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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de Médico Veterinario Y Zootecnista. AUTORA: Valeria Sofía Poma Vivanco TUTOR: Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc. Quito, Diciembre, 2014
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN
CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de
Médico Veterinario Y Zootecnista.
AUTORA:
Valeria Sofía Poma Vivanco
TUTOR:
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
Quito, Diciembre, 2014
ii
DEDICATORIA
Dedico este proyecto de tesis a Dios y a mis padres. A Dios por su
incondicional amor y la fortaleza que me ha dado en cada paso. A mis
padres, por todo el amor y apoyo que me han brindado a lo largo de mi vida,
por enseñarme a no rendirme y siempre dar mi mejor esfuerzo.
Valeria Poma
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco a mis padres, Joselito y Zonia, que siempre me han alentado para
cumplir mis sueños, por todo lo que han hecho cada día para mi bienestar,
por apoyarme en mi carrera y nunca dejarme rendir.
A las empresas que colaboraron en este proyecto, por la apertura que nos
dieron al realizar esta investigación.
A mi tutor el Dr. Christian Vinueza, y a la Dra. María Belén Cevallos Directora
del laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria
(UCE), quienes me permitieron ser parte de esta investigación y confiaron en
mí para la elaboración de este proyecto.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, y al Centro Internacional
de Zoonosis, por facilitar sus instalaciones durante la elaboración de este
proyecto.
A Nathaly y Sofía por los momentos compartidos durante la elaboración de
nuestras tesis, que sin su colaboración este proyecto no hubiera sido posible.
A mis amigos, mi segunda familia quienes han sido mi pilar en los momentos
difíciles, que me ayudaron a levantarme cuando más lo necesite y aunque a
veces la distancia nos separe, me han demostrado su apoyo incondicional.
iv
ACEPTACIÓN DEL TUTOR
Por la presente dejo constancia que he leído el Proyecto de Trabajo de
Grado, presentado por la señorita Valeria Sofía Poma Vivanco para optar el
Grado de Médico Veterinario y Zootecnista cuyo título tentativo es:
“AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN
CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA”, y en tal
virtud, acepto asesorar al estudiante, en calidad de Tutor, durante la etapa
del desarrollo del trabajo de grado hasta su presentación y evaluación.
En la ciudad de Quito a los dos días del mes de Diciembre de 2013.
FIRMA
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
C.C.: 1713266227
v
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, VALERIA SOFÍA POMA VIVANCO, en calidad de autora del trabajo de
investigación o tesis realizada sobre “AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN
MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN
CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES
INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA”, por la presente
autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos
los contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contiene esta obra,
con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que
como autores no corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a nuestro favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley Intelectual y su
Reglamento.
Quito, a 12 de Noviembre de 2014.
_____________________________ FIRMA
Valeria Sofía Poma Vivanco
C.C.: 1724036510
vi
APROBACIÓN DE TRIBUNAL
“AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni
y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS
EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA”
El tribunal constituido por:
Presidente: Dra. María Belén Cevallos
Vocal Principal: Dr. Marco Cisneros
Vocal Principal: Dra. María Inés Baquero
Vocal Suplente: Dr. Richard Rodríguez
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado previo a la obtención
del grado de Médico Veterinario y Zootecnista presentado por la Srta. Valeria
Sofía Poma Vivanco.
Con el título:
“Aislamiento y tipificación molecular de Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli en contenido cecal de pollos faenados en camales
industriales en la provincia de Pichincha”
Ha emitido el siguiente Veredicto: APROBADO
Quito 1 de Diciembre de 2014
Por constancia de lo actuado firman:
Presidente: Dra. María Belén Cevallos
Vocal Principal: Dr. Marco Cisneros
Vocal Principal: Dra. María Inés Baquero
Suplente: Dr. Richar Rodríguez
vii
ÍNDICE GENERAL
CONTENIDO pp
DEDICATORIA ............................................................................................... ii
ÍNDICE DE CUADROS ................................................................................ viii
ÍNDICE DE GRÁFICOS ................................................................................. ix
RESUMEN...................................................................................................... x
INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1
CAPÍTULO I ................................................................................................... 2
EL PROBLEMA ............................................................................................. 2
Planteamiento del Problema ....................................................................... 2
Justificación ................................................................................................ 4
Objetivos .................................................................................................... 6
CAPÍTULO II .................................................................................................. 7
MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 7
Antecedentes de la investigación ............................................................... 7
Fundamentación Teórica ............................................................................ 8
CAPÍTULO III ............................................................................................... 34
METODOLOGÍA .......................................................................................... 34
Determinación de Métodos a utilizar ......................................................... 34
Diseño de la investigación ........................................................................ 34
Descripción de la zona de estudio ............................................................ 34
Técnicas e instrumentos de recolección de información ........................... 37
Técnicas de Procesamiento y análisis de datos ....................................... 43
CAPÍTULO IV .............................................................................................. 44
RESULTADOS ............................................................................................ 44
Presentación de Resultados ..................................................................... 44
Discusión de Resultados .......................................................................... 48
CAPÍTULO V ............................................................................................... 53
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................... 53
Conclusiones ............................................................................................ 53
Recomendaciones .................................................................................... 54
viii
REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS .............................................................. 55
ANEXOS ..................................................................................................... 67
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación científica de Campylobacter..................................... 9
Cuadro 2. Especies de Campylobacter, sus fuentes y espectro de
enfermedades que causan en seres humanos ............................................ 12
Cuadro 3. Diferenciación de las especies termófilas de Campylobacter ..... 30
Cuadro 4. Ubicación y código de las Plantas de faenamiento industriales de
aves en la Provincia de Pichincha. .............................................................. 35
Cuadro 5. Cálculo del mater mix para una reacción .................................... 41
Cuadro 6. Programa para termociclador ..................................................... 42
Cuadro 7. Resultados de aislamiento de Campylobacter spp. del contenido
cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento ........................... 45
Cuadro 8. Especies de Campylobacter encontradas en las empresas
muestreadas. ............................................................................................... 47
Cuadro 9. Grupos farmacológicos usados en granja previo al faenamiento en
las aislamientos positivos a Campylobacter spp. ......................................... 48
ix
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Patogénesis de Campylobacter jejuni en el tracto gastrointestinal
de seres humanos y aves. ............................................................................. 17
Gráfico 2. Estructuras de la superficie de C. jejuni. ....................................... 23
Gráfico 3. Mecanismos de resistencia antimicrobiana de Campylobacter spp.25
Gráfico 4. Repique positivo a Campylobacter spp. sembrado en MCCDA y
tinción Gram modificada de Campylobacter spp. ........................................... 44
Gráfico 5. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identifica C. coli por
presentar bandas específicas de 364pb y C. jejuni con 773 pb. .................... 46
Gráfico 6. Identificación de especies de Campylobacter mediante la PCR
múltiple. ......................................................................................................... 46
x
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE Campylobacter jejuni y Campylobacter coli EN CONTENIDO CECAL DE POLLOS FAENADOS EN CAMALES INDUSTRIALES EN LA PROVINCIA DE PICHINCHA
Autor: Valeria Sofía Poma Vivanco Tutor: Dr. Christian Vinueza M.Sc.
Fecha: Noviembre, 2014
RESUMEN
La campylobacteriosis es una enfermedad entérica en seres humanos, que en la mayoría de casos se asocia a Campylobacter jejuni y Campilobacter coli como agentes causales de esta enfermedad, siendo las aves el principal reservorio de estas bacterias. El objetivo de este estudio fue aislar y tipificar molecularmente C. jejuni y C. coli en contenido cecal de pollos faenados en camales industriales en la provincia de Pichincha, Ecuador, mediante métodos microbiológicos y moleculares. Durante el sacrificio de los pollos se tomó al azar 25 ciegos por cada muestra. Finalizado los 6 meses de muestreo, se obtuvo 181 muestras. Las muestras fueron aisladas en agar modificado carbón cefoperazona desoxicolato (MCCDA). De las 181 muestras 130 (71,8%) fueron positivas a Campylobacter spp. Los resultados de la PCR múltiple para identificar las especies de C. jejuni y C. coli fueron: 88 muestras (67,69%) C. coli, 23 muestras (17,69%) C. jejuni, 18 muestras (13,85%) consistieron en muestras mixtas de C. coli y C. jejuni y 1 (0,77%) no pudo ser identificada mediante esta PCR. En conclusión, en este estudio se obtuvo un alto número de aislamientos de Campylobacter de contenido cecal de pollos faenados en plantas industriales en la provincia de Pichincha. Por esta razón, se recomienda realizar otros estudios que permitan obtener más datos sobre esta enfermedad en el Ecuador.
Descriptores:
Campylobacter coli/ Campylobacter jejuni/ POLLOS BROILER/ PICHINCHA/
AISLAMIENTO/ TIPIFICACIÓN MOLECULAR/ PCR MÚLTIPLE.
xi
ISOLATION AND MOLECULAR TYPING OF Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in FECAL CONTENT OF CHICKEN SLAUGHTERED IN INDUSTRIAL SALUGHTERHOUSES IN THE PROVINCE OF PICHINCHA ABSTRACT Campylobacteriosis is an enteric infection of humans, which in most cases is associated with Campylobacter jejuni and Campylobacter coli as causative agents of this disease. Birds are the main reservoir of these bacteria. The aim of this study was to isolate and characterize molecularly C. jejuni and C. coli in fecal contents of chickens slaughtered in industrial slaughterhouses in the Province of Pichincha, Ecuador, by microbiological and molecular methods. During the slaughter of chickens, 25 chickens were chosen randomly for each sample. Once the six-month sampling ended, 181 samples were obtained. The samples were isolated in Modified Charcoal Cefoperazone Desoxycholate Agar (mCCDA). Out of the 181 samples, 130 (71.8%) were positive for Campylobacter spp. The results from the multiplex PCR to identify species of C. jejuni and C. coli were as follows: 88 samples (67.69%) of C. coli, 23 samples (17.69%) of C. jejuni, 18 samples (13.85%) consisted of mixed samples of C. coli and C. jejuni, and one sample (0.77%) could not be identified by this PCR. In conclusion, in this study a large number of isolations of Campylobacter were obtained from the fecal content of slaughtered chickens in industrial plants in the Province of Pichincha. Therefore, it is recommended to carry out further studies to learn more about this disease in Ecuador. Descriptors: Campylobacter coli / Campylobacter jejuni / Broiler chickens / Pichincha/ isolation / molecular typing / multiplex PCR.
1
INTRODUCCIÓN
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son microorganismos Gram
negativos, termófilos y microaerófilos que colonizan la mucosa intestinal de
muchos animales de sangre caliente, incluyendo las aves de abasto. Estos
microorganismo son los más asociadas a campylobacteriosis en seres
humanos, esta enfermedad pertenece al grupo de enfermedades transmitida
por los alimentos (ETA), siendo una de las causas más frecuentes de diarrea
aguda desde su identificación como productora de esta patología en 1975
(WHO, OIE, FAO, Universiteit Utrecht, 2012).
La carne de pollo es considerada uno de los vehículos alimentarios más
importantes en la transmisión de la bacteria, por lo que el estudio de la
presencia de Campylobacter spp. en aves es indispensable para poder
monitorear la enfermedad de una manera adecuada (Habib et al.,2012).
Los primeros aislamientos en Latinoamérica se dieron en Brasil, en el año
1979, en niños con diarrea; posterior a esto esta bacteria ha sido aislada en
todos los países de Sudamérica (Fernández, 2011). Aunque los estudios que
existen en su mayoría no son actualizados tanto en seres humanos como en
pollos de engorde.
El presente estudio aplicó las técnicas microbiológicas y moleculares
establecidas en el laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia para la identificación de C. coli y C. jejuni en
contenido cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento
industriales en la provincia de Pichincha.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
La campylobacteriosis es considerada uno de los agentes causales de la
diarrea del viajero (Villa et al., 2011). El diagnóstico de campylobacteriosis
indica que alrededor del 95% de las infecciones son causadas por C. jejuni
seguido por C. coli (Wagenaar & Jacobs, 2014).
