Un análisis de la seguridad ambiental de las proteínas...

Un análisis de la seguridad ambiental de las proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation1156 Fifteenth Street N.W., Washington D.C. 20005-1743 EE. UU.

7 de febrero de 2013

Palabras clave

Cry34, Cry35, proteínas in-secticidas cristalinas, toxina binaria, Bacillus thuringien-sis, resistencia a los insectos, genéticamente modificado, evaluación de riesgo ambiental

Copyright © ILSI Research Foundation 2013El presente trabajo está autorizado en virtud de la licencia Creative Commons Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0 de Estados Unidos. Para ver una copia de esa licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/ o envíe una carta a Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California, 94105, EE. UU.

INTRODUCCIÓN

Este documento provee un análisis exhaustivo de la información y los datos relevantes para la evaluación del riesgo ambiental de dos proteínas codificadas por genes aislados deBacillus thuringiensis, Cry34Ab1 y Cry35Ab1, y presenta un informe en síntesis de la seguridad ambiental de esas proteínas cuando se las produce en el evento del maíz genéticamente modificado (GM) DAS-59122-7 (Zea mays, L.). Todas las fuentes de información aquí revisadas están disponibles públicamente e incluyen expedientes presentados a las autoridades reguladoras; documentos de decisiones preparados por las autoridades reguladoras; descripciones del producto preparadas por los desarrolladores de productos y bibliografía revisada por pares.

Las evaluaciones de riesgo ambiental relacionadas con la plantación de cultivos GM se realizan caso por caso y consideran la biología de la planta, las características de los transgenes y las proteína codificadas, el fenotipo que concede el transgen, los usos previsto del cultivo y la naturaleza del ambiente en que se introducirá la planta. Dichas evaluaciones, que consideran riesgo y exposición, por lo general implican comparaciones con una línea progenitora sin transformar o con una isolínea muy relacionada (Craig, Tepfer, Degrassi y Ripandelli, 2008; OCDE, 2007). El propósito de estas comparaciones es identificar los posibles riesgos que la planta GM podría presentar al ambiente, más allá de los ya aceptados de plantas similares no GM. Se evalúan las consecuencias de esos riesgos, si los hay.

Las aprobaciones reglamentarias1 para liberaciones ambientales y el uso en alimentos y para alimentación del evento de maíz GM DAS-59122-7, presente solo en una variedad de maíz o junto con otros eventos GM, se emitieron en tres países: Canadá (en 2005), Japón (en 2006), y en Estados Unidos (en 2005) (Vea ILSI,

1 Es posible que los reglamentos requieran la renovación periódica de los registros de pesticidas. Por ejemplo, el estado actual de los registros de USEPA se puede consultar enhttp://www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/pip_list.htm.

Base de datos de cultivos GM, http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database).

ORIGEN Y FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS CRY34Ab1 Y CRY35Ab1

Bacillus thuringiensis y las proteínas insecticidas Cry34Ab1 y Cry35Ab1

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria en forma de bastón, gram positiva, que produce endosporas de larga vida. Aunque se la considera una bacteria del suelo, Bt es ubicua en el ambiente. Se ha estudiado la especie con profundidad y se la ha utilizado comercialmente durante varios años como un pesticida agrícola debido a su capacidad de sintetizar una gran cantidad de proteínas con actividad contra un amplia variedad de pestes en los cultivos (Hofte and Whiteley, 1989; OCDE, 2007; Schnepf et al., 1998; van Frankenhuyzen, 2009).

En Francia en 1938 se utilizaron preparados de bacterias Bt aisladas naturalmente como insecticidas comerciales y desde entonces el uso de preparados de Bt como insecticida se volvió común en todo el mundo. Bacillus thuringiensis está registrado para su uso en los Estados Unidos desde 1961 (USEPA, 1998) y varios preparados Bt se registraron en Australia, Canadá, y la Unión Europea (APVMA, 2013; DGSANCO, 2013; Health Canada, 2008; Kumar, Sharma y Malik, 1996; Schnepf et al., 1998). Debido a que esos preparados derivan de células cultivadas de bacterias Bt, contienen una mezcla compleja de todas las proteínas pesticidas producidas por la cepa usada. Muchos cientos de proteínas pesticidas fueron aisladas de cultivos de Bt (Crickmore et al., 2012) y esas proteínas muestran una formidable secuencia de diversidad, modo de acción y especificidad diana (Hofte y Whiteley, 1989; OCDE, 2007; Pigott y Ellar, 2007; Schnepf et al., 1998; Vachon, Laprade y Schwartz, 2012; van Frankenhuyzen, 2009). Incluyen compuestos fungicidas, ß-exotoxinas, proteínas Cyt (cytolytic), proteínas insecticida vegetativas (Vip) y las δ-endotoxinas, un grupo que incluye las proteínas insecticidas Cry (cristalinas) (Hofte y Whiteley, 1989;

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OCDE, 2007; Schnepf et al., 1998). Esas proteínas pueden interactuar entre ellas para influenciar el espectro de actividad y toxicidad de los preparados de bacterias individuales (OCDE, 2007; Schnepf et al., 1998).2

En 2012, científicos industriales informaron el aislamiento de una sustancia proteínica nueva de cuerpos de inclusión de cristales paraesporales de varias cepas de Bt (Ellis et al., 2002; Narva et al., 2000). Se descubrió que esa sustancia era tóxica para el gusano de la raíz de maíz del oeste (Diabrotica virgifera virgifera) (WCR) pero no para el taladro del maíz europeo (Ostrinia nubilalis) (ECB), el gusano de la mazorca del maíz (Helicoverpa zea) o el gusano cortador grasiento (Agrotis ipsilon). Un análisis detallado reveló que la toxina estaba compuesta de dos proteínas, una de una masa aproximada a 44 kDa y la otra de una masa de entre 13 y 14 kDa. Las dos proteínas estaban codificadas por genes adyacentes en un único operón, donde el gen codificaba a la proteína más pequeña ubicada secuencia arriba del gen para la proteína más grande, separada por un separador de aproximadamente 100 bp. Mientras que ninguna de las proteínas tenía homología secuencial significativa para conocer las proteínas Bt insecticidas Cry, la proteína 44 kDa tenía aproximadamente entre un 26% a 29% de homología secuencial de proteínas insecticidas Cry de B. sphaericus3 con actividad contra mosquitos (Ellis et al., 2002; Jones et al., 2007; Schnepf et al., 2005).

Las cepas Bt recombinantes que producían solo la proteína 14 kDa o la 44 kDa no eran insecticidas para los WCR, lo que condujo a la conclusión de que las dos proteínas conformaban una toxina binaria (Ellis et al., 2002).4 Cuando se las probó en larvas del gusano de la raíz del maíz meridional (Diabrotica undecimpunctata howardi) (SCR), la proteína 14 kDa sola inhibía el crecimiento de los insectos, pero su toxicidad contra SCR se sinergizaba por la proteína 44 kDa. Una cantidad relativamente pequeña de la proteína 44 kDa parece ser necesaria para el sinergismo, por ejemplo, una relación 9:1 de 14 kDa:44 kDa es suficiente para una alta mortalidad de SCR. Sin embargo, no se ha identificado una relación óptima (Ellis et al., 2002; Herman et al., 2002).

