Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias
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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Profesor Patrocinante Dra. Gudrun Kausel Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias EFECTO DE ESTIMULOS ESTROGENICOS EN LA EXPRESION DE FACTORES HIPOFISIARIO EN Cyprinus carpio Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y al Título Profesional de Bioquímico Horst Walter Grothusen Miller Valdivia – Chile 2008
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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias
Profesor Patrocinante Dra. Gudrun Kausel
Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias
EFECTO DE ESTIMULOS ESTROGENICOS EN LA EXPRESION DE FACTORES HIPOFISIARIO EN Cyprinus carpio
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y al Título Profesional de Bioquímico
Horst Walter Grothusen Miller Valdivia – Chile
2008
ii
Agradecimientos
Agradezco sinceramente a Gudy, por haberme dado la oportunidad de tenerla
como profesora patrocinante. Quien más que una profesora fue siempre una amiga
incondicional, ya que con su perseverancia y entrega me alentó siempre a seguir
adelante y así poder concretar finalmente esta etapa tan importante.
A mis profesores patrocinantes Jaime y Alejandro, gracias por ayudarme en
este proceso y la paciencia que han tenido en este largo camino.
Agradezco también a mi familia y en especial a mis padres por haberme
entregado su esfuerzo, apoyo y comprensión mediante el cual permitieron mi
desarrollo como persona alentándome a avanzar e ir cerrando ciclos.
En especial quiero agradecer a Karina, mi esposa por su incondicional apoyo,
cariño y amor entregado, pilar fundamental en todos los logros de mi vida.
Agradezco también al proyecto ACGI/CGRI-DRI 3.4/10/01068, mediante el
cual fue posible realizar éste trabajo. También es importante mencionar la ayuda y
apoyo entregado por la Universidad de Liege, departamento de Biología Molecular e
ingienería Genética, en especial a Marc Muller, por haberme guiado y a la vez
permitir realizar parte de mi investigación en sus dependencias.
Sinceramente gracias a todas las personas que de algún modo me entregaron
su apoyo y ayuda con la cual me incentivaron a seguir y terminar este proceso, el
cual sin duda me engrandece como persona y profesional.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
1 RESUMEN III SUMMARY 2 2 INTRODUCCION 3 3 MATERIALES Y METODOS 14
3.1 MATERIALES 14 3.1.1 Animales de experimentación 14 3.1.2 Líneas celulares 14
3.2 REACTIVOS 16 3.2.1 Oligonucleótidos 16 3.2.2 Equipos 17 3.2.3 Análisis de Secuencias e Imágenes 18
3.3 METODOS 20 3.3.1 Estimulación de carpas aclimatizadas con 17-β-estradiol 20 3.3.2 Preparación de RNA total 20 3.3.3 Cuantificación de RNA por espectrofotometría 21 3.3.4 Preparación del cDNA 21 3.3.5 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR) 22 3.3.6 Caracterización de DNA por digestión enzimática 22 3.3.7 Caracterización de ácidos nucleicos en gel de agarosa 23 3.3.8 Análisis por hibridación in situ 24 3.3.9 Extracción orgánica de muestras de agua 27 3.3.10 Ensayo celular para la detección de efectos hormonales 28 4 RESULTADOS 31
4.1 ANÁLISIS DE LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS DOS GENES GH DE CARPAS ACLIMATIZADAS 31
4.1.1 Diseño del análisis por RT-PCR de los dos genes GH de carpa 31 4.1.2 Expresión de los dos genes GH en carpas aclimatizadas 36 4.1.3 Efecto estrogénico a la transcripción de los dos genes GH en carpas aclimatizadas 39
4.2 ANÁLISIS DE LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS DOS GENES PIT1 DE CARPAS ACLIMATIZADAS 39
4.2.1 Diseño del análisis por RT-PCR de los dos genes Pit1 de carpa 39 4.2.2 Expresión de los dos genes Pit1 en carpas aclimatizadas 41
4.3 DETECCIÓN DE EFECTOS HORMONALES EN AGUA DEL HÁBITAT DE CARPAS ACLIMATIZADAS POR ENSAYO CELULAR 46
4.3.1 Efecto estrogénico en línea celular reportero MMV-Luc 50 4.3.2 Efecto androgénico en línea celular reportero TARM-Luc 54 5 DISCUSION 58 6 BIBLIOGRAFÍA 68
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema de la acción del estrógeno ........................................................... 6 Figura 2: Estrógenos naturales y químicos, que imitan a estrógeno. .......................... 9 Figura 3: Alineamiento de secuencias GH de Cyprinus carpio. ................................. 33 Figura 4: Estandardización del análisis RT-PCR para los genes GH de carpa ........ 35 Figura 5: Cuantificación de transcritos GH por RT-PCR en pituitarias de carpas aclimatizadas ............................................................................................................. 37 Figura 6: Cuantificación de la razón de los transcritos de los dos genes GH por RT-PCR en pituitarias de carpas aclimatizadas .............................................................. 38 Figura 7: Alineamiento de secuencias génicas Pit1 de C. carpio. ............................ 40 Figura 8: Análisis del efecto E2 a la transcripción del gen GH en pituitaria de carpas aclimatizadas a invierno por RT-PCR ....................................................................... 42 Figura 9: Estandardización del análisis RT-PCR para los genes Pit1 de carpa ....... 43 Figura 10: Comparación de los niveles de expresión de los genes Pit1 en carpas aclimatizadas a invierno por hibridación in situ ......................................................... 45 Figura 11: Esquema de la generación de las líneas celulares indicadores de efectos estrogénicos y androgénicos. .................................................................................... 47 Figura 12: Esquema de extracción orgánica de muestras de agua. .......................... 48 Figura 13: Esquema del ensayo celular para la detección de efectos hormonales. . 49 Figura 14: Curva de calibración del efecto estrogénico a la expresión de la luciferasa en MMV-Luc .............................................................................................................. 51 Figura 15: Efecto de extracto orgánico de H2O destilada y de 17-β-estradiol a la expresión de la luciferasa en MMV-Luc .................................................................... 52 Figura 16: Efecto de extracto orgánico de aguas ambientales a la expresión de la luciferasa en MMV-Luc .............................................................................................. 53 Figura 17: Curva de calibración del efecto androgénico a la expresión de la luciferasa en TARM-Luc ............................................................................................ 55 Figura 18: Efecto de extracto orgánico de H2O destilada y de olución estándar DHT a la expresión de luciferasa en TARM-Luc ........................................ 56 Figura 19: Efecto de extracto orgánico de aguas ambientales a la expresión de la luciferasa en TARM-Luc ............................................................................................ 57
1
1 RESUMEN
En la vida humana cotidiana se utilizan muchos compuestos químicos con un
potencial impacto al sistema neuroendocrino, el cual regula procesos vitales como
desarrollo, crecimiento, metabolismo y reproducción.
En el presente trabajo se ha analizado el efecto de 17-β-estradiol, utilizando
como modelo a carpas (Cyprinus carpio) aclimatizadas. Se desarrolló un sistema de
detección de expresión gen-copia específico de GH y Pit1, genes duplicados y
activos diferencialmente en carpas, con la finalidad de probar genes del eje
hipotálamo-hipofisiario como nuevos biomarcadores de respuesta temprana a
efectos nocivos inducidos por disruptores endocrinos como el estrógeno. Los
resultados en la expresión de GH sugieren que éste debería considerarse en la
evaluación de efectos de xenobióticos, sin embargo no sería un indicador robusto
para efectos estrogénicos.
Además se elaboró un protocolo de preparación de muestras de aguas
ambientales apto para utilizar ensayos con líneas celulares reporteras altamente
sensibles a efectos estrogénicos o androgénicos. La estandarización de la
preparación de los extractos del agua corroborará futuros ensayos de monitoreo con
peces expuestos a aguas ambientales.
El desarrollo de biomarcadores más sensibles es muy importante para que
puedan ser usados como señales de alerta temprana indicando la exposición a
compuestos estrogénicos y con ello un potencial riesgo de efectos adversos a la
población de organismos acuáticos en la cadena alimenticia y finalmente a todos los
que utilizan el agua.
2
SUMMARY
Potential impact arises from many chemical compounds used in daily life on
the neuroendocrine system, which regulates vital processes such as development,
growth, metabolism and reproduction.
In the present study the effect of 17-β-estrogen was analyzed in a model fish,
acclimatized Cyprinus carpio. A system for detection of gen-copy specific expression
was developed for growth hormone (GH) and Pit1, both duplicated genes
differentially transcribed in carp, with the aim to develop genes of the hypothalamo-
hypophyseal axis as new biomarkers with early response to harmful effects of
endocrine disrupters such as estrogen. The results of expression change observed in
this study and from literature for GH suggest that it should be considered in the
evaluation of xenobiotic effects but that it might not be a robust indicator for
estrogenic effects.
Furthermore a protocol for preparation of samples from ambient water was
developed, enabling application to a bioassay based on reporter cell lines highly
sensitive to estrogenic and androgenic effects. The standardization of the extraction
protocol will corroborate future assays monitoring fish exposed to ambient water.
The development of more sensitive biomarkers is very important and could
serve as signals for early alert about exposition to estrogenic compounds and with
that a potential risk of adverse effects on the population of aquatic organisms in the
alimentary chain and finally in everybody using water.
3
2 INTRODUCCION
Los factores del sistema hipotálamo-hipofisiario regulan de forma centralizada
la salud y el crecimiento de peces. Además, modelos animales son muy valiosos
para evaluar efectos toxicológicos en humanos y para entender mejor las
interacciones de genes con el medio ambiente (Mommsen y Moon, 2005). En la vida
humana cotidiana se utilizan muchos compuestos químicos con un potencial impacto
al sistema neuroendocrino, que regula procesos vitales como desarrollo, crecimiento,
metabolismo y reproducción (Guillette y Crain, 1999).
Tales procesos son regulados por moléculas denominadas hormonas; éstas
son secretadas al torrente sanguíneo y se unen a sus receptores en las células de
órganos blancos, desencadenando una serie de procesos celulares en respuesta al
estímulo y así adapta el organismo a las nuevas condiciones. El sistema endocrino
está organizado de forma jerárquica, hormonas se sintetizan en el sistema
hipotálamo-hipofisiario, los cuales regulan la síntesis y liberación de hormonas en
glándulas periféricas que producen otras hormonas para causar los efectos en las
respectivas células blancos (Bolander, 2004).
Las hormonas esteroidales ejercen profundos efectos en el crecimiento,
desarrollo, diferenciación y homeostasis. Los efectos están mediados por receptores
esteroidales específicos intracelulares los cuales actúan mediante múltiples
mecanismos (Zhao et al., 2008). El ejemplo paradigmático es el 17-β-estradiol (E2)
que se une a su receptor, el receptor de estrógeno (ER, estrogen receptor). El
receptor de estrógeno activado por su ligando, dimeriza y transloca al núcleo, donde
reconoce elementos de respuesta hormona específica (ERE, estrogen response
element) en o cerca de la región promotora del DNA del gen blanco (Fig.1,
4
Mommsen y Moon, 2005). Los receptores de estrógeno pertenecen a la familia de
receptores nucleares y se distinguen por dos regiones transactivadoras (TA-1 y TA-
2), la región de unión al DNA (DBD, DNA binding domain con dos dedos de zinc) y la
región de unión del ligando (LBD, ligand binding domain) (Marino et al., 2006).
También E2 actúa por un mecanismo indirecto uniéndose a otros factores de
transcripción que se unen a su elemento de reconocimiento en el DNA. En este caso
ER modula la actividad del factor de transcripción, ej. la proteína activador AP-1,
factor nuclear κB (NF-κB) y proteína estimulante -1 (SP-1) (Marino et al., 2006; Duan
et al., 2008). Así puede afectar genes que no tienen el elemento ERE en el
promotor. Además se observaron efectos rápidos en menos de 15 segundos, por lo
tanto se llaman efectos no-genómicos (Marino et al., 2006). La regulación de la
expresión génica a través de E2 es un proceso multifactorial, que incluye acciones
genómicas y no-genómicas, las cuales convergen en elementos de respuesta
localizados en los promotores de genes blancos y son específicos para distintos
tipos celulares y dependen del contexto del medio ambiente especifico de cada
célula (Marino et al., 2006).
El 17-β-estrógeno (E2) es una hormona del ovario que funcionalmente esta
implicada en el desarrollo embrionario temprano y en el establecimiento y
mantenimiento del sistema reproductor femenino (Bolander, 2004). En la hipófisis
estimula la síntesis de PRL que, a su vez, entre su múltiples funciones, en
mamíferos induce la producción de leche y en peces es fundamental para la
osmorregulación y adaptación al agua dulce (Freeman et al., 2000; Bentley, 2002).
