Un metodo molecolare

per l’enumerazione di C. tyrobutyricum

Limite di determinazione = 14 genomi eq/ml o g

Metodo automatizzabile

Validazione in corso

Valutazione degli Insilati usati nella filiera

di produzione del Grana Padano DOP

Qualità degli Insilati

Progetto FILIGRANA «Valorizzazione della produzione del Grana Padano per il controllo di filiera e l’ottimizzazione dei processi produttivi»

Valutazione qualitativa degli Insilati e Fieni in Pianura Padana

Informazioni raccolte in azienda Tipologia di insilamento, Dimensioni trincea, copertura e tipologie di film plastici, appesantimento della superficie, presenza di teli laterali, densità della massa, uso di additivi, procedure di insilamento, avanzamento sul fronte

Gallo et al., 2015. JSFA, accepted

Percentuale aeree a rischio nelle

trincee campionate

Parte a rischio < 10%

Parte a rischio 10-20%

Parte a rischio 25-35%

Parte a rischio 35-70%

Rischio >70%

26% delle Trincee 36% delle Trincee

12% delle Trincee 16% delle Trincee

10% delle Trincee

Prodotto della ricerca:

Indice di qualità degli INSILATI

Definizione dell’Indice di qualità fermentativa

e di conservazione degli Insilati

Componenti utilizzate nel modello Peso Componenti

• Attività Clostridica 30%

• Fermentazioni Omolattiche 50%

• Fermentazioni Eterolattiche* 20%

Disponibilità di Calibrazioni NIRS

TRASFERIBILITA’ IMMEDIATA AL

SISTEMA LATTIERO CASEARIO

*Si tiene conto dell’utilizzo di Inoculi come Lactobacillus buchneri

Variable m.u. val

Butyric acid g kg-1 DM 0.1

Valerianic acid g kg-1 DM 0

Isovalerianic acid g kg-1 DM 0

Isobutyric acid g kg-1 DM 0

Lactic acid g kg-1 DM 62.47

Soluble CP g kg-1 DM 55

NH3-N g kg-1 TN 45

pH dmls 3.4

Propionic acid g kg-1 DM 4

Acetic acid g kg-1 DM 22

"Fermentative Quality Index"

Studio della microbiologia

degli Insilati

Manuscript under preparation «Prediction of Clostridium tyrobutyricum count

in Corn Silages»

Approccio condotto attraverso 3 tecniche multivariate

Regressione multipla con selezione STEPWISE

Principal Component Regression analysis

Partial Least Square Regression analysis

Previsione del contenuto di

cellule e spore di C. tyrobutyricum

negli Insilati di Mais

Modello (R2=0.64, √MSE=2.58)

Predittori: • Densità • Sostanza Secca • N-NH3 • pH • Acidi Grassi Volatili • Fattore Inibente • Tecniche Insilamento • Presenza Teli laterali

Valutare i fattori che negli Insilati influenzano lo sviluppo di cellule e spore di Clostridium tyrobutiricum.

IMMAGINE

IMMAGINE

impiego di un sistema per correggere la razione durante la

preparazione del carro (alimentazione di precisione)

Disegno sperimentale e controlli

8 allevamenti (MN, BS, LO)

Installazione impianti

Fase preliminare: da fine ottobre 2013 a fine gennaio 2014

in funzione sistema

nostri controlli preliminari in dicembre – inizio febbraio

Fase sperimentale:

Cross over (attivo/disattivo correzione carico alimenti) con 2 periodi

1° periodo di 14 settimane (inizio febbraio – inizio maggio)

(nostri controlli fine marzo – inizio maggio)

2° periodo di 12 settimane (inizio maggio – fine luglio)

(nostri controlli in giugno – luglio)

Alimentazione di precisione

3

4

5

6

7

Fresche Intermedia Complessiva

Ure

a, m

mo

l/L

Attivo DisattivoDati ematici • Urea più bassa. Nelle fresche valori più bassi con

attivo. Dieta più costante ed equilibrata tutti i

giorni migliore utilizzazione N ingerito (EFFICIENZA),

• Alcuni parametri ematici (colesterolo, Ca,

Bilirubina, GOT) depongono per un periodo di

transizione meno problematico. Meno

anomalie digestive. MIGLIORE BENESSERE.

WP9 – Alimentazione di precisione

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

Fresche Intermedia Complessiva

Ce

llule

so

mat

ich

e,

log(

n/m

L)

Attivo DisattivoLATTE

• Maggiore produzione

• Grasso, proteine e lattosio

sostanzialmente non

variano.

