SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

Rektor : prof. Ing. Mikuláš Látečka, PhD

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

Dekan : prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc.

MOLEKULÁRNE DETERMINANTY TECHNOLOGICKEJ KVALITY PŠENICE

Bakalárska práca

Katedra biochémie a biotechnológie

Vedúci katedry : doc. RNDr. Dana Urminská, CSc.

Vedúci bakalárskej práce : Ing. Milan Chňapek, PhD.

Študijný program : Bezpečnosť a kontrola potravín

Meno : Andrea Máliková

Nitra 2011

1

ČESTNÉ VYHLÁSENIE

Podpísaná Andrea Máliková vyhlasujem, že som bakalársku prácu na tému „Molekulárne determinanty technologickej kvality pšenice“ vypracovala samostatne s použitím uvedenej literatúry.

Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, horeuvedených nepravdivých údajov

V Nitre 10.mája 2011 --------------------------

2

POĎAKOVANIE

Touto cestou sa chcem poďakovať vedúcemu bakalárskej práce Ing. Milanovi Chňapekovi PhD., za odbornú pomoc, venovaný čas a poskytnuté cenné rady pri spracovaní bakalárskej práce.

V neposlednom rade patrí vďaka celej mojej rodine za ich neustálu morálnu podporu a trpezlivosť.

3

ABSTRAKT

Bakalárska práca je zameraná na spracovanie problematiky technologickej kvality pšenice na základe bielkovinových ,markerov a ich ovplyvňovanie kvality zrna.

V práci sa charakterizujú bielkovinové markery, predovšetkým vysokomolekulárne glutenínové subjednotky HMW-GS ako markery technologickej kvality zrna pšenice a ich vplyv na reologické vlastnosti cesta.

Technologická kvalita pšenice je v závislosti od zastúpenia zásobných bielkovín a to hlavne HMW-GS, ktoré sa využívajú ako molekulové markery na výpočet Glu-skóre pre určenie technologickej kvality pšeničného zrna.

Kľúčové slová : pšenica, bielkovinový marker, technologická kvalita, gliadíny,gluteníny,HMW-GS

4

ABSTRAKT

The thesis is focused on the processing problems of the technological quality of wheat based on protein, trace elements and their influence on grain quality. The work is characterized by protein markers, particularly high molecular weight glutenin subunits HMW-GS as markers of the technological quality of wheat grains and their impact on rheological properties of dough.

The technological quality of wheat is in stock depending on the representation of protein and especially HMW-GS, which are used as molecular markers to calculate the Glu-score overdetermined technological quality of wheat.

Keywords: wheat, protein marker, technological quality, gliadins, glutenins, HMW-GS

5

POUŽITÉ SKRATKY

Da Dalton (molekulová hmotnostná jednotka)

DNA deoxyribonukleová kyselina

Gli gliadín (y)

Glu glutenín (y)

HMW-GS high molekular weigh-glutenin subunit

(vysokomolekulová glutenínová subjednotka)

LMW-GS low molekular weigh-glutenin subunit

(nízkomolekulová glutenínová subjednotka)

SDS-PAGE polyakrylamidová gélová elektroforéza v

prostredí SDS

6

METODIKA A CIEĽ PRÁCE

Cieľom bakalárskej práce bolo urobiť literárny prehľad z problematiky identifikácie, diferenciácie a charakteristiky genotypov pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.) na základe genetických markerov.

Bakalárska práca bola kompilačného charakteru, teda vznikla prevzatím a novým zostavením už dosiahnutých vedeckých poznatkov a výskumov iných autorov.

Praktická časť nebola riešená.

Cieľom práce bolo preštudovanie bielkovinových markerov pšenice letnej formy ozimnej.

Materiál k štúdiu poskytovali vedecké zdroje zo svetových databázach a Slovenská poľnohospodárska knižnica v Nitre. Metodika spočívala vo vyhľadávaní vedeckých

prác, z dostupných zdrojov, naštudovaní predloženej problematiky a  následnou

úpravou do ucelenej formy.

7

Obsah

ÚVOD ...................................................................................................................7

CIEĽ A METODIKA PRÁCE ...........................................................................9

1 PREHĽAD LITERATÚRY ..........................................................................10

1.1 VŠEOBECNÁ CHARAKTERISTIKA OBILNÍN ..............................10

1.1.1 Charakteristika pšenice letnej ............................................................10

1.1.2 Botanická charakteristika pšenice .....................................................10

1.1.3 Anatomická stavba zrna ....................................................................14

1.1.4 Chemické zloženie zrna .....................................................................15

1.1.5 Základné zloženie obilných bielkovín ..................................................18

1.1.5.1 Využiteľnosť bielkovín .............................................................19

1.1.5.2 Glutén - Lepok ..........................................................................20

1.2 MOLEKULÁRNE MARKERY ............................................................21

1.2.1 Parametre genetických markerov ........................................................22

1.2.3 Bielkovinové markery pšenice ............................................................24

1.2.4 Zásobné bielkoviny .............................................................................25

1.2.4.1 Gliadíny .....................................................................................26

1.2.4.2 Gluteníny ...................................................................................26

1.2.4.3 HMW a LMW-glutenínové podjednotky ..................................28

1.2.5 Chromozómová lokalizácia génov ......................................................29

1.3 VPLYV ZÁSOBNÝCH BIELKOVÍN NA KVALITU ZRNA PŠENICE 31

1.3.1 HMW podjednotky - vzťah k pekárskej kvalite .....................................31

1.3.1.1 Hodnotenie kvality - Glu skóre .....................................................33

1.3.2 Zvyšovanie technologickej kvality pšenice ............................................34

1.4 ZÁVER ........................................................................................................35

1.5 ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ....................................................36

8

ÚVOD

Obilniny tvoria ekonomicky, agronomicky, a aj spotrebiteľsky najdôležitejšiu

skupinu plodín v štruktúre celej rastlinnej výroby. Pestujú sa v prvom rade pre zrno na

konzum, výživu zvierat, na priemyselné spracovanie a na osivo.

Cereálie najlepšie zodpovedajú súčasným predstavám zdravej a racionálnej výživy.

V ľudskej výžive zabezpečujú dnes rozhodujúcu časť energetického príjmu

z potravín a nemalý podiel i z celkového príjmu bielkovín.

Najviac pestovanou obilninou na Slovensku i vo svete je pšenica letná, ktorá

zabezpečuje pre organizmus prísun nevyhnutných látok.

Pšenica obsahuje všetky výživné látky. Hlavnou zložkou sú glycidy, bielkoviny,

minerálne látky, vitamíny (B a E).

Charakteristika, rôznorodosť a identifikácia rastlín je v závislosti od rastlinného

genómu. Niektoré rastlinné genotypy je možné rozlíšiť pomocou polymorfizmu

bielkovín a pri iných použitím DNA profilov.

Molekulárne markery umožňujú ľahko a vhodne identifikovať hybridy, kultivarové

odrody, umožňujú sledovať evolučné vzťahy medzi jednotlivými druhmi. Pestované

druhy pšenice sa vyznačujú najširším spektrom kvalitatívnych parametrov a preto

identifikácia je nevyhnutná pri ich pestovaní.

Z molekulárnych markerov sú najrozšírenejšie DNA markery, pretože sú odrazom

kódujúcich i nekódujúcich sekvencií nukleotidov DNA.

DNA markery nie sú ovplyvnené vývojom rastliny ani agroekologickými

podmienkami pestovania.

Bielkovinové markery stanovujú pôvod kultúrnych rastlín na základe bielkovín

semien, určuje sa podľa nich štruktúra genómu, presná genómová analýza, detekcia línií

a mutantov.

V oblasti biotechnického výskumu sa pozornosť sústreďuje na vypracovanie

objektívnych metód hodnotenia kvality produkcie, kde sa aktuálne venuje problematike

9

detekcie markerov na úrovni polymorfizmu DNA a bielkovín. Cieľom je tvorba nového

genetického materiálu s požadovanými kvalitatívnymi ukazovateľmi.

Aj keď je venovaná dostatočná pozornosť identifikácii genotypov rastlín, mnoho

rastlinných druhov z hľadiska hospodárskej významnosti neboli identifikované

a diferencované na molekulárnej úrovni.

10

1 PREHĽAD LITERATÚRY

1.1 Všeobecná charakteristika obilnín

V historickom vývoji ľudstva majú obilniny najdôležitejšie postavenie spomedzi

poľných plodín. Obilniny sa pestujú v prvom rade pre zrno na konzum, výživu zvierat,

na priemyselné spracovanie a na osivo. V ľudskej výžive zabezpečujú dnes rozhodujúcu

časť energetického príjmu bielkovín. V rozvojových krajinách je denná energetická

potreba krytá zo 60 – 80 % obilninami, vo vyspelých krajinách z 20 – 40 %.

Obilniny majú výhodný pomer obsahu základných výživných látok – glycidov

a bielkovín, sú zdrojom minerálnych látok a vitamínov skupiny B.

Pšenica je našou základnou obilninou. Zrno sa využíva k výrobe chleba, pečiva,

krúp, cestovín a v cukrárstve. Vlastnosti chleba a pečiva závisia od chemického zloženia

zrna, najmä bielkovín, ktoré vytvárajú lepok s mimoriadnym významom pri pečení

chleba (Pospišil et al., 2007).