En organismos que ponen huevos, E2 está asociado al desarrollo de los ovarios y
sobre todo a la síntesis de vitelogenina (Vg), la proteína precursora del vitelo que
nutre al embrión (Hiramatsu et al., 2005). E2 estimula el hígado para que sintetice
5
Vg, que se libera a la sangre y se incorpora en los oocitos, constituyendo el
precursor más abundante de la yema del huevo (Fig.1). Por lo tanto vitelogenina se
produce mayoritariamente en hembras y no en machos (Sumpter et al., 1995). Sin
embargo, en peces la diferenciación sexual no está ligada a cromosomas sexuales y
puede ser influenciada por estímulos ambientales, como cambios de temperatura,
que causan un aumento de la expresión de vitelogenina y crecimiento de gónadas
(Gilbert, 2003). Además, Munkittrick et al. (1998) descubrieron que carpas macho al
ser expuestos a estímulos estrogénicos empezaron a sintetizar Vg y desarrollar
gónadas aumentando significativamente el índice gonadal, el cuociente del tamaño
de las gónadas en relación al tamaño total del pez. Se han visto interrupciones del
sistema sexual en poblaciones salvajes de peces en ríos bajo efluentes de industrias
respecto a poblaciones que habitaron rió arriba de éstas (Jobling et al., 1998). La
inmunodetección de vitelogenina en machos, la forma soluble en sangre por ELISA o
por inmunocitoquímica en cortes de hígado, permite estimar más cuantitativamente
el grado de exposición a estímulos estrogénicos (Thomas-Jones et al., 2003).
6
Figura 1: Esquema de la acción del estrógeno. Factores de la pituitaria estimulan
a las gónadas para la producción de estrógeno, el que es liberado a la sangre y
estimula en el hígado la formación de vitelogenina, liberación hacia el torrente
sanguíneo e incorporación al oocito como principal precursor en la formación de la
yema (vitelo) del huevo. (Extraído de Mommsen y Moon, 2005).
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Globalmente hay una enorme preocupación sobre los impactos de químicos
disruptores endocrinos presentes en el ambiente acuático que puedan alterar
funciones fisiológicas en la fauna y en humanos (Filby et al., 2007). Generalmente
se refiere al impacto negativo de un estrógeno ambiental, que actúe como disruptor
del sistema endocrino endógeno. El lado positivo, la relación de fitoestrógenos en la
dieta y su efecto en la reducción del riesgo de adquirir cáncer de mama, presenta
evidencias epidemiológicas todavía no concluyentes (Mense et al., 2008).
Especialmente preocupante son los efectos de muy baja concentración de un
disruptor endocrino a largo plazo. En un estudio por un período de 7 años se
expusieron peces (Fathead minnow, Pimephales promelas) en un lago experimental
en Canadá a bajas concentraciones (5 - 6 ng/L) de estrógeno sintético 17-α-
etinilestradiol (EE2, agente de la píldora del control de natalidad) que llevó al colapso
de la población de los peces (Kidd et al., 2007).
Cambios del medio ambiente pueden ser provocados por variación de
condiciones físicas, ej. fotoperíodo o temperatura, químicos, bióticos o xenobióticos
(Sumpter, 1998). Inicialmente el término xenobiótico, etimológicamente “extraño de
la vida”, estaba limitado a compuestos químicos sintetizados por el hombre,
detectados con posterioridad en los sistemas naturales y en un más amplio sentido
se refiere a cambios ambientales causados por actividades del hombre (Mommsen y
Moon, 2005). En el último tiempo uno de los factores extensamente estudiado en el
contexto de efectos xenobióticos al sistema endocrino es el estrógeno (Mommsen y
Moon, 2005). El más potente y común estrógeno natural es el 17-β-estradiol (E2)
(Mommsen y Moon, 2005). Además de los estrógenos de origen natural, como son
las hormonas endógenas de animales y los fitoestrógenos de plantas, existen los de
origen artificial, más bien creados mediante reacciones químicas en procesos
8
industriales, o formados durante la degradación de otros compuestos o moléculas de
origen francamente sintético (Fig.2). De una serie de desechos industriales,
municipales y agrícolas se ha mostrado un efecto estrogénico en peces (Munkittrick
et al., 1998; Mommsen y Moon, 2005). Ejemplos incluyen productos de la
biodegradación de alquilfenoles polietoxilados, bifenilos policlorinados (PCBs),
pesticidas como el diclorodifeniltricloroetano (DDT), chlordecone y metoxicloro, como
también los estrógenos sintéticos etinilestradiol (EE2) y dietilstilbestrol (DES)
(Sumpter et al., 1998).
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Figura 2: Estrógenos naturales y químicos, que imitan a estrógeno.
Compuestos naturales (coumestrol) y químicos sintéticos (etinilestradiol EE2,
dietilstilbestrol DES, 4-nonilfenol 4-NP, o,p`-DDT y kepone) actúan como disruptores
endocrinos por imitación o bloqueo de las acciones normales de estrógeno en vías
dependientes o independientes de receptores de estrógeno. (Extraído de Mommsen
y Moon, 2005).
10
Los químicos que imitan o antagonizan las acciones de hormonas naturalmente
presentes se llaman disruptores endocrinos (endocrine disrupters EDs) o disruptores
endocrinos químicos (endocrine disrupting chemicals, EDCs) (Guilette y Crain, 1999;
Mommsen y Moon, 2005). Por definición, estos disruptores son agentes exógenos
que interfieren con la síntesis, almacenamiento o liberación, transporte,
metabolismo, acciones de unión o eliminación de hormonas. Éstos incluyen
estrógenos del medio ambiente, sustancias que desencadenan una respuesta
estrogénica por imitar la acción del 17-β-estradiol (E2) endógeno (Gillette y Crain,
1999). La evaluación de la expresión del gen vitelogenina es utilizable como
indicador de la exposición a compuestos disruptores estrogénicos en peces machos,
es decir se estima un efecto estrogénico por la variación de la expresión del
biomarcador vitelogenina (Sumpter et al., 1995).
En la última década se transformó la investigación sobre la identificación y los
efectos de estos compuestos, que interrumpen el sistema endocrino, en un área
importante de la biociencia humana y del medio ambiente. Tradicionalmente el
biomonitoreo ha sido realizado utilizando características morfológicas, índice
gonadal, crecimiento de una aleta (Ashfield et el., 1998; Sepúlveda et al., 2004),
expresión de genes relacionados con detoxificación, citocromo P450 (El-Kady et al.,
2004) o la expresión de genes relacionados con el sistema reproductivo, vitelogenina
(Sumpter et al., 1995). No obstante, existen efectos en la diferenciación gonadal a
concentraciones de estrógeno muy bajas que no son suficientes para producir una
respuesta a vitelogenina pero con potenciales efectos nocivos a largo plazo
(Mommsen y Moon, 2005). Por eso se desarrollan nuevos marcadores, como por
ejemplo las coriogeninas, precursores de la matriz del envoltorio del huevo, que al
igual que vitelogenina están bajo la influencia de E2 (Arukwe y Goksoyr, 2003). Sin
11
embargo, constituyen genes blancos relativamente al final de la cascada de eventos.
Nosotros proponemos desarrollar factores del sistema hipotálamo hipofisiario como
nuevos genes marcadores de alerta temprana que se encuentran arriba en la
cascada de la respuesta organizada del organismo a efectos ambientales.
El teleósteo Cyprinus carpio es un buen modelo para estudiar el dinamismo de
la respuesta génica de factores hipotálamo-hipofisiarios a cambios ambientales
debido a la distribución de sus células productoras de hormonas en la glándula
pituitaria, el gran tamaño de los núcleos celulares y el tamaño de la hipófisis en
carpas adultos de dos a tres años de edad (Figueroa et al., 2005). Para evaluar el
efecto a la expresión génica in vivo, el análisis cuantitativo requiere contemplar las
variaciones estacionales del nivel basal de los factores que se analizan (Higashitani
et al., 2003). El efecto de un compuesto sobre el sistema endocrino de un organismo
dependerá del estado en el cual se encuentra la composición de todos sus genes
activos en ese momento. En estudios anteriores en nuestro grupo de trabajo se ha
demostrado que la reprogramación génica en el ectotermo Cyprinus carpio que
conlleva la adaptación reversible a cambios estacionales de su medio ambiente, se
refleja a nivel de transcripción y traducción (Krauskopf et al.,1998; Sarmiento et al.,
2001; Álvarez et al., 2001; López et al., 2001). La variación de la expresión de los
factores del eje hipotálamo-hipofisiario durante la aclimatización sugiere que éstos
están involucrados en la organización de la respuesta compensatoria (Kausel et al.,
1999). Se observó una variación significativa de la expresión de prolactina (PRL,
Figueroa et al., 1994), hormona de crecimiento (GH, Figueroa et al., 2000) y del
factor de transcripción de estas hormonas tejido específicas, Pit1 (Dolle et al.,1990;
Dasen y Rosenfeld, 1999; Sekkali et al., 1999; Kausel et al.,1998,1999).
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Otro aspecto importante para la evaluación cuantitativa de la expresión génica
en carpa se refiere a la noción tetraploide de este teleósteo, un pez relativamente
moderno, que duplicó su genoma unos 13 millones de años atrás (David et al.,
2003). Genes reportados como de copia única en vertebrados como los mamíferos,
en la carpa pueden existir en dos copias y cuatro alelos (Ferris y Whitt, 1977;
Leipoldt, 1983). Claramente hay dos genes para GH en C. carpio (Chiou et al.,
1990; Figueroa et al., 2000). Según las observaciones de Zhao et al. (1996) en la
carpa existen dos cDNAs de GH que sugiere la expresión de las dos copias del gen
GH (Chiou et al., 1990). En el caso de Pit1 se encontraron dos genes Pit1, y ambos
son expresados (Salazar et al., 2003; Kausel et al., 2006). Para la evaluación
cuantitativa de un efecto en la expresión génica, sí es importante determinar la
expresión de los genes duplicados, porque podría existir un efecto diferencial en la
expresión de cada una de las copias expresadas que podría enmascarar la
respuesta a un estímulo. En el caso de la expresión de POMC, un factor
hipotalámico, se observó una respuesta diferencial de los dos genes en respuesta a
cambios de temperatura en carpas aclimatadas (Arends et al., 1998).
Por otro lado se han desarrollado ensayos para la evaluación de potenciales
efectos en el sistema endocrino con genes marcadores en cultivo celular. Basado en
líneas celulares mamarias humanas establemente transformadas que contienen el
gen reportero de luciferasa bajo el control de elementos de respuesta a hormonas
esteriodales se pueden revelar efectos estrogénicos y androgénicos (Willemsen et
al., 2004).
Por todo lo anterior se plantea la siguiente hipótesis general: contaminantes
como el 17-β-estradiol modulan la expresión de factores hipofisiarias en Cyprinus
carpio.
13
El objetivo general es la caracterización del efecto de estrógeno en la expresión
de factores hipofisiarios del pez Cyprinus carpio.
Como objetivos específicos se plantea
- Evaluar la expresión gen-copia específica de factores hipofisiarios en
respuesta al cambio ambiental circanual y finalmente,
- Evaluar el efecto estrogénico en la expresión de un gen hipofisiário.
- Además se propone elaborar un protocolo de preparación de muestras de
agua ambiental apto para utilizar ensayos con líneas celulares reporteras altamente
sensibles a efectos estrogénicos o androgénicos, que se evaluará mediante la
acción de luciferasa (Willemsen et al., 2004).
Lo anterior permitirá avanzar en la caracterización de potenciales nuevos
biomarcadores para evaluar contaminación acuática. La estandarización de la
preparación de los extractos del agua corroborará futuros ensayos de monitoreo con
peces expuestos a agua ambiental potencialmente contaminada.
14
3 MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Animales de experimentación
Se utilizaron carpas macho adultas de aproximadamente 1,5 kg (Cyprinus
carpio) que fueron capturadas en el río Calle – Calle, en los alrededores de la ciudad
de Valdivia, en los períodos de invierno y verano. Los ejemplares fueron
mantenidos por un mínimo de dos semanas en una jaula de 3 x 4 m y sumergida 2
m ubicada en la rivera del río Cau Cau, Valdivia. La temperatura del agua en invierno
fluctuó entre 8 – 10 ºC y en verano entre 18 – 20 ºC. Las carpas se anestesiaron con
BZ-20 (Veterquímica, 15-20 ml por 100 L de agua) y se sacrificaron por decapitación,
se les extrajo la pituitaria, la que se procesó inmediatamente para extracción de RNA
total, el que se mantuvo congelado a -80ºC hasta su utilización. Los restos no
utilizados y los desechos biológicos que se generaron, se destruyeron en el
incinerador ubicado en el Fundo Teja Norte de la UACh. Este procedimiento da
cumplimiento a lo establecido en el Manual de Procedimientos de Manejo de
Residuos del Proyecto Administración Ambiental Corporativa (PAAC) de la UACh y
las Normas de Bioseguridad de Conicyt.
3.1.2 Líneas celulares
Las dos líneas celulares TARM-Luc y MMV-Luc utilizadas en esta tesis fueron
desarrolladas y facilitadas por Dr. Marc Muller y Dr. Joseph Martial (Laboratoire de
Genie Genetique y Biologie Moleculaire, Universite de Liege, Bélgica).
15
3.1.2.1 Línea celular reportera para andrógenos TARM-Luc
La línea celular reportera TARM-Luc se desarrolló según describe Willemsen
et al, 2004. En breve se describe la construcción de la línea celular reportera para
andrógenos. Se construyó primero el vector pMMTV-Luc, el gen reportero para
luciferasa bajo control del promotor MMTV-LTR que es inducible por los receptores
de glucocorticoides, progestágenos y andrógenos. El pMMTV-Luc se transfectó en la
línea celular T47D (ATCC HTB-133) proveniente de tumor mamario humano, dando
origen a la línea celular TM-Luc. Para aumentar la sensibilidad de las células a
estímulos androgénicos se modificó la línea celular para además expresar el
receptor de andrógeno. Para eso se construyó pSV-ARo, un vector de expresión,
que codifica el receptor de andrógenos y se transfectó en las TM-Luc, dando origen
a la línea altamente sensible TARM-Luc (Willemsen et al., 2004).
