mcan & SD of triplicate ciiltiiies

tirre to the same extent. The use of variuus detergents also demonsti-ated a similar cytolytic effect in bot1.t inyoblasts and inyotubes. Thus, the iiicreased susceyt- ibility of inyotubes to the group 11 PLA2s cannot be attributed to a possibly lower ability of these cells to cope with general perturbations of mernbraile home- ostasis. The differentiation of myoblasts into myo- tubes must lead to changes that specifically favour the action of group 11 PLA2 myotoxins It is likely that these chariges involve the expression of either a higher nurnber, or it higher affinity type, of acceptor sites for the myotoxic PLA2s on the plasma inenibrane. How- ever, the possible participation of intracellular pro- cesses arising after rnyoblast fusion, as seen i n the enhanced dainage to myotubes, cannot be excluded at this time.

Copyright ;r.l 2005 John Wiley 1(( Sons, Ltd Cell Kinchein F'icttct (i i i piess)

Detergent (%) Figuic 4 Cornpaiison of the cytolytic activity nf different deteigent types on C2C12 niyoblasts (e) or myotiibes (0) (A) Triton X- 100, neutral; (B) sodiuin dodecylsulfate, anionic; aiid (C) cetyl-trimethyl ammonium bromide, catioriic Cytolysis was estimated by the ielease of lactic dehyd~ogcnase (LDI-1) into slipciiiatanis after 3 ti Each poirit reprcsents inean SD of triplicatc cultuies

The selectivity of the myotoxic effect of venoln PLA2s in i ~ i v o has been ascribed to the existence of specific binding sites on the pIasina mernbrane of ske- letal niuscie cells, but their nature is completely unknowil. A number of high affinity protein acceptors for presynaptically active rleurotoxic PLAzs have Ixen ideiltified in neurona1 tissue.""" On the other haiid, a multidomain membrane protein of 180 kDa, known as the M-type receptor, has been characterized as ri binding site for sorne gi'oup 1 PLA2s i i i skeletal

pt 15-129 ~115-129 B asper myotoxin I I ACL myotoxin

Figure S Conipaiisoii of the cytolytic activity of two synthetic peptides corresponding to thc C-terminal regions (sequence 1 15-1 29) of Bothrops o,c;pet niyotoxin 11 (KKYRYYLKPFCKK) and Agkisfrodon cotirortrix !~rticiiicnis myotoxin (KKYKAY- FKFKCKK). rcspectively, on C2CI2 inyoblasts (m) or myotiihes (m) Cytolysis was estimated by the release of lactic dehydiogenase (LDH) into supcriiatants aftcr 3 h Peptides were assayed at 100 ~ i g per wcll, correspoiiding to appioximate pioteiii concenttations of 360 I ~ M Bars represent mean f SD of thiee deteiminations

r n i i s c~e .~~ I-Iowever, 170 evidence for the involveinent of M-type receptors in the rnyotoxic effect of group II PLA2s has been reported.

Alternatively, group II PLA2 myotoxins could be actiiig through the recognition of membrane lipids, such as glyceropliospholipids 01- glycolipids, that might be differentially expressed, or differentially clustered, in myoblasts and myotubes. Severa1 obser- vations suggest that negatively-charged phospholi- p i d s ' ~ a y be iinportant acceptors for the inyotoxic n-iechariisrn of these proteins, as recently reviewed.' In particular, the cytolytic activity denlonstrated for an all-D amino acid forní of a syii- thetic peptide derived frorn Agkistrodorz piscivor-lis piscivnr~ls Lys49 PLA2, strongly suggests that the mechanism of action of these myotoxiris does not involve 1-ecognition of a proteinaceous acceptor sjte on muscle c e ~ l s . ~ '

In the subgroup of Lys49 PLA2 myotoxins, the C-termiríal region has been identified as central for myotoxic/cytolytic activity. 20-22,39 Synthetic peptides corresponding to the sequence 115-129 of sorne of these proteins can reproduce their mernbrane-darna- ging actions and, therefore, it was also of interest to compare the susceptibility of myoblasts and rnyotubes to such peptides. The results demonstrated a higher cytolytic effect of synthetic peptides from Lys49 PLA2s on the n-iyotubes thari on the inyoblasts. Thus,

Copyiight (<) 2005 John Wiley & Sons, Ltd Cell Uiocheni fiaic! (jn press).

Y . ANGUL20 A N D B. LOMON J 1:

these C-terminal peptides behaved iri a qualitatively sirnilar fashion to their parent proteins, in agreenxent with their proposed effector role in the ineinbrane diiiiiaging mechanisiii of Lys49 PLAz inyotoxins, I 2

and furthes supporting the notion of a specific iiicreased susceptibility of rnyotubes to group 11 PLA2 inyotoxins.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by the International Founda- tion for Science (F/2766-2), University of Costa Rica (VI-74 1 -99269 and VI -74 1 -A350 1 3), CONICIT- FORINVES (FV058-02), and NeTropica Swedeii- Central America network.

We thank Dr J. M. Gutiérrez for critically reading this inanuscript.

This study was perforined in partial fulfilment of the doctoral degree of Y. Angulo at the University of Costa Rica.

REFERENCES

1 Ogawa T. Kitajiina M, Nakashirna K, Sakaki Y, Ohno M Molcculai evolution of group 11 phospholipases A? J Mol Evo1 1995; 41: 867-877

2 Kiiii Rbl. Phospholipase h2-a coinplcx miiltif~~nctioiial pio- tei ii puzzle lii Verlont f ' lro~~~~lrol i~~flse A2 E~tz)lrne.~ .5ft ~tct~lrt?, Frirrclion crnd Mrt-hcini~in, Kini RM (ed ). John Wiley bZ Soiis: Englaiid, 1997; 1-28

3 Kudo 1, Miirakiimi M. Phosplioliprise A2 enzymes Prosragl Lipid Mecl 2002; 68-69: 3-58.

4. A~ni RK, Ward RJ Phospholipase Az-a stt~icttiral review 70 i ¡con 1996; 34: 827-8 4 1

5. LValrell DA Clinicnl features of cnveiioming frorn snnke bites. Iii Erii~enomiirgs (¿)id their Trent/netrt, Bon C. Goyffoii M (4s) . Editicins Fondation Mar cel Mérieux: Lyoii, 1996; 63-76,

6 Mebs D. Owriby CL Myotoxic componcnts of snakc veiioms: thcii biochemical aiid hiological activities. Phltrnrcic Tlier 1990; 48: 223-236

7 Hairis JB. Phospholipases in siiake venoins and their effects on nerve and niuscle In Sriuke To~iris, Haivey AL (ed ) Pergainon Piess: New Yoik. 1991; 91-129.

8, GutiWreZ JM, Loinonte B Phospholipase A2 rnyotoxins frotn Rothr+ops snake venoins. fiuicon 1995; 33: 1405-1424.

9 Gutikric~ JM, Lomonte B. Phospholipase A2 rnyotoxins tiom Horlirop.~ siiake venoiiis In Venom Pho.spholi/~rr.re A7 Er:iizyrnes: Sm~c~lrrr , Func-iinri, n ~ i d Mechcirlism, Kini RM (ed.). Johii Wiley and Sons: Englaiid, 1997; 321-352.