Pšenica a jačmeň patria medzi plodiny zaberajúce najväčšiu pestovateľskú plochu.

Pšenica letná f. ozimná sa v Slovenskej republike pestuje na ploche 394 tisíc

hektárov, jačmeň ozimný na ploche 30 tisíc hektárov. Pšenica patrí medzi prvé

pestované rastliny. I v súčasnosti zostáva prioritným článkom potravinového reťazca

(Kraic, Šliková et al., 2002).

Využíva sa tiež ako surovina k výrobe celého radu dôležitých látok – lepkové

bielkoviny, lepidlá a iné chemikálie (Karabínová et al., 1997).

Pšeničné šroty a otruby predstavujú vysokokoncentrované uhľohydrátové krmivo so

širokým pomerom dusíkatých látok k energii 1:8,5 – 11,5 vhodné pre všetky druhy

hospodárskych zvierat. Ku kŕmeniu sa využívajú odrody s horšou pekárskou kvalitou

(Karabínová, Molnárová, Gregorová, 1995)

Podľa Zimolku et al. (2005) časť potravinárskej pšenice putuje do kŕmnych fondov

hoci z hľadiska krmivárskych požiadaviek na skladbu bielkovín zrna tomuto účelu

vôbec nevyhovuje. Ide predovšetkým o nežiadúci podiel bielkovín tvoriacich lepok,

11

hlavne málo rozpustné frakcie prolamínov a glutenínov. Tie sú príčinou nižšej

konverzie bielkovín v tráviacom trakte monogastrických zvierat. Tiež koncentrácia

esenciálnych aminokyselín nesplňuje nároky krmivárov.

1.1.1 Charakteristika pšenice letnej (Ttriticum aestivum L)

Pšenica je prastará rastlina, počiatky jej pestovania úzko súvisia so vznikom

poľnohospodárstva v 10.-8. tisícročí pred n. l. (Karabínová et al., 1997).

Za pravlasť pšenice považujeme územie Prednej a Malej Ázie. Archeologické nálezy

z tohto obdobia dokazujú pestovanie pšenice jednozrnnej (Triticum monococcum L.)

a pšenice dvojzrnnej (Triticum dicoccum). V 6 . tisícročí pred n. l. sa začala pestovať

pšenica obyčajná (Triticum aestivum L) a pšenica špaldová (Triticum spelta L.), ktorá je

známa len z archeologických nálezov v Európe (Špaldon et al., 1982).

Divé formy pšenice Triticum dicoccoides a Triticum boeticum dali vznik kultúrnym

formám pšenice jednozrnovej a dvojzrnovej. Na naše územie sa pšenica naplno rozšírila

na začiatku slovanského osídlenia, t.j. od 5.storočia n. l. Do Ameriky sa jej pestovanie

rozšírilo až z Európy (Karabínová et al., 1997).

1.1.2 BOTANICKÁ CHARAKTERISTIKA PŠENICE

Rod pšenica (Triticum L.) patrí do čeľade lipnicovitých (Poaceae). Zahŕňa niekoľko

jej druhov a veľký počet foriem a kultivarov. Hlavné sú dva druhy : pšenica obyčajná

(Triticum aestivum L., syn Triticum vulgare Host.) a pšenica tvrdá (Triticum durum

Desf.)

Rod pšenica sa delí na 3 podrody :

1. diploidné pšenice so 14 chromozómami (2n = 14)

2. tetraploidné pšenice s 28 chromozómami (2n = 28)

3. hexaploidné pšenice so 42 chromozómami (2n = 42) (Špaldon et al,1982).

12

Z pozorovania hybridov pšenice a vzájomných vzťahov ich genómov v meióze

vyplýva, že diploidy majú majú 2n = 4x = 14 a genóm AA, tetraploidy 2n = 4x = 28

a genóm AABB a hexaploidy 2n = 6x = 42 a genómy AABBDD. Z toho je zrejmé, že

tetraploidy vznikli ako výsledok kríženia medzi diploidmi AA a BB a následného

zdvojnásobenia chromozómov (AA x BB =AB ---AABB). Hexaploidy vznikli z kríženia

tetraploidov s diploiným druhom – donorom genómu D a opätovného zdvojnásobenia

chromozómov (AABB x DD = ABD ---AABBDD). (J.P.Laptev, 1988).

Každý podrod môžeme ďalej deliť na tri typy :

a) bezplevnaté, nahé pšenice ( s pevným klasovým vretenom a zrnom ležiacim

voľne v plevách),

b) plevnaté pšenice ( s lámavým klasovým vretenom a zrnom pevne uzavretým

v plevách,

c) nekultúrne, plané pšenice ( s lámavým klasovým vretenom a plevnatým zrnom

(Špaldon et al., 1982).

V rámci jednotlivých typov je niekoľko druhov, ktoré na základe farby pliev, farby

zrna, ostennosti plevice sa delia na variety (Karabínová et al., 1997).

Zo všetkých druhov sa najviac pestuje pšenica letná, zaberá 80 – 90% z celkovej

plochy. Je mnohozrnný, morfologicky a ekologicky značne plastický druh. Má ozimné

a jarné formy (Pospišil et al., 2007)

Pšenica siata (Obr.1) má nelámavý klas, ostinatý alebo bezostinatý, rôzne hustý.

Plevy aj plevice sú vajcovité alebo podlhovasto vajcovité, so zreteľnou ryhou. Zrno je

nahé, bucľatejšie, na reze oblé, s mierne vystúpeným klíčkom, na protiľahlej strane

s briadkou (Zimolka et al., 2005)

Používa sa na výrobu múky, krupice, škrobu. Je veľmi výživná, obsahuje vitamín B

(najmä v klíčkoch), lepok (glutén) je dôležitý pri pekárenských výrobkoch. (Baranec,

Poláčiková, Košťál, 1998).

13

Obr. 1: Pšenica letná forma ozimná (Triticum aestivum L.)

Pšenica tvrdá ( Obr.2) je po pšenici letnej rozšírená najviac, plevice majú ostiny,

zriedkavo sú bezostinaté. Má ozimné a jarné formy (Pospišil et al., 2007).

Obr. 2: Pšenica tvrdá (Triticum durum DESF.)

Má tuhé väčšinou plné steblá. Zrno i endosperm sú tvrdé. (Baranec, 1988)

Patrí do skupiny tetraploidných pšeníc. Jej plevy majú takmer zhodnú dĺžku

s plevicami. Zrno je sklovité, trojhranné s vpadnutým klíčkom, bez briadky, lepok je

14

vhodný k výrobe cestovín. Zrno pšenice tvrdej sa vyznačuje obsahom pevného lepku,

ktorý nie je vhodný na pečenie chleba a iných pekárenských výrobkov, pretože vytvára

malý objem pečiva. (Zimolka et al., 2005)

Významná je tiež Triticum spelta L. (Obr.3), ktorá je charakteristická vyšším

obsahom bielkovín s priaznivým aminokyselinovým zložením, minerálnych látok, tuku,

vlákniny a vitamínov. Má liečivé účinky a je oveľa ľahšie stráviteľná ako ostatné druhy

obilnín (Hanzlíková, 2010).

Špalda patrí medzi hexaploidné druhy so 42 chromozómami. Má plevnaté zrno,

lámavé klasové vreteno a spolu s nízkou reakciou na hnojenie dusíkom i väčšou

poliehavosťou malo za následok jej nahradenia pšenicou siatou. Zrno špaldy je však

viacej cenené pre vyšší obsah bielkovín, tuku, minerálnych látok, vitamínov

a esenciálnych aminokyselín v porovnaní s koncentráciami v zrne pšenice siatej. Tiež

má vyšší obsah lepku, avšak horšej kvality. Klásky sú štvorkveté, len dva kvietky sú

plodné, zrno je pevne uzavreté v plevách. Pestuje sa ozimná aj jarná forma. Využíva sa

na výrobu cestovín (Schwaben-spätzle) alebo nedozreté obilky (Grunkern) ako prísada

do polievok (Zimolka et al., 2005)

Obr. 3: Pšenica špalda (Triticum spelta L.)

15

Tab. 1 Prehľad druhov pšenice (Triticum) (Příhoda, Skřivan, Hrušková, 2004)

Počet chromozómov Druhový názov

14 jednozrnná monococcum

28 Dvojzrnná dicoccum

tvrdá,cestovinová durum

Poľská polonicum

hrubozrnná turrgidum

42 obyčajná,pekárska aestivum

Špaldová spelta

Nakopená compactum

guľatozrnná sphaerococcum

1.1.3 ANATOMICKÁ STAVBA ZRNA

Plod – obilné zrno z botanického hľadiska je jednosemenná nažka

(caryopsis).Skladá sa z troch základných častí:

1. zárodok (embryo), tvorí 1,5 – 4,5% z hmotnosti zrna,

2. jadro (endosperm), 84 – 86%,

3. obaly (ektosperm), 10,0 - 14,5%

Podľa toho, či zrno má plevy, alebo ich nemá existujú obilniny s plevnatým zrnom,

alebo nahým zrnom. Najväčšiu časť zrna tvorí jadro (endosperm), v ktorom sú uložené

rezervné látky. Vytvára ho tenkostenné parenchymatické pletivo vyplnené zrnkami

škrobu a smerom k obvodu zrna aj bielkovinami, tvoriacimi podstatu lepku.