3.1.2.2 Línea celular reportera para estrógeno MMV-Luc Para desarrollar la línea celular reportera de estímulos estrogénicos MMV-
Luc, se utilizó la línea celular MCF-7 (ATCC HTB-22) proveniente de tumor mamario
humano que fue transformada con pMAR-Vit-Luc. El pMAR-Vit-Luc contiene el gen
de luciferasa bajo control del promotor de vitelogenina de Xenopus laevis y además
una matrix attachment region (MAR) (Willemsen et al., 2004).
16
3.2 Reactivos GibcoBRL: DMEM 10X con y sin rojo fenol, Suero Fetal Bovino (FBS), Penicilina G
(100 U/ml), estreptomicina (100 ug/ml), amfotricina B, Tripsina-EDTA 0.05%, PstI,
HindIII.
Sigma: 17-β-estradiol (E2), dihidrotestosterona (DHT), luciferina, bromuro de etidio,
RNAsa, DNAsa, levamisol, Triton X-100, azul de nitrotetrazolium (NBT).
Merck: Etanol, metanol, acetato de etilo, Na2HPO4, NaH2PO4, Tris, ácido acético
glacial, ácido etilendiamino tetra acético (EDTA), gelatina.
Millipore: Filtros 0.45 µm
Invitrogen: Random Primers, Trizol Reagent.
Promega: Oligo-dT15, dNTPs 100 mM, Taq DNA polimerasa, desoxirribonucleótido
Terminal transferasa (TdT).
Winkler: Agarosa, Albúmina de suero bovino (BSA)
Whatman 3MM: Filtros de papel
Scharlau Chemie S.A.: Bálsamo de Canadá
Boehringer-Mannheim: Dig-11-dUTP, antidigoxigenina-AP fragmento fab.
Otros: Aceite vegetal
3.2.1 Oligonucleótidos
Para amplificar secuencias GH específicas se utilizaron los siguientes
oligonucleótidos:
Oli GH-ex1s (cGH8s) 5’-GTCTACCCTGAGCGAAATGGC-3’
Oli GH1s 5’-ATGGGCATCAGTGTGCTCAT-3’
Oli GH-ex5a (cGH3s) 5’-CAGGGTGCAGTTGGAATCCA-3’
17
En la reacción PCR con templado cDNA hipófisis de carpa los partidores
GHex1s y GH-ex5a amplifican un fragmento de 646 pb, el que al digerir con HindIII
da origen a dos fragmentos, de 356 pb y 290 pb; con los partidores GH1s/GH-ex5a
se amplifica un fragmento de 225 pb (Figueroa et al., 2005).
Para amplificar secuencias Pit1 específicas se utilizaron los siguientes
oligonucleótidos
Oli6s 5’-CGATGCCTCGTGTGCAGGAC-3’ (específica gen-I)
Oli7s 5’-ACAGGTGGGACCCTGAGTAG-3’ (específica gen-II)
Oli3a 5’-GCGGCGGTAAGCTGTGGGTC-3’
Oli8s 5’-GGTGAAGATCTAGAGTCATG-3’
Oli9a 5’-ATGCGGGTCTGGGAGATGC-3’
En la reacción de PCR en templado cDNA hipófisis de carpa se amplifica con
oli6s/oli3a un fragmento de 523 pb, que al digerir con PstI resulta en tres fragmentos,
de 242 pb, 144 pb, 137 pb; con oli7s/oli3a se obtiene por amplificación un producto
de 523 pb, y la digestión PstI resulta en dos fragmentos de 386 pb y 137 pb; los
oligonucleótidos oli8s/oli9a amplifican un producto de 349 bp que son fragmentos del
gen-I que a digerir con PstI resulta en dos fragmentos de 133 pb y 236 pb, y del gen-
II que no se digiere con PstI.
3.2.2 Equipos • Agitador Magnético Matheson Scientific
• Agitador Orbital IKA-VIBRAX-VXR
• Balanza KERN (440-33)
• Baño Termorregulado Arquimed YCW-03S
• Cámara Electroforesis BioJSP
18
• CCD Camera Spectroline CA 1000/F
• Espectrofotómetro Shimadzu UV-1203
• Estufa Incubación NuaireTM
• Fuente de Poder BRL, Life Technology 4000
• Lector de luminiscencia Walak Victor2 Multilabel Counter (Perkin-Elmer Life
Sciences, Turku, Finland)
• Micro Ondas Samsung
• Microcentrífuga refrigerada Boeco M-240R
• pH Metro WTW (pH 530)
• Rotavapor Büchi
• Sistema de captura de imágenes Spectroline CA 1000-F, AU 1000-F
• Termociclador MJ Research MinicyclerTM
• Transiluminador Vilbert Loumart (TFX-20 M)
• Video Archival unit Spectroline AU-1000/F
• Vortex Velp Científica
3.2.3 Análisis de Secuencias e Imágenes Para el análisis de las secuencias se utilizaron los siguentes programas de libre aceso:
Banco de Datos GenBank:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide
Comparación de secuencias BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
19
Alineamiento múltiple de secuencias Clustal W1.8
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html
Análisis de cortes de enzimas de restricción Webcutter 2.0:
http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html
Diseño de partidores Primer3:
http://www.es.embnet.org/cgi-bin/primer3_www.cgi
Análisis semicuantitativo de imágenes digitalizados Un-Scan-It: Silk Scientific, Inc.
Análisis estadístico de datos y producción de gráficos Sigmaplot, versión demo
http://www.systat.com/products/SigmaPlot/
20
3.3 METODOS
3.3.1 Estimulación de carpas aclimatizadas con 17-β-estradiol Se preparó una solución stock de 17-β-estradiol 10 mg/ml en una emulsión de
aceite vegetal - etanol en proporción de 9:1. Los peces se separaron en dos grupos,
un grupo A y otro B. Al primer grupo (A) se le administró una dosis de 0,5 mg de 17-
β-estradiol por kilogramo de peso corporal cada 24 horas de intervalo por vía
intraperitoneal (i.p.) durante un período de tres días. Al segundo grupo (B) se le
administró 0.5 ml de sólo emulsión aceite-etanol 9:1 por la misma vía. Los peces
fueron sacrificados por decapitación al cuarto día. El procedimiento se repitió con
ejemplares recolectados durante las estaciones de verano e invierno.
3.3.2 Preparación de RNA total Muestras de tejido hipofisiario (50 – 100 mg) de las carpas tratadas fueron
homogeneizadas en un Potter en 1 ml de reactivo de Trizol siguiendo el protocolo
del proveedor (Invitrogen). El homogeneizado se incubó por 5 min a temperatura
ambiente y se adicionaron 200 µl de cloroformo por ml de reactivo de Trizol utilizado
inicialmente. Se agitó vigorosamente la muestra por 15 segundos y se incubó por
3 min a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12000 xg durante
15 min a 4 ºC, se recuperó la fase superior acuosa, la que fue transferida a un nuevo
tubo de centrífuga de 1,5 ml estéril. A la fase acuosa se le agregaron 500 µl de
isopropanol frío y se incubó a -20 ºC por toda la noche. Luego se centrifugó la
muestra a 12000xg por 10 minutos a 4 ºC, el sobrenadante fue descartado y el
sedimento se lavó con 1 ml de etanol 75% frío. Las muestras se agitaron con vortex
y se centrifugaron a 7500xg por 5 min a 4 ºC, se removió cuidadosamente todo el
21
sobrenadante y se dejó secar el sedimento a temperatura ambiente por unos 10 min.
El RNA se resuspendió en un volumen de 50 µl de agua libre de RNAsa y se
almacenó a – 20 ºC.
3.3.3 Cuantificación de RNA por espectrofotometría
La concentración del RNA se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm en
un espectrofotómetro Shimadzu UV-1203 de una dilución 1:1000 de la muestra de
RNA. Se calculó la concentración con el factor de dilución y considerando que 1
unidad de absorbancia corresponde a 40 µg/ml de RNA (Sambrook et al., 1989). La
pureza del material genético se estimó mediante la razón de los valores de
absorbancia a 260 y 280 nm, ya que preparaciones puras de RNA tienen valores
cercanos a 2.0 (Sambrook et al. 1989). En caso de contaminación este valor se ve
disminuido, lo que indicaría presencia de proteínas, por el contrario, si se presenta
elevado, podría significar presencia de interferentes como fenol.
3.3.4 Preparación del cDNA El RNA total se trató con DNAsa libre de RNAsa con el fin de eliminar
fragmentos residuales de DNA que pudiesen interferir con las reacciones de RT-
PCR, este procedimiento se realizó en un volumen total de 20 µl (Sambrook et al.,
1989). Una cantidad de 5 µg de RNA total de hipófisis de carpa se trató con 0,5 U de
DNAsa libre de RNAsa en el tampon de la enzima DNAsa en concentración final de
1X y agua libre de RNAsa para completar 20 µl de reacción. La mezcla se incubó a
temperatura ambiente por 15 min, posteriormente se adicionaron 2 µl de EDTA
0.5 M y se incubó a 70 ºC por 10 min.
22
El DNA complementario (cDNA) se sintetizó en un volumen de 20 µl; en una
primera etapa se mezcló 1 µg de RNA tratado con DNAsa con 0.25 µg de oligo-dT15
en 7 µl H2O bidestilada y se incubó a 70 ºC por 10 min para asegurar la denaturación
de la hebra templado, y se enfrió en hielo. En una segunda etapa se adicionó el
tampon de la transcriptasa a la concentración final 1x (250 mM Tris/HCl pH 8.3,
375 mM KCl, 1,5 mM MgCl2) y 0,33 mM dNTP, se incuba a 42 ºC por 2 min y luego
se agregó 100 U de transcriptasa reversa RT superscript II; la incubación continúa
por 50 min a 42 ºC. Para inactivar la enzima se lleva a 72 ºC por 10 min y se guarda
la reacción a 4 ºC.
3.3.5 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR) La reacción de la polimerasa en cadena (PCR) se realizó en un volumen de
50 µl total, con 100 ng DNA templado cDNA, aproximadamente 100 ng de cada
partidor, sentido y antisentido, tampón 1x (10 mM Tris/HCl, pH 9, 50 mM KCl, 1%
Triton-X100), 0,33 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1 U TaqPol (Sambrook et al., 1989).
Para asegurar el desapareamiento de los componentes y evitar mal apareamiento se
realizó un hot start, un paso previo de incubación a 94 ºC por 3 min, seguido de
treinta ciclos de denaturación a 94 ºC por 30 segundos, apareamiento a 55 ºC por
30 segundos, extensión a 72 ºC por 30 segundos, seguido por una extensión final a
72 ºC y terminando el programa enfriando a 4 ºC. Finalizado el PCR, las muestras se
guardaron a -20 ºC.
3.3.6 Caracterización de DNA por digestión enzimática Los productos de amplificación gen-copia específica se distinguieron por un
polimorfismo en un sitio de restricción. Las digestiones enzimáticas se realizaron en
23
un volumen final de 30 µl. Se tomaron 20 µl del producto de PCR, los que se
mezclaron con el tampon de la enzima HindIII o PstI, respectivamente, REact 2 1X
(50 mM Tris/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2), se agregaron 10 U de enzima
y agua destilada estéril para completar el volumen. La digestión se realizó por dos
horas a 37 °C, tras lo cual la mitad del volumen de digestión (15 µl) se analizó por
electroforesis en gel de agarosa.
3.3.7 Caracterización de ácidos nucleicos en gel de agarosa Los fragmentos de DNA y los productos de amplificación se fraccionaron por
electroforesis (Sambrook et al., 1989) en geles de agarosa al 1,5 y 2,0 %, para
productos de amplificación de PCR y productos de digestión enzimática
respectivamente. Se pesó la cantidad de agarosa necesaria y se mezcló con tampon
TAE 1X, la mezcla se fundió en un microondas y se dejó enfriar hasta 50 ºC,
después se vació a un molde de acrílico para darle forma al gel y marcar los pocillos
con una peineta. Una vez gelificado se trasladó el gel a la cámara de electroforesis,
donde se sumergió en buffer TAE 1X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8.3). Las
muestras se aplicaron con tampón de carga concentración final 1x (solución stock
6x: 40% (p/v) sucrosa, 0,25% (p/v) azul de bromofenol). La corrida electroforética se
realizó a 75 mA (1 - 5 V/cm) hasta que el indicador del frente iónico llegó a dos
tercios del largo del gel. Los fragmentos de DNA se visualizaron por tinción con
bromuro de etídio (0,5 µg/ml) bajo luz UV. El tamaño de los productos de
amplificación se determinó por comparación frente a un estándar molecular con
fragmentos de tamaño conocidos.
24
3.3.8 Análisis por hibridación in situ
3.3.8.1 Preparación de porta objetos gelatinizados Los portaobjetos se lavaron con abundante agua destilada. Posteriormente se
pasaron por agua destilada estéril en reiteradas ocasiones, se sumergieron en
etanol 95º por 5 minutos y se dejaron secar a temperatura ambiente (Sambrook et
al., 1989). Para la preparación de la gelatina se calentó agua destilada estéril a no
mas de 50 ºC, se agregaron 2.5 gramos de gelatina y se agitó hasta disolución.