10 Dixon RW, Wai r is JR Myotoxic activity of rhe toxic phospho- lipase, notexin, fioin the verioin of the Aiistralian tiger snake. J Nuuroprrrltol Erp Neurol 1996; 55: 1230-1237.

11. Giitiérrez JM, Ownby CL Skeletal inuscle tlcgeiicratioii iiiduced by venom phospholipases A2: iiisights into tlie incchan- isnis oC local and systemic tnyotoxici ty. Toxicon 2003; 42: 9 15- 931.

12 Lo11)onte B, Aripu\o Y, Caldei6n L. An overview of Lysirie-49 phospliolipasc A, myotoxins fronl crotalid snake veiionis arid

~hcir strtict~iral detein-iinriiits of n-iyotoxic action To<~icon 2003: 42: 885-901

13 Kii2aj 1, Riebci- AL, Ritonja A, GubeiiSek F 'The pririiary structuie of aminodytin L, a niyotoxic phospholipasc A? lionw- logudfi-om Viyeríl a~nrnot1yte.s venoi-i-i. Eur J Biot lietn 199 1 ; 202: 1 165-1 168

14. E3rus6 JL, Capnso J, Katz E, Pilar G Speciíic in i~itro biological activity of siiake vcnom myotoxins .I N e ~ r o c h ~ n i 1993; 50: 1030-1 042.

15 Buliríin E, Thelestatn M, Gutiérrez JM Effccts on cultuied inammalian cells of myotoxin 111, a pbospholipase A2 isolatcd froin Rothrops nsper (teiciopelo) venom Biochirn Biophys Acta i 993; 1179: 253-259.

16. Lomonte B, Tarkowski A, Hanson LA Broad cytolytic speci- ficity of inyotoxin 11, a lysine-49 phospholipase A2 of Rothrnl).~ n.sl?l'er snake venom. Toxicon 1994; 32: 1359-1 369.

17 lncerpi S, de Vito P, Luly P, Rufini S, Effect of ammodytin L from Viycru crrnniorlytes on L-6 cells from rat skeletal rntiscle Biochini Biophys Acta 1995; 1268: 137-1 42

18. Andriao-Escarso SH, Sonres AM, Rodrig~ies VM, et al. Myo- toxic phosphcilipases A2 in Bothrops snake venoins: effect ot cheinical ~iiodifications oii the enzymatic rind phainiacological properties of bothiopstoxins frorn Bothrops jtrrcrrilritsat Biochinrie 2000; 82: 755-763.

19 Lomontc B, Aiigiilo Y, Rufini S, et 01. Cornparalive st~tdy of the cytnlytic activity of n~yotoxic phospholipases A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal niuscle (C2C12) cells iri vitr-o Toxiton 1999; 37: 145-158.

20 Loinonte B, Moieno E, Taikowski A, Hanson LA, Maccaiaria M Neutializing interaction bctween heparins and myotoxin TI, a Lysine 49 phospholipase A* from Borhrnps nsper siiake veiiom Ideiitificatioii of a heparin-binding and cytolytic toxin iegion by thc iisc of synthetic pcptides and moleculai inodeling 3 IJiol Cher,i 1094; 269: 29867-29873

2 1 Lomonte B. Aiigiilo Y, Santnmaiía C Compatative study ot synthctic peptides coiresporiding to region 115-129 iii Lys49 myotoxic phospholipases A, from sliake venoms. ' lb~icun 2003; 42: 307-312

22 Nuñez CE, Angiilo Y, Lomonte B. Tdentification of the myo- toxic sitc of the Lys49 phospholipase A2 from Agkistroclon yiscivor~is />iscivorus snake venom: synthctic C-terminal pcp- tides frotii Lys49, but not froin Asp49 iiiyotoxins, exei-t mem- biaiie-damaging activities. 7b,kicon 2001; 39: 1587-1594

23 Bicber AL, Ziolkowski C, d'Avis PA. Raitlcsnake toxins alicr development of inuscle cells iií ciiltui e. Ariii NY Acn~f Sci 1994; 710: 126145

24 Gutiénez JM, Ownby CL, Odell GV Isolarion of a myotoxin irom Bofhrops nsper venom: partial characterization and üctiun on skeletal muscle Toxicorl 1984; 22: 1 15-1 28.

25 Loinonte B, Gutiérrez JM A new muscle damaging toxin, myotoxin 11, from the venom of the siiake Bothro[>s nsper (terciopelo) Toxicon 1989; 27: 725-733

26 Kaiser 11, Gutiériez JM, Plumrner D, Aird D, Odell GV Thc ainino acid sequence of a ii~yotoxic phospholipase fiom the venom o f Hothrops ospcr. Arcli Biochetn Biophys 1990; 278: 3 19-325

27. Díaz C, Lomonte 3, Zaniudio F, Gutiériez JM Purification anrl chatacteiizatioii o f myotoxin IV, a phospholipase Ai vaiiant, fioni Rothrops ctsper snake venom. Nntirrcll T i i m 1995: 3: 26-3 1

28 Díaz C, Gi~tiéircz JM, Loinonte B. IsoIation and characteriza- tion of bnsic myotoxiii phospholipase A2 fiom Hofl irq) ,~ god~?~li>ii (Godman's pit viper) snake venom. Arch Bioclieni Bic~pliys 1992; 298: 135-142.

Copyright 4?> 2005 John Wiley & Sons, Ltd. Cell Hiochetrt Ftaict (in press)

1)IFI:UKl~N'l'IAL SUSCEFl'IBII.ITY OF MYOB1,ASIS AND MYOfUlII3S

29. Gu~iéircz JM, Lomoiitc B, Ccidas L Isolation aiid partial cl~iracteiizntioii of B myntoxii~ froiii the venoin of the snake llnrlirops iiiarirtt$er 7i.iicon 1986; 24: 885-894.

30 Aiigiilo Y, Olnmcndi-PoitiigaI T, Possani LD, Lomoritc B. Isolaiioii nnd chal actci ization of' rnyotoxin 11 Srom Atr-opoi(le,s (Horhrops) nrrntn i f i~ siiake venorn, a new Lys49 phospholipase A? hori~oli~gue. lnt J H ~ C ) C I I C ~ / I I Ce11 Biol 2000; 32: 63-7 1.

31 Arigiilo Y, Chnvcs E, Aliipe A, Rucavado A, Guriirez JM, Loinonte B Isolation and chaiacteiizatioii of a myotoxic phos- philpase A2 fronl the venom of the arboreal snake Bofltricchis (Barlzr~~ps) schlegelii iroin Costa Rica. Arch Biocliem Biophys 1997; 339: 260-267

32 Traiib P, Mizushima S. Lowry CV, Nomuia M. Reconstitution of ribosomes froin siibribosomal companents. Metho~is Enzytnol 1971; 30: 391-417.