Najvrchnejšia vrstva buniek endospermu je anatomicky odlišná a nazýva sa aleurónová

vrstva (Pospišil et al., 2007).

16

Aleurónová vrstva sa skladá z vrstvy obdĺžnikovitých buniek. (Muchová, 2001).

Najdôležitejšou časťou zrna z hľadiska rozmnožovania je zárodok čiže klíčok

(embryo) (Pospišil et al., 2007).

Klíčok tvorí najmenší, avšak kolísajúci podiel zrna; u kukurice 5 až 15%, u pšenice

iba 3%.

Obaly zaberajú 8 – 14% hmotnosti zrna. Sú tvorené niekoľkými vrstvami buniek, ktoré

chránia klíčok a endosperm pred vysychaním a mechanickým poškodením.

Oplodie (perikarp) tvorí pokožka (epidermis), bunky pozdĺžne (epicarp), bunky priečne

(mesocarp) a bunky hadicové (endokarp).

Osemenie (perisperm, testa) je tvorené vrstvou farebnou a hyalinnou (sklenou).

(Frančáková, Čuboň, Michalcová, 2007).

1.

2. Oplodie a osemenie

3.

4. Aleurónová vrstva

5. Endosperm

6. Embryo

7. Koreňový zárodok

8. Pošva klíčka

9. Štítok

10. Briadka

Obr.4: Stavba zrna pšenice

http://www.obz.hr/vanjski/CD_AGBASE2/HTM/psenica.htm

1.1.4 CHEMICKÉ ZLOŽENIE ZRNA

Chemické zloženie (Tab.2) zrna obilnín kolíše podľa druhu, odrody, pôdno-

klimatických podmienok (lokalita, stanovište), agrotechniky (hnojenie, ochrana atď.) a

počasia v konkrétnom roku. (Muchová, 2001).

17

Podľa Špaldona et al., (1982), pšeničné zrno obsahuje priemerne 13,6% vody, 10 –

16% bielkovín, 63,8% bezdusíkatých extraktívnych látok, 2,2% hrubého tuku, 2,4%

buničiny a 2%.

Macevilly (2004) uvádza, že cereálne zrno sa skladá z dvoch hlavných častí: z vody

a sušiny. Obsah vody je približne 12 – 15%, zostatok je sušina. V nej je obsiahnutých

približne 75 % sacharidov, 10 – 15 % proteínov, 2 % lipidov.

Tab. 2 Zastúpenie hlavných zložiek v jednotlivých častiach zrna pšenice (Muchová,

2001)

Znak

Časť zrna

Popol

v %

Bielkoviny

v %

Tuk

v %

Vláknina

v %

Pentózany

v %

Oplodie 3,0 10,7 0,9 26,6 47,9

Osemenie 13,0 17,8 - 1,3 34,5

Aleurón 10,9 31,7 9,1 6,6 28,3

Zárodok 5,8 34,0 27,6 2,4 -

Endosperm 0,61 12,6 1,6 0,3 3,3

Celé zrno 1,9 14,7 2,7 2,9 8,2

Obilniny sú významným zdrojom energie, sú hlavne zdrojom glycidov, ktoré sa

nachádzajú v endosperme a z nich najväčší podiel tvorí škrob. (Prugar, Hraška, 1986).

Sacharidy tvoria podstatnú časť sušiny zrna (65 – 85%) (Muchová et al.,2011)

(tab.3)

Nachádzajú sa v zrne vo forme cukrov, dextrínov, škrobu, hemicelulóz a celulózy.

Pentózy sa nachádzajú hlavne v obalových vrstvách a bunkových stenách endospermu.

Z hexóz má najväčší význam glukóza, ako základný kameň pre tvorbu škrobu

a celulózy (Frančáková, Čuboň, 2007).

Ďalší polysacharid v obilnom zrne je celulóza (vláknina). Nachádza sa v obalových

vrstvách zrna v oplodí a osemení. (Prugar, Hraška, 1986).

Celulóza a hemicelulózy sú hlavnou zložkou otrubnatých častíc v múke a tvoria

podstatný podiel cereálnej vlákniny. (Frančáková, Čuboň, 2007).

18

Tab. 3 Zastúpenie niektorých sacharidov v pšenici (Muchová, 2001)

Druh Škrob Pentózan

y

Hrubá

vláknina

Sacharóza Maltóz

a

Glukóza Fruktóza

Pšenica 58-76 7,0-8,0 2,4-2,6 0,6-1,0 0,5-2,0 stopy stopy

Pri uskladňovaní obilnín a výrobkov majú veľký význam tuky zrna. Ich obsah je

v obilninách nízky v priemere 1,5%. Najvyšší obsah je v klíčkoch a v aleurónovej

vrstve 7 – 12%, najmenej ich je v endosperme.(Karabínová et al., 1997).

Vitamíny ich obsah v pšeničnom zrne je relatívne nízky, iba vitamíny zo skupiny B

sú vo významnom zastúpení (Grundas, 2003).

Veľmi dôležitú zložku pšeničného zrna tvoria bielkoviny (Prugar, Hraška, 1986).

Kvalitu bielkovín určuje zloženie aminokyselín. Všeobecne možno povedať, že čím

viac druhov aminokyselín bielkoviny obsahujú, tým vyššia je hodnota pšeničného zrna.

(Špaldon et al.,1982).

Ich zoradenie v molekule určitej bielkoviny daného biologického druhu je

charakteristické a geneticky určené; nazýva sa primárna štruktúra bielkoviny a zapisuje

sa spravidla skratkami aminokyselín (Val = valín, Lys = lyzín a pod.) (Rosypal et al.,

1994).

Esenciálne (nepostrádateľné) aminokyseliny sú tie, ktoré si organizmus vyšších

živočíchov s jednoduchým žalúdkom (monogastri) syntetizuje v nedostatočnej miere

alebo ich syntetizovať de novo nevie vôbec a musí ich prijať v potrave.

Pri rastlinných bielkovinách sa uvádza, že nie sú plnohodnotné, tzn. že neobsahujú

všetky esenciálne aminokyseliny v dostatočnom zastúpení. Najčastejšie uvádzanou

limitujúcou aminokyselinou v cereáliách je lyzín, ktorý je minimálne zastúpený

v bielkovinách obilovín (pšenica, ryža, kukurica) a cereálnych výrobkoch, kde jeho

limitujúce množstvo je predovšetkým v gliadínoch, na rozdiel od glutelínov

(bielkovinové frakcie rôznej rozpustnosti) (J. Prugar et al., 2008).

19

V obilovinách je dominantnou AMK kyselina glutámová, ktorá je prítomná vo forme

svojho amínu – glutamínu, predstavuje viac ako 1/3 z celkového obsahu aminokyselín.

Prolín je v poradí druhý najviac zastúpená AMK a to viac ako 10 % - ným zastúpením

v pšeničnej bielkovine. Vďaka svojmu štruktúrnemu usporiadaniu dáva predpoklady

k vytvoreniu pružnej priestorovej bielkovinovej štruktúre pšeničného cesta (Kučerová,

2004).

1.1.5 ZÁKLADNÉ ZLOŽENIE OBILNÝCH BIELKOVÍN

Obilné bielkoviny môžeme klasifikovať podľa niekoľkých hľadísk. Podľa

morfologického pôvodu rozlišujeme bielkoviny endospermu, aleurónovej vrstvy

a zárodočné, pochádzajúce z klíčka.

Podľa biologickej funkcie v rastline môžeme rozlíšiť bielkoviny metabolicky aktívne,

tzn. cytoplazmatické s funkciami v bunke (napr. enzými, membránové, zložky

ribozómov a pod.) a zásobné, ktoré môžeme rozdeliť na nízkomolekulové

a vysokomolekulové (Příhoda, 2004).

Zásobné bielkoviny: klasifikáciu, podľa rozpustnosti, vypracoval T.J. Osborne už

v roku 1924 a je orientačne používaná dodnes. Podľa nej rastlinné semenné bielkoviny

klasifikujeme do 4 skupín:

albumíny – rozpustné vo vode

globulíny – rozpustné v roztokoch solí

prolamíny – rozpustné v alkohole

glutelíny - rozpustné v slabých kyselinách alebo zásadách (Kraic, 2004).

Z bielkovín sa vo vode rozpúšťa len albumín. Skupina bielkovín nerozpustných vo

vode tvorí lepok. Táto skupina bielkovín je tvorená v podstate dvoma frakciami:

gliadínmi a glutenínmi. Gliadíny ľahko podliehajú peptizácii a majú emulzoidný

charakter. Gluteníny majú vlastnosti stužujúce. Pomer gliadínu a glutenínu určuje

kvalitu lepku (Karabínová et al., 1997).

Podľa funkčného významu bielkovinových zložiek sa bielkoviny delia:

a) Protoplazmatické, ku ktorým zaraďujeme:

20

katalytické bielkoviny – albumíny a globulíny. Tieto bielkoviny sú enzymaticky

aktívne, vyznačujú sa amylázovou a proteázovou aktivitou.