Las proteínas 14 kDa y 44 kDa se clasifican como Cry δ-endotoxinas y se designaron Cry34Ab1 y Cry35Ab1, respectivamente (Crickmore et al.,

2 El espectro de la actividad de los rociadores preparados de un cultivo Bt par-ticular se debe a una combinación de múltiples toxinas producidas por la bacteria así como las cualidades de las células bacterianas, que pueden tener un impacto de la selectividad y el rango del receptor (Schnepf et al., 2005; Tabashnik, 1992). Por lo tanto, el espectro de actividad de rociadores hechos de cultivos bacterianos Bt puede diferir del espectro de actividad de proteínas Bt individuales producidas por una planta GM. (OCDE 2007).

3 Bacillus sphaericus fue renombrada Lysinibacillus sphaericus (Ver Ahmed et al. 2007. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(5): 1117-25.

4 En este documento los términos "Toxina binaria”, “Cry34Ab1 y Cry35Ab1”, y “Cry34Ab1/Cry35Ab1” se usan de manera intercambiable.

2012). Los genes que codifican las proteínas, cry34Ab1 y cry35Ab1,5 se clonaron en Pseudomonas fluorescens para una expresión heteróloga (Gao et al., 2004; Huang, Badger, Haney y Evans, 2007). La actividad biológica de la forma binaria de la toxina, cuando se produce en P. fluorescens, fue comparable a la de la toxina que se producía en las plantas de maíz GM (Gao et al., 2004; Huang et al., 2007; Moellenbeck et al., 2001; USEPA, 2005a). Las proteínas, ya sean producidas en P. fluorescens o en el maíz, tenían el mismo peso molecular, reconocimiento inmunogénico y secuencias N-terminal. Además, ninguna de las proteínas está glicosilada en P. fluorescens o en el maíz, aunque ambas proteínas tienen sitios de N-glicosilación (Gao et al., 2004). Cry34Ab1 experimenta inmediatamente el truncamiento del extremo C-terminal en el estómago medio de insectos sensibles, lo que reduce el peso molecular a 40 kDa, pero el truncamiento no inhibe el efecto sinérgico de Cry35Ab1 en la toxicidad de Cry34Ab1; de hecho, el truncamiento de Cry35Ab1 tiene un efecto de potenciación más fuerte en la toxicidad de Cry34Ab1 (Gao et al., 2004).

La toxina binaria tiene un espectro de actividad estrecho, es tóxica en primer lugar para las larvas de especies de insectos coleópteros. Las larvas de WCR, SCR, y el gusano de la raíz del maíz septentrional (Diabrotica barberi) son las más sensibles. Por eso, los genes que codifican la toxina binaria se usan ya sea solos o combinados con genes de otras toxinas de Bt activas de Diabrotica, en las variedades de maíz propensas a ser cultivadas en regiones en que la depredación del gusano de la raíz causa grandes pérdidas de cultivos (Baum et al., 2004).

Mecanismo de la actividad insecticida de Cry34Ab1/Cry35Ab1

Como otras proteínas insecticidas Cry, la toxina binaria causa daño celular en el intestino medio de insectos susceptibles a través de la creación de canales iónicos, lo que resulta en la desestabilización de la membrana. Ese efecto aumenta significativamente en condiciones ácidas, como las que existen en el estómago de los coleópteros, en oposición a las condiciones alcalinas que aparecen en el estómago medio de las larvas de lepidópteros (Masson et al., 2004; Moellenbeck et al., 2001). Los poros pueden ser creados por la proteína Cry34Ab1 o la Cry35Ab1 individualmente, pero los poros resultantes de la mezcla de ambas proteínas se mantienen abiertos por más tiempo, lo que causa una mayor desestabilización de la membrana. Además, la versión truncada de 40 kDa de la proteína Cry35Ab1 resultó ser más efectiva en la creación de poros que la versión nativa de 44kDa. La conversión de la proteína nativa a la versión truncada tiene un pH óptimo de 5.5-6.0, similar al pH del intestino medio de las larvas de coleópteros El estómago medio de los lepidópteros proporciona un entorno más alcalino y esa diferencia puede ser un factor en la selectividad de la toxina binaria (Masson et al., 2004). Aunque se desconoce el mecanismo preciso por el que la toxina binaria forma poros y desestabiliza membranas, parece involucrar un mecanismo diferente al asociado con Cry3Bb1, otra proteína pesticida de Bt activa en

5 Más investigaciones revelaron que la toxina binaria Cry34Ab1/Cry35Ab1 es miembro de una familia de toxinas producidas por varias cepas de B. thuringien-sis que se encuentran en Asia, Australia y en América del Norte y del Sur (Jones et al., 2007). No obstante, de las toxinas de esa familia descubiertas hasta ahora, la toxina binaria Cry34Ab1/Cry35Ab1 tiene el nivel más alto de actividad pesti-cida contra WCR (Baum et al., 2004; Schnepf et al., 2005).

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contra de los WCR (Gassmann, Petzold-Maxwell, Keweshan y Dunbar, 2011; Masson et al., 2004).

Expresión de Cry34Ab1/Cry35Ab1 en maíz GM resistente a los insectos

Los niveles de expresión transgénica en una planta GM modificada pueden ser influenciados por muchos factores relacionados al proceso de transformación genética, entre ellos el tipo de secuencias de promotor y terminador utilizadas, también la ubicación cromosómica en donde el transgen se incorporó al genoma. Los niveles de expresión también pueden estar modificados por el tipo de tejido que se tome de la muestra, la edad de la planta al momento en que se tomó la muestra y las condiciones ambientales en que crecía la planta. Los datos obtenidos de los ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), que muestran niveles de expresión de las proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en plantas de maíz GM DAS-59122-7, están disponibles en presentaciones reglamentarias de acceso público y documentos de decisión asociados con procesos de aprobación regulatoria a nivel nacional, supranacional y de estado miembro (BBAC, 2009; CFIA, 2005a; EFSA, 2008, 2009a, 2009b; FSANZ, 2005; USDA, 2005). Se recolectaron muestras de diferentes tipos de tejidos, en estadios de crecimiento múltiples y de plantas cultivadas en diferentes ubicaciones para conseguir datos representativos del rango típico de la expresión de ambas proteínas. La Tabla 2 presenta los valores más altos informados de expresión de las proteínas Cry34Ab1/Cry35Ab1 en las plantas de maíz GM que contenían DAS-59122-7 solo o cuando DAS-59122-7 estaba junto a otros eventos en la misma planta. Los datos de expresión de proteínas pueden utilizarse para calcular la exposición potencial de varios organismos en el entorno a Cry34Ab1/Cry35Ab1 cuando se cultiva el evento de maíz GM DAS-59122-7 que produce dichas proteínas. Los datos que existen actualmente sobre la expresión de las proteínas Cry34Ab1/Cry35Ab1 por DAS-59122-7 y DAS-59122-7 junto con otros eventos GM aparecen en el Anexo I. En algunos casos cuando las plantas de maíz GM contenían cry34Ab1/cry35Ab1 y un gen para la tolerancia a los herbicidas (pat o epsps), se recolectaron los datos de la expresión de las proteínas de plantas que habían sido tratadas con herbicida, glufosinato o glifosato apropiado, así como también de plantas cultivadas en la misma ubicación pero sin rociar, para determinar si el herbicida tenía algún efecto en la concentración de la proteína.

