UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · RESUMEN Escherichia coli es un bacilo...
Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · RESUMEN Escherichia coli es un bacilo...
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-
LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE
ORIGEN AVIAR.
Trabajo de Grado presentado como requisito para obtener el Grado o
Título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSLAVAS
TUTOR:
Dr. CHRISTIAN VINICIO VINUEZA BURGOS Msc.
Quito, Diciembre 2015
iii
DEDICATORIA
A mis madres, Nidia y Nancy
A una hermana, Estefanía
A mis Abuelos, Luis y María Laura
A mi familia.
Por enseñarme cada día que la manifestación más grande del amor se
expresa a través de la esperanza, la bondad y la comprensión.
Por hacer que todo tenga un sentido y valga la pena.
v
AGRADECIMIENTOS
Primeramente, quiero expresar mis mayores agradecimientos al Dr.
Christian Vinueza, por su gran calidad humana, su respaldo continuo, y
por compartir su filosofía de vida y de trabajo en el transcurso de este
estudio. En segundo lugar, agradezco al Centro Internacional de Zoonosis
(CIZ), a su director, personal científico y administrativo, por todo su apoyo
en el desarrollo de este proyecto.
Además, agradezco a la Dra. María Inés Baquero, al Dr. Carlos Gómez y
a todo el personal del Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia, por su constante y amigable apoyo en
todo el camino de este trabajo.
Finalmente, agradezco a todos mis amigos, que siempre me ha apoyado
en el camino académico y de la vida.
vii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSLAVAS, en calidad de Autor
del trabajo de investigación o tesis realizada sobre “IDENTIFICACIÓN DE
GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN
CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE ORIGEN AVIAR”, por el
presente, autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer
uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que
contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley
Intelectual y su Reglamento.
En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de diciembre de 2015
-----------------------------------
Cristian Andrés Narváez Manosalvas
C.I.: 1003144316
ix
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado “IDENTIFICACIÓN DE
GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN
CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia coli DE ORIGEN AVIAR”,
presentado por el señor CRISTIAN ANDRÉS NARVÁEZ MANOSALVAS
para optar por el Grado de Médico Veterinario Zootecnista; dejo
constancia que he leído mencionado trabajo, y en tal virtud, considero que
reúne todos los requisitos y méritos para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de diciembre de 2015
-----------------------------------
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos Msc.
C.I.: 1713266227
xi
APROBACIÓN DE TRIBUNAL
IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-
LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE
ORIGEN AVIAR.
El tribunal constituido por:
Presidente: Dra. María Inés Baquero.
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos.
Vocal Principal: Dr. Gustavo Salgado.
Vocal Suplente: Dr. Freddy Proaño.
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la
obtención del título o grado de Médico Veterinario Zootecnista,
presentado por el Sr. Cristian Andrés Narváez Manosalvas.
Con el título:
“Identificación de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en
cepas BLEE y AmpC de Escherichia coli de origen aviar”.
Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO
En la Ciudad de Quito, a _____________________ de 2015.
Para constancia de lo actuado firman:
Presidente: Dra. María Inés Baquero. ______________________
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos. ______________________
Vocal Principal: Dr. Gustavo Salgado. ______________________
Vocal Suplente: Dr. Freddy Proaño. ______________________
xiii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ..................................................................................................................... iii
LISTA DE CUADROS ........................................................................................................ xv
LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................................... xvii
RESUMEN .......................................................................................................................... xix
INTRODUCCION ..................................................................................................................1
CAPITULO I ...........................................................................................................................3
EL PROBLEMA ....................................................................................................................3
Planteamiento del problema .........................................................................................3
Justificación .....................................................................................................................5
Objetivos: ..........................................................................................................................6
CAPITULO II ..........................................................................................................................7
MARCO TEORICO ...............................................................................................................7
Antecedentes de la Investigación ...............................................................................7
Fundamentación Teórica ...............................................................................................8
Escherichia coli ...........................................................................................................9
Importancia de la resistencia bacteriana ............................................................14
Antimicrobianos ........................................................................................................17
La resistencia en E. coli ...........................................................................................23
Identificación molecular de genes CTX-M, SHV, TEM y CMY .........................26
La PCR ........................................................................................................................ 28
CAPÍTULO III ...................................................................................................................... 30
METODOLOGIA ................................................................................................................ 30
Determinación de los métodos a utilizar ................................................................ 30
Tipo de investigación .............................................................................................. 30
Diseño de la investigación ..................................................................................... 30
Descripción de la zona de estudio ....................................................................... 30
Procedimiento de la investigación ....................................................................... 31
CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 38
RESULTADOS ................................................................................................................... 38
Presentación de los resultados ................................................................................ 38
Discusión de los resultados ...................................................................................... 41
CAPITULO V ...................................................................................................................... 44
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................. 44
Conclusiones ................................................................................................................ 44
Recomendaciones........................................................................................................ 45
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................... 46
xv
LISTA DE CUADROS
Tabla 1. Clasificación sistemática de E. coli ............................................................................. 10
Tabla 2. Clasificación de los β-lactámicos ................................................................................ 18
Tabla 3. Clasificación de las β-lactamasas ............................................................................... 22
Tabla 4. Número de cepas BLEE y AmpC elegidas para el estudio...................................... 31
Tabla 5. Primers utilizados en el estudio ................................................................................... 33
Tabla 6. Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de la PCR ......................... 34
Tabla 7. Protocolo utilizado en la identificación del gen CTX-M ............................................ 34
Tabla 8. Protocolo utilizado en la identificación del gen SHV ................................................. 35
Tabla 9. Protocolo utilizado en la identificación del gen TEM ................................................ 35
Tabla 10. Protocolo utilizado en la identificación del gen CMY .............................................. 35
xvii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Ecología de los antibióticos y la resistencia antibiótica.. ...................................... 16
Gráfico 2. Resultado de una PCR para los genes de estudio. .............................................. 38
Gráfico 3. Cepas BLEE que presentan al menos uno de los tres genes de
estudio ............................................................................................................................................ 39
Gráfico 4. Número de genes CTX-M, SHV y TEM encontrados en las 212 cepas
BLEE ............................................................................................................................................... 39
Gráfico 5. Número de genes tipo BLEE encontrados en la misma cepa ............................. 40
Gráfico 6. Cepas AmpC que presentan el gen CMY ............................................................... 40
xix
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICACIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS EN CEPAS BLEE Y AmpC DE Escherichia Coli DE ORIGEN AVIAR.
Autor: Cristian Andrés Narvaez Manosalvas
Tutor: Dr. Christian Vinueza Msc.
Fecha: Diciembre, 2015
RESUMEN
Escherichia coli es un bacilo gramnegativo que reside en el tracto
gastrointestinal de los animales. Generalmente es un saprofito, sin
embargo existen patotipos capaces de causar enfermedad. Cepas de E.
coli que presentan genes que codifican para β-lactamasas van en
continuo aumento, lo cual es causa de preocupación para la salud pública
mundial. La presente investigación tuvo como objetivo reportar la
presencia de los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY en una colección de E.
coli BLEE obtenida de la industria avícola ecuatoriana. Se utilizaron
primers específicos de cada gen para identificar las secuencias de interés
mediante una PCR. De 212 cepas BLEE analizadas se encontró una
prevalencia de los genes CTX-M, TEM y SHV en el 90,6%, 42% y 10,4%
respectivamente. De las 67 cepas con fenotipo AmpC, el 91% resultaron
positivas a la presencia del Gen CMY. Estos resultados demuestran la
variedad de β-lactamasas presentes en la industria avícola ecuatoriana,
por lo que se recomienda la implementación de estudios adicionales que
ayuden a determinar la epidemiología de estos genes en el país.
Palabras clave: Escherichia coli, saprofito, patotipos, genes
xxi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IDENTIFICATION OF RESISTANCE GENES TO β-LACTAM ANTIBIOTICS IN ESBL/AmpC Escherichia coli ISOLATED FROM POULTRY.
ABSTRACT
Escherichia coli is a gram negative bacillus that resides in the
gastrointestinal tract of animals. Generally it is a saprophyte, but there are
pathotypes that cause disease. E. coli strains that have genes encoding β-
lactamases are continuously increasing, and are of global concern for
public health. The present study aimed to report the presence of CTX-M,
SHV, TEM and CMY genes in a collection of ESBL E. coli obtained from
the Ecuadorian poultry industry. Gene-specific primers were used to
identify sequences of interest by PCR. From 212 ESBL strains analyzed
prevalence of CTX-M, TEM and SHV genes was found in 90.6%, 42% and
10.4% respectively. From the 67 strains with AmpC phenotype, 91%
tested positive for the presence of Gen CMY. These results demonstrate
the variety of β-lactamases present in Ecuador's poultry industry. The
implementation of additional studies will help to determine the
epidemiology of these genes in Ecuador.
Keywords: Escherichia coli, commensal, pathovars, genes
1
INTRODUCCION
Escherichia coli es una bacteria gramnegativa que reside en el tracto
gastrointestinal de animales de sangre caliente (Zhou et al., 2015). La
mayoría de estos microorganismos corresponden a cepas no patógenas,
sin embrago, se han descrito cepas capaces de causar enfermedad en
humanos y animales (K. S. Baker, 2014; Dale & Woodford, 2015; Hasan
et al., 2011; Pitout, 2012).
El amplio uso de antibióticos para tratar infecciones bacterianas en
humanos y animales ha conducido a la presencia cada vez mayor de
bacterias resistentes a los antibióticos. Microorganismos que tienen la
capacidad de transmitir sus genes de resistencia a otras especies
bacterianas (Korzeniewska, Korzeniewska, & Harnisz, 2013; Livermore,
2012; Valentin et al., 2014).
El creciente número de bacterias resistentes a los β-lactámicos es de
particular importancia. Estos antibióticos son usados ampliamente en
medicina humana y veterinaria. El mecanismo más importante de esta
resistencia se debe a cepas productoras de β-lactamasas (Brouwer et al.,
2014; de Been et al., 2014; Jamborova et al., 2015; Smet et al., 2010; C.
Suárez & Gudiol, 2009).
Cepas de E. coli productoras de β-lactamasas de espectro extendido
(BLEE) o cepas tipo AmpC han sido aisladas de animales de producción,
siendo estos un reservorio de bacterias resistentes (Egervärn et al., 2014;
P. M. C. Huijbers et al., 2014; Reuland et al., 2015). Estos
microorganismos representan un riesgo en la transmisión de genes de
resistencia como lo han demostrado estudios en criadores de animales de
abasto (Hammerum et al., 2014).
Las principales enzimas tipo BLEE son: CTX-M, SHV y TEM (Kaarme,
Molin, Olsen, & Melhus, 2013; Moghaddam, Forghanifard, & Moshrefi,
2012). Dentro de este grupo CTX-M han tenido un aumento dramático,
2
siendo la más prevalente en todo el mundo (Brigante et al., 2005;
Feizabadi et al., 2010; Peerayeh, Eslami, Memariani, & Siadat, 2013).
En el grupo de las β-lactamasas tipo AmpC, CMY-2 es la más
frecuentemente encontrada en cepas de E. coli en todo el mundo
(Bortolaia, Hansen, Nielsen, Fritsche, & Guardabassi, 2014; Ohnishi et al.,
2013).
El presente estudio fue realizado en los laboratorios de Bacteriología de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y laboratorios de Biología
Molecular del CIZ. Se aplicaron técnicas microbiológicas y moleculares,
que permitieron determinar la existencia y prevalencia de genes tipo CTX-
M, SHV, TEM y CMY en la industria aviar, que confieren resistencia hacia
antibióticos β-lactámicos.
3
CAPITULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del problema
Los antibióticos han sido sin duda una de las drogas más exitosas de la
sociedad (Wright, 2011). Son ampliamente usados en la medicina humana
y veterinaria (Hernández, 2010; Schaumburg et al., 2014). Su amplio uso
ha sido correlacionado con el aumento de la resistencia antimicrobiana
(Lázaro, Iglesias, López, & Fernández, 2010). Esta resistencia tiene sus
peores consecuencias en los hospitales, especialmente en las unidades
de cuidados intensivos (Cisneros et al., 2010).
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la resistencia
bacteriana hacia los antibióticos es una de las tres mayores amenazas
para la salud (Piddock, 2012).
Se estima que en Europa, aproximadamente 400.000 pacientes cada año
sufren de una infección por bacterias resistentes a múltiples fármacos y
aproximadamente 25.000 mueren como consecuencia directa de esta
infección (Monnet, 2010).
La propagación de patógenos resistentes es un grave problema en la
salud pública de todo el mundo (Pomares et al., 2014; Rasheed,
Thajuddin, Ahamed, Teklemariam, & Jamil, 2014). A pesar de esta
creciente y continua resistencia bacteriana, diversos factores no han
permitido el desarrollo de nuevos antibióticos (García, 2010).
La introducción de antibióticos β-lactámicos, fue un gran paso en la
terapia de la medicina en contra de las infecciones bacterianas (C. M.
Dierikx et al., 2012; Randall et al., 2014; Wagner, Gally, & Argyle, 2014).
Estos antibióticos son muy utilizados, especialmente en infecciones
nosocomiales causadas por bacterias gramnegativas como E. coli
4
(Sedláková et al., 2014; Sun et al., 2010). Sin embargo, el desarrollo de
bacterias que poseen β-lactamasas de tipo BLEE o AmpC, es uno de los
mecanismos más comunes de resistencia en bacterias gramnegativas
hacia los mencionados antibióticos (Curello & MacDougall, 2014; Fischer
et al., 2014; Sharma, Sharma, & Ray, 2010).
Las infecciones causadas por E. coli productora de β-lactamasas limitan
severamente las opciones terapéuticas. Estas patologías se asocian con
un mayor tiempo de tratamiento, una mayor morbilidad y mortalidad
(Blaak et al., 2014; Knudsen & Andersen, 2014; von Salviati, Laube,
Guerra, Roesler, & Friese, 2015).
La prevalencia de E. coli productora de BLEE se ha incrementado tanto
en medicina humana como veterinaria (Mo et al., 2014). Este aumento es
una causa de preocupación para la salud pública, puesto que estos genes
son fácilmente transferibles entre bacterias. Además, los plásmidos que
albergan estos genes de resistencia, frecuentemente se acompañan de
genes que confieren resistencia hacia otros antibióticos (quinolonas y
aminoglucósidos), limitando de esta forma las opciones terapéuticas
(Endimiani, Rossano, Kunz, Overesch, & Perreten, 2012; Hayakawa et al.,
2013; Koga et al., 2015; Martinez, Garzón, & Mattar, 2012; Tofteland,
Dahl, Aasnæs, Sundsfjord, & Naseer, 2012).
Se ha propuesto que la propagación de infecciones causadas por BLEE,
especialmente del tipo CTX-M, es mayor en los países en vías de
desarrollo. Esto podría deberse a diversos factores socioeconómicos,
entre ellos, la auto-prescripción de antibióticos que se venden sin receta
médica (Villegas, Kattan, Quinteros, & Casellas, 2008).
5
Justificación
El problema de la resistencia a los antimicrobianos que presentan las
bacterias repercute en la práctica microbiológica, terapéutica,
epidemiológica y de la salud pública (L. Martínez & Calvo, 2010). Por esta
razón, el uso adecuado de los antimicrobianos requiere la participación
activa de varios sectores, ya que estos compuestos se encuentran entre
los fármacos más utilizados en los centros de salud (Gudiol, 2010;
Sánchez, Palomo, Ortega, & Ribas, 2010). Es así que en Europa, el
Centro Europeo para la Prevención y el Control de las Enfermedades
(ECDC) ha realizado varias campañas con este propósito (Campos,
Pérez, & Oteo, 2010).
Un informe de la Sociedad de Enfermedades Infecciosas de Estados
Unidos (IDSA) menciona que E. coli productora de BLEE requiere con
urgencia nuevas terapias (Peirano & Pitout, 2010).
La identificación de microorganismos productores de β-lactamasas en el
laboratorio clínico requiere personal capacitado e infraestructura
adecuada. Los estudios microbiológicos deben complementarse con
técnicas moleculares. De esta manera se pueden suministrar datos útiles
para una terapéutica adecuada y los factores de riesgo asociados con las
infecciones, para identificar la relación clonal entre microorganismos y
describir su epidemiología (Kaftandzieva, Trajkovska-Dokic, & Panovski,
2011; L. Martínez & Calvo, 2010; Sharma et al., 2010; J. Stuart et al.,
2010).
Estos precedentes han sido un motivo para la implementación de
programas de monitoreo de la resistencia a los antibióticos en los
animales productores de alimentos (Cindy Maria Dierikx, 2013).
En vista de la importancia en el área de la Salud Pública a nivel mundial
que se da a las cepas de E. coli productoras de β-lactamasas y los
escasos los estudios realizados en Ecuador sobre la presencia de genes
CTX-M, SHV y TEM en cepas BLEE, y del gen CMY en cepas AmpC de
6
E. coli. El presente estudio identifico la presencia de estos genes, así
como su frecuencia en cepas de E. coli de origen aviar. De esta manera
permitió tener un sustento científico para que en el futuro se pueda tomar
medidas adecuadas del manejo de antibióticos en la industria avícola
ecuatoriana.
Objetivos:
GENERAL:
Identificar genes de resistencia a antibióticos β-Lactámicos en cepas
BLEE y AmpC de E. coli de origen aviar, pertenecientes al banco de
cepas de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la
Universidad Central del Ecuador (UCE), utilizando técnicas de Biología
Molecular.