33 Ehisui C , Tsujinaka T, Moriinoto T, et al. Jnterleukin-6 induces piotcolysis by activating intracellulw pioteases (cathepsins 3 aiid L. proteasome) in C2C12 myotubes. Clin Sci 1995; 89: 43 1-439

34 Ownby CL, Powell JR, Jiang MS, Fletcher JE Melittin and phospholipase A2 f i o n ~ bee (Apis ~nellij'om) venom cause

neci osis oi inuriric skelctal ni~iscle in ii\po 7¿).ticon 1997; 35: 67-80

35 Laiiibeau G, Baihaniti J, Scl-iwcitz 11, Qnr J, Lazdiinski M Ideriiification aiid propeitics o i very higl-i ai'finity lirain nieiri- brane-binding sites for a i~euroioxic ~>hospholipasc iiom rhe tnipan veiiorn J Biol C l l e ~ t 1939; 264: 1 t 503-1 1 5 10

36 KriZaj I, GubenSek F. Neurorial iecepiols lor plinspliolipascs A2 and 0-neurotoxicity. Bioc~liínie 2000: 82: 807-814

37. Lambcau G, Schii-ijd-Alliana A, LazrIunski M, Baihaniii J Identifcation arid purification of a very Iiigh affinity biriding protein for toxic phospho1ipases A2 in skeleial muscle J Biol Chern 1990; 265: 9526-9532.

38. Diaz C, León G, Rucavado A , Rojas N, Schroit AJ, Gutiérrez JM. Modulation of the susccptibility of htiman erylhrocytes to snake veriom iliyotoxic phospholipases A?; role negatively charged phosyholipids as potential mernbitine binding sitcs Arch Biochern Biophys 2001 ; 391: 56-64

39. Chioato L, Ward RJ Mapping stiiictural deteiminaiits of bjo- lopical activities in snake verioin phospholipases A2 by sequence analysis and site clirected iniitagcnesis. Toticon 2003: 4 2 869-883

Copyiight d> 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

Available online at www.sciencedirect.com

ScIENcrz GDIREcT. Biochemicül Pharrnacology 66 (2003) 1993-2000

ivww elsevier coiii/locate/biochcmphai in

Inhibitory effect of fucoidan on the activities of crotaline snake venorn myotoxic phospholipases A2

Yamileth ~ n ~ u l o " ' ~ ? * , Bruno Lomonte"

"bisrituto Clodoniiro Picnilo, Facttlrnd de Microbiología, Ur~iversidud de Costa Rica, Son José, Costa Rico b~eporraniento ríe Bioquínzica, Esclrela de Medicirin, Urziversidad de Costa Rico, San José, Costa Rica

Received 25 June 2003; accepted 24 July 2003

Abstract

Myotoxic phospholipases A2 account for most of the muscle necrosis that results from envenenomation by crotaline snakes. In this study, we investigated the protective effect of fucoidan, a natural sulfated polysaccharide obtained froin the brown seaweed Fucl~s vesiciilosus, against the cytotoxic and rnyotoxic activities of a group of phospholipase A2 myotoxins from crotaline snake venoms Bothrops asper myotoxins 1, II, 111, and IV, Cerrophidio~i godmani myotoxins 1 and 11, Atropoides n~ttnmifer myotoxins 1 and 11, and Bothriechis schlegelii myotoxin 1. All of the toxins tested were efficiently inhibited by fucoidan, in both their cytotoxic and inyotoxic effects The basis for this inhibition appears to be the rapid formation of complexes between fucoidan and myotoxins, as evidenced by ti~rbidimetric analysis. The possible binding site of fucoidan on the inyotoxins was investigated using short synthetic peptides that represent the membrane-damaging region (residues 115-129) for three of these toxins Fucoidan clearly inhibited the cytolytic activity of the peptides, indicating its ability to interact with the C-tennirial inyotoxic region of these phospholipases A2 Fucoidan significantly inhibited inuscle damage in rnice, when administered locally, iinmediately after experimental etivcnoination with cmde venom from B. asper These results encourage furtlier studies of sulfated fucans as conipounds of potential use to iinprove the treatment of envenoinations by crotaline snakes O 2003 Elsevier Inc. AIl rights reserved

Key,vol.ds. Fucoidan; Myotoxin; Phospholipiise A*; Snake venorn; Iiihibition; Polysaccharide

1. Introduction

Phospholipases A2 (PLA2; EC 3.1.1.4) are ubiquitous enzymes that catalyze the hydrolysis of the sri-2 position of glycerophospholipids, leading to production of free fatty acids and 1ysophospholipids [ 1 1 . Although al1 PLA2s cat- alyze essentially the same reaction, their biologic activities vary considerably. In snake venoms, PLA2s have evolved into potent toxins with diverse specific activities such as neurotoxicity, myotoxicity, stirnulation or inhibition of plateIet aggregation, anticoagulant, hypotensive, cardio- toxic, edema-inducing 121, and bactericidal [3] effects.

Crotaline snakes (family Viperidae, subfamily Crotali- nae) are widely distributed in Amei-ica f4], comprising a large number of species which are responsible for the majority of snakebitc envenomations in this continent [5]. Myotoxic PLAzs have been described in the venoms

* Corresponding author Te1 : +506-229-0344; fax: $506-292-0485. E-rnail address yanguloC3caiiari ucr ac cr (Y Angulo) Abbrevintions: PLA2, phospholipasc A?; CK, creatine kinase; LDH,

lactic dehydrogenase

of crotaIine species from the genera Bothrops, Agkistrodon, Porthidiiinr, Trirrzeresurus, A tropoides, Crutalus, Borhr ie- chis, CaEloseEasr~za, and Cerrophidiorz E6-101, as compo- nents that have a prominent roíe in the induction of skeletal muscle necrosis. These PLA2s are structurally classified into group IIA [ l 11, belonging either to the enzymatically- active (Asp49-type) or enzymatically-inactive (Lys49-type) subgroups.

The clinical relevance of myonecrosis in snakebite envenomations has motivated the search for nonimrnune neutralizing inolecules against rnyotoxic PLA2s, including natural inhibitors of animal and plant origins [ 12- 161, that could complement conventional antivenom therapy. Among the different types of inhibitors studied, some anionic polysaccharides such as heparin have been shown to neutralize myotoxic PLA2s isolated from Bothrops jarnrncussil [17] and B. asper [18,19] venoms. On this basis, we decided to investigate if fucoidan, a compicx sulfated polysaccharide extracted from the brown seaweed Fucus vesiculosus, could inhibit the toxic activities of a group of myotoxic PLA2s frorn crotaline venoms

0006-2952/$ - see front matier O 2003 Elsevier Inc. Atl rights ieserved doi: 10 101 6lS0006-2952(03)00579-3

1994 Y Arigir lo, B ú)mor,te /Llioc hemicril Plicirmucology 66 (2003) 1993-2000

The structure of fucoidan has been characterized in detaii. The core region of the fucan is composed primarily of a polymer of a l -3-Iinked fucose, with sulfate groups sub- stituted at the 4 position on some of the fucose residues. Fucose is also attached to this polymer to form branch points, one for evc1.y 2-3 fucose residues within the chain f20,2 11. This polysaccharide mediates a variety of biological effects in niammals, including leukocyte recrujtment inhibi- tion [22], revascularization of ischemic tissue [23] , platelet aggregation 17241, collagen contraction [25], and inhibition of smooth muscle cell proliferatioii [26]. Fucoidan interacts with severa1 components of the coagulation and fibrinolysis systems, such as heparin cofactor 11, antithrombin 111, thrombin, glutamic plasminogen, tissue plasminogen acti- vator and low molecular weight-urokinase 127,281, and exerts antitumor 1291, as well as antimicrobial activities 1307.