Tabla 1: La mayor concentración de proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1 registrada en maíz GM DAS-59122-7 y en uniones de tejidos de DAS-59122-7.

Tejido ng Cry34Ab1/mg peso seco(etapa de crecimiento)

ng Cry35Ab1/mg peso seco(etapa de crecimiento)

Hoja302

(R4 – el contenido de los granos es pastoso)

126(R4 – el contenido de los granos

es pastoso)

Grano 117(Madurez de la semilla)

3.7(Madurez de la semilla)

Raíz 102(Madurez)

15.4(V9 – el collar de la cuarta hoja

es visible)

Polen 87.2(Antesis)

0.15(Antesis)

Planta entera

88(Madurez)

18.1(R1 – el pelo se hace visible)

Modificaciones a los genes que codifican a Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en maíz GM

Para producir maíz GM resistente a los insectos DAS-59122-7, se aislaron los genes cry34Ab1 y cry35Ab1 de la cepa B. thuringiensis Berliner PS149B1 (Ellis et al., 2002). Se crearon versiones sintéticas de los genes en que las secuencias de ADN se modificaron para reflejar la preferencia codónica en el maíz, para una expresión óptima de la proteína (Murray, Lotzer y Eberle, 1989). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1 resultantes fueron idénticas a las secuencias de las proteínas bacterianas nativas. La transcripción de los genes Cry34Ab1 y Cry35Ab1 fue dirigida por el promotor de ubiquitina y el promotor de peroxidasa de trigo, respectivamente. La terminación de la transcripción fue dirigida por el terminador 35S (CFIA, 2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2005; USEPA, 2005a, 2005b, 2010; USFDA, 2004).6

PRUEBA E IMPACTOS DE LA EXPOSICIÓN A LAS PROTEÍNAS CRY34AB1 Y CRY35AB1 EN LOS ORGANISMOS NO DIANA

La toxina binaria Cry34Ab1/Cry35Ab1 tiene propiedades insecticidas contra ciertas especies de insectos coleópteros cuando se expresa en el maíz GM DAS-59122-7. La toxina se dirige a las plagas de coleópteros que se alimentan de las raíces, así reduce el daño causado por la alimentación de esas plagas (Baum et al., 2004; Ellis et al., 2002; Gao et al., 2004; Herman et al., 2002; Kaiser-Alexnat, Büchs, y Huber, 2009; Oppert, Ellis y Babcock, 2010; Schnepf et al., 2005; Storer Babcock, y Edwards, 2006). Se denominan organismos no diana (non-target organism, NTO) a los organismos del ambiente que no son plagas de maíz pero que están, directa o indirectamente, expuestos a la toxina binaria. La exposición directa ocurre cuando los NTO se alimentan de tejidos de cultivos vivos que expresan la toxina binaria o de desechos de cultivos que se encuentran arriba o debajo del suelo. La exposición indirecta resulta de la depredación de un organismo a otro que estuvo directamente expuesto a la toxina binaria. El daño potencial a los NTO por la exposición a la toxina binaria se consideró en evaluaciones de riesgo realizadas por muchas autoridades reguladoras (CFIA, 2005a; EFSA, 2008; USDA, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Los datos recolectados de las pruebas de campo del maíz GM que produce la toxina binaria y enviados a los reguladores establecieron que las proteínas Cry34Ab1/Cry35Ab1 son específicamente activas contra el subconjunto de plagas de coleópteros que se alimentan de la raíz del maíz y que son inofensivas para las especies vertebradas y otros NTO (CFIA, 2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

Las evaluaciones de los posibles impactos a los NTO y las decisiones reglamentarias informadas por la evaluación están fundamentadas en la bien documentada y larga historia de la evaluación de formulaciones de insecticidas clásicos, como la formulación microbiana de B. thuringiensis (Romeis et al., 2008, 2013; Sanvido et al., 2012). Las evaluaciones de

6 La secuencia de ADN que se utiliza en el proceso de transformación original, que resultó en el aislamiento del evento DAS-59122-7, también contiene el gen pat, que confiere tolerancia a los herbicidas de glufosinato de amonio. Para obten-er un análisis completo de la seguridad ambiental de la proteína PAT, consulte “A Review of the Environmental Safety of the PAT Protein” (CERA, 2011).

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impactos sobre los NTO incluyen una revisión crítica de datos entregados por el desarrollador del producto para demostrar que los NTO expuestos a la toxina binaria, directa o indirectamente, no están dañados. La evaluación de riesgos de los NTO comienza normalmente con una determinación de los organismos que tienen posibilidad de estar directa o indirectamente expuestos a la toxina binaria. A menudo, se otorga una consideración particular a los NTO que tienen funciones beneficiosas para el ambiente, como los polinizadores o los enemigos naturales de las plagas agrícolas. Las autoridades reguladoras pueden prestarle atención especial a los NTO que se designaron como especies amenazadas o en peligro o especies con valor cultural reconocido. Esas especies, o sustitutos válidos de esas especies, se evalúan para determinar si la exposición a la toxina binaria puede causar impactos adversos importantes.

El acercamiento "por niveles" para evaluar los impactos de los pesticidas químicos sobre los NTO se usa efectivamente desde hace muchos años, científicos y reguladores también determinaron que la evaluación en niveles es apropiada para la evaluación de impactos posibles de los cultivos GM sobre los NTO (Duan, Lundgren, Naranjo y Marvier, 2009; Dutton, Romeis y Bigler, 2003; EFSA, 2006; Garcia-Alonso et al., 2006; Raybould, 2006; Romeis et al., 2008, 2013; USEPA, 2007, 2011). Normalmente, los primeros estudios por niveles involucraban la exposición de NTO o especies sustitutas a grandes concentraciones de pesticidas, en condiciones controladas de laboratorio. Esos estudios identifican a las especies que se ven muy afectadas por los pesticidas. Dichos efectos, cuando se encuentran, pueden requerir de un análisis mayor a un nivel superior. Las primeras pruebas por niveles también identifican aquellos NTO que no son afectados por la proteína pesticida y para los cuales no es necesario realizar pruebas en niveles superiores. Las pruebas en un nivel superior también pueden ser apropiadas cuando los resultados de las pruebas anteriores son inconclusos. Las pruebas en niveles superiores involucran mayores niveles de complejidad y de condiciones reales de evaluación (EFSA, 2006; Garcia-Alonso et al., 2006; Romeis et al., 2008; USEPA, 2007, 2011).