ESPECIFICOS:
1. Obtener ADN de cepas BLEE y AmpC de E. coli, pertenecientes al
banco de cepas de la FMVZ de la UCE.
2. Identificar la presencia de genes CTX-M, SHV y TEM, del banco de
cepas BLEE de E. coli, perteneciente al laboratorio de bacteriología
de la FMVZ de la UCE mediante la utilización de la PCR.
3. Identificar la presencia del gen CMY, del banco de cepas AmpC de
E. coli, perteneciente al laboratorio de bacteriología de la FMVZ de
la UCE mediante la utilización de la PCR.
7
CAPITULO II
MARCO TEORICO
Antecedentes de la Investigación
La forma en que se utilizan los antibióticos en la producción avícola ha
cambiado, especialmente en países europeos. La fuerza impulsora del
cambio radica en la noción de los potenciales riesgos percibidos con esta
práctica en la salud pública. Es así que los primeros estudios realizados
en Gran Bretaña demostraron la resistencia de E. coli a múltiples
antimicrobianos en muestras provenientes de la flora fecal de pollos de
engorde (Singer & Hofacre, 2006).
En Holanda se realizó un estudio para determinar la prevalencia de cepas
tipo BLEE y AmpC en E. coli, de muestras provenientes de pollos y del
personal que laboraba en granja (C. Dierikx et al., 2013).
En España de 260 muestras fecales tomadas mediante hisopado rectal de
pollos vivos, 237 cepas (91,1%) fueron caracterizadas como E. coli tipo
BLEE (Abreu et al., 2014).
En Ecuador en el 2014 se realiza un estudio para determinar la
prevalencia de E. coli BLEE. Las muestras se tomaron a partir de ciegos
de pollos faenados en camales de la provincia de Pichincha. De 145
muestras analizadas el 86,89% resultaros positivas (126/145) (Vásconez,
2015). Un estudio posterior en el 2015 cuantificó E. coli BLEE en puntos
críticos de control en los mismos camales, indicando que las mayores
cargas bacterianas de E. coli se encuentran en el eviscerado (Perez,
2015).
Adicionalmente, varios estudios realizados en hospitales del Ecuador, así
como en otros países, han reportado la presencia de microorganismos
productores de BLEE, entre ellos, E. coli (Alarcón, Obregón, & Suárez,
8
2011; Albarado et al., 2009; Arce, Llontop, Alarcón, & Lopez, 2014; León
& Pacheco, 2010; Pavón, Zalazar, Morales, & Rojas, 2011; Sana et al.,
2011).
Por último, un estudio realizado en comunidades del norte de la costa
ecuatoriana, concluyó que hay una fuerte correlación entre la virulencia y
resistencia a los antibióticos en E. coli (Zhang et al., 2015).
Por lo expuesto anteriormente, el tema de la resistencia hacia los
antibióticos causada por microorganismos productores de enzimas Tipo
BLEE y AmpC es de particular importancia a nivel mundial. Esta
importancia es tanto en la salud pública humana como veterinaria. El
presente trabajo permite aportar información de genes que confieren
resistencia a los antibióticos β-lactámicos presentes en la industria aviar.
Fundamentación Teórica
Generalmente se considera a los microorganismos como agentes
productores de enfermedades, pero no todos son dañinos, la mayoría son
apatógenos, muchos son muy útiles en la alimentación, industria,
ecología, etc. (Stanchi, 2007). Los microorganismos están ampliamente
distribuidos en el ambiente. En los organismos vivos constituyen la "flora
normal" en piel, mucosas e intestinos. Su importancia en Medicina
Veterinaria radica en que algunos de ellos, además de causar
enfermedad en los animales, tienen carácter zoonósico (Stanchi, 2007;
Winn et al., 2013c).
En el grupo de los microorganismos, las bacterias comprenden el mayor
grupo de patógenos (Stanchi, 2007; Winn et al., 2013c). Estas son
organismos unicelulares que contienen un ADN carente de membrana
nuclear (procariotas), ARN, junto con la maquinaria necesaria para crecer
y autorreplicarse. Si bien su estructura interna es simple, su envoltura
celular es compleja. Formando parte de esta envoltura se encuentra la
pared celular, que permite dividir las bacterias de acuerdo con su
9
capacidad de retener o no un colorante (Tinción de Gram) en
grampositivas y gramnegativas (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009c;
Stanchi & Gentilini, 2007b; Winn et al., 2013c).
La enterobacterias son el grupo más grande y diverso de bacilos
gramnegativos. Se recuperan frecuentemente de muestras clínicas y se
encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza (tierra, agua, sobre
las plantas, y tubo digestivo de humanos y animales) (Murray, Rosenthal,
& Pfaller, 2009b; Winn et al., 2013b). Estas Pueden ser agrupadas en tres
categorías: patógenos principales, patógenos oportunistas y no
patógenos. Los principales patógenos animales, E. coli, especies de
Salmonella y especies de Yersinia causan principalmente enfermedades
entéricas y sistémicas (Quinn et al., 2011).
Escherichia coli
Historia
Fue un pediatra nacido en Alemania en 1857, Theodor Escherich, que
tras estudios realizados en el tracto gastrointestinal de infantes presento
sus conclusiones acerca de la morfología, propiedades y efectos de las
poblaciones bacterianas, entre ellas Bacterium coli commune (bacilo de
colon común, conocido como Escherichia coli) (Fernández, Rodriguez,
Rodriguez, & Gomez, 2003; Shulman, Friedmann, & Sims, 2007). La
clasificación taxonómica de este bacilo se muestra en la Tabla 1.
10
Tabla 1. Clasificación sistemática de E. coli
Reino: Procariotas
División: Gracilicutes
Clase: Escotobacteria
Orden: Eubacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Tribu: Escherichieae
Género: Escherichia
Especie: coli
Fuente: Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2010a; Parma, 2007
Modificado por: El autor
Morfología
E. coli es un bacilo recto gramnegativo, mide entre 1,5 µm x 6 µm. Forma
colonias circulares de bordes continuos, convexas y en medios
diferenciales presenta brillo metálico (Parma, 2007; Winn et al., 2013c).
Elementos constitutivos
E. coli contiene un citoplasma morfológicamente simple, rodeado de una
membrana citoplasmática, la cual está delimitada por una pared celular
compleja y una membrana externa. Su material genético no está separado
del citoplasma por una membrana. Presenta ribosomas, fimbrias, flagelos
para la locomoción, y solo algunas cepas presentan cápsula (Parma,
2007; Willey, Sherwood, & Woolverton, 2008).
Citoplasma: en él se encuentran enzimas, iones, gránulos con
reserva de alimentos, ribosomas y el material genético, el ADN
(Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009a; Winn et al., 2013a).
Membrana citoplasmática: es el principal punto de contacto con el
medio externo (Willey et al., 2008). Posee una doble capa de
fosfolípidos (no contiene esteroles) (Murray et al., 2009a). Cumple
varias funciones, entre ellas, el mantenimiento de un potencial
eléctrico, transporte hacia el interior y exterior celular, producción de
11
energía y polímeros y replicación del ADN, debido a la presencia de
diversas enzimas (Brooks et al., 2010a; Foster, 2004; Murray et al.,
2009a; Winn et al., 2013a).
El periplasma: ubicado entre la membrana plasmática y la capa de
peptidoglucano, es un compartimento altamente viscoso ocupado por
diversas proteínas, tales como las β-lactamasas (Ruiz, Kahne, &
Silhavy, 2006).
Pared bacteriana: es externa a la membrana citoplasmática, confiere
la rigidez suficiente para mantener la forma celular (Winn et al.,
2013a). Protege a la célula de la lisis osmótica y sustancias tóxicas
(Willey et al., 2008). Estructuralmente está compuesta por dos capas:
1) una capa delgada de peptidoglucano (5% a 10% de la pared
celular) y 2) una membrana externa (Murray et al., 2009a).
Capa de peptidoglucano: es una malla formada por cadenas
lineales de polisacáridos unidas mediante péptidos (Murray et al.,
2009a). A diferencia de las bacterias grampositivas en
gramnegativas es una capa laxa, con un grosor de
aproximadamente 2 a 7 nm (Willey et al., 2008; Winn et al., 2013a).
La glucosamina tras una serie de reacciones enzimáticas da lugar
al disacárido GlcNAc-MurNAc, el que se une a una cadena
polipeptídica mediante transglucosilasas. En el exterior celular las
cadenas disacárido-polipeptídicas se entrecruzan entre sí mediante
un grupo de enzimas denominadas proteínas de unión a la
penicilina (PBP, penicillin binding protein) (Marcela & Monge, 2013;
Murray et al., 2009a; Winn et al., 2013e).
Membrana externa: compuesta por un lipopolisacárido que
contribuye a la carga negativa en la superficie bacteriana, la
adhesión, formación de biopelículas, permeabilidad selectiva y
protección de las defensas del huésped. Consta de tres
componentes: 1) el lípido A, también llamado endotoxina, su
estructura general es idéntica en todas las enterobacterias, 2)
polisacárido central, similar entre especies o géneros bacterianos y
12
3) polisacárido O, llamado también antígeno O, provoca una
respuesta inmune y confiere particularidad serológica en especies
bacterianas (serotipos), mediante el cual se puede diferenciar
distintas cepas como la O157:H7 de E. coli (Murray et al., 2009a;
Stanchi & Gentilini, 2007b; Willey et al., 2008; Winn et al., 2013a).
Nucleoide: Su material genético, el cromosoma, es una molécula
circular única de ADN bicatenario (Murray et al., 2009a; Willey et al.,
2008).
Plásmidos: Además del cromosoma, muchas procariotas contienen
ADN extracromosómico, el plásmido, que puede ser circular o lineal,
capaz de replicarse en forma autónoma. Aunque su información
genética no es esencial, posee relativamente pocos genes que pueden
codificar para factores de virulencia, como la resistencia a los
antimicrobianos (plásmidos R) (Harbottle, Thakur, Zhao, & White,
2006; Moreno M, González E, & Beltrán, 2009; Willey et al., 2008;
Winn et al., 2013a).
Ribosomas: están formados por proteínas y ARN. Son las estructuras
físicas donde se sintetizan proteínas. (Willey et al., 2008).
Flagelos: son apéndices filiformes que se extienden desde la
membrana plasmática hacia afuera (Willey et al., 2008). Permiten que
las bacterias se dirijan hacia los nutrientes o se alejen de sustancias
tóxicas (Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2010b). E. coli
presenta flagelos perítricos, sin embrago, existen cepas sin flagelos
carentes de movilidad (Parma, 2007).
Pilosidades o fimbrias: estas estructuras presentan un menor
diámetro y longitud que los flagelos (Stanchi & Gentilini, 2007a). Es
aceptado el término fimbria para describir estructuras relacionadas con
la adherencia bacteriana y el término pili sexual, a estructuras
relacionadas con la transferencia de ADN en la conjugación bacteriana
(Brooks et al., 2010b; Stanchi & Gentilini, 2007a).
13
Patotipos de E. coli
Desde que E. coli se descubrió ha sido muy estudiada en numerosos
laboratorios de todo el mundo, no solo es un habitante intestinal
inofensivo, también un patógeno altamente versátil (Hacker & Blum-
Oehler, 2007; Sun et al., 2010). Normalmente coloniza el tracto
gastrointestinal pocas horas después del nacimiento. La mayoría de las
cepas son comensales y rara vez causan enfermedad (Kaper, Nataro, &
Mobley, 2004; Meng, LeJeune, Zhao, & Doyle, 2013). Sin embargo, hay
cepas que han adquirido factores de virulencia específicos que les
confieren una mayor capacidad de adaptación a nuevos nichos, dando
lugar a patotipos que pueden causar enfermedad en presencia de
determinados factores predisponentes (Croxen & Finlay, 2009; Kaper et
al., 2004; Quinn et al., 2011). En general las cepas patógenas de E. coli
se pueden dividir en aquellas que causan enfermedades entéricas y
extraintestinales. Los patotipos que pueden producir enfermedad entérica
en humanos y animales de manera general incluyen a: 1) ETEC (E. coli
Enterotoxigénica), 2) AEEC (E. coli Adherente) y 3) EAggEC (E. coli
Enteroagregativa) (Pereira et al., 2013; Quinn et al., 2011). Los patotipos
que tienen la capacidad de producir enfermedad extraintestinal,
denominados de manera general como ExPEC (E. coli patogénica
Extraintestinal) provocan enfermedades en animales y seres humanos
(colibacilosis) (Copes, 2007; Danzeisen, Wannemuehler, Nolan, &
Johnson, 2013). En los animales estas ExPEC pueden a su vez
subdividirse en: 1) APEC (E. coli patogénica Aviar), 2) SEPEC (E. coli
Septicémica), 3) UPEC (E. coli Uropatogénica) y 4) patógenos
Oportunistas (Dai et al., 2010; Quinn et al., 2011).
Colibacilosis Aviar
Esta enfermedad infecciosa causada por E. coli afecta a aves de todas las
edades, es considerada como una de las principales causas de morbilidad
y mortalidad. Causa fuertes pérdidas económicas en la industria avícola
14
de todo el mundo (Dziva & Stevens, 2008; Lutful Kabir, 2010; Oosterik,
Peeters, Mutuku, Goddeeris, & Butaye, 2014). El riesgo de esta
enfermedad aumenta con la presencia de factores que deterioran el
estado inmunológico de las aves. El reservorio más importante es el tracto
intestinal de mamíferos y aves. Además, está presente en las heces, agua
y alimentos contaminados (Lutful Kabir, 2010; Parma, 2007).
Las medidas preventivas están encaminadas a prevenir la contaminación
en los huevos, tener una infraestructura adecuada, implementar buenas
medidas de bioseguridad, realizar el control de plagas, entre otras (Lutful
Kabir, 2010). A pesar de que la mayoría de las cepas APEC aviares y
ExPEC humanas difieren, algunos trabajos sugieren que una posible
fuente de cepas ExPEC que colonizan humanos provendrían de carne de
aves contaminada (Danzeisen et al., 2013). Hay estudios que indican que
cepas patógenas para humanos se han aislado ocasionalmente de aves
de corral enfermas y sanas (Lutful Kabir, 2010). Cepas de E. coli
resistentes a los antibióticos procedentes del intestino de las aves,
pueden contaminar las canales durante el faenamiento y ser ingeridas. De
esta manera, bacterias multirresistentes podrían colonizar el tracto
intestinal humano, transferir sus genes de resistencia a bacterias
patógenas y causar infección (Dziva & Stevens, 2008; Lutful Kabir, 2010;
Oosterik et al., 2014; Singer & Hofacre, 2006).
Importancia de la resistencia bacteriana
Después de muchos años fuera de la luz pública, la resistencia a los
antimicrobianos adquiere importancia mundial en la agenda política y
científica, haciéndose presente en los medios de información general,
traspasando los límites de la literatura médica (Alós, 2014; S. Baker,
2015). Según la OMS, la resistencia de los microorganismos hacia los
antibióticos es uno de los mayores problemas que enfrenta la salud
pública mundial (Galán, Moreno, & Baquero, 2014). Las infecciones
nosocomiales son un problema que enfrentan los centros de salud. Hasta
15
el 10% de los pacientes hospitalizados adquieren una infección
intrahospitalaria, valores similares tanto en la práctica humana como
veterinaria (en pequeñas especies) (Buriticá, Echeverry, Jaimes, &
Gómez, 2012). Al mantener pacientes en estado infeccioso, no solo
aumentan los costos de los tratamientos si no también se facilita la
transmisión de la enfermedad a otras personas (Alós, 2014; Fernandes,
Amador, Oliveira, & Prudêncio, 2014; Fica, 2014; Galán et al., 2014). En
los centros de salud de muchos países la resistencia a múltiples drogas
en infecciones por bacilos gramnegativos, ha restringido severamente las
opciones terapéuticas (Carlet et al., 2011). Se estima que 25000 personas
fallecen cada año en Europa por infecciones causadas por bacterias
resistentes a los antibióticos, particularmente aquellas productoras de
BLEE. Un reciente informe de los Centros para el Control y la Prevención
de Enfermedades (CDC) estima que por lo menos 2 millones de
enfermedades y 23000 muertes al año en los EE.UU. fueron causadas
por microorganismos resistentes (Blair, Webber, Baylay, Ogbolu, &
Piddock, 2015; Laxminarayan et al., 2013; Sütterlin et al., 2014).
Causas que favorecen la presencia de bacterias resistentes
Según la organización mundial de la salud, el excesivo e inapropiado uso
de antibióticos en la medicina humana y veterinaria, se considera la más
importante causa de la creciente resistencia bacteriana (Hansen,
Hoffmann, McCullough, van Driel, & Del Mar, 2015; Rodríguez-Rojas,
Rodríguez-Beltrán, Couce, & Blázquez, 2013). Recientes estudios
mencionan que las concentraciones de antibióticos muy por debajo de la
concentración mínima inhibitoria (CIM) seleccionan bacterias resistentes
(Fica, 2014). Estas bajas concentraciones de antibióticos se encuentran
en muchos entornos naturales (aguas residuales, ríos, lagos e incluso en
el agua de beber), también en los pacientes, ganado, acuacultura y
agricultura, durante el uso de antibióticos. Estos factores conllevan a un
ciclo continuo de antibióticos, con el riesgo de seleccionar bacterias
resistentes en el medioambiente donde se espera que la probabilidad de
16
la transferencia horizontal de genes de resistencia sea alta (Andersson &
Hughes, 2014; Blaak et al., 2015; Dahshan, Abd-Elall, Megahed, Abd-El-
Kader, & Nabawy, 2015; J. L. Martínez, Coque, & Baquero, 2015) .