In this study, we report and characterize the inhibitory effect of fucoidan on the cytotoxic and myotoxic activities of different myotoxic PLA2s isolated from crotaline snake venoxns, and evaluate its potential to reduce myonecrosis when rapidly administered after the injection of Bothrops usper venoni in a mouse model.

2. Materials and nietliods

2 1 lsolntinrz of niyotnxic PLA2s

Each venorn was a pool obtained froni specimens col- lected in Costa Rica and kept at the serpentarium of the Iristi tu to Clodomiro Picado. Myotoxic PLA2s were purified by cation-exchange chrornatography on carboxymethyl- Sephadex C-25 (Pharmacia, Sweden), as dcscribed: B. nsper rnyotoxins 1 [3 1],11 [32], 111 [33] and IV 1341; C. go~lrrlnrzi inyotoxins 1 and 11 [353; A. numn@"er myotoxins 1 [36] and 11 1371; and B. schlegelii myotoxin 1 /38]. Toxin homogeneity was assessed by urea-PAGE for basic proteins [39], and reverse-phase high performance Iiquid chromatography (RP-I-IPLC) on a C4 column (25 mm x 4.6 mm; Vydac), eiuted at 1 .O mLlmin with a gradient from O to 60% acet- onitrile in 0.1 % trifluoroacetic acid (vlv), using an Agilent model 1 100 HPLC system.

2.2. Irihibition of cytoloxic activity in vitro

Cytotoxic activity of the purified PLAzs and its inhibi- tion was assayed on murine C2C12 skeletal rnuscle myo- bIasts (ATCC CRL-1772) grown in 96-weII plates, as described [40]. Toxins alone, or mixed with fucoidan (n-iolecular mass 135 kDa; Sigma) at different molar ratios, were incubated for 30 rnin at room temperature. Then, aiiquots of 150 pL (containing 30 pg of toxin in DME medium) were applied to the cultures, after aspirating their growth medium (DME with 15%, v/v fetal calf serum). After 3 hr of incubation at 37", lactate dehydrogenase (LDH; EC l . 1.1.27) reIeased to supernatants was deter-

mined with a colorimetric procedure (Sigma 500C). Refer- cnce controls for O and 100% cytotoxicity consisted of medium alone and mediurn containing 0.170 (vlv) Triton X-100, respcctivcly. Additional controls consistcd of cells iiícubated with fucoidan in the abscnce of toxins Assays were carried out in triplicate.

2.3, Time-course of the inhibition of B. nsper niyotoxin II

In order to determine the time required for the inhibition of cytotoxicity by fucoidan, B. nsper myotoxin 11 alone, or mixed with fucoidan at a 1 : 1 molar ratio, was incubated for 5,10,15, or 30 min, at room temperature. Then, cytotoxicity was quantified on the C2C 12 cultures, as described above.

2.4. Inhibition of the cytotoxic activity of synthetic peptides of Lys49- PLA2s

Three synthetic peptides corresponding to the C-term- inal regions (sequence 1 15-129) of B. asper myotoxin II (KKYRY YLKPFCKK), Agkistrodon piscivorus piscivorus Lys49-PLA2 (KKYKAYFKLKCKK), and A. contartrix laticinctus myotoxin (KKY KAYFKFKCKK), respectively, have been shown to exert direct cytotoxic activity upon C2C12 cultures, therefore rnimicking the effects of their parent toxins [4 1,421. These peptides, either alone (1 00 pg/ 150 pL) or mixed with fucoidan at a molar ratio of 0.25 (fucoidanlpeptide), were incubated for 30 min at room ternperature, and then applied to the C2C12 cultures to assay for cytotoxicity, as described above.

2.5. Inhibition of lnyotoxic activity in vivo

Myotoxic activity of the PLA2s was estimated by deter- mining the plasma levels of creatine kinase (CK; EC 2.7.3.2) in groups of four CD-1 mice (1 8-20 g body weight), after an intramuscular injection (in the gastrocnemius) of 75 pg of each toxin, either alone, or preincubated with fucoidan at a I : 1 molar ratio for 30 min at room temperature. Control groups received an identical injection (100 pL) of PBS, pH 7.2 afone, or fucoidan alone. In addition, inhibition of the rnyotoxic activity of whole B. asper venorn by fucoidan was tested similarly, using a venom challenge dose of 50 pg. After 3 hr, blood samples were collected from the tail into heparinized capillary tubes, and the plasma CK activity was determined by a kinetic assay (Sigma CK- 10). Activity was expressed as U/L ( 1 unit defined as the amount of enzyme wllich produces 1 pmol of NADHlmin at 30").

2.6. Inhibition of myotoxicity in vivo by locally advzinistered filcoidnn

Three groups of four mice received an intramuscular injection of crude B. asper venom (50 pg) in the gastrocne- mius. In two of the groups, this was followed immediately by

an injection of fucoidan (90 or 270 pg) at the süme site. Assuming that the venom contriins 20% of myotoxins by weight, these fucoidan amounts would represent approx- imate molar ratios of 1 : 1 and 3: 1 (fucoidanlinyotoxin) Control animals received PBS alone, or fucoidan alone. Myonecrosis was estirnated as described, 3 hr after vcnoni injection. Al1 in vivo experiments were approved by the University Committee o11 Animal Use and Care.

2.7. Yhospholipase A2 activity

PLA2 activity of two Asp49-type myotoxins (B. nsper myotoxins 3. and 111) was determined using micellar egg yolk phospholipids (suspended in 0.1 M Tris-HCI, 0.01 M CaC12, pH 8.5) as substrate, in the presence of 1% (v/v) Triton X-100. Toxins (10 pg), either alone or preincubated with fucoidan at different molar ratios for 30 min at room temperature, were added to 1 mL of substrate. After an incubation of 15 min at 37", the free fatty acids were extracted and titrated with 0.018 M NaOH, as described by Dole [43]. Controls consisted of substrate with PBS, or substrate with fucoidan. Assays were carried out in triplicate.

2.8. Fornicztion of ~izncronioleculnr conlplexes between fucaihn nnd R. nsper nzyotoxins

Complex formation between fucoidan and B. nsper myotoxins 1-1V was assessed by turbidimetry, as prc- viously described [19]. Two-hundred ~ t g of each toxin were added to 2 mL of Tris-KC10.01 M, pH 7.0, followed by consecutive additions of 1 pL of fucoidan (20 mg/mL) to give different final ratios of fucoidan/myotoxin, After each addition, the mixtures were incubated for 1 mi11 before reading the absorbance at 340 nm.

