UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · Universidad Central del Ecuador para que realice...
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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÍA
Efecto antimicrobiano del aceite esencial del coriandrum
sativum (cilantro) al 25, 50 y 100% sobre cándida albicans.
Estudio in vitro.
Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la
obtención del título de Odontólogo General
Autora: Chicaiza Chiguano Myrian Elizabeth
Tutor: Dr. Viteri Moya Juan Alberto
Quito, abril 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano en calidad de autora y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de investigación “EFECTO
ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DEL CORIANDRUM SATIVUM
(CILANTRO) AL 25, 50 Y 100% SOBRE CÁNDIDA ALBICANS. ESTUDIO IN
VITRO”, modalidad presencial, de conformidad de conformidad con el Art.
114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la
Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva
para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos.
Conservamos a mi/nuestro favor todos los derechos de autor sobre la obra,
establecidos en la normativa citada. Asimismo, autorizo/autorizamos a la
Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de
este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
d ispuesto en e l Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El (los) autor (es) declara (n) que la obra objeto de la presente autorización es
original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros,
asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por
esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.
Firma:
Chicaiza Chiguano Myrian
CC. 1727500280
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Dr. Juan Alberto Viteri Moya, en mi calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por MYRIAN ELIZABETH CHICAIA
CHIGUANO, cuyo título es: “EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE
ESENCIAL DEL CORIANDRUM SATIVUM (CILANTRO) AL 25, 50 Y 100%
SOBRE CÁNDIDA ALBICANS. ESTUDIO IN VITRO”, previo a la obtención de
grado de Odontóloga, consideró que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios
en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte
del tribal examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo
investigativo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación, determinado por
la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 12 días de marzo del año 2019
DOCENTE-TUTOR
C.C. 1708461908
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dra. Carolina Santorum y Dr. Juan Pablo Jaramillo luego de
receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del título de
Odontóloga presentado por la señorita MYRIAN ELIZABETH CHICAIZA
CHIGUANO.
Con el título:
“EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DEL
CORIANDRUM SATIVUM (CILANTRO) AL 25, 50 Y 100% SOBRE CÁNDIDA
ALBICANS. ESTUDIO IN VITRO”.
Emite el siguiente veredicto:.........................
Fecha: 23 de abril del 2019
Para constancia de lo actuando firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente Dra. Carolina Santorum ................... ...........................
Vocal Dr. Juan Pablo Jaramillo .................. ...........................
v
DEDICATORIA
Dedico esté presente trabajo de investigación a mi Familia, pilar
importante en mi vida. Principalmente a mis padres Sonia y José
por apoyarme siempre en las decisiones que me han llevado
donde me encuentro ahora.
A mi Familia Materna por siempre estar cuando uno más los
necesitaba, a mi tío y primo paterno porque sin ustedes, no
podría haber continuado.
A mis amigos realizados en esta travesía “la vida Universitaria”
por apoyarme y darme ánimos y a todas aquellas personas que
confiaron en mi trabajo, que gracias a ellos saque fuerzas para
seguir.
vi
AGRADECIMIENTO
A mis Padres por siempre brindarme el amor incondicional, por
guiar mi camino, por su esfuerzo de darme la mayor herencia que
me pudieron dar la Educación.
Al Doctor Juan Viteri por guiarme en el presente trabajo de
titulación, por sus enseñanzas y tiempo, convirtiéndose en un
pilar de soporte científico y técnico, sin usted este trabajo no
podría haberse realizado.
A la Dra. Vicky Arias gracias por confiar en mí, por guiarme y
enseñarme nuevas estrategias y tips para ejercer esta hermosa
profesión, con excelencia y paciencia.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DERECHOS DE AUTOR………………………………………………………….i
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN……………...ii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN……………...iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL…………………iv
DEDICATORIA……………………………………………………………………v
AGRADECIMIENTO……………………………………………………………...vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS……………………………………………………….vii
LISTA DE TABLAS………..………………………………………………………x
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………….xi
LISTA DE ANEXOS……………………………………………………………….xii
RESUMEN…………………………………………………………………………xiii
ABSTRACT……………………………………………………………………….xiv
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………1
CAPÍTULO I………………………………………………………………………………2
1. PROBLEMA……………………………………………………………………...2
1.1. Planteamiento del problema………………………………………………………2
1.2. Justificación………………………………………………………………………..3
1.3. Objetivos…………………………………………………………………………...3
1.3.1. Objetivo General…………………………………………………………………..3
1.3.2. Objetivos específicos………………………………………………………………3
1.4. Hipótesis…………………………………………………………………………...4
1.4.1. Hipótesis de investigación H1……………………………………………………..4
1.4.2. Hipótesis nula H0………………………………………………………………….4
CAPÍTULO II………………………………………………………………………………5
2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………….5
2.1. Microbiología bucal……………………………………………………………….5
2.1.1. Cándida albicans…………………………………………………………………...6
2.1.1.1. Taxonomía………………………………………………………………………....7
2.1.1.2. Características microbiológicas……………………………………………………7
2.1.1.3. Características metabólicas………………………………………………………...8
2.1.1.4. Características genéticas…………………………………………………………...8
2.1.1.5. Factores de virulencia………………………………………………………………9
2.1.1.6. Candidiasis…………………………………………………………………………10
2.1.1.7. Clasificación Candidiásica oral…………………………………………………….11
2.2. Farmacología antimicótica…………………………………………………………13
2.2.1. Antifúngicos tópicos………………………………………………………………..14
2.2.1.1. Nistatina……………………………………………………………………………14
2.2.2. Antifúngicos sistémicos…………………………………………………………….15
viii
2.2.3. Agentes Antifúngicos alternativos………………………………………………….15
2.3. Botánica…………………………………………………………………………….15
2.3.1. Riqueza botánica del Ecuador………………………………………………………15
2.3.2. Coriandrum sativum………………………………………………………………..16
2.3.2.1. Descripción……………………………………………………………………...16
2.3.2.2. Composición química…………………………………………………………...17
2.3.2.3. Taxonomía………………………………………………………………………17
2.3.2.4. Hábitat………………………………………………………………………......18
2.3.2.5. Usos terapéuticos……………………………………………………………..…18
2.3.2.6. Efectos adversos o tóxicos…………………………………...……………..….20
2.4. Fitoterapia…………………………………………………...……………..…..20
2.4.1. Preparado fito-terapéutico…………………………………...…………..……..21
2.4.2. Aceites esenciales……………………………………………………….……...21
2.4.2.1. Propiedades físicas……………………………………………………………..21
2.4.2.2. Obtención de los aceites esenciales………………………………….…………22
2.4.2.2.1. Destilación por arrastre de vapor de agua………………………….…………..22
2.4.2.2.1.1. Descripción………………………………………………...….……………….22
2.4.2.2.1.2. Ventajas…………………………………………………...….………………..23
2.4.2.2.1.3. Desventajas……………………………………………...….………………….23
CAPÍTULO III………………………………………………………………………………24
3. METODOLOGÍA……………………………………………………………………….24
3.1. Diseño de la investigación………………………………………………………………24
3.2. Población de estudio y muestra…………………………………………………………24
3.3. Criterios de Inclusión y exclusión…………………………………………...………….25
3.3.1. Criterios de Inclusión……………………………………………………………….25
3.3.2. Criterios de Exclusión………………………………………………………………25
3.4. Conceptualización de variables…………………………………………………………25
3.4.1. Variable dependiente……………………………………………………………….26
3.4.2. Variable independiente……………………………………………………………..26
3.4.3. Variables de control………………………………………………………………...26
3.5. Definición operacional de las variables…………………………………………………27
3.6. Estandarización………………………………………………………………………….28
3.7. Manejo y métodos de recolección de la información……………………………………28
3.7.1. Recursos humanos………………………....………………………………………..29
3.7.2. Recursos utilitarios………………………………………………………………….30
3.8. Diseño de la Investigación………………………………………………………………31
3.8.1. Recolección de las semillas de coria.um sativum…………………………………..31
3.8.2. Lavado y secado de las semillas coriandrum sativum……………………………...31
3.8.3. Proceso de obtención del aceite esencial…………………………………………...32
3.8.4. Dilución de las distintas concentraciones……………………………………..……33
3.8.5. Medio de cultivo…………………………………………………………..………..34
3.8.6. Activación de la cepa…………………………………………………...…………..35
3.8.7. Patrón de turbidez de McFarland…………………………………...………………35
3.8.8. Rotulación de las cajas Petri para la posterior inoculación…………………………36
3.8.9. Inoculación bacteriana para la experimentación…………...……………………….37
3.8.10. Aplicación de las concentraciones del aceite control positivo y control negativo.....37
3.8.11. Incubación de las muestras……………………………...………………………......39
3.8.12. Medición de los halos de inhibición………………..………………………………39
3.8.13. Manejo de bioseguridad y control……………...………………………………..…40
3.8.14. Eliminación de desechos……………………………………………………………40
ix
3.9. Aspectos bioéticos………………………………………………………………………41
3.10. Riesgos potenciales del estudio…………………………………………………….41
3.11. Beneficios potenciales del estudio………………………………………………….41
3.12. Idoneidad, ética, experticia del investigador……………………………………….42
3.13. Declaración de conflicto de intereses………………………………………………42
CAPÍTULO IV……………………………………………………………………………..43
4. ANÁLISIS E INERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS………………………....43
4.1. Análisis estadísticos…………………………………………………………………....44
4.1.1. Prueba de normalidad……………………………………………………………...44
4.1.2. Prueba no paramétrica, Kruskal Wallis………………….………………………...45
4.2. Discusión……………………………………………………………………………....50
CAPÍTULO V………………………………………………………………………….…..52
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES………………………………………52
5.1. Conclusiones………………………………………………………………………….52
5.2. Recomendaciones……………………………………………………………………..52
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………….54
ANEXOS………………………………………………………………………………….58
x
LISTA DE TABLAS
Tabla No. 1 Resultados de los halos de inhibición a las 72 horas
Tabla No. 2 Resultados de Prueba de Normalidad
Tabla No. 3 Comparación entre todas las sustancias: Kruskal Wallis
Tabla No. 4 Subconjuntos Homogéneos (Resumen)
Tabla No. 5 Sensibilidad de las sustancias
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura No. 1 Recolección de la planta Coriandrum Sativum (cilantro)
Figura No. 2 Lavado y secado de la planta
Figura No. 3 Trituración de la semilla seca de la planta
Figura No. 4 Equipo de destilación por arrastre de vapor con semillas trituradas
Figura No. 5 Concentraciones de Aceite esencial de coriandrum sativum
Figura No. 6 Elaboración del Agar Dextrosa Sabouraud
Figura No. 7 Activación de la Cepa
Figura No. 8 Obtención del Patrón de Turbidez de McFarland
Figura No. 9 Rotulación de a caja Petri
Figura No. 10 Inoculación de la cepa
Figura No. 11 Colocación de los discos en cada una de las soluciones
Figura No. 12 Incubación de la muestra
Figura No. 13 Medición de los halos
Figura No. 14 Cabina de seguridad Biológica
Figura No. 15 Manejo de desechos previo a esterilización
Figura No. 16 Comparación de medias entre sustancias
Figura No. 17 Prueba no paramétrica de Krukal Wallis
Figura No. 18 Prueba dos a dos entre sustancias
Figura No. 19 Sensibilidad de las sustancias
xii
LISTA DE ANEXOS
Anexo No. 1 Factura de la compra de la cepa de Cándida Albicans ATCC®10231™
Anexo No. 2 Aceptación de tutoría.