Además de seleccionar bacterias resistentes, se ha documentado en E.
coli que dosis subletales de antibióticos se correlacionan
significativamente con un aumento en la mutagénesis por diversos
mecanismos. Este hecho aumenta la variabilidad genética y la capacidad
de resistir la acción de los antimicrobianos (Rodríguez-Rojas et al., 2013).
En el Gráfico 1 se muestra la ecología de los antibióticos y la resistencia a
estos.
Gráfico 1. Ecología de los antibióticos y la resistencia antibiótica. Los antibióticos se liberan en el medio ambiente, ejerciendo una presión selectiva sobre las bacterias, favoreciendo el desarrollo de cepas resistentes. Tomado de: Andersson & Hughes, 2014
El uso de pequeñas dosis de antibióticos en la industria animal es una
práctica difundida. Es así que en Estados Unidos entre el 2009 y 2010 se
emplearon 4 veces más de antibióticos en animales que en humanos,
especialmente como promotores de crecimiento (Alós, 2014; Carlet et al.,
17
2011; Fica, 2014). En los países de bajos ingresos, estos antibióticos
suelen ser de la misma clase a los que se utilizan en la terapia humana
(S. Baker, 2015; Laxminarayan et al., 2013). Las bacterias y sus genes de
resistencia pueden diseminarse de los animales a los humanos, a través
del contacto directo y la cadena alimentaria (Grave et al., 2014; Leigue,
Moura, Aguilar, Pestana, & Lincopan, 2013). La fuente más probable de
bacterias resistentes en los alimentos de origen animal sería la
contaminación de las canales con los intestinos de los animales durante la
matanza, así como en otras etapas de la cadena alimentaria. Se estima
que de las 100000 - 200000 toneladas de antibióticos fabricados cada
año, la mayoría son utilizados en la agricultura, horticultura y sector
veterinario (Laxminarayan et al., 2013).
Antimicrobianos
Un antimicrobiano se define como toda sustancia de origen natural o
sintético que inhibe el desarrollo o mata a un microorganismo. Los
antibióticos tienen estas mismas propiedades, excepto que son
producidos de manera natural por microorganismos (Gentilini, 2007). Fue
Alexander Fleming en 1928, quien descubrió la penicilina al mirar como
en una placa de agar se había inhibido el crecimiento de Staphylococcus
aureus por un hongo, Penicillium notatum, hecho que dio lugar a la
revolución de la terapia antiinfecciosa (Capita & Calleja, 2013). Los
antibióticos son clasificados de acuerdo a su mecanismo de acción
(Sumano & Ocampo, 2006).
β-lactámicos. La mayoría de antibióticos que inhiben la síntesis de la
pared celular se clasifican como β-lactámicos (Alós, 2014; Gentilini, 2007).
Tienen semejanza estructural al sustrato de las PBP, por lo que inhiben la
formación del peptidoglucano, dando como resultado final la lisis
bacteriana (Murray et al., 2009a; Winn et al., 2013a). La clasificación de
estos antibióticos se muestra en la Tabla 2.
18
Inhibidores de las β-lactamasas (IBL). Son compuestos que presentan
semejanza estructural a los β-lactámicos, por tanto pueden unirse a las β-
lactamasas evitando la hidrólisis de los β-lactámicos, manteniendo de
esta manera el mecanismo de acción de estos (Winn et al., 2013e).
Tabla 2. Clasificación de los β-lactámicos
CLASE GRUPO ALGUNOS EJEMPLOS
β-lactámicos Penicilinas naturales Penicilina G, Penicilina V
Penicilinas resistentes a penicilinasas Meticilina, Nafcilina, Oxacilina, Cloxacilina
Aminopenicilinas Ampicilina, Amoxicilina
Carboxipenicilinas Carbenicilina, Ticarcilina
Ureidopenicilinas Mezlocilina, Piperacilina
Carbapenenmes Imipenem, Meropenem
Monobactámicos Aztreonam
Combinaciones de β-lactámicos con inhidores de
β-lactamasas
Amoxicilina-Clavulánico, Ampicilina-
Sulbactam
Carbacefem Loracarbef
Cefalosporinas de primera generación Cefalotina, Cefalexina, Cefazolina,
Cefaloridina
Cefalosporinas de segunda generación Cefaclor, Cefámandol, Cefuroxima ,
Cefatrizina
Cefalosporinas de tercera generación Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftacidima,
Cefixima, Ceftiofur
Cefalosporinas de cuarta generación Cefepima, Cefpiroma
Cefamicinas Cefoxitina, Cefotetán
Glucopeptidos Glucopeptidos Vancomicina, Teicoplanina
Fosfomicinas Fosfomicina
Otros Bacitracina, Fosfomicina, Isoniacida,
Cicloserina.
Fuente: Gentilini, 2007; Winn et al., 2013e Modificado por: El Autor.
Resistencia de los microorganismos a los antibióticos
Desde su descubrimiento en el siglo pasado, los antibióticos han permitido
la sobrevivencia de millones de individuos a infecciones bacterianas, lo
cual ha aumentado la esperanza de vida en la población. Sin embargo, su
utilidad se ha visto amenazada por la creciente resistencia bacteriana,
definida como la capacidad que tienen las bacterias a sobrevivir en
19
determinadas concentraciones de antibióticos que serían letales para
otras de su misma especie (Alós, 2014; Carlet et al., 2011). Esta
resistencia aumenta frente a la exposición de un antimicrobiano, ya que
en presencia de este, únicamente crecerán las bacterias resistentes a él
(Alós, 2014; Fica, 2014). Se ha dicho que esta resistencia no es otra cosa
que la expresión de arcaicos mecanismos de sobrevivencia que permitían
que las bacterias sobrevivan en ambientes agresivos (Casellas, 2011;
Spellberg, Bartlett, & Gilbert, 2013). Es así que, estudios realizados sobre
la resistencia bacteriana a los antimicrobianos, demuestran que en la
amazonia ecuatoriana existen bacterias ambientales que poseen genes
de resistencia hacia antibióticos como ampicilina, tetraciclina y
eritromicina, en áreas sin intervención humana (Valencia, 2009). Este
problema es agravado por la existencia de bacterias que presentan más
de un mecanismo para resistir la acción de los antibióticos y que tienen la
capacidad de transmitirlo a su descendencia, o a otras especies
bacterianas (Moreno M et al., 2009).
Tipos y mecanismos generales de resistencia
Natural o intrínseca: es propia de la morfología y fisiología de la
especie, presente en el genoma de todo un género microbiano
hacia antibióticos específicos (Gentilini, 2007).
Mutacional: producida por cambios espontáneos en la secuencia
de nucleótidos del ADN. El cambio puede darse en genes
preexistentes o adquiridos (Gentilini, 2007).
Adquirida: se debe a la transferencia horizontal de genes de
resistencia anteriormente inexistentes en la bacteria, mediante
conjugación, transformación o transducción (Gentilini, 2007;
Moreno M et al., 2009).
Conjugación: el mecanismo más importante, lo usan bacterias
gramnegativas e incluso grampositivas, una bacteria donadora
transfiere su material genético (plásmidos) a una receptora
mediante el pili sexual (Gentilini, 2007; Winn et al., 2013e). Los
20
elementos que participan en la transferencia son: 1) plásmidos,
2) transposones, que son pequeñas secuencias de ADN que
pueden moverse e integrarse entre plásmidos, de un cromosoma
a un plásmido o viceversa y no se autorreplican y 3) integrones,
secuencias de ADN que no pueden transponerse, pero se
asocian a transposones y plásmidos. Estos pueden integrar
varios genes de resistencia. Esta integración implica que el uso
de un antibiótico que induzca la expresión de un gen de
resistencia, seleccione resistencia hacia otros antibióticos, cuyos
genes de resistencia están en el integrón (Alós, 2014; Gentilini,
2007). El plásmido de E. coli aviar, el Papec-O2-R, contiene
genes de resistencia a metales pesados, un gen de resistencia a
compuestos de amonio cuaternario, y hasta ocho genes de
resistencia a antibióticos diferentes. Todos o alguno de estos
genes pueden estar bajo presión de selección en el entorno de
las aves de corral, lo cual hace suponer que la persistencia de la
resistencia hacia un antibiótico determinado puede presentarse
en ausencia al mismo (Singer & Hofacre, 2006).
Transformación: en este proceso el ADN desnudo de una
bacteria presente en el medio extracelular, puede incorporarse al
genoma de otra bacteria y expresarse, generalmente se da entre
géneros muy relacionados (Gentilini, 2007; Moreno M et al.,
2009).
Transducción: el ADN de un plásmido es incorporado y luego
transferido a otra bacteria mediante un virus que infecta
bacterias (bacteriófago) (Moreno M et al., 2009).
21
Mecanismos de resistencia hacia antibióticos β-
lactámicos
Modificaciones de las PBP: cambios estructurales en las PBP por
mutaciones en los genes que las codifican da lugar a una menor
afinidad hacia todos los antibióticos β-lactámicos (Gentilini, 2007;
Marcela & Monge, 2013; Moreno M et al., 2009).
Inactivación enzimática mediada por β-lactamasas: las β-
lactamasas son un mecanismo frecuente de resistencia, inactivan
los antibióticos mediante ruptura del anillo β-lactámico y se ubican
a nivel extracelular o en el espacio periplásmico (Gentilini, 2007;
Moreno M et al., 2009; Urumova, 2015). Los bacilos gramnegativos
se caracterizan por una producción de β-lactamasas mucho más
variada y compleja que las bacterias grampositivas (Winn et al.,
2013e). Estas enzimas han sido clasificadas en base a su
secuencia de aminoácidos, perfiles inhibitorios e hidrolíticos y
actualmente en características específicas de cada enzima
(Marcela & Monge, 2013). Se ha descrito alrededor de 963 tipos de
β-lactamasas funcionales diferentes, En la Tabla 3 se indica la
clasificación de estas enzimas (Bush & Jacoby, 2010). La mayoría
de las nuevas β-lactamasas se diferencian entre sí por el cambio
de un único aminoácido en su secuencia proteica, pero con
profundos efectos para el manejo de las enfermedades infecciosas
(Winn et al., 2013e). Estas subclases de enzimas pueden degradar
diferentes antibióticos pertenecientes a un mismo grupo (Blair et
al., 2015).
22
Tabla 3. Clasificación de las β-lactamasas
Familia
de
Enzimas
Grupo funcional
o subgrupo
No. de enzimas Enzimas representativas
CMY 1, 1e 50 CMY -1 a CMY- 50
TEM 2b, 2be, 2br, 2ber 172
2b 12 TEM -1, TEM – 2, TEM – 13
2be 79 TEM -3. TEM- 10, TEM-26
2br 36 TEM-30 (IRT-2), TEM -31 (IRT-
3),TEM – 163
2ber 9 TEM -50 (CMT- 1), TEM -158
(CMT -9)
SHV 2b, 2be, 2br 127
2b 30 SHV -1, SHV – 11, SHV -89
2be 37 SHV – 2, SHV – 3, SHV – 115
2br 5 SHV – 10, SHV – 72
CTX-M 2be 90 CTX –M -1, CTX-M-44, a CTX –
M- 92
PER 2be 5 PER -1 a PER – 5
VEB 2be 7 VEB -1 a VEB- 7
GES 2f 15 GES – 2 a GES -7, GES -15
KPC 2f 9 KPC- 2 a KPC-10
SME 2f 3 SME -1, SME- 2, SEM -3
OXA 2d, 2de, 2df 158
2d 5 OXA -1, OXA -2, OXA -10
2de 9 OXA -11, OXA – 14, OXA -15
2df 48 OXA -23, OXA – 51, OXA -58
IMP 3a 26 IMP -1, IMP -26
VIM 3a 23 VIM – 1, VIM – 23
IND 3a 8 IND -1, IND -2, IND -2a, IND -3,
a IND -7
Fuente: Bush & Jacoby, 2010 Modificado por: El Autor
Disminución de la permeabilidad: se da cuando el antibiótico no
puede ingresar a la célula a través de las porinas de las bacterias
gramnegativas. Esta resistencia puede ser natural, como en el caso
de las porinas de P. aeruginosa que pueden ser hasta 90 veces
23
menos permeables que las de E. coli. La resistencia adquirida se
debe a mutaciones en los genes que las codifican, dando lugar a la
modificación en el tamaño, carga eléctrica de las porinas o a una
menor expresión, lo que afecta el acceso de los antibióticos a las
PBP (Babic, Hujer, & Bonomo, 2006; Gentilini, 2007; Marcela &
Monge, 2013; Moreno M et al., 2009; C. J. Suárez, Kattán,
Guzmán, & Villegas, 2006; Vila & Marco, 2010).
Bombas de Eflujo: son canales proteicos bacterianos que pueden
expulsar moléculas de antibióticos u otras moléculas tóxicas para
las bacterias del citoplasma o periplasma (Gentilini, 2007).
La resistencia en E. coli
La resistencia a muchas clases de antimicrobianos en E. coli humana y
animal se ha reportado en todo el mundo. Esta multirresistencia presenta
un desafío importante para la eficacia terapéutica. Por tanto, la detección
de estas Enterobacteriaceae resistentes se ha convertido en un tema de
preocupación mundial, tanto en medicina humana como veterinaria. La
resistencia a antibióticos β-lactámicos que presenta E. coli ha sido bien
documentada, siendo el mecanismo principal la producción de enzimas
tipo BLEE o AmpC (Brunton, Reeves, Snow, & Jones, 2014; Meunier,
Jouy, Lazizzera, Kobisch, & Madec, 2006).
β-lactamasas tipo BLEE
Este grupo de enzimas pueden hidrolizar una gran variedad de β-
lactámicos, mas no cefamicinas ni carbapenémicos y son inhibidas por el
ácido clavulánico. La amplia difusión de estas enzimas en los hospitales y
animales de producción es de gran preocupación y representa un
problema para el tratamiento de enfermedades infecciosas. (Brunton et
al., 2014; Fica, 2014; Silva et al., 2012). En este grupo se encuentran
24
enzimas de las familias TEM, SHV, CTX-M, y otras con menor prevalencia
como PER, VEB, BES, GES, TLA, SFO y OXA (Navarro, Calvo, Cantón,
Fernández-Cuenca, & Mirelis, 2011; Poole, 2004). La resistencia de cepas
productoras de BLEE a los β-lactámicos suele asociarse con la resistencia
a los aminoglucósidos, fluoroquinolonas y clotrimoxazol, dado que los
genes que confieren tal resistencia suelen ubicarse en el mismo plásmido
(Egea et al., 2012; Gentilini, 2007; Moreno M et al., 2009; Silva et al.,
2012). Cepas de E. coli tipo BLEE han sido detectadas en todo el mundo.
Son las enzimas más prevalentes en Enterobacteriaceae, asociadas con
infecciones nosocomiales (Carattoli, 2008; Liebana et al., 2013; Paterson
& Bonomo, 2005). También han sido aisladas en humanos y animales
sanos, así como en productos alimenticios como la carne, el pescado, y
leche cruda (James Stuart et al., 2012; Zurfluh, Hachler, Nuesch-
Inderbinen, & Stephan, 2013). Se ha estimado que la prevalencia de E.
coli tipo BLEE a nivel hospitalario en América Latina, Asia, Europa y
Norte América, es del 13,5%, 12,0%, 7,6%, y 2,2% respectivamente
(Falagas & Karageorgopoulos, 2009).
Detección fenotípica de E. coli BLEE
La detección de enzimas BLEE no siempre es fácil, pues su fenotipo
depende de la cantidad de enzima producida y de la presencia o no de
otros mecanismos de resistencia. La detección fenotípica de estas
enzimas se fundamenta en su capacidad de hidrolizar cefalosporinas de
tercera y cuarta generación, y que son inhibidas por el ácido clavulánico.
Existen diversas pruebas basadas en esta acción inhibitoria, entre ellas la
técnica de disco-difusión. Esta prueba se fundamenta en el diámetro de
los halos de inhibición de algunos antibióticos betalactámicos y en la
sinergia producida entre cefalosporinas de amplio espectro o
monobactámicos con el ácido clavulánico (Navarro et al., 2011).
25
β-lactamasas tipo AmpC
Estas enzimas pertenecientes a la clase molecular C de Ambler (Navarro
et al., 2011). Están codificadas por el gen AmpC, resisten la acción de
cefalosporinas, bencilpenicilinas y cefemicidas, no son inhibidas por
inhibidores de β-lactamasas ni EDTA, lo que obliga a los hospitales a
usar carbapenems cuando estas enzimas están presentes en infecciones
bacterianas (Blaak et al., 2015; Fica, 2014; Marcela & Monge, 2013). La
producción de enzimas AmpC puede ser constitutiva o inducible. Cuando
se expresa constitutivamente, puede hacerlo a niveles basales cuando la
localización es cromosómica o en grandes cantidades cuando es de
localización plasmídica. La forma inducible se da por exposición a
antibióticos β-lactámicos, cuando los productos de degradación de la
pared celular activan la proteína AmpR, la cual a su vez activa la
expresión del gen ampC, el que codifica para β-lactamasas tipo AmpC
(Navarro et al., 2011; Rubin & Pitout, 2014; C. J. Suárez et al., 2006). Los
genes blaAmpC plasmídicos procedentes del cromosoma bacteriano
incluyen a CIT, DHA, ACC, FOX, MOX, EBC, ACT y CMY (Navarro et al.,
2011; C. J. Suárez et al., 2006). Los plásmidos que llevan genes AmpC
pueden acompañarse de genes de resistencia a los aminoglucósidos,
cloranfenicol, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, trimetoprim,
mercurio, así como los genes para otras β-lactamasas tipo BLEE (Jacoby,
2009; Urumova, 2015).