Competition between fucoidan and rabbit antibodies against the C-terminal region 1 15-129 of myotoxic PLA2s [44], for simultaneous binding to B. asper myotoxin 11, was evaluated using an enzyme-immunoassay. Microplates (Dynatech Laboratories) were coat ed with B. asper myo- toxin 11 at 0.4 pg per well, by overnight incubation in O. 1 M Tris 0.15 M NaCI, pH 9 0 buffer. After five washing with solution A (O 05 M Tris, 0.15 M NaC1,20 pM ZnCl?, 1 mM MgC12, pH 7.4), varying dilutions of the rabbit serurn to region 1 15-129 were added to triplicate wells, diluted in solution A containing 2% (wfv) BSA, and incubated at 4" for 24 hr. A parallel set of rabbit serum dilutions was incubated in the presence af 500 pg per well of fucoidan. After five washings with solution A, bound antibodies were detected with an antirabbit inmunogIobulin-alkaline phos- phatase conjugate (Sigma), diluted 1:2000 in solution A-BSA, and incubated for 1 hr. After washing as described, color was developed with p-njtrophenylphosphate, and

absorbances were recorded on a microplate reader (Labsys- tems Multiskan RC) at 405 nm. Normal rabbit serum was utilized as a negative control.

3. Results

Fucoidail inhibited the cytotoxic activity of al1 the myotoxic PLA2s tested, although with some quantitative variations among the~n. B. nsper- myotoxins I I and IV, A. nuntmifer myotoxins 1 and If , C. godrnani myotoxins 1 and 11, and B. schlegelii myotoxin 1 were completely inhibited by preincubation with fucoidan, whereas the activity of B. clsper myotoxins 1 and IU was reduced by 50-65%, at a I : 1 molar ratio (Fig. 1). Toxin inhibition, as evaluated by LDH release, was consistent with microscopic observations of cell culture morphofogy. Fucoidan alone, at the maximal concentrations utilized in inhibition experiments, did not alter cell morphology, and did not cause LDH release.

Fucoídanlmyotoxin molar ratio

Fig 1 Inhibition of the in vitro cytotoxic activity of myotoxic phospholipases A2 by fucoidan Cytotoxicity was determined by the release of Inctnie dehydiogeniise (LDH) from C2C12 skeletal muscle myoblasts, 3 hr after exposuie to myotoxins (30 pg), either done or preincubated wi!h fucoidan at the indicaled molar ratios, as described in Section 2. (A) B aspel myotoxins 1 (e), 11 (m), 111 (A), and IV (+). (B) C. godniani rnyotoxins 1 (0) and 11 (u), A nummifer rnyotoxins I (A) and 11 (O), and B. schlegelii myotoxin 1 (O). Each point represents the mean k SD of triplicate culiures

O 5 10 15 20 25 30

Time (min)

cytotoxic activity. As shown in Fig, 2, tlie action of fucoidan was very rapid, with a complete toxin inhibition achieved within only 5 mjn of incubation at room tem- perature, before the application of thc mixture t o ceil cultures. Thcse results are in agreement with the rapid forrnation of macromolecular complexes between fucoidan and B. clsper myotoxins 1, 11, 111, and IV, as observed by turbidimetry assays. Addition of fucoidan to these toxins in solution resulted in a rapid increase of turbidity at 340 nm, indicating the formation of insoluble complexes (Fig. 3). These complexes caused maximal turbidity at a molar ratio of approximateIy 0.1 : 1 (fucoidan/myotoxin), and subse- qucntly redissolved by the gradual addition of a polysac- charide excess (Fig. 3).

The possible interaction site of fucoidan on the myotoxic PLA2s was investigated by a solid-phase competition

Fig. 2. Timc-course of [he inhibition of the in vilyo cylotoxic activity ofB. binding assayy and by the use of cytolytic 'ynthetic pep- urpsr myotoxin 11 by fucoidan. Cytoloxicity \vas determined by the release tides- In the former test, the presente of fucoidan caused a of Iactiite dehydrogenase (LDH) from C2C12 cells, 3 hr after exposure to sjgnificant reduction in the binding of rabbit antibodies nlyotoxin 11 (30 klg) done (time 0) or preincubated with fucoidan at n 1:l towardS the C-terminal 1 15-129 of B. usper niyo- inolar ratio, for the iiidicnted periods of time Each point represents mei\n -Ir SD of rriplicate cultures

toxin 11, to immobilized myotoxin II (Fig. 4). In addition, cytotoxicity experiments showed that the activity of three cytolytic synthetic peptides, corresponding to the region

Fucoidan pretreatment of the cells, folIowed by washing 115-129 of diffcrent myotoxic PLA2s, was completely with medium, and subsequent exposure to the toxins, did inhibitcd by their preincubation with fucoidan (Fig. 5 ) . not inhibit their cytolytic activity (data not shown) Using the two Asp49-type PLAzs from B. asper (myo-

B. asper myotoxin 11 was selected to study the time- toxins 1 and III), the possiblc inhibition of their catalytic course of the inhibitory effect of f~icoidan upon its in vitr-o activity by fucoidan was iiivestigated When fucoidan was

Fucoidanlmyotoxin molar ratio

Fig. 3 Formation of macromolecular complexes between fucoidan and B osper myotoxins Two-hundred pg of B. asper rnyotoxins 1 (A), 11 (B), 111 (C) or IV (D) were added to 2 rnL of Tris-KCI 0 01 M. pH 7 0, followed by consecutive sdditions of 1 ~ I L of fucoidan (20 mg/mL) to give the indicated final ratios of fucoidaiilmyo~oxin Afier each addition the mixtures were incubated for 1 min before reading the absorbance at 340 nm.

Serum dilution

Fig 4. Competition between antibodies tu peptide 115-129 and fucoidan for binding to immobilized B. usper myotoxin 11. Binding of rabbit nntibodies raised against the C-terminal region of B asper myotoxin 11 ( 1 15-129) wns tested by enzyme-immunoassay, using microplates coated with myotoxin 11, as described in Section 2. Varying dilutions of the rabbit immune serum were tested eithcr alone (O) or in the presence of 500 pg per well of fucoidan (O). Normal rabbit serum (A) was included as a negative control Each point represents the mean SD of tripiicaie wells.

incubated with these toxins, up to a molar ratio of 2:l (fucoidan/rnyotoxin), their PLA2 activity was identical to that of the control toxins incubated without fucoidan, evidencing that this enzymatic activity was not inhibited by fucoidan (data not shown).

pAcl

LDH release (%)

Fig. 5. Inhibition of ihe in vifro cytotoxic activity of synthetic peptides 115-129 of myotoxic phospholipases A2 by fucoidan. Cytotoxicity was determined by the release of lactate dehydrogenase (LDH) frorn C2C12 cells, 3 hr after exposure to synthetic peptides (100 pg) representing the C-terminal iegion 1 15-129 of B. asper myotoxin 11 (pl15F). Agkistrodon piscivorus piscivorus Lys49 phospholipase A2 (pAppk), and A. contortrix luticirtctus myotoxin (pAcl), either alone (filled bars) or preincubated with fucoidan (empty bars) at a 0.25 molar ratio (fucoidanlpeptide). Peptide sequences are described in Section 2. Each bar represents the mean & SD of triplicate cultures.