Anexo No. 3 Coincidencia; Tema del trabajo de titulación.
Anexo No. 4 Inscripción del Tema de Tesis con Aceptación.
Anexo No. 5 Oficio a uso de laboratorio y asesoramiento de la Facultad de Química
Anexo No. 6 Oficio para uso de laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Odontología.
Anexo No. 7 Aprobación del tema en el departamento de SEISH-UCE
Anexo No. 8 Certificado de Supervisión del Bioquímico Farmacéutico.
Anexo No. 9 Certificado de calidad de la cepa.
Anexo No. 10 Recomendaciones de activación y uso de la cepa.
Anexo No. 11 Normas del manejo de desechos del Ministerio de Salud la cual se rige
en la FOUCE
Anexo No. 12 Certificado de la supervisión del Doctor del Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Odontología.
Anexo No. 13 Idoneidad, ética y experticia del investigador y tutor.
Anexo No. 14 Conflicto de interés del investigador y tutor.
Anexo No. 15 Certificado del Urkund
Anexo No. 16 Certificado de traducción del Abstract
xiii
Tema: Efecto antimicrobiano del aceite esencial del coriandrum sativum (cilantro)
al 25, 50 y 100% sobre cándida albicans. Estudio in vitro.
Autora: Chicaiza Chiguano Myrian Elizabeth
Tutor: Juan Alberto Viteri Moya
RESUMEN
Las plantas han beneficiado al hombre desde los principios del tiempo, muchas de ellas
tiene distintos usos, en cambio otras solo son empleadas en un fin, desconociendo sus
demás propiedades, por ello elegimos al coriandrum sativum (cilantro) como planta
objeto de estudio corroborando la acción antimicrobiana del aceite esencial al 25, 50 y
100% de concentración extraído de ella, frente a la cándida albicans ATCC ®10231™ ,
un microorganismo que se encuentra en la flora normal de la boca, que cuando se rompe
el equilibrio de este ecosistema puede causar enfermedades como la candidiasis y sus
variaciones.
La metodología de la investigación fue la siguiente para obtener el aceite esencial se
consiguió mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor de las semillas secas,
en cambio para determinar la sensibilidad utilizamos el método Kirby-Bauer que
consiste en conseguir el Microorganismo con su certificado de autenticidad, activarlo e
inocularlo, en cajas Petri con agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck, y colocar los discos
con cada una de las concentraciones, el control positivo que es la nistatina y el control
negativo que el suero fisiológico, en total 5 discos por cada caja Petri.
Se las incubo a una temperatura de 37ºC por 72 horas, después medimos los halos de
inhibición cuyos resultados fueron que el aceite esencial al 100% es el que tiene una
actividad antimicrobiana similar al Control positivo.
PALABRAS CLAVES: CORIANDRUM SATIVUM, CANDIDA ALBICANS,
ACEITE ESENCIAL, ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
xiv
Tittle: Antimicrobial effect of the essential oil of the coriandrum sativum
(coriander) at 25, 50, and 100% against the candida albicans. study in vitro.
Author: Chicaiza Chiguano Myrian Elizabeth
Tutor: Juan Alberto Viteri Moya
ABSTRACT
Plants have benefited humanity since the beginning of time, many of them have
different uses, while others are only used in one end, ignoring their other properties, so
we chose Coriandrum Sativum (coriander) as the plant object of study which
corroborates the antimicrobial action of the essential oil at 25, 50 and 100%
concentration extracted from it, compared to the candida albicans ATCC ®10231 ™, it
is a microorganism found in the normal flora of the mouth, when the balance of this
ecosystem is broken, It can cause diseases such as candidiasis and its variations.
The methodology of the research to obtain the essential oil, the technique of steam
distillation of dry seeds was applied, however to determine the sensitivity we use the
Kirby-Bauer method that consists of getting the Microorganism with its certificate
Authenticity, activate it and inoculate it, in Petri dishes with agar; Agar Dextrose
Sabouraud 4% Merck, and place the discs with each of the concentrations, the positive
control that is nystatin and the negative control that the physiological saline, in total 5
discs for each Petri dish.
We incubated them at 37ºC temperature for 72 hours, then we measured the inhibition
zones whose results were that the 100% essential oil that is the one that has an
antimicrobial activity similar to the positive control.
KEYWORDS: CORIANDRUM SATIVUM, CANDIDA ALBICANS, ESSENTIAL
OIL, ANTIMICROBIAL ACTIVITY
Yo, CERTIFICO que esta traducción es fiel copia del original en español.
I CERTIFY that the above is a true and correct translation from the document in Spanish.
18 Marzo/March 2019.
MSc. Nancy Jacqueline Sangoluisa Sangoluisa
TRADUCTOR/TRANSLATOR
CI:1715374276 Cel.: 0997475991
SENESCYT 1005-2016-173989
1
INTRODUCCIÓN
El Ecuador, país privilegiado rico en flora y fauna, posee gran variedad de plantas,
de las cuales desconocemos sus propiedades, especialmente sobre
microorganismos que nos causan enfermedades, como la cándida albicans que se
encuentra con frecuencia en la boca y relacionado con varias patologías fúngicas
bucales.
Existe evidencia científica gracias a investigaciones realizadas por Lalitha
mencionado que el aceite esencial del coriandrum sativum demostró ser bactericida
contra S. typhi y bacteriostático contra E. coli., esta propiedad se la atribuye al
componente principal del aceite, Linalool. (15).
Gracias a esta información nos propusimos a identificar el efecto antimicrobiano del
aceite esencial del coriandrum sativum al 25%, 50% y 100% de concentración sobre
la cándida albicans ATCC ®10231™ cultivadas en agar Dextrosa Sabouraud.
El aceite esencial se conseguirá mediante la técnica de destilación por arrastre de
vapor de las semillas secas, el Microorganismo se obtendrá en Medibac con su
certificado de autenticidad, se activará y usará el método Kirby-Bauer para
determinar la sensibilidad al aceite esencial.(40)
Las distintas concentraciones se colocarán en discos de papel, así como la nistatina
control positivo y agua destilada como control negativo, correspondiendo a 5 discos
en cada caja Petri, 15 muestras en total. Luego se colocarán en la incubadora por un
tiempo de 72 horas a 37 °C. Se Obtendrá datos midiendo el halo de inhibición de
los discos que serán registrados en el programa Excel y analizados por medio del
programa estadístico SPSS.
Con este estudio incentivaremos a nuevas investigaciones sobre plantas de uso
común y endémicas de fácil acceso, a que las Universidades del Ecuador sean
testigos de nuestro interés y puedan en un futuro aprobarnos patentes para crear
productos a base de plantas.
2
CAPÍTULO I
1. PROBLEMA
1.1.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La cándida albicans se considera como uno de los patógenos fúngicos más comunes
de los seres humanos, que pueden producir infecciones superficiales de la piel y
mucosas, incluso infecciones sistémicas, Höfs incluso aseguró que son la cuarta
causa de infecciones nosocomiales a nivel sanguíneo en los Estados Unidos (10).
Muchos investigadores le atribuyen su capacidad patogénica a la formación de
biopelículas, Pozo incluso mencionó que muchos biodispositivos médicos pueden
actuar como sustrato para el desarrollo de biopelículas (41), a nivel bucal estos
dispositivos pueden ser las prótesis removibles y totales (42).
Millsop y Patil mencionaron que existen factores locales y sistémicos que puede
conducir a que las biopelículas de cándida albicans adquieran patogenicidad entre
ellas tenemos Xerostomía, estado nutricional, consumo de tabaco, trastornos
inmunes, endocrinos y congénitos entre otros (21) (27). Por ello se ve la necesidad
de buscar alternativas de tratamiento como es el uso de productos naturales como el
aceite esencial del coriandrum sativum.
Existe ya evidencia de la acción antimicrobiana del aceite esencial del coriandrum
sativum ya que Delaquis examinó esta propiedad ante microorganismos de la
putrefacción de alimentos tanto gram positivos como gram negativos (13).
Matasyoh mencionó que la acción letal del aceite esencial del cilantro puede deberse
a su gram capacidad de romper la barrera de permeabilidad de la membrana celular
y la pérdida de control quimiosmótico (43). Existe relación entre las propiedades de
los aceites esenciales y las condiciones del suelo, el medio ambiente en donde se
desarrollaron las plantas de donde se obtienen (34).
Teniendo toda esta evidencia científica publicada en la actualidad, se requiere
conocer si ¿existirá efecto antimicrobiano del aceite esencial del coriandrum
sativum 25, 50 y 100% de concentración ante la cándida albicans ATCC ®10231™?
3
1.2.JUSTIFICACIÓN
Nobile mencionó que la cándida albicans se ha relacionado con un sin número de
enfermedades que afectan al ser humano, siendo importante resaltar una como la
candidiasis de la cavidad oral, produciendo principalmente incomodidad, ardor,
dolor e incluso halitosis a los pacientes. (24).
Se desea realizar esta investigación con el objeto de obtener mayor información
sobre la existente propiedad antimicrobiana del aceite esencial de la coriandrum
sativum, al 25, 50, 100 % de concentración, especialmente sobre microorganismos
propios de la boca, en este caso la cándida albicans ATC 10231™.
Buscando beneficiar a investigadores, aportando evidencia científica sobre esta
propiedad antimicrobiana para futuros proyectos farmacológicos y sus afines,
cambiando o siendo alternativa de plan de tratamiento, la utilización misma del
aceite esencial de la coriandrum sativum. Ayudando a resolver o controlar las
posibles enfermedades que causa este microorganismo a nivel oral y corporal.
1.3.OBJETIVOS
1.3.1. OBJETIVO GENERAL
Identificar el efecto antimicrobiano in vitro del aceite esencial del coriandrum
sativum sobre la cándida albicans.
1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Comprobar la actividad antimicrobiana del aceite esencial del coriandrum
sativum sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™ en una
concentración del 25%.
4
- Comprobar la actividad antimicrobiana del aceite esencial del coriandrum
sativum sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™ en una
concentración del 50%.
- Comprobar la actividad antimicrobiana del aceite esencial del coriandrum
sativum sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™ en una
concentración del 100%.
1.4.HIPÓTESIS
1.4.1. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN H1: El aceite esencial de la planta
coriandrum sativum posee actividad antimicrobiana sobre cándida albicans.
1.4.2. HIPÓTESIS NULA H0: El aceite esencial de la planta coriandrum sativum no
posee actividad antimicrobiana sobre cándida albicans.