Konštitučné bielkoviny – s nukleovými kyselinami a lipidmi tvoria štruktúry

cytoplazmy a jadra.

b) Zásobné – patria sem prolamíny a glutelíny, ktoré rozhodujú o kvalite zrna (Gálová

et al., 2008).

Frakcia prolamínová je rozpustná v 70% alkohole, je značne heterogénna, skladá

sa z mnohých zložiek (α,β,γ,ω) a nachádza sa vo všetkých obilninách: gliadín v pšenici,

hordeín v jačmeni, avenin v ovsi, zein v kukurici.

Frakcia glutelínová je rozpustná v roztokoch slabých kyselín a zásad a je doteraz

najmenej preštudovaná. Je tvorená zmesou bielkovinových podjednotiek, kde sa

uplatňujú vodíkové a disulfidické väzby, čím sa dosahuje vysoká molekulová hmotnosť

(Frančáková, Čuboň, 2007) .

1.1.5.1 VYUŽITEĽNOSŤ BIELKOVÍN

Biologická hodnota bielkovín (BHB) je súčasťou výživnej hodnoty bielkovín.

Výživná hodnota bielkovín obilnín je nízka a je podmienená vysokým podielom

proteínových frakcií typu prolamínov, ktoré sa vyznačujú nízkym obsahom

esenciálnych aminokyselín (lyzín, metionín, arginín a podobne) a naproti tomu

vysokým podielom neesenciálnych aminokyselín (kyselina glutámová, prolín). (Gálová

et al., 2008.)

Prevažná časť cereálnych tzv. zásobných bielkovín zrna je lokalizovaná

v endosperme, ktorý zahrňuje viac ako 80% štruktúry zrna. Zásobné bielkoviny

v endosperme vytvárajú bielkovinový komplex. Zásobné bielkoviny typu prolamínov

a glutelínov, na ktoré pripadá okolo 70% z celkového obsahu bielkovín sa vyznačujú

unikátnou schopnosťou vytvárať charakteristickú štruktúru pšeničného lepku, čo je

dôležité pri výrobe chleba a výrobkov z múky. Avšak nízka rozpustnosť

i hydrolizovateľnosť spôsobuje ich nedostatočnú stráviteľnosť.

Okrem nízkeho obsahu, ale najmä nevyrovnaného zastúpenia esenciálnych

aminokyselín, k ďalším závažným negatívom zásobných bielkovín patrí prítomnosť

hemaglutenínov, purotonínov, inhibítorov amyláz, proteáz ale i alfa-gliadínových

21

bielkovín, ktoré spôsobujú malabsorpčný syndróm glutan senzitívnej enteropatie známy

pod názvom celiacea sprue (celiakiálne ochorenie) (Michalík, 1998).

1.1.5.2 GLUTÉN - LEPOK

Medzi najdôležitejšie bielkoviny našej najvýznamnejšej chleboviny – pšenice – patrí

gliadín a glutenín, ktoré tvoria tzv. lepok, t.j. pružnú a ťažnú hmotu, ktorá sa získa

vypieraním cesta slabým prúdom vody, čo zistil už v roku 1728 Beccari. Po vypraní

zostávajú v lepku adsorbované asi 2% cukru, 6% škrobu, 2% lipidov a iných zložiek.

V kvalitnom, pružnom tuhšom a dobre napučiavateľnom lepku bol zistený vyšší

podiel glutenínu ( vysokomolekulárne zásobné pšeničné bielkoviny, HMW-GS)

(Muchová et al., 2001, Muchová et al., 2011).

Čo sa týka konštitúcie lepku, tvorí lepok podľa moderných predstáv trojrozmernú

sieť peptidických reťazcov, rôznym spôsobom zriasených a prepojených navzájom

rôznymi mostíkmi a väzbami, kde určitý význam má aj vrstvička lipidov. Rozdiely

v usporiadaní tejto štruktúry sa považujú za príčiny rôznych vlastností lepku.

(Frančáková, Čubon, 2007).

1.2 MOLEKULÁRNE MARKERY

22

Potreba identifikácie, diferenciácie a verifikácie genotypov rastlín vyplýva

z praktických požiadaviek šľachtenia, skúšobníctva a povoľovania novovytvorených

odrôd, ich patentovej ochrany, multiplikácie v semenárskej výrobe, obchodných

vzťahoch pri nákupe a predaji osív, spracovateľských vzťahoch, ochrany autorských,

licenčných a iných práv. Súčasná a budúca orientácia v oblasti identifikácií rastlinných

genotypov smeruje k analýzam na úrovni polymorfizmu bielkovín a DNA.

Existuje niekoľko prístupov k idetifikácii genotypov rastlín v závislosti od

rastlinného druhu. Vzájomnú diferenciáciu a rozlišovanie genotypov je možné

vykonávať na viacerých kvalitatívnych úrovniach ako sú :

1. Morfologicko – agronomické hodnotenie : a) makro – a mikroanatómia

b) agronomické parametre

2. Technologické ukazovatele : a) sekundárne metabolity

b) iné chemické zložky

3. Karyologické pozorovania : a) počet chromozómov

b) morfológia chromozómov

4. Analýza bielkovín : a) zásobné bielkoviny

b) izoenzými

c) sekvencia bielkovín

d) štúdium protilátok – imunológia

5. DNA analýzy : a) Hybridizačné techniky – založené na princípe hybridizácie

DNA

b) Amplifikačné techniky – založené na princípe PCR reakcie

c) Amplifikačno – hybridizačné – kombinácia dvoch predošlých

(Gálová et al., 2008).

1.2.1 PARAMETRE GENETICKÝCH MARKEROV

Genetické markery odhaľujú genóm rastliny prejavujúci sa v určitých podmienkach

vonkajšieho prostredia. Jednotlivé typy markerov nie sú rovnako citlivé na ich vplyv.

23

Vhodný genetický marker by mal spĺňať nasledovné, všeobecne platné kritériá:

Parametre vhodných genetických markerov

Vysoká úroveň variability (polymorfizmu)

Vysoký stupeň dedičnosti

Distribúcia po celom genóme rastliny (lokalizácia na viacerých chromozómoch)

Stabilita v rôznych vonkajších podmienkach

Ľahká, rýchla dostupnosť bez potreby opakovania

Možnosť sledovania vo všetkých fázach rastu

Jednoduchá genetická interpretácia

Jednoznačnosť a presnosť

Vysoká reprodukovateľnosť v rámci medzi testovacími pracoviskami

Nízka cena stanovenia (Kraic, 2004).

1.2.2 DNA MARKERY

Molekulárne markery sa využívajú na identifikáciu genotypov, detekovanie

rôznorodosti medzi organizmami, identifikáciu hybridov a pod. V rastlinnom systéme

boli pomocou nich vytvorené rozsiahle genetické mapy pri viacerých rastlinách:

pšenica, jačmeň, ryža a mnohé iné (Agarwal et al., 2008).

Termín molekulárny marker je používaný pre mnohé techniky, ktoré sú zamerané na

hodnotenie variability na úrovni DNA (Koebner et al., 1994).

DNA markery nie sú ovplyvnené štádiom vývinu rastliny ani agroekologickými

podmienkami pestovania. Súčasné analýzy polymorfizmu DNA sú založené buď na

hybridizácii DNA (hybridizačné techniky) alebo na princípe amplifikácie DNA

pomocou PCR (amplifikačné techniky) (Gálová et al., 2008) (tab.4).

Rastlinná bunka obsahuje 3 typy deoxyribonukleovej kyseliny. DNA v natívnom

stave je prítomná vo všetkých živých bunkách rastliny, dá sa extrahovať, manipulovať

s ňou a elektroforeticky separovať. Základnými princípmi manipulácie s DNA, pre

účely hľadania polymorfizmu, sú štiepenie, hybridizácia, amplifikácia a elektroforetická

detekcia (Kraic, 2004).

24

Tab.4 Prehľad techník detekcie DNA polymorfizmu ( Gálová, et al., 2008)

Techniky detekcie DNA polymorfizmu

1. Hybridizačné RFLP(Restriction Fragment Lenght

Polymorphism)

DNA fingerprinting

2. amplifikačné

a) náhodné primery

b) polonáhodné primery

RAPD (Randomly Amplified

Polymorphic DNA)

DAF (DNA Amplification fingerprinting)

AP – PCR (Arbitrarily Primed – PCR)

AFLP (Amplified Fragment Lenght

Polymorphism)

MP-PCR (Microsatellite Primed – PCR)

ISSR ( Inter – SSR Amplification

c) špecifické primery STS (Sequence Tagged Sites)

SCAR (Sequence Characterized

Amplified Region)

CAPS ( Cleaved Amplified Polymorphic

Sequences)

IRAP ( Inter – Retrotransposon Amplified

Polymorphism)

EST – SSR ( Expressed Sequence Tag –

SSR

STMS ( Sequence Tagged –

Microsatellite Sites)

d) kombinácia rôznych primerov RAMP ( Random Amplified Polymorphic

Microsatellites)

SAMPL ( Selective Amplification of

Microsatellite Polymorfic Loci

REMAP ( Retrotransposon –

Microsatellite Amplified Polymorphism)

3. amplifikačno - hybridizačné RAMPO ( Random Amlified

25

Microsatellite Polymorhism)

1.2.3 BIELKOVINOVÉ MARKERY PŠENICE

Bielkoviny sú produktom translačného procesu, teda výsledkom poradia nukleotidov

DNA do poradia aminokyselín bielkovinového reťazca, ktorá vznikne medzi - OH

skupinou z karboxylového konca jednej AMK a - NH₂ skupinou druhej AMK za

súčasného odštiepenia molekuly vody. Rôznorodosť molekúl bielkovín, nachádzajúcich

sa v živých organizmoch, je predpokladom obrovského rozsahu bielkovinovej

variability aj pri rastlinách. Pre sledovanie variability obsahu molekúl bielkovín je teda

nevyhnutná izolácia, separácia a diferenciácia bielkovinových molekúl (Kraic, 2004,

Kopáčová, 2007).