Vías de exposición ambiental

Además del contacto directo con la planta del maíz GM, las autoridades reguladoras pueden considerar otras vías posibles de exposición a la toxina binaria Cry34Ab1/Cry35Ab1: exposición a la toxina en el polen, exposición a la toxina depositada en el suelo por el material de plantas en descomposición y exposición a especies depredadoras que consumen herbívoros que se alimentaron de plantas de maíz GM (CFIA, 2005a; EFSA, 2007, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

La exposición a Cry35Ab1 a través del polen está limitada por los bajos niveles de expresión de esa proteína en el polen de variedades que los reguladores autorizaron para emisiones al medio ambiente (ver Tabla 2 y Anexo II). La expresión de Cry34Ab1 en el polen se compara con los niveles que se encuentran en las plantas enteras de maíz, pero la exposición a Cry34Ab1 por el polen está limitada por la creciente disminución de la densidad de deposiciones de polen con distancia en aumento de la fuente de origen (JBCH, 2006a). (Ver Anexo I para encontrar datos sobre el nivel de expresión en el polen de variedades aprobadas). Además, los datos entregados a las autoridades reguladoras indican que la toxina binaria se degrada rápidamente una vez que se libera del tejido de la

planta en descomposición y no suele continuar o acumularse en el suelo (USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005b, 2010).

Prueba ecotoxicológica de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en organismos no diana

Las pruebas ecotoxicológicas de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en NTO se realizaron en una variedad de organismos bien caracterizados mediante pruebas que se usan típicamente para pruebas ecotoxicológicas de pesticidas químicos y los datos de esas pruebas los evaluaron autoridades reguladoras durante las evaluaciones de riesgo para las emisiones ambientales de variedades de maíz GM. Aunque se puede presentar cierta exposición biológicamente significativa a poca distancia de los campos de cultivo, por lo general, las autoridades reguladoras únicamente solicitan datos del impacto de la toxina binaria en las especies polinizadoras más representativas, es decir, en las abejas melíferas. Además, la especificidad de la toxina binaria a la Coleóptera y la evidencia que sugiere la posibilidad de exposición al suelo condujo a los reguladores a requerir las pruebas de especies representativas de artrópodos que habitan en el suelo. Algunas autoridades reguladoras también piden que se recolecten datos sobre especies no artrópodas que habiten en el suelo, como las lombrices de tierra, para demostrar que no hay impactos significativos sobre esas especies por la exposición a la toxina binaria. Entre los organismos de prueba se incluyeron Apis mellifera (abeja melífera); Orius insidious (chinche pirata diminuta); Coleoptera: Coccinella septempunctata, Hippodamia convergens y Coleomegilla maculata (mariquita) Chrysoperla carnea (crisopa de alas verdes); Nasonia vitripennis (avispa parasitaria); Folsomia candida (colémbolos); Daphnia magna; y Eisenia foetida (lombrices) (Balog, Szenasi, Szekeres y Palinkas, 2011; CFIA, 2005a; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Los organismos de prueba fueron expuestos a niveles de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 que representaban la peor situación de exposición calculada en base a las concentraciones de toxina binaria más altas encontradas en los tejidos de plantas de maíz GM, e iban desde 0.15 – 302 ng/mg en peso seco de tejido (Ver Tabla 2). Ninguno de los organismos mostró una respuesta importante a la toxina binaria (CFIA, 2005a; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Además, se realizaron pruebas toxicológicas y de equivalencia nutricional sobre algunos vertebrados: Mus musculus (ratón); Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris); Gallus domesticus (pollo); and Rattus rattus (rata Sprague Daley)(CFIA, 2005a; EFSA, 2007; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; Malley et al., 2007; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005b, 2010).7 Ver Tabla 2.

Los resultados de las pruebas del Nivel 1 indican que no es necesario realizar pruebas en un nivel superior desde un punto de vista regulador, porque no se detectaron efectos adversos;8 no obstante, como se analiza a continuación, se realizaron estudios de los efectos de la toxina binaria en poblaciones naturales de NTO.

7 USEPA emitió un registro condicional del evento DAS-59122-7, pero requiere que el aplicante realice dos pruebas adicionales, utilizando Orius insidiosus (chinche pirata diminuta) y carábidos (escarabajo de tierra) (USEPA, 2005a).

8 La realización de estudios en el terreno se considera caso por caso, según el nivel de daño y exposición potenciales, y los objetivos se pueden modificar a medida que se acumulan información y experiencia (USEPA, 2007).

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Tabla 2: Resumen de estudios ecotoxicológicos de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 sobre organismos no diana, no lepidópteros (Malley et al., 2007; USDA, 2004)

Especies Método de exposición Resultados Comentarios

Apis mellifera (abeja melífera)

Polen Cry34/35Ab1 del evento TC5639

NOECpolen = 2 mg/larva (0.056 μg Cry34/35Ab1 ICP†/larva)NOECICP = 20 μg/larva

Los microorganismos produjeron proteínas Cry34Ab1 (54% pura) y Cry35Ab1 (37% pura)

NOECCry34Ab1 = 3.2 μg/larvaNOECCry35Ab1 = 2.4 μg/larva

Chrysoperla carnea(crisopa verde)


NOEC > 280 μg a.i./mLLC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLNOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLLC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mLNOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL

Coleomegilla maculata(mariquita de doce puntos)


LC50 > 902 μg a.i./gNOEC > 902 μg a.i./gLC50 Cry34Ab1 > 900 μg a.i./gNOEC Cry34Ab1 > 900 μg a.i./gLC50 Cry35Ab1 > 2 μg a.i./gNOEC Cry35Ab1 > 2 μg a.i.

Se informó reducción de peso

Polen endogámico homocigoto mezclado 1:1 con huevos de gusanos de maíz molidos.

NOEC >58.52 μg a.i./gNOEC Cry34Ab1 > 58.5 μg a.i./gNOEC Cry35Ab1 > 0.02 μg a.i./g

Sin efectos sobre la mortalidad, el peso o el desarrollo

Daphnia magna Los microorganismos produjeron proteínas Cry34Ab1 (54% pura) y Cry35Ab1 (37% pura)

EC50 > 100 mg a.i./LNOEC > 100 mg a.i./LLC50 Cry34Ab1 > 57 mg a.i./LNOEC Cry34Ab1 > 57 mg a.i./LLC50 Cry35Ab1 > 43 mg a.i./LNOEC Cry35Ab1 > 43 mg a.i./L

Eisenia foetida(Lombriz de tierra)


LC50 > 25.4 mg a.i./kg de suelo secoNOEC > 25.4 mg a.i./kg de suelo secoLC50 Cry34Ab1 > 6.4 mg a.i./kg de suelo seco NOEC Cry34Ab1 > 6.4 mg a.i./kg de suelo secoLC50 Cry35Ab1 > 19.0 mg a.i./kg de suelo secoNOEC Cry35Ab1 > 19.0 mg a.i./kg de suelo seco

Folsomia candida (Colémbolos)


LC50 > 12.7 mg a.i./kg dietaNOEC > 12.7 mg a.i./kg de dietaLC50 Cry34Ab1 > 3.2 mg a.i./kg de dietaNOEC Cry34Ab1 > 3.2 mg a.i./kg de dietaLC50 Cry35Ab1 > 9.5 mg a.i./kg de dietaNOEC Cry35Ab1 > 9.5 mg a.i./kg de dieta

Gallus domesticus(pollo)

Alimento que consiste 60% de maíz, evento DAS-15344

LC50 > 25.1 ng a.i./mg de dietaNOEC > 25.1 ng a.i./mg de dietaLC50 Cry34Ab1 > 23 ng a.i./mg de dietaNOEC Cry34Ab1 > 23 ng a.i./mg de dietaLC50 Cry35Ab1 > 2.1 ng a.i./mg de dietaNOEC Cry35Ab1 > 2.1 ng a.i./mg de dieta