5
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1.MICROBIOLOGÍA BUCAL
La microbiología bucal se refiere al estudio de los microorganismos que viven o que
realiza alguna de las etapas biológicas en la cavidad oral, y las interacciones con el
medio en el que habitan. Perturbaciones en este medio puede ser o no responsable
de ciertas patologías que se encuentran en los diferentes órganos que la constituyen
(1).
Scannapieco menciona que los microorganismos que viven o se encuentran en la
cavidad oral son fascinantes y únicos, ya que realizan todas o algunas de sus
funciones vitales en diferentes áreas como mucosa bucal, lengua, encía, paladar duro
y blando, piso de boca, tejidos duros como los dientes, que están en contacto
constante con el ambiente externo y con la saliva que contiene componentes
químicos de defensa inmunitarios como no inmunitarios que controlan la población
microbiológica.
La población microbiológica de la boca es la segunda más diversa después del
intestino delgado, existen aproximadamente 700 especies de microrganismos, entre
ellos, virus, hongos, bacterias, protozoarios. Está diversidad es adquirida al
momento en que nacemos, ya que la boca está expuesta al medio ambiente, por el
simple hecho de respirar, hablar, comer, besar estamos modificando este
microbioma (7).
Estos microrganismos bucales se los encuentra de dos maneras: los de libre
flotación que se encuentran en la saliva que es aproximadamente el 1 % y aquellos
que se adhieren a las diversas superficies de esta cavidad el 99% (32). Los que se
adhieren a superficies forman la llamada biopelícula o biofilm ya que las superficies
de la boca ofrecen un sustrato al cual estos se pueden adherir, denominada película
adquirida compuesta por lípidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos que
provienen principalmente de la saliva, el líquido crevicular y productos producidos
por bacterias (7).
6
Pero este microbioma bucal se encuentra en simbiosis con el ser humano, es decir
coexistimos en una asociación continua para beneficiarnos mutuamente, por lo
tanto, los microrganismos de la boca nos ayudan en ciertos procedimientos
biológicos que nosotros por si solos no podemos, como por ejemplo la conversión
de los nitratos en nitritos, gracias a la oxido reductasa que estos generan. Los
nitritos nos ayudan a mantener una buena salud cardiovascular y a la generación del
moco gástrico (7).
Pero este estado de simbiosis que nos proporciona una buena salud bucal puede
verse perturbado y romperse, manifestándose con el aumento y diversificación de
las poblaciones celulares microbiológicas generando patología orales. Esto puede
suceder por una dieta rica en carbohidratos o deficiente de frutas y vegetales, el
estrés, la inmunodeficiencia del huésped, etc.
2.1.1. CÁNDIDA ALBICANS
Microrganismo que hace parte del microbioma oral, que pude dar lugar a
infecciones cuando la inmunidad del huésped se ve afectada, aquejando
mayormente a la mucosa del cuerpo y hasta originando afecciones sistémicas
(20). Lockhart aseguró que la prevalencia de cándida albicans es mayor en
adultos mayores, embarazadas, enfermos con diabetes, pacientes con
inmudeficiencia, portadores de prótesis totales o parciales, o pacientes que están
en tratamiento con antibióticos u corticoides (19).
Tsui et al menciona que la cándida albicans es un hongo dimorfo, que tiene la
capacidad de pasar de levadura células individuales ovaladas a formar hifas
células filamentosas unidas de extremo a extremo, una estrategia que utiliza para
poder formar parte de la película adquirida facilitando así su virulencia. Se
considera que las hifas intervienen facilitando la adhesión y la invasión de otros
tejidos (20). Se cree que cambio de la morfología de este microorganismo tiene
que ver con la temperatura del ambiente en el que se encuentra: permanece
como levadura a una temperatura de 37°C y toma la forma de hifas a 25 °C (11).
7
La cándida albicans es una colonizadora inicial del cuerpo humano que es
resistente al medio externo, se encuentra en todas las membranas del cuerpo y en
especial del sistema digestivo y reproductor, la cual hasta la actualidad no
conocemos que beneficios da al cuerpo cuando esta se encuentra en simbiosis,
ya que las investigaciones se han centrado más a las patologías que esta causa
(28).
2.1.1.1.TAXONOMÍA
La Taxonomía se refiere a la ciencia de la clasificación científica que se aplica a
cualquier organismo vivo para facilitar su estudio.
La especie Cándida albicans pertenece:
Dominio: eucariota
Reino: Fungi
Filo: deuteromycota
Subfilo: Deuteromicotina
Clase: Deuteromycetes
Orden: Blastomycetidae
Familia: Criptococcaceae
Género: Cándida (40).
2.1.1.2.CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS
Struthers menciona que los hongos son eucariotas, que poseen pared celular que
contiene 1,3 betaglucano, quinina y pequeñas cantidades de otros carbohidratos,
y se caracterizan por su membrana celular que utiliza como esteroide al
ergosterol que es blanco de antifúngicos. La Cándida albicans es un
microorganismo anaerobio, Gram positivo, levaduriforme (36).
Vistas bajo el microscopio óptico la cándida albicans, se puede encontrar en
forma de levadura sus células son redondeadas u ovaladas, de un tamaño
8
aproximado de 3-8 x 2-7 micras de tamaño, pero cuando están en forma de hifas
sus células se tornan alargadas tomando la apariencia de filamentos, y una forma
intermedia entre las dos que se conoce como dimorfismo (11).
Pardi y Cardozo manifiestan que en agar sabouraund y otros cultivos similares,
las colonias crecen lisas, suaves, húmedas, de color y aspecto cremoso, cuyo
tamaño oscila entre 1,5 a 2mm, de consistencia blanda en forma de levadura que
proyecta sus hifas hacia el interior del agar. Cuando estas colonias crecen in
vitro lo deben hacer en un ambiente de aerobiosis, en un pH que oscile entre 2,5-
7,5 a una temperatura entre 20 y 38°C, su crecimiento se puede evidenciar
después de 24 a 72 horas (26).
2.1.1.3.CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS
El metabolismo de la cándida albicans, depende mucho del lugar donde estas se
encuentren, la morfología que está presente por ende con la patogenicidad de la
misma y la presencia de antibióticos u antimicóticos que se presenten en el
medio que ella habite. Existe una relación directa entre el metabolismo de los
carbohidratos y la morfología de la cándida albicans, a mayor presencia de
carbohidratos en su medio, mayor es la capacidad de formas hifas o biopelículas
que serán explicadas más adelante. En cambio, el metabolismo de los
aminoácidos y lípidos tiene poca importancia para el crecimiento de este
microorganismo (26).
2.1.1.4.CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS
McManus aseguró que el genoma de la cándida albicans consta de ocho pares de
cromosomas homólogos. Esta especie se caracteriza especialmente en ser
diploide, y tener una gran capacidad de plasticidad es decir de cambiar su
genoma, hasta de realizar reordenamientos cromosómicos, dependiendo de las
condiciones ambientales a la que estén expuestas (20).
9
McManus afirma que la reproducción de este microorganismo es clonal pero
también puede utilizar un ciclo parasexual (20). Este ciclo se caracteriza por
implicar cambios en el número de cromosomas y asemejarse a la reproducción
sexual (3).
2.1.1.5.FACTORES DE VIRULENCIA
Existen ciertas cualidades propias de este microrganismo, que ayudan a su
patogenicidad, como las siguientes:
Morfogénesis
Höfs confirma que la transformación de levadura a hifa representa el factor de
virulencia más importante de la cándida albicans. Ambas formas tienen
importancia para la patogenicidad, las levaduras que se encuentran libre ayudan
a la diseminación en distintos lugares para su infección, mientras que las hifas
son más invasivas contribuyendo al daño tisular del huésped (10). Paulain
asegura que etas distintas formas en las que se presenta son adoptadas
dependiendo las condiciones ambientales como: pH, temperatura, composición
del medio, presión del CO2, etc (28).
Adhesión y formación de biopelículas
Rivera explicó que esta es la una fase importante para el inicio de la formación
de biopelícula de cándida albicans, esto comienza cuando la levadura se adhiere
a la superficie tisular, y en al cabo de 8 -11 horas se encuentra en etapa
temprana, intermedia de 12 a 30 horas y madura a las 38-42 horas. Cuando está
madura posee una red densa de hifas, seudohifas, levaduras, recubierta por
matriz extracelular y asociada a bacterias (29).
Nobile menciona que la formación de la biopelícula de cándida albicans consta
de cuatro etapas temporales: adherencia a una superficie, proliferación para
10
formar una capa basal de anclaje de células, crecimiento de seudohifas e hifas,
dispersión lenta de células (levadura) para sembrar nuevos sitios (24)(38).
Höfs argumenta que la unión a la célula huésped, se da por medio de las
adhesinas que posee la cándida para poderse adherir a las células hospedadoras,
así también como las fuerzas de Vanders Waals y las interacciones hidrofóbicas
(10).
Matriz extracelular
Las biopelículas maduras de la cándida albicans están encerradas en un material
complejo conocido como matriz extracelular (24). Se ha encontrado formando
parte de ella carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos, glucosa, fósforo y ácido
urónico. Además, se le atribuye la capacidad de resistir a fármacos específicos
por la síntesis de B 1-3 glucano que se realiza en ella (14).
Capacidad invasora de hifas
Höfs menciona que durante la patogenia de la cándida albicans se puede
observar un cierto grado de invasión de las células huésped, las hifas se pueden
encontrar intracelularmente, lo que demuestra que esta forma es la más invasiva,
para penetrar el epitelio las hifas deben hacerlo más rápido que la descamación
normal de la piel, para evitar su desprendimiento (10).
Para la invasión la cándida utiliza dos mecanismos que son: la endocitosis
inducida que es utilizada por las células hospedadoras independiente de la
viabilidad de la célula de la cándida, y la penetración activa impulsada por los
hongos independientemente si la célula huésped este viva o no. Esto
especialmente se da en el epitelio oral, por las características del mismo (10)
(38).
11
2.1.1.6.CANDIDIASIS
García afirmó que el término candidiasis corresponde a infecciones micóticas
oportunistas más comunes que afectan a la cavidad oral del ser humano. (9).
Estas son causadas principalmente por la cándida albicans que se encuentra
formando parte la microbiología oral aproximadamente entre el 30 y 50 % de las
personas portan este microorganismo (35).
Esta enfermedad se presenta más a los extremos de la edad; generalmente el 5-
7% de los niños desarrollan candidiasis oral, la prevalencia en pacientes con sida
está entre el 9-31% y en el 20% de pacientes con cáncer (35).
Millsop describió que la candidiasis oral se presenta en dos formas blancas que
se desprenden fácilmente o eritematosa con intensa inflamación (21).
Existen factores tanto locales como sistémicos que puede presentar los seres
humanos que pueden conducir a la cándida de comensal a patógena (21). Entre
los factores locales tenemos: disfunción de las glándulas salivales como la
xerostomía, el uso de prótesis dentales, medicamentos tópicos, el tabaco, la dieta
rica en carbohidratos. Mientras que los factores sistémicos tenemos: la edad, el
estado nutricional, el uso prolongado de fármacos sistémicos como los
antibióticos, desordenes endocrinos, trastornos inmunes, quimioterapia,
radioterapia, y las condiciones congénitas (21) (27).