Detección fenotípica de E. coli AmpC
Los métodos fenotípicos utilizados en la detección de cepas de E. coli
productoras de enzimas AmpC plasmídicas suelen ser económicos y
sencillos, pero no en cepas que presentan una AmpC cromosómica
natural o la expresen constitutivamente a un nivel muy basal como en E.
coli. El indicador de mayor utilidad es su resistencia a inhibidores de β-
lactamasas. Los más adecuados por su eficacia, sencillez y bajo costo
son el método sinérgico de doble disco y el de discos combinados con
inhibidores (Navarro et al., 2011).
26
Identificación molecular de genes CTX-M, SHV, TEM y CMY
Luego de una identificación fenotípica de cepas BLEE o AmpC, la
identificación final se lleva a cabo por la caracterización molecular de los
genes que confieren resistencia, utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (Helmy & Wasfi, 2014; Liebana et al., 2013; Mezger et
al., 2015).
Genes tipo CTX-M
Los genes BLEE más extendidos son aquellos que codifican enzimas
CTX-M. Estos han tenido éxito en la colonización intestinal migrando del
cromosoma de especies del género Kluyveraba a plásmidos de E. coli
(Alós, 2014; Liebana et al., 2013; Smet et al., 2010). Estas enzimas
comprenden cinco subfamilias en las que existe gran variabilidad. Estas
subfamilias comprenden a CTX-M1, CTX-M2, CTX-M8, CTX-M9 y CTX-
M25 (Fica, 2014). En la actualidad 150 variantes han sido identificadas,
las cuales predominan sobre las enzimas TEM y SHV. El nombre CTX-M
se deriva de la actividad preferente de las enzimas para hidrolizar
cefotaxima o ceftriaxona, mientras que el '' M '' se refiere a Munich, ciudad
donde estas enzimas fueron descritas por primera vez. Una de las
propiedades de éstas enzimas es su amplia distribución en varias partes
del mundo a nivel nosocomial y comunitario (Fica, 2014; Rubin & Pitout,
2014).
La colonización intestinal de personas sanas por enterobacterias
productoras de enzimas BLEE tipo CTX-M ha alcanzado niveles de
pandemia en pocos años, se calcula que hay 1.753 millones de personas
colonizadas por bacterias productoras de estas enzimas (Alós, 2014). De
particular importancia son las enzimas CTX-M-14 y CTX-M-15, como
causas importantes en infecciones de las vías urinarias y del torrente
sanguíneo (Rubin & Pitout, 2014). Estas bacterias se han identificado en
zorros, animales de compañía, equinos, aves, cerdos, ganado, codornices
y conejos en muchos países como: Corea, Japón, China, países
27
europeos, etc. (Alós, 2014; Blair et al., 2015; Carattoli, 2008; Rubin &
Pitout, 2014; Stefani et al., 2014; Sun et al., 2010; Wasyl, Hasman,
Cavaco, & Aarestrup, 2012; Zheng et al., 2012).
Genes tipo SHV
Estos genes se originan a partir del cromosoma de K. pneumoniae (Smet
et al., 2010). Estas enzimas fueron descritas por primera vez en la década
de 1970 cuando se demostró su capacidad de hidrolizar penicilinas y
cefalosporinas de primera generación. A partir de 1980 se describe su
capacidad de generar resistencia a cefalosporinas de tercera generación.
En la actualidad 182 variantes SHV han sido descritas. Se ha identificado
en aves, caballos, cerdos, perros, alimentos para animales, etc. en
distintos países (Carattoli, 2008; Lazarus, Paterson, Mollinger, & Rogers,
2015; Pouget, Coutinho, Reid-Smith, & Boerlin, 2013; Stefani et al., 2014;
Sun et al., 2010; Wasyl et al., 2012).
Genes tipo TEM
El primer tipo de enzima descrita mediada por un plásmido, la TEM-1, se
aisló en 1965 en Grecia (Atenas) de un paciente llamado Temoneira a
partir de E. coli de un cultivo de sangre (Grover, Sahni, & Bhattacharya,
2013; Paterson & Bonomo, 2005; Shah, Hasan, Ahmed, & Hameed,
2004). Originalmente confería resistencia a penicilinas y cefalosporinas de
primera generación. Las mutantes que han aparecido muestran un mayor
espectro de resistencia. Se han descrito 216 variantes de TEM (Rubin &
Pitout, 2014).
Genes tipo CMY
Entre las enzimas tipo AmpC, CMY representa con mucho la β-lactamasa
más frecuente en la ganadería europea (Laube et al., 2013). CMY-2 es la
enzima con la distribución geográfica más amplia y una causa importante
de la resistencia a β-lactámicos (Smet et al., 2010). Esta enzima se ha
identificado a nivel global, tanto en animales como piensos (Jacoby, 2009;
28
Jure et al., 2011; Lazarus et al., 2015; Nilsson, Borjesson, Landén, &
Bengtsson, 2014; Vingopoulou et al., 2014; Wasyl et al., 2012).
La PCR
El diagnóstico de agentes infecciosos suele requerir el uso de
aislamientos bacteriológicos junto a la identificación y sensibilidad a los
antibióticos del agente aislado (Craver, 1988; Fournier, Dubourg, &
Raoult, 2014). La PCR (The polymerase chain reaction) permite este
diagnóstico sin la necesidad de un cultivo (Craver, 1988), pues tiene la
capacidad de replicar de manera automatizada segmentos específicos de
ADN in vitro, creando millones de copias de estas secuencias (Bej,
Mahbubani, & Atlas, 1991; Erlich, 1989). La estrategia de la PCR en la
identificación de marcadores de resistencia es adecuada en la
identificación de genes de resistencia particulares, lo cual permite
instaurar medidas terapéuticas adecuadas (Fournier et al., 2014).
Fundamento
La PCR es una reacción enzimática que amplifica exponencialmente
secuencias específicas de ADN (Tamay de Dios, Ibara, & Velasquillo,
2013). Esta reacción es similar a la que ocurre en una célula cuando se
divide en dos células hijas (Renneberg, 2012). El método consiste en
ciclos automáticos y repetitivos de tres pasos: 1) desnaturalización del
ADN, 2) hibridación del cebador y 3) extensión del cebador por la ADN
polimerasa. Cada uno de estos pasos necesita grados variables de
temperatura (Bej et al., 1991; Renneberg, 2012). Los tres pasos
mencionados constituyen un ciclo que puede durar de 3 a 5 minutos, que
se repite de 20 a 40 veces (Craver, 1988; Erlich, 1989).
Interpretación de los resultados
Si las secuencias de ADN diana han sido amplificadas, y una cantidad
suficiente de ADN está presente en la muestra, este puede detectarse
mediante electroforesis en un gel de agarosa. La electroforesis en gel de
agarosa permite identificar el tamaño de los ácidos nucleicos en base a su
29
tamaño y carga eléctrica. El ADN al tener una carga eléctrica neta
negativa, migra a través del gel hacia el polo positivo, (Craver, 1988;
Giovambattista et al., 2007; Karp, 2009; Winn et al., 2013d).
30
CAPÍTULO III
METODOLOGIA
Determinación de los métodos a utilizar
Tipo de investigación
El presente estudio fue una investigación observacional y descriptiva.
Diseño de la investigación
Esta investigación empleó un diseño observacional descriptivo, pues se
estudió en un grupo de cepas características de interés, sin manipulación
de las variables. También fue retrospectiva transversal, pues parte de un
banco de cepas clasificadas como BLEE y AmpC de E. coli, sin que se
haga un seguimiento posterior de las mismas (Jaramillo, 2010).
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de laboratorio se realizó en los laboratorios de Bacteriología de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la Universidad
Central del Ecuador y laboratorios de Biología Molecular del Centro
Internacional de Zoonosis (CIZ). Laboratorios ubicados en las calles
Jerónimo Leitón y Gato Sobral, dentro de la ciudadela Universitaria,
cantón Quito, en la provincia Pichincha.
Población
La población objeto de estudio correspondió al banco de cepas BLEE y
AmpC de E. coli, de la FMVZ, proveniente del proyecto: “Estudio de
Prevalencia de Escherichia coli BLEE, Campylobacter spp. y Salmonella
en el tracto gastrointestinal de pollos faenados en camales industriales de
la Provincia de Pichincha”.
31
Muestra
Se realizó un muestreo probabilístico aleatorio del banco de cepas BLEE
y AmpC de E. coli de origen aviar, para identificar la presencia o ausencia
de las variables de interés: los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY. En la
Tabla 4 se indica el número total de cepas.
Tabla 4. Número de cepas BLEE y AmpC elegidas para el estudio
Cepas BLEE
Cepas AmpC
212 67 Fuente: Investigación directa
Procedimiento de la investigación
El estudio se realizó en tres etapas: 1) recolección de la información, 2)
procesamiento de las muestras en el laboratorio y 3) procesamiento de la
información obtenida.
Recolección de la información
Los códigos de las cepas tipo BLEE y AmpC, y el grupo de muestreo al
que pertenecieron, se obtuvo a partir de la base de datos del proyecto
anteriormente descrito.
Procesamiento de las muestras en el laboratorio
1. Fase microbiológica
Técnica de aislamiento de E. coli BLEE
Procedimiento de siembra
Las cepas BLEE y AmpC almacenadas en microtubos a -80oC, se
descongelaron.
Se tomó una asada del microtubo y se realizó una dispersión del inóculo
bacteriano en una caja Petri. Esta caja tuvo el medio TBX más Cefotaxime
(TBX+C), selectivo para el crecimiento de cepas de E.coli productoras de
β-lactamasas (Blaak et al., 2015).
32
Incubación
Luego de la siembra las muestras se incubaron a 37 grados centígrados
por 24 horas.
Identificación morfológica
Un crecimiento positivo se determinó por la presencia de colonias
brillantes azul-verdosas.
2. Fase molecular
Obtención de ADN
Se seleccionó con un asa dos o tres colonias de cada cepa. Las colonias
se suspendieron y homogenizaron en 300 µl de agua destilada estéril en
tubos Ependorf® de 1.5 ml. Estos tubos se colocaron en gradillas
flotantes, y se sometieron a ebullición durante 20 minutos. De esta
manera se obtuvieron lisados bacterianos con el ADN suspendido en los
tubos, que se almacenaron a -20oC. A partir de estos lisados, se trabajó
en la identificación de los genes CTX-M, SHV, TEM y CMY. Este
protocolo de trabajo se obtuvo de estudios similares realizados por: O.
Ahmed, Omar, Asghar, & Elhassan, 2013; Izadi, Nasab, Mood, & Meshkat,
2014; Vali et al., 2014.
Procesamiento de la mezcla maestra (mastermix) en la PCR
Los reactivos utilizados para que se lleve a cabo la PRC de los genes de
estudio fueron los siguientes:
1. Template (ADN): Se trabajó con 212 lisados de cepas BLEE y 67
lisados de cepas AmpC. Como control de calidad, debido a
posibles contaminaciones con ADN exógeno, y verificación del
tamaño del amplicón esperado en cada corrida de la PCR se utilizó
dos controles: 1) un control positivo, que corresponde al ADN de
las cepas TIAC. La TIAC 809, 361, 430 y 811 se utilizaron para los
genes CTX-M, SHV, TEM, la y CMY y 2) un control negativo, agua
33
ultrapura. El uso de estos controles en reacciones de la PCR se ha
mencionado en estudios anteriores (Bej et al., 1991; Craver, 1988).
2. Primers, para los 4 genes a identificar, se utilizó 4 pares de
primers (Tabla 5)
3. El kit GoTaq® Flexi DNA Polymerase de Promega, que incluye:
GoTaq® Flexi Buffer 5X, MgCl2 Solution, 25mM1, PCR, GoTaq®
DNA Polymerase (5u/µl)
4. Nuclease-Free Water® de Promega
5. Nucleotide Mix®, 10mM de Promega
Las cantidades necesarias de reactivos para una reacción se describen
en la Tabla 6. La mezcla de estos reactivos se colocó en tubos de PCR,
los cuales fueron ubicados en el termociclador con el programa
correspondiente al gen a identificarse.
Tabla 5. Primers utilizados en el estudio
GEN
PRIMERS TAMAÑO
CTX-M Forward CTX-MU1 5'-ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC-3' 600pb
Reverse CTX-MU2 5'-TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG-3'
SHV Forward SHVOS5 5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3' 850pb
Reverse SHVOS6 5'-GATTTGCTGATTTCGCTCGG-3'
TEM Forward TEM front P1 5'-GCGGAACCCCTATTTG-3' 1000pb
Reverse TEM-C-R-ny 5'-ACC AAT GCT TAA TCA GTG AG-3'
CMY Forward Queprev cmy-2 sart 5'-ATGATGAAAAAATCGTTATGCTGC-3' 1000pb
Reverse cmy-group2-R5'GCTTTTCAAGAATGCGCCAGG-3'
Fuente: (Arlet, Rouveau, & Philippon, 1997; Hasman, Mevius, Veldman, Olesen, &
Aarestrup, 2005; Kar et al., 2015; Kruger et al., 2004; Olesen, Hasman, & Aarestrup, 2004; Sharma et al., 2010). Modificado por: El Autor
34
Tabla 6. Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de la PCR
Reactivo C. inicial C. final Volumen para una reacción
Agua - - 15,875µl
Template ? ? 1µl
Buffer 5x 1x 5µl
MgCl2 25mM 2mM 2µl
dNTP Mix 10mM 0,2mM 0,5µl
Primer 1 100pmol/µl 1pmol/µl 0,25µl
Primer 2 100pmol/µl 1pmol/µl 0,25µl
Polimerasa 5U/µl 0,025U/µl 0,125µl
Total 25µl
Fuente: Investigación directa
De los 212 lisados provenientes de cepas BLEE, por cada uno se
identificó la presencia de los genes CTX-M, SHV y TEM. Los programas
utilizados para la identificación de estos genes se indican en las tablas 7,
8, 9 respectivamente. En la Tabla 10 se puede observar el programa
utilizado en la identificación del gen CMY.
Tabla 7. Protocolo utilizado en la identificación del gen CTX-M
Programa del termociclador para gen CTX-M
Etapa To Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35
Hibridación de los primers 62 ° 1min
Extensión de la cadena 72 ° 1min
Elongación final 72 ° 7min 1
Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1
Fuente: Hasman et al., 2005
Modificado por: El Autor
35
Tabla 8. Protocolo utilizado en la identificación del gen SHV
Programa del termociclador para gen SHV
Etapa To Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35
Hibridación de los primers 62 ° 1min
Extensión de la cadena 72 ° 1min
Elongación final 72 ° 7min 1
Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1
Fuente: Arlet et al., 1997 Modificado por: El Autor
Tabla 9. Protocolo utilizado en la identificación del gen TEM
Programa del termociclador para gen TEM
Etapa To Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35
Hibridación de los primers 53 ° 1min
Extensión de la cadena 72 ° 1min
Elongación final 72 ° 8min 1
Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1
Fuente: O. Ahmed et al., 2013; Olesen et al., 2004; Paterson et al., 2003; Sharma, Sharma, & Ray, 2010 Modificado por: El AutoR
Tabla 10. Protocolo utilizado en la identificación del gen CMY
Programa del termociclador para gen CMY
Etapa To Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial del ADN 94 ° 4min 1
Desnaturalización del ADN 94 ° 1min 35
Hibridación de los primers 63 ° 1min
Extensión de la cadena 72 ° 1min
Elongación final 72 ° 10min 1
Conservación de los amplicones 10 ° infinito 1
Fuente: Kruger et al., 2004 Modificado por: El Autor
36
Electroforesis
Una vez terminado el programa en el termociclador, las muestras fueron
sometidas a electroforesis. Para que esta se lleve a cabo se necesitó de
los siguientes componentes:
1. Ultra Pure Agarose InvitrogenTM
2. TBE 5 x, CHEM CruzTM
3. SYBER®Safe, DNA gel Stain, InvitrogenTM
4. Bench Top 100bp DNA Ladder de Promega
5. Amplicones a ser identificados
6. Control positivo
7. Control negativo
Técnica de la electroforesis e interpretación de los resultados
En 50ml de TBE a 0,5X, se agregó 0,5g de agarosa (preparación al
1%), esta mezcla se disolvió calentándola en un microondas por 2
minutos.
Una vez realizada la disolución, se agregó 5µl de SYBER®Safe (1µl
por cada 10ml de solución) y se agito la solución hasta
homogenizarla.
La mezcla, se vertió en un molde, se colocaron peines y después
de 20 minutos, se enfrió y se formó un gel.
Una vez enfriado el gel, se retiró los peines, quedando pequeños
pocillos descubiertos. Este gel se colocó en la cámara de
electroforesis. En los pocillos, se colocaron los amplicones a
identificar, los controles y el marcador molecular.
El tiempo de la corrida electroforética fue de 30 minutos, a 100
voltios y 400 miliamperios.
Terminada la electroforesis, el gel se colocó en un sistema digital
de fotodocumentación de geles, sistema que por acción de luz ultra
violeta, permitió visualizar el ADN como bandas. Los fundamentos
de esta técnica se obtuvieron de: Craver, 1988; Giovambattista et
37
al., 2007; Karp, 2009; Tamay de Dios et al., 2013; Winn et al.,
2013d.