Sin efectos sobre la mortalidad, aumento de peso, eficiencia de alimentación o rendimiento de canal

Hippodamia convergens(mariquita)


LC50 ICP > 280 μg a.i./mLNOEC > 280 μg a.i./mLLC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLNOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLLC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mLNOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL

Mus musculus(ratón)


LD50 Cry34Ab1> 2700 mg a.i./kgLD50 Cry35Ab1> 1850 mg a.i./kgLD50 Cry34/35Ab1> 2000 mg a.i./kg

Nasonia vitripennis(avispa parasitaria)


LC50 > 280 μg a.i./mLNOEC > 280 μg a.i./mLLC50 Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLNOEC Cry34Ab1 > 160 μg a.i./mLLC50 Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mLNOEC Cry35Ab1 > 120 μg a.i./mL

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Tabla 2 (continuación)

Especies Método de exposición Resultados Comentarios

Oncorhynchus mykiss(trucha arco iris)


LC50 > 100 mg a.i./kg de dietaNOEC > 100 mg a.i./kg de dietaLC50 Cry34Ab1 > 25 mg a.i./kg de dietaNOECCry34Ab1 > 25 mg a.i./kg de dietaLC50 Cry35Ab1 > 75 mg a.i./kg de dieta NOEC Cry35Ab1 > 75 mg a.i./kg de dieta

Rattus rattus(ratas Sprague Daley)

Evaluación subcrónica de 90 días; alimento que consiste 35% de maíz, evento DAS-59122-7

No se observaron diferencias adversas relacionadas a la dieta

† ICP = Proteína insecticida cristalina

Estudios de campo de Cry34Ab1/Cry35Ab1 en organismos no diana

Las autoridades reguladoras han considerado el posible impacto de la toxina binaria en poblaciones naturales de NTO y determinaron que los efectos adversos sobre NTO son poco probables por diversas razones. Primero, la toxina binaria tiene un espectro reducido de actividad pesticida. Segundo, en ensayos de laboratorio de Nivel I, que emplearon un rango de especies invertebradas presentes en los ecosistemas agrícolas de maíz, o sustitutos para esas especies, se demostró que la toxina binaria no causa efectos observables en esas especies. Tercero, en estudios de Nivel I también se demostró que la toxina binaria no tiene ningún efecto observable en especies vertebradas ni acuáticas representativas. Cuarto, los niveles de la toxina binaria utilizada en estos ensayos de Nivel I fueron mucho más altos que aquellos medidos en tejidos de maíz GM cultivados en el campo. Quinto, los estudios de campo de variedades de granos que producían la toxina binaria no mostraron efectos adversos significativos en estafilínidos, un artrópodo no diana beneficioso (Balog et al., 2011) y ningún efecto en el gusano cortador grasiento (Agrotis ipsilon) (USDA, 2004). Sexto, al compararlo con el control de insectos mediante la toxina binaria, el control de insectos habitual, que utiliza pesticidas químicos, altera la diversidad de las especies de manera significativa y daña las especies no diana. Esos descubrimientos en conjunto indican que es improbable que la toxina binaria tenga efectos adversos en poblaciones naturales de organismos, excepto en las plagas de coleóptera de los cultivos a las cuales va dirigida (Balog et al., 2011; CFIA, 2005a; EFSA, 2008; FSANZ, 2005; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

ESTABLECIMIENTO Y PERSISTENCIA EN EL AMBIENTE DE PLANTAS DE MAÍZ QUE EXPRESAN CRY34Ab1 AND CRY35Ab1

Biología de la especie de planta

La biología de la especie de planta no GM dentro del ambiente que la recibe es, por lo general, el punto de partida de las evaluaciones de riesgo ambiental de plantas GM (OCDE, 2003, 2007). Se puede utilizar información sobre la biología de la planta no GM para evaluar si una variedad GM de la planta puede convertirse en maleza, invasiva o dañina de cualquier otra forma para el ambiente. También puede brindar detalles acerca de las interacciones significativas entre la planta

y los demás organismos, y esos detalles pueden ser importantes para considerar los posibles perjuicios. Al considerar la biología de la planta huésped, un evaluador de riesgo puede identificar los peligros posibles que pueden estar asociados con la expresión de la nueva proteína (por ejemplo, Cry34Ab1 o Cry35Ab1) y luego puede evaluar la probabilidad de que dichos peligros se hagan realidad. Por ejemplo, el hecho de si una planta es una especie anual o perenne o si se autopoliniza o si la poliniza el viento, es relevante para evaluar la probabilidad de que la planta GM se establezca y persista fuera del cultivo (EFSA, 2006; OCDE, 1992, 2003, 2007).

Datos del fenotipo

La información acerca del fenotipo de las plantas GM que expresan Cry34Ab1 y Cry35Ab1 se recaba del laboratorio, el invernadero y los estudios de campo, y se presenta en las presentaciones reglamentarias para: (1) identificar todo cambio intencional al fenotipo que pueda afectar la seguridad ambiental de la planta, y (2) para identificar todo cambio no intencional hecho sobre la biología de la planta que pueda afectar la seguridad ambiental. En las presentaciones reglamentarias y en las publicaciones de pares, los datos del fenotipo se han concentrado en las características de la planta que podrían contribuir a su supervivencia o persistencia (es decir, el potencial para convertirse en maleza), o que podrían afectar negativamente el rendimiento agrícola (por ejemplo, la susceptibilidad frente a enfermedades y los datos de rendimiento) (CFIA, 2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Las observaciones del fenotipo tuvieron en cuenta el fenotipo resultante del rasgo transgénico deseado, en este caso, la resistencia a la depredación de insectos mediada por Cry34Ab1 y Cry35Ab1. Algunos de los datos recolectados son cuantitativos (por ejemplo, altura de la planta o porcentaje de germinación de la semilla), mientras que otros datos son cualitativos y de observación (por ejemplo, síntomas de susceptibilidad frente a enfermedades). Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre plantas GM que expresan la toxina binaria y los controles, pero esas diferencias no fueron uniformes entre las ubicaciones de ensayo en campo y se ubicaron dentro del rango informado para variedades de maíz no GM (CFIA, 2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Conjuntamente, los reguladores determinaron que los datos del fenotipo no respaldan la hipótesis de que la expresión de la toxina binaria tiene algún impacto no intencionado en la morfología general o las características del fenotipo de las plantas de maíz, además de conferir resistencia a las plagas de insectos coleópteros (CFIA, 2005a; JBCH, 2006a; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

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Potencial para convertirse en maleza en ambientes agrícolas

Generalmente no se considera al maíz como una maleza, posee pocas de las características que aumentan las posibilidades de que una planta se convierta en maleza, como latencia de las semillas, desgrane y competitividad (Baker, 1974; Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; Raybould et al., 2011; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). No hay datos que indiquen que la expresión de la toxina binaria resulte en la latencia alterada de la semilla, la capacidad de sobrevivir el invierno, ni otras características que puedan alterar la prevalencia de la voluntariedad del maíz en temporadas de crecimiento posteriores (Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; Raybould et al., 2011; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). No se espera que los voluntarios de la temporada siguiente del maíz que produzcan la toxina binaria presenten ninguna dificultad de control y se los puede tratar del mismo modo que a los voluntarios convencionales de maíz.