La aplicación de técnicas mejoradas para su aislamiento han podido
comprobar que la incidencia de Campylobacter spp. en muchos países es
superior a Salmonella spp. (FAO & WHO, 2009). Sin embargo, no se le ha
dado la importancia debida, al ser considerada una enfermedad autolimitante
(Lapierre, 2013).
Entre las formas de transmisión, la más común se da por contaminación
cruzada, siendo la carne de pollo un factor importante (OMS, 2011). La carne
de pollo se contamina con Campylobacter spp. durante el desplume y la
evisceración, existiendo contaminación cruzada entre lotes de pollos
positivos y negativos contribuyendo a la contaminación de las canales (Habib
et al., 2012).
Aunque información sobre Campylobacter spp. en aves de corral es limitada,
se considera que el riesgo de contaminación varía en función de las medidas
y las prácticas de control implementadas a lo largo de la cadena, desde la
producción primaria hasta la preparación final para el consumo (FAO &
WHO, 2009).
3
En los pocos estudios que se han realizado en Sudamérica, se ha asilado C.
coli con mayor frecuencia, representando cerca del 25% de los casos de
diarrea producidos por este género, a diferencia de países industrializados
donde solo representa entre el 5 y 10% de todos los casos (Fernández,
2011).
Dado que campylobacteriosis es la zoonosis más frecuente a nivel mundial y
la principal causa es el consumo de carne de pollo (OMS, 2011),
consideramos de gran interés su estudio, sobre todo al no existir en Ecuador
trabajos previos sobre aislamiento de Campylobacter spp. en contenido cecal
de pollos en las plantas de faenamiento.
4
Justificación
Campylobacter spp. es una de las principales bacterias que causa
enfermedades diarreicas transmitidas por los alimentos (ETA) en el ser
humano, provocando más casos de diarrea que Salmonella (OMS, 2011),
siendo el primer agente de diarrea en seres humanos en países
desarrollados y el segundo o tercero en países subdesarrollados (Fernández,
2011). La campylobacteriosis humana es causada principalmente por C. coli
y C. jejuni, aunque Campylobacter lari también se ha asociado como
causante de la enfermedad (Torralbo, 2013).
Su importancia se debe a su elevada incidencia, baja dosis infectante y
duración, además de que está asociada a neuropatías periféricas como el
síndrome de Guillain-Barré, síndrome Miller Fisher y enfermedades
funcionales del intestino como el síndrome de intestino irritable (WHO et al.,
2012), afectando con mayor frecuencia a niños menores de dos años, que
algunas veces culmina con la muerte del paciente (OMS, 2011).
El principal reservorio de Campylobacter spp. son las aves de corral
(Wagenaar & Jacobs, 2014). En estos animales la bacteria es un comensal
del tracto intestinal, por lo que la presencia de la misma en la carne de pollo
es un factor de riesgo para la transmisión de la enfermedad a seres humanos
(García, Valenzuela, Rodríguez, León, & Fernández, 2009), dicha
transmisión se da con mayor frecuencia por contaminación cruzada y
consumo de carne de pollo mal cocida contaminada con este patógeno
zoonótico durante el proceso de faenamiento (Martín de Santos, Cepeda,
Herrera, & Martínez, 2012).
El consumo per cápita de pollo a nivel mundial ha ido incrementando con el
pasar de los años, y Ecuador no ha sido la excepción según CONAVE el
consumo de pollo promedio por habitante es de 35 Kg por persona,
5
aumentando considerablemente el consumo en relación a los últimos 10
años (CONAVE, 2013).
En el Ecuador no se ha reportado la presencia de Campylobacter spp. en las
plantas de faenamiento de pollos. Por esta razón es indispensable una
investigación que permita tener una visión más clara sobre la presencia de
Campylobacter spp. en el tracto intestinal de los pollos.
Existen distintas técnicas para detección de Campylobacter spp.; en esta
investigación como metodología se utilizó el aislamiento por siembra directa
en MCCDA, y la tipificación molecular se realizó mediante la PCR múltiple
para C. coli y C. jejuni. La PCR múltiple es un método rápido de detección de
las distintas especies de Campylobacter con alta sensibilidad y especificidad,
por lo cual se la considera una alternativa efectiva a los métodos
tradicionales de identificación de estas bacterias. (Méndez Álvarez & Pérez
Rotha, 2004).
Los resultados obtenidos al culminar el presente trabajo de investigación,
otorgaron datos actualizados sobre estas bacterias en las plantas de
faenamiento industriales en pollos en la provincia de Pichincha, permitiendo
utilizar estos datos para estudios epidemiológicos posteriores. Además, estos
datos serán de gran utilidad para las empresas que colaboraron en el
proyecto, para que mejoren sus procesos productivos.
6
Objetivos
En el presente estudio se planteó los siguientes objetivos:
General
Aislar y tipificar Campylobacter jejuni y Campylobacter coli en
contenido cecal de pollos faenados en camales industriales en
la Provincia de Pichincha, mediantes métodos microbiológicos y
moleculares.
Específicos
o Aislar Campylobacter spp. en contenido cecal de pollos en el
medio selectivo MCCDA.
o Identificar y tipificar Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
de los aislamientos obtenidos por sus características
fenotípicas, por medio de pruebas moleculares.
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes de la investigación
En Ecuador se ha realizado pocos estudios sobre Campylobacter spp.
debido a que las enfermedades diarreicas en nuestro país no se reportan a
las entidades de salud.
El primer reporte en Ecuador de enfermedad diarreica en humanos fue en
diciembre de 1984, donde se examinó 100 niños de 1 a 24 meses de edad
que sufrían de diarrea aguda, aislando Campylobacter fetus en el 23% de las
muestras (Guderian, Ordoñez, & Bossano, 1987).
En 1994, se examinó 177 niños menores de cinco años, reportando que el
3,37 % de las muestras fueron positivas a Campylobacter spp. (Vasco et al.,
2014).
En la provincia de Esmeraldas, en el 2005, se analizó 160 muestras de
heces de personas de distintas edades en las cuales no hubo crecimiento de
Campylobacter spp. (Gaitán, 2007).
En la ciudad de Quito se muestreó 80 carcasas de pollos de las cuales el
3,75% fueron positivas a Campylobacter jejuni, se concluyó que existe
contaminación por esta bacteria en carne de pollo vendida en la ciudad de
Quito; el 2,5% de las muestras positivas se obtuvo de carcasas de pollos
vendidas en supermercados y el 1,25% de las muestras positivas provenían
de ferias libres (Durango, 2007).
8
Por lo expuesto, en Ecuador no se posee información actualizada sobre la
campylobacteriosis humana, sus reservorios animales y formas de
transmisión, siendo necesario investigaciones que permitan tener una base
de datos actualizada de la enfermedad.
Fundamentación Teórica
Historia del Campylobacter
En 1886, el bacteriólogo alemán Theodor Escherich, describió en heces de
bebés con diarrea (Cholera infantum) un microorganismo espiriláceo, no
cultivable, al que domino vibrio felinus, por su parecido morfológico a otros
vibrios (Henry, 2013). En 1913 McFaydean y Stockman encontraron
“espirilos” en fetos de abortos bovinos, recibiendo la denominación de Vibrio
fetus. Jones, en 1931, identifico Vibrio jejuni en diarreas de ganado vacuno,
en 1944 Doyle aisló Vibrio coli en disentería porcina (Torralbo, 2013).
La conexión de la enfermedad con el consumo de alimentos se asoció a un
brote de gastroenteritis en Illinois, por el consumo de leche cruda en un
establecimiento penitenciario (Levy, 1946). En 1947, Vicent y colaboradores
aislaron Vibrios fetus en el hombre (Vinzent, Dumas, & Picard, 1947). Diez
años después se observó en muestras sanguíneas de mujeres embarazadas
(King, 1957) distinguiendo dos grupos por sus características bioquímicas y
serológicas: Vibrio fetus y otro grupo termófilo o “related Vibrio”
(Campylobacter jejuni y Campylobacter coli) (Torralbo, 2013).
En 1963, Sebald y Veron proponen la creación del género Campylobacter
(Silva et al., 2011). Posterior a esto en los años setenta se desarrollaron
medios de cultivo que permitieron aislar estos microorganismos con mayor
facilidad. En 1973, Butzler y Dekeyser aislaron los microorganismo de heces
de personas con enteritis por medio de filtración (Orietta, 2009), Skirrow en
1977 describió una técnica sencilla para el aislamiento de C. coli y C. jejuni a
partir de heces de humanos (Fernández, 2011). Estos estudios permitieron
lograr grandes avances en el estudio epidemiológico de la enfermedad.
9
Taxonomía de Campylobacter
El género Campylobacter según la décima edición del Bergey´s Manual of
Determinative Bacteriology, pertenece al reino bacteria (Cuadro 1), que a su
vez pertenece al filo Proteobacteria en las que se encuentran todas las Gram
negativas, clase Epsilon de las proteobacterias junto con Arcobacter y
Helicobacter (Torralbo, 2013).
Cuadro 1. Clasificación científica de Campylobacter
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Epsilonproteobacteria
Orden: Campylobacterales
Familia: Campylobacteraceae
Género: Campylobacter
Tomado de: Lapierre (2013)
Elaboración: La Autora
El género Campylobacter consiste de 17 especies y seis subespecies, de las
cuales las más frecuentes son C. jejuni (subespecie jejuni) y C. coli. Otras
especies como C. lari y Campylobacter upsaliensis se ha asilado en
pacientes con enfermedades diarreicas (OMS, 2011). Recientemente, se han
incluido especies adicionales dentro del género llegando 24 especies
potenciales del género: Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis,
Campylobacter lanieane, Campylobacter sputorum, Campylobacter
mucosalis, Campylobacter concisus, Campylobacter curvus, Campylobacter
rectus, Campylobacter gracilis, Campylobacter showae, Campylobacter
hominis, C. jejuni, C. coli, C. lari, Campylobacter insulaenigrae,
Campylobacter canadiensis, Campylobacter peloridis, Campylobacter
subantarticus, C. upsaliensis y Campylobacter helveticus (Debruyne, Gevers,
& Vandamme, 2008), sumándose Campylobacter avium (Rossi et al., 2009) y
Campylobacter cuniculorum (Zanoni, Debruyne, Rossi, Revez, & Vandamme,
2009) en el año 2009, así como Campylobacter ureolyticus, en el 2010, por la
10
reclasificación de Bacteroides ureolyticus (Vandamme, Dewhirst, De Brandt,
& Falsen, 2010) y Campylobacter troglodytis en el 2011 (Kaur et al., 2011).
Morfología
Las bacterias del género Campylobacter son bacilos pequeños curvos de
0,2–0,8 μm × 0,5–5 μm, Gram negativos, espiralados o en forma de S, con
un flagelo polar en uno o ambos extremos curvado, lo que le confiere la
característica de motilidad de sacacorchos (Silva et al., 2011). Generalmente
son bacterias microaerofílicas, requiriendo: 5% de oxígeno, 10% de dióxido
de carbono y 85% de nitrógeno (Lapierre, 2013). Algunas especies requieren
una atmósfera anaeróbica, aunque también pueden crecer en condiciones
microaeróbicas (OMS, 2011).
La mayoría de especies crecen a 37°C, aunque la temperatura optima de
crecimiento de C. jejuni, C. coli y C. lari es a 42 °C por lo cual se las conoce
como termófilas. Son oxidasa positiva a excepción de C. gracilis y catalasa
positiva. No fermentan ni oxidan carbohidratos pero obtienen su energía de
aminoácidos, o intermediarios del ciclo de ácidos tricarboxílicos; la mayoría
de las cepas son resistentes a la cefalotina (Lapierre, 2013).
Campylobacter spp. es incapaz de crecer con un pH menor a 4,9 y mayor de
9,0, su pH óptimo está entre 6,5 y 7,5 (Silva et al., 2011). Se destruyen en
condiciones subóptimas, congelación, deshidratación e irradiación. En
cultivos envejecidos predominan las formas esféricas, cocoides o
cocobacilares (FAO & WHO, 2009), no son cultivables en esta forma por su
menor nivel de péptidos, ácidos nucleicos, superoxidodismutasa y por su
menor integridad celular (Ikeda & Karlyshev, 2012).