Procesamiento de la información obtenida
1. Técnica de procesamiento de los datos
Los códigos y resultados de cepas BLEE y AmpC se almacenaron en una
base de datos y se representaron en una tabla bidimensional, cada
columna y fila con un código único con su respectivo resultado. Dicha
tabla se efectuó en una hoja de cálculo de Microsoft Excel ®.
2. Análisis de los datos
Los resultados obtenidos se analizaron porcentualmente en base a los
grupos de muestreo y al total de muestras analizadas. Para el análisis de
los datos se utilizó una hoja de cálculo de Microsoft Excel ®.
38
A B
C D
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Presentación de los resultados
Despues de realizar la PCR se observaron las bandas específicas de
cada gen como se puede visualizar en el Grafico 2.
Gráfico 2. Resultado de una PCR para los genes de estudio. A) CTX-M, B) SHV, C) TEM, D) CMY, Pos. control positivo, NEG. control negativo, bp. bases pareadas Fuente: Investigación directa
39
De las 212 cepas BLEE analizadas, el 99% (210) resultaron positivas para
la presencia de al menos uno de los tres genes de estudio (Gráfico 3)
Gráfico 3. Cepas BLEE que presentan al menos uno de los tres genes de estudio Fuente: Investigación directa
De las 212 cepas BLEE analizadas el 90,6% (192) resultaron positivas al
gen CTX-M, 42% (89) positivas a TEM y 10,4% (22) positivas a SHV y.
Estos resultados se muestran en el Gráfico 4.
Gráfico 4. Número de genes CTX-M, SHV y TEM encontrados en las 212 cepas BLEE Fuente: Investigación directa
1%
99%
NEGATIVAS
POSITIVAS
91%
42%
10%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CTX-M TEM SHV
positivas
40
De los tres genes BLEE analizados 118 cepas (55,7%) presentaron un
solo gen, 88 (41,5%) presentaron dos genes, 3 (1,4%) presentaron los
tres genes y 3 (1,4%) no presentaron resultados positivos (Gráfico 5).
Gráfico 5. Número de genes tipo BLEE encontrados en la misma cepa Fuente: Investigación directa
De las 67 cepas con fenotipo AmpC, 61 cepas (91%) resultaron positivas
a la presencia del Gen CMY (Gráfico 6).
Gráfico 6. Cepas AmpC que presentan el gen CMY Fuente: Investigación directa
56%42%
1% 1%
1 gen
2 genes
3 genes
0 genes
9%
91%
NEGATIVAS
POSITIVAS
41
Discusión de los resultados
El objetivo del presente estudio fue identificar la presencia de genes de
resistencia a antibióticos β-Lactámicos en 279 cepas de E. coli con
fenotipo BLEE/AmpC, pertenecientes al banco de cepas de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador,
mediante PCR. De las 212 cepas caracterizadas como tipo BLEE, el gen
más prevalente correspondió a CTX-M (90,6%), seguido de TEM (42%) y
SHV (10,4%).
A pesar de que distintos estudios en la industria avícola reportan
prevalencias menores de los genes de resistencia estudiados en esta
investigación, las proporciones de los mismos son similares. Es así que
En Holanda de 22 cepas de E. coli, CTX-M fue positivo en el 54,6%, TEM
en el 13,4% y SHV en el 4,6% (Cindy Dierikx, van Essen-Zandbergen,
Veldman, Smith, & Mevius, 2010). Otro estudio realizado en Holanda
encontró que en 49 de estas colonias de bacterias que presentaron
resistencia hacia los β-lactámicos, el gen CTX-M se logró identificar en el
63,3% de las cepas y TEM en el 2% (Patricia M.C. Huijbers et al., 2015).
En Francia de 301 cepas se identificó la presencia de CTX-M en el 69,1%
y TEM en el 14% (Baron et al., 2014). En Bélgica de 51 cepas, el 43,14%
fueron positivas a CTX-M y el 15,7% a TEM (Smet et al., 2008). En Suecia
se investigó la presencia de E. coli BLEE/AmpC en la carne de pollo y se
identificó CTX-M en el 9,1% y TEM en el 4,6% (Borjesson, Egervarn,
Lindblad, & Englund, 2013). La falta de reportes de genes SHV en estos
estudios puede atribuirse al pequeño número de muestras analizadas. Sin
embargo, todos estos estudios indican que la prevalencia de CTX-M es la
más alta, seguido de TEM y SHV, en concordancia a los resultados
obtenidos en la presente investigación.
A diferencia de los resultados expuestos, varios estudios en Europa y Asia
han reportado que el segundo gen más prevalente en E. coli aislado en la
industria avícola fue SHV. Así en Japón, España, Alemania y Holanda, se
han reportado prevalencias de SHV en el 14%, 11%, 47% y 29% de
42
muestras respectivamente (Blaak et al., 2015; Blanc et al., 2006; Cortes et
al., 2010; Hiki et al., 2013; P. M. C. Huijbers et al., 2014; Reich,
Atanassova, & Klein, 2013).
Otras investigaciones han reportado que TEM es el gen más prevalente
en este tipo de muestras. Por ejemplo, en Portugal, Alemania, Rumania,
Holanda y Egipto se han reportado prevalencias del 48,2%, 53,6%,
43,3%, 37,16% y 50% de TEM respectivamente. (A. M. Ahmed,
Shimamoto, & Shimamoto, 2013; Blaak et al., 2014; C. Dierikx et al., 2013;
Cindy M. Dierikx, van der Goot, Smith, Kant, & Mevius, 2013; Laube et al.,
2013; Laube, Friese, von Salviati, Guerra, & Rösler, 2014; Maciuca et al.,
2015; Silva et al., 2012).
Las diferencias encontradas en las prevalencias de SHV y TEM en estos
estudios pueden ser atribuidas a factores geográficos, biológicos o
ambientales (Cindy M. Dierikx et al., 2013; Patricia M.C. Huijbers et al.,
2015).
En cuanto a las combinaciones de genes tipo BLEE encontradas en el
presente estudio, el 55,7% de las cepas presento un solo gen, el 41,5%
dos genes y el 1,4% tres genes. En concordancia con nuestros
resultados, estudios en España y Holanda han demostrado que la mayor
parte de cepas analizadas de E. coli BLEE presentaron un solo gen
codificante de β-lactamasas (Blanc et al., 2006; P. M. C. Huijbers et al.,
2014). Además, otras investigaciones han reportado la presencia de hasta
tres genes de resistencia en E. coli aislados de la industria avícola (Laube
et al., 2013; Maciuca et al., 2015; Reich et al., 2013).
Estos hallazgos demuestran la importancia de cepas de E. coli
productoras de BLEE en la medicina veterinaria, pues son una causa de
preocupación para la salud pública. Los genes de resistencia en estas
cepas son fácilmente transferibles entre bacterias, lo cual puede provocar
que los mismos se transfieran a bacterias potencialmente patógenas para
el ser humano (Andersson & Hughes, 2014; Endimiani et al., 2012; Koga
43
et al., 2015; Laxminarayan et al., 2013; Mo et al., 2014; Ojer-Usoz et al.,
2013).
Por último, se ha reportado que la frecuencia del gen CMY en cepas
BLEE/AmpC de E. coli en muestras procedentes de la industria avícola,
varía de acuerdo al país. Así, en países europeos, CMY se ha reportado
con prevalencias que van del 12% al 86% (Baron et al., 2014; Blanc et al.,
2006; C. Dierikx et al., 2013; Cindy M. Dierikx et al., 2013; Cindy Dierikx et
al., 2010; P. M. C. Huijbers et al., 2014; Patricia M.C. Huijbers et al., 2015;
Laube et al., 2013, 2014; Maciuca et al., 2015; Reich et al., 2013; Smet et
al., 2008). Mientras que en Egipto y Japón se ha reportado prevalencias
del 15 % y 68% respectivamente (A. M. Ahmed et al., 2013; Hiki et al.,
2013; Kameyama et al., 2013).
La mayoría de estos estudios tienen una prevalencia menor de CMY a la
reportada en la presente investigación. Esto puede ser atribuido a que
dichas investigaciones determinan la presencia en cepas BLEE/AmpC de
E. coli, mientras que el presente estudio parte de cepas fenotípicamente
confirmadas como AmpC en las cuales se esperaría que la prevalencia
de genes AmpC sea Mayor.
44
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
La prevalencia del gen CTX-M es elevada en comparación a los
genes TEM y SHV en las cepas BLEE de origen aviar.
La prevalencia del gen CMY es dominante en las cepas AmpC
analizadas.
La prevalencia de los genes identificados, refleja la variedad de β-
lactamasas presentes en la industria avícola ecuatoriana, lo que
podrían tener un impacto en la salud pública de los consumidores
de carne de pollo.
45
Recomendaciones
Realizar una subtipificación de la familia de los genes CTX-M
encontrados en el presente estudio.
Identificar otros genes de importancia epidemiológica en las cepas
BLEE y AmpC negativas a los primers utilizados en esta
investigación.
Ejecutar estudios moleculares longitudinales desde las granjas
avícolas hasta los productos terminados, para determinar la
epidemiologia de estos genes en la cadena alimenticia.
46
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Abreu, R., Castro, B., Espigares, E., Rodríguez-Álvarez, C., Lecuona, M.,
Moreno, E., … Arias, Á. (2014). Prevalence of CTX-M-Type
Extended-Spectrum β-Lactamases in Escherichia coli Strains Isolated
in Poultry Farms. Foodborne Pathogens and Disease, 0(0), 1 – 6.
http://doi.org/10.1089/fpd.2014.1796
Ahmed, A. M., Shimamoto, T., & Shimamoto, T. (2013). Molecular
characterization of multidrug-resistant avian pathogenic Escherichia
coli isolated from septicemic broilers. International Journal of Medical
Microbiology, 303(8), 475–483.
http://doi.org/10.1016/j.ijmm.2013.06.009
Ahmed, O., Omar, A., Asghar, A., & Elhassan, M. (2013). Prevalence of
TEM, SHV and CTX-M genes in Escherichia coli and Klebsiella spp
Urinary Isolates from Sudan with confirmed ESBL phenotype. Life
Science Journal, 10(2), 3–7. Retrieved from
http://www.lifesciencesite.com/lsj/life1002/029_16104blife1002_191_1
95.pdf
Alarcón, B. F., Obregón, M. P., & Suárez, A. J. (2011). FRECUENCIA DE
ESCHERICHIA COLI BETA LACTAMASA DE ESPECTRO
EXTENDIDO EN LA FLORA INTESTINAL DE MENORES DE CINCO
AÑOS QUE SON ATENDIDOS EN LOS CENTROS DE SALUD DEL
CANTÓN CUENCA, JUNIO - SEPTIEMBRE, 2011. UNIVERSIDAD
DE CUENCA.
Albarado, L., García, J., Rodriguez, E., Carpio, C., Salazar, E., Evelin, F.,
… Guzmán, M. (2009). Frecuencia de enterobacterias nosocomiales
productoras de b-lactamasas de espectro extendido, Cumaná,
Venezuela. Publicación Cientifica En Ciencias Biomédicas, 7(11), 52–
59.
Alós, J.-I. (2014). Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis
47
global. Enfermedades Infecciosas Y MIcrobiología Clínica. Retrieved
from http://dx.doi.org/10.1016/j.eimc.2014.10.004
Andersson, D. I., & Hughes, D. (2014). Microbiological effects of sublethal
levels of antibiotics. Nature Reviews Microbiology, 12(7), 465–78.
http://doi.org/10.1038/nrmicro3270
Arce, Z., Llontop, J., Alarcón, E., & Lopez, E. (2014). Detección de los
genes SHV , TEM Y CTX-M en cepas de Escherichia coli β -
lactamasas de espectro extendido procedentes de un Hospital de
Chiclayo- Perú . Rev. Cuerpo Méd, 7(3), 27–30.
Arlet, G., Rouveau, M., & Philippon, A. (1997). Substitution of alanine for
aspartate at position 179 in the SHV-6 extended-spectrum B-
lactamase. FEMS Microbiology Letters, 152(1), 163–167.
http://doi.org/10.1016/S0378-1097(97)00196-1
Babic, M., Hujer, A., & Bonomo, R. (2006). What’s new in antibiotic
resistance? Focus on beta-lactamases. Drug Resistance Updates,
9(3), 142–156. http://doi.org/10.1016/j.drup.2006.05.005
Baker, K. S. (2014). Demystifying Escherichia coli pathovars. Nature
Reviews. Microbiology, 13(1), 5. http://doi.org/10.1038/nrmicro3411
Baker, S. (2015). A return to the pre-antimicrobial era? Science,
347(6226), 1064 – 1066. http://doi.org/10.1126/science.aaa2868
Baron, S., Jouy, E., Larvor, E., Eono, F., Bougeard, S., & Kempf, I. (2014).
Impact of third-generation cephalosporin administration in hatcheries
on fecal E. coli antimicrobial resistance in broilers and layers.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 58(9), 5428–5434.
http://doi.org/10.1128/AAC.03106-14
Bej, A., Mahbubani, M., & Atlas, R. (1991). Amplification of nucleic acids
by polymerase chain reaction (PCR) and other methods and their
applications. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,
26(3/4), 301–334.
48
Blaak, H., Hamidjaja, R., van Hoek, A., de Heer, L., de Roda, A., & Schets,
F. (2014). Detection of Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL)-
Producing Escherichia coli on Flies at Poultry Farms. Applied and
Environmental Microbiology, 80(1), 239–246.
http://doi.org/10.1128/AEM.02616-13
Blaak, H., van Hoek, A., Hamidjaja, R., van der Plaats, R., Kerkhof-de
Heer, L., Husman, A. M., & Schets, F. M. (2015). Distribution,
Numbers, and Diversity of ESBL-Producing E. coli in the Poultry Farm
Environment. Plos One, 10(8), e0135402.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0135402
Blair, J., Webber, M., Baylay, A., Ogbolu, D., & Piddock, L. (2015).
Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nature Reviews
Microbiology, 13(1), 42–51. http://doi.org/10.1039/c0cc05111j
Blanc, V., Mesa, R., Saco, M., Lavilla, S., Prats, G., Miró, E., …
Llagostera, M. (2006). ESBL- and plasmidic class C β-lactamase-
producing E. coli strains isolated from poultry, pig and rabbit farms.
Veterinary Microbiology, 118(3-4), 299–304.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.08.002
Borjesson, S., Egervarn, M., Lindblad, M., & Englund, S. (2013). Frequent
Occurrence of Extended-Spectrum Beta-Lactamase- and
Transferable AmpC Beta-Lactamase-Producing Escherichia coli on
Domestic Chicken Meat in Sweden. Applied and Environmental
Microbiology, 79(7), 2463–2466. http://doi.org/10.1128/AEM.03893-12
Bortolaia, V., Hansen, K. H., Nielsen, C. a., Fritsche, T. R., & Guardabassi,
L. (2014). High diversity of plasmids harbouring blaCMY-2 among
clinical Escherichia coli isolates from humans and companion animals
in the upper Midwestern USA. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,
69(6), 1492–1496. http://doi.org/10.1093/jac/dku011
Brigante, G., Luzzaro, F., Perilli, M., Lombardi, G., Colì, A., Rossolini, G.
M., … Toniolo, A. (2005). Evolution of CTX-M-type beta-lactamases in
49
isolates of Escherichia coli infecting hospital and community patients.
International Journal of Antimicrobial Agents, 25(2), 157–62.
http://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2004.09.013
Brooks, G., Carroll, K., Butel, J., Morse, S., & Mietzner, T. (2010a).
Clasificación de las bacterias. In G. Brooks, K. Carroll, J. Butel, S.
Morse, & T. Mietzner (Eds.), Jawetz, Melnick y Adelberg.
Microbiología médica (25a. ed., pp. 41 – 51). México, D.F.: MC Graw
Hill.
Brooks, G., Carroll, K., Butel, J., Morse, S., & Mietzner, T. (2010b).
Estructura celular. In G. Brooks, K. Carroll, J. Butel, S. Morse, & T.
Mietzner (Eds.), Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica
(25a. ed., pp. 9 – 39). México, D.F.: McGraw-Hill.
Brouwer, M. S. M., Bossers, A., Harders, F., Essen-zandbergen, A. Van,
Mevius, D. J., & Smith, H. E. (2014). Complete Genome Sequences
of IncI1 Plasmids Carrying Extended- Spectrum B-Lactamase Genes.
Genome Announcements, 2(4), 1–2.
http://doi.org/10.1128/genomeA.00859-14.Copyright
Brunton, L. A., Reeves, H. E., Snow, L. C., & Jones, J. R. (2014). A
longitudinal field trial assesing the impact of feeding waste milk
containing antibiotic residues on the prevalence of ESBL-producing
Escherichia coli in calves. Preventive Veterinary Medicine, 1 – 10.
http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2014.08.005
Buriticá, E. F., Echeverry, D. F., Jaimes, J. A., & Gómez, A. P. (2012).
Control antimicrobiano integral: estrategia contra las infecciones
nosocomiales en veterinaria. Revista Colombiana de Ciencia Animal,
5(1), 107–112.