Potencial para convertirse en maleza en ambientes no agrícolas

Los principales mecanismos mediante los cuales se puede introducir la toxina binaria en un ambiente no agrícola son mediante el movimiento de propágulos fuera de las áreas cultivadas y mediante el flujo de genes de la planta GM a una población naturalizada de familiares compatibles sexualmente (Lee and Natesan, 2006). Las evaluaciones de riesgo para el maíz GM que expresan la toxina binaria consideran los posibles impactos asociados con ambos tipos de movimientos (Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; Raybould et al., 2011; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Como resultado del extenso cruzamiento selectivo, las variedades comerciales de maíz tienen reducida en gran medida su capacidad de persistir en ambientes no agrícolas sin la intervención del ser humano, y el maíz no se considera una maleza invasiva ni agresiva fuera de sistemas agrícolas (Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a, 2006b; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). Los datos agronómicos indican que la toxina binaria no tiene un impacto significativo sobre los rasgos asociados con el potencial para convertirse en maleza(Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010). A pesar de que se ha brindado la liberación de factores de control natural (entre ellos los insectos herbívoros) como una explicación parcial del éxito de especies invasivas (Blumenthal, 2005; Keane y Crawley, 2002; Mack, 1996; Mason, Braun, Warwick, Zhu, y Stewart, 2004), las decisiones reguladoras han determinado que es poco probable que la resistencia a plagas de coleópteros permita que el maíz productor de la toxina binaria se vuelva invasivo en ambientes no agrícolas (Carpenter et al., 2002; JBCH, 2006a, 2006b; OCDE, 2003; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

Movimiento del transgen a familiares sexualmente compatibles

El movimiento de transgenes de una planta GM a sus familiares silvestres se realiza mediante el polen, y la producción de híbridos reproductivamente viables depende de diversos factores: si el donante de polen se autopoliniza, la proximidad física y temporal de las plantas GM con las

especies compatibles sexualmente, la movilidad y viabilidad del polen y la presencia de polinizadores correspondientes. Predominantemente, el maíz es polinizado por el viento y no tiene parientes sexualmente compatibles que se consideren invasivos (Carpenter et al., 2002; OCDE, 2003). El maíz se hibrida libremente con teosintes silvestres, pero se cree que la introgresión de genes es limitada (Baltazar, De Jesús Sánchez-Gonzalez, De la Cruz-Larios y Schoper, 2005; Castillo-Gonzalez y Goodman, 1997; OCDE, 2003). Las poblaciones de teosintes silvestres se limitan a la zona de México, Guatemala y una única población en Nicaragua; y si bien algunos agricultores mexicanos la consideran una maleza grave, otros la usan como forraje y la consideran como una especie culturalmente significativa (González y Corral, 1997; Mondragon-Pichardo y Vibrans, 2005). No se espera que ocurran cruces entre teosintes y maíz GM que expresen Cry34Ab1 y Cry35Ab1 con más frecuencia que entre teosintes y variedades de maíz producidas tradicionalmente (Carpenter et al., 2002; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

ANÁLISIS DE COMPOSICIÓN DE LAS PLANTAS DE MAÍZ QUE EXPRESAN CRY34Ab1 Y CRY35Ab1

Muchos procesos de aprobación reglamentaria requieren un análisis de la composición de las plantas GM que se utilizarán en alimentos para seres humanos y animales. Los datos de composición se pueden utilizar para identificar cambios no intencionados en el cultivo debido a la presencia del transgen. Por lo general, el análisis compara la planta GM con la línea parental no transformada o una isolínea estrechamente relacionada, y los analitos medidos dependen del cultivo y sus usos planificados. El análisis puede utilizar plantas que se cultivan en diversas ubicaciones durante el transcurso de más de un año, debido a que las condiciones ambientales locales pueden tener un impacto en la composición nutricional, incluso en variedades producidas en forma convencional. El objetivo del análisis es verificar que los valores obtenidos para la planta GM están dentro del rango observado en las variedades tradicionales cultivadas en condiciones comparables.

La semilla del maíz GM que expresa Cry34Ab1 y Cry35Ab1 se ha sometido a un análisis proximal para determinar los niveles de proteína cruda, grasa cruda, fibra, humedad y ceniza. Además, se han determinado los niveles de minerales seleccionados, ácidos grasos y aminoácidos. Algunas plantas del cultivo producen toxinas o compuestos antinutritivos, y también se miden los niveles de estos compuestos para determinar si la presencia de los transgenes ha resultado, de manera inadvertida, en una producción elevada de estas sustancias. Se sabe que el maíz produce compuestos antinutritivos como ácido fítico, rafinosa y el inhibidor de la tripsina (OCDE, 2002), y se determinaron los niveles de estas sustancias. En el Anexo II se sintetizan los datos de las fuentes disponibles al público. Todas las diferencias encontradas en las variedades de maíz GM analizados y las variedades del comparador se encontraron dentro del rango normal de variación, y esas diferencias se consideraron irrelevantes para la seguridad ambiental (CFIA, 2005a; EFSA, 2008, 2009b; Health Canada, 2006; USDA, 2004, 2005; USEPA, 2005a, 2010).

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CONCLUSIÓN

Las proteínas Cry34Ab1 y Cry35Ab1 producidas por plantas de maíz GM con resistencia a los insectos se derivan de las bacterias comunes del suelo Bacillus thuringiensis y son específicamente tóxicas para los coleópteros. Las pruebas de toxicidad con un rango representativo de organismos no diana arrojó valores de NOEC en concentraciones significativamente mayores que las concentraciones ambientales esperadas de Cry34Ab1 o Cry35Ab1. Los datos del terreno sugieren que el cultivo de plantas de maíz GM que expresan la toxina binaria no afecta la abundancia de artrópodos no diana. La toxina binaria en plantas puede ser tóxica para los Coleópteros no diana, pero las evaluaciones reguladoras de riesgo para los productos aprobados han concluido que el riesgo es bajo debido a la falta de exposición a la toxina en el ambiente, especialmente cuando se compara con otras prácticas de control de insectos. El peso de las pruebas de los análisis de datos de fenotipo y de composición demuestra que la expresión de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en variedades aprobadas de maíz no altera la fisiología general de las plantas del cultivo e indica que dichas plantas no tienen más probabilidades de convertirse en malezas ni en invasivas que las variedades convencionales de maíz.

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11

Tabla I.1. Niveles de expresión promedio máximos y mínimos de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en maíz DAS-59122-7

Promedio mínimong/mg peso seco de tejido

Promedio máximong/mg peso seco de tejido

Cry34Ab1 29.2(tallo híbrido rociado*)

232(hoja híbrida rociada)

Cry35Ab1 0.01(polen híbrido rociado)

85.3(hoja híbrida sin rociar)

*Los tratamientos “rociados” recibieron dos aplicaciones secuenciales de herbicida de glufosinato de amonio.

Tabla I.3. Resumen de niveles de expresión de la proteína Cry34Ab1 en el grano de maíz DAS-59122-7 cosechado en la madurez.