C. godmani M t 11

A. nummifer Mt II

A. nummifer Mt 1

B. asper Mt IV

B. asper Mt III

B. asper Mt 11

B. asper Mt I

B. asper venom

O 25 50 75 100 125

Plasma CK activity (%)

Fig. 6. Inhibition of the in vivo myotoxic activity of phospholipases A2 and crude B. asper venom by fucoidan Myotoxins (75 kig) or crude B asper venom (50 pg) were injected intramuscularly, either alone (filled bars) or preincubated with fucoidan (empty bars) at a I:I molar ratio, as described in Section 2 After 3 hr, plasma creatine kinase (CK) levels were determined Values are expressed as a percentage of the CK activity resulting from the injection of each toxin (or venom) done One-hundreci percent values varied from 2105 to 4223 U/L. The plasma CK values of mice receiving a PBS injection done were subtiacted in al1 cases Eiich bar represents the mean 3z SD of four ailimals

The inhibition of rnyotoxic PLA2s by fucoidan was subsequently examined in vivo, by estimating skeletal muscle damage through the increase of plasma CK leveis in mice. Data summarized in Fig. 6 show a clear reduction

Fuc 1 V 3:l

Fuc / V 1:t

Venom

PBS

Plasma CK activity (UIL)

Fig, 7. Inhibition of the in vivo myotoxic activiiy of crude B asper venom by independent local injection of fucoidan Venom (50pg) was injected intramuscularly into three groupc of mice, two of which received irnmediately an injection of fucoidan (90 pg, FuclV 1:l; or 270 pg, FucN 3:1) at the same site A control group received an injection of PBS, pH 7 2 done After 3 hr, plasma creatine kinase (CK) levels were determined Bars represent ihe mean f SD of four animals. The values corresponding to FucN 1: 1 and FucN 3:l are significantly lower ( P < O OS) than those of the venoin group

in the plasma CK activity induced by al1 toxins tested, after their incubation with fucoidan at a 1:l molar ratio. Although there are minor quantitative differences between toxins, irihibitions varied between 70 and 95% (Fig. 6). Accordingly, fucoidan also inhibited the rnyotoxic action of crude B. nsper venom, in these preincubation experi- ments (Fig. 6). Injection of fucoidan alone did not increase plasina CK values above those of control animals receiving a PBS injection (data not shown).

Finalfy, the protective effect of fucoidan was evaluated jn independent administration tests, in which the polysac- charíde was injected locally, immediately after an intra- muscular challenge with B. asper venom in mice. Fucoidan administration significantly reduced the extent of myone- crosis, resulting in CK values that corresponded to approxi- rnately 50% of those of the control group receiving venom done (Fig. 7). A 3-fold increase in the dose of fucoidan administered in situ (from 90 to 270 pg) did not improve the leve1 of protection (Fig. 7).

4. Discussion

Within the Iast decade, a growing number of inhibitors of snake venom myotoxic PLA2s have been reported, ranging from animal plasina proteins [12-141 and poly- saccharides [17-191, to plant components [15,4S]. Together with the gradual advances in our understanding of the molecular determinants and mechanisms of action involved in the toxic effects of myotoxins, the search for efficient inhibitors might lead to a significant improvement of snakebite treatment, in addition to conventional anti- venom therapy, in the future.

The discovery of enzymatically-inactive Lys49 PLA2 variants in the venoms of crotalines [46,47] prompted the search for a toxic site in these proteins, not necessarily related to the known catalytic site of PLA2s. Current evidence indicates that the C-terminal region of Lys49 variants, combining cationic and hydrophobic amino acids, constitutes a key determinant for their myotoxic activity 11 9,41,44,48,49]. Thus, polyanionic molecules with the ability to bind to this toxic site constitute rational candi- dates for evaluation of myotoxin inhibitory activity.

The present study focused on fucoidan, a complex sulfated polysaccharide extracted Irom marine algae. Although sharing some biological properties with heparin, sulfated fucans constitute aIternative polyanionic mole- cules with a range of different pharmacological profiles [50]. Using a group of myotoxic PLA2s purified from different crotaline venoms, it was demonstrated that fucoi- dan efficiently inhibits both their cytotoxic (in vitro) and rnyotoxic (in vivo) effects. Moreover, in the case of two catalytically-active (Asp49) PLA2s, fucoidan inhibited their toxic actions without affecting their ability to hydro- lyze phospholipids. This result further exernplifies the dissociation between toxicity and catalysis jn the family

of class 11 Asp49-type myotoxins, reported in a number of previous studies [7,18,5 1,523.

The inhibition mechanism of fucoidan against myotoxic PLAzs appears to be the rapjd formation of complexes, probably mediated through multivalent, electrostatic inter- actions between the anionic sulfates of the polysaccharide and the niimcrous cationic residues of the toxins, which have highly basic isoelectric points. Reversible cornplex forrnation was evidenced by turbidimetry xneüsurements, where the Iight scatteríng properties of the fucoidan/myo- toxin mixtures varied according to the relative proportions of these two interacting components, resulting in typical bell-shaped absorbance curves.

The possible binding site of fucoidan on the myotoxins was investigated using short synthetic peptides that repre- sent the membrane-damaging region (residues 1 15-1 29) for three of toxins 1423. Fucoidan clearly inhibited the cytolytic activity of the three synthetic peptides, demon- strating its ability to interact with the C-terminal myotoxic region of these phospholipases As. Further support to this conclusion was provided by cornpetition binding data iising antibodies raised against the synthetic peptidc 1 15-129 of B. asper myotoxin 11 [U]. Binding of these antibodies to the immobilized toxin was reduced in the presence of fucoidan. The region 1 1 5-1 29 of Lys49 myo- toxic PLA2s, such as B. asper myotoxin 11, was previously shown to constitute a heparin-binding site, and to be involved in its cytolytic action in vitro [19,41) In this rcgard, fucoidan appears to act in a similar mode as heparin [19], in agreement with their common polyanionic nature, provided by a high density of sulfate substituents. How- ever, it should be noted that the density of negative charges on a polysaccharide backbone is not the only factor determining jts ability to interact with the rnyotoxic PLA2s, For example, the binding of chondroitin sulfate and der- matan sulfate to B. nsper myotoxin II is weaker than the binding of heparan sulfate, although the Iatter is less sulfated 11 91, highlighting the contribution of the type of polysaccharide backbone upon an optimal interaction with proteins. Therefore, it was of interest to characterize and evaluate the inhibitory activities of fucoidan against myotoxic PLA2s.

Using the crude venom of B. nsper, the ability of fucoidan to inhibit muscle damage when administered locally, immediately after cnvenomation, was evaluated in mice, Under these conditions, fucoidan injection par- tially decreased the myonecrosis induced by the venom, to a leve1 of approximately 50% of that of untreated animals. Thus, its efficiency is clearly limited in experiments that resernble the actual situation of a snakebite, although a 50% reduction in muscle damage is stiti a considerable benefit. A major limitation for the development of any clinically effective inhibitor for myotoxins is the dramatic rapidity by which these proteins affect skeletal muscle, as recorded by intravital miscroscopy techniques [53]. The high molecular weight of the fucoidan (135 kDa) may also

be a factor that cou1d limit its distribution and diffusion in the tissue. Furthcr characterization of fucoidan fragments of lower mass, or of different types of sulfated fucans obtained from a varicty of natural sources 150) might be of interest in the search for a clinically usefui, optimaI inhibitor of myotoxic PLA2s from snake venoms.