Luego se dejó enfriar la solución a unos 30 ºC y se adicionó 0,25 g de sulfato de
cromo y potasio. Finalmente se filtró la solución en papel filtro whatman 3MM y se
dejó que la solución alcanzara la temperatura ambiente. Se sumergieron los
portaobjetos previamente lavados con agua destilada estéril en la solución de
gelatina por 10 minutos. Los canastillos con los portaobjetos se hornearon durante
toda la noche a 100 ºC.
3.3.8.2 Preparación de cortes histológicos
Para la hibridación in situ de hipófisis de carpa en paraformaldehído al 4% en
PBS 1X ( Na2PO4 10 mM; NaCl 137 mM; KH2PO4 1,76 mM; KCl 2,68 mM; pH 7,4)
por 1 hora, posteriormente se realizaron los cortes (10 µm de espesor
aproximadamente) por medio de un crióstato. Los cortes se montaron en los porta
objetos anteriormente gelatinizados y se guardaron a -80 ºC.
3.3.8.3 Marcaje de oligonucleótidos para la hibridación in situ
El marcaje de los oligonucleótidos se realizó en el extremo 3`en 10 µl de
reacción para la desoxirribonucleótido transferasa terminal (TdT) (Figueroa et al.,
1994). Para la reacción se agregó 2,0 µl del tampón 5X de la enzima transferasa
25
terminal, 1,0 µl de oligonucleótido específico 50 µM, 0,5 µl dATP 10 µM, 1.5 µl Dig-
11-dUTP (1 nmol/ µl), 2,0 µl TdT (20 U/ µl) y 3,0 µl de agua desionizada. El mix de
reacción se incubó por 1 hora a 37 ºC y posteriormente se colocó en hielo. El mix se
almacenó a -20 ºC.
3.3.8.4 Hibridación in situ Se dejó secar los porta objetos con los cortes histológicos (guardados a -80 ºC)
a temperatura ambiente; ésto ayuda a una mejor fijación de los cortes al
porta objeto. Es importante marcar los porta objetos (con lápiz diamante) para saber
la orientación de los cortes. Los cortes histológicos ya secos y marcados se
incubaron en hielo por 5 min con una solución previamente enfriada de
paraformaldehído al 4% en PBS 1X, terminada la incubación se realizaron 3 lavados
de 5 min cada uno con PBS 1X frío. Luego se sumergieron los cortes en solución
SSC 2X (0,3 M NaCl; 0,03 M citrato de Sodio; pH 7,0) enfriada a 4 ºC.
La prehibridación se realizó con unas gotas se solución de prehibridación (50%
v/v formamida desionizada; 4X SSC; 0,5 X reactivo de Denhhardt`s; 0,25 µg/ml DNA
de timo de ternera; 10% dextran sulfato) sobre los porta objetos, se incubó por 1
hora en cámara húmeda; finalizada la incubación se descartó la solución de
prehibridación y se reemplazó por solución de hibridación (solución de prehibridación
más la sonda en dilución de 1:200). Se incubó en cámara húmeda por toda la noche
a 37 ºC. Al día siguiente se elimina la solución de hibridación y en un coplín se lavó
los porta objetos con solución 2X de citrato de sodio salino (SSC) con agitación
constante durante 1 hora, luego se cambió la solución por 1X SSC en las mismas
condiciones anteriores. El siguiente lavado fue con solución 0.5 X SSC, la
26
incubación se realizó por 30 minutos a 37 ºC, este paso se repitió una vez más a
temperatura ambiente.
Para la detección inmunológica se comenzó con un lavado con la solución 1
(100 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 mM NaCl) por 1 min a temperatura ambiente, luego se
realizó una incubación con solución 1 BSA-Triton X-100 (1% BSA; 0,3% Triton X-
100, en solución 1) durante 30 min a temperatura ambiente, se eliminó la solución
anterior y se realizó una incubación de los cortes con gotas de los anticuerpos anti-
digoxigenina-AP fragmento fab, diluidos 1:200 en solución BSA-Triton X-100
(1%BSA; 0,3% Triton X-100) por tres a cuatro horas a temperatura ambiente.
Finalizada la incubación se realizó un lavado con solución 1, en coplin, con agitación
constante a temperatura ambiente por 10 min, luego se repitió el lavado con
solución 2 (100 mM Tris-HCl pH 9,5; 100 mM NaCl; 50 mM MgCl2). Finalmente se
realizó una incubación en cámara húmeda con solución de revelado (225 µg/ml NBT;
175 µg/ml BCIP y 0,36 µg/ml levamisol en solución 2) en relativa oscuridad por
20 min hasta 4 h. El revelado se detuvo con solución 3 (10 mM Tris-HCl pH8,0;
0,1 mM EDTA).
Los cortes se deshidrataron en una batería de etanol en concentraciones
crecientes de 70%, 80%, 90%, 96%, 100%-I, 100%-II, durante 30 min por cada uno.
Una vez terminado el proceso de deshidratación, se montaron los portaobjetos con
los cortes en Bálsamo de Canadá y se dejó secar a 37 ºC.
3.3.8.5 Análisis semicuantitativo de imágenes digitales Las imágenes digitales de las hibridaciones in situ de los cortes de hipófisis de
carpas aclimatizadas se procesaron computacionalmente a través del programa
27
IMAGE-PRO PLUS 3.0, con el cual se realizó el análisis semicuantitativo de la
intensidad de reacción obtenida en la hibridación in situ.
El programa básicamente mide la densidad óptica integrada (IOD) restando el
valor de la reacción de fondo, lo que permite estimar un valor en la reacción de
hibridación. Se seleccionaron varios campos por cada corte histológico y los valores
de IOD obtenidos fueron promediados y posteriormente analizados en el programa
Sigma-Plot, aplicando el test de t Student`s además para conocer la significancia en
las variaciones de las muestras analizadas y graficar los resultados.
3.3.9 Extracción orgánica de muestras de agua Las muestras de agua se recolectaron aproximadamente 15 cm bajo la
superficie en una botella de vidrio limpia. El agua se filtró por papel filtro en otra
botella de vidrio limpio, se procesó de inmediato o se guardó filtrada unos días a
4 ºC. Para evitar la incorporación de trazas, compuestos con capacidad estrogénica,
durante todo el tratamiento la muestra de agua nunca tuvo contacto con material
plástico u otro que no sea vidrio (Fig.2). Se concentraron 500 ml en un rotavapor a
70 ºC, reduciéndolas a un volumen de 1 a 2 ml aproximadamente. Este concentrado
se trasladó a un embudo de decantación y se agregó un volumen de acetato de etilo,
se mezcló vigorosamente y se esperó a que se separe la fase acuosa de la fase
orgánica. Luego se aisló la fase orgánica (superior) y se trasladó a un tubo de vidrio,
se repitió la extracción de la fase acuosa remanente agregando nuevamente un
volumen de acetato de etilo y repitiendo por un total de tres veces el procedimiento.
Las fases orgánicas recolectadas se concentraron a un volumen de 1 ml
aproximadamente con rotavapor a 40 ºC. El concentrado se traspasó a un tubo de
vidrio y se llevó a sequedad a temperatura ambiente. El concentrado seco se
28
trasladó a Bélgica y se realizaron los ensayos en el Laboratoire Genie Genetique y
Biologie Moleculaire de Liege.
El extracto se resuspendió en 20 µl de metanol absoluto y se utilizaron 2 µl por
cada 100 µl de medio por pocillo con células reporteras.
3.3.10 Ensayo celular para la detección de efectos hormonales
Soluciones para ensayo celular (Willemsen et al., 2004):
Inactivación del suero fetal bovino: Un frasco nuevo con suero fetal bovino
(BFS) se inactivó por incubación a 60 ºC por 1 h y se guardó alicuotado en Falcon
50 ml a -20 ºC.
Para los ensayos de estimulación con hormonas una alícuota de 50 ml del
suero fetal bovino se trató con carbón activado, se agregó una espátula de carbón
activado, se mezcló suavemente por 30 min a temperatura ambiente, y se filtró con
filtros de 0,45 µm y se guardó a -20 ºC.
Medio de cultivo: El Medio DMEM se guardó a 4 ºC, antes de usar se completó
con el suero fetal bovino correspondiente, con la mezcla de antibióticos a una
concentración final de 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml, anfotericina B y se precalentó
a 37 ºC.
Solución tripsina: Para el manejo de las líneas celulares se utilizó tripsina-
EDTA 0,05% (Gibco BRL).
PBS solución stock 10x: Para preparar un litro se disolvió 80 g NaCl, 2 g KCl,
14,4g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 en 800 ml agua, se ajustó a pH 7,4 con HCl, se aforó
a 1 litro y se autoclavó.
Mantención de las líneas celulares TARM-Luc y MMV-Luc: Las líneas celulares
TARM-Luc y MMV-Luc mantenidas en viales de criopreservación en nitrógeno
29
líquido, se descongelaron en un baño termorregulado a 37 ºC, se inocularon en
frascos de cultivo Falcon de 75 ml con medio de cultivo DMEM suplementado con
10% de suero fetal bovino inactivado y mantenidas a 37 ºC en aire con 5% CO2. Al
llegar a una confluencia no menor a 75 – 80 %, se tripsinizaron. Para eso se eliminó
el medio de cultivo, las células adheridas se lavaron tres veces con 10 ml PBS 1x, se
agregó 2 ml solución tripsina 0,05%, se incubó unos minutos, cuando fue necesario;
las células se desprendieron dando golpes suaves contra la mano. Para inactivar la
actividad de la tripsina, se agregó directamente el medio con suero en el volumen
necesario. Se determinó el número de células en una cámara de Neubauer. Para el
ensayo se necesitó de un mínimo de 70% de confluencia por pocillo en 24 h. Por eso
se diluyó la suspensión celular de tal manera que en 100 µl de volumen había
aproximadamente 106 células.
Bioensayos en las líneas celulares: Los ensayos se realizaron en triplicado y se
repitieron por lo menos dos veces (Fig.3).
Para los ensayos se utilizaron placas de 96 pocillos, en los cuales se agregó
una cantidad de 100 µl de la suspensión celular con 2 – 6 x 106 células en medio
suplementado con 10% de suero fetal bovino depletado con carbón activado y se
incubaron por 24 h a 37 ºC. Para la medición del efecto estrogénico en la expresión
de luciferasa en las células MMV-Luc, se utilizó medio de cultivo tratado con carbón
activado sin rojo fenol. En el caso de las células TARM-Luc se procedió de igual
manera con la diferencia que el medio contenía rojo fenol. A las 24 h el medio fue
descartado y reemplazado por el mismo medio fresco conteniendo las muestras
correspondientes al ensayo, se incubó por 18 h más a 37 ºC y se procesaron para la
detección de la actividad de la luciferasa.
30
Para la medición de la actividad de luciferasa en los extractos celulares, se descartó
el medio de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS 1x y se
procesaron según la instrucción de la estación de trabajo Wallac Victor2 Multilabel
Counter (Perkin-Elmer Life Sciences, Turku, Finland). Las células se resuspendieron
en solución de lisis (Brasier et al., 1989) y una alícuota se traspasó al pocillo de una
nueva placa, la cual se introdujo al lector de luminiscencia Wallac Victor2 Multilabel
Counter, el que estaba programado para agregar la solución con sustrato más ATP,
se leyó la absorbancia a 385 nm y s el resultado. La actividad de luciferasa se
normalizó por el número total de células que se determinó por la concentración de
DNA con el Kit Pico Green ds DNA Quantification Reagent Kit (Molecular Probes,
Eugene, OR, US) de acuerdo a la instrucción del proveedor.
31
4 RESULTADOS
4.1 Análisis de la transcripción de los dos genes GH de carpas aclimatizadas
4.1.1 Diseño del análisis por RT-PCR de los dos genes GH de carpa
En el genoma duplicado de la carpa se encuentran dos genes de GH descrito
parcialmente en la literatura y confirmado por secuencias parciales caracterizadas en
nuestro laboratorio (Figueroa et al, 2005). El alineamiento de las secuencias de
cDNA de GH de carpa reveló que la secuencia publicada por Koren et al. (1989,
Acc.No.M27000), Bai (1999), cGH (Acc.No.X51969) y la secuencia amplificada en
DNA genómico GH-1 (Figueroa et al., 2005, Acc.No. AY822623) corresponden al
gen-I, que se diferencia claramente de la secuencia identificada por Chao et al.