Promedio(ng/mg peso seco seco)

Desviación típica Rango(ng/mg peso seco)1

Número de muestras2

Control de no GM 0 0 0-0 6/6

Híbrido GM sin rociar 49.7 16.2 28.9-84.8 30/0

Híbrido GM rociado 61.1 19.4 30.9-117 30/0

GM endogámico 51.7 11.5 38.6-78.3 15/0

1 El límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) de Cry34Ab1 para granos fue de 0.072 ng/mg peso seco.2 Número de muestras = el número de muestras analizado/el número de muestras debajo del límite LOQ.

Tabla I.4. Resumen de niveles de expresión de la proteína Cry35Ab1en el grano de maíz DAS-59122-7 cosechado en la madurez.

Promedio(ng/mg peso seco seco)

Desviación típica Rango(ng/mg peso seco)1

Número de muestras2

Control de no GM 0 0 0-0 6/6

Híbrido GM sin rociar 0.99 0.33 0.48-1.58 30/0

Híbrido GM rociado 0.92 0.30 0.50-1.61 30/0

GM endogámico 1.10 0.54 0-1.83 15/2

1 El límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) de Cry34Ab1 para granos fue de 0.072 ng/mg peso seco.2 Número de muestras = el número de muestras analizado/el número de muestras debajo del límite LOQ.

Tabla I.5. Niveles de expresión promedio de Cry34Ab1 y Cry35Ab1 en tejidos de líneas de maíz híbrido que contienen el evento DAS-59122-7 (USEPA, 2005a, 2010)

Tejido Cry34Ab1 (ng/mg peso seco de tejido ± desviación estándar)* Cry35Ab1 (ng/mg peso seco de tejido ± desviación estándar)*

Hoja 50±8 - 220±38 41±7 - 85±19

Raíz 37±9 - 50±20 3±2 - 8±8

Planta entera 32±16 - 77±10 7±2 - 14±2

Polen 74±7 0.02±0.04

Tallo 33±4 10±2

Forraje 53±10 12±3

Grano 50±16 1±0.3

* Los rangos reflejan el rango de promedios en diferentes etapas de crecimiento.

Tabla I.2. Niveles de expresión en granos (ng/mg peso seco de tejido) (EFSA, 2008, 2009a, 2009b)

59122 x NK6031 59122 x 15072 59122 x 1507 x NK603 59122

Promedio Rango Promedio Rango Promedio Rango Promedio Rango

Cry34Ab1 52 34 – 76 52 28 – 88 48 23 – 70 41 30 – 51

Cry35Ab1 2.8 2.1 – 3.7 2.3 1.7 – 3.1 2.1 1.4– 2.9 2.2 1.3 – 3.2

1 La línea progenitora NK603 confiere tolerancia al glifosato (CP4 EPSPS).2 La línea progenitora 1507 confiere tolerancia al glufosinato y resistencia a los insectos (PAT and Cry1F).

ANNEXO I: RESUMEN DE LOS DATOS DE EXPRESIÓN DE CRY34Ab1/CRY35Ab1

Las tablas que aparecen a continuación presentan un resumen de datos de documentos de decisión preparados por autoridades reguladoras y presentaciones reglamentarias. Siempre que es posible, los datos y las estadísticas que los acompañan se presentan como aparecen en el docu-mento citado para facilitar las referencias cruzadas. En las fuentes citadas, se puede encontrar información adicional acerca de las metodologías de recolección y de toma de muestras.

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Tabla I.7. Resumen de niveles de expresión de la proteína Cry35Ab1 medida en tejidos recolectados de híbridos de maíz 59122 (evento DAS-59122-7) (USDA, 2004)

Etapa de crecimiento Tejido Promedio de Cry34Ab1

(ng/mg peso seco de tejido) Desviación típica Rango de Cry34Ab1 (ng/mg peso seco de tejido)1 Número de muestras2

V93

Hoja 40.7 7.29 29.7 – 55.1 30

Raíz 8.06 2.98 4.08 – 15.4 18

Planta entera 7.36 2.19 4.13 – 10.1 6

R14

Hoja 52.2 12.9 29.2 – 80.8 30

Polen 0.02 0.04 0 – 0.15 30

Tallo 10.0 2.26 5.64 – 14.2 30

Raíz 5.08 1.57 2.49 – 8.85 30

Planta entera 12.3 3.54 9.02 – 18.1 6

R45

Hoja 85.3 18.9 61.1 – 126 18

Raíz 3.50 0.85 1.74 – 5.76 18

Forraje 12.4 2.77 8.44 – 16.4 6

Madurez6 Grano 0.99 0.33 0.48 – 1.58 30

R67

Hoja 54.4 22.2 1.41 – 77.3 18

Raíz 3.10 2.43 0.72 – 10.6 18

Planta entera 13.9 1.91 10.7 – 16.4 6

1 Límite de cuantificación (LOQ) de muestra para Cry34Ab1: 0.18 ng/mg peso seco para hojas; 0.26 ng/mg peso seco para el polen; 0.12 ng/mg peso seco para tallos; 0.99 ng/mg peso seco para raíces; y 0.072 ng/mg peso seco para granos y los tejidos de toda la planta.2 Todas las muestras medidas superaban el LOQ3 Etapa de crecimiento cuando aparece el collar de la cuarta hoja.4 Etapa de crecimiento cuando aparece el pelo.5 Etapa de crecimiento cuando el material en el contenido de los granos produce una consistencia pastosa. Esa etapa puede ocurrir apenas transcurridos 24 días después de la polinización.6 Madurez típica de cosecha para los granos.7 Madurez, la madurez típica de cosecha para los granos.

Tabla I.6. Resumen de niveles de expresión de la proteína Cry34Ab1 medida en tejidos recolectados de híbridos de maíz 59122 (evento DAS-59122-7) (USDA, 2004)

Etapa de crecimiento Tejido Promedio de Cry34Ab1

(ng/mg peso seco de tejido) Desviación típica Rango de Cry34Ab1 (ng/mg peso seco de tejido)1 Número de muestras2

V93

Hoja 49.5 7.79 37.0 - 81.4 30

Raíz 38.8 8.28 24.6 - 56.3 18

Planta entera 31.5 15.5 8.67 - 51.9 6

R14

Hoja 80.6 12.4 59.1 - 103 30

Polen 74.4 6.57 62.9 - 87.2 30

Tallo 32.9 4.14 25 - 40.6 30

Raíz 36.8 8.54 23.3 - 52.1 30

Planta entera 45.4 13.5 35 - 71.9 6

R45

Hoja 220 37.5 143 - 302 18

Raíz 49.1 9.23 33.3 - 67.3 18

Forraje 53.1 19.1 30.5 - 82.6 6

Madurez6 Grano 49.7 16.2 28.9 -- 84.8 30

R67

Hoja 163 83.6 4.26 - 296 18

Raíz 49.7 19.6 25.7 - 102 18

Planta entera 76.5 10.3 60.5 - 88 6

1 Límite de cuantificación (LOQ) de muestra para Cry34Ab1: 0.18 ng/mg peso seco para hojas; 0.26 ng/mg peso seco para el polen; 0.12 ng/mg peso seco para tallos; 0.99 ng/mg peso seco para raíces; y 0.072 ng/mg peso seco para granos y los tejidos de toda la planta.2 Todas las muestras medidas superaban el LOQ3 Etapa de crecimiento cuando aparece el collar de la cuarta hoja.4 Etapa de crecimiento cuando aparece el pelo.5 Etapa de crecimiento cuando el material en el contenido de los granos produce una consistencia pastosa. Esa etapa puede ocurrir apenas transcurridos 24 días después de la polinización.6 Madurez típica de cosecha para los granos.7 Madurez, la madurez típica de cosecha para los granos.