García recomendó que el diagnóstico de la candidiasis oral se realice
clínicamente basándose en el reconocimiento de las lesiones por parte del
profesional y confirmarse con la identificación microscópica de cándida. Entre
las técnicas disponibles están frotis citológico, el cultivo de los microorganismos
y la biopsia que está indicada para los casos hiperplásicos porque este tipo
pueden presentar displasias (9).
2.1.1.7.CLASIFICACIÓN CANDIDIÁSICA ORAL
Esta clasificación es según Parihar la cual será manifestada a continuación: (27)
12
Agudas: Pseudomembranosa y eritematosa.
Crónicas: eritematoso, pseudomembranoso, hiperplásico o nodular.
Lesiones asociadas a cándida: estomatitis subprotésica, queilitis angular,
glositis romboidal media.
Candidiasis Pseudomembranosa
Se presenta en las superficies orales como placas cremosas confluentes de color blanco
o amarillo blanquecino que se asemejan a cuajadas de leche o requesón. Estas placas
consisten en células epiteliales descamadas, agregados enmarañados de hifas, fibrina y
material necrótico, esta placa se puede eliminar con el frotis, pero deja una superficie
eritematosa sangrante. Los síntomas de la forma aguda son leves y los pacientes indican
que solo sienten hormigueos y un sabor desagradable con juntamente con mal aliento
(27).
Candidiasis eritematosa
Se presenta en las superficies de la cavidad oral como parches eritematosos dolorosos
que se presentan mayormente en el paladar duro, pero también se pueden encontrar en
la mucosa bucal o la cara dorsal de la lengua, puede estar acompañada de atrofia de las
papilas. Se ha relacionado directamente con el uso continuo de antibióticos y
corticoides, el VIH, la diabetes no controlada, la anemia y deficiencia de vitamina B12
(21). El diagnóstico diferencial debe realizarse con estomatitis protésica, eritema
migratorio, quemaduras térmicas y eritroplaquia (27).
Candidiasis hiperplásica o nodular
Otero aseguró que esta es la menos común de todas las candidiasis orales, se caracteriza
ya que sus placas blancas no se desprenden al raspado, persisten con el tiempo y tienden
a encontrarse en mucosa yugal retromolar, lengua, paladar y labios. Se distinguen dos
formas la homogénea que es uniforme adherente y asintomático; y la forma nodular,
dolorosa con presencia de nódulos blanquecinos en una mucosa eritematosa. Sugirió
realizar siempre en esta candidiasis la biopsia para diferenciarlas de otros procesos (25).
13
Estomatitis subprotésica
Shankargouda Patil menciona que también es conocida como candidiasis atrófica
crónica, que se caracteriza por una inflamación crónica de la mucosa, restringida al
área que ocupa la prótesis dental. Clínicamente las lesiones se pueden observar como
hiperemia puntual, tipo eritematoso difuso o granular, generalmente asintomáticas pero
el paciente se puede quejar de dolor y ardor (27)
Queilitis angular
También es conocida como boquera o perleche, clínicamente se presenta como parches
eritematosos y fisurados bilaterales a lo largo de la comisura de la boca, con formas
costrosas a su alrededor, el paciente puede presentar un dolor intenso, con afección de la
capacidad funcional propia de los labios (21) (25).
Glositis romboidal media
Millsop aseguró que esta patología se presenta clínicamente como un parche simétrico
eritematoso, con forma romboidal, despapilada (21). Localizado típicamente en la línea
media de la lengua, se presenta lisa o lobulada, asintomática, pero puede existir dolor,
plurito o irritación se ve comúnmente en fumadores y usuarios de esteroides inhalados
(27).
2.2.FARMACOLOGÍA ANTIMICÓTICA
Shankargouda Patil afirma que existen tres categorías de agentes antifúngicos para
el tratamiento de la candidiasis: los polienos conformados por la nistatina y
anfotericina B; los inhibidores de la biosíntesis de ergosterol como los azoles,
alilaminotestiocarbamatos y morfolinas; y análogo de ADN 5- flurocitosina y
agentes más nuevos tales como caspofunginas. La elección del fármaco a usar tiene
mucha relación entre las características de la lesión y el estado sistémico del
14
paciente. Hay tres objetivos principales de los medicamentos antimicóticos en
cándida: la membrana celular, la pared celular y los ácidos nucleicos (27).
Los polienos estos se unen al ergosterol en la membrana fúngica causando la
alteración en su estructura y función. Los inhibidores de la biosíntesis de ergosterol
trabajan a nivel del retículo endoplásmatico impidiendo la formación de esta
molécula. El análogo de ADN 5-florocitosina inhibe la síntesis de ADN y las
Caspofunginas que trabajan inhibiendo la enzima 1-2 B-D- glucano componente
principal de la pared celular de las levaduras (27) (40).
Millsop aseguró que para los casos leves de candidiasis oral, los agentes
antimicóticos tópicos pueden ser adecuados. Para las enfermedades resistentes a los
medicamentos tópicos, los pacientes con riesgo de candidiasis diseminada y en
pacientes inmunodeprimidos, es necesaria la terapia antimicótica sistémica (21).
García recomienda complementar el tratamiento de la candidiasis mediante la
eliminación de cualquier causa subyacente o factor de riesgo identificables, como
por ejemplo la higiene, el ajuste y el uso controlado de las prótesis dentales (9).
2.2.1. Antifúngicos tópicos
Otero aseguró que los casos de candidiasis más simples, localizada y en
pacientes con función inmune normal pueden ser tratados tópicamente, este va a
requerir que el fármaco entre en contacto con la superficie afectada el tiempo
suficiente para evitar la residivancia de la enfermedad, y recomienda continuar
el tratamiento de 2 a 3 semanas después de que las características clínicas hayan
desaparecido, pero hay que tener cuidado ya que la exposición prolongada a
antifúngicos puede causar resistencia (25).
Los antifúngicos tópicos normalmente utilizados son: nistatina, anfotericina B,
derivados azólicos (miconazol, clotrimazol, econazol y ketoconazol) (25).
15
2.2.1.1.Nistatina
Millsop define a la nistatina como un agente antifúngico que es derivado de la
especie Streptomices noursei, cuya función es unirse al ergosterol de la
membrana fúngica generando poros para interrumpir la permeabilidad de la
membrana. La presentación de este medicamento puede ser en crema,
ungüentos, pastillas, o suspensión oral (18) (21).
La pastilla de nistatina tiene una acción de mayor duración, pero contiene
glucosa que puede aumentar el riesgo de aparición de caries, y empeorar la
diabetes. La suspensión oral puede causar malestar estomacal, disminución de la
intolerancia de la glucosa y mayor riesgo de caries (21).
García recomienda la siguiente dosificación de la nistatina:
Suspensión oral de 60 ml, 4 a 6 ml cada 6 horas que es muy bien tolerada.
Ungüento 30 gr, 2 o 4 aplicaciones al día.
Tabletas 2 cada 8 horas, pero puede haber náuseas, vómitos y problemas
gastrointestinales (9).
2.2.2. Antifúngicos sistémicos
Ruiz asegura que las micosis sistémicas suelen afectar a pacientes con factores
predisponentes, y pueden tener mal pronóstico si no se identifica primero el
factor que la causo. Se recomienda que no todas las candidiasis se traten igual,
realizar la identificación de las cepas y estudios de sensibilidad (30).
2.2.3. Agentes antifúngicos alternativos
Existen investigaciones nuevas sobre las propiedades antifúngicas de plantas que
se pueden utilizar como tratamiento alternativo. Cuyas presentaciones pueden
ser, extractos naturales, aceites esenciales, lociones, cremas, etc. Algunas de las
plantas que ya se ha observado que tienen una buena acción antifúngica son:
hojas de té, canela, jengibre, orégano, menta, romero, tomillo, etc. (27).
16
2.3.BOTÁNICA
Es aquella ciencia que estudia a las plantas tanto en sus características, propiedades,
clasificación, reproducción, relación con su medio y los demás seres vivos, se
consideran como mantenedoras primarias de vida, ya que aportan con el Oxígeno
del ambiente importante para los animales y seres humanos, además de ser y proveer
alimento, y muchas otras cualidades como por ejemplo la medicinal (40).
2.3.1. Riqueza botánica del Ecuador
El Ecuador país que se encuentra en la mitad del mundo, es uno de los países
con mayor diversidad tanto de flora y fauna. Internacionalmente se encuentra en
el puesto diecisiete entre los países más megadiversos y en el número uno si esta
megadiversidad es relacionada a su superficie (22).
Consta de cuatro regiones que poseen un ambiente, clima, flora característica,
que propicia lugares óptimos para el desarrollo de todo tipo de platas.
Concentrando un 10 % de todas las especies de platas del planeta. El cuarto
informe Nacional para el Convenio sobre la diversidad biológica informa que el
Ecuador posee más de 17. 058 especies de plantas vasculares o platas con flor
(24).
Con la cantidad expuestas de plantas que se encuentran en nuestros territorios, se
requiere investigar más a las distintas especies, muchas de ellas poseen efecto
antimicrobiano y antifúngico, recordemos que estas propiedades están
relacionadas con el ambiente y la calidad de suelo en donde habitan.
2.3.2. Coriandrum Sativum
En nuestro país es más conocido como cilantro o culantro, se cultiva
mayormente en la sierra, es utilizado en la gastronomía ya que brinda un olor y
sabor únicos, por esta delimitación de su uso, son para muchas desconocidas sus
propiedades medicinales.
17
2.3.2.1.Descripción
Bhat definió al coriandrum sativum como una plata anual que se cultiva a partir
de sus semillas a cualquier temporada del año, que es endémica de las regiones
del mediterráneo y medio oriente, que a partir de aquí se extendió a la mayor
parte del mundo (4).
Shyamapada la describió como una planta erecta con raíz pivotante, con tallos,
esbeltos ramificados que miden de 20 a 70 cm de altura. Sus hojas son
lanceoladas y otras variables en forma lobuladas, de color verde claro a oscuro.
Las flores son pequeñas, con pétales blancos o rosados, asimétricos, que nacen
en umbelas (34).Las semillas son ovaladas, tienen un saber suave, dulce
ligeramente agrio, sus componentes principales son el aceite esencial y
triglicéridos (4).
2.3.2.2.Composición Química
Laribi aseguró que las hojas contienen aceites esenciales, flavonoides, ácidos
fenólicos y polifenoles. También posee betacarotenos precursores de la vitamina
A. Se encontraron mayor cantidad de ácidos grasos poliinsaturados, la cantidad
de ácidos grasos depende de la cantidad de NaCl presente en el suelo donde se
cultiva (17). Shyamapada menciona que el follaje verde posee vitaminas,
hidratos de carbono, proteínas, fibra y minerales como el fósforo, hierro y calcio
(34).