Acknowlcdgments

We thank the fnternational Foundation for Science (F/ 2766-21, Consejo Nacional para Investigaciones Cíen- tíficas y Tecnológicas (CONICIT) of Costa Rica (FV- 058-02), Vicerrectoría de Investigación, University of Costa Rica (VI-741-99269 and 741-98518), and the Ernbassy of Japan in Costa Rica, for generous support to these studies. We also thank Prof. Mats Wahlgren (Karolinska Institute, Sweden) for introducing us to the study of fucoidan, and Drs. José María Gutiérrez and Alberto Alape for critica1 review of the manuscript. This work was performed in partial fulfillment of the doctoral degree of Y. Angulo at the University of Costa Rica.

[ i ] Kudo 1, Muraknini M. Phospholipase A2 enzymes Prostagl Lipid Mcd 2002;68/69:3-58

[2] Rosenberg P Phospholipases. ID: Shiet WT, Mebs D, editors Hand- book of toxinology. New York: Marcel Dekkcr; 1990 p 67-277

[3] Páramo L, Lonionte B, Pizarro-Cerdá J, Beiigoechea JA, Gorvel JP, Moreno E BactericidaI activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phos- pholipases A2 froin Bothrops asper snake venom: syiithetic Lys49 myotoxin 11-(115-129)-peptide identities its bactericidal region Eirr J Biochern 1998;253:452-61.

[4] Caiiipbell JA, Lamar WW The venomous reptiles of Latin America New York: CorneH University Ptess; 1989 p 1-425

[ S ] Gutiérrcz JM Clinical toxicology of snakebitc in Central Arncrica In: Meier J, White J , editors Handbook of clinical toxicology of animal vcrioms and poisons Boca Raton, FL: CRC Press; 1995. p 645-65.

(63 Mebs D, Owiiby CL Myotoxic componenls of snake venorns: their biochemical and biological activities. Pharrnacol Ther f997;48: 223-36

171 Gutiérrez JM, Lomonte B. Phospholipase A2 myotoxins frorn Bo- throps snake venoms. In: Kini RM, editor. Venom phospholipase A2 enzymes: structure, function, and mechanism. Chichester: Wiley; 1997. p 321-52.

181 Nakashima K, Nobuhisa 1, Deshin~aru M, Nakai M, Ogawa T, Shimohigashi Y, Fukumaki Y, Hattori M, Sakaki Y, Hattori S, Ohno M Accelerated evolution in the protein-coding regions is universal in crotalinae snake venorn gland phospholipase A2 isozyme genes Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:5605-9

[9] Soares AM, Rodrigues VM, Homsi-Brandeburgo MI, Toyama MH, Lornbardi FR, Ami RK, Giglio JR A rapid procedure for the isolation of the Lys-49 myotoxin 11 from Bothrops rnoojeni (caissaca) venom: biochemical characterization, crysta\lization, mynloxic and edernato- gctiic activity. Toxicon 1998;36:503-I4

[lo] Tsai IH, Chen YH, Wang YM, Tu MC, Tu AT Purificarion, sequen- cing, and phylogenetic analyses of novel Lys-49 phospholipases A2 from the venoms of rattlesnakes and other pit vipers. Archs Biochem Biophys 2001 ;394:236-44.

1111 Six DA, Dennis EA The expanding superfamily of phospholipase A2 ertzyrnes: clrissification and charac~erization. Biochim Biophys Acta 2000;1488: 1- 19

[12] Nobuhisa 1. Chiwata T, Fukuinnki Y, Hattori S, Shimohigashi Y, Ohno M Structuriil elemcnts of T~imeresurtts Jlovoviridis serum irihibitots for recognition of its venorn phospholipnse A2 isozyrnes FEBS Lctt 1998;429:385-9.

[13] Lizano S, Angulo Y, Loniontc B. Fox JW, Larnbcou G, Lazdunski M, Gutiérrez JM Two phospholipnse A2 inhibitors from the plasma of Cerrophiriiori (Bothrops) gorhnc~ni which selectivel y inhibit two dif- ferent group 11 phospholipase A2 nlyofoxins from its own venorii: isoIation, molecular cloning, iind biologiczil properties Biochem J 2000;346:63 1-9.

[14] Rocha SLG, Lomoiite B. Neves-Ferreira AGC, Trugilho MRO, Jun- queira de Azevcdo ILM. Ho PL, Domont G, Gutiérrez JM, Perales J. Functional analysis of DM64, an antimyotoxic protein with iminu- noglobuliii-like structure from Didelj)his rncirsicpicrlis serun] Eur J Biochem 2002;269:6052-62

1151 Deepa M, Gowda TV. Purification and characterization of a gtyco- protein inhibitor of ioxic phospholipase from Withania sutnnifera. Archs Biochem Biophys 2002;408:42-50

1161 Armda EZ, Silva NMV, Moraes RAM, Melo PA Effect of suramin on myotoxidty of some crotalid snake venoms. Braz J Med Biol Res 2002;35:723-6.

1171 Melo PA, Hornsi-Brandeburgo MI, Giglio JR, Suarez-Kurtz G . An- tagonism of the myotoxic effect of Bathrops jararacuss~t venom and bothiopstoxin by polyanions Toxicon 1993;3 1 :285-91.

1183 Lomonte B, Tarkowski A, Bagge U, Hanson LA. Neutralization of the cytolytic and myotoxic activities of phospholipase A2 fon i Bothrups asper snake venom by glycosaminoglycans of the heparinheparan sulfate family, Biochem Pharmacol 1994;47: 1509-1 8.

1191 Lomoiite B. Moreno E, Tarkowski A, Hanson LA, Maccarana M Neutralizing interaction between heparins and myotoxin 11 a Lys-49 phospholipase A2 from Bothrups aspe) snake venom ldentification of a hepalin-binding and cytolytic toxin region by the use of synthetic peptidcs and molecular modeling. J Biol Chem 1994;269:29867-73

1201 Patankiir M, Oehniiiger S, Barnett T, Williams R, Clark G. A revised struciure for fucoidan mny explain sorne of its biologicnl activities J Biol Chem 1993;268:21770-6

[21] Nishino T, Nishioka C. Ura H, Nagumo T. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from cornmcrcial Fircns vesiculo.slts fucoidan Carbohydr Res 1994;255: 2 13-23

[22] Preobrazhenskaya ME, Berman AE, Mikhailov VI, Ushakova NA, Mazurov AV, Semenov AV, Usov Al, Nifantev NE. Bovin NY Fucoidan inhibits leukocyte recruitmenl in a model peritonent inflarn- mation in rat and blocks interaction of P-selectin with its carbohydrate ligand. Biochem Mol Biol Int 1997;43:443-51

[23] Luyt CE, Meddahi-Pelle A, Ho-Tin-Noe B, Colliec-Jouauit S, Gue- zennec J, touedec L, Prats H, Jacob MP, Osborne-Pellegrin M, Letoumeur D. Michel JB. Low-molccular weight fucoidan promotes therapeutic revascularization in a rat model of critica1 hindlinib ischemia J Pharmacol Exp Ther 2003;305:24-30.