(1989, Acc.No.X13670) la cual corresponde junto con la secuencia GH-2 (Figueroa
et al., 2005, Acc.No.AY822624) al gen-II (Fig. 3). Se observan 16 diferencias en la
secuencia nucleotídica, de los cuales 11 son conservativos y 5 causan el cambio del
aminoácido codificado (Fig. 3). En la posición 309 (Koren et al., 1989,
Acc.No.M27000) se destaca un sitio de restricción para la enzima HindIII, por un
cambio de T por una C en la región 3’ en la secuencia correspondiente del gen-II,
por lo que en el gen-II se pierde el sitio de restricción para la enzima HindIII. Se
diseñaron los oligonucleótidos cGH8 y cGH3 flanqueando este polimorfismo. En
cDNA de hipófisis de carpa se amplificaron los productos del tamaño esperado con
los oligonucleótidos cGH1/3 de 225bp, y con cGH8/3 de 646pb (Fig. 4). La digestión
del producto de amplificación de 656 pb con HindIII resultó en la formación de dos
fragmentos de 356 pb y de 290 pb que corresponderían a los productos de digestión
32
de la secuencia del gen-I y la persistencia de una banda de menor intensidad del
tamaño de 646 pb que correspondería al producto de amplificación no digerido del
gen-II (Fig. 4A). Las condiciones de la reacción de PCR se optimizaron y primero se
mostró que con 30 ciclos la reacción está claramente en la fase logarítmica de
amplificación, como se muestra en el aumento de la intensidad de las bandas con el
aumento del numero de ciclos (Fig. 4B). También se determinó que se puede
detectar la variación de la cantidad de transcritos cGH específicos en las muestras
de cDNA utilizando diferentes diluciones de cDNA templado tanto de carpas de
invierno como de verano (Fig. 4C).
33
Figura 3: Alineamiento de secuencias GH de Cyprinus carpio.
oli GH-ex1s1 15 16 30 31 45 46 60 61 75 76 90
M A R V L V L L S V V L V S L L V N 1 KOREN AACTAAGCCTGCAAG AGTTTAGTTTGTCTACCCTG AGCGAAGTCTACCCTG AGCGAAATGATGGCGCTAGA GTATTAGTGCTATTG TCGGTGGTGCTGGTT AGTTTGTTGGTAAAC 902 BAI --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 03 cGH --------------- --------------- ------ATGGCTAGA GTATTAGTGCTATTG TCGGTGGTGCTGGTT AGTTTGTTGGTGAAC 544 GH-2 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 05 GH-3 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 06 CHAO --------------A GGTGTGTCTACCCTG AGCGAAATGGCTAGA GCATTAGTGCTGTTG TCGGTGGTGCTGGTT AGTTTGTTGGTGAAC 76
A
91 105 106 120 121 135 136 150 151 165 166 180 Q G R A S D N Q R L F N N A V I R V Q H L H Q L A A K M I N
1 KOREN CAGGGGAGAGCATCA GACAACCAGCGGCTC TTCAATAATGCAGTC ATTCGTGTACAACAC CTGCACCAGCTGGCT GCAAAAATGATTAAC 1802 BAI ------------TCA GACAACCAGCGGCTC TTCAATAATGCAGTC ATTCGTGTACAACAC CTGCACCAGCTGGCT GCAAAAATGATTAAC 783 cGH CAGGGGAGAGCATCA GACAACCAGCGGCTC TTCAATAATGCAGTC ATTCGTGTACAACAC CTGCACCAGCTGGCT GCAAAAATGATTAAC 1444 GH-2 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 05 GH-3 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 06 CHAO CAGGGGAGAGCATCA GATAACCAGCGGCTC TTCAATAATGCAGTC ATTCGTGTACAACAC CTGCACCAGCTGGCC GCAAAAATGATTAAC 166
181 195 196 210 211 225 226 240 241 255 256 270 D F E D S L L P E E R R Q L S K I F P L S F C N S D Y I E A
1 KOREN GACTTTGAGGACAGC CTGTTGCCTGAGGAA CGCAGACAGCTGAGT AAAATCTTCCCTCTG TCTTTCTGCAATTCT GACTACATTGAGGCG 2702 BAI GACTTTGAGGACAGC CTGTTGCCTGAGGAA CGCAGACAGCTGAGT AAAATCTTCCCTCTG TCTTTCTGCAATTCT GACTACATTGAGGCG 1683 cGH GACTTTGAGGACAGC CTGTTGCCTGAGGAA CGCAGACAGCTGAGT AAAATCTTCCCTCTG TCTTTCTGCAATTCT GACTACATTGAGGCG 2344 GH-2 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 05 GH-3 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 06 CHAO GACTTTGAGGATAGC CTGTTGCCCGAGGAG CGCAGACAGCTGAGT AAAATCTTCCCTCTG TCTTTCTGCAATTCT GACTACATTGAGGCG 256
HindIII (A/AGCTT)271 285 286 300 301 315 316 330 331 345 346 360 P A G K D E T Q K S S M L K L L R I S F H L I E S W E F P S
1 KOREN CCTGCTGGAAAAGAT GAAACACAGAAGAGC TCTATGCTGAAGCTT CTTCGCATCTCTTTT CACCTCATTGAGTCC TGGGAGTTCCCAAGC 3602 BAI CCTGCTGGAAAAGAT GAAACACAGAAGAGC TCTATGCTGAAGCTT CTTCGCATCTCTTTT CACCTCATTGAGTCC TGGGAGTTCCCTAGC 2583 cGH CCTGCTGGAAAAGAT GAAACACAGAAGAGC TCTATGCTGAAGCTT CTTCGCATCTCTTTT CACCTCATTGAGTCC TGGGAGTTCCCTAGC 3244 GH-2 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 05 GH-3 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- 06 CHAO CCCACTGGAAAAGAT GAAACACAGAAGAGC TCTATGTTGAAGCTC CTTCGCATCTCTTTC CGCCTCATTGAGTCT TGGGAGTTCCCCAGC 346
T Roli GH1s
361 375 376 390 391 405 406 420 421 435 436 450 Q S L S G T V S N S L T V G N P N Q L T E K L A D L K M G I
1 KOREN CAGTCCCTGAGCGGA ACCGTCTCAAACAGC CTGACCGTAGGGAAC CCCAACCAGCTCACT GAGAAGCTGGCCGAC TTGAAAATGGGCATC 4502 BAI CAGTCCCTGAGCGGA ACCGTCTCAAACAGC CTGACCGTAGGGAAC CCCAACCAGCTCACT GAGAAGCTGGCCGAC TTGAAAATGGGCATC 3483 cGH CAGTCCCTGAGCGGA ACCGTCTCAAACAGC CTGACCGTAGGGAAC CCCAACCAGCTCACT GAGAAGCTGGCCGAC TTGAAAATGGGCATC 4144 GH-2 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- ------ATGGGCATC 95 GH-3 --------------- --------------- --------------- --------------- --------------- ------ATGGGCATC 96 CHAO CAGACCCTGAGCGGA ACCGTCTCAAACAGC CTGACCGTCGGGAAC CCCAACCAGATCACT GAGAAGCTGGCCGAC TTGAAAATGGGCATC 436
T I
451 465 466 480 481 495 496 510 511 525 526 540 S V L I Q A C L D G Q P N M D D N D S L P L P F E D F Y L T
1 KOREN AGTGTGCTCATCCAG GCATGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAACGACTCCTTG CCGCTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 5402 BAI AGTGTGCTCATCCAG GCATGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAATGACTCCTTG CCGCTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 4383 cGH AGTGTGCTCATCCAG ---TGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAACGACTCCTTG CCGCTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 5014 GH-2 AGTGTGCTCATCCAG GCATGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAACGACTCCTTG CCGCTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 995 GH-3 AGTGTGCTCATCAAG GGATGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAACGACTCCCTG CCACTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 996 CHAO AGTGTGCTCATCAAG GGATGTCTCGATGGT CAACCAAACATGGAT GATAACGACTCCCTG CCACTGCCTTTTGAG GACTTCTACTTGACC 526
541 555 556 570 571 585 586 600 601 615 616 630 M G E N N L R E S F R L L A C F K K D M H K V E T Y L R V A
1 KOREN ATGGGGGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTCAAGAAGGACATG CACAAAGTCGAGACC TACTTGAGGGTTGCA 6302 BAI ATGGGGGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTCAAGAAGGACATG CACAAAGTCGAGACC TACTTGAGGGTTGCA 5283 cGH ATGGGGGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTCAAGAAGGACATG CACAAAGTCGAGACC TACTTGAGGGTTGCA 5914 GH-2 ATGGGGGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTCAAGAAGGACATG CACAAAGTCGAGACC TACTTGAGGGTTGCA 1895 GH-3 ATGGGAGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTTAAGAAGGACATG CACAAGGTCGAAACC TACCTGAGGGTTGCA 1896 CHAO ATGGGAGAGAACAAC CTCAGAGAGAGCTTT CGTCTGCTGGCTTGC TTTAAGAAGGACATG CACAAGGTCGAAACC TACCTGAGGGTTGCA 616
oli GH-ex5a631 645 646 660 661 675 676 690 691 705 706 720 N C R R S L D S N C T L * 210
1 KOREN AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTGTAGATGGCA CCGGTGT----ATTG TTAGTCAATGCCTGT AACACATTTGTGCTT 7162 BAI AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTGTAG------ --------------- --------------- --------------- 5673 cGH AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTGTAG------ --------------- --------------- --------------- 6304 GH-2 AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTG--------- --------------- --------------- --------------- 2255 GH-3 AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTG--------- --------------- --------------- --------------- 2256 CHAO AATTGCAGGAGATCC CTGGATTCCAACTGC ACCCTGTAGAGGGCG CTTGTATTGCTAGTC AGTGCCTGCAAATCT AAGACTAGTTTAAGT 706
34
En letras mayúsculas en azul se observa la secuencia amino acídica derivada de la
secuencias nucleotídicas del Gen-I. En letras mayúsculas en rosado se indican los
aminoácidos derivados del Gen-II, los que se diferencian de la secuencia del Gen-I.
En azul y subrayado se muestra el sitio de restricción para la enzima HindIII y en
morado subrayado, la secuencia correspondiente en el Gen-II sin sitio de restricción
para HindIII. Finalmente las secuencias nucleotídicas subrayadas indican la
ubicación de los partidores.
35
Figura 4: Estandarización del análisis RT-PCR para los genes GH de carpa.
Productos de amplificación fraccionados en gel de agarosa al 2%. (A) 1) control
negativo sin templado, 2) estándar de tamaño molecular, templado cDNA de
pituitaria de carpa 3) Fragmento 290 pb gen-I y gen-II (oliGH1s/cGH3a) 4)
Fragmento de 646 pb, Gen-I y gen-II (olicGH8s/cGH3a) 5) el producto de
amplificación de (4) digerido con HindIII. (B) Determinación de la fase logarítmica de
la amplificación. Productos del PCR después de 2) 25, 4) 30, 6) 35, 7) 40 ciclos y
digerido con HindIII en 3), 5), 7), 9), estándar de tamaño molecular en 1) y 10), en
11) control negativo sin templado. Se eligieron 30 ciclos para todos los próximos
ensayos. (C) Determinación de la cantidad de cDNA templado de pituitaria de carpa
aclimatizada a invierno dilución 2) 1:10, 3) 1:100, 4) 1:1000, y a verano dilución 5)
1:10, 6) 1:100, 7) 1:1000, 1) DNA fago λ/HindIII, 8) control negativo sin templado.
B C1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A 1 2 3 4
225 290 356 646
1 2 3 4 5 6 7
V I
356 646
290
36
4.1.2 Expresión de los dos genes GH en carpas aclimatizadas
Se confirmó que hay más transcritos de GH en verano respecto a los de
invierno (Fig. 4C, y Figueroa et al., 2005). En las condiciones determinadas para la
evaluación semicuantitativa del número de transcritos de secuencias GH gen-copia
especifica en cDNA de hipófisis de carpa se evaluó la intensidad de la banda
amplificada por los oligonucleótidos GH8/3 con un producto de amplificación de
646 pb que corresponde a los dos genes y la banda de 646 pb después de la
digestión con HindIII que corresponde a la fracción del gen-II no digerido (Fig. 3 y
Fig. 4). Al determinar la razón de intensidad de pixeles de gen-I+gen-II dividido por la
del gen-I mostró que la adaptación a las dos estaciones opuestas del año, invierno y
verano, afectó por igual a la transcripción del gen-I y gen-II de GH en carpa (Fig. 5).
Eso queda en evidencia al presentar la razón de (gen I + gen II / gen II), donde se
muestra que no hay una diferencia significativa (Fig. 6).
37
Figura 5: Cuantificación de transcritos GH por RT-PCR en pituitarias de carpas
aclimatizadas. El gráfico demuestra la evaluación de los imágenes digitalizadas del
los productos de amplificación fraccionados en geles de agarosa del análisis de RT-
PCR de los dos genes GH de carpa.
g en Igen I I
C arpas i
C arpas v0,00
5000,00
10000,00
15000,00
20000,00
Carpas iCarpas v
Gen II/ Gen I Inv 1:1.91 Gen II/ GenI ver. 1:1.92
38
B646
356290
1 2 bp
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Raz
ón G
H g
ene- I+
II/ge
ne-II
verano invierno
A
cGH8 cGH3
646 pbgen -II
gen -I cGH8 cGH3
290 pb356 pb
HindIII
(646 pb)
(646 pb)
B646
356290
1 2 bpB646
356290
1 2 bp
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Raz
ón G
H g
ene- I+
II/ge
ne-II
verano invierno
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Raz
ón G
H g
ene- I+
II/ge
ne-II
verano invierno
A
cGH8 cGH3
646 pbgen -II
gen -I cGH8 cGH3
290 pb356 pb
HindIII
(646 pb)
(646 pb)
A
cGH8 cGH3
646 pbgen -II
gen -I cGH8 cGH3
290 pb356 pb
HindIII
(646 pb)
(646 pb)cGH8 cGH3
646 pbgen -II
gen -I cGH8 cGH3
290 pb356 pb
HindIII
(646 pb)
(646 pb)
Figura 6: Cuantificación de la razón de los transcritos de los dos genes GH por
RT-PCR en pituitarias de carpas aclimatizadas. (A) Presentación esquemática de
la secuencia del gen-I y gen-II GH de carpa entre exon I y V a indicación del
polimorfismo del sitio de restriccion HindIII. (B) Producto de amplificación con
oligonucleótido exon Is y exon Va en cDNA de pituitaria de carpa (1) antes y (2)
después de la digestión con HindIII y fraccionado en un gel de 1.4% agarosa.(C) El
histograma presenta la razón de los transcritos del gen-I+II/gen-II en pituitarias de
carpas aclimatizadas a verano e invierno determinados como valores en pixeles
totales en las imágenes digitalizadas del gel de la banda de 646pb de los productos
del RT-PCR antes y después de la digestión con HindIII. Barra: promedio +/-
desviación estándar; (n=4; Student’s t test, P<0.01).