Epidemiología
Campylobacter spp. es una bacteria patógena, que se ubica en el colón y
afecta al hombre causando diarrea, asociado a otras enfermedades como
septicemia, meningitis o complicaciones, como artritis reactivas y el
11
Síndrome de Guillian Barre. Los síntomas se presentan después del período
de incubación de 1 a 7 días, la severidad varía desde diarrea acuosa a
sanguinolenta, con fiebre y dolor abdominal, la enfermedad es autolimitante
en la mayoría de casos (Lapierre, 2013). Su dosis infectante es baja en
relación a otras bacterias, se necesita un inoculo de 104 para producir la
enfermedad (Orietta, 2009), aunque se ha comprobado que 500 bacterias
pueden instaurar la enfermedad en seres humanos (Hernández, Aguilera, &
Castro, 2013).
En las aves Campylobacter spp. no produce enfermedad y es un comensal
del intestino de las aves, siendo el sitio primario de colonización las criptas
del ciego, en el cuál se puede encontrar alrededor de 106 a 108 UFC/g
(Meade et al., 2009). Solo se necesita 35 UFC para la colonización exitosa
del tracto intestinal de las aves (Hermans et al., 2011). Campylobacter spp.
se establece en el ciego a las 24 horas de haber ingresado al ave y
aproximadamente el 94% de las aves serán positivas a las 72 horas después
de la colonización. La colonización de Campylobacter spp. en las aves
empieza a partir de las dos a cuatro semanas de edad (van Gerwe et al.,
2009), probablemente por la presencia de anticuerpos maternales en pollos
jóvenes que impide la colonización y las medidas de bioseguridad que se
implantan en las granjas durante las primeras semanas de vida de las aves.
En el cuadro 2 se puede observar algunas especies de Campylobacter y las
enfermedades que pueden producir a los seres humanos (Forbes, Sahm, &
Weissfeld, 2009).
12
Cuadro 2. Especies de Campylobacter, sus fuentes y espectro de
enfermedades que causan en seres humanos
Microorganismo Fuente Espectro de enfermedades en los seres
humanos
C. concisus, C. curvus, C. rectus, C.showae
Seres humanos Enfermedad periodontal; gastroenteritis.
C. gracili Seres humanos Infecciones de los tejidos profundos de la
cabeza, cuello y las vísceras: surcos gingivales
C. coli Cerdos, aves de
corral, ovejas, toros, pájaros
Gastroenteritis,* septicemia
C. jejuni subesp, jejuni
Aves de corral, toros, perros, gatos, pájaros
y otros animales
Gastroenteritis,* septicemia, meningitis; proctitis
C. jejuni subesp, doylei
Seres humanos Gastroenteritis,* septicemia
C. lari Pájaros, aves de
corral, otros animales; agua de ríos y mares
Gastroenteritis,* septicemia; infección de prótesis articulares
C. hyointestinals subesp, hyointestinalis
Cerdos, vacas, hamsters, ciervos
Gastroenteritis
C. upsaliensis Perros, gatos Gastroenteritis; septicemia, abscesos
C. fetus subesp. Fetus
Vacas, ovejas Septicemia, gastroenteritis; aborto;
meningitis
C. fetus subesp.venerealis
Vacas Septicemia
C. sputorum biovar. Spoutorum
Seres humanos, vacas, cerdos
Abscesos, gastroenteritis
*Forma clínica más común. Tomado de: Forbes et al. (2009)
Elaboración: La Autora
Distribución geográfica y reservorios
Campylobacter spp. es uno de los agentes bacterianos que con mayor
frecuencia está asociado a gastroenteritis. La incidencia de gastroenteritis
causada por Campylobacter spp. es poco conocida sobre todo en países de
bajos y medianos ingresos, estudios en países desarrollados han estimado
que el índice anual se encuentra entre 4,4 y 9,3 por cada 1000 habitantes.
(WHO et al., 2012).
El principal reservorio de Campylobacter spp. Es el trato gastrointestinal de
mamíferos salvajes, domésticos y aves. Debido a esto muchos países
13
poseen programas de monitoreo para determinar la prevalencia de
Campylobacter spp. en alimentos procedentes de animales y pájaros (FAO &
WHO, 2009).
En países industrializados la especie más comúnmente asociada a
infecciones gastrointestinales en humanos es C. jejuni seguido por C. coli y
C. lari (Fernández, 2011).
En 2012, El número de casos reportados de campylobacteriosis humana en
la Unión Europea fue 214.268, que fue un descenso del 4.3% comparado
con el 2011. La tasa de notificación de la Unión Europea fue 55.49 por
100.000 habitantes en 2012. (EFSA & ECDC, 2014).
En este mismo año, algunos países de la Unión Europea proporcionaron
información sobre la presencia de Campylobacter spp. en parvadas de pollos
de engorde, lotes de sacrificio o animales individuales basado en un tamaño
de muestra ≥ 25. La prevalencia en parvadas fue alta en Eslovenia 63,4% y
83,6% en Hungría. En lotes de sacrificio la prevalencia oscilo del 1,6% en
Finlandia a 62,1% en España. En Alemania la prevalencia fue de 9,2% de
pollos de engorde. Finlandia proporcionó información sobre distintos periodos
de muestreo con diferentes estrategias de muestreo registrando mayor
prevalencia de Campylobacter spp. en lotes de aves de abasto muestreadas
durante junio a octubre (5.3%) que en los muestreos durante enero, mayo,
noviembre y diciembre (1,6%) (EFSA & ECDC, 2014).
En el año 2013, la incidencia en Estados Unidos estimada de la infección por
Campylobacter spp. por cada 100.000 habitantes fue 13,82% (Crim et al.,
2014).
De la misma forma en África se ha aislado Campylobacter spp., en países
como Kenia, se ha aislado de pollos, cerdos, cabras, ganado vacuno, ovejas,
patos y perros domésticos (Turkson, Lindqvist, & Kapperud, 1988). En
14
Etiopía, se identificó en pollos y cerdos; en ovejas en Nigeria (Raji, Adekeye,
Kwaga, & Bake, 2000).
En Asia, se identificó Campylobacter spp. en broiler en países como China y
Japón (Chen et al., 2010), en Tailandia y en Malasia se ha aislado de broiler,
patos y aves silvestres (Torralbo, 2013). En Irán se aisló en aves, vacas,
caballos y camellos (Baserisalehi, Bahador, & Kapadnis, 2007).
Campylobacter spp. se aisló en Australia de perros, gatos, bovinos, ovejas y
aves (Bailey et al., 2003) y de aves domésticas en Nueva Zelanda (Bates,
Hiett, & Stern, 2004).
En Sudamérica, C. coli ha sido aislado con mayor frecuencia, representando
cerca del 25% de los casos de diarrea producidos por Campylobacter spp.
Esto se debe a que C. coli se ha aislado a partir de diversos reservorios,
como material fecal de pollos, carne de aves, aguas servidas, animales
silvestres y domésticos. Otra diferencia de los países sudamericanos en
relación a países industrializados es el hallazgo frecuente en seres humanos
de portadores sanos (Fernández, 2011).
Campylobacter spp. también ha sido asilado en pingüinos de la Antártida
(Griekspoor, Olsen, & Waldenström, 2009).
La prevalencia de campylobacteriosis ha sido estimada entre 7,6 y 100 veces
más alta que los valores oficiales declarados en cada país (Gilliss et al.,
2013). Como resultado al alto número de casos que no se notifican.
Todos estos datos proporcionados, dan una idea generalizada de la difusión
que tiene Campylobacter spp. a nivel mundial, así como la variedad de
hospedadores, siendo su principal hospedador las aves domésticas.
Transmisión
En las aves la transmisión horizontal es la principal forma de diseminación
del Campylobacter spp, factores potenciales como el agua de bebida no
15
tratada, alimentos, otros animales en la granja, aves silvestres, mosquitos,
trabajadores, maquinaria, entre otros, son diseminadores de Campylobacter
spp. en granja (Zhang & Saif, 2011). Una vez que un ave se contagia,
Campylobacter spp. se difunde a partir del agua, alimento y la cama
(Sánchez, Serrano, Marfil, & Jodral, 2009).
La transmisión vertical no está totalmente comprobada, se ha aislado en
huevos en pocas ocasiones y en su mayoría se atribuye a contaminación
fecal de la cáscara de los huevos; además, que Campylobacter spp. tiene
una tasa de supervivencia baja en la albumina de los huevos (FAO & WHO,
2009).
La principal ruta de contaminación de los alimentos por Campylobacter spp.
es durante el proceso de faenamiento y evisceración de animales de abasto
por contaminación fecal. El faenamiento de animales como ganado vacuno y
porcino es generalmente más higiénico que el faenamiento de broiler, por lo
tanto la carne de bovinos y porcinos generalmente se contamina menos con
Campylobacter spp. que la carne de pollo (FAO & WHO, 2009). Se considera
que entre el 50-80% de todos los casos de campylobacteriosis humana,
asocian al pollo como reservorio de esta bacteria (Bahrndoff, Rangstrup,
Nordentoft, & Hald, 2013).
C. coli y C. jejuni son las especies con mayor frecuencia asociadas a
infecciones humanas transmitidas por los alimentos; no se multiplican en los
alimentos a diferencia de otros agentes causantes de gastroenteritis
transmitida por alimentos (Forbes et al., 2009). La mayor parte de
campylobacteriosis humana está asociada con la manipulación de la carne
cruda de pollo, inadecuada cocción de la carne, contaminación cruzada con
otros alimentos y la poca higiene al momento de preparar alimentos (Hadush
& Pal, 2013).
16
Patogenia y Factores de Virulencia
La causa por la cual Campylobacter spp. es patógeno en humanos y se
establece como comensal en las aves no está muy clara, pero la diferencia
de temperatura corporal entre las aves y seres humanos puede ser un factor
significativo. Se ha observado diferencias entre la expresión de algunos
genes a temperatura de 37°C comparada con 42°; a 42°C se expresan
mayormente los genes indispensables para la quimiotaxis y motilidad en
comparación a la expresión de los mismos genes a 37°C (Alemka,
Corcionivoschi, & Bourke, 2012). En el ser humano puede ser patógeno por
la baja dosis infectante que se requiere para producir la enfermedad
(Hernández et al., 2013).
Como se puede observar en el Gráfico 1, algunos estudios han demostrado
que Campylobacter spp. al ingresar al tracto gastrointestinal de los seres
humanos evade la capa de moco del intestino e interactúa con las células
epiteliales, causando la producción de interleucina (IL) 8, al ingresar la
bacteria a la célula epitelial y haber inducido la producción IL-8 provoca el
reclutamiento de células dendríticas, macrófagos y neutrófilos, que
interactúan con el Campylobacter spp. (Young, Davis, & DiRita, 2007).
Esta interacción origina la respuesta inflamatoria masiva y el aumento de
citoquinas. Sin embargo, en las aves Campylobacter spp. solo reside en la
capa mucosa en el intestino especialmente el ciego; en algunos estudios se
demostró que Campylobacter spp. estimula la producción de IL-1beta y IL-6,
pero la respuesta del huésped no suele conducir a la diarrea inflamatoria en
pollos, los factores que influyen en la disminución de la respuesta inmune y
permiten la tolerancia no están muy bien definidos (Young et al., 2007).
17
Gráfico 1. Patogénesis de C. jejuni en el tracto gastrointestinal de seres humanos y aves. C. jejuni evade a la capa de moco del intestino en seres humanos, e interactúa con las células intestinales, estimulando la producción de IL-8, que provoca el reclutamiento de células dendríticas, neutrófilos y macrófagos. Este proceso induce a la respuesta inflamatoria. Al contrario, en aves C. jejuni reside en la capa mucosa del intestino. Los factores por los que la respuesta inmune es disminuida o se redirige a la tolerancia son desconocidos.