• Cellule somatiche: più basse

in attivo nei controlli individuali

• Tempo di rassodamento del

coagulo più breve

LATTE PIU’ IDONEO ALLA CASEIFICAZIONE

0,235

0,240

0,245

0,250

0,255

0,260

0,265

0,270

0,275

0,280

0 5 10 15

MO

L, €

/kg

latt

e

Settimane

C PF

S. Angelo Lodigiano, 13-03-2015 – FUTURO DEL LATTE IN VALLE PADANA: Scenari attuali e prospettive

WP9 – Alimentazione di precisione

AUMENTO DEL MARGINE OPERATIVO LORDO (differenza ricavi ce costi alimentazione). Aumento di 0.018 €/kg di latte.

Effetto delle Micotossine da foraggio sulla fisiologia ruminale

Incidenza Micotossine da foraggio (SILOMAIS)

Micotossine ricercate prodotte da Pennicillum roqueforti, Aspegillus fumigatus, Aspergillus flavus, Fusarium spp., Alentaria spp., Monascus ruber

Pricnipali Micotossine

Incidenza campione

(trincea cont.)

Media (ppb)

Min (ppb)

Max (ppb)

Valori Olandesi

(ppb)

PR tossina * * * *

Ac. Micofenolico 25.3 (57%) 1758 41 48000 17%

(45000)

Roquefortina C 16.2 (32%) 744 10 32000 23%

(25000)

Gliotossina 2.6 (<5%) 275 119 560

DON 31.2 (40%) 141 31 601 81% (996)

Micotossine da P. roqueforti

Effetto della presenza di

Acido Micofenolico e Roquefortina C

sull’attività fermentativa ruminale

Parametro Acido

Micofenolico Roquefortina

Effetto singercico (Myco x Roque)

Fermentescibilità della razione (Vf, ml/g OM)

-7% -7% -14%

(lineare)

Produzione di VFA (mmol/l)

-19% -12% -36%

(quadratico)

Fattori di variazione delle spore di Clostridium tyrobutyricum nelle feci di bovine.

IMMAGINE

IMMAGINE

• Prove sperimentali per verificare se nel transito lungo il canale digerente

le spore di Clostridium tyrobutyricum si moltiplicano in maniera variabile in

funzione di fase fisiologica (asciutta e lattazione), rapporto F:C (senza e

con concentrati) e base foraggera (fieno, fieno + mais silo). • prove su bovine allevate presso la stalla sperimentale annessa all’Istituto

• somministrazione di spore di C. tyrobutyricum e G. stearothermophilus in

dispersione acquosa in un’unica soluzione

• cinetica di escrezione nelle feci (114 campioni da 14 animali)

• Prove sperimentali per valutare l’effetto della fermentescibilità dei

carboidrati non fibrosi in razione senza insilati sulla moltiplicazione delle

spore di C. tyrobutyricum nell’apparato digerente • confronto mais fioccato vs sorgo farina in quadrato latino 2x2

• al termine di ogni periodo somministrazione di spore di C. tyrobutyricum

• cinetica di escrezione nelle feci (160 campioni)

• Relazioni fra razione, pH delle feci e contenuto di spore di C.

tyrobutyricum nelle feci • 40 campioni di feci da 10 allevamenti

IMMAGINE

Asciutte con solo fieno

Dopo la somministrazione delle spore:

Aumenta solo G. stearothermophilus

Sotto limite rilevabilità C. tyrobutyricum.in 2 animali

su 7. Negli altri aumenti saltuari. L’aumento è stato

tuttavia di entità tale e che lascia presupporre una

incompatibilità con una moltiplicazione e sporificazione nell’apparato digerente. Le spore

potrebbero trovare le condizioni per germinare

nell’apparato digerente ma non si sarebbero

moltiplicate (o più probabilmente non avrebbero trovato

le condizioni per sporificare nuovamente).

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

-2 0 2 4 6 8

Cfu

/g

Giorni dalla somministrazione

Gs Ct

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

-2 0 2 4 6 8

Cfu

/g

Giorni dalla somministrazione

Gs CtBovine inizio lattazione, razione tipica a base di mais silo

Dopo la somministrazione delle spore:

G. stearothermophilusn on si osserva nessun

aumento per l’elevato background.

C. tyrobutyricum.isi osserva aumento nonostante

elevato background. I risultati depongono per una germinazione, moltiplicazione e sporificazione nell’apparato digerente

Fattori di variazione delle spore di nelle feci di bovine.

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

Ba Be Bo Ga Gr Mig Mi Pe Pin Pi

Log(

cgu

/g)

Aziende

Spore feci 10 aziende

Razione senza insilati: spore nelle feci sotto limite rilevabilità Effetto fermentescibilità dell’amido in razione senza insilati: non ha effetti sulla presenza di spore nelle feci (sempre sotto il limite) Anche con razioni a base di insilato di mais ci sono situazioni dove in tutti gli animali controllati i valori sono sotto il limite di rilevabilità?!

WP3 - Obiettivo 4 - Fattori di variazione delle spore di Clostridium tyrobutyricum nelle feci di bovine.