Pšeničný endosperm má štatisticky najvyšší podiel bielkovín s najväčšou

makromolekulovou a najvyššími molárnymi hmotnosťami.

Tradične boli doteraz popisované gliadíny (prolamíny) pšenice ako jednoreťazcové

makromolekuly, zatiaľ čo gluteníny majú makromolekuly zložené z viacerých reťazcov.

(Příhoda, Skřivan, Hrušková, 2004).

Glutelínová frakcia zahŕňa veľa rozdielnych molekúl od jednoduchých

polypeptidických reťazcov s pomerne nízkou molekulárnou hmotnosťou až po

molekulárne útvary, zložené z viacerých polypeptidických reťazcov, nazývaných

podjednotky, navzájom prepojených disulfidovými väzbami (Muchová et al., 2011).

1.2.4 ZÁSOBNÉ BIELKOVINY

Unikátnosť zásobných bielkovín spočíva v tom, že sú súčasne aj funkčnými

bielkovinami. Nemajú enzýmovú aktivitu, ale sú jedinými cereálnymi bielkovinami

26

schopnými formovať silné, súdržné cesto, ktoré uchováva plyny a vytvára ľahké

pekárske produkty (Kopáčová, 2007).

V endosperme pšeničného zrna majú funkciu zásobnú, ktorá pri klíčení zrna sa štiepi

na AMK a peptidy, pričom sa vytvára zdroj dusíka potrebných na syntézu bielkovín pre

vyvíjajúce sa embryo (Prugar, Hraška, 1986).

Obsah a kvalita zásobných bielkovín pšeničného zrna sú hlavným faktorom, ktorý

ovplyvňuje technologickú kvalitu zrna pšenice (Gálová, Smolková, Gregová, 1998).

Veľmi dôležitou vlastnosťou zásobných bielkovín pšeničného zrna je schopnosť

gliadínov a glutelínov tvoriť lepok, ktorý má kľúčovú úlohu v procese formovania

pšeničného cesta a určuje jeho pekárske vlastnosti. Sú charakteristické vysokým

obsahom kyseliny glutámovej, glutamínu a prolínu (Prugar, Hraška, 1986).

Zásobné bielkoviny v endosperme vytvárajú bielkovinový komplex.

Jednotlivé frakcie sa líšia nielen rozdielnou rozpustnosťou v rôznych rozpúšťadlách, ale

i aminokyselinovým zložením, molekulovou hmotnosťou, fyzikálno-chemickými

vlastnosťami, čo spôsobuje ich odlišnosť v biologickej významnosti výživnej

a technologickej kvality.

Konarev (1975) rozpracoval metodiku delenia gliadínov v polyakrylamidovom gély,

pričom jednotlivé gliadínové komponenty rozdelil podľa ich mobility na α, β, γ a ω

(Michalík, 1988).

Kolektív autorov pod vedením Shewry odporučil zásobné lepkové bielkoviny

rozdeliť na monomérne gliadíny a agregovaný glutenín. Pričom monomérne gliadíny sú

zastúpené: alfa, beta, gama gliadínmi (prolamíny bohaté na síru).

Naproti tomu agregovaný glutenín je zložený z nízkomolekulárnych glutenínových

podjednotiek – LMW (alebo agregované gliadíny) a vysokomolekulárnych

glutenínových subjednotiek – HMW (Michalík, 1998).

1.2.4.1 GLIADÍNY

27

V zrne pšenice tvoria hlavnú časť bielkovín, pričom ich obsah je rozličný

v závislosti od vonkajších podmienok, pestovateľskej zóny, zvláštnosti kultivaru

a podmienok extrakcie.

Gliadíny pšenice sú veľmi heterogénne bielkoviny, zložené z mnohých zložiek.

Woychik a kol., (1961) prvýkrát hlbšie rozdelil gliadíny, pričom získal 4 subfrakcie: α,

β, γ a ω gliadíny ( Prugar, Hraška 1986).

Rozlíšenie gliadínov, vyskytujúcich sa v skupinách (blokoch) je možné na základe

génov, ktoré ich kódujú.

Nachádzajú sa vo výťažku múky ako monomerické polypeptidy. Vo veľkej miere

ovplyvňujú fyzikálne a chemické vlastnosti lepku ( Branlard et al, 2003).

Veľkosť molekúl gliadínov je relatívne malá, ich molekulová hmotnosť sa pohybuje

okolo 35 kDa (Payne, 1987).

Hlbšie rozdelenie gliadínov na jednotlivé komponenty sa dosahuje v súčasnosti

pomocou elektroforézy za využitia rozdielnej elektroforetickej pohyblivosti

jednotlivých zložiek gliadínov.

Molekulové hmotnosti jednotlivých zložiek gliadínov sú rozličné, pri väčšine sa však

blíži k 36 000 (Bietz a Wall, 1972., Platt a kol., 1974). Wrigley a Shepherd (1973)

udávajú molekulovú hmotnosť gliadínov 50 000 – 80 000 (Prugar, Hraška, 1986).

Kódujúce gliadínové alely sú početné a frekvenčne sa líšia v závislosti od oblastí

pôvodu odrody pšenice (Wrigley et al., 2006).

1.2.4.2 GLUTENÍNY

Bietz a Wall (1976) zistili, že glutenín je zložitý komplex tvorený približne z 15

subfrakcií s molekulovou hmotnosťou od 11 600 do 133 000.

V súčasnosti najbežnejšie prijímaný názor na glutenínový komplex je, že sa skladá

zo zmesi bielkovinových subjednotiek viazaných krížovou väzbou prostredníctvom

medzisubjednotkových disulfidických väzieb tak, že sa dosiahne široké spektrum

molekulových hmotností s rozpätiami až do vysokých polymérov s molekulovými

hmotnosťami niekoľko miliónov (Prugar, Hraška, 1986).

Z technologického hľadiska gluteníny vplývajú na elasticitu čiže pružnosť a pevnosť

cesta a gliadíny na viskozitu – rozťažnosť a rozplývavosť cesta. Glutenín tvoria dve

28

skupiny podjednotiek a to vysokomolekulárne (HMW) a nízkomolekulárne (LMW)

subjednotky. Približne 50 % zásobných bielkovín predstavujú gliadíny, zvyšných 10 %

tvoria HMW glutenínové a 40% LMW glutenínové podjednotky (Gálová, Smolková,

Gregová, 1998) .

Z koncepčného hľadiska gluteníny tvoria polyméry , v ktorých sú polypeptidy

pospájané disulfidickými mostíkmi.

Kódujúce gény gliadínov a glutenínov majú špecifickú polohu v genóme pšenice.

Táto odlišnosť má schopnosť, že gliadíny majú menšiu molekulovú hmotnosť ako

glutelíny v priemere o 100 000 Daltona.

Oddelenie gliadínov a glutelínov v roztoku môžeme prakticky dosiahnuť pomocou

metódy SDS - PAGE (Wrigley et al., 2006)

Shewry a kol.(1989) predložil nasledovnú klasifikáciu gluténu:

a) monomérne jednotky gliadínu (Obr.5)

- s vysokým obsahom sírnych amynokyselín : alfa-gliadíny, beta-gliadíny, gama-

gliadíny

- s nízkym obsahom sírnych amynokyselín : omega-gliadíny

b) agregovaný glutén :

- nízkomolekulárne komponenty gluténu ( LMW-GS) tzv. agregované gliadíny

- vysokomolekulárne komponenty gluténu (HMW-GS).

Vysoká heterogenita, druhová a genotypová špecifickosť, rozdielne fyzikálno –

chemické vlastnosti ako i skutočnosť, že ich biosyntéza sa realizuje v poslednej fáze

tvorby zrna, ich predurčuje plniť úlohu markerov hospodársky významných znakov

a vlastností (Gálová et al., 2008).

29

GLUTÉN

MONOMÉRNE GLIADÍNY AGREGOVANÝ GLUTÉN

Omega Alfa Beta Gama LMWpodjednotky HMW podjednotky

Deficit sírnych AMK Prolamíny bohaté na síru

Viskozita a rozťažnosť Elasticita

Obr. 5 Frakčná štruktúra lepkových bielkovín (Gálová et al., 2008)

1.2.4.3 HMW A LMW - GLUTENÍNOVÉ PODJEDNOTKY

Nomenklatúra vysokomolekulárnych (HMW) polypeptidov glutenínu bola

vytvorená na základe ich zjavných veľkostí ( po redukcii disulfidických väzieb)

pomocou SDS elektroforézy, neskôr pridaný o polohu génu, kódujúceho podjednotku,

ktorá sa nachádza na dlhom ramene prvej skupiny chromozómov.