La capacidad terapéutica u nutricional de las semillas del coriandrum sativum se
debe a que esta contiene muchos compuestos bioactivos como: ácidos grasos,
esteroles, tocoles, compuestos volátiles, proteínas en un 3.3% y carbohidratos en
un 6 %(17) (34). Bhat afirmó que en las semillas se encuentran mayormente
aceites volátiles en un 1.8 %, el cual contiene un 65% de linalool (4). Pero en
cambio Shyamapada menciona que el ácido petrosilínico es el que se encuentra
en mayor porcentaje, seguido por el linalool, después el oleico y por último el
palmítico.
18
2.3.2.3.Taxonomía
Al coriandrum sativum o cilantro como comúnmente se le conoce, pertenece a:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Apiales
Familia: Apicaceace
Subfamilia: Apioideae
Tribu: Coriandreae
Género: Coriandrum (40).
2.3.2.4.Hábitat
La planta en si es originaria de Europa en la región mediterránea y en la parte de
Asia menor, estos lugares se caracterizan por el clima cálido seco, pero a pesar
de esto esta especie tiene la cualidad de aclimatarse y adaptarse a climas no
óptimos, propagándose a la mayoría de países del mundo. Por ello en cada
región o país donde se encuentre lo que más varía es su tamaño, y el tiempo de
cosecha, ya que son estrategias para vivir en diferentes climas (37).
2.3.2.5.Usos terapéuticos
Existen varias investigaciones las cuales aseguran que el coriandrum sativum
posee las siguientes propiedades terapéuticas.
Actividad analgésica: Laribi aseguró que el linalool tiene propiedades
analgésicas este estudio se realizó en ratones. Por lo que recomienda usar el
extracto acuoso o el aceite esencial (17).
Actividad antihiperglusémica: Bhat menciona que la integración de la semilla
molida a la dieta conduce a una disminución marcada de la glucosa en sangre y
aumento de la insulina, así mismo esto se comprobó en ratas diabéticas (4).
19
Actividad antihelmíntica: Se comprobó tanto in vivo como in vitro que el
extracto hidroalcohólico del coriandrum sativum tiene mejor actividad contra los
parásitos adultos, en cambio el extracto de la semilla tiene mejor actividad
contra el Haemonchus cortantus (17).
Efecto Hipolipidémico.- la hiperlipidemia es cuando se produce más productos
de oxidación de los lípidos que se acumulan en la periferie de los vasos y en el
hueso, en el hueso puede acelerar su degeneración, se investigó con ratones con
esta patología administrándoles 1gr/kg, se encontró que se disminuyó la
absorción y mejora la degradación de los lípidos (4).
Actividad Ansiolítica: el cilantro se ha utilizado en Irán como medicina popular
contra el insomnio. Se realizaron investigaciones con ratones, se encontró que
administrando 100 a 200 mg /kg de extracto hidroalcohólico producía efectos
similares ansiolíticos que el diazepam (4).
Actividad Antibacterial: Laribi mencionó que recientemente se aisló un
péptido antimicrobiano denominado “Plantaricin CS” de las hojas del
coriandrum sativum, se mostró que este tiene mayor efecto antibacterial ante el
Staphylococcus aureus y mayormente en bacterias gram positivas (17). Se ha
observado que el aceite esencial de esta planta es eficaz contra las bacterias
gram positivas y gram negativas, afectando principalmente la permeabilidad de
la membrana (17) (34).
Actividad Diurética: se comprobó mediante un estudio con ratones en el cual
se administró como infusión, se confirmó que el aumento significativo de orina
similar a la furosemida, por lo que se recomienda su uso en esta afección (4).
Actividad anticancerígena: Laribi señalo que el linalool ha demostrado tener
efectos anticancerígenos ya que inhibe moderadamente la proliferación celular.
Además se atribuye esta actividad por su función protectora contra los efectos
nocivos del metabolismo de los lípidos ya que esto se asociado con la
malignidad de los tumores (17).
20
Desintoxicación de metales: Bhat aludo que los compuestos químicos que se
encuentran en el cilantro tienden adherirse a los metales y ayudar a su
eliminación como el mercurio, se debe principalmente al efecto vinculante del
grupo carboxílico al mercurio (4).
Actividad Antifúngica: gracias al linalool y a la presencia de plantaricin CS se
ha observado que el aceite esencial del coriandrum sativum produce una
inhibición considerable en el crecimiento del contra especies de cándida y
Trichophyton. Debido a esta propiedad y baja toxicidad, podría ser un plan de
tratamiento alternativo para afecciones, provocadas por la cándida albicans, pero
necesariamente se requiere más investigaciones (17).
2.3.2.6.Efectos adversos o tóxicos
Shyamapada menciona que de acuerdo con Hedge y Stener que la dosis parcial
estimada para que el aceite esencial de coriandrum sativum sea tóxico es de
2139, 98 mg/kg, lo que indica una baja toxicidad. En cambio Patel mencionan
que hasta 3000mg/kg de peso corporal el extracto de esta planta no es tóxico,
esto también realizado en ratones, por lo tanto que el cilantro se puede
considerar inofensivo para el consumo humano (34).
2.4.FITOTERAPIA
El médico francés Henric Leclerc fue el primero en implementar este término, años
más tarde se definió como ‘Terapia complementaria que utiliza plantas o partes de
estás, donde el empirismo de la medicina tradicional se transforma en fundamento
científico’ 34 p.p. 63
, es decir la utilización de las propiedades medicinales y
terapéuticas de las plantas, pero respaldarla con un fundamento científico (35).
Caracterizándose principalmente por utilizar tanto la planta, una parte de esta, como
también productos de estas, como extractos, aceites esenciales, esencias, lociones
etc., conocidos como fitocomplejos, un fitocomplejo es un combinado de la
sustancia activa con otro agregado para lograr un mismo fin terapéutico (5).
21
Cruz menciona que alrededor de cuatro mil millones de personas es decir cerca del
80% de la población mundial hace usó de las plantas para tratar diferentes
afecciones, se debe a distintas razones uno de los más principales es el factor
económico, esto se ve muchas veces hasta en los países desarrollados, con fuerte
investigación farmacológica (8).
Además, se ha visto gran popularidad por consumir los productos naturales en
países desarrollados, ya que muchas investigaciones avalan su utilización segura y
eficaz, además que muchos productos sintéticos pueden producir efectos
secundarios, aunque se estén administrando de la manera más segura (8).
2.4.1. Preparado Fito- terapéutico
Según el Instituto nacional de vigilancia de medicamentos y alimentos de
Colombia un preparado Fito-terapéutico es aquel producto medicinal que posee
elementos activos derivados de plantas o de la asociación de varias de ellas, que
puede hallarse en estado bruto o en forma farmacéutica que se utiliza para fines
curativos (12).
Los que se encuentran en estado bruto son: extractos, tinturas, aceites
esenciales, infusiones, agua aromática, decocción, lociones, ungüentos (17).
2.4.2. Aceites esenciales
Usano aseguró que el aceite esencial es una combinación de compuestos
volátiles altamente concentrados, resultado del metabolismo secundario que solo
las plantas lo pueden hacer. Son utilizados aproximadamente el 90 % en la
cosmetología, gastronomía, farmacéutica. Generalmente se extraen los aceites de
las siguientes familias de plantas: como lamiaceae, asteraceae, solamaceae, entre
otras (33) (39). La gran parte de platas liberan estos aceites esenciales de
estructuras denominadas tricomas glandulares (39).
22
Como los aceites esenciales son productos del metabolismo secundario estos
pueden modificarse dependiendo las necesidades de la planta, eso quiere decir
que el clima, las condiciones del suelo, los fertilizantes, pueden ayudar a esta
modificación. La cantidad y la calidad también dependen de que parte de la
planta se extraigan, el proceso de elaboración, y la técnica de almacenamiento
(39).
2.4.2.1.Propiedades físicas
Los aceites esenciales con de aspecto oleoso, muy volátiles al ambiente,
insolubles en agua, pero solubles en alcohol, etér de petróleo, aceites inertes,
solventes orgánicos, teracloruro de carbono. Son altamente inflamables, son los
responsables del darle el olor y sabor característico a las plantas. Su densidad es
menor a la del agua (33).
2.4.2.2.Obtención de los aceites esenciales
Sena aseguró que, según el material a utilizar, es decir que parte de la planta,
dependerá la elección de la técnica de extracción, la calidad del aceite dependerá
mucho de la técnica escogida, pero de igual manera si la materia prima no es
apropiada, mucho menos lo va a ser el producto que se obtenga (33).
Sena menciona las siguientes técnicas:
Métodos directos: Extrusión, Exudación.
Destilación: Directa, Arrastre con vapor de agua, Maceración.
Extracción con solventes
2.4.2.2.1. Destilación por arrastre con vapor de agua (DAV)
Es una de las técnicas más utilizadas, ya que se asegura que la materia prima
no se combine con otra sustancia que ayude a su obtención, ya que
únicamente utilizará el vapor, para este proceso se puede utilizar cualquier
parte de la planta, pero deben estar molidas para facilitar la liberación del
aceite.
23
2.4.2.2.1.1.Descripción
La destilación por arrastre con vapor de agua es un proceso que utiliza el
calor, para que el vapor entre en contacto con la materia prima vegetal,
liberando sus componentes volátiles difundiéndolos desde los tricomas
glandulares hacia el exterior, para después condensarlos enfriando este vapor
y expresarlo a manera de aceite (2) (33).
Balboa aseguró que la destilación por arrastre con vapor de agua se utiliza
para los compuestos que expresen las siguientes características: alta
volatilidad, inmiscibles en agua, presión de vapor baja, punto de Ebullición
alto (2).
2.4.2.2.1.2.Ventajas
SENA afirma que como esta técnica usa únicamente agua evitamos la
contaminación de la materia prima vegetal, además los productos son más
exacto y reproducibles, gracias a que se tiene control: de la velocidad de
destilación, de la presión, satisfaciendo las necesidades de calidad y
cantidad comerciales (33).
2.4.2.2.1.3.Desventajas
Si la temperatura no es controlada podría: eliminar completamente los
compuestos volátiles, variar la presión del vapor óptima para la obtención
del aceite, y por ende variar la velocidad de la destilación. Se debe
controlar la cantidad de materia prima que se ingresa a destilación, ya que
puede rebasar la cantidad que permite el DAV (2) (33).
24
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1.DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
EXPERIMENTAL.- intervenimos mediante la inclusión de las variables
independientes (concentraciones del aceite esencial del coriandrum sativum)
sobre los cultivos de la cándida albicans ATC 10231 para observar si hay efecto
antimicrobiano.
IN VITRO.- ya que la investigación se llevó a cabo por modelos
experimentales, estudio y observación en laboratorio.
ANALITICO.- porque se analizó cuantitativamente el halo de inhibición de
cada una de las muestras, correspondiente a cada una de las concentraciones del
aceite esencial y para el grupo control positivo y negativo.
COMPARATIVO.- ya que se comparó los valores finales obtenidos de los
diferentes grupos con el fin de contrarrestar la efectividad de la actividad
antimicrobiana ante la cándida albicans ATC 10231.
3.2.POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA
POBLACIÓN
La población es la cepa de Cándida Albicans ATC 10231 la cual se adquirió en
el Importador Integral de Equipos e Insumos para Laboratorios MEDIBAC, el
cual es una institución privada que se encuentra en Pichincha - Quito: Av.