Tomado de: Young et al. (2007)
Otros estudios han demostrado que la mucina del tracto gastrointestinal de
las aves puede afectar la invasión de Campylobacter spp.; al ser muy
sulfatada en comparación a la mucina de los seres humanos, haciendo
posible que esta sulfatación module la virulencia de Campylobacter spp. y
sus manifestaciones clínicas en los distintos hospedadores (Alemka et al.,
2012).
C. jejuni tiene tres fenotipos de colonización en las aves, en el fenotipo uno
se encuentran cepas que no son capaces de colonizar las aves hasta el día
14 de edad, el fenotipo dos corresponde a cepas que se eliminan
rápidamente es decir cepas transitorias y el fenotipo tres pertenece a cepas
18
eficientes para colonizar y mantener la colonización. Estos fenotipos son
estables, independientes del nivel de inóculo y de los pasajes en el tracto
gastrointestinal de las aves, además que las cepas aisladas en seres
humanos tienen menor eficacia al colonizar aves (Hermans et al., 2011).
Aunque la patogénesis de Campylobacteriosis no está totalmente
comprendida, investigaciones recientes se han concentrado en el análisis
genómico siendo una alternativa para identificar genes de virulencia (Quinn
et al., 2013). La descripción de la patogenia de Campylobacter spp. se centra
en el C. jejuni por ser la especie más estudiada (Torralbo, 2013).
Los factores de virulencia más relevantes son la quimiotaxis, motilidad por la
presencia de flagelos, la capacidad de adherencia e invasión a la célula
eucariota y la producción de citotoxinas (Lapierre, 2013).
Quimiotaxis
La quimiotaxis es un sistema de transducción de señales por la cual la
bacteria detecta los estímulos ambientales y responde a ellos con acciones
como el desplazamiento, en el caso de Campylobacter spp. la quimiotaxis se
realiza mediante la rotación flagelar y quimiotaxis positiva hacia la mucina, L-
fucosa y la bilis, (Klotz, Garcés, Romero, & Ramírez, 2012), siendo
importantes componentes del tracto gastrointestinal y mucus de aves y seres
humanos (Fernández & Alonso, 2010).
En la quimiotaxis de Campylobacter spp. intervienen múltiples receptores de
transmembrana de metil-aceptación de las proteínas (MCP), que detectan
sustancias como: aminoácidos (aspartato, cisteína, serina y glutamato), sales
de ácidos orgánicos (citrato, fumarato, a-ketoglutarato, malato, piruvato y
succinato), L-asparagina, formiato y D-lactato (Hermans et al., 2011).
Existen diversos genes implicados en la quimiotaxis de Campylobacter spp.
entre los que están: cheA, cheW, cheV, cheY, cheR y cheB, todos estos
participan en la aceptación al receptor (Bouwman & van Putten, 2012);
19
aunque, el gen cheY es uno de los principales reguladores de respuesta en
la rotación flagelar, crucial para la virulencia (Torralbo, 2013). Mutaciones en
los genes cheB y cheR reducen la habilidad de colonización de los ciegos de
las aves (Malagón, García, & Heredia, 2010).
Otros genes como el gen B (docB o Tlp10) están implicados en la capacidad
de colonización y codifica al MCP, el gen docC (Tlp4) es importante para
obtener altos niveles de colonización. El gen Tlp1 es indispensable para la
colonización y su mutación disminuye la habilidad de colonización, siendo
estos tres genes muy importantes para la invasión (Vegge, Brondsted, Li,
Bang, & Ingmer, 2009).
El factor accesorio de colonización (acfB), codifica probablemente una
proteína MCP, siendo transcendente en las primeras etapas de colonización
y está presuntamente implicado en la persistencia de C. jejuni en el ciego de
pollo en presencia de la flora intestinal (Hermans et al., 2011). Otros genes
que intervienen durante la colonización y energía de quimiotaxis de
Campylobacter spp. son: cetA y cetB (Elliott & DiRita, 2008).
Motilidad Bacteriana y Flagelos
Las bacterias del género Campylobacter son móviles con dos flagelos
bipolares que les facilita la colonización de células humanas. Los flagelos
son necesarios para la colonización del intestino delgado y para que el
patógeno pueda trasladarse hasta el colón, está formado por tres
estructuras: el cuerpo basal, el gancho, y el filamento. El filamento está
compuesto por una flagelina mayor FlaA y una menor FlaB (Cróínin & Bakert,
2012), ambas codificadas por dos genes que son la flaA y flab (Solís, 2011).
Algunos estudios han demostrado que el flagelo posee un rol complejo en la
patogenicidad, incluyendo la secreción de proteínas ya que las especies de
Campylobacter no poseen sistemas de secreción tipo 3 o tipo 4 (SST3 y
SST4) indispensables en otros agentes patógenos entéricos (Lapierre, 2013).
20
La flagelina de Campylobacter spp. es una estructura altamente glicosilada,
su glicosilación es muy importante para que se pueda ensamblar el flagelo.
Por otra parte la formación de biofilms se mide por la cantidad de glicanos en
la flagelina y se supone que la formación de biofilms permite la sobrevivencia
de la bacteria en agua y medioambiente (Lapierre, 2013).
La adhesión e invasión son dependientes de la motilidad y expresión flagelar,
así cuando existen mutaciones que disminuyan la motilidad también
disminuirán la capacidad de adhesión e invasión (Fernández & Alonso,
2010).
Adhesión e invasión
La adhesión de Campylobacter spp. desempeña un papel temprano en el
proceso infeccioso uniéndose a receptores específicos de las células del
hospedador, Campylobacter spp. tiene predilección por los receptores de
superficie apical o basolateral de los enterocitos (Torralbo, 2013). La
adhesión e invasión están correlacionadas con el grado de severidad de los
síntomas clínicos en pacientes infectados (Dasti, Tareen, Lugert, Zautner, &
Gross, 2010).
Campylobacter spp. puede ingresar en la célula epitelial a través de la
invasión o mediante uniones estrechas que permite que la bacteria se mueva
en la superficie basolateral, para poder invadir la célula epitelial o ser
capturado por un macrófago, pudiéndose replicar dentro de estos e inducir la
apoptosis (Fernández & Alonso, 2010). La interacción que puede darse entre
células epiteliales, células dendríticas y macrófagos puede liberar citosinas y
quimiocinas que contribuyen a la diarrea e infección (Fernández & Alonso,
2010).
Una de las principales proteínas de adhesión de C. jejuni y C. coli es la
proteína de adherencia de Campylobacter spp. a la fibronectinia (cadF) de la
matriz celular (Lapierre, 2013), la diferencia de secuencia de inserción de 39
pb entre C. jejuni y C.coli demuestra que la adhesión de C.jejuni en las
21
células epiteliales intestinales es más eficiente que C. coli (Dasti et al., 2010).
Al cumplir cadF la función de adhesión tipo “tiggers” con la célula hospedera
también activa a GTPasas Rac1 y Cdc42 que inducen la internalización de la
bacteria en la célula hospedadora (Dasti et al., 2010).
Debido a que Campylobacter spp. no posee otros sistemas de secreción
como otras bacterias, en la invasión participan las proteínas Cia A-H
secretadas por el filamento del flagelo, de estas proteínas la CiaB es
fundamental para la internalización de la célula epitelial (Fernández &
Alonso, 2010).
Polisacárido capsular (CPS)
La cápsula de Campylobacter spp. está compuesta por unidades repetitivas
de oligosacáridos permitiendo la unión débil a la superficie celular, la capsula
cumple las funciones de colonizar, invadir y evasión en el intestino además
de que le confiere resistencia al suero (Fernández & Alonso, 2010). En la
cápsula se encuentra el polisacárido capsular (CPS), este factor le confiere a
la cápsula sus funciones y algunos estudios han demostrado que la
composición de CPS en C. jejuni es alta (Bouwman & van Putten, 2012).
Lipo-O-ligosacarido (LOS)
Como se puede observar en el Gráfico 2, la mayor parte de la superficie
externa de la membrana de C. jejuni está constituida por LOS (Bouwman &
van Putten, 2012), en esta bacteria posee una alta variación por la diferencia
entre los monosacáridos y su composición (Fernández & Alonso, 2010), el
LOS muestra mimetismo molecular con los gangliósidos de los nervios
periféricos en seres humanos, pudiendo generar una condición autoinmune
como el síndrome de Guillain-Barré (González, Huaracán, García, &
Figueroa, 2013). El gen cst-II que la bacteria requiere para la generación de
estructuras de LOS es similar al implicado en la biosíntesis de los
gangliosidos GM1 en seres humanos, por lo que el organismo del ser
humano genera anticuerpos que actúan tanto contra LOS y los gangliósidos,
22
afectando la estructura bacteriana y los gangliósidos de los nervios
periféricos en el ser humano, desencadenando la degeneración axonal y
desmielinización de los nervios periféricos (Nyaty & Nyaty, 2013). Por otro
lado el gen cst-II está vinculado a la invasión de C. jejuni a las células del
epitelio intestinal (González et al., 2013).
Además, los antígenos O de C. jejuni poseen en sus estructuras ácido
siálico, el cual es parecido al observado en los gangliósidos humanos
(Louwen et al., 2008).
Sistema N- glycosilación
Este sistema modifica algunas proteínas periplasmáticas y de la membrana
externa, tal como se observa en el Gráfico 2. Siendo importante para la
colonización, adherencia e invasión de las células epiteliales (Hernández et
al., 2013); algunas proteínas que conforman este sistema son responsables
por la post-translación de la bacteria; su rol biológico se asocia a la virulencia
de la bacteria (Fernández & Alonso, 2010). Al mutar el sistema N-
glycosilación produce la reducción de la competencia natural, reducción del
inmunoreactividad con el suero humano y reduce la colonización en pollos
(Bouwman & van Putten, 2012).
23
Gráfico 2. Estructuras de la superficie de C. jejuni. La superficie de la célula de C. jejuni posee varias estructuras, que cumplen un
papel importante en la interacción huésped-bacteria. La cápsula, es un polisacárido importante para la virulencia, adhesión e invasión. El LOS es variable y cumple un papel importante en la adhesión e invasión y está relacionado con el síndrome de Gullain-Barreé. El flagelo es importante para la colonización, virulencia y adhesión, actúa como un aparato de secreción para los antígenos de invasión, y en este se encuentra el sistema de O-glicosilación esencial para el ensamblaje de flagelina y la motildad. El sistema de N-glicosilación modifica algunas proteínas periplasmáticas y de membrana externa, importante para la colonización, adhesión e invasión.
Tomado de: Young et al. (2007)
O- glycosilación
El sistema de O-glycosilación es el responsable de la glicosilación flagelar,
así como se observar en el Gráfico 2. Es esencial para el correcto
ensamblaje de la flagelina y motilidad, por lo tanto influye en la adhesión,
invasión y virulencia (Fernández & Alonso, 2010). Tanto C. jejuni como C.
coli poseen una alta concentración de O-glycanos (Bouwman & van Putten,
2012).
Cápsula
Membrana Externa
Membrana Interna
LOS
Citoplasma
Periplasma Peptidoglicano
O-glicano
N-glicano
24
Lipopolisácarido (LPS)
LPS también se encuentra en la membrana externa de la bacteria, posee
actividad endotóxica al contener el antígeno O contiene ácido siálico y al
igual que LOS está relacionado con el síndrome de Guillain-Barré (Lapierre,
2013).
Toxina de distención citoletal (CDT)
La CDT es considerada como un factor importante de virulencia de
Campylobacter spp., esta toxina causa que las células eucariotas se
detengan en fase G2 de la mitosis (Torralbo, 2013), provocando la muerte
celular y subsecuentemente la respuesta inflamatoria (Fernández & Alonso,
2010). Está compuesta por tres subunidades codificadas por los genes cdtA,
cdtB y cdtC, estos genes permiten la unión a la membrana celular del
hospedador, produciendo daño en el ADN celular (Lapierre, 2013). La cdtB
es la subunidad activa y la cdtA y cdtC son los componentes de unión. La cdt
también induce a la célula epitelial a secretar la IL-8 que interviene en el
proceso inflamatorio (Fernández & Alonso, 2010).