Spájanie týchto podjednotiek selektovaných ako dlhšie zostavy, vznikli HMW-GS

odlišujúce sa od nízkomolekulových gluténových podjednotiek (LMW-GS).

Termín HMW-GS v praxi je v závislosti od pohyblivosti v SDS géli.

Payne a Lawrence (1983) popísali HMW-GS použitím SDS - PAGE

prostredníctvom číselného systému a každej podjednotke priradili číslo podľa rýchlosti

pohybu v géli. Podjednotky zoskupili podľa narastajúcej mobility od 1 po 12 (Wrigley

et al., 2006).

Po separácii v SDS géli sa LMW glutenínové podjednotky podľa veľkosti javia ako

menšie a tak alely ( na lokuse Glu-3) je možné označiť pre LMW - GS podľa

príslušného lokusu na krátkych ramenách prvej skupiny chromozómov (Gupta, Sheperd

1990).

30

1.2.5 CHROMOZÓMOVÁ LOKALIZÁCIA GÉNOV

Na základe výsledkov rozsiahleho výskumného programu z využitia

monozomatických línií boli identifikované a charakterizované jednotlivé lokusy

hexaploidných pšeníc, z ktorých vyplýva, že každý genóm hexaploidných pšeníc

(Triticum aestivum L.) je zložený zo sedem trojpárov chromozómov, pričom gluteníny

a gliadíny sú kódované génmi nasledovných lokusov:

Lokus Glu-1 je lokalizovaný na dlhom ramene chromozómov 1A, 1B,

1D s génmi kódujúcimi HMW glutenínové podjednotky,

Lokus Gli-1 a Glu-3 sú lokalizované na krátkom ramene chromozómov

1A, 1B, 1D s génmi kódujúcimi LMW glutenínové podjednotky, gama-gliadíny

a omega-gliadíny,

Lokus Gli-2 je lokalizovaný na krátkom ramene chromozómov 6A, 6B

a 6D s génmi kódujúcimi alfa-gliadíny a beta-gliadíny (Gálová et al,2008) (Obr.6)

Syntéza HMW glutenínových subjednotiek je podmienená multigénovými lokusmi :

Glu-1, ktorý je lokalizovaný na dlhom ramene chromozómu 1B, 1D a 1A prvej

homologickej skupiny (Payne,1987). Chromozóm 1B riadi syntézu 12 rozdielnych

HMW subjednotiek (od 1 do 3). Chromozóm 1D podmieňuje celkove 6 rozdielnych

subjednotiek a chromozóm 1A 5 subjednotiek.

Glutenínové subjednotky, analogicky ako i gliadínové, sa manifestujú spoločne

ako ,,glutenínový blok“.

31

Obr.6 Základný katalóg alel kódujúcich HMW glutenínové podjednotky

(Payne et al., 1987)

Podľa molekulovej hmotnosti glutenínové HMW subjednotky sú členené na x – typy

(zastúpenie bielkovín s vysokou molekulárnou hmotnosťou) a y – typy (nízka

molekulová hmotnosť), pričom gény pre syntézu x – typov bielkovín sú lokalizované na

1A a 1B a y – typov na 1B chromozóme. Je pozoruhodné, že x – typy sa vyznačujú

nízkym obsahom Cys zvyškov (okolo 0,4mol.%) a naproti tomu y – typy vykazujú

vysoký obsah Cys zvyškov (1,3mol%) ( Michalík, 1998).

Z hľadiska praktického riešenia problematiky hodnotenia technologickej kvality zrna

pšenice najväčšiu pozornosť si zaslúžia výsledky Shewryho a kol. (1986) (tab.5)

Tab.5 Prehľad lokalizácie lokusov (podľa Shewry a kol.1986)

Chromozóm

y

Lokus Rameno chromozómu Biosyntéza bielkovín

1 D Glu-D1 dlhé HMW glutenínové subjednotky

1 D Gli-D1 krátke Omega a gama gliadíny

1 D Nedostatočne

preštudovaný

krátke LMW glutenínové subjednotky

1 B Glu-B1 dlhé HMW glutenínové subjednotky

1 B Gli-B1 krátke Omega a gama gliadíny

1 B Glu-B2 krátke LMW glutenínové subjednotky

32

1.3 VPLYV ZÁSOBNÝCH BIELKOVÍN NA KVALITU ZRNA

PŠENICE

Pojem zásobné bielkoviny zahrňuje gluténové bielkoviny, ktoré sú uložené

v bunkách škrobového endospermu vyvíjajúceho sa zrna. Časť lepkových bielkovín

nazývané vysokomolekulové gluténové bielkoviny je dôležitá hlavne kvôli vysokému

stupňu elasticity, ktorý sa prejavuje ako sila cesta.

Genetickými manipuláciami je možné meniť množstvo a zastúpenie jednotlivých

zložiek gluténových bielkovín, čo v konečnom dôsledku vedie k zvyšovaniu

technologickej kvality cesta (Chňapek, 2008).

Úžitkovosť je rozdielna a závisí od využitia produktu. Dôležitú funkciu pri určovaní

vlastností cesta, ako je pevnosť, ťažnosť a stabilita cesta, majú zásobné bielkoviny

endospermu pšenice. Iný znak vzťahujúci sa ku kvalite škrobu ovplyvňuje viskozitu

cestovín (Wrigley et al., 2006).

Ako príklad môžeme uviesť produkciu chleba, ktorá vyžaduje veľmi silné a elastické

cesto, na druhej strane výroba koláčov a sušienok je determinovaná extenzibilitou

(Chňapek, 2008).

Hľadisko pre posudzovanie technologickej kvality zrna pšenice sú predmetom

ďalších výskumov. Pre kvalitu zrna sú určujúce znaky poukazujúce na obsah

a viskoelastické vlastnosti lepkových bielkovín, tvrdosť zrna, hmotnosť, obsah

minerálnych látok a viskozity (aktivita enzýmov) ( Šíp et al., 2000).

1.3.1 HMW PODJEDNOTKY – VZŤAH K PEKÁRSKEJ KVALITE

Základnými prostriedkami identifikácie a diferenciácie rastlinných genotypov

v súčasnom období sú genetické markery založené na polymorfizme bielkovín a DNA.

Pre pšenicu letnú (Triticum aestivum L.) sa využívajú predovšetkým

vysokomolekulárne podjednotky glutenínov (HMW-GS) ako bielkovinové markery

pekárskej kvality pšenice.

33

Sledovaním vzťahu jednotlivých HMW glutenínových podjednotiek

a chlebopekárskej kvality bolo zistené, že existuje medzi nimi súvislosť (Gálová et al.,

2008).

Tendencie o vysvetlenie pevnosti pri miesení cesta boli zamerané hlavne na HMW-

GS ( Payne et al., 1981).

Bolo dokázané, že jednotlivé podjednotky, respektíve ich páry ovplyvňujú

v kladnom alebo zápornom smere technologickú kvalitu zrna pšenice(Michalík,1998).

Podľa Peňa et al (2005) je množstvo glutenínov a hlavne x-typov HMW

glutenínových podjednotiek v silnej pozitívnej korelácii na reologické vlastnosti cesta.

V tomto zmysle podjednotky 5+10 lokalizované na lokuse Glu-D1 pozitívne

prispievajú k pekárskej kvalite pšeničnej múky, kým dvojica podjednotiek 2+12 má

v tomto smere negatívny vplyv (Oslovičová et al, 2009).

Rozmanitá variabilita glutenínových podjednotiek ovplyvňuje technologickú kvalitu

odrôd pšenice rozdielne. Dokázalo sa, že podjednotky bielkovín označené ako Glu-A1

(1), Glu- A1 (2*), Glu-B1 (7+9), Glu-B1 (17+18) alebo Glu-D1 (5+10) určujú vysokú

technologickú kvalitu. Protikladne pôsobia ich alelické varianty ako Glu-A1 (0), Glu-

B1 (6+8) alebo Glu-D1 (2+12), ktoré upozorňujú na nižšiu kvalitu (Popineau et al.,

1994; Gianibelli et al., 2001).

Aj na lokuse Glu-B1 sú alely, ktorých produkty zvyšujú chlebopekársku kvalitu-

alely (17+18, 7+8, 7+9) a alely (6+8 a 7), ktoré sú horšie vo vzťahu k technologickej

kvalite pšenice (Gálová et al., 2008).

Jednotlivé HMW subjednotky rozdielne ovplyvňujú reologické vlastnosti cesta, čo

vytvára základ Glu-hodnotenia pre potreby pedikcie technologickej kvality pšenice.

Medzi najrozšírenejšie hodnotenie patrí podľa Payne a Lawrence (1983), uvedené

v tab.6 (Michalík, 1998).

HMW glutenínové podjednotky 5+10 má kladný vplyv na kvalitu, v jeho prítomnosti

stúpa pozitívny efekt niektorých ďalších HMW-GS, napr. 1; 2*; 7+8; 7+9 (Kraic,

Gregová, 1998).