República de el salvador e Irlanda Edf. Rosania. Teléfonos: (02) 226 1478 – 246
6318 el cual nos brinda ya con el certificado de autenticidad, modo de activación
y fecha de caducidad de la cepa. (ANEXO1)
Además de ello se utilizó 1000 gramos de semillas secas de coriandrum sativum
traídas del cantón mejía con el que se preparó el aceite esencial.
25
MUESTRA
El criterio de selección de muestra fue por conveniencia, tomando en cuenta el
propósito de la presente investigación para esto se ha tomado como referencia el
artículo de Azuero Andrea, et al, Análisis de la actividad antimicrobiana de
plantas medicinales en el Ecuador, del 2016. Se realizó en 15 muestras (cajas
Petri), utilizando el método Kirby Bauer, medio de cultivo agar Sabouraud-
Dextrosa sembrados con Cándida Albicans ATCC ®10231™, 15 para cada
concentración del aceite esencial de la coriandrum sativum 25, 50 y 100% y 15
para control positivo que se realizó con nistatina y otras 15 para el control
negativo que se realizó con suero fisiológico.
3.3.CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN
3.3.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Cepas de Cándida Albicans ATCC ®10231™, que no contengan ningún
medicamento o reactivo previo a la experimentación.
3.3.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Cepas de Cándida Albicans ATCC ®10231™, incapaces de desarrollarse en el
medio de cultivo.
Cepas de Cándida Albicans ATCC ®10231™, que se hayan utilizado para
experimentos previos.
Cepas que no sean Cándida albicans ATCC® 10231™.
Cajas Petri que no fueron esterilizadas previamente.
Cajas Petri que tienen algún daño estructural.
3.4.CONCEPTUALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
En el proyecto de investigación se determinó:
26
3.4.1. VARIABLE DEPENDIENTE
- Efecto Antimicrobiano. - Característica química del aceite esencial de las
semillas secas del cilantro; habilidad de producir el efecto esperado, tras su
aplicación logra la acción.
3.4.2. VARIABLE INDEPENDIENTE
- Aceite Esencial de coriandrum sativum al 25, 50 y 100% de concentración.
- Sustancia química proveniente de la destilación por arrastre de vapor de las
semillas secas de cilantro para luego diluir en aceites inertes para obtener las
distintas concentraciones.
3.4.3. VARIABLES DE CONTROL
- Control positivo: Nistatina 100.000 U.I
- Control negativo: Suero Fisiológico
3.5.DEFINICIÓN OPERACIONAL DE LAS VARIABLES
27
VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONAL TIPO CLASIFIACIÓN INDICADOR
CATEGÓRICO
ESCALA DE
MEDICIÓN
Actividad
antimicrobiana
Se registrará la presencia de halos
de inhibición de crecimiento en
mm
Dependiente Ordinal
Nula
Intermediamente Sensible
Sensible
≤ 8 mm
9-11 mm
12-15mm
Aceite esencial del
coriandrum
sativum en distintas
concentraciones
Representa en el porcentaje en el
que el aceite será disuelto Independiente Nominal
Concentraciones 25%
50%
100%
A
B
C
Nistatina 30 mg/ml
(control positivo)
Se registrará la presencia de halos
de inhibición de crecimiento en
mm, fármaco de elección para
tratamiento de patologías
candidiásicas
Variable de
control Ordinal
Nula
Intermediamente Sensible
Sensible
≤ 8 mm
9-11 mm
12-15mm
Suero fisiológico
(control negativo)
Se registrará la presencia de halos
de inhibición de crecimiento en
mm
Variable de
control Ordinal
Nula
Intermediamente Sensible
Sensible
≤ 8 mm
9-11 mm
12-15mm
28
3.6.ESTANDARIZACIÓN
El presente proyecto fue realizado en base a protocolos ya establecidos del método
Kirby-Bauer. La cepa se activó y se procedió a cultivarla por dispersión con un
hisopo estéril en medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck. Después se
procedió a incubar la cepa a temperatura de 37°c por 72 horas en el Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador.
La turbidez estandarizada que se utilizó fue de 0,5 McFarland, obteniendo la
cantidad de bacterias por ml dentro de los parámetros establecidos. Se colocó cada
una de las concentraciones del aceite esencial, en discos de papel estériles, en el
control positivo se colocó la nistatina y en el control negativo suero fisiológico en
sus respectivos discos.
Se medirán los halos de acción antimicrobiana trascurrido las 72 horas de
incubación, utilizando una regla milimetrada Merck Sharp & Dohme y un contador
de colonias tipo Quebec. Esto se llevará a cabo con el acompañamiento del Dr. Juan
Viteri tutor y responsable del área de Laboratorio de microbiología de la Facultad de
Odontología de la Universidad Central del Ecuador.
El aceite esencial se obtuvo mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor
de agua y para obtener cada una de las concentraciones se diluyo con aceites inertes.
Este proceso se logrará junto con el acompañamiento del Bioquímico Farmacéutico
Darwin Roldán, Profesor de la Facultad de Química de la Universidad Central del
Ecuador.
3.7.MANEJO Y MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
Para la elaboración del proyecto de investigación “Efecto Antimicrobiano del aceite
Esencial del coriandrum sativum (cilantro) al 25, 50 y 100 % frente a la cándida
albicans. Estudio in vitro” se realizó la solicitud para la tutoría del proyecto al Dr.
Juan Viteri. (ANEXO 2)
Una vez aceptada a Tutoría por parte del tutor, se realizó el pedido del oficio que
compruebe que el tema no se encuentra repetido, en la base de datos de titulación de
29
la Facultad de Odontología, provisto en Dirección de Carrera, por la Dra. Quezada.
(ANEXO 3)
Una vez con el oficio de dirección de Carrera y la aceptación de tutoría, se envió al
Departamento de titulación de la facultad de Odontología, para que se apruebe el
tema y pueda constar en la base de datos de titulación. (ANEXO 4)
Se realizó el oficio dirigido a la Decana de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador Dra. Isabel Fierro para que se facilite el trabajo del
investigador, permitiendo el uso de las instalaciones del Laboratorio de Análisis
Clínico y Bacteriológico del departamento de Ofertas Servicios y Productos para la
obtención del Aceite Esencial al 25, 50 y 100% de concentración, y las instalaciones
del Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico para realizar el proyecto
piloto. (ANEXO 5)
Después se realizó el oficio dirigido al Dr. Jorge Naranjo Decano Encargado de la
Facultad de Odontología para poder utilizar las instalaciones del Laboratorio de
Microbiología para realizar la experimentación. (ANEXO 6)
Así mismo la propuesta del proyecto de investigación se envió al Subcomité de
Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad Central del Ecuador
SEISH- UCE para su debida aprobación. (ANEXO 7)
3.7.1. RECURSOS HUMANOS
Una vez con los permisos aprobados se necesitó la colaboración del Dr. Juan
Viteri Microbiólogo, quién supervisó el proceso experimental, el bioquímico
farmacéutico B.F Darwin Roldán, quien contribuyo a la obtención del aceite y
las tres distintas concentraciones, El Ingeniero Jaime Molina que ayudo con la
acogida de los datos de la experimentación para realizar los respectivos cuadros
y tablas estadísticas, y las personas encargadas de valorar el progreso del trabajo
del proyecto de investigación de la Facultad de Odontología para tener
confianza en sus resultados.
30
3.7.2. RECURSOS UTILITARIOS
EQUIPOS
Autoclave
Incubadora
Estufa
Refrigeradora
Cabina de seguridad Biológica
Equipo tipo Quebec
MATERIALES
Mandil
Mascarilla
Gafas
Guantes
Hisopos
Discos de papel filtro de 6mm de diámetro
INSTRUMENTOS
Mortero y pistilo
Cajas Petri
Tubos de ensayo
Gradilla
Pipetas
Puntas para pipetas
Pinzas estériles
Asas bacteriológicas
SUSTANCIAS
Cepas liofilizadas de Cándida Albicans ATCC®10231™
Aceite esencial de coriandrum sativum
Agar Sabouraud dextrosa
Solución Mcfarland 0,5
31
Suero fisiológico
Nistatina 30mg/ml
3.8.DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
3.8.1. RECOLECCIÓN DE LAS SEMILLAS DE CORIANDRUM SATIVUM
Las semillas del coriandrum sativum se recolectaron en la provincia Pichincha,
Cantón Mejía, de plantas maduras.
Figura 1.- Recolección de la Planta Coriandrum Sativum (Cilantro)
Elaboración: Provincia Pichincha, Cantón Machachi
Fecha: 30/11/2018 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.2. LAVADO Y SECADO DE LAS SEMILLAS DE CORIANDRUM
SATIVUM
Las semillas se lavaron con agua clorificada apto para el consumo humano, a
temperatura ambiente, se dejaron secar 3 días en una superficie limpia y seca a
la luz natural. Después fueron colocadas en fundas limpias con selle hermético
llevándolas a los Laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador.
32
Figura 2.- Lavado y secado de la Planta Coriandrum Sativum (Cilantro)
Elaboración: Provincia Pichincha, Cantón Machachi
Fecha: 30-4/11-12/2018 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.3. PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL
Se procedió de la siguiente manera:
A las semillas, se las pesaron y trituraron en un mortero de vidrio, con el fin de
lograr que el aceite contenido en ellas sea arrastrado por el vapor de agua en el
proceso de destilación, facilitando la obtención.
Figura 3.- Trituración de la semilla seca de coriandrum sativum
Elaboración: Laboratorio de Ofertas, Servicios y Productos de la Facultad de Ciencias Químicas
Fecha: 4 /12/2018 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
Se colocan 50 gramos de semillas en el balón de destilación y se añadieron
alrededor de 400 ml de agua, se armó el equipo de destilación por arrastre de
vapor y se procedió a calentar a temperatura de ebullición del agua (90 – 91 °C) .
33
Figura 4.- Equipo de destilación por arrastre de vapor con semillas trituradas
Elaboración: Laboratorio de Ofertas, Servicios y Productos de la Facultad de Ciencias Químicas
Fecha: 5 /12/2018 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
El vapor generado arrastra los componentes volátiles de las semillas (aceite) y de
esta manera se puede extraer el aceite. El proceso dura de 2 a 3 horas y una vez
que toda el agua se evapora, se enfría el balón y se procede a realizar otra
extracción con las mismas semillas añadiendo solo 400 ml más de agua. Para
obtener la cantidad de aceite necesario para el estudio se utilizaron alrededor de
1000 gr de semillas.
3.8.4. DILUCIÓN DE LAS DISTINTAS CONCENTRACIONES
Posteriormente el aceite resultante fue dividido en tres muestras, las dos fueron
disueltas con aceite inerte para conseguir el 25 y 50% de concentración y la
tercera pura para el 100%.
Para obtener el aceite esencial de coriandrum sativum al 25 % de concentración
se tomaron 0.50 ml de aceite puro de cilantro y se diluyeron con 1.50 ml de
aceite deodorizado inerte.