Resistencia a Múltiples Fármacos
Los antibióticos dependiendo de sus propiedades químicas y estructura
entran en la bacteria y pueden tomar distintas rutas (Jeon, Muraoka, &
Zhang, 2010), el primer obstáculo para el antibiótico es la permeabilidad de
la membrana, el LOS y CPS contribuyen a la naturaleza hidrófila de la
superficie de la bacteria, reduciendo la permeabilidad a antibióticos
hidrofóbicos (Jeon, Muraoka, Scupham, & Zhang, 2009). Algunos
antimicrobianos al atravesar la membrana citoplasmática son extruidos por la
bomba de eflujo de múltiples fármacos conocida en sus siglas en inglés
como Cme, la cual reduce la concentración intracelular del fármaco, siendo el
segundo mecanismo de defensa de la bacteria contra los antibióticos (Jeon
25
et al., 2010) y media la resistencia a metales pesados (Hermans et al., 2011).
El Cme está compuesto por el operón cmeA, cmeB y cmeC; el CmeA
consiste en una proteína periplasmática, CmeB es un transportador de flujo
de membrana interna y el CmeC es una proteína de la membrana externa
(Wieczorek & Osek, 2013).
Otro mecanismo utilizado por la bacteria es la modificación de la diana, como
sucede en las mutaciones espontáneas del gen GyrA en la región
determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) (Jeon et al., 2010),
reduciendo la afinidad de las fluoriquinolonas a la DNA gyrasa y como
resultado la resistencia a este tipo de fármacos (Notario et al., 2011).
En el Gráfico 3 se puede observar algunos de los mecanismos de resistencia
a antibióticos que posee Campylobacter spp.
Gráfico 3. Mecanismos de resistencia antimicrobiana de Campylobacter spp. LOS reduce la absorción de antibióticos hidrófobos como los macrólidos. Las
bombas de eflujo como CmeABC y otros transportadores de salida no
caracterizados, disminuyen la concentración intracelular de antibióticos. Las
mutaciones espontáneas reducen la afinidad de los antibióticos a la diana.
Tomado de: Jeon, Muraoka, & Zhang, 2010.
26
En relación a las tetraciclinas, la resistencia de Campylobacter spp. está
dada por el gen tet(O), este gen codifica a la proteína de protección
ribosamal (RPPs), confiriendo a la bacteria altos niveles de resistencia a las
tetraciclinas (Wieczorek & Osek, 2013).
Los macrólidos, en especial la eritromicina son antibióticos de amplio
espectro que actúan tanto contra Gram positivos y Gram negativos
(Wieczorek & Osek, 2013), incluyendo a Campylobacter spp. La resistencia
de Campylobacter spp. se da por la modificación del sitio de unión del
ribosoma de destino por mutación de 23S ARNr y otras proteínas
ribosamales (Iovine, 2013).
La resistencia de Campylobacter spp. a aminoglucósidos está mediada por la
modificación enzimática que disminuye la afinidad de los aminoglucósidos
para el sitio A del ARNr (Wieczorek & Osek, 2013). Estas enzimas son:
aminoglucósidos acetiltransferasas, aminoglucósidos adeniltransferasas y
aminoglucósidos fosfotransferasas, cada enzima posee su propio sistema de
modificación de las características y sustrato. En C. jejuni y C. coli, estas tres
enzimas poseen un mecanismo similar mediante la producción de una
fosfotransferasa 30-O-aminoglucósido (Pollett et al., 2012).
La resistencia a betalactámicos no está totalmente definida, pero la mayoría
de especies de Campylobacter spp. son resistentes a betalactámicos,
especialmente a penicilina y cefalosporinas de espectro reducido (Orietta,
2009). Tanto C. jejuni como C. coli producen betalactamasas que inactivan la
molecula del betalactámico por hidrolisis del anillo de lactama estructural
(Iovine, 2013).
Resistencia a la bilis
Las enterobacterias poseen mayor resistencia a la bilis que otras bacterias,
esta adaptación es indispensable para la supervivencia de Campylobacter
spp. en el intestino, proporcionándole una mayor ventaja competitiva sobre
otras bacterias al colonizar el intestino (Stef et al., 2013). La resistencia a la
27
bilis en Campylobacter spp. está mediada por la Cme ABC que regula la
resistencia a múltiples fármacos (Wieczorek & Osek, 2013).
Técnicas de Diagnóstico de Campylobacter spp.
Aislamiento e Identificación de la bacteria
Para poder aislar Campylobacter spp. a partir de heces o alimentos, se utiliza
medios de cultivos selectivos que contengan eliminadores de oxígeno, como
la sangre, hierro ferroso o piruvato, entre otros, y agentes selectivos como
antibióticos (Silva et al., 2011). Sin embargo, no está establecido un método
estandarizado para el aislamiento de Campylobacter spp. a partir de heces,
alimentos o muestras ambientales, no obstante algunas instituciones han
establecido algunos métodos como el propuesto por la Organización
Internacional de Estandarizacion (ISO) que estableció la ISO 10272:2006
para enumeración de Campylobacter termotolerante en alimentos, en el cuál
el primer medio selectivo que se utiliza es el agar modificado carbón
cefoperazona desoxicolato (mCCDA) (Habib, Uyttendaele, & De Zutter,
2011), entre otros métodos.
Toma y Transporte de Muestra
Las muestras tomadas de heces en aves vivas, contenido cecal de los
pollos después del proceso de evisceración y piel de cuello se deben
transportar de forma aséptica y en temperaturas entre 4 y 2°C (Wagenaar
& Jacobs, 2014), siendo 25 gramos de heces suficiente para la detección
de Campylobacter spp. (Torralbo, 2013), en el caso de realizar hisopado
rectal o de la superficie de la canal se debe colocar la muestra en un
medio de transporte como: Cary-Blair, Cary-Blair modificado, medio Stuart
modificado, entre otros (Wagenaar & Jacobs, 2014). Las muestras se
pueden procesar no más de 3 días después de la toma de muestra
(Wagenaar & Jacobs, 2014).
28
Aislamiento de Campylobacter spp.
El aislamiento de Campylobacter spp. de muestras fecales de ciego o
intestinales se puede realizarse directamente en el medio selectivo o por
medio de filtración sobre un medio selectivo (Wagenaar & Jacobs, 2014).
Aunque muchas técnicas utilizan el enriquecimiento para aumentar la
sensibilidad del cultivo o en bajos niveles de microrganismos en heces
(Silva et al., 2011). Para el enriquecimiento se utiliza caldos selectivos
como: el caldo Bolton (BB), Caldo de enriquecimiento Campylobacter
(CEB) y el caldo Preston.
Como ya se ha mencionado Campylobacter spp. es una bacteria
exigente, y por esta razón los medios de cultivo se han desarrollado para
satisfacer las necesidades de esta bacteria, así como el proporcionar las
condiciones adecuadas de microaerofilia, temperatura (42°C en el caso
de C. jejuni y C. coli) y tiempo (48 horas), favorecen el crecimiento de la
bacteria. Los medios de cultivos se dividen básicamente en dos grupos:
los que contienen sangre y los que contienen carbón (Wagenaar &
Jacobs, 2014), la sangre y el carbón sirven como eliminadores de
derivados tóxicos de oxígeno (Silva et al., 2011). La principal diferencia
entre los medios de cultivo es el grado de inhibición de la flora
contaminante, la mayoría de medios utilizan cefalosporinas y a veces en
combinación con otros antibióticos (Wagenaar & Jacobs, 2014).
Entre los medios sólidos con sangre están: Agar Preston, Agar Skirrow,
Campy-Cefex. Y entre los medios sólidos con carbón están: mCCDA uno
de los medios más utilizados (Gharst, Oyarzabal, & Hussain, 2013), Agar
Karmali, medio de carbón selectivo (CSM), entre otros (Wagenaar &
Jacobs, 2014).
Entre las técnicas de diagnóstico directo se encuentran: el método Gram
directo, la microscopia de contraste de fases y tinciones de Hooker y
Vagó, las dos primeras tienen un valor predictivo de 60 y 85,7%
29
respectivamente; mientras que la tinción de Hooker tiene sensibilidad del
37% y especificidad de 100% (Fernández, 2011). En estas técnicas se
puede observar bacilos finos en espiral o curvados que se mueven en
forma de sacacorchos, característico de Campylobacter spp. (Wagenaar
& Jacobs, 2014).
La filtración pasiva es un método desarrollado por Steele y McDermott
(Wagenaar & Jacobs, 2014), en el cual no se utiliza medios selectivos.
Esta técnica no permite el paso de microorganismos grandes a través del
filtro; Campylobacter spp. al tener alta motilidad y forma delgada pasa
fácilmente por la membrana (Gharst et al., 2013).
Identificación de especies de Campylobacter
La identificación de Campylobacter spp. se puede realizar mediante
varias técnicas entre las más importantes están: Pruebas bioquímicas,
Prueba de aglutinación en latex, Detección molecular y recientemente se
ha empezado a utilizar ELISA como prueba serlógica.
Pruebas bioquímicas: Las características fenotípicas específicas
de cada especie de Campylobacter, permite diferenciarlas e
identificarlas a cada una. En el caso de C. jejuni y C. coli, se utiliza
un grupo de pruebas para poder diferenciarlas, como se puede
observar en el Cuadro 3, usualmente C. jejuni se diferencia de
otras especies porque es positiva a la hidrólisis de hipurato y
también es sensible al ácido nalidíxico al igual que C. coli
(Wagenaar & Jacobs, 2014). Este tipo de identificación se ha
tornado poco útil, como resultado a la mutación bacteriana,
ocasionando variación de resultados a las pruebas bioquímicas ya
establecidas, por lo cual no es una prueba totalmente certera y se
debe utilizar métodos más precisos (Winn et al., 2013)
30
Cuadro 3. Diferenciación de las especies termófilas de Campylobacter
ES
PE
CIE
S D
E
CA
MP
YL
OB
A
CT
ER
CA
TA
LA
SA
CRECIMIENTO SULFURO DE
HIDRÓGENO-
TRIPLE AZÚCAR HIERRO
SENSIBILIDAD
HIP
UR
AT
O
AC
ET
AT
O D
E
IND
OX
ILO
25°C
42°C
Glicina 1%
NaCl 1,5%
Ácido Nalidíxico
Cefalotina
C. coli + - + + - - V R - +
C. jejuni + - + + - - V R + +
V= Variable; R= Resistente; (+) Positivo; (-) Negativo Tomado de: Winn et al., 2013; Quinn et al., 2013
Elaboración: La autora
Pruebas de aglutinación en látex: Es una prueba de rápida
identificación de Campylobacter spp., se utiliza anticuerpos
policlonales para detectar proteínas flagelares y de membrana (Gharst
et al., 2013). Las partículas de látex son recubiertas con
inmunoglobulinas que se levantan contra los antígenos de algunas
especies de Campylobacter, especialmente C. jejuni y C. coli (Gharst
et al., 2013).
Detección Molecular: Los métodos de identificación molecular son
rápidos y específicos para identificar las especies de Campylobacter,
estos métodos amplifican segmentos específicos de ADN o ARN
(Gharst et al., 2013). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
la PCR múltiple son la más utilizada, algunas técnicas utilizan
protocolos de enriquecimiento para incrementar la cantidad de
bacterias. Este tipo de prueba tiene un umbral de detección entre 103
UFC por ml en cultivos puros (Gharst et al., 2013). La PCR múltiple
permite identificar varias especies con una misma muestra, por la
amplificación de varios segmentos de ADN. Como ventajas de esta
técnica se puede mencionar su alta sensibilidad y especificidad
(Fernández & Alonso, 2010).
