Unidad 8
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MMÉÉTODOS TODOS MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICOSGICOS
Unidad VIII
![Page 2: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/2.jpg)
Cultivo de microorganismos en el laboratorio
Muestra Ambiental
Inoculación
Aislamiento
IdentificaciónBioquímicas
Tinción
Microscopia
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Toma de muestras
Materiales estérilesUso de guantes, cubrebocasToma de muestrasConservación de las muestras
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Medios de cultivo
Macronutrientes necesariosMacronutrientes necesarios
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Medios de cultivo
MicronutrientesMicronutrientes necesariosnecesarios
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Medios de cultivo
Factores de crecimientoFactores de crecimiento
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Medios de cultivoSoluciones nutritivas que se utilizan en el Soluciones nutritivas que se utilizan en el laboratorio para el cultivo de microorganismos.laboratorio para el cultivo de microorganismos.
QUIMICAMENTEQUIMICAMENTEDEFINIDOSDEFINIDOS COMPLEJOSCOMPLEJOS
![Page 8: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/8.jpg)
Medios de cultivoMedios de Cultivo para microorganismos que Medios de Cultivo para microorganismos que requieren nutrimentos simples o complejosrequieren nutrimentos simples o complejos
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Preparación de los medios de cultivo
•• Los medios sLos medios sóólidos se preparan igual que los llidos se preparan igual que los lííquidosquidos
•• Se agrega Se agrega agaragar al 1.5 %al 1.5 %
•• EsterilizaciEsterilizacióón de los medios de cultivon de los medios de cultivo
•• Vertido sobre placas de cristal o plVertido sobre placas de cristal o pláásticostico
•• SolidificaciSolidificacióónn
•• Prueba de esterilidad (incubaciPrueba de esterilidad (incubacióón)n)
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Técnicas de aislamiento
Permiten la obtenciPermiten la obtencióón de microorganismos a partir n de microorganismos a partir de muestras complejas:de muestras complejas:
SUELOSUELO AGUAAGUA ALIMENTOSALIMENTOS
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Técnicas de aislamiento
Existen diferentes mExisten diferentes méétodos para aislar microorganismos:todos para aislar microorganismos:
Enriquecimiento Enriquecimiento
Métodos de diluciónMétodos de dilución
Siembra en placa por extensiónSiembra en placa por extensión
Medios sólidos por estría en placaMedios sólidos por estría en placa
![Page 12: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/12.jpg)
Métodos de enriquecimiento y aislamiento
TECNICA DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
Cultivo y aislamiento de microorganismos en medios altamente selectivosselectivos.
Las muestras son inoculadas directamente al medio de cultivo.
Los restos de materia orgánica por la muestra puede favorecer el crecimiento de especies que no precisamente son selectivos del medio preparado.
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Métodos de enriquecimiento y aislamiento
Aislamiento de Aislamiento de AzotobacterAzotobacter
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Métodos de enriquecimiento y aislamiento
Columna de Columna de WinogradskyWinogradsky
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Método de dilución (Numero Mas Probable)
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Método de dilución (Numero Mas Probable)
10 ml N M P
PresuntivaC. Totales
1.0 ml
0.1
0.01
0.001
+++
+++
+++
0.0001
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Técnica asépticaSerie de procedimientos que evitan la contaminaciSerie de procedimientos que evitan la contaminacióón n durante la manipulacidurante la manipulacióón de los cultivos, muestras y medios n de los cultivos, muestras y medios de cultivos estde cultivos estéériles.riles.
![Page 18: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/18.jpg)
Técnica estría en placa
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Técnica estría en tubo
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Siembra en placa por extensión
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Siembra en profundidad
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Cultivo axénico o puroMedios de cultivo sMedios de cultivo sóólidoslidos
![Page 23: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/23.jpg)
Cultivos axénicos de alta tecnologíaPinzas lPinzas lááserser
![Page 24: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/24.jpg)
IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas
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IdentificaciónBioquBioquíímicasmicas
![Page 26: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/26.jpg)
Identificación
TINCIÓN
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IdentificaciónMicroscopía
![Page 28: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/28.jpg)
Identificación
Microscopio óptico
Campo claro
Contraste de fases
Campo oscuro
Fluorescencia
![Page 29: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/29.jpg)
Identificación
![Page 30: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/30.jpg)
Identificación
![Page 31: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/31.jpg)
No cultivables
![Page 32: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/32.jpg)
Nuevos métodos para cultivar bacterias (Katie Greene)
No todos los microorganismos pueden ser cultivables.
El cultivo de microorganismos tiene muchas ventajas (se
puede aislar de ellos, enzimas o antibióticos).
Recreación de condiciones naturales.
![Page 33: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/33.jpg)
Aislamiento de microorganismos no cultivables simulando un ambiente natural
(T. Kaeberlein, K. Lewis, S.S. Epstein)
Metodología:
Muestra: Sedimento marino.
Medios:
1) Cámaras con sedimento y agua marina, O2, membranas con nutrientes y químicos ambientales.
2) Placas Petri con caseína y caldo marino.
![Page 34: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/34.jpg)
Resultados:
* Crecimiento de diferentes formas en una semana.
* El 99 % de éstas no eran visibles.
* 300 veces más el número de colonias en las cámaras
que en las placas Petri.
* Microcolonias obtenidas en diferentes meses:
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Febrero Marzo Junio Julio Agosto Septiembre
![Page 35: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/35.jpg)
Aislaron 11 cepas puras (MSC1, MSC2 y otras 9).* Fueron diferenciadas y detectadas por formas macroscopicas (colonia) por microscopía y por técnicas moleculares (PCR y 16s rRNA).* En las placas crecieron las cepas MSC1 y MSC2 juntas.
![Page 36: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/36.jpg)
Métodos Moleculares16s rRNA
• 16s rRNA son de aproximadamente 1,500 nucleotidos.
• Contienen varias regiones altamente conservadas.
• Regiones que consiguen alinear las secuencias adecuadamente.
• Pero, presentan suficiente variabilidad de secuencias en otras regiones.
• Son excelentes cronómetros filogenéticos.
Ribosoma 70S Subunidad 50S
Subunidad 30S5S (120 nucleotidos)
16S (1500 nucleotidos)
23S (2900 nucleotidos)
![Page 37: Unidad 8](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022020503/568c4b7c1a28ab49169c57f2/html5/thumbnails/37.jpg)
Genome-enabledMuestras ambientales
Células DNA mRNA Proteínas
Cultivo Secuenciar Análisis con microsatélites
ProteomicsAmbiental
Secuenciación
Función de los genes
Modelo conceptual de genes
Inferencia de la funciónY regulación de las
Condiciones ambientalesDe los genes que se
expresan
Genoma Completo