Para obtener el aceite esencial de coriandrum sativum al 50 % de concentración
se tomaron 0.75 ml de aceite puro de cilantro y se diluyeron con 0.75 ml de
aceite deodorizado inerte.
34
Se procedió a esterilizar los productos finales con luz UV, las distintas
concentraciones se colocaron en un recipiente ámbar estéril con tapa rotulado
que nos asegure que no se contamine y que la luz no los modifique. (ANEXO 8)
Figura 5.- Concentraciones de Aceite Esencial de Coriandrum Sativum
Elaboración: Laboratorio de Ofertas, Servicios y Productos de la Facultad de Ciencias Químicas
Fecha: 2/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.5. MEDIO DE CULTIVO
Se usó el medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck, adecuado para
el crecimiento de la Cándida Albicans. Este medio selectivo es recomendado por
el Dr. Juan Viteri tutor y encargado del Laboratorio de Microbiología de la
FOUCE.
Figura 6. Elaboración de Agar Dextrosa Sabouraud.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 07/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
35
3.8.6. ACTIVACIÓN DE LA CEPA
Fueron respetadas las condiciones de temperatura al momento de importar la
cepa de Cándida Albicans ATCC® 10231™ en estado de liofilización en su
envase KWIK-STIK™, proporcionada por MEDIBAC. (ANEXO 9)
Para su activación la cepa fue retirada de refrigeración dejando equilibrar la
temperatura de la cepa a la del ambiente por media hora, se abrió y activo
siguiendo las recomendaciones que son suministradas por el distribuidor. Luego
fueron incubadas a temperatura de 37°C por 72 horas en el Laboratorio de
Microbiología de la FOUCE. (ANEXO 10)
Figura 7. Activación de la cepa.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la FOUCE
Fecha: 11/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.7. PATRÓN DE TURBIDEZ DE MCFARLAND
Este patrón es la estandarización en la cantidad de microrganismo a usar, que es
proporcionada por el mismo distribuidor de la cepa, se comparó visualmente con
el caldo del inóculo que fue previamente elaborado con la cepa Cándida albicans
ATCC® 10231™ .
36
Figura 8. Obtención del Patrón de Turbidez de Mcfarland
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.8. ROTULACIÓN DE LAS CAJAS PETRI PARA LA POSTERIOR
INOCULACIÓN
Se marcaron cada una de las 15 cajas Petri, ya que se colocaron 5 discos de
papel filtro de 6mm de diámetro en cada una. Tres pertenecientes a las
concentraciones del aceite esencial al 25,50 y 100% de concentración, uno al
control positivo que fue la Nistatina y uno al control negativo que fue suero
fisiológico.
Figura 9. Rotulación de la caja Petri que contiene el agar Dextrosa Sabouraud 4% Merck
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
37
3.8.9. INOCULACION BACTERIANA PARA LA EXPERIMENTACIÓN
El contenido fúngico una vez establecido el patrón de turbidez de Mcfarland, fue
dispersado con un hisopó estéril en el medio de cultivo Sabouraud Dextrosa 4%
Merck. La dispersión se realiza en diferentes direcciones teniendo como objetivo
esparcir sobre toda la superficie la levadura. Esto se realizó en las 15 cajas Petri.
Figura 10. Inoculación de la cepa en cada una de las cajas Petri
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.10. APLICACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DEL ACEITE, EL
CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO EN LOS DISCOS Y
EN LOS CULTIVOS
15 discos de papel estéril se depositaron en las diluciones del aceite esencial de
coriandrum sativum al 25%, 50% y 100% de concentración que se encontraban
en Vasos Dapen debidamente rotulados previamente esterilizados, 15 en
nistatina y 15 en suero fisiológico que se colocaron en una caja petri dividida
previamente estéril. Los discos deben sumergirse por 3 minutos para que se
impregnen bien las soluciones.
38
Figura 11. Colocación de los discos de papel filtro en cada una de las soluciones.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
Se procedió a colocar cada uno de los discos de papel filtro en las 15 cajas petri, según
como esta se encontraba rotulada, con pinzas debidamente esterilizadas.
Figura 11. Colocación de los discos de papel filtro en cada una de las cajas petri.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
39
3.8.11. INCUBACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las cajas Petri con las muestras fueron incubadas por 72 horas a una
temperatura de 37°C.
Figura 12. Incubación de la muestra.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la FOUCE
Fecha: 15/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.12. MEDICIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN
Cada uno fue medido tras las 72 horas de su incubación, utilizando una regla
milimetrada Merck Sharp & Dohme y un contador de colonias tipo Quebec.
Figura 13. Medición de los Halos.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología
Fecha: 18/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
40
3.8.13. MANEJO DE BIOSEGURIDAD Y CONTROL
La experimentación se realizó dentro de la cabina de seguridad biológica, equipo
que filtra el aire mientras dura el proceso, asegurándose de no contaminar las
muestras y al personal del laboratorio.
Figura 14. Cabina de seguridad Biológica.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la FOUCE
Fecha: 18/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.8.14. ELIMINACIÓN DE DESECHOS
Absolutamente todos los hisopos, cajas Petri, tubos de ensayo, etc.
Contaminados con la cepa en la experimentación fueron clasificados y llevados
a una autoclave específica para procesar material contaminado, después se
enfriaron durante 30min y se colocaron en fundas rojas rotuladas con su
respectiva fecha, se enviaron al Depósito final de Desechos de la Facultad de
Odontología de la Universidad Central.
Los desechos infecciosos de la Universidad son retirados por la empresa
“EMGIRS-EP”. Toda información adicional en base al manejo de material
infeccioso fue proporcionada por el laboratorio de Microbiología de la Facultad
de Odontología. (ANEXO 11)
41
Figura 15. Manejo de desechos previo a esterilización.
Elaboración: Laboratorio de Microbiología de la FOUCE
Fecha: 18/01/2019 Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
3.9.ASPECTOS BIOÉTICOS
El proyecto de investigación requirió condiciones controladas, sin experimentar en
seres vivos, únicamente con cepas liofilizadas fúngicas, no requiriendo un
consentimiento informado ni la declaración de confidencialidad.
3.10. RIESGOS POTENCIALES DEL ESTUDIO
Se siguieron las medidas de bioseguridad propuestas por el laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador
evitando así que exista riesgo para el investigador, la experimentación
microbiológica in vitro fue supervisada por un especialista, llevando normas de
orden en todo momento. (ANEXO 12)
3.11. BENEFICIOS POTENCIALES DEL ESTUDIO
Principalmente para la Universidad Central del Ecuador ya que impulsa a los
estudiantes a realizar futuras investigaciones relacionadas a este tema, no
únicamente de la facultad de Odontología sino también de facultades con carreras
relacionadas a este fin, e incentivar para que las Universidades del Ecuador
aprueben patentes para crear productos a base de plantas ya que en la actualidad no
lo hacen.
42
Con los resultados que fueron obtenidos, el beneficio será como aporte de
información y fundamento para motivar a seguir investigando y lograr un avance
científico futuro en el consumo y utilización de productos naturales para tratar
patologías producidas por el microorganismo en mención.
3.12. IDONEIDAD, ÉTICA, EXPERTICIA DEL INVESTIGADOR
La autora fue guiada por los conocimientos y experiencia del Tutor para el
desarrollo del presenté proyecto de investigación. (ANEXO 13)
3.13. DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERESES
La autora, así como el Tutor no mantienen ningún tipo de vínculo o relación directa
económica, laboral, académica o de otro tipo con la casa comercial MEDIBAC. Los
resultados se manejarán como propiedad del autor. (ANEXO 14)
43
CAPITULO IV
4. ANÁLISIS E INERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los datos obtenidos en el proceso experimental fueron codificados y se transfirieron
al programa Excel, que se utilizó como matriz para guardarlos en un archivo para
verificar la ausencia de errores.
Como referencia en la medición de los halos de inhibición se utilizó la escala de
Rosco la cual es usada en sus investigaciones del 2011:
- Sensible: 12-15 mm
- Intermediamente Sensible: 9-11mm
- Nula: ≤ 8 mm (31)
Tabla 1.- Resultados de los halos de inhibición en milímetros a las 72 horas
EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DEL
CORIANDRUM SATIVUM (CILANTRO) AL 25%, 50 Y 10% FRENTE A
CÁNDIDA ALBICANS. ESTUDIO IN VITRO
RESULTADOS
CILANTRO (CORIANDRUM
SATIVUM)
NISTATINA SUERO
FISIOLÓGICO
25% 50% 100%
REPETICIÓN HALOS DE INHIBICIÓN
(mm)
HALOS DE INHIBICIÓN
(mm)
1 6 10 16 20 6
2 6 10 17 20 6
3 6 9 15 18 6
4 6 10 15 18 6
5 6 12 16 18 6
6 6 10 17 19 6
7 7 11 17 18 6
8 7 10 15 18 6
9 6 11 15 18 6
10 6 11 14 18 6
11 6 10 15 18 6
12 6 10 15 18 6
13 7 9 15 19 6
14 7 11 15 18 6
15 6 10 15 18 6
44
Fuente: Autora
4.1.ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
4.1.1. PRUEBA DE NORMALIDAD
Según el “Manual para presentar documentos escritos de trabajo de titulación –
modalidad proyectos de investigación e intervención” se verifica que las
muestras provienen de una población con distribución Normal, esto se realiza
con ayuda de las pruebas de Kolmogorov – Smirnov o con la prueba de Shapiro
– Wilk (menor a 20 datos).
Esto se comprueba mediante el valor de significación (Sig), este valor se
compara con el valor 0,05 (95% de confidencialidad), de esto se obtiene que:
- Ho: (hipótesis inicial) Las muestras provienen de poblaciones con
distribución Normal cuando su valor de significación es superior a 0,05.
- Ha: (hipótesis alterna) Las muestras no provienen de poblaciones con
distribución Normal cuando su valor de significación es menor a 0,05.
Tabla 2.- Resultados de prueba de normalidad
Advertencias
SUERO FISIOLÓGICO es constante.
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
CILANTRO 25% 0,453 15 0,000 0,561 15 0,000
CILANTRO 50% 0,297 15 0,001 0,865 15 0,028
CILANTRO 100% 0,362 15 0,000 0,781 15 0,002
NISTATINA 0,440 15 0,000 0,596 15 0,000
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
En la prueba de Normalidad de Shapiro-Wilk, todos los valores del nivel de
significación (Sig) en las muestras son inferiores a 0,05 (95% de confiabilidad), por lo
tanto se comprueba la hipótesis alterna, que menciona que las muestras NO provienen
45
de poblaciones con distribución Normal, entonces para la comparación de grupos se
utiliza pruebas no paramétricas: Kruskal Wallis.