31
Ensayo por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA): es un
método serológico de diagnóstico rápido de campylobacteriosis
(Murray, Rossenthal, & Pfaller, 2009), tiene un umbral de detección de
104 UFC por ml-1 (Oyarzabal & Battle, 2012). Lo resultados que se
obtienen deben ser confirmados con métodos de cultivo (Gharst et al.,
2013). Entre estas pruebas se encuentran la ProSpecTTM
Campylobacter en heces la cual tiene sensibilidad entre 97-100% y
especificidad de 98-100% (Oyarzabal & Battle, 2012). En alimentos
una de las más usadas es VIDAS CAM, que posee una sensibilidad
entre 88-94% (Oyarzabal & Battle, 2012).
Enfermedades relacionadas
Campylobacter spp., como ya se lo ha mencionado, está relacionado con
otras enfermedades como es el síndrome de Guillain-Barré, artritis reactiva y
el síndrome de intestino irritable.
Guillain-Barré se asocia a Campylobacter spp., porque muchos casos de
personas con este síndrome presentan infección con Campylobacter spp.
(WHO et al., 2012); la desmielinización de los nervios periféricos se da
porque LOS de Campylobacter spp. muestra mimetismo molecular con los
gangliósidos de los nervios periféricos en seres humanos (Nyaty & Nyaty,
2013). En países poco desarrollados se reportó en el 2011, que en el 57% de
casos de personas con este síndrome se atribuyó a Campylobacter spp.
(WHO et al., 2012).
La artritis reactiva se produce en 1-5 % de las personas infectadas con
Campylobacte spp. (WHO et al., 2012).
El síndrome de intestino irritable es otra enfermedad considerada como
secuela de infecciones con Campylobacter spp., este síndrome se produce
por el incremento de los linfocitos y la regulación de citosinas en la mucosa
rectal, lo que indica la activación del sistema inmune, después de la infección
el síndrome hace que aumente la permeabilidad intestinal, que puede
32
incrementar la carga antigénica y aún más la activación del sistema inmune
(WHO et al., 2012). Algunos estudios han reportado que el 36% de personas
con campylobacteriosis aguda desarrollaron este síndrome después de 1 o 2
años de la infección (WHO et al., 2012).
Prevención
Las medidas para prevenir la colonización de los pollos en las granjas de
broillers, así como la contaminación de las canales en el matadero son
fundamentales en la prevención de la infección en seres humanos (EFSA,
2013). Es decir, la adecuada implementación medidas de bioseguridad en
granja pueden contribuir a la disminución o retraso de la colonización de los
pollos (O´Mahony, Buckley, Bolton, Whyte, & Fanning, 2011).
Administrar antibióticos en las aves para prevenir o disminuir la colonización
del tracto gastrointestinal de las aves, puede producir resistencia a
antimicrobianos, en especial porque se trata de animales destinados al
consumo humano (Torralbo, 2013). Debido a esto, se recomienda el empleo
de aditivos químicos o biológicos en el alimento y el agua (EFSA, 2011),
entre los cuales, el uso de probióticos ha demostrado la reducción
significativa de Campylobacter spp., por la exclusión competitiva que se
produce entre las bacterias (Torralbo, 2013).
Un método novedoso para disminuir la colonización de esta bacteria en el
tracto gastrointestinal de los pollos, es el uso de bacteriocinas (FAO & WHO,
2009), las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos (AMPs) producidos por
las bacterias para inhibir el crecimiento de otras bacterias (Jeon et al., 2010),
se ha demostrado que el uso de bacteriocinas en el agua de bebida elimina a
Campylobacter spp. en un 90% de los casos (Riazi et al., 2013), las
bacteriocinas que han demostrado un efecto antagonista significativo contra
Campylobacter spp. son OR-7 del Lactobacillus salivarius y E-760 de
Enterococcus (Jeon et al., 2010).
33
Además, se ha considerado el uso de bacteriofágos por su actividad lítica
(Siringan, Connerton, Cummings, & Connerton, 2014). Los bacteriofágos se
unen a la bacteria por medio de receptores de proteína o lipooligosacáridos,
penetrando en ella para multiplicarse, produciendo lisis de la bacteria por
multiplicación de los fagos (Torralbo, 2013).
Tratamiento
Campylobacter spp. al ser un comensal del tracto gastrointestinal de las
aves, no se realiza ningún tratamiento (Hermans et al., 2011). En los seres
humanos la enteritis que se produce es de corta duración y autolimitante,
pero cuando los síntomas son prolongados o muy graves el antibiótico de
elección es la eritromicina, pues muchas especies de Campylobacter son
resistentes a una amplia gama de antibióticos (Fernández, 2011).
Vacunación
Hasta el momento no se ha desarrollado una vacuna efectiva contra
campylobacteriosis en seres humanos y se sospecha que la inmunidad frente
a Campylobacter spp. puede ser específica de cada cepa (Torralbo, 2013).
En animales existe una vacuna contra C. fetus, pero no existe una vacuna
para C. jejuni (Nielsen et al., 2011). Las vacunas que se han desarrollado
para aves pueden reducir y hasta prevenir la infección (EFSA, 2011), aunque
los resultados obtenidos hasta ahora no han sido satisfactorios ya que la
mayoría de estudios son poco reproducibles y la protección inducida por la
vacuna no disminuye la infección en las aves (Torralbo, 2013).
Entre los factores que interfieren en una vacuna efectiva contra
Campylobacter spp. están: la poca compresión que se tiene sobre los
mecanismos de patogenia, el no tener un modelo animal adecuado y la
respuesta inmunológica de las distintas especies (Hernández et al., 2013).
34
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Determinación de Métodos a utilizar
Tipo de investigación
El tipo de investigación del cual se sustentó el presente proyecto es
cualitativo no experimental, no probabilístico.
Diseño de la investigación
En el presente proyecto se utilizó un diseño transversal descriptivo, porque
no se manipuló deliberadamente las variables. Este estudio nos permitió
identificar las especies de C. jejuni y C. coli presentes en el contenido cecal
de pollos en seis plantas de faenamiento industriales en la provincia de
Pichincha, mediante el aislamiento bacteriano y aplicación de la PCR
múltiple.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de campo se realizó en seis plantas de faenamiento industrial de
pollos, ubicados en la Provincia de Pichincha, en las siguientes parroquias:
Carcelén, Pintag, Puembo, San Antonio, Tababela pertenecientes al cantón
Quito y la parroquia Ascázubi perteneciente al cantón Cayambe.
35
El trabajo de laboratorio se realizó en el laboratorio de Bacteriología de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, y en el laboratorio de Biología
Molecular del Centro Internacional de Zoonosis, ambas instituciones parte de
la Universidad Central del Ecuador.
Población y muestra
La población objeto de estudio estuvo conformada por las parvadas de aves
faenadas en seis plantas de faenamiento industriales en la Provincia de
Pichincha, las empresas proporcionaron al laboratorio una muestra por cada
granja faenada durante cada ciclo productivo.
Los nombres de estas empresas se mantuvieron en absoluta reserva, ya que
se estableció un acuerdo de confidencialidad con dichas empresas, por lo
cual para identificar las muestras se estableció un código alfanumérico.
Cuadro 4. Ubicación y código de las Plantas de faenamiento industriales de aves en la Provincia de Pichincha.
Empresa Ubicación
1CT Pintag
2CT San Antonio de Pichincha
3CT0 Carcelén
4CT0 Ascázubi
5CT0 Puembo
6CT0 Tababela
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
Muestra
El tipo de muestreo que se aplicó en la investigación es un muestreo no
probabilístico aleatorio, porque en el estudio se estableció la presencia o
ausencia de C. coli y C. jejuni en un periodo de tiempo de seis meses
36
establecido por el “Estudio de Prevalencia y Resistencia a los antibacterianos
de Campylobacter spp., Escherichia coli BLEE y Salmonella spp. en
muestras gastrointestinales de pollos faenados en camales industriales de la
Provincia de Pichincha-Ecuador”, al cual pertenece el presente proyecto.
Se tomó 25 gramos de contenido cecal por muestra, un gramo de heces por
ciego de pollo; según la norma ISO 6579:2002 para la detección de
Salmonella spp. móviles en fecas. Esta metodología se utilizó ya que
paralelamente se realizó el aislamiento de Salmonella spp. y Eschericha coli
BLEE. .
El muestreo se realizó de forma aséptica después del eviscerado en las
plantas de faenamiento, por cada muestra se tomó 25 ciegos y se transportó
en refrigeración al laboratorio de bacteriología de la FMVZ.
En el laboratorio, se pesó 1 gramo de heces por cada ciego, se realizó un
pool de heces y se sembró en agar MCCDA, después de la confirmación por
tinción Gram modificada se repicó seis colonias en dos agares MCCDA, y se
guardó tres de estás cepas en sangre desfibrinada de cordero y una en caldo
brucella con glicerol, estas cepas se almacenaron a 80°C. Del primer repique
que se almacenó en sangre, se tomó una asada para su posterior lisis e
identificación molecular mediante la PCR múltiple.
Procedimiento de la Investigación
Se realizó en dos etapas:
a. Recolección de la información
Las plantas de faenamiento proporcionaron la información
sobre las granjas que se faenaban por día.
Una persona encargada en cada planta de faenamiento facilitó
la información para el registro de cada muestra.
Se tomó por cada muestra 25 ciegos de pollos después del
eviscerado.
37
Se identificó y almacenó la muestra de forma adecuada.
b. Procesamiento de la información y muestras en el laboratorio
Se aisló Campilobacter spp. utilizando el medio MCCDA y se
confirmó mediante tinción Gram modificada.
Se repicó en MCCDA para obtener cepas aisladas.
Se realizó un lisado del repique de la primera cepa almacenada
en sangre para su posterior análisis molecular.
Se tipificó molecularmente mediante la PCR múltiple para C.
jejuni y C. coli, según el protocolo establecido por Vandamme et
al. (1997).
Técnicas e instrumentos de recolección de información
Registro de muestreo de Campylobacter spp.: La
recolección de información de la muestra se obtuvo mediante
un cuestionario, el cual proporcionó datos importantes de los
animales muestreados (Anexo A).
Registros de Laboratorio: La datos obtenidos durante el
procesamiento de las muestras se registraron de acuerdo a los
dos procesos de laboratorio que se realizaron:
Registro de Laboratorio de Bacteriología para
aislamiento de Campylobacter spp.
Registro de Laboratorio de Biología Molecular para
identificar C. jejuni y C. coli.
Técnicas de Laboratorio
Técnica de procesamiento de la muestra
El procesamiento de la muestra se dio de la siguiente forma:
Colocar los ciegos en alcohol al 70% durante 5 minutos, a
continuación se quita el exceso de alcohol.
38
Cortar los ciegos en la parte distal, realizar un pool de heces
para esto se pesa 1 gramo de heces por cada ciego y se
homogeniza.
Técnica de Aislamiento de Campylobacter spp.
Siembra en el medio MCCDA OXOID® CM0739
Procedimiento de cultivo
El pool de heces de contenido cecal se siembra en MCCDA por
estriación simple, de la siguiente forma:
Tomar una asada de heces y realizar el inoculo primario,
en el primer cuadrante de la caja Petri.
Esterilizar el asa, y en el segundo cuadrante rozando el
inoculo primario realizar estrías hasta la otra esquina, con
movimientos de atrás hacia delante.
Realizar el mismo procedimiento con los dos cuadrantes
restantes, realizando estrías más separadas en cada
cuadrante para poder obtener colonias aisladas.
Incubación
Incubar en microaerofilia (5-6% de Oxígeno, 10% CO2 y 84-85%
Nitrogeno) por 48 horas a 42°C.
Identificación de la morfología de colonias
Las colonias de Campylobacter spp. son colonias pequeñas,
redondas, planas, mucoides, plateadas y con brillo metálico
(Forbes et al., 2009).
Confirmación de Campylobacter spp.
Tinción Gram modificada
La tinción modificada de Campylobacter spp. utiliza solo la
safranina como colorante.
39
Procedimiento para la tinción
a) Tomar una colonia del microorganismo y homogenizar
con agua destilada estéril en una placa porta objetos.
b) Secar al ambiente y fijar a la llama del mechero.
c) Colocar safranina durante 1 minuto, lavar y dejar secar
al ambiente.
Interpretación:
Campylobacter spp.: Bacilos curvos, pequeños, en forma
de bastón o en “alas de gaviota” (Forbes et al., 2009).