Podľa Kolstera et al. (1991) pár 5+10 sa považuje za kľúčový. V jeho prítomnosti

majú podjednotky 1 a 2*, resp. 7+8 a 7+9 výrazne lepší vplyv na kvalitu v porovnaní

s ostantými HMW-GS lokusov Glu-1A, Glu-1B.

34

Rozdiely v pekárskej kvalite múky sú následkom premenlivosti alel na Glu-1D

lokuse. Na tomto lokuse alely kódujúce kombináciu HMW-GS 5+10 prispievajú

k vyššej pekárskej hodnote ako podjednotky 2+12 (Weegels et al., 1996).

1.3.1.1 HODNOTENIE KVALITY - GLU SKÓRE

Účelom Glu- skóre hodnotenia bolo vytvoriť vyjadrenie kvality pre odrody

a stanoviť tak mieru predikcie elasticity cesta. Pomenovali ho ako Glu-1 hodnotenie

(Glu - 1 skóre) a prvýkrát ho publikoval Payne et al.,(1987).

Najvyššia hodnota Glu-skóre je maximálne 10. Technologické vlastnosti múky sú

tým lepšie, čím je táto hodnota vyššia (Gálová, 2002).

Tab.6 Hodnotenie glutenínových HMW subjednotiek pre výpočet Glu-score podľa

Payne a Lawrence (1983) (Michalík, 1998)

Stupeň LOKUS

Glu

A1Glu B1 Glu D1

4 - - 5+10

3 1 17+18 -

3 2 7+8 -

2 - 7+9 2+12

2 - - 3+12

1 žiadny 7 4+12

1 - 6+8 -

Kódujúcim podjednotkám z troch génových lokusov boli pridelené rozdielne

hodnoty, ktoré majú vzťah k malej alebo veľkej elasticite cesta.

Najviac vplývajú na elasticitu cesta podjednotky 5+10 a boli označené najvyšším

hodnotením 4 pre jednotlivé alely.

35

Podjednotkám 2+12 , druhá najlepšia kvalita na tomto lokuse bolo pridelené

hodnotenie 2.

Podjednotky 1 a 2* ( chromozóm 1A) poukazovali výslovne na vyššiu kvalitu oproti

nulovej forme alely, ale boli pomerne nekvalitné v porovnaní s podjednotkami 5+10

a 2+12, získali tak hodnotenie 2.

Nulová alela bola ohodnotená číslom 1 (Wrigley et al.,2006).

V pšeničných odrodách nie sú nezvyčajné ani prípady, ktoré majú pšenično-ražnú

translokáciu 1R/1B, ktorá je spojená s inhibičným účinkom na kvalitu pšeničného lepku

a reologické vlastnosti cesta. Z tohto dôvodu sa pri stanovenom Glu-skóre znižuje jeho

hodnota o dva body a označuje sa pojmom ražné skóre (Payne, Lawrence, 1983).

Podľa Starovičovej a Gálovej (2002) z  jeho prítomnosti vyplýva, že genóm pšenice

je obohatený o sekalínové gény, ktoré majú za následok výrazné zhoršovanie kvality

pšeničného lepku a gény odolnosti voči hrdzi trávovej Sr31.

Prítomnosť tejto translokácie 1R/1B spôsobuje vyšší obsah albumínov a globulínov

a nízku hodnotu glutén indexu v porovnaní s líniami, ktoré túto translokáciu

neobsahovali (Dvořáček et al., 2006).

V mnohých znakoch sa jednotlivé odrody výrazne líšia, preto je nutné rešpektovať

ich úžitkový smer, požiadavky na agrotechniku a pestovateľské podmienky.

Základný úžitkový smer, ktorý sa sleduje u všetkých registrovaných odrodách je ich

pekárenská akosť ( Prugar et al.,2008).

1.3.2 ZVYŠOVANIE TECHNOLOGICKEJ KVALITY PŠENICE

Jedným zo spôsobov zvyšovania technologickej kvality pšeničného zrna je

využívanie poznatkov a metód najnovšieho nástroja poľnohospodárskeho výskumu

biotechnológií. V súlade s tradičnými šľachtiteľskými postupmi biotechnológia

prispieva k vyvíjaniu nových účinnejších metód pre genetické manipulácie a kontrolu

tvorby nových odrôd. Biotechnológia zahŕňa systematickú aplikáciu biologických

procesov pre zvyšovanie hospodársky významných znakov plodín. Konvenčný

šľachtiteľský postup využíva pre zvyšovanie kvalitatívnych parametrov existujúcich

kultivarov ako potenciálny zdroj génov iba gény z podobných genómov, ale na druhej

strane biotechnológia nám ponúka možnosť využívať aj transfer špecifických génov

a génových sekvencií z iných organizmov.

36

Zvyšovanie kvality pšenice je v súčasnosti zamerané hlavne na zvyšovanie

úrodového potenciálu a kvalitatívnych charakteristík, na rezistenciu voči biotickým

stresom a toleranciu voči abiotickým stresom v závislosti na podmienkach pestovania

(Chňapek, 2008).

1.4 ZÁVER

Význam cereálnych potravín v našej strave je daný fakticky ich každodenným

uplatnením v spotrebe. Tvoria súčasť takmer všetkých hlavných jedál. Vedľa

samostatného použitia predstavujú základné prílohy pri všetkých mäsitých, vaječných,

ale aj mliečnych a zeleninových pokrmoch. V našich podmienkach potravinová skupina

obilniny pokrýva viac ako polovicu spotreby sacharidov, viac než tretinu energetickej

spotreby, okolo 28% celkovej spotreby bielkovín, takmer 30% spotreby vitamínu B₁, 25% vitamínu PP.

Spracovateľský priemysel preferuje hlavne technologickú hodnotu. Je to súhrn

znakov a vlastností suroviny, ktoré umožňujú spracovateľovi maximálnu výťažnosť

a požadovanú akosť finálneho výrobku. Prejavuje sa až v priebehu konkrétneho

technologického spracovania.

Najviac informácií pre technologickú aplikáciu z vlastností cesta poskytujú ich

reologické vlastnosti.

Cieľom bakalárskej práce bolo pomocou bielkovinových markerov detekovať

HMW glutenínové podjednotky určujúce technologickú kvalitu pšenice.

37

POUŽITÁ LITERATÚRA

1. AGARWAL, M. – SHRIVASTAVA, N. – PADH, H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciense. 2008. In: Plant Cell Rep,vol.27, 2008

2. BARANEC, T. – POLÁČIKOVÁ, M. – KOŠŤÁL, J.: Systematická botanika. Nitra: SPU. 1998. 206s. ISBN 80-967111-2-1.

3. BRANLARD, G. – DARDEVER, M. – AMIOUR, N. – IGREJAS, G.: Allelic diversity of HMW and LMW glutenin subunits and omega – gliadins in French bread beat. Genetic Resources and Crop Evolution, 50. 2003. s. 669-675

4. DVOŘÁČEK, V. - BRADOVÁ, J. - STEHNO, Z. 2006. Effect of 1B/1R translocation on selected grain quality parameters in a set of doubled haploid wheat lines. In Czech Journal of Genetics Plant Breeding, vol.42, 2006, no 2, s. 50-56

5. FRANČÁKOVÁ, H. – ČUBOŇ, J. – MICHALCOVÁ, A.: Hodnotenie poľnohospodárskych produktov. Štvrté nezmenené vydanie, Nitra: SPU, 2007, s. 178. ISBN 978-80-8069-836-2.

6. GÁLOVÁ, Z. 2002. Genetické markery technologickej kvality zrna pšenice a

jačmeňa. In Mapovanie genómu zrna pšenice pre účely determinácie genetickej

diverzity obilnín, VEGA projekt č. 1/7648/20 : záverečná správa, 2002, s. 1. – 3.

7. GÁLOVÁ, Z. – BALÁŽOVÁ, Ž. - MICHALÍK, I. – LIBANTOVÁ, J. – MORAVČÍKOVÁ, J. – HRICOVÁ, A. – MATUŠÍKOVÁ, I.: Biotechnológie v rastlinnej produkcii. Nitra: SPU. 2008. 149s. ISBN 978-80-552-0146-7.

8. GÁLOVÁ, Z. – SMOLKOVÁ, H. – GREGOVÁ, E.: Biosyntéza individuálnych HMW glutenínových subjednotiek vo formujúcom sa zrne pšenice. Kvalita zrna pšenice. 1998. Zborník referátov z 1. vedeckej konferencie. ISBN 80-7137-505-5.