Bush, K., & Jacoby, G. (2010). Updated Functional Classification of B-
Lactamases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54(3), 969–
976. http://doi.org/10.1128/AAC.01009-09
Campos, J., Pérez, M., & Oteo, J. (2010). Las estrategias internacionales
50
y las campañas para promover el uso prudente de los antibióticos en
los profesionales y los usuarios. Enfermedades Infecciosas Y
Microbiologia Clinica, 28(SUPPL. 4), 50–54.
http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70044-6
Capita, R., & Calleja, C. A. (2013). Antibiotic-Resistant Bacteria: A
Challenge for the Food Industry. Antibiotic-Resistant Bacteria: A
Challenge for the Food Industry, 53(1), 11–48.
http://doi.org/10.1080/10408398.2010.519837
Carattoli, a. (2008). Animal reservoirs for extended spectrum beta-
lactamase producers. Clinical Microbiology and Infection and
Infectious Diseases, 14(1), 117–123. http://doi.org/10.1111/j.1469-
0691.2007.01851.x
Carlet, J., Collignon, P., Goldmann, D., Goossens, H., Gyssens, I. C.,
Harbarth, S., … Voss, A. (2011). Society’s failure to protect a precious
resource: antibiotics. The Lancet, 378(9788), 369–371.
http://doi.org/10.1016/S0140-6736(11)60401-7
Casellas, J. M. (2011). Resistencia a los antibacterianos en América
Latina: consecuencias para la infectología. Revista Panamericana de
Salud Pública, 30(6), 519–528. http://doi.org/10.1590/S1020-
49892011001200004
Cisneros, J. M., Ortiz, C., Lepe, J. A., Obando, I., Conde, M., Cayuela, A.,
& Victoria, M. (2010). Uso prudente de antibióticos y propuestas de
mejora desde la medicina hospitalaria. Enferm Infecc Microbiol Clin,
28(Supl 4), 28–31. http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70041-0
Copes, J. A. (2007). ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR
ALIMENTOS (ETA). In N. O. Stanchi, P. E. Martino, E. Gentilini, H. E.
Reinoso, M. G. Echeverría, N. A. Leardini, & C. J. Alberto (Eds.),
Microbiología Veterinaria (1 ra. ed., pp. 524 – 527). Buenos Aires:
INTER-Médica.
Cortes, P., Blanc, V., Mora, a., Dahbi, G., Blanco, J. E., Blanco, M., …
51
Llagostera, M. (2010). Isolation and Characterization of Potentially
Pathogenic Antimicrobial-Resistant Escherichia coli Strains from
Chicken and Pig Farms in Spain. Applied and Environmental
Microbiology, 76(9), 2799–2805. http://doi.org/10.1128/AEM.02421-09
Craver, C. F. (1988). Oxford University Press. The Journal of Infectious
Diseases, 158(6), 1154–1157.
Croxen, M. A., & Finlay, B. B. (2009). Molecular mechanisms of
Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology, 8(1),
26–38. http://doi.org/10.1038/nrmicro2265
Curello, J., & MacDougall, C. (2014). Beyond Susceptible and Resistant,
Part II: Treatment of Infections Due to Gram-Negative Organisms
Producing Extended-Spectrum β-Lactamases. J Pediatr Pharmacol
Ther, 19(3), 156–164. http://doi.org/10.1056/NEJMra1313875
Dahshan, H., Abd-Elall, A. M., Megahed, A. M., Abd-El-Kader, M. a., &
Nabawy, E. E. (2015). Veterinary antibiotic resistance, residues, and
ecological risks in environmental samples obtained from poultry
farms, Egypt. Environmental Monitoring and Assessment, 187(2), 1 –
10. http://doi.org/10.1007/s10661-014-4218-3
Dai, J., Wang, S., Guerlebeck, D., Laturnus, C., Guenther, S., Shi, Z., …
Ewers, C. (2010). Suppression subtractive hybridization identifies an
autotransporter adhesin gene of E. coli IMT5155 specifically
associated with avian pathogenic Escherichia coli (APEC). BMC
Microbiology, 10, 1–17. http://doi.org/10.1186/1471-2180-10-236
Dale, A. P., & Woodford, N. (2015). Extra-intestinal pathogenic
Escherichia coli (ExPEC): Disease, carriage and clones. Journal of
Infection, 1–12. http://doi.org/10.1016/j.jinf.2015.09.009
Danzeisen, J. L., Wannemuehler, Y., Nolan, L. K., & Johnson, T. J. (2013).
Comparison of Multilocus Sequence Analysis and Virulence
Genotyping of Escherichia coli from Live Birds, Retail Poultry Meat,
and Human Extraintestinal Infection. Avian Diseases, 57(1), 104–108.
52
http://doi.org/10.1637/10218-042812-ResNote.1
de Been, M., Lanza, V. F., de Toro, M., Scharringa, J., Dohmen, W., Du,
Y., … van Schaik, W. (2014). Dissemination of Cephalosporin
Resistance Genes between Escherichia coli Strains from Farm
Animals and Humans by Specific Plasmid Lineages. PLoS Genetics,
10(12), e1004776. http://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004776
Dierikx, C. M. (2013). General introduction. In Beta-lactamases in
Enterobacteriaceae in broilers (pp. 8– 27). Utrecht.
Dierikx, C. M., van der Goot, J. A., Smith, H. E., Kant, A., & Mevius, D. J.
(2013). Presence of ESBL/AmpC -Producing Escherichia coli in the
Broiler Production Pyramid: A Descriptive Study. PLoS ONE, 8(11),
e79005. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0079005
Dierikx, C. M., van Duijkeren, E., Schoormans, a. H. W., van Essen-
Zandbergen, a., Veldman, K., Kant, a., … Mevius, D. J. (2012).
Occurrence and characteristics of extended-spectrum-β-lactamase-
and AmpC-producing clinical isolates derived from companion
animals and horses. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 67(6),
1368–1374. http://doi.org/10.1093/jac/dks049
Dierikx, C., van der Goot, J., Fabri, T., van Essen-Zandbergen, a., Smith,
H., & Mevius, D. (2013). Extended-spectrum- -lactamase- and AmpC-
-lactamase-producing Escherichia coli in Dutch broilers and broiler
farmers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 68(1), 60–67.
http://doi.org/10.1093/jac/dks349
Dierikx, C., van Essen-Zandbergen, A., Veldman, K., Smith, H., & Mevius,
D. (2010). Increased detection of extended spectrum beta-lactamse
producing Salmonella enterica and Escherichia coli isolates from
poultry. Veterinary Microbiology, 145(3-4), 273–278.
Dziva, F., & Stevens, M. P. (2008). Colibacillosis in poultry: unravelling the
molecular basis of virulence of avian pathogenic Escherichia coli in
their natural hosts. Avian Pathology, 37(4), 355–366.
53
http://doi.org/10.1080/03079450802216652
Egea, P., López-Cerero, L., Torres, E., Gómez-Sánchez, M. D. C.,
Serrano, L., Sánchez-Ortiz, M. D., … Pascual, A. (2012). Increased
raw poultry meat colonization by extended spectrum beta-lactamase-
producing Escherichia coli in the south of Spain. International Journal
of Food Microbiology, 159(2), 69–73.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.08.002
Egervärn, M., Börjesson, S., Byfors, S., Finn, M., Kaipe, C., Englund, S., &
Lindblad, M. (2014). Escherichia coli with extended-spectrum beta-
lactamases or transferable AmpC beta-lactamases and Salmonella on
meat imported into Sweden. International Journal of Food
Microbiology, 171, 8–14.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.11.005
Endimiani, A., Rossano, A., Kunz, D., Overesch, G., & Perreten, V. (2012).
First countrywide survey of third-generation cephalosporin-resistant
Escherichia coli from broilers, swine, and cattle in Switzerland.
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 73(1), 31–38.
http://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2012.01.004
Erlich, H. A. (1989). Polymerase chain reaction. Journal of Clinical
Immunology, 9(6), 437–447. http://doi.org/10.1007/BF00918012
Falagas, M. E., & Karageorgopoulos, D. E. (2009). Extended-spectrum β-
lactamase-producing organisms. Journal of Hospital Infection, 73(4),
345–354. http://doi.org/10.1016/j.jhin.2009.02.021
Feizabadi, M., Delfani, S., Raji, N., Majnooni, A., Aligholi, M.,
Shahcheraghi, F., … Yadegarinia, D. (2010). Distribution of blaTEM,
blaSHV, blaCTX-M Genes Among Clinical Isolates of Klebsiella
pneumoniae at Labbafinejad Hospital, Tehran, Iran. Microbial Drug
Resistance, 16(1), 49 – 53.
Fernandes, R., Amador, P., Oliveira, C., & Prudêncio, C. (2014). Molecular
characterization of ESBL-producing Enterobacteriaceae in northern
54
Portugal. The Scientific World Journal, 2014, 782897.
http://doi.org/10.1155/2014/782897
Fernández, R., Rodriguez, C., Rodriguez, I., & Gomez, F. (2003).
Escherichia coli como causa de diarrea infantil. Revista Cubana de
Pediatría, 75(3). Retrieved from http://scielo.sld.cu.sci-
hub.org/scielo.php?pid=S0034-
75312003000300010&script=sci_arttext
Fica, A. (2014). Resistencia Antibiótica en Bacilos Gram Negativos ,
Cocáceas Gram Positivas y Anaerobios. Implicancias terapéuticas.
REV. MED. CLIN. CONDES, 25(3), 432–444.
Fischer, J., Rodríguez, I., Baumann, B., Guiral, E., Beutin, L., Schroeter,
A., … Guerra, B. (2014). blaCTX-M-15-carrying Escherichia coli and
Salmonella isolates from livestock and food in Germany. The Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, 69(11), 2951–2958.
http://doi.org/10.1093/jac/dku270
Foster, J. W. (2004). Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur
acidophile. Nature Reviews. Microbiology, 2(11), 898–907.
http://doi.org/10.1038/nrmicro1021
Fournier, P.-E., Dubourg, G., & Raoult, D. (2014). Clinical detection and
characterization of bacterial pathogens in the genomics era. Genome
Medicine, 6(11), 2 – 15. http://doi.org/10.1186/s13073-014-0114-2
Galán, J. C., Moreno, A., & Baquero, F. (2014). IMPACTO DE LOS
MOVIMIENTOS MIGRATORIOS EN LA RESISTENCIA
BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS. Rev Esp Salud Pública, 88(6),
829–837.
García, C. (2010). El papel de la industria farmacéutica. ¿Por qué no se
comercializan nuevos antibióticos? Enfermedades Infecciosas Y
Microbiología Clínica, 28(Supl 4), 45–49.
http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70043-4
55
Gentilini, E. (2007). ANTIMICROBIANOS. In N. O. Stanchi, P. E. Martino,
E. Gentilini, H. E. Reinoso, M. G. Echeverría, N. A. Leardini, & C. J.
Alberto (Eds.), Microbiología Veterinaria (1 ra. ed., pp. 162 – 175).
Buenos Aires: INTER-Médica.
Giovambattista, G., Ripoli, M. V., Díaz, S., Castagnasso, E. E., Carollo, V.,
Lirón, J., … García, P. (2007). TECNICAS DE ANALISIS
MOLECULAR. In N. O. Stanchi, P. E. Martino, E. Gentilini, H. E.
Reinoso, M. G. Echeverría, N. A. Leardini, & C. J. Alberto (Eds.),
Microbiología médica (1 ra. ed., pp. 153 – 161). Buenos Aires:
INTER-Médica.
Grave, K., Torren-Edo, J., Muller, A., Greko, C., Moulin, G., & Mackay, D.
(2014). Variations in the sales and sales patterns of veterinary
antimicrobial agents in 25 European countries. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy, 69(8), 2284–2291.
http://doi.org/10.1093/jac/dku106
Grover, N., Sahni, A. K., & Bhattacharya, S. (2013). Therapeutic
challenges of ESBLS and Ampc beta-lactamase producers in a
tertiary care center. Medical Journal Armed Forces India, 69(1), 4–10.
http://doi.org/10.1016/j.mjafi.2012.02.001
Gudiol, F. (2010). Uso prudente de antibioticos y propuestas de mejora en
los centros sociosanitarios. Enfermedades Infecciosas Y
Microbiología Clínica, 28(Supl 4), 32–35.
http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70040-9
Hacker, J., & Blum-Oehler, G. (2007). In appreciation of Theodor
Escherich. Nature Reviews Microbiology, 5(12), 902–902.
http://doi.org/10.1038/nrmicro1810
Hammerum, A. M., Larsen, J., Andersen, V. D., Lester, C. H., Skovgaard
Skytte, T. S., Hansen, F., … Agerso, Y. (2014). Characterization of
extended-spectrum B-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli
obtained from Danish pigs, pig farmers and their families from farms
56
with high or no consumption of third- or fourth-generation
cephalosporins. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 69(10),
2650–2657. http://doi.org/10.1093/jac/dku180
Hansen, M., Hoffmann, T., McCullough, A., van Driel, M., & Del Mar, C.
(2015). Antibiotic Resistance: What can be done in primary care to
alleviate the crisis? Frontiers in Public Health, 3(35), 1– 7.
http://doi.org/10.3389/fpubh.2015.00035
Harbottle, H., Thakur, S., Zhao, S., & White, D. G. (2006). Genetics of
Antimicrobial Resistance. Animal Biotechnology, 17(2), 111–124.
http://doi.org/10.1080/10495390600957092
Hasan, B., Faruque, R., Drobni, M., Waldenström, J., Sadique, A., Ahmed,
K. U., … Alam, M. (2011). High Prevalence of Antibiotic Resistance in
Pathogenic Escherichia coli from Large- and Small-Scale Poultry
Farms in Bangladesh. Avian Diseases, 55(4), 689 – 692.
http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1637/9686-021411-Reg.1
Hasman, H., Mevius, D., Veldman, K., Olesen, I., & Aarestrup, F. (2005).
B-Lactamases among extended-spectrum -lactamase (ESBL)-
resistant Salmonella from poultry, poultry products and human
patients in The Netherlands. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,
56(1), 115–121. http://doi.org/10.1093/jac/dki190
Hayakawa, K., Gattu, S., Marchaim, D., Bhargava, A., Palla, M.,
Alshabani, K., … Kaye, K. S. (2013). Epidemiology and risk factors for
isolation of Escherichia coli producing CTX-M-type extended-
spectrum β-lactamase in a large U.S. Medical Center. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 57(8), 4010–4018.
http://doi.org/10.1128/AAC.02516-12
Helmy, M. M., & Wasfi, R. (2014). Phenotypic and molecular
characterization of plasmid mediated AmpC β-lactamases among
Escherichia coli, Klebsiella spp., and Proteus mirabilis isolated from
urinary tract infections in Egyptian hospitals. BioMed Research
57
International, 2014, 171548. http://doi.org/10.1155/2014/171548
Hernández, Á. (2010). Uso prudente de antibióticos: propuestas de mejora
desde la pediatría comunitaria. Enfermedades Infecciosas Y
Microbiologia Clinica, 28(Supl 4), 23–27.
http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70038-0
Hiki, M., Usui, M., Kojima, A., Ozawa, M., Ishii, Y., & Asai, T. (2013).
Diversity of Plasmid Replicons Encoding the blaCMY-2 Gene in
Broad-Spectrum Cephalosporin-Resistant Escherichia coli from
Livestock Animals in Japan. Foodborne Pathogens and Disease,
10(3), 243–249. http://doi.org/10.1089/fpd.2012.1306
Huijbers, P. M. C., Graat, E. a. M., Haenen, a. P. J., van Santen, M. G.,
van Essen-Zandbergen, a., Mevius, D. J., … van Hoek, a. H. a. M.
(2014). Extended-spectrum and AmpC -lactamase-producing
Escherichia coli in broilers and people living and/or working on broiler
farms: prevalence, risk factors and molecular characteristics. Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, 69(10), 2669–2675.
http://doi.org/10.1093/jac/dku178
Huijbers, P. M. C., van Hoek, A. H. A. M., Graat, E. A. M., Haenen, A. P.
J., Florijn, A., Hengeveld, P. D., & van Duijkeren, E. (2015).
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and extended-spectrum
and AmpC β-lactamase-producing Escherichia coli in broilers and in
people living and/or working on organic broiler farms. Veterinary
Microbiology, 176(1-2), 120–125.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.12.010
Izadi, N., Nasab, M. N., Mood, E. H., & Meshkat, Z. (2014). Prevalence of
TEM and SHV Genes in Clinical Isolates of Klebsiella Pneumonia
From Mashhad, North- East Iran. Iranian Journal of Pathology, 9(3),
199 – 205.
Jacoby, G. A. (2009). AmpC B-Lactamases. Clinical Microbiology
Reviews, 22(1), 161–182. http://doi.org/10.1128/CMR.00036-08
58
Jamborova, I., Dolejska, M., Vojtech, J., Guenther, S., Uricariu, R.,
Drozdowska, J., … Literak, I. (2015). Plasmid-Mediated Resistance to
Cephalosporins and Fluoroquinolones in Various Escherichia coli
Sequence Types Isolated from Rooks Wintering in Europe. Applied
and Environmental mMcrobiology, 81(2), 648–57.
http://doi.org/10.1128/AEM.02459-14
Jaramillo, C. J. (2010). Investigación epidemiológica. In C. J. Jaramillo &
J. J. Martínez (Eds.), Epidemiología Veterinaria (1ra. ed., pp. 83 –
101). México, D.F.: Manual Moderno.
Jure, M. A., Presti, C., Cudmani, N. M., Grellet, L. M., López, C., Musa, E.
H., … De Castillo, M. C. (2011). β -lactamasas AmpC plasmídicas
tipo CMY-2 emergentes en Tucumán , Argentina. Revista Argentina
de Microbiología, 43, 24–27.
Kaarme, J., Molin, Y., Olsen, B., & Melhus, Å. (2013). Prevalence of
extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in
healthy Swedish preschool children. Acta Paediatrica, 102(6), 655–
660. http://doi.org/10.1111/apa.12206
Kaftandzieva, A., Trajkovska-Dokic, E., & Panovski, N. (2011).