Otras bacterias Gram negativas: Bacilos largos, cocos,
cocobacilos u otras formas.
Repique de Campylobacter spp.
Como el primer cultivo puede ser un cultivo mixto se realiza un
repique de seis colonias que presenten la características de
Campylobacter spp., sembrar en dos agares MCCDA incubar en
microaerofilia, a 42°C durante 48 horas.
Pasada las 48 horas revisar la morfología de las colonias y realizar
otra tinción Gram modificada, si los repiques son cultivos puros se
guarda como respaldo cuatro de estos repiques, tres en sangre
desfibrinada de cordero o equino y uno en caldo brucella con 15%
glicerol a -80°C.
Procedimiento de crioconservación de Campylobacter spp.
Sangre desfibrinada
Procedimiento
Tomar una asada del repique positivo y colocar en crioviales o tubo
ependorf® con 1 ml de sangre desfibrinada, repetir el mismo
procedimiento con los dos repiques positivos restantes. Y
almacenar a -80°C.
40
Caldo brucella con glicerol
Procedimiento
Tomar una asada de uno de los repiques positivos y colocar en 1
ml de caldo brucella con 15% de glicerol sin disgregar la asada.
Almacenar a - 80°C.
Técnica de tipificación molecular de C. jejuni y C. coli
Preparación de ADN
Con una asa de 1 µl se recoge material del primer repique de
cada muestra y se coloca en un tubo Ependorf ® con 300 µl de
agua destilada estéril, se mezcla y se coloca en baño María a
90°C por 20 minutos.
PCR múltiple
Composición
Los primers utilizados son: C. coli 1 (5´-AG GCA AGG GAG
CCT TTA ATC-3´), C. coli 2 (5´-TAT CCC TAT CTA CAA ATT
CGC-3´), C. jejuni 3 (5´-CA TCT TCC CTA GTC AAG CCT-3´) y
C. jejuni 4 (5´-AAG ATA TGG CTC TAG CAA GAC-3´). Los
primers de C. coli anidan en el gen homólogo de la glicerol-3-
fosfato deshidrogenasa y los primer de C. jejuni anidan en una
secuencia teórica que codifica a la proteína putativa
periplasmatica.
Se utilizó el Kit Go Taq G2® Flexi DNA Polymerase de
Promega, este Kit contiene dNTP Mix, MgCl2 y 5X Green
GoTaq®. También se utilizó para la PCR la Nucleasa-free
Water® y el dNTP Mix® de 10nM, marca Promega, que no están
incluidos en el Kit.
Las cantidades necesarias para una reacción están descritas
en el Cuadro 5.
41
Cuadro 5. Cálculo del mater mix para una reacción
Reactivo
Concentración inicial
Concentración final
Volumen para una reacción
Cantidad Unidad Cantidad Unidad Cantidad Unidad
Agua
15,2 µl
Template
1 µl
Buffer 5 X 1 X 5 µl
dNTP Mix 10 mM 0,3 mM 0,75 µl
MgCl2 25 mM 2 mM 2 µl
Col 1 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Col 2 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Jun 3 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Jun 4 100 mmol/µl 0,8 mmol/µl 0,2 µl
Taq 5 U/µl 0,05 U/µl 0,25 µl
Total 25 µl
Tomado de: Vandamme, 1997 Elaboración: La Autora
Procedimiento
PCR: Se utilizó un protocolo touchdown para esta PCR;
en el Cuadro 6 se puede observar el programa que se
utilizó en el termociclador.
42
Cuadro 6. Programa para termociclador
Programa T° Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 5min 1
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 64°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 62°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 60°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 58°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
2 Alineación de Primers 56°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min
30 Alineación de Primers 54°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Elongación final 72°C 10min 1 Tomado de: Vandamme, 1997
Elaboración: La Autora
Electroforesis
Componentes
Ultra PureTM Agarose, INVITROGENTM
TBE 5 x, CHEM CruzTM
SYBR®Safe, DNA gel Stain, INVITROGENTM
Marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder
INVITROGENTM
Muestras a analizar.
Controles positivos de C. jejuni y C. coli
Control negativo
43
Procedimiento
Preparar el gel de agarosa al 2% utilizando como
disolvente TBE 0,5X.
En los pocillos del gel colocar el marcador de peso
molecular, los controles positivos, control negativo, y las
muestras a analizar.
Para la corrida electroforética, programar la fuente de
poder a 30 minutos y a 100 voltios.
Observar el gel mediante la utilización de luz ultravioleta
y una cámara digital. La determinación se da por la
observación de bandas específicas, si es C. coli (364 pb)
y C. jejuni (773 pb).
Técnicas de Procesamiento y análisis de datos
La información proveniente de las plantas de faenamiento relacionada con
las características, ubicación y estado sanitario de las aves de cada una de
las granjas que se muestrearon se almacenó en una base de datos al igual
que los resultados obtenidos, los cuáles se representaron en una tabla
bidimensional, donde cada columna tiene un nombre único y en cada fila se
introdujo la información de cada muestra recolectada dependiendo de lo que
se solicitó en cada columna. Dicha tabla se registró en Microsoft Excel ®.
Análisis de datos
Los resultados obtenidos se analizaron porcentualmente en base al total de
muestras procesadas hasta el final del periodo establecido de muestreo y los
aislamientos positivos. Además de un análisis porcentual de los resultados
obtenidos de tipificación molecular. Estos aislamientos también se analizaron
conjuntamente con la información proporcionada por la plantas de
faenamiento, para establecer características asociadas a la positividad. Para
el análisis de los datos se utilizó Microsoft Excel®.
44
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Presentación de Resultados
El aislamiento de Campylobacter spp. se realizó en el medio MCCDA, y se
confirmó mediante tinción Gram modificada. En el óráfico 4, se puede
observar un repique positivo a Campylobacter spp. con colonias de color
plateado metálico, y la tinción Gram modificada, en la que se observa bacilos
curvos, en forma de gaviota, característico de esta bacteria.
Gráfico 4. Repique positivo a Campylobacter spp. sembrado en MCCDA y tinción Gram modificada de Campylobacter spp. Obsérvese los bacilos en forma de alas de gaviota, característicos de Campylobacter spp.
Fuente: La Autora
45
Durante los seis meses de muestreo, se obtuvo 189 muestras de seis plantas
de faenamiento. Del total de muestras procesadas durante esta investigación
se eliminaron 8 muestras por problemas técnicos en el laboratorio en
incubación inicial. De las 181 muestras analizadas 130 (71,8%) fueron
positivas a Campylobacter spp. Los resultados de aislamiento por siembra
directa se pueden observar en la Cuadro 7.
Cuadro 7. Resultados de aislamiento de Campylobacter spp. del contenido cecal de pollos faenados en seis plantas de faenamiento
* # (Número de muestras positivas), % (Porcentaje de muestras positivas)
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
El número de muestras procesadas por cada planta de faenamiento no fue
homogéneo, debido a las características y tamaño de cada empresa, razón
por la cual al final del muestreo, algunas plantas de faenamiento
proporcionaron mayor número de muestras que otras, como se puede
observar en el Cuadro 7.
PLANTAS DE FAENAMIENTO
RESULTADOS
Número de muestras
procesadas
Positivo
#* %*
1CT 93 66 70,97
2CT 39 28 71,79
3CT 16 14 87,50
4CT 12 6 50
5CT 15 13 86,67
6CT 6 3 50
46
Para poder identificar la especie de las muestras positivas se utilizó una PCR
múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identificó las bandas específicas de C. coli
(364 pb) y C. jejuni (773 pb), como se muestra en el Gráfico 5.
Gráfico 5. PCR múltiple para C. coli y C. jejuni. Se identifica C. coli por presentar bandas específicas de 364pb y C. jejuni con 773 pb. Se puede observar que en algunas muestras se identificó ambas especies de Campylobacter.
Fuente: La Autora
Al realizar la PCR múltiple a las 130 muestras positivas al cultivo
bacteriológico, se obtuvo los siguientes resultados: C. coli 88 (67,69%), C.
jejuni 23 (17,69%), aislamiento mixto de C. coli y C. jejuni 18 (13,85%) y
negativo el restante 1 (0,77%). En el Gráfico 6 se puede observar los
resultados obtenidos.
Gráfico 6. Identificación de especies de Campylobacter mediante la PCR múltiple.
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
67,69%
17,69% 13,85%
0,77% 0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
Resultados de PCR múltiple
Po
rce
nta
je
C. coli
C. jejuni
C. coli y C. jejuni
Negativo
47
Los resultados de tipificación molecular obtenidos por cada empresa se
puede observar en el Cuadro 8.
Cuadro 8. Especies de Campylobacter encontradas en las empresas muestreadas.
PLANTAS DE FAENAMIENTO
C. coli C. jejuni C. coli y C.
jejuni Negativo**
#* %* #* %* #* %* #* %*
1CT 50 75,76 9 13,64 7 10,60
2CT 14 50 8 28,57 5 17,86 1 3,57
3CT 9 64,29 4 28,57 1 7,14
4CT 5 83,33 0 0 1 16,67
5CT 7 53,85 2 15,38 4 30,77
6CT 3 100 0 0 0 0
* #= número de muestras identificadas, %= Porcentaje de muestras identificadas.
** Muestras que no se tipificaron mediante la PCR múltiple.
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
Los aislamientos en los cuales se identificó dos bandas después de la
electroforesis y la banda de 773 pb no era clara, fueron sometidos a una
PCR con un set de primers para C. jejuni, como método de confirmación de
resultados.
Los antibióticos utilizados en las parvadas de aves que fueron positivas a
Campylobaccter spp., fueron agrupados según grupos farmacológicos como
se describe en el Cuadro 9. Aquí se puede observar que los grupos
farmacológicos más utilizados fueron: quinolonas, nitrofuranos y fenicoles.
48
Cuadro 9. Grupos farmacológicos usados en granja previo al faenamiento en las aislamientos positivos a Campylobacter spp.
Grupos farmacológicos
Resultados Generales
#* %*
Aminoglucósidos 4 3,1
Betalactámicos 6 4,3
Estreptograminas 5 3,8
Fenicoles 35 26,9
Macrólidos 30 23,1
Nitrofuranos 61 46,9
Pleuromutilinas 10 7,7
Tetraciclinas 5 3,8
Quinolonas 82 63,1
Sulfonamidas 2 1,5
* #= número de parvadas positivas que usaron antibiótico, %= Porcentaje de parvadas
positivas que utilizaron antibiótico.
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: La Autora
Discusión de Resultados
El aislamiento en MCCDA por cultivo directo, ha demostrado ser un método
eficaz para el aislamiento de C. jejuni y C. coli. Un estudio para la detección
de C. jejuni y C. coli en contenido cecal de broilers usando algunos métodos
de cultivo, demostró que el aislamiento por cultivo directo en MCCDA y en
agar Karmali detectan entre 102 y 103 UFC g-1, indicando que estos métodos
son apropiados para monitorear Campylobacter spp. en heces de pollos
(Rodgers, Clifton, Marin, & Vidal, 2010). Al utilizar un modelo Bayesiano para
determinar la sensibilidad de los métodos de cultivo para Campylobacter spp.
en carne de pollo, se determinó que la sensibilidad del aislamiento bacteriano
49
utilizando pre enriquecimiento fue de 41% mientras que la siembra directa
fue de 69% (Habib, Sampers, Uyttendaele, De Zutter, & Berkvens, 2008). En
otro modelo Bayesiano se estimó que la sensibilidad del cultivo directo de
muestras cecales de pollo en MCCDA está entre 64% y 66% (Woldemariam,
Bouma, Vemooij, & Stegeman, 2008).
Una investigación en la cual se utilizó PCR múltiple para la identificación de
C. coli y C. jejuni de cultivos puros y directamente a partir de muestras de
heces en seres humanos demostró que la sensibilidad de la PCR múltiple en
muestras de heces en humanos fue de 105 células por ml de heces; mientras
que cuando las mismas muestras fueron cultivadas en MCCDA previo a la
PCR la sensibilidad fue de 100 células por ml de heces, determinando que el
cultivo en MCCDA previo a la PCR es superior en comparación con la
purificación directa de ADN al menos al analizar muestras frescas de heces
en seres humanos (Persson & Olsen, 2005).