39
4.1.3 Efecto estrogénico sobre la transcripción de los dos genes GH en carpas aclimatizadas
Finalmente se determinó la cantidad de transcritos de GH por RT-PCR en
carpas inyectadas con 17-β-estrógeno en comparación a las carpas control
inyectadas sólo con vehículo (Fig. 6A). En las condiciones del ensayo no ocurrió un
efecto diferencial en la expresión de los dos genes y el cuociente gen-I+gen-II / gen-
II no mostró diferencia significativa en carpas aclimatizadas a invierno respecto a las
de invierno inyectados con E2. El experimento se realizó en una ocasión con carpas
macho y a pesar de que se nota un aumento de la intensidad de las bandas
correspondientes a los genes de GH en carpas inyectadas con E2 respecto a las
carpas control, no se alcanzó una evaluación estadísticamente significativa (Fig. 6B).
Sin embargo, el sistema montado permitirá aumentar el número de muestras y
clarificar los efectos en carpas adultas en varias épocas del año.
4.2 Análisis de la transcripción de los dos genes Pit1 de carpas aclimatizadas
4.2.1 Diseño del análisis por RT-PCR de los dos genes Pit1 de carpa
Anteriormente se habían descrito los dos genes de Pit1 de carpa y que hay
transcritos de los dos genes en hipófisis de carpa adulta (Kausel et al., 2006). El
alineamiento de la secuencia parcial del cDNA del gen-I y gen-II de Pit1 reveló 18
diferencias a nivel nucleotídico y 9 cambios amino acídicos (Fig. 7). En la región río
arriba del codón de inicio de la traducción ATG se destacó un elemento de 36pb en
40
+1 oli7s
GP7 TATAAATACCTGCACACGCCCTGCTCATAGCACACAGGTGGGACCCTGAGTAGGACCCTG-AGT---------AGGTGAAGATCTAGAGTCGP4 TATAAATACCTGCACACGCCCTGCTCGTGTCACACAGGTGTGCCGATGCCTCGTGTGCAGGACTCAGACCCTGAGGTGAAGATCTAGAGTC
5'cDNA ACACAGGTGTGCCGATGCCTCGTGTGCAGGACTCAGAGCCTGAGGTGAAGATCTAGAGTColi6s oli8s
1 15 16 30 31 45 46 60 61 75 76 90 M T C Q A F S T T D C F T T L S G D S A A L P L L M H H T G
GP7 ATGACCTGCCAGGCC TTCAGCACCACTGAT TGCTTCACTACTCTG AGCGGAGACTCGGCT GCTCTGCCGCTGCTC ATGCATCACACCGGA 905'cDNA ATGACCTGCCAGGCC TTCAGCACCACTGAT TGCTTCACTACTCTT AGCGGAGACTCGGCT GCTCTGCCGCTGCTC ATGCATCACACCGGA 90
M T C Q A F S T T D C F T T L S G D S A A L P L L M H H T G
91 105 106 120 121 135 136 150 151 165 166 180 A A D C L P V S S H T T N M M P S V P S G L P L V Q S S K R
GP7 GCCGCAGACTGTCTG CCCGTCTCCAGCCAC ACCACCAACATGATG CCTTCAGTCCCCTCA GGTCTGCCACTGGTT CAGTCATCCAAACGC 1805'cDNA GCTGCAGACTGTCTG CCCGTCACCAGCCAC GCCACCAACATGGTG CCTCCAGTCCCCTCA GATCTCCCTCTGGTC CAGTCGTCCAAACGC 180
A A D C L P V T S H A T N M V P P V P S D L P L V Q S S K RPst I
181 195 196 210 211 225 226 240 241 255 256 270 S H M H L S T S A L G N A S A S L H Y P M P P C H Y S N Q Q
GP7 TCACATATGCACCTG TCCACTTCTGCTTTG GGCAATGCGTCAGCC AGCCTGCACTATCCA ATGCCCCCGTGTCAC TATAGCAACCAGCAG 2705'cDNA TCTCATATGCACCTG TCCGCTTCTGCTTTG GGCAATGCGTCAGCC AGCCTGCACTACCCA TTGCCCCCATGTCAC TATAGCAACCAGCAG 270
S H M H L S A S A L G N A S A S L H Y P L P P C H Y S N Q Q
271 285 286 300 301 315 316 330 331 345 346 360 T T Y G M M A A Q E M L S A S I S Q T R I L Q T C S M P H A
GP7 ACCACCTACGGCATG ATGGCAGCACAGGAA ATGCTCTCTGCCAGC ATCTCCCAGACCCGC ATCCTGCAGACCTGC AGCATGCCTCATGCC 3605'cDNA ACCACTTACGGCATG ATGGCAGCACAGGAA ATGCTCTCTGCCAGC ATCTCTCAGACCCGC ATCCTGCAGACCTGC AGCATGCCTCATGCC 360
T T Y G M M A A Q E M L S A S I S Q T R I L Q T C S M P H AOli9a Pst I
361 375 376 390 391 405 406 420 421 435 436 450N M V N G A N S L Q G A L A S R L Y K F P E H S L G G G S C
GP7 AACATGGTCAACGGA GCCAACTCACTGCAA GGAGCTCTGGCTTCA CGCCTCTATAAGTTC CCAGAGCACAGTTTG GGTGGGGGCTCCTGT 4505'cDNA AACATGGTCAACAGT GCCAACTCACTGCAA GGAGCTCTGGCTCCA CGCCTCTATAAGTTC CCAGAGCACAGTCTG GGTGGGGGCTCCTGT 450
N M V N S A N S L Q G A L A P R L Y K F P E H S L G G G S C
GP7 CTTTGACCCACAGTTTACCGCColi3a
Figura 7: Alineamiento de secuencias génicas Pit1 de C. carpio. Alineamiento
de la secuencia cDNA producido por empalme in silico de la secuencia gen-II de Pit1
(Acc.No.AF132287), gen-I Pit1 (Acc.No.AY273789), y 5’cDNA del gen-I (Acc.No.
AF096863), en mayúscula arriba y abajo las secuencias aminoacídicas deducidas;
subrayado: oligonucleótidos; rojo: sitio de HindIII.
41
el gen-I completamente diferente a la secuencia correspondiente en el gen-II que
permitió el diseño de oligonucleótidos específicos para cada gen, el oli6 del gen-I y
el oli7 del gen-II (Fig. 8). Otra diferencia se encontró en los sitios de reconocimiento
de la enzima de restricción PstI, es decir dos sitios PstI en el gen-I y el cambio en la
posición 93 de una T en el gen-I a una C en el gen-II subyace la perdida de uno de
los sitios PstI en el gen-II (Fig. 8). El polimorfismo para la digestión con PstI confirmó
la especificidad para el gen-I del oli6s que amplificó con oli3a un producto de 520 pb
que al ser digerido con PstI resultó en tres fragmentos de tamaños de 144pb, 242pb
y 134pb (Fig. 9A y B). Después de la digestión desapareció la banda de 520 pb
indicando la digestión completa de la secuencia para el gen-I y la ausencia de
secuencia del gen-II (Fig. 9B).
4.2.2 Expresión de los dos genes Pit1 en carpas aclimatizadas
Para la evaluación semicuantitativa del efecto medioambiental en la expresión de los
dos genes de Pit I de carpa, se diseñaron los oligonucleótidos oli8s y oli9a
flanqueando el sitio polimórfico PstI y apareando con secuencias idénticas en los
dos genes (Fig.8 y 9A). Con eso se eliminó una posible interferencia por
oligonucleótidos diferentes en cada gen que podrían causar un cambio de la
eficiencia de la reacción del PCR. Además se obtiene un fragmento de tamaño
idéntico después de la digestión, importante para la evaluación comparativa de la
intensidad de bandas en las imágenes digitalizadas de los geles con los productos
de amplificación. El sistema montado permitirá la evaluación del número de
transcritos gen-copia especifica de GH de carpa, como se mostró en las muestras de
carpas aclimatizadas a invierno y verano (Fig. 9C).
42
Figura 8: Análisis por RT-PCR del efecto E2 en la transcripción del gen GH en
pituitaria de carpas aclimatizadas a invierno. (A) Productos de amplificación de
Gen-I y Gen-II con olicGH8s/cGH3a y digerido con HindIII en cDNA de carpas
aclimatizadas a invierno, tratados con vehículo: 2) #1, 3) #2, 4)#3 y tratados con E2
5)#4, 6)#5, 7)#6; 1) estándar de tamaño molecular, 8) control negativo sin templado.
(B) Gráfico de la evaluación de la expresión de los dos genes de GH en carpas
control, tratadas con vehículo (columna negro) y tratadas con 17-β estradiol
(columna gris). Para Gen-I se indican la suma de los pixeles de las bandas 356 y
290 pb, para el Gen-II de la banda 646 pb del análisis de las imágenes digitalizados
del gel (A). Student´s t-test n=3, P=0.05.
43
A
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4C
gen-I
gen-II
gen-Igen-II
Oli8s Oli9aPstI
113 pb 236 pb
Oli6s Oli3aPstI PstI
144 pb 242 pb 137 pb
Oli7s Oli3a
523 pb
PstI
113pb
236pb
349pb
A
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 41 2 3 4C
gen-I
gen-II
gen-Igen-II
Oli8s Oli9aPstI
113 pb 236 pb
Oli6s Oli3aPstI PstI
144 pb 242 pb 137 pb
Oli7s Oli3a
523 pb
PstI
gen-I
gen-II
gen-Igen-II
Oli8s Oli9aPstI
113 pb 236 pb
Oli8s Oli9aPstI
113 pb 236 pb
Oli6s Oli3aPstI PstI
144 pb 242 pb 137 pb
Oli6s Oli3aPstI PstI
144 pb 242 pb 137 pb
Oli7s Oli3a
523 pb
PstIOli7s Oli3a
523 pb
PstI
113pb
236pb
349pb
Figura 9: Estandardización del análisis RT-PCR para los genes Pit1 de carpa.
(A) Esquema de los productos de amplificación. (B) Determinación de la fase
logarítmica del PCR. Fraccionamiento de productos de PCR de cDNA de pituitaria de
carpa con 1) oli6s/oli3a (gen-I), 2) control negativo sin templado, 3) y 12) estándar de
tamaño molecular, 4) 25, 6) 30, 8) 35, 9) 40 ciclos y digerido con PstI en 5), 7), 9),
11). (C) Productos de amplificación en cDNA de carpa con oli8s/9a (los dos genes)
aclimatizada a 1) invierno y 3) verano y digerido con PstI respectivamente en 2) y 4).
44
La evaluación de la detección de secuencias RNA específicas de cada copia
del gen de Pit-1 por hibridación in situ, reveló que hay más transcritos del gen-I de
Pit1 respecto al gen-II en hipófisis de carpas aclimatizadas a invierno (Fig. 10), lo
que sugiere una regulación diferencial de los genes de Pit1 para las condiciones
estudiadas.
45
Pit-1 gene-I and gene-II transcripts (ISH)
0 1 2 3
Tota
l pix
el v
alue
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
gene-I gene-II
*
n=6
A B
C Pit-1 gene-I and gene-II transcripts (ISH)
0 1 2 3
Tota
l pix
el v
alue
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
gene-I gene-II
*
n=6
Pit-1 gene-I and gene-II transcripts (ISH)
0 1 2 3
Tota
l pix
el v
alue
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
gene-I gene-II
*
n=6
A B
C
Figura 10: Comparación de los niveles de expresión de los genes Pit1 en
carpas aclimatizadas a invierno por hibridación in situ. Hibridación in situ con
oligonucleotidos Pit1 gen-copia específicos en cortes sagitales de pituitarias de
carpas aclimatizadas a invierno (A) gen-I, (B) gen-II. Inserto en panel (B) muestra la
misma sección de la pituitaria de carpa teñido con hematoxilina. (C) Gráfico de los
pixeles totales del análisis de los imágenes digitalizados muestra 4,6 veces mayor
intensidad para el gen-I respecto al gen-II.