9. GIANIBELLI, M. C. - LARROQUE, O. R. - MacRITCHIE, F. - WRIGLEY, C. W:

2001. Biochemical, genetic and molecular charakterization of wheat glutenin and its

component subunits. Cereal Chem., 78, 2001, p. 635-646

10. GRUNDAS, S. T. 2003. Wheat. In Encyklopedia of Food Science and Nutrition,

38

Oxford Academic Press, vol. 10, 2003, p.6130 -6146

11. GUPTA, R. B. - SHEPERD, K. W. 1990. Two-step one-dimensional SDS - PAGE

analysis of LMW subunits of glutenin. I. Variation and genetic control of the subunits in

hexaploid wheats. Theor. Appl. Genet., 80, 1990, p.65-74

12. HANZLÍKOVÁ, Z. 2010. Analýza vysoomolekulových bielkovín v genotypoch

Triticum L.: Diplomová práca. Nitra: UKF, 2010

13. CHŇAPEK, M. - GÁLOVÁ, Z. – GREGÁŇOVÁ, Ž. 2004. Bielkovinové markery

technologickej kvality zrna pšenice. In Aktuálne problémy riešene v Agrokomplexe :

Zborník z X. medzinárodného vedeckého seminára. Nitra : SPU, 2004, s. 235 – 240.

ISBN 80-8069-488-6.

14. CHŇAPEK, M. 2008. Využietie bielkovinových markerov pri identifikácii,

diferenciácii a charakteristike genotypov pšenice letnej, tvrdej, špaldy a jačmeňa

jarného : dizertačná práca. Nitra : SPU, 2008.

15. KARABÍNOVÁ, M. – ADAMOVSKÝ, F. – GROMOVÁ, Z. – HÚSKA, J. – ILLÉS, L. – MOLNÁROVÁ, J. : Špeciálna rastlinná výroba – obilniny. Druhé nezmenené vydanie, Nitra: SPU, 1997, p. 204. ISBN 80-7137-344-3.

16. KOEBNER, R. M. D. – DEVOS, K. M. – GALE, M. D.: Advances in the Application of Genetic Markers in Plant Breeding. In: Asian Seed 94, Chiang Mai, Thailand, 1994. 19. KRAIC, J.: Genetické markery rastlín. Nitra: SPU. 2004.67s. ISBN 80-8069-381-1.

17. KOLSTER, P. – VAN EEUWIJK, F. A. – VAN GELDER, W. M. J. 1991. Additive

and epistatic effects of allelic variation at the high molecular weight glutenin subunit

loci in determining the bread – making quality of breeding lines of wheat. Euphytica,

55, 1991, s. 227-285

18. KOPÁČOVÁ, O. 2007. Trendy ve zpracování cereálií s přihlédnutím zejména

k celozrnným výrobkům. Praha: Ústav zemědelských a potravinářských informací,

2007, p. 10 - 15, ISBN 978-80-7271-184-0

39

20. KRAIC, J. - GREGOVÁ, E. 1998. Hodnotenie kvality a homogenity pšenice elektroforetickými technikami. In Kvalita zrna pšenice : Zborník referátov z I. vedeckej konferencie. Nitra : SPU, 1998, s. 51 - 52. ISBN 80-7137-505-5

21. KUČEROVÁ, J.: Technologie cereálií. Brno: Mendělova zemědělská a lesnická univerzita, 2004. 141s. ISBN 80-7157-811-8

22. LAPTEV, J. P.: Heteroploidia v šľachtení rastlín. Bratislava: Príroda. 1988, s. 288. ISBN 064-026-88.

23. MACEVILLY, C.: Cereals. Encycklopedia of Food Science and Nutrition, Vol. 2, Academic Press, Oxford . 2004.p. 1008.

24. MICHALÍK, I.: Komponentná charakteristika a biosyntéza zásobných bielkovín zrna obilnín. Kvalita zrna pšenice. 1998. Zborník referátov z 1. vedeckej konferencie. ISBN 80-7137-505-5.

25. MUCHOVÁ, Z. – FRANČÁKOVÁ, H. – BOJŇANSKÁ, T. – BAJČI, P.: Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu. Štvrté nezmenené vydanie, Nitra: SPU, 2007, s. 217. ISBN 978-80-8069-835-5.

26. MUCHOVÁ, Z. – FRANČÁKOVÁ, H. – BOJŇANSKÁ, T. – MAREČEK, J.: Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu. Vydanie prvé, Nitra: SPU, 2011, s.220. ISBN 978-80-552-0564-9

27. OSLOVIČOVÁ, V. – GÁLOVÁ, Z. – BALAŽOVÁ, Ž.: In Acta fytotechnika et zootechnika – Mimoriadne číslo Nitra SPU, 2009, s. 517-524

28. PAYNE, P. I. : Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread-making quality. Ann. Rev. Plant Physiol. 38, 1987, s. 141-153.

29. PAYNE, P. I. - HOLT, L. M. - LAW, C. N. 1981.Struktural and genetical studies on

the high- molecular-weight subunitz of wheat glutenin. Part I. Allelic variation in

subunits amongst varieties of wheat. Theor. Appl. Genet., 60, 1981, p. 229-236

30. PAYNE, P. I. - LAWRENCE, G. J. 1983. Catalogue of alleles for the complex gene

loci, Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, which code for high molecular weight subunits of

glutenin in hexaploid wheat. In Cereal Research Communication, vol. 11, 1983,

p. 29-35

31. PAYNE, P. I. - NIGHITINGALE, M.A. - KRATTIGER, A. F: - HOLT, L. M. 1987.

The relationship between HMW glutenin subunit composition of the bread - making

quality of Britsh- grow wheat varietes. J. Sci. Food Agric., 40, 1987, p. 51-65

40

32. PEŇA, E. – BERNARDO, A. – SOLER, C. – JOUVE, N. 2005. Relationship

between common wheat (Triticum aestivum L.) gluten proteins and dough rheological

properties. Euphytica 143, 2005, s. 169 – 177

33. POPINEAU, Y. - CORNEC, M. - LEFEBRE, J.- MARCHYLO, B: 1994. Influence

of high Mr glutenin subunits on gluten polymers and rheological properties of glutens

and gluten sub. Fractions of near-isogenic lines of wheat Sicco. J. Cereal Sci.,19, 1994,

p.231-241

34. POSPIŠIL, R. - KARABÍNOVÁ, M. - DANČÁK, I .- CANDRÁKOVÁ, E. - POLÁČEK, M.- HORVÁT, F.: 2007. Integrovaná rastlinná výroba. Druhé nezmenené vydanie, Nitra: SPU, 2007, p. 170. ISBN 978-80-8069-856-0.

35. PRUGAR, J.: Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. Tisíciletí. Praha: 2008. Výzkumní ústav pivovarský a sladařský. 326s. ISBN 978-80-86576-28-2

36. PRUGAR, J. – HRAŠKA, Š.: Kvalita pšenice. Bratislava: Príroda. 1986. 220s. ISBN 64-133-86

37. PŘÍHODA, J. – SKŘIVAN, P: - HRUŠKOVÁ, M.: Cereální chemie a technologie 1.: cereální chemie, mlýnské technologie, technologie výroby těstovin. Vysoká škola chemicko – technologická v Praze, Praha: 2004. s. 203. ISBN 80-7080-530-7.

38. STAROVIČOVÁ, M. – GÁLOVÁ, Z. : Charakteristika kolekcie rôznych genotypov pšeníc využitím bielkovinových markerov. Sborník přednášek: Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin, Šumperk, 2002 s.33- 37

39. ŠÍP, V. - ŠKORPÍK, M. - CHRPOVÁ, J. - ŠOTNÍKOVÁ, V. - BÁRTOVÁ, Š:

2000. Vliv odrůdy a pěstitelských opatření na výnos zrna a potravinářskou jakost

ozimné pšenice In : Rostlinná výroba, vol. 46, 2000, no: 4, p. 159-167

40. ŠPALDON, E. – ANDRAŠČÍK, M. – BECHYNĚ, M. – BELEJ, J. – FRIC, V. – FUCIMAN, L. – HRUŠKA, L. – KRAUSKO, A. – PETR, J. – RYBÁČEK, V. – ŠKULA, K. – VÁŠA, F. – VOTOUPAL, B. – VRZALOVÁ, J.: Rastlinná výroba. Bratislava: Príroda, 1989, s. 628. ISBN 64-032-82.

41. ZIMOLKA, J. – EDLER, S. – HŘIVNA, L. – JÁNSKÝ, J. – KRAUS, P. – MAREČEK, J. – NOVOTNÝ, F. – RICHTER, R. – ŘÍHA, K. – TICHÝ, F.: Pšenice pěstování, hodnocení a užití zrna. Praha: Profi Press. 2005. s. 180. ISBN 80-86726-09-6

42. WEEGEWLS, P. – HAMER, R. J. – SCHOFIELD, J. D. 1996. Functional

41

properties of wheat glutenin. In Journal Cereal Science, vol 23, 1996, p. 1 – 18.

43. WRIGLEY, C. - BÉKÉS, F. - BUSHUK, W. 2006. Gliadin and Glutenin. 2006, p.

466, ISBN 1-891127-51-9

INTERNETOVÉ ODKAZY

http://www.fem.uniag.sk/acta/download.php?id=635 (2011-05-10)

Obr. 1: Pšenica letná forma ozimná (Triticum aestivum L.)http://gabkinblog.blogspot.com/2010/07/psenicne-soiree.html

Obr. 2 : Pšenica tvrdá (Triticum durum DESF.)http://www.lookfordiagnosis.com/images.php?term=Triticum&lang=1

Obr.3 : Pšenica špalda (Triticum spelta L.) http://www.increasemyvocabulary.com/definition/of/triticum-spelta/

42