Como resultado a estos estudios se puede concluir que el uso de MCCDA
para aislamiento de Campylobacter spp., previo a la PCR múltiple, puede
mejorar la sensibilidad de la PCR múltiple.
La PCR múltiple utilizada en el presente estudio, fue evaluada en una
investigación con cepas ATCC, en la cual se determinó que la sensibilidad y
especificidad para la identificación de C. jejuni es de 93% y 100%
respectivamente, mientras que para C. coli estos valores son 100% (On &
Jordan, 2003). Estos resultados soportan el uso de esta PCR como método
eficaz para la tipificación de C. coli y C. jejuni.
El aislamiento de Campylobacter spp. que se obtuvo en el presente estudio
(71,8%), concuerda con resultados obtenidos en otros investigaciones. Así,
se ha reportado que la prevalencia media de Campylobacter spp. en la unión
Europea es 71,2% (EFSA, 2010), mientras que en Reino Unido es 75,8%
(Powell et al., 2012). En Argentina, en un estudio se aisló 62,1% de
Campylobacter spp. a partir de contenido cecal de pollos faenados en tres
50
plantas de faenamiento (Velilla, Terzolo, & Méndez, 2011). En la provincia de
Shandong, China, la prevalencia de Campylobacter spp, en contenido cecal
fue 35,9% (Chen et al., 2010). Mientras que en Estados Unidos, en un
estudio se determinó la prevalencia en varias parvadas de pollos boiler de
muestras fecales en 51,4% (Berghaus et al., 2013). Esta información
obtenida en varios países sustenta los resultados obtenidos, al existir una
alta prevalencia de Campylobacter spp. a nivel mundial.
En la mayoría de estudios realizados en pollos, la frecuencia de aislamiento
de C. jejuni es mayor que la de C. coli. En un estudio en Andalucía en
muestras cloacales de pollos en granja, la prevalencia de C. jejuni fue
31,71% y C. coli 6,0% (Torralbo, 2013). Estos resultados concuerdan con
resultados de otros autores en los que se ha encontrado 39,5% C. jejuni y
17,7% C. coli en lotes de broiler (Sasaki et al., 2010). En Europa se estimó
que la presencia de C. jejuni fue 40,6% y C. coli 31,9% en pollos broiler
(EFSA, 2010). Todos estos estudios contrastan con los resultados obtenidos
en la presente investigación, sin embargo, en España se detectó mayor
prevalencia de C. coli (61,4%) que C. jejuni (38,3%) (EFSA, 2010), la
variación de este estudio con otros estudios en países de la unión Europea
se puede asociar a los diferentes métodos de muestreo y detección de
Campylobacter spp. En un estudio realizado en muestras de ciegos de pollos
en Argentina, se identificó el 62,2% de positividad a C. coli y 37,8% a C.
jejuni (Velilla et al., 2011). Estos últimos resultados son similares a los
obtenidos en el presente estudio en el que se identificó el 67,69% de C. coli,
38,3% de C. jejuni y aislamientos mixtos de C. coli y C. jejuni 13,85%.
En una investigación realizada en Thailandia se atribuyó mayor incidencia de
C. coli a la contaminación de carne pollo con carne de cerdo en negocios
minoristas (Suzuki & Yamamoto, 2009). Sin embargo, este factor no se
puede atribuir a las muestras tomadas en este estudio, pues las plantas de
faenamiento en las cuales se tomaron las muestras procesaban
exclusivamente pollos broiler.
51
Fernández (2011) indica que C. coli ha sido aislado con mayor frecuencia en
países Sudaméricanos tanto de seres humanos como de animales,
representando el 25% de casos de diarrea en seres humanos producida por
especies de Campylobacter. Esta información concuerdan con el alto
porcentaje de aislamientos de C. coli obtenido en el presente estudio.
Las diferencias reportadas por varios autores en las proporciones de los
aislamientos de C. coli y C. jejuni en diferentes zonas geográficas se podría
atribuir a variaciones climáticas, zootécnicas, genéticas bacterianas, etc. Sin
embargo, al no existir explicaciones claras sobre estas variaciones, se
necesitan estudios epidemiológicos complementarios para determinar los
factores a los que se les puede atribuir estas diferencias.
En la presente investigación los aislamientos mixtos de C. jejuni y C. coli
representaron el 13,85% de las muestras, lo que concuerda con el rango
descrito en otros estudios en los que se reporta infecciones mixtas entre el
11,7 al 19,1% de las muestras estudiadas (Torralbo, 2013; Al Amri, Senok,
Yusuf, Al-Mahmeed, & Botta, 2007).
Una de las muestras aisladas como Campylobacter spp, no pudo ser
identificada por la PCR múltiple. Otros autores han reportado muestras de
Campylobacter spp. que no pudieron ser identificadas como C. jejuni o C. coli
(Sasaki et al., 2010). Esto se puede dar porque existen otras especies de
Campylobacter termófilas como C. lari, cuya frecuencia de aislamiento en
aves es rara. Por ejemplo en Italia se determinó la prevalencia de C. lari en
1,1% de las muestras aisladas de contenido cecal (Di Giannatale et al.,
2010).
Según la FAO el riesgo de Campylobacter spp. en pollos broiller, está
altamente asociada a la edad de faenamiento (FAO & WHO, 2009). En
diversos estudios se menciona que el pico máximo de colonización en aves
está entre 42-45 días de vida, debido al estrés que provoca, el retiro de
alimento previo al faenameinto, encierro en jaulas y transporte a la planta de
52
faenameinto (Velilla et al., 2011). Este dato concuerdan con La edad
promedio de faenamiento de las parvadas positivas (44,67 días; S: 3,50)
muestreadas en el presente estudio.
En todas las parvadas positivas al aislamiento de Campylobacter spp. se
utilizó algunos antibióticos, de los cuales los de mayor uso fueron: quinolonas
en el 63,1% de muestras positivas, nitrofuranos en el 46,9% y fenicoles en
26,9%. En varios estudios en países sudamericanos se ha demostrado la
existencia de cepas de origen humano y animal resistentes a eritromicina,
tetraciclina, ampicilina y quinolonas, siendo la resistencia a quinolonas
común en la mayoría de cepas de Campylobacter spp. Así, en Perú se
identificó entre 63-78% de cepas resistentes a quinolonas, en Argentina entre
49,1-59,6%, en Bolivia 47%, en Brasil 72,2% y Chile 50% (Fernández, 2011).
Probablemente las cepas de C. coli y C. jejuni aisladas en este estudio
también presenten fenotipos resistentes a los antibióticos más utilizados,
entre ellos las fluroqinolonas, por lo que posteriores estudios sobre la
resistencia a antimicrobianos deben ser realizados para estimar el potencial
riesgo de estas bacterias en la salud de la población.
53
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
El alto porcentaje de aislamiento de Campylobacter spp. en ciegos
de pollos (71,8%) podría ser importante al representar un riesgo a
la salud humana si estas bacterias sobreviven en la carne pollo.
En el presente estudio la presencia de C. coli es mayor (67,69%) a
C. jejuni (17,69%), lo que contrasta con países industrializados
donde se ha aislado en mayor porcentaje C. jejuni.
En este estudio se identificó un 63,1% de parvadas positivas, en
las que se utilizó quinolonas en granja, lo que podría incurrir a la
propagación de cepas resistentes a estos antibióticos usados
también en medicina humana.
54
Recomendaciones
Se requiere realizar estudios complementarios sobre la presencia y
cuantificación de C. coli y C. jejuni en la industrialización de carne
de pollo para evaluar el riesgo que estas bacterias pueden
representar en la salud pública.
Investigar sobre resistencia antimicrobiana en las cepas aisladas
en estudios en granja y en carne de pollo, para obtener información
que pueda ayudar a establecer el uso adecuado de antibióticos
tanto en animales como en seres humanos.
Identificar la variabilidad genética de las cepas de C. coli y C. jejuni
encontradas a nivel de granja para poder determinar las posibles
variantes que circulan en el país y su epidemiología.
Realizar pruebas moleculares con la muestra que no pudo ser
identificada mediante la PCR múltiple, para confirmar su género y
posibles especies.
55
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0718-8
67
ANEXOS
68
ANEXO A
Registro de muestras
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Identificación de muestras
ID:……………………………………………
Fecha :
Lote:
Edad:
Nombre de la granja:
Ubicación de la granja:
Número de galpones en la granja:
Antibióticos usados al nacimiento en incubadora
(dosis):
Antibióticos usados en la recepción (dosis y
número de días):
Promotores de crecimiento usados en el
alimento (dosis):
Antibióticos usados en tratamientos 1 recepción
(dosis y número de días):
Antibióticos usados en tratamientos 2 recepción
(dosis y número de días):
Antibióticos usados en tratamientos 3 recepción
(dosis y número de días):
Enfermedades asociadas a bacterias
Observaciones:
69
ANEXO B
Descripción del Medio MCCDA OXOID® CM0739
Para poder sembrar en este medio de cultivo se debe adicionar el
suplemento selectivo CCDA SR0155. Este medio sirve para el
aislamiento de especies termófilas de Campylobacter (C. jejuni, C.
coli y C. laridis).
El medio MCCDA remplaza la sangre con carbón, conjuntamente
con el desoxicolato de Sodio y sulfato Ferroso promueve el
crecimiento de Campylobacter spp. Mientras que la cefoperazona
inhibe el crecimiento de Gram negativos entéricos y Gram
positivos, mejorando así la selectividad del medio. La Anfotericina
B inhibe la contaminación con levaduras y hongos que
probablemente ocurre a 37°C.
Formula:
MCCDA g /lt
Caldo Nutritivo N°.2 25.0
Carbón bacteriológico 4.0
Caseina hidrolizada 3.0
Desoxicolato de Sodio 1.0
Sulfato Ferroso 0.25
Piruvato de Sodio 0.25
Agar 12.0
pH 7.4 ± 0.2 @ 25°C
Suplemento Selectivo CCDA por vial por litro
Cefoperazona 16mg 32 mg
Anfotericina B 5 mg 10 mg
* Cada vial es suficiente para 500 ml de medio.
70
Procedimiento:
Suspender 22,75 g de MCCDA en 500 ml de agua destilada y
hervir hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15
minutos. Enfriar a 50°C y asépticamente añadir 1 vial de
suplemento selectivo CCDA previamente reconstituido con 2ml
de agua destilada estéril. Mezclar bien y dispensar en cajas
Petri estériles.
Conservación:
Las cajas Petri se almacenan hasta 2 semanas en fundas
pláticas, en posición invertida a 2-8°C.
71
ANEXO C
Positivo Negativo
En un tubo Ependorf con 300ul de
agua destilada estéril, adicionar una
azada de la primera cepa que se va
a almacenar.
Respaldar tres de las
cepas en tubos Ependorf
con 1 ml de sangre de
equino u ovino y una de
las cepas se almacena en
caldo brucella con 15%
glicerol.
Positivo Negativo
Almacenar en el
ultracongelador a -
80°C.
Almacenar en el
ultracongelador a -80°C.
Poner en baño María a 90°C,
durante 20 min.
Incubar a 42° C en microaerofilia durante
48 h.
Tinción Gram modificada de las seis cepas.
Procesamiento de muestras
Campylobacter spp.
Muestra 25 ciegos de pollos
Colocar los ciegos en alcohol por 5 min
Secar los ciegos en una superficie y cortarlos en su
parte distal.
Pesar 25 g de heces de los ciegos, un gramo por
cada ciego.
Homogenizar la muestra.
Sembrar una azada de la muestra en agar MCCDA
Incubar a 42° C, en microaerofilia durante 48 h.
Tinción Gram modificada de colonias sospechosas (pequeñas de
color plateado).
Esterilizar y desechar
las cajas.
Repique de seis colonias positivas
en dos cajas de MCCDA.
Realizar PCR
múltiple