[24j Durig J. Bruhn T, Zurborn KH, Gutensohn K, Bruhn HD, Beress L Anticoagulant fucoidan fractions from Fzlcus vesiculosirs induce pIatelet activation in vitro. Thrornb Res 1997;85:479-91

1253 Fujirnara T, Shibuya Y, Moriwaki S , Tsukahara K, Kitaharn T, Sano T, Nishizawa Y, Takema Y. Fucoidan is the active component of Fucus vesiculosus that prornotes contraction of fibroblast-populated collagen gels Biol Pharm Bull 2000;23: 1 180-4

1261 Religa P, Kazi M, Thyberg J , Gaciong Z, Swedenborg 1, Hedin U hcoidan itihibits smooth muscle cell proliferation and reduces mito- gen-activated protein kinase activity Eur J Vas Endovasc Surg 2000; 20:4 19-26

[27] Church FC, Meade JB, Treanor RE, Whinna HC Anlithrombin activity of fucoidan J Biol Chem 1989;264:36I8-23.

2000 Y Angitlo, B bmotife/BiochemicnI Phcirtnncology 66 (2003) 1993-2000

[28] Minix R. Doctor VM Interaction of fucoidan with proteases 2nd inhibitors of coagulation and fibnnolysis. Thromb Res 1997;87:419-29

{29] Koyanagi S. Taiiigawa N, Nakiigiiwa H. Soeda S, Shimeno H. Over- sulfrition of fucoidan enhances its antiangiogenic and antitumor activities. Biochem Ph;iriníico! 2003;65:173-9

[30] Zapopozhets TS, Besednova NN, Loenko IN Antibacterial and iin- rnuriornodulatirig nctivity of fucoidaii Aniibiot Khirniotcr 1995;40: 9-13

[31] Gutiérrez JM. Ownby CL, Odell GV ísolation of í i myotoxin froin Borhrops usper venom: partial charíicterzation and action on skeletal miiscle. Toxicon 1984;22: 1 15-28

[32] Lornonte 8, Gutiérrez JM A new miiscle darnaging toxin, myotoxin 11, from the venom of the snake Borhmps asper (terciopelo). Toxicon 1989;27:725-33.

[33] Kaiser 11, Gutiérrez JM, Pluinmer D. Aird SD, Odell GV The aniino acid sequence of a inyotoxic phospholipase from the venom of Borhrups asper. Arch Biocheni B iophys 1990;278:3 19-25

[34] Diaz C . Lomonte B, Zamudio E Gutiérrez JM Purification and characterization of myotoxin IV, a phospholipase As variant, from Bothrops asper snake venom. Nat Toxins 1994;3:2&3 1.

(351 Díaz C, Gutiérrez JM, Lomonte B. Isolntion and characterization of basic myotoxic phospholipases A2 from Bothrops godmani (Godman's pit viper) snake venom Arch Biochem Biophys 1992;298: 135-42

[36] Gutiérrez JM, Lonionte B, Cerdas L Isolation and partial character- ization of a myotoxin from the venoin of the snake Bothrops nurnmifer Toxicon 1986;24:885-94

1371 Angulo Y, Olamendi-Portugal T, Possani LD, Lomonte B. Isolation and characterization of myotoxin I I frorn Atropoides tiiit>irnfer snake venom, a new Lys49 pliospholipase A2 homologue Int J Biochem Cell Biol 2000;32:63-7 1

[38] Angulo Y, Chaves E, Atape A, Rucavado A, Gutiérrez JM, Loinonte B lsolation and characterizíition of a myotoxic phospholipase A2 from ihe venom of the arboreal snake Bothriechis (Bothrops) scfilegelii from Costa Rica Archs Biochein Biophys 1997;339:260-6

[39] Traiib P, Mizushimo S, Lowly CV, Nomuríi M. Reconstitution of ribosomes froin subribosonial coinponents Meth Enzymol 1971;20: 391-417

[40] Lomonte B, Angulo Y, Rufini S, Cho W. GigIio JR, Ohno M, Daniele JJ, Geoghegan P, Gutiérrez JM Cornparative study of the cytolytic activity of myotoxic phospholipascs A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletiil muscle (C2C12) cclls iri vitro Toxicon 1999;37:145-58

[41] Núñez CE, Angulo Y, Lomonte B Identification of the myotoxic site of ihe Lys49 phospholipase A2 from Agkistrocionpiscivo~irspiscivor 14s

snake venom: synthetic C-terminal peptides frorn Lys49, but no1 from Asp49 myotoxins, exeri mernbrane-damaging activities Toxicon 2001 ;39: 1587-94

[42] Loinonte B, Angulo Y, Santainaría C . Comparative study of synthctic peptides corresponding to regioii 115-129 iii Lys49 myotoxic phos- pholipnses A2 from snake venoms. Toxicon 2003, in press

{43] Dole VP Relation between rioriesterified fritty acids in plasma end thc metnbotisin of glucose J Clin Invest 1956;35:150-4.

[44] Calderón L, Lomonte B Inirnunochemical characterization and role in toxic activities of region 115-129 of myotoxin 11, a Lys49 phospho- lipase A2 from Bothrops usper snakc venom Arch Biochem Biophys 1998;358:343-50,

1451 Mahanta M, Mukherjee AK. Neutralisation of lethality, myotoxicity and loxic enzymes of Ncijli kaoirthia venom by Mimosa pitdicti root extracts J Ethnopharm 2001;75:55-60.

[46] Maraganore JM, Merutka G , Cho W, Welches W, Kézdy FJ, Hein- rikson RL A new class of phospholipases A2 with lysine in place of aspartatc 49. J Biol Chem 1984;259: 13839-43

[47] Maraganore JM, Heinrikson RL. The lysine-49 phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon piscivorus piscivorus Relation of stnicture and function to other phospholipases A2. I Biol Chem 1986; 26 1 :4797-804.

[48] Chioato L, de Oliveira AHC, Ruller R, S i JM, Ward RJ. Distinct sites for myotoxic and membrane-damaging activities in the C-terminal region of a Lys49-phospholipase A2 Biochein J 2002;366:971-6.

[49] Lomonte B, Angulo Y, Santamaría C Comparatíve study of synihetic peptides corresponding to region 115-129 in Lys49 rnyotoxic phos- pholipases A2 from snake venoins Toxicon 2003, in press

[50] Mourao PAS, Pereira M. Searching for alternatives to heparin: sulfatcd fucans from marine invertebrates Trends Cardiovasc Med 1999;9: 225-32

[SI] Lomonte B, Gutiérrez JM, Rarnírez M, Díaz C Neutralizatioti of myotoxic phospholipases A2 froin ihe venoin of the snake Bothrops asper by monoclonal antibodies Toxicon 1992;30:23945

(521 Sonres AM, And~i'?o-Escarso SH, Bortole!~ RK, Rodrigues-Simioili L, Arni RK, Waid RJ, Gutiérrez JM, Giglio JR. Dissociation of enzymatic and pharmacological propeities of piratoxins-1 and -111, two inyotoxic phospholipases A2 froin Bothrops pirajai snake venoin AI ch Biochem Biophys 2003 ;387: 188-96

[53] Lomonte B, Lundgren J, Johansson B, Bagge U The dynamics of local tissue damage induced by Bothrvps asper snake venom and myotoxin II on the mouse cremaster muscle: an intravital and electron micro- scopic study Toxicon 1994;32:41-55.