PREVALENCE AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF
EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASES (ESBLs)
PRODUCING ESCHERICHIA COLI AND KLEBSIELLA
PNEUMONIAE. Contributions, Sec Biology Medical Sciences, 32(2),
129–141.
Kameyama, M., Chuma, T., Yabata, J., Tominaga, K., Iwata, H., &
Okamoto, K. (2013). Prevalence and Epidemiological Relationship of
CMY-2 AmpC β-Lactamase and CTX-M Extended-Spectrum β-
Lactamase-Producing Escherichia coli Isolates from Broiler Farms in
Japan. Journal of Veterinary Medical Science, 75(8), 1009–1015.
http://doi.org/10.1292/jvms.12-0453
Kaper, J. B., Nataro, J. P., & Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia
59
coli. Nature Reviews. Microbiology, 2(2), 123–140.
http://doi.org/10.1038/nrmicro818
Kar, D., Bandyopadhyay, S., Bhattacharyya, D., Samanta, I., Mahanti, A.,
Nanda, P. K., … Singh, R. K. (2015). Molecular and phylogenetic
characterization of multidrug resistant extended spectrum beta-
lactamase producing Escherichia coli isolated from poultry and cattle
in Odisha, India. Infection, Genetics and Evolution, 29, 82–90.
http://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.11.003
Karp, G. (2009). Técnicas en biología celular y molecular. In G. Karp (Ed.),
BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR (5ta. ed., pp. 727 – 776).
México, D.F.: McGraw-Hill Interamericana.
Knudsen, J. D., & Andersen, S. E. (2014). A Multidisciplinary Intervention
to Reduce Infections of ESBL- and AmpC-Producing, Gram-Negative
Bacteria at a University Hospital. PLoS ONE, 9(1), e86457.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0086457
Koga, V. L., Rodrigues, G. R., Scandorieiro, S., Vespero, E. C., Oba, A.,
de Brito, B. G., … Kobayashi, R. K. T. (2015). Evaluation of the
Antibiotic Resistance and Virulence of Escherichia coli Strains
Isolated from Chicken Carcasses in 2007 and 2013 from Paraná,
Brazil. Foodborne Pathogens and Disease, 12(6), 479–85.
http://doi.org/10.1089/fpd.2014.1888
Korzeniewska, E., Korzeniewska, A., & Harnisz, M. (2013). Antibiotic
resistant Escherichia coli in hospital and municipal sewage and their
emission to the environment. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 91, 96–102.
http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1016/j.ecoenv.2013.01.014
Kruger, T., Szabo, D., Keddy, K. H., Deeley, K., Marsh, J. W., Hujer, A. M.,
… Paterson, D. L. (2004). Infections with nontyphoidal Salmonella
species producing TEM-63 or a novel TEM enzyme, TEM-131, in
South Africa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(11), 4263–
60
4270. http://doi.org/10.1128/AAC.48.11.4263-4270.2004
Laube, H., Friese, a, von Salviati, C., Guerra, B., & Rösler, U. (2014).
Transmission of ESBL/AmpC-producing Escherichia coli from broiler
chicken farms to surrounding areas. Veterinary Microbiology, 172(3-
4), 519–27. http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.06.008
Laube, H., Friese, a., von Salviati, C., Guerra, B., Kasbohrer, a.,
Kreienbrock, L., & Roesler, U. (2013). Longitudinal Monitoring of
Extended-Spectrum-Beta-Lactamase/AmpC-Producing Escherichia
coli at German Broiler Chicken Fattening Farms. Applied and
Environmental Microbiology, 79(16), 4815–4820.
http://doi.org/10.1128/AEM.00856-13
Laxminarayan, R., Duse, A., Wattal, C., Zaidi, A. K. M., Wertheim, H. F. L.,
Sumpradit, N., … Cars, O. (2013). Antibiotic resistance—the need for
global solutions. The Lancet Infectious Diseases, 13(12), 1057–1098.
http://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70318-9
Lázaro, E., Iglesias, F. J. D. A., López, A., & Fernández, M. J. (2010). Uso
de antibióticos en España y marco regulador para su desarrollo
clínico en la Unión Europea. Enferm Infecc Microbiol Clin, 28(Supl 4),
10–16. http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70036-7
Lazarus, B., Paterson, D., Mollinger, J., & Rogers, B. (2015). Do Human
Extraintestinal Escherichia coli Infections Resistant to Expanded-
Spectrum Cephalosporins Originate From Food-Producing Animals.
Clinical Infectious Diseases, 60(3), 439 – 452.
http://doi.org/10.1080/87559129.2014.981826
Leigue, L., Moura, R., Aguilar, P., Pestana, A., & Lincopan, N. (2013).
Current status of extended-spectrum β -lactamase ( ESBL ) -
producing Enterobacteriaceae in animals. Microbial Pathogens and
Strategies for Combating Them: Science, Technology and Education,
3, 1600–1607. Retrieved from
http://www.formatex.info/microbiology4/vol3/1600-1607.pdf
61
León, C. E., & Pacheco, Mi. A. (2010). Epidemiología de las infecciones
por microorganismos productores de BLEE en el Hospital Vozandes
Quito entre los años 2005 y 2009. UNIVERSIDAD DEL AZUAY.
Liebana, E., Carattoli, A., Coque, T. M., Hasman, H., Magiorakos, A.-P.,
Mevius, D., … Threlfall, J. (2013). Public Health Risks of
Enterobacterial Isolates Producing Extended-Spectrum B-Lactamases
or AmpC B-Lactamases in Food and Food-Producing Animals: An EU
Perspective of Epidemiology, Analytical Methods, Risk Factors, and
Control Options. Clinical Infectious Diseases, 56(7), 1030–1037.
http://doi.org/10.1093/cid/cis1043
Livermore, D. M. (2012). Current epidemiology and growing resistance of
Gram-negative pathogens. Korean Journal of Internal Medicine, 27(2),
128–142. http://doi.org/10.3904/kjim.2012.27.2.128
Lutful Kabir, S. M. (2010). Avian colibacillosis and salmonellosis: A closer
look at epidemiology, pathogenesis, diagnosis, control and public
health concerns. International Journal of Environmental Research and
Public Health, 7(1), 89–114. http://doi.org/10.3390/ijerph7010089
Maciuca, I. E., Williams, N. J., Tuchilus, C., Dorneanu, O., Guguianu, E.,
Carp-Carare, C., … Timofte, D. (2015). High Prevalence of
Escherichia coli- Producing CTX-M-15 Extended-Spectrum Beta-
Lactamases in Poultry and Human Clinical Isolates in Romania.
Microbial Drug Resistance, 00(00), 150303083437008.
http://doi.org/10.1089/mdr.2014.0248
Marcela, K., & Monge, M. (2013). Carbapenémicos: Tipos Y Mecanismos
De Resistencia Bacterianos. Revista Médica de Costa Rica Y
Centroamerica, (608), 599–605.
Martínez, J. L., Coque, T. M., & Baquero, F. (2015). Prioritizing risks of
antibiotic resistance genes in all metagenomes. Nature Reviews
Microbiology, 13(6), 396–396. http://doi.org/10.1038/nrmicro3399-c2
Martínez, L., & Calvo, J. (2010). Desarrollo de las resistencias a los
62
antibióticos: causas, consecuencias y su importancia para la salud
pública. Enfermedades Infecciosas Y Microbiología Clínica, 28(Supl
4), 4–9. http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70035-5
Martinez, P., Garzón, D., & Mattar, S. (2012). CTX-M-producing
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from community-
acquired urinary tract infections in Valledupar, Colombia. The
Brazilian Journal of Infectious Diseases, 16(5), 420–425.
http://doi.org/10.1016/j.bjid.2012.05.001
Meng, J., LeJeune, J. T., Zhao, T., & Doyle, M. P. (2013).
Enterohemorrhagic Escherichia coli. In M. P. Doyle & R. L. Buchanan
(Eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers (4th ed., pp.
287 – 309). Washington: ASM Press.
http://doi.org/10.1128/9781555818463
Meunier, D., Jouy, E., Lazizzera, C., Kobisch, M., & Madec, J.-Y. (2006).
CTX-M-1- and CTX-M-15-type β-lactamases in clinical Escherichia
coli isolates recovered from food-producing animals in France.
International Journal of Antimicrobial Agents, 28(5), 402–407.
http://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2006.08.016
Mezger, A., Gullberg, E., Göransson, J., Zorzet, A., Herthnek, D., Tano,
E., … Andersson, D. I. (2015). A General Method for Rapid
Determination of Antibiotic Susceptibility and Species in Bacterial
Infections. Journal of Clinical Microbiology, 53(2), 425–432.
http://doi.org/10.1128/JCM.02434-14
Mo, S. S., Norström, M., Slettemeås, J. S., Løvland, A., Urdahl, A. M., &
Sunde, M. (2014). Emergence of AmpC-producing Escherichia coli in
the broiler production chain in a country with a low antimicrobial usage
profile. Veterinary Microbiology, 171(3-4), 315–20.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.02.002
Moghaddam, M. N., Forghanifard, M. M., & Moshrefi, S. (2012).
Prevalence and Molecular Characterization of Plasmid-mediated
63
Extended-Spectrum β-Lactamase Genes (balaTEM, blaCTX and
blASHV) Among Urinary Escherichia coli Clinical Isolates in Mashhad,
Iran. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 15(3), 833–839.
Monnet, D. L. (2010). Raising awareness about prudent use of antibiotics:
a necessity for the European Union. Enfermedades Infecciosas Y
Microbiología Clínica, 28(Supl 4), 1–3. http://doi.org/10.1016/S0213-
005X(10)70034-3
Moreno M, C., González E, R., & Beltrán, C. (2009). Mecanismos de
resistencia antimicrobiana en patógenos respiratorios. Revista de
Otorrinolaringología Y Cirugía de Cabeza Y Cuello, 69(2), 185–192.
http://doi.org/10.4067/S0718-48162009000200014
Murray, P., Rosenthal, K., & Pfaller, M. (2009a). Clasificación, estructura y
replicación de las bacterias. In P. Murray, K. Rosenthal, & M. Pfaller
(Eds.), Microbiología médica (6ta. ed., pp. 9 – 21). Madrid:
ELSEVIER.
Murray, P., Rosenthal, K., & Pfaller, M. (2009b). Enterobacteriaceae. In P.
Murray, K. Rosenthal, & M. Pfaller (Eds.), Microbiología médica (6a
ed., pp. 300 – 315). Madrid: ELSEVIER.
Murray, P., Rosenthal, K., & Pfaller, M. (2009c). Introducción a la
microbiología médica. In P. Murray, K. Rosenthal, & M. Pfaller (Eds.),
Microbiología médica (6a ed., pp. 3 – 5). Madrid: ELSEVIER.
Navarro, F., Calvo, J., Cantón, R., Fernández-Cuenca, F., & Mirelis, B.
(2011). Detection of resistance phenotypes in gram-negative bacteria.
Enfermedades Infecciosas Y Microbiología Clínica, 29(7), 524–534.
http://doi.org/10.1016/j.eimc.2011.03.011
Nilsson, O., Borjesson, S., Landén, A., & Bengtsson, B. (2014). Vertical
transmission of Escherichia coli carrying plasmid-mediated AmpC
(pAmpC) through the broiler production pyramid. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy, 69(6), 1497–1500.
http://doi.org/10.1093/jac/dku030
64
Ohnishi, M., Okatani, a T., Esaki, H., Harada, K., Sawada, T., Murakami,
M., … Takahashi, T. (2013). Herd prevalence of Enterobacteriaceae
producing CTX-M-type and CMY-2 β-lactamases among Japanese
dairy farms. Journal of Applied Microbiology, 115(1), 282–289.
http://doi.org/10.1111/jam.12211
Ojer-Usoz, E., González, D., Vitas, A. I., Leiva, J., García-Jalón, I., Febles-
Casquero, A., & Escolano, M. de la S. (2013). Prevalence of
extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in
meat products sold in Navarra, Spain. Meat Science, 93(2), 316–321.
http://doi.org/10.1016/j.meatsci.2012.09.009
Olesen, I., Hasman, H., & Aarestrup, F. M. (2004). Prevalence of beta-
lactamases among ampicillin-resistant Escherichia coli and
Salmonella isolated from food animals in Denmark. Microbial Drug
Resistance, 10(4), 334–340. http://doi.org/10.1089/mdr.2004.10.334
Oosterik, L. H., Peeters, L., Mutuku, I., Goddeeris, B. M., & Butaye, P.
(2014). Susceptibility of Avian Pathogenic Escherichia coli from
Laying Hens in Belgium to Antibiotics and Disinfectants and Integron
Prevalence. Avian Diseases, 58(2), 271–278.
http://doi.org/http://dx.doi.org/10.1637/10680-100113-RegR
Parma, A. E. (2007). ESCHERICHIA. In N. A. C. J. A. Stanchi, Nerstor
Oscar; Martino, Pablo Eduardo; Gentilini, Elida; Reinoso, Hugo Enso;
Echeverría, María Gabriela; Leardini (Ed.), Microbiología Veterinaria
(1 ra. ed., pp. 197–202). Buenos Aires: INTER-Médica.
Paterson, D. L., & Bonomo, R. A. (2005). Extended-Spectrum β-
Lactamases: a Clinical Update. Clinical Microbiology Reviews, 18(4),
657–686. http://doi.org/10.1128/CMR.18.4.657
Paterson, D. L., Hujer, K. M., Hujer, A. M., Yeiser, B., Bonomo, M. D.,
Rice, L. B., & Bonomo, R. a. (2003). Extended-Spectrum B-
Lactamases in Klebsiella pneumoniae Bloodstream Isolates from
Seven Countries: Dominance and Widespread Prevalence of SHV-
65
and CTX-M-Type B-Lactamases. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 47(11), 3554–3560.
http://doi.org/10.1128/AAC.47.11.3554-3560.2003
Pavón, S., Zalazar, M., Morales, M., & Rojas, M. (2011). Extendido En
Enterobacterias Aisladas De Casos De Infección Nosocomial. Ciencia
Ergo Sum, 18(2), 164 – 170.
Peerayeh, S. N., Eslami, M., Memariani, M., & Siadat, S. D. (2013). High
prevalence of bla CTX-M-1 group extended-spectrum β-lactamase
genes in Escherichia coli isolates from Tehran. Jundishapur Journal of
Microbiology, 6(7), e6863. http://doi.org/10.5812/jjm.6863
Peirano, G., & Pitout, J. D. D. (2010). Molecular epidemiology of
Escherichia coli producing CTX-M β-lactamases: the worldwide
emergence of clone ST131 O25:H4. International Journal of
Antimicrobial Agents, 35(4), 316–321.
http://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2009.11.003
Pereira, A., Santos, A., Tacão, M., Alves, A., Henriques, I., & Correia, A.
(2013). Genetic diversity and antimicrobial resistance of Escherichia
coli from Tagus estuary (Portugal). Science of The Total Environment,
461-462, 65–71. http://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2013.04.067
Perez, E. A. (2015). CUANTIFICACIÓN DE Escherichia coli
PRODUCTOR DE β - LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
(BLEE) EN PUNTOS CRÍTICOS DE CONTROL EN CAMALES
INDUSTRIALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA. UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR.
Piddock, L. J. (2012). The crisis of no new antibiotics—what is the way
forward? The Lancet Infectious Diseases, 12(3), 249–253.
http://doi.org/10.1016/S1473-3099(11)70316-4
Pitout, J. D. D. (2012). Extraintestinal pathogenic Escherichia coli: A
combination of virulence with antibiotic resistance. Frontiers in
Microbiology, 3(9), 1–7. http://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00009
66
Pomares, T., Fouteau, S., Jacquet, M. E., Roche, D., Barbe, V.,
Castellanos, M., … Branger, C. (2014). Characterization of a P1-Like
Bacteriophage Carrying an SHV-2 Extended-Spectrum -Lactamase
from an Escherichia coli Strain. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 58(11), 6550–6557.
http://doi.org/10.1128/AAC.03183-14
Poole, K. (2004). Resistance to B-lactam antibiotics. Cellular and
Molecular Life Sciences, 61(17), 2200–2223.
http://doi.org/10.1007/s00018-004-4060-9
Pouget, J. G., Coutinho, F. J., Reid-Smith, R. J., & Boerlin, P. (2013).
Characterization of blaSHV Genes on Plasmids from Escherichia coli
and Salmonella enterica Isolates from Canadian Food Animals (2006-
2007). Applied and Environmental Microbiology, 79(12), 3864–3866.
http://doi.org/10.1128/AEM.00355-13
Quinn, P. J., Markey, B. K., Leonard, F. C., FitzPatrick, E. S., Fanning, S.,
& Hartigan, P. J. (2011). Enterobacteriaceae. In P. J. Quinn, B. K.
Markey, F. C. Leonard, E. S. FitzPatrick, S. Fanning, & P. J. Hartigan
(Eds.), Veterinary Microbiology and Microbial Disease (second, pp.
698 – 766). Iowa: Wiley-Blackwell.
Randall, L. P., Lemma, F., Rogers, J. P., Cheney, T. E. a, Powell, L. F., &
Teale, C. J. (2014). Prevalence of extended-spectrum-β-lactamase-
producing Escherichia coli from pigs at slaughter in the UK in 2013.
The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 69, 2947 – 2950.
http://doi.org/10.1093/jac/dku258
Rasheed, M. U., Thajuddin, N., Ahamed, P., Teklemariam, Z., & Jamil, K.