4.1.2. PRUEBA NO PARAMÉTRICA, KRUSKAL WALLIS
- Ho (hipótesis nula): Las muestras provienen de poblaciones con la misma
distribución de probabilidad (Medias, medianas similares)
- Ha (hipótesis alternativa): Existen diferencias respecto a la tendencia
central de las poblaciones (medias medianas no son similares)
Tabla 3.- Comparación entre todas las sustancias: Kruskal Wallis
Descriptivos
HALOS
N Media Desviación
estándar
95% del intervalo de
confianza para la media Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
CILANTRO 25% 15 6,27 0,46 6,01 6,52 6 7
CILANTRO 50% 15 10,27 0,80 9,82 10,71 9 12
CILANTRO 100% 15 15,47 0,92 14,96 15,97 14 17
NISTATINA 15 18,40 0,74 17,99 18,81 18 20
SUERO FISIOLÓGICO 15 6,00 0,00 6,00 6,00 6 6
Total 75 11,28 5,02 10,12 12,44 6 20
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
46
Figura 16. Comparación de medias entre sustancias
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
- La muestra de CILANTRO 25% tiene una de las medias más bajas con un valor
de 6,27mm
- La muestra CILANTRO 50% con una media de 10,27mm,
- La muestra CILANTRO 100% con una media de 15,27mm
- La muestra de NISTATINA con una media de 18,40mm
- La muestra de SUERO FISIOLÓGICO con una media de 6,00mm con el valor
más bajo.
Para determinar si las diferencias entre las muestras son significativas se realiza la
prueba no paramétrica de Kruskal Wallis para muestra independientes:
6,27
10,27
15,47
18,40
6,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
CILANTRO25%
CILANTRO50%
CILANTRO100%
NISTATINA SUEROFISIOLÓGICO
COMPARACION DE MEDIAS ENTRE SUSTANCIAS
47
Figura 17. Prueba no paramétrica de Kruskal Wallis para muestra independientes
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
De la Prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, el valor del nivel de significación (Sig.
asintótica (prueba bilateral = 0,000) es inferior a 0,05 (95% de confiabilidad),
comprobando la hipótesis alterna, que menciona que existen diferencias respecto a la
tendencia central de las poblaciones. No todas las medias, medianas de las muestras son
similares.
48
Para determinar cuáles son similares o diferentes se hace la prueba dos a dos:
Figura 18. Prueba dos a dos entre sustancias Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
De la prueba de dos a dos son similares (significancia mayor a 0,05) tenemos:
- El suero fisiológico es similar al cilantro al 25%
- El cilantro al 25% es similar al cilantro al 50%
- El cilantro al 100% es similar a la Nistatina.
49
De la prueba de dos a dos no son similares (significancia menor a 0,05) tenemos:
- El suero fisiológico no es similar al cilantro al 50%.
- El suero fisiológico no es similar al cilantro al 100%
- El suero fisiológico no es similar a la Nistatina.
- El cilantro al 25% no es similar al cilantro al 100%.
- El cilantro al 25 % no es similar a la Nistatina.
- El cilantro al 50% no es similar a la Nistatina.
-
Tabla 4.- Subconjuntos Homogéneos (resumen)
HALOS
SUSTANCIAS N Subconjunto para alfa = 0.05
1 2 3 4
SUERO FISIOLÓGICO 15 6,00
CILANTRO 25% 15 6,27
CILANTRO 50% 15 10,27
CILANTRO 100% 15 15,47
NISTATINA 15 18,40
Sig. 0,964 1,000 1,000 1,000
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
50
Tabla 5. Sensibilidad de las sustancias
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
Figura 19. Sensibilidad de las sustancias
Fuente: Myrian Elizabeth Chicaiza Chiguano
A B C
Coriandrum Coriandrum Coriandrum
Sativum Sativum Sativum
25% 50% 100%
Cant. 0 1 15 15 0 31
% 0,00% 6,66% 100% 100% 0,00% 41,33%
Cant. 0 14 0 0 0 14
% 0,00% 93,33% 0,00% 0,00% 0,00% 18,66%
Cant. 15 0 0 0 15 30
% 100% 0,00% 0,00% 0,00% 100% 40%
Cant. 15 15 15 15 15 75
% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
SE
NS
IB
IL
ID
AD Sensible
Intermediame
nte sensible
Nula
TOTAL
SENSIBILIDAD DE LA SUSTANCIA (Tabulación cruzada)
SUSTANCIAS
TOTALN
Nistatina
S
Suero
Fisiológico
0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
A CORIANDRUM SATIVUM 25%
B CORIANDRUM SATIVUM 50%
C CORIANDRUM SATIVUM 100%
N NISTATINA
S SUERO FISIOLÓGICO
SENSIBILIDAD DE LAS SUSTANCIAS
NULA INTERMEDIAMENTE SENSIBLE SENSIBLE
51
4.2.DISCUSIÓN
Estudios como Ardila Q. et al., Saeed et al., P. Aelenei et al., Asma Ashraf et.al,
Azucero et al, que fundamentan la actividad antimicrobiana del coriandrum
sativum, Ardila Q. et al. (2009) Estudió la actividad antimicrobiana de varios
extractos de plantas entre ellas el coriandrum sativum frente a Clostridium
perfringens, bacteria Gram positiva anaerobia, utilizando el método Kirby-Bauer y
medio de difusión de pozos de 5mm, en el cual se produjo dos extractos con
diferentes vehículos, el hexano-diclorometano inhibiendo con mayor eficacia
comparado con el hexano-cloroformo, cuyo gol estándar en el estudio era la
vancomicina.
Soares et al. (2012) menciona que el aceite esencial del C. sativum es activo in vitro
contra Microsporum canis y Candida spp. Lo que demuestra buena actividad
antifúngica. Los MIC y las concentraciones fungicidas mínimas (MFC) para las
cepas de M. canis variaron de 78 a 620 y de 150 a 1,250 μg / mL, respectivamente, y
los MIC y MFC para Candida spp. las cepas variaron de 310 a 620 y 620 a 1,250 μg
/ ml, respectivamente.
Saeed et al., (2013) menciona que existe inhibición a los siguientes
microorganismos gram positivos y gram negativos como la eschericha coli,
estafilococos áureos, Klesiella peumonia, basillus subtillis, proteus mirabillis,
utilizaron el mismo método mencionado en esta investigación, pero usando el
extracto del coriandrum sativum.
En el trabajo investigativo de P. Aelenei et al. Publicado en el 2018 menciona que el
aceite esencial del coriandrum sativum es rico en linalool en su 70,11%, a la cual se
le atribuye su capacidad antibacterial, se aplicó in vitro a gram positivos como el
Staphylococos aureus y epidermitis y gram negativos como Pseudomonas
aeruginosa y escherichia coli, combinados con otros antibióticos como por ejemplo
la oxacilina, amoxicilina, gentamicina, tetraciclina y ciprofloxaxina. Comprobaron
que en esta combinación la concentración mínima inhibitoria de los antibióticos se
redujo. Dando resultados prometedores para el desarrollo de nuevas opciones
terapéuticas para las infecciones bacterianas.
52
Asma Ashraf y colaboradores realizaron una investigación en el 2018 con
nanopartículas resultantes de la combinación del extracto del coriandrum sativum
con nitrato de plata, verificando su actividad antimicrobiana contra gram positivos y
gram negativos. Resultado ser efectivos contra, Enterobacter aerogenes y
Staphylococcus aureus, pero con mayor efecto en basillus subtilis, Pasteurella
multocida. Potenciando sus capacidades ya que el coriandrum sativum con el
linalool afecta a la membrana celular, en cambio los iones de plata se combinan con
el ADN, inhibiendo su reproducción.
En cambio en Ecuador, la investigación realizada por Azuero y colaboradores
análisis del efecto antimicrobiano de doce plantas medicinales de uso ancestral en el
Ecuador (2016) se ha demostrado que el aceite esencial del coriandrum sativum
inhibe el crecimiento de la cándida albicans, con halos de 10 a 14 mm en las cuatro
muestras realizadas, por el método Kirby-Bauer, por el tamaño de la muestra
utilizada, el estudio puede tener falencias, en cambio en la presente proyecto
investigativo se realizó en quince muestras, para tres concentraciones al 25, 50 y
100%, demostrando que existe inhibición desde una concentración al 50%,
utilizando la misma metodología antes mencionada.
53
CAPITULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1.CONCLUSIONES
- Se comprobó que existe efecto antimicrobiano in vitro del aceite esencial del
coriandrum sativum al 50% y 100% de concentración sobre la cándida albicans
durante sus 72 horas de incubación.
- El aceite esencial del coriandrum sativum al 25% de concentración no posee
actividad antimicrobiana sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™,
siendo su acción similar al control negativo que fue el suero fisiológico,
mostrando la cepa una sensibilidad nula a esta sustancia.
- El aceite esencial del coriandrum sativum al 50% de concentración posee
actividad antimicrobiana sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™,
mostrando la cepa ser intermediamente sensible a esta sustancia.
- El aceite esencial del coriandrum sativum al 100% de concentración posee
actividad antimicrobiana sobre cepas de cándida albicans ATCC ®10231™,
mostrando la cepa ser sensible a esta sustancia, siendo similar al control
positivo que fue la Nistatina.
5.2.RECOMENDACIONES
- Se sugiere realizar esta misma investigación, pero en cambio in vivo, para
corroborar su efecto antimicrobiano y su comportamiento ante la mucosa bucal.
- Elaborar más investigaciones con el coriandrum sativum, utilizando otro tipo
principios activos de la planta, para corroborar su actividad antimicrobiana y
utilizando otro tipo de gol estándar.
54
- Analizar cada uno de los componentes que forman el aceite esencial del
coriandrum sativum, especialmente el linalool, y en qué porcentaje se encuentra,
ya que las cualidades de estos componentes pueden estar relacionados con la
calidad del suelo en donde se cultivó.
- Continuar las investigaciones en plantas tanto en especies nativas como
introducidas, pero sin olvidar la capacidad adaptativa y el acceso que las
personas pueden tener a las mismas.
55
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59
ANEXOS
ANEXO 1.- Factura de la compra de la cepa de Cándida Albicans ATCC®10231™
60
ANEXO 2. Aceptación de tutoría.
61
ANEXO 3. Coincidencia; Tema del trabajo de titulación.
62
ANEXO 4. Inscripción del Tema de Tesis con Aceptación.
63
64
ANEXO 5. Oficio a uso de laboratorio y asesoramiento de la Facultad de Química.
65
ANEXO 6. Oficio para uso de laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología.
66
ANEXO 7.- Aprobación del tema en el departamento de SEISH-UCE
67
ANEXO 8.- Certificado de Supervisión del Bioquímico Farmacéutico.
ANEXO 9.- Certificado de calidad de la cepa.
68
ANEXO 10.- Recomendaciones de activación y uso de la cepa Cándida Albicans® 10231™.
69
ANEXO 11.- Normas del manejo de desechos del Ministerio de Salud la cual se rige en la
FOUCE
70
ANEXO 12.- Certificado de la supervisión del Doctor del Laboratorio de Microbiología de la
Facultad de Odontología.
71
ANEXO 13. - Idoneidad, ética y experticia del investigador y tutor.
72
73
ANEXO 14.- Conflicto de interés del investigador y tutor.
74
75
Anexo 15. Certificado del Urkund
76
Anexo 16. Certificado de traducción del Abstract
77
78