46
4.3 Detección de efectos hormonales en agua del hábitat de carpas aclimatizadas por ensayo celular
Los estudios sobre efectos estrogénicos en la expresión de factores
hipofisiarios de carpa se complementaron con el análisis del potencial de agua del
hábitat de los peces de causar efectos estrogénicos y de otras hormonas en líneas
celulares reportero. Las líneas celulares establemente transformados para un
ensayo altamente sensible se desarrollaron en Bélgica (Fig.11, Willemsen et al.,
2004). En un primer acercamiento no se logró la evaluación de extracto de muestras
de agua ambiental, donde se consiguió identificar actividad androgénica y de
progestágenos por la gran sensibilidad del ensayo (Willemsen et al., 2004). Sin
embargo, no se logró hacer un análisis sistemático de las muestras, debido a la
toxicidad de las muestras concentradas (Willemsen et al., 2004), por lo que se
desarrolló un nuevo protocolo para la preparación del extracto orgánico del agua
(Fig.12). Con las muestras preparadas de acuerdo a las precauciones indicadas se
identificaron efectos específicos con el test celular (Fig.13).
47
MCF-7
MAR-Vit-Luc
MMV-Luc TARM-Luc
TM-Luc
pSV-AR0
T47D
MMTV-Luc
efectos estrogénicos
efectos androgénicos
A B
MCF-7
MAR-Vit-Luc
MMV-Luc
MCF-7
MAR-Vit-Luc
MCF-7
MAR-Vit-Luc
MMV-Luc TARM-Luc
TM-Luc
pSV-AR0
T47D
MMTV-Luc
TM-Luc
pSV-AR0
T47D
MMTV-Luc
T47D
MMTV-LucMMTV-Luc
efectos estrogénicos
efectos androgénicos
A B
Figura 11: Esquema de la generación de las líneas celulares indicadores de
efectos estrogénicos y androgénicos.
48
2-3 ml.
rotavapor
70 ºC
acetato de etilo1 Vol fase
orgánicafase
acuosaagitación
repetición extracciónfase acuosa ( X3)
recolección fase orgánica
Rotavapor
40 ºC
evaporación a temperatura
ambiente
extracto orgánico seco de muestra de agua
traspasar concentrado
a tubo de vidrio
500 ml
2-3 ml.
rotavapor
70 ºC
acetato de etilo1 Vol fase
orgánicafase
acuosaagitación
repetición extracciónfase acuosa ( X3)
recolección fase orgánica
Rotavapor
40 ºC
evaporación a temperatura
ambiente
extracto orgánico seco de muestra de agua
traspasar concentrado
a tubo de vidrio
500 ml500 ml
Figura 12: Esquema de extracción orgánica de muestras de agua.
49
Figura 13: Esquema del ensayo celular para la detección de efectos
hormonales en extracto de agua.
50
4.3.1 Efecto estrogénico en línea celular reportero MMV-Luc
Primero se elaboró la curva de calibración agregando concentraciones
crecientes de una solución estándar de 17-β-estradiol a las células MMV-Luc
(Fig.14). La respuesta de luminescencia frente a concentración de E2 llevó a el
gráfico de forma sigmoidal, reflejando la respuesta celular caracterizada por una fase
de lento aumento, la fase en la cual hay proporción directa entre concentración y
aumento de luminiscencia y la fase de saturación de la respuesta (Fig.14). La
sensibilidad llega hasta detectar una respuesta a una concentración de 10-12 M E2
(Fig.14). En la figura 15 se presenta un gráfico de inducción para el tratamiento con
extracto de agua con 0,25x10-8 M 17β-estradiol procesada de la manera indicada en
Fig.12. Con el fin de evaluar una posible mortalidad de extracto en el ensayo celular
se aplicaron los extractos de agua con E2 en dos diluciones. La aplicación de
extracto cuatro o veinte veces diluido no causó diferencias significativas en la
respuesta celular (no mostrado). Claramente se apreció un aumento de
aproximadamente 1,7 veces de la luminiscencia por la actividad de luciferasa
estimulada por extracto de agua con E2 en comparación con células tratadas con
extracto de agua destilada o células no tratadas (Fig.15).
Finalmente se evaluaron extractos de agua ambiental de varios lugares cerca
de Valdivia con las MMV-Luc. Solamente la muestra de Collico, una zona altamente
contaminada con aguas servidas, indujo la luminiscencia del gen reportero luciferasa
bajo control del promotor vitelogenina en cuatro veces más respecto al efecto de las
muestras de toma del agua potable de la región y otros lugares cerca de Valdivia
(Fig.16).
51
Figura 14: Curva de calibración del efecto estrogénico a la expresión de la
luciferasa en MMV-Luc. El gráfico muestra la curva de calibración con
concentraciones de 17-β-estradiol de 10-12 hasta 10-9 M. La media de la actividad de
luciferasa ± SD fue determinada para cada concentración y normalizada a la máxima
inducción, que fue arbitrariamente fijada como 100 %.
52
Figura 15: Efecto de extracto orgánico de H2O destilada y de 17-β-estradiol
sobre la expresión de la luciferasa en MMV-Luc. El gráfico demuestra el promedio
de la inducción +/- desviación estándar en relación a las células tratadas con
extracto de agua destilada (1), y células tratadas con extracto de solución estándar
de 17-β-estradiol 0.25x10-8 M (2). La expresión de Luciferasa fue medida 24 h
después, la media de la inducción ± SD es relativa a células no tratadas. (Student´s
t-test n=3, P<0,1).
53
Figura 16: Efecto de extracto orgánico de agua ambiental sobre la expresión de
la luciferasa en MMV-Luc. El gráfico demuestra el promedio de la inducción +/- SD
y un aumento significativo en la muestra correspondiente al sector Collico (3)
respecto a las muestras de otros lugares del alrededor de Valdivia: Aguas Décima
(1), Pelchuquín (2), Cau-Cau (4), San José de la Mariquina (5), Las Mulatas (6) y Río
Cautín (7). La expresión de luciferasa fue medida 24 h después del tratamiento con
el extracto, la media de la inducción ± SD del test en triplicado (n=3) es relativa a las
células no tratadas (Students T-test, n=3, P<0,05).
54
4.3.2 Efecto androgénico en línea celular reportero TARM-Luc
De la misma manera se utilizó la línea celular TARM-Luc como reportero de
efectos androgénicos en las muestras de agua (Fig.11, B). La curva de calibración
obtenida por la respuesta de los TARM-Luc al tratamiento con DHT con
concentraciones entre 10-9 hasta 10-2 M revela una respuesta similar que podría
indicar que las células están en la fase saturación de la respuesta (Fig.17). Por lo
tanto el efecto del extracto de agua con DHT en una concentración de 10-9 M induce
un aumento de la actividad de luciferasa de casi 30 veces más en relación al efecto
de extracto de agua destilada (Fig.18). La línea celular reportera a efectos
androgénicos no revela agentes con este potencial en el extracto de agua del hábitat
de las carpas en estudio (Fig.19).
55
Figura 17: Curva de calibración del efecto androgénico en la expresión de la
luciferasa en TARM-Luc. El gráfico muestra la curva de calibración con
concentraciones crecientes de DHT de 1x10-12 hasta 1x10-9 M. Al igual que para las
células MMV-Luc, la media de la actividad de luciferasa ± SD fue determinada para
cada concentración y normalizada a la máxima inducción, que fue arbitrariamente
fijada como 100 %.
56
Figura 18: Efecto de extracto orgánico de H2O destilada y de solución
estándar DHT en la expresión de luciferasa en TARM-Luc. El gráfico demuestra
el promedio de la inducción +/- desviación estándar en relación a las células tratadas
con extracto de agua destilada (1) y células tratadas con extracto de solución
estándar DHT 0.25x10-7 M. La expresión de Luciferasa fue medida 24 h después del
tratamiento con extracto, la media de la inducción ± SD es relativa a células no
tratadas (Student`s t-test; n=3 test en triplicado; P<0,05).
57
Figura 19: Efecto de extracto orgánico de agua ambiental en la expresión de la
luciferasa en TARM-Luc. El gráfico demuestra el promedio de la inducción +/-
desviación estándar con extracto de muestras de agua del alrededor de Valdivia:
Aguas Décima (1), Pelchuquín (2), Collico (3), Cau-Cau (4), San José de la
Mariquina (5), Las Mulatas (6) y Río Cautín (7). La expresión de Luciferasa fue
medida 24 h después del tratamiento con extracto, la media de la inducción ± SD es
relativa a las células no tratadas (test en triplicado).
58
5 DISCUSION
En el presente trabajo se ha analizado el efecto de 17-β-estradiol sobre la
expresión de GH en pituitaria de carpa. Para desarrollar genes del eje hipotálamo-
hipofisiario como nuevos biomarcadores de efectos nocivos por disruptores
endocrinos como el estrógeno, se desarrolló un sistema de detección de expresión
gen-copia específica de GH y Pit1, genes duplicados y activos diferencialmente en
carpas aclimatizadas (Figueroa et al., 2005; Kausel et al., 2006).
La gran adaptabilidad de carpas a diferentes ambientes, su durabilidad en
condiciones extremas como de hipoxia o de contaminación con tóxicos, refleja la
enorme plasticidad de la red de transcripción orquestando su genoma duplicado y
funcionalmente diploidizado (Billard, 1999; De Boeck et al., 2000). Es importante
contemplar una posible regulación diferencial de genes duplicados que podría estar
relacionada con un efecto biológico.
El efecto de un compuesto xenobiótico en el sistema endocrino de un
organismo dependerá del estado en el cual se encuentra la composición de todos
sus genes activos en ese momento. En el caso de la carpa hemos observado una
diferencia significativa de los niveles de PRL, GH y Pit1 en pituitarias de carpas
aclimatizadas a verano respecto a invierno, menor en el último período (Kausel et al.,
1999; Figueroa et al, 2005). Los análisis de RT-PCR demostraron una represión de
3,3 veces de la expresión de GH en los peces adaptados a la estación fría, lo que
se demostró en conjunto con los resultados obtenidos mediante inmunocitoquímica
(2,9 veces) e hibridación in situ (2,7 veces) (Figueroa et al., 2005).
59
Los resultados deben ser interpretados en el contexto de que la carpa
tiene su genoma duplicado. La tetraploidización de la carpa común (C. carpio) fue
estimada su ocurriencia hace 10 – 15 millones de años atrás y se demuestra en
muchas observaciones, incluyendo su alto contenido de DNA y su número de
cromosomas (100), que es el doble de otros peces de la familia Cyprinidae (David et
al., 2003; Castro, 2007).
El hecho de que se encuentren dos tipos de cGH mRNA por RT-PCR en
un solo pez sugiere que hay al menos dos genes distintos activos de hormona de
crecimiento presentes en el genoma de la carpa (Figueroa et al., 2005). Estas dos
copias del gen de GH están relacionadas a cDNAs que fueron reportados por dos
grupos distintos, el cDNA descrito por Koren et al. (1989) para el gen-I y el cDNA
reportado por Chao et al. (1989) para el gen-II. Más aún, la detección de los dos
genes de GH en la carpa es consistente con la identificación de variantes de
hormona de crecimiento que parecen ser producto de genes distintos en trucha
(Agellon et al., 1988) y Carassius aurata (Law et al., 1996). Por otro lado, variantes
de GH en mamíferos parecen ser producto de un procesamiento diferencial de un
solo transcrito de RNA primario (Kawauchi et al., 1986; Rand-Weaver et al., 1991;
Law et al., 1996).
En un principio estudios en el genoma de la carpa sugirieron que sólo la
mitad de sus genes se encontraban activos a un tiempo determinado o en un
determinado tejido (Ferris y Whitt, 1977). Genes duplicados pueden presentar tres
fines destinos: pérdida o pseudogenización guiada por la inactivación de una de las
copias, subfuncionalización que implica una actividad específica temporal o espacial
para cada una de las copias del gen, o la neofuncionalización, es decir, desarrollar
una nueva actividad (David et al., 2003). Secuenciaciones a gran escala y análisis
60
de expresión en plantas poliploides revelaron que a pesar de que ocurre una
subfuncionalización para un gran porcentaje de genes duplicados, algunos genes
homólogos contribuyen por igual al transcriptoma (Adams et al., 2003). En la carpa la
expresión diferencial de dos pares de genes duplicados ocurre durante la exposición
a cambios de temperatura en el agua en experimentos de aclimatación (Arends et
al., 1998, Polley et al., 2003). Algo parecido ocurre con el receptor de prolactina de
carpa, su expresión génica está modulada durante el proceso de aclimatización y las
isoformas derivadas de uno de los genes duplicados despliega patrones de
transcripción tejido específicos (San Martín et al., 2004; 2007). En nuestro trabajo se
demostró por primera vez que los dos genes de hormona de crecimiento se
expresan simultáneamente en la glándula pituitaria en las carpas aclimatizadas a las
distintas estaciones. Se observó una razón constante entre el gen-I y el gen-II de los
transcritos de GH bajo condiciones fisiológicas en la adaptación estacional de las
carpas, indicando que la expresión de los genes es afectada de forma similar por las
variaciones estacionales (Figueroa et al., 2005).