(2014). ANTIMICROBIAL DRUG RESISTANCE IN STRAINS OF
Escherichia coli ISOLATED FROM FOOD SOURCES. Revista Do
Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, 56(4), 341–346.
http://doi.org/10.1590/S0036-46652014000400012
Reich, F., Atanassova, V., & Klein, G. (2013). Extended-Spectrum β-
67
lactamase- and AmpC-Producing Enterobacteria in Healthy Broiler
Chickens, Germany. Emerging Infectious Diseases, 19(8), 1253 –
1259. http://doi.org/10.3201/eid1908.120879
Renneberg, R. (2012). Biotecnología Analítica y Genoma Humano. In R.
Renneberg (Ed.), Biotecnología para principiantes (1ra. ed., pp. 253 –
285). Barcelona: EDITORIAL REVERTÉ.
Reuland, E. A., Halaby, T., Hays, J. P., de Jongh, D. M. C., Snetselaar, H.
D. R., van Keulen, M., … Al Naiemi, N. (2015). Plasmid-mediated
AmpC: prevalence in community-acquired isolates in Amsterdam, the
Netherlands, and risk factors for carriage. PloS One, 10(1), e0113033.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0113033
Rodríguez-Rojas, A., Rodríguez-Beltrán, J., Couce, A., & Blázquez, J.
(2013). Antibiotics and antibiotic resistance: A bitter fight against
evolution. International Journal of Medical Microbiology, 303(6-7),
293–297. http://doi.org/10.1016/j.ijmm.2013.02.004
Rubin, J. E., & Pitout, J. D. D. (2014). Extended-spectrum β-lactamase,
carbapenemase and AmpC producing Enterobacteriaceae in
companion animals. Veterinary Microbiology, 170, 10–18.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.01.017
Ruiz, N., Kahne, D., & Silhavy, T. J. (2006). Advances in understanding
bacterial outer-membrane biogenesis. Nature Reviews. Microbiology,
4(1), 57–66. http://doi.org/10.1038/nrmicro1322
Sana, T., Rami, K., Fouad, D., Marcel, A., Hassan, M., Sani, H., & Monzer,
H. (2011). Detection of genes TEM , OXA , SHV and CTX-M in 73
clinical isolates of Escherichia coli producers of extended spectrum
Beta- lactamases and determination of their susceptibility to
antibiotics . THE INTERNATIONAL ARABIC JOURNAL OF
ANTIMICROBIAL AGENTS, 1, 1–6. http://doi.org/10:3823/704
Sánchez, O. D., Palomo, J. B., Ortega, M. S., & Ribas, F. M. (2010). Uso
prudente de antibióticos y propuestas de mejora desde la farmacia
68
comunitaria y hospitalaria. Enferm Infecc Microbiol Clin, 28(Supl 4),
36–9. http://doi.org/10.1016/S0213-005X(10)70041-0
Schaumburg, F., Alabi, A. S., Frielinghaus, L., Grobusch, M. P., Köck, R.,
Becker, K., … Mellmann, A. (2014). The risk to import ESBL-
producing Enterobacteriaceae and Staphylococcus aureus through
chicken meat trade in Gabon. BMC Microbiology, 14(286).
http://doi.org/10.1186/s12866-014-0286-3
Sedláková, M. H., Urbánek, K., Vojtová, V., Suchánková, H., Imwensi, P.,
& Kolář, M. (2014). Antibiotic consumption and its influence on the
resistance in Enterobacteriaceae. BMC Research Notes, 7(454).
http://doi.org/10.1186/1756-0500-7-454
Shah, A. A., Hasan, F., Ahmed, S., & Hameed, A. (2004). Characteristics,
epidemiology and clinical importance of emerging strains of Gram-
negative bacilli producing extended-spectrum β-lactamases.
Research in Microbiology, 155(6), 409–421.
http://doi.org/10.1016/j.resmic.2004.02.009
Sharma, J., Sharma, M., & Ray, P. (2010). Detection of TEM & SHV genes
in Escherichia coli & Klebsiella pneumoniae isolates in a tertiary care
hospital from India. The Indian Journal of Medical Research, 132,
332–336.
Shulman, S. T., Friedmann, H. C., & Sims, R. H. (2007). Theodor
Escherich: the first pediatric infectious diseases physician? Clinical
Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases
Society of America, 45(8), 1025–1029. http://doi.org/10.1086/521946
Silva, N., Costa, L., Gonçalves, A., Sousa, M., Radhouani, H., Brito, F., …
Poeta, P. (2012). Genetic characterisation of extended-spectrum β-
lactamases in Escherichia coli isolated from retail chicken products
including CTX-M-9 containing isolates: a food safety risk factor. British
Poultry Science. http://doi.org/10.1080/00071668.2012.740554
Singer, R., & Hofacre, C. (2006). Potential impacts of antibiotic use in
69
poultry production. Avian Diseases, 50(107), 161–172.
http://doi.org/doi: 10.1637/7569-033106R.1
Smet, A., Martel, A., Persoons, D., Dewulf, J., Heyndrickx, M., Catry, B.,
… Butaye, P. (2008). Diversity of Extended-Spectrum B-Lactamases
and Class C B-Lactamases among Cloacal Escherichia coli Isolates in
Belgian Broiler Farms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
52(4), 1238–1243. http://doi.org/10.1128/AAC.01285-07
Smet, A., Martel, A., Persoons, D., Dewulf, J., Heyndrickx, M., Herman, L.,
… Butaye, P. (2010). Broad-spectrum β-lactamases among
Enterobacteriaceae of animal origin: molecular aspects, mobility and
impact on public health. FEMS Microbiology Reviews, 34(3), 295–
316. http://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2009.00198.x
Spellberg, B., Bartlett, J. G., & Gilbert, D. N. (2013). The Future of
Antibiotics and Resistance. New England Journal of Medicine, 368(4),
299 – 302. http://doi.org/10.1056/NEJMp1215226
Stanchi, N. O. (2007). La Ciencia Microbiológica. In N. O. Stanchi, P. E.
Martino, E. Gentilini, H. E. Reinoso, M. G. Echeverría, N. A. Leardini,
& C. J. Alberto (Eds.), Microbiología Veterinaria (1 ra. ed., pp. 6 – 9).
Buenos Aires: INTER-Médica.
Stanchi, N. O., & Gentilini, E. (2007a). CITOLOGIA BACTERIANA. In N.
A. C. J. A. Stanchi, Nerstor Oscar; Martino, Pablo Eduardo; Gentilini,
Elida; Reinoso, Hugo Enso; Echeverría, María Gabriela; Leardini
(Ed.), Microbiología Veterinaria (1 ra. ed., pp. 16 – 24). Buenos Aires:
INTER-Médica.
Stanchi, N. O., & Gentilini, E. (2007b). Citología Bacteriana. In N. O.
Stanchi, P. E. Martino, E. Gentilini, H. E. Reinoso, M. G. Echeverría,
N. A. Leardini, & C. J. Alberto (Eds.), Microbiología Veterinaria (1 ra.
ed., pp. 16 – 24). Buenos Aires: INTER-Médica.
Stefani, S., Giovanelli, I., Anacarso, I., Condò, C., Messi, P., De
Niederhäusern, S., … Sabia, C. (2014). Prevalence and
70
characterization of extended-spectrum β-lactamase-producing
Enterobacteriaceae in food-producing animals in Northern Italy. New
Microbiologica, 37(4), 551–555. Retrieved from
http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
84908556402&partnerID=40&md5=310e522fec1e59dfdc135f8f6dbb7
bcf
Stuart, J., Dierikx, C., Al Naiemi, N., Karczmarek, A., Van Hoek, A. H. A.
M., Vos, P., … Leverstein-Van Hall, M. A. (2010). Rapid detection of
TEM, SHV and CTX-M extended-spectrum B-lactamases in
Enterobacteriaceae using ligation-mediated amplification with
microarray analysis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65(7),
1377–1381. http://doi.org/10.1093/jac/dkq146
Stuart, J., van den Munckhof, T., Voets, G., Scharringa, J., Fluit, A., & Hall,
M. L. Van. (2012). Comparison of ESBL contamination in organic and
conventional retail chicken meat. International Journal of Food
Microbiology, 154(3), 212–214.
http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.034
Suárez, C., & Gudiol, F. (2009). Antibióticos betalactámicos.
Enfermedades Infecciosas Y Microbiología Clínica, 27(2), 116–129.
http://doi.org/10.1016/j.eimc.2008.12.001
Suárez, C. J., Kattán, J. N., Guzmán, A. M., & Villegas, M. V. (2006).
Mecanismos de resistencia a carbapenems en P. aeruginosa,
Acinetobacter y Enterobacteriaceae y estrategias para su prevención
y control. Asociación Colombiana de Infectología, 10(2), 85–93.
Sumano, H., & Ocampo, L. (2006). Antimicrobianos. In H. Sumario & L.
Ocampo (Eds.), FARMACOLOGÍA VETERINARIA (3ra. ed., pp. 127 –
146). México, D.F.: McGraw-Hill Interamericana.
Sun, Y., Zeng, Z., Chen, S., Ma, J., He, L., Liu, Y., … Liu, J. H. (2010).
High prevalence of blaCTX-M extended-spectrum B-lactamase genes
in Escherichia coli isolates from pets and emergence of CTX-M-64 in
71
China. Clin Microbiol Infect, 16, 1475 – 1481. http://doi.org/CLM3127
[pii]\n10.1111/j.1469-0691.2009.03127.x
Sütterlin, S., Edquist, P., Sandegren, L., Adler, M., Tängdén, T., Drobni,
M., … Melhus, A. (2014). Silver resistance genes are overrepresented
among Escherichia coli isolates with CTX-M production. Applied and
Environmental Microbiology, 80(22), 6863–6869.
http://doi.org/10.1128/AEM.01803-14
Tamay de Dios, L., Ibara, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo
real. Investigacion En Discapacidad, 2(2), 70 – 78.
http://doi.org/10.1157/13059826
Tofteland, S., Dahl, K. H., Aasnæs, B., Sundsfjord, A., & Naseer, U.
(2012). A nationwide study of mechanisms conferring reduced
susceptibility to extended-spectrum cephalosporins in clinical
Escherichia coli and Klebsiella spp. isolates. Scandinavian Journal of
Infectious Diseases, 44, 927 – 933.
http://doi.org/10.3109/00365548.2012.707330
Urumova, V. (2015). Extended spectrum beta lactamase producing animal
enterobacteriaceae isolates as potential risk to public health – review.
Revue Méd. Vét, 166(7-8), 192–207.
Valencia, P. A. (2009). Evidencia de transferencia horizontal de genes de
resistencia a antibióticos provenientes de bacterias ambientales.
UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO.
Valentin, L., Sharp, H., Hille, K., Seibt, U., Fischer, J., Pfeifer, Y., …
Käsbohrer, A. (2014). Subgrouping of ESBL-producing Escherichia
coli from animal and human sources: An approach to quantify the
distribution of ESBL types between different reservoirs. International
Journal of Medical Microbiology, 304(7), 805–816.
http://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.015
Vali, P., Shahcheraghi, F., Seyfipour, M., Zamani, M., Allahyar, M., &
72
Feizabadi, M. (2014). Phenotypic and Genetic Characterization of
Carbapenemase and ESBLs Producing Gram-negative Bacteria
(GNB) Isolated from Patients with Cystic Fibrosis in Tehran Tospitals.
Journal of Clinical and Diagnostic Research, 8(1), 26–30.
http://doi.org/10.7860/JCDR/2014/6877.3916
Vásconez, D. C. (2015). AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE
Escherichia coli BLEE EN CIEGOS DE POLLOS FAENADOS EN
CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA.
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR.
Vila, J., & Marco, F. (2010). Lectura interpretada del antibiograma de
bacilos gramnegativos no fermentadores. Enfermedades Infecciosas
Y Microbiología Clínica, 28(10), 726–736.
http://doi.org/10.1016/j.eimc.2010.05.001
Villegas, M. V, Kattan, J. N., Quinteros, M. G., & Casellas, J. M. (2008).
Prevalence of extended-spectrum beta-lactamases in South America.
Clinical Microbiology and Infection, 14(1), 154–158.
http://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2007.01869.x
Vingopoulou, E. I., Siarkou, V. I., Batzias, G., Kaltsogianni, F., Sianou, E.,
Tzavaras, I., … Miriagou, V. (2014). Emergence and maintenance of
multidrug-resistant Escherichia coli of canine origin harbouring a
blaCMY-2-IncI1/ST65 plasmid and topoisomerase mutations. Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, 69(8), 2076–2080.
http://doi.org/10.1093/jac/dku090
von Salviati, C., Laube, H., Guerra, B., Roesler, U., & Friese, A. (2015).
Emission of ESBL/AmpC-producing Escherichia coli from pig fattening
farms to surrounding areas. Veterinary Microbiology, 175(1), 77–84.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.10.010
Wagner, S., Gally, D. L., & Argyle, S. A. (2014). Multidrug-resistant
Escherichia coli from canine urinary tract infections tend to have
commensal phylotypes, lower prevalence of virulence determinants
73
and ampC-replicons. Veterinary Microbiology, 169(3-4), 171–178.
http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2014.01.003
Wasyl, D., Hasman, H., Cavaco, L. M., & Aarestrup, F. M. (2012).
Prevalence and Characterization of Cephalosporin Resistance in
Nonpathogenic Escherichia coli from Food-Producing Animals
Slaughtered in Poland. Microbial Drug Resistance, 18(1), 79–82.
http://doi.org/10.1089/mdr.2011.0033
Willey, J. M., Sherwood, L. M., & Woolverton, C. J. (2008). Procaryotic
Cell Structure and Funtion. In J. M. Willey, L. M. Sherwood, & C. J.
Woolverton (Eds.), PRESCOTT, HARLEY, AND KLEIN’S
MICROBIOLOGY (7th ed., pp. 40 – 78). New York: McGraw-Hill.
Winn, W., Allen, S., William, J., Elmer, K., Gary, P., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2013a). Bacteriología médica: taxonomia, morfología,
fisiología y virulencia. In W. Winn, S. Allen, J. William, K. Elmer, P.
Gary, P. Schreckenberger, & G. Woods (Eds.), Koneman Diagnóstico
microbiológico Texto y Atlas en color (6ta. ed., pp. 161 – 203).
México, D.F.: Editorial Médica Panamericana.
Winn, W., Allen, S., William, J., Elmer, K., Gary, P., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2013b). Enterobacteriaceae. In W. Winn, S. Allen, J.
William, K. Elmer, P. Gary, P. Schreckenberger, & G. Woods (Eds.),
Koneman Diagnóstico microbiológico Texto y Atlas en color (6ta. ed.,
pp. 205 – 288). México, D.F.: Editorial Médica Panamericana.
Winn, W., Allen, S., William, J., Elmer, K., Gary, P., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2013c). Introducción a la microbiología: Parte I. In W.
Winn, S. Allen, J. William, K. Elmer, P. Gary, P. Schreckenberger, &
G. Woods (Eds.), Koneman Diagnóstico microbiológico Texto y Atlas
en color (6ta. ed., pp. 1 – 65). México, D.F.: Editorial Médica
Panamericana.
Winn, W., Allen, S., William, J., Elmer, K., Gary, P., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2013d). Microbiología molecular. In W. Winn, S. Allen,
74
J. William, K. Elmer, P. Gary, P. Schreckenberger, & G. Woods
(Eds.), Koneman Diagnóstico microbiológico Texto y Atlas en color
(6ta. ed., pp. 129 – 160). México, D.F.: Editorial Médica
Panamericana.
Winn, W., Allen, S., William, J., Elmer, K., Gary, P., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2013e). Pruebas de sensibilidad a los antibióticos. In
W. Winn, S. Allen, J. William, K. Elmer, P. Gary, P. Schreckenberger,
& G. Woods (Eds.), Koneman Diagnóstico microbiológico Texto y
Atlas en color (6ta. ed., pp. 902 – 974). México, D.F.: Editorial Médica
Panamericana.
Wright, G. D. (2011). Molecular mechanisms of antibiotic resistance.
Chemical Communications, 47, 4055–4061.
http://doi.org/10.1039/c0cc05111j
Zhang, L., Levy, K., Trueba, G., Cevallos, W., Trostle, J., Foxman, B., …
Eisenberg, J. N. S. (2015). The effects of selection pressure and
genetic association on the relationship between antibiotic resistance
and virulence in Escherichia coli. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, (August), AAC.01094–15.
http://doi.org/10.1128/AAC.01094-15
Zheng, H., Zeng, Z., Chen, S., Liu, Y., Yao, Q., Deng, Y., … Liu, J.-H.
(2012). Prevalence and characterisation of CTX-M β-lactamases
amongst Escherichia coli isolates from healthy food animals in China.
International Journal of Antimicrobial Agents, 39(4), 305–310.
http://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2011.12.001
Zhou, M., Yang, Y., Chen, P., Hu, H., Hardwidge, P. R., & Zhu, G. (2015).
More than a locomotive organelle: flagella in Escherichia coli. Applied
Microbiology and Biotechnology, 99(21), 8883 – 8890.
http://doi.org/10.1007/s00253-015-6946-x
Zurfluh, K., Hachler, H., Nuesch-Inderbinen, M., & Stephan, R. (2013).
Characteristics of Extended-Spectrum B-Lactamase- and
75
Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae Isolates from Rivers
and Lakes in Switzerland. Applied and Environmental Microbiology,
79(9), 3021–3026. http://doi.org/10.1128/AEM.00054-13