Wp3 – Obiettivo 5 - Fattori di variazione della attitudine del latte alla acidificazione.

IMMAGINE

IMMAGINE

• Controlli negli allevamenti a lenta e rapida velocità di acidificazione:

• Scelta degli allevamenti (91 allevamenti da 7 caseifici);

• Controlli in 24 allevamenti;

• Alimenti e razioni, benessere, condizioni metaboliche e

attività digestiva (analisi sangue: ematocrito, glucosio, colesterolo,

urea, Ca, P, Mg; Na, K, Cl, Zn, CuCp, proteine totali, albumine, globuline, GOT,

GGT, ALP, bilirubina,aptoglobina e feci: s.s.; pH, acidi grassi volatili; ALP)

caratteristiche del latte (318 campioni di sangue e feci e

376 campioni di latte);

• Analisi proteomica e metabolomica di campioni di latte selezionati

fra quelli prelevati nelle prove effettuate in campo;

• Aggiunta al latte di alcuni metaboliti individuati con le ricerche per

valutare l’effetto sulla velocità di acidificazione

• Effetti dell’acidificazione del latte sulla acidficazione della cagliata

nelle prima fasi di lavorazione

Wp3 – Obiettivo 5 - Fattori di variazione della attitudine del latte alla acidificazione.

s.s. UFL PG Amido F:C NDF NDFf NFC

kg/d U/kg % % % % %

Rapida 23.12 0.93 15.83 27.03 55.82 35.45 26.42 38.01

2.39 0.03 1.18 1.04 7.48 1.92 3.06 2.04

Intermedia 21.89 0.92 16.50 26.48 56.26 35.73 27.75 36.80

1.88 0.04 1.28 4.81 8.69 3.20 2.66 2.95

Lenta 23.27 0.96 16.57 28.59 53.85 32.83 25.46 39.76

1.31 0.03 0.86 2.36 3.83 3.61 3.02 3.25

Razioni in allevamenti a Rapida, intermedia e lenta velocità di acidificazione

Negli allevamenti con più lenta velocità di acidificazione del latte le razioni erano mediamente più ricche di concentrati

e da ritenere più a rischio per la buona attività fermentativa nel rumine e più in generale dell’attività digestiva. In

particolare erano più ricche di proteine grezze, di carboidrati non fibrosi, e di amido. Per contro più bassi erano i valori

di NDF totale e di NDF da foraggi.

L’analisi multivariata su tutti i dati ha evidenziato che fra le variabili rilevate a livello

ematico, digestivo e del latte, quelle che risultano maggiormente associate alla velocità

di acidificazione erano l’urea del sangue/latte (relazione negativa) e il grasso del latte

(relazione positiva), in sintonia e per effetto delle differenze nelle razioni prima

evidenziate.

Wp3 – Obiettivo 5 - Fattori di variazione della attitudine del latte alla acidificazione.

Variabile R2 parziale R2 modello F Prob F

Urea 0.0656 0.0656 14.96 0.0001

Fase lattazione 0.0483 0.1189 11.56 0.0008

Grasso 0.0661 0.16 17.01 <.0001

Stagione 0.0381 0.247 10.59 0.0013

Acido citrico 0.0216 0.2666 6.15 0.014

Dati in sintonia con i riscontri sulle feci (AGV più elevati con acidificazione lenta). Nel

complesso razioni povere in fibra fisico-effettiva e molto ricche in carboidrati non

fibrosi e che comportano eccessi fermentativi nell’apparato digerente, più

probabilmente nel grosso intestino, sono sfavorevoli per la velocità di acidificazione

del latte

GONFIORE TARDIVO

MICROBIOTA

DGGE

qPCR

NGS

C. butyricum

Lisozima

LAB-Clostridi

Caseificazioni

sperimentali

C.tyrobutyricum

Ciclo di vita

Spore Cellule

C. tyrobutyricum

Lisozima

Modello

GP - C.tyrobutyricum

Germinazione

spore-cellule-LAB-aa

Genomi

DGGE

qPCR

NGS

MICROBIOTA

of 83 spoiled cheese

. 4,477,326 high quality filtered sequences, 97.2% were correctly classified at the genus

level and 94.3% at the species level

LAB-Clostridi S. thermophilus L. helveticus L. rhamnosus => C. tyrobutyricum

L. delbruecki. L.casei => C. butyricum

C. butyricum

Lisozima

LAB-Clostridi

C.tyrobutyricum

Caseificazioni

sperimentali

C.tyrobutyricum

Lisozima CASEIFICAZIONI CON (L+) e SENZA LISOZIMA (L-) • In presenza di lisozima e con una contaminazione iniziale del latte di ~10-100 spore di C. tyrobutyricum , il difetto non si manifesta. CASEIFICAZIONI CON (L+) e SENZA LISOZIMA (L-), CON E SENZA SPORE AGGIUNTE • L’assenza di lisozima ha sempre portato alla comparsa di un difetto nel

formaggio, in 2 casi su 3 correlata alla presenza di C. tyrobutyricum

L+ L-

L+ S+

L- S+

C. butyricum

C.tyrobutyricum Genomi

AMINO ACID METABOLISM

DNA METABOLISM (CRISPR-associated proteins and restriction-modification systems)