En carpas machos aclimatizadas a invierno el tratamiento con E2 resultó en un
aumento de la expresión de GH, aunque en las condiciones del experimento no fue
significativo. Con el análisis gen-copia especifica, se reveló que el tratamiento con
17-β-estrógeno afectó en igual forma la expresión de los dos genes GH en carpas
aclimatizadas a invierno. Eso concuerda con que el cambio de condiciones
ambientales estacionales implicaba de la misma manera los dos genes GH. A nivel
de proteínas no se podría discriminar con el anticuerpo GH preparado contra un
oligopéptido elegido en una región conservada (Figueroa et al., 2005). Por eso la
variación de niveles de GH en pituitarias de carpa después de la aclimatización
corresponde a la cantidad total de GH (Figueroa et al., 2005). El análisis GH gen-
61
copia específica sugiere regulación coordinada a nivel de transcripción en las
condiciones del ensayo. En otra especie y otro régimen de tratamiento, el estrógeno
no afectó la cantidad de GH en la sangre (McCormick et al., 2005). En juveniles de
salmón del Atlántico en un esquema de cuatro inyecciones con 17-β-estradiol el día
1, 4, 8, y 11 no se observó un efecto en la concentración plasmática de GH, sin
embargo con un esquema parecido con 10 µg/g 4-nonilfenol se detectó un aumento
de GH plasmática (McCormick et al., 2005). Eso sugiere que GH debería
considerase en la evaluación de efectos xenobióticos, sin embargo no seria un
indicador robusto para efectos estrogénicos.
En los últimos años se amplió la clásica determinación del efecto sobre un gen
a la vez como biomarcador, indicativo de cambios ambientales, al análisis de
transcriptomas completos. “Genechips” (microarreglos) no-comerciales se
prepararon a partir de cDNAs y productos de amplificación de genes identificados en
hígado y/o mezcla de otros tejidos. El grupo de Cossins (Liverpool, Inglaterra)
desarrollo bibliotecas de cDNA de hígado, músculo y mezcla de tejidos, músculo,
corazón, intestino, branquias y cerebro de Cyprinus carpio,
(http://legr.liv.ac.uk/carpbase/library.htm) y provee enlaces a los bancos de datos del
pez cebra (Danio rerio, http://legr.liv.ac.uk/zfbase/index.htm). El grupo de Cossins midió
la expresión de todos los genes afectados por una disminución de temperatura
controlada, utilizando microarreglo para siete diferentes tejidos de carpas
aclimatadas (Gracey et al., 2004). Sin embargo, en éste análisis no se distinguieron
los factores de la glándula pituitaria, el cDNA estaba incluido en las muestras de
cerebro (Fraser, pers comm.). Hasta ahora, de acuerdo a nuestro conocimiento no
hay análisis de microarreglo específico sobre efectos de factores en la glándula
pituitaria.
62
El análisis de microarreglos en cambios de la expresión de los genes asociados
a la exposición de xenobióticos, constituye una metodología muy poderosa para
analizar todos los genes afectados en un tejido en un momento determinado. La
interacción del ER a escala genómica se evaluó a través de métodos novedosos,
“ChIP on chip”, secuenciación, perfiles de expresión en células del cáncer mamario
(Terasaka et al., 2004; Dietz and Carroll, 2008). En el modelo de peces, por un lado
éstas técnicas se enfocan en relacionar la expresión de genes en el hígado al
someter al pez a distintos disruptores endocrinos, por ejemplo un microarreglo de
carpa con muestras de hígado de carpas tratadas con distintos compuestos (Moens
et al, 2006).
En pez cebra (Danio rerio) se identificaron perfiles de expresión en muestras de
hígado, el órgano implicado en detoxificación, en peces expuestos a 17-β-estradiol,
bisfenol A y genisteina que modularon genes involucrados en metabolismo,
procesos de reproducción y desarrollo (Kausch et al., 2008). Se reveló la variación
en el perfil de expresión de 211 genes en peces tratados con β-estrógeno, 47 con
bisfenol y 231 con genisteina, los tres compuestos regularon genes involucrados en
metabolismo (Kausch et al., 2008). Genes específicos muchas veces se caracterizan
después con métodos más cuantitativos como qRT-PCR (Martinyuk et al., 2006).
Recientemente el grupo de Tyler analizó el impacto de exposición a E2 sobre la
expresión de genes involucrados en la regulación de un amplio repertorio de
funciones fisiológicas, entre ellos, efectos en la pituitaria (Filby et al., 2006). En
concordancia con nuestros resultados, ocurrió un leve aumento pero no
estadísticamente significativo para mensajeros de GH determinado por PCR en
tiempo real en pituitarias de Fathead minnow adultos, expuestos a 32 ng/L E2 por 14
dias (“flow through”) (Filby et al., 2006). Sin embargo, en estas muestras se detectó
63
un incremento de 7 veces de transcritos del receptor de estrógeno 1 esr1
(antiguamente receptor de estrógeno alfa), de 3,5 del receptor estrógeno 2a esr2a
(anteriormente receptor de estrógeno beta2 o gama) y 2 veces del receptor
estrógeno 2b esr2b (anteriormente receptor de estrógeno beta), 4 veces el receptor
de hormona de crecimiento ghr y 3 veces de insulin like growth factor 1 igf1 en
hembras, la baja significativa de la presencia de transcritos de esr2a en machos
(Filby et al., 2006). Claramente la expresión diferencial de diversos genes sugiere
efectos profundos a la glándula pituitaria (Filby et al., 2006). Por el contrario todos
estos genes medidos en cerebro no varían significativamente, excepto igf1, lo que
refuerza la importancia de la glándula pituitaria en el control y coordinación de la
adaptación molecular (Filby et al., 2006). El análisis por Northern blot en Salmo salar
juveniles después de tres días de una inyección de E2 mostró aumento por 5 veces
del LHβ, pero no alcanzó a revelar diferencias significativas para GH y tampoco para
Pit1 en hembras (Yadetie y Male, 2002).
Otro estudio reciente reporta sobre la citocromo P450 aromatasa, la enzima
que cataliza la conversión de androgenos en estrógenos y se mostró una fuerte
estimulación de la expresión por estrógeno durante el desarrollo en células glia en
pez cebra (Le Page et al., 2008). Para incluir genes del sistema nerviosos a la
evaluación del perfil de expresión en respuesta a estímulos estrogénicos, se
desarrolló una biblioteca de cDNA enriquecida por secuencias del hipotálamo de
Carassius aurata (Van der Ven et al., 2005). Ellos detectaron un total de 56 genes
expresados diferencialmente en cerebro del pez cebra, la mayoría mostró expresión
disminuida (Van der Ven et al., 2005).
El efecto de 17-α-etinilestradiol (EE2) en agua en la expresión de genes en
cerebro de Carassius auratus expuesto por 15 días se evaluó con un microarreglo de
64
secuencias de diversos tejidos de carpa y además secuencias de genes
enriquecidas en cerebro de una biblioteca substractiva de cDNA, especialmente en
hipotálamo de Carassius auratus (Martyniuk et al., 2006). El pez dorado y Cyprinus
carpio, pertenecientes a los cyprinidae, divergieron menos que 10 millones de años
atrás y por eso ocurrió hibridación cruzada en las secuencias estudiadas (Martyniuk
et al., 2006). Curiosamente tomaron como gen control el neuropeptido isotocina, que
no mostró variación significativa en hipotálamo. En el gen del precursor de isotocina
de carpa hemos identificado un elemento ERE en el cual se forma un complejo
especifico detectado en ensayos de retardo (Kausel et al., 2008). Actualmente se
está estudiando el efecto de estrógeno en la expresión de este gen. Sin embargo, la
determinación del perfil de la expresión de genes enriquecidos en cerebro mejora los
datos para evaluar riesgos asociados con disruptores endocrinos (Martyniuk et al.,
2006). Sin duda, el tratamiento con β-estrógeno induce un incremento de PRL en
hipófisis de carpa (Haussmann et al., 2006). La vía clásica implica la interacción con
el receptor junto con una proteína chaperona, la hsp90 (Fig.1). Al unirse con
estrógeno comienza la formación de homodimeros y la unión a secuencias de
respuesta a estrógeno (ERE), y con la formación de complejos con co-activadores
y/o represores modula la transcripción de genes blancos mostrados en la acción
sinergética de ER y Pit1 en el promotor de PRL (Sharp et al., 2006).
El efecto de estradiol en peces se relaciona con modulación de la expresión de
por lo menos 185 transcritos en hígado, el más conocido el gen vitelogenina. Un
sólido indicador para la exposición a estrógenos ambientales constituye la
transcripcion del gen vitelogenina en peces machos y tortugas (Lattier et al., 2001;
Tada et al., 2008). Sin embargo, en carpas aclimatizadas el tratamiento con
estrógeno incrementó los niveles de vitelogenina circulante en peces macho de
65
verano pero no en los de invierno y se sugirió como responsable por lo menos en
parte los niveles más bajos del receptor de estrógeno en carpas de la estación fría
(Hernandez et al., 1992).
Estradiol en peces tiene efectos marcados al sistema reproductivo mediado por
la pituitaria mientras que estradiol en agua resulta en un incremento de GH y del
factor de crecimiento tipo insulina en plasma del salmón de Atlántico juvenil
(McCormick et al., 2005).
El otro factor para el cual se diseñó un protocolo similar a GH, fue Pit1, factor
de transcripción específico de la glándula pituitaria que es requerido para la
regulación de la expresión de PRL, GH, subunidad β de la hormona estimulante de
tiroides (TSH-β) y su propio gen (Bodner et al., 1988, Ingraham et al., 1988). La
modulación espacial y temporal de la expresión de hormona de crecimiento se
correlaciona con la expresión de Pit1 en las células somatotropas (Kausel et al.
1999). La aplicación intraperitoneal de β-17-estradiol a carpas macho claramente
causó un esperado incremento de PRL en hipófisis (Haussmann et al., 2006). Pit1 y
ER son necesarios para la expresión de PRL estimulada por estrógeno (Yin y Lin,
2000; Sharp et al., 2006).
En el caso de Pit1 también se demostró que los dos genes presentes en el
genoma duplicado de la carpa están expresados en el mismo individuo (Kausel et
al., 2006). Para caracterizar la expresión de los dos genes en ensayos de RT-PCR,
con pares de partidores específicos para cada gen, podría eventualmente ocurrir una
competición irregular al amplificar los dos transcritos (Siebert y Larrick, 1993). Para
homologar la amplificación en la reacción de PCR de los dos genes de Pit1 se
diseñó un nuevo par de partidores que aparea en secuencias idénticas de los dos
genes de Pit1. Los productos se diferenciaron por el polimorfismo en un sitio de corte
66
para la enzima de restricción PstI. Por lo tanto se cuantificó la intensidad de los
fragmentos del mismo tamaño teñidos con bromuro de etidio en un gel de agarosa
los que corresponden al producto de amplificación de los dos genes y al lado al
correspondiente a uno de los genes. Con eso se optimizó la evaluación cuantitativa
de fragmentos de DNA en geles de agarosa (Siebert y Larrick, 1993). El análisis que
por razones de tiempo y falta de muestras no se alcanzó a terminar en esta tesis,
está montado para futuros estudios y para complementar el análisis por PCR tiempo
real de Pit1 frente a agentes xenobióticos. Sin embargo, el análisis por hibridación in
situ utilizando los oligonucleótidos gen-copia específica clarificó que el gen-I está
significativamente más expresado que el gen-II en pituitaria de carpas aclimatizadas
a invierno. No se sabe si esa diferencia de expresión temporal va a influir en la
expresión de los dos genes de Pit1 frente a la inducción por E2. El factor de
transcripción Pit1 constituye un muy importante nodo en la red de regulación
transcripcional en la glándula pituitaria (Rosenfeld et al., 2006). Con el sistema
montado durante la presente tesis será posible estudiar en más detalle el efecto de
E2 sobre la expresión de Pit1 en hipófisis de peces.
Por otro lado, se desarrollaron ensayos en cultivo celular para determinar
actividades de xenobióticos (Smeets et al., 1999). Para la detección de efectos
estrogénicos en agua se utilizó un bioensayo basado en líneas celulares
transformadas para detectar la serie de eventos normalmente inducidos por
compuestos estrogénicos (Willemsen et al., 2005). No obstante, la sensibilidad del
bioensayo es tan alta, que la evaluación es difícil por la ocasional toxicidad de
muestras aplicadas a las células y requiere la cuidadosa preparación de la muestra
sin introducción de trazas de estrógeno durante el procesamiento (Willemsen et al.,
2004). La estandarización de la preparación de los extractos del agua corroborará
67
futuros ensayos de monitoreo con peces expuestos a agua ambiental (Grothusen et
al., 2004).
En la industria de la salmonicultura, que en Chile se ha incrementado
tremendamente en los últimos años, los efectos de contaminación acuática son de
gran importancia para el desarrollo de los peces en cultivo y para la calidad del
producto final. En distintas épocas del año, según un estudio que identificó
contaminación orgánica en salmones, se reveló que los peces criados en Europa
están más contaminados que los de origen de América de Norte o del Sur (Hites et
al., 2004).
La carpa se ha utilizado como organismo modelo para los monitoreos de
cambios de temperatura, de estímulos estrogénicos o con otras sustancias nocivas
con genes marcadores como la vitelogenina o de transcriptomas completos de
hígado (Cossins et al., 2006; Moens et al., 2007a, b; Robbens et al., 2007). Sin
embargo, el desarrollo de biomarcadores más sensibles es muy importante para que
puedan ser usados como señales de alerta temprana indicando la exposición a
compuestos estrogénicos y con ello un potencial riesgo de efectos adversos a la
población de organismos acuáticos en la cadena alimenticia y finalmente a todos los
que utilizan el agua (Gunnarsson et al. 2007; Kidd et al., 2007).
68
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