CARBOHYDRATE METABOLISM (mannose and mannitol utilization)

UREASE urea decomposition (ureA, ureC, ureD, ureE, ureF, and ureG)

Caseificazioni

sperimentali

Ciclo di vita

spore cellule

LATTE IN CALDAIA

FINE COTTURA

ESTRAZIONE

CAGLIATA 24H

FORMA DOPO SALE

FORMAGGIO A 3 MESI

FORMAGGIO A 6 MESI

SPORE

SPORE

CELLULE C. tyr

Inizio

GERMINAZIONE

1,00E+001,00E+011,00E+021,00E+031,00E+041,00E+051,00E+061,00E+07

CELLULE C. tyrobutyricum

CELLULE e SPORE

SPORE 1,00E+001,00E+011,00E+021,00E+031,00E+041,00E+051,00E+061,00E+071,00E+081,00E+09

SPORE C. tyrobutyricum

CELLULE e SPORE

SPORE

Modello

GP- C.tyrobutyricum

germinazione

spore-cellule-LAB-aa

STUDIO DELLA GERMINAZIONE

• ANALISI GASCROMATOGRAFO PER PRODUZIONE IDROGENO

• MISURAZIONE CALO PERCENTUALE OD600nm

• MICROANALISI E MICROSCOPIA ELETTRONICA (SEM)

Trasferibilità dei Risultati e Prospettive

Future

TRASFERIBILITA’ DEI RISULTATI RAGGIUNTI

Indice di qualità fermentativa degli insilati come strumento applicabile nelle aziende e dai caseifici;

calibrazioni NIRS per valutare la qualità dei foraggi;

Divulgazione dei risultati del progetto FILIGRANA (allevatori del comprensorio del GP DOP, associazioni d’allevatori, caseifici, tecnici e nutrizionisti, istituti zooprofilattici).

Manuale di Buone Pratiche di insilamento spedito a tutte le aziende consorziate e disponibile online sul sito del Consorzio del Formaggio Grana Padano;

PROSPETTIVE FUTURE • Validazione dell’indice di qualità degli insilati su più aziende ed su più

annate agrarie. • Studio delle relazioni fra Indice di qualità degli insilati e contaminazione del

latte • Divulgazione capillare delle conoscenze nei comprensori produzioni DOP

Ricadute Applicative

indice di qualità fermentativa degli insilati di mais

buone pratiche di insilamento spedito a tutti gli aziende consorziate e disponibile online sul sito del Consorzio del Formaggio Grana Padano;

determinazione di una razione per le bovine più equilibrata che consenta una migliore attività digestiva e un latte più idoneo allo sviluppo di lattobacilli;

metodo rapido basato su strumenti NIR (FT-120) per la valutazione dell’idoneità del latte alla trasformazione;

sistema automatizzato di alimentazione di precisione per correggere la razione durante la preparazione del carro miscelatore

metodica di qPCR per la determinazione ed enumerazione di C. tyrobutyricum in latte, formaggio, foraggi e altre matrici, applicabile nei laboratori di analisi su larga scala;

tecniche di Next Generation Sequencing per lo studio del microbioma del formaggio Grana e per l’individuazione del microbiota di alterazione.

Conoscenze riguardo la presenza di micotossine negli insilati, i fattori

predisponenti la loro presenza e i reali effetti sugli animali;

Si è evidenziata la possibilità di determinare indirettamente mediante

strumenti infrarosso, alcuni parametri che consentono di valutare in

maniera più ampia l’idoneità del latte alla trasformazione a Grana

Padano. Gli approfondimenti degli studi iniziati con approccio

proteomico e metabolomico paiono promettenti e meritano un

proseguimento.

Sussiste una relazione tra le specie di batteri lattici nel siero innesto e lo

sviluppo di clostridi alterativi? Ulteriori prove sperimentali di caseificazione

mirate a dimostrare l’effetto del microbiota del siero innesto e della sua

tecnologia di preparazione sullo sviluppo di clostridi butirrici e sulla

comparsa del difetto

I risultati del progetto indicano una relazione tra alimentazione delle

bovine da latte e il numero di clostridi nel tratto digerente e nelle feci. Le

nuove tecnologie di analisi del microbioma intestinale, basate su

approcci di NGS, consentirebbero oggi di investigare in dettaglio le

interazioni tra dieta e comunità di clostridi e rappresentano un possibile

approccio sperimentale.