13

Tabla I.8. Cálculos de exposición prolongada (HEEE, por sus siglas en inglés)1 para expresiones de proteínas Cry34/35Ab1. Los HEEE se basan en valores de expresión obtenidos de plantas de maíz no rociadas con glufosinato de amonio y plantas rociadas con glufosinato de amonio. (USDA, 2004)

Cry34Ab1 Cry35Ab1Suma de Cry34 y Cry35

Tejido (etapa de crecimiento) Promedio Desv. estánd. HEEEa N Promedio Desv.

estánd. HEEE N HEEE

Hoja (V9) 45.93 7.56 47.19 60 36.27 9.07 37.79 60 84.98

Planta entera (V9) 39.41 22.76 48.31 12 7.75 1.92 8.50 12 56.81

Raíz (V9) 38.48 8.72 40.37 36 8.05 2.80 8.65 36 49.02

Polen (R1) 74.27 6.09 75.29 60 0.02 0.03 0.03 60 75.32

Tallo (R1) 31.03 4.62 31.81 60 8.64 2.54 9.06 60 40.87

Raíz (R1) 40.58 10.43 42.32 60 5.24 1.58 5.50 60 47.83

Hoja (R1) 76.24 1.257 78.34 60 54.51 14.30 56.91 60 135.25

Planta entera (R1) 46.48 14.23 52.05 12 12.66 4.27 14.34 12 66.38

Forraje (R4) 46.58 24.23 56.06 12 13.25 2.89 14.38 12 70.44

Raíz (R4) 57.98 22.00 62.75 36 3.70 1.02 3.93 36 66.68

Hoja (R4) 226.44 39.52 235.03 36 83.01 18.39 87.00 36 322.03

Grano (R6, cosecha) 55.39 18.3 58.51 60 0.95 0.31 1.01 60 59.52

Planta entera, incluido el grano (R6, senescencia) 86.30 18.01 93.35 12 15.38 2.93 16.52 12 109.87

Planta entera, excluido el grano (R6, senescencia) 109.032 132.533

Raíz (R6, senescencia) 54.04 20.83 58.56 36 3.33 2.18 3.80 36 62.37

Hoja (R6, senescencia) 149.52 81.93 167.31 36 53.20 23.26 58.25 36 225.57

1 Cálculo de exposición prolongada = Promedio + (t0.1, por encima del valor, n-1 x desv. estánd.)/n1/2.2 Grano g dw/A = ((235 bu/A – 235 bu/A x (1-0.85 peso seco)) x 56 lb/bu) x 1 g/0.002205 lb = 5073016. Rastrojo g dw/A = Grano g dw/A x 1/0.45 = 11273369. Proteína en rastrojo μg/g dw = (Proteína en la planta entera, incluido el grano (R6, Senescencia) x Suma de Grano+Rastrojo dw/A. Proteína en grano (R6, Cosecha) x Grano g dw/A) x 1/Rastrojo g dw/A = (93.35 x 16346384 – 58.51 x 5073016) x 1/11273369 = 109.03.3 (109.87 x 16346384 – 59.52 x 5073016) x 1/11273369 = 132.53.

Tabla I.9. Proteína Cry34Ab1 y Cry35Ab1 promedio producida en maíz DAS-59122-7 (CFIA, 2005b)

Hoja, todas las etapas de

crecimiento

Raíz, todas las etapas de

crecimientoTallo Grano Polen Forraje

Cry34Ab1 54.9-266.41 35.4-43.7 49 36.4 64.7 97.7

Cry35Ab1 23.3-97.1 5.3-15.5 19.3 2.0 0.06 28.1

1 Todos los valores expresados como nanogramos de proteínas por miligramo de peso seco de tejido.

14

ANEXO II: RESUMEN DE ANÁLISIS DE COMPOSICIÓN DE EXPRESIONES DE MAÍZ GM CRY34Ab1 Y CRY35Ab1

Tabla II.1. Resumen del análisis proximal y de fibra en granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)

Analito1 Rango de bibliografíaPromedios2

DAS-59122-7 sin rociar DAS-59122-7 rociado Control

Proteína cruda 6-16.1 10.0* 10.3* 9.61

Grasa cruda 1.2-18.8 4.69 4.62 4.49

Fibra cruda 1.6-5.5 2.3 2.2 2.3

Fibra detergente ácido 1.82-11.3 3.5 3.6 3.5

Fibra detergente neutro 3.0-22.6 10.8 11.2* 10.3

Ceniza 0.62-6.28 1.55* 1.6* 1.42

Carbohidratos3 63.3-89.8 83.8 83.5* 84.5

1 Porcentaje del peso seco2 Promedios de mínimos cuadrados 3 Carbohidrato=100% - % proteína -% grasa -% ceniza* Diferencias estadísticamente significativas entre granos DAS-59122-7 y granos Control (P<0.05)

Tabla II.2. Resumen de análisis proximal y de fibra en DAS-59122-7 y en forraje de control (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)


DAS-59122-7 Control Error estándar

Proteína cruda 3.14 - 15.9 6.45 6.27 0.097

Grasa cruda 0.37 - 6.7 2.73 2.68 0.068

Fibra cruda 19 - 42 24.0 23.7 0.237

Fibra detergente ácido 16.1 - 41.0 31.7 31.1 0.363

Fibra detergente neutro 20.3 - 63.7 49.4 49.4 0.388

Ceniza 1.3 - 10.5 5.60* 5.13 0.103

Carbohidratos3 66.9 - 94.5 85.2* 85.9 0.210

1 Porcentaje del peso seco2 Promedios de mínimos cuadrados 3 Carbohidrato=100% - % proteína -% grasa -% ceniza* Diferencias estadísticamente significativas entre granos DAS-59122-7 y granos Control (P<0.05)

Tabla II.3. Resumen de análisis mineral de granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)



Calcio 0.002-0.1 0.00278* 0.00286* 0.00227

Fósforo 0.21-0.75 0.299 0.308* 0.266

Cobre 0.000085-0.001 0.000112 0.000104 0.000118

Hierro 0.0001-0.01 0.00199 0.00225 0.00194

Magnesio 0.08-1.0 0.117 0.123 0.108

Manganeso 0.00007-0.0054 0.000648 0.000686* 0.000577

Potasio 0.28-0.72 0.352 0.362 0.332

Sodio 0.0-0.15 0.000427 0.000367 0.000378

Zinc 0.00065-0.0037 0.00183 0.00179 0.00163

1 Porcentaje del peso seco2 Promedios de mínimos cuadrados * Diferencias estadísticamente significativas entre granos DAS-59122-7 y granos Control (P<0.05)

15

Tabla II.4. Resumen de análisis ácidos grasos de granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)



Ácido palmítico 6.51-19 11.5* 11.7 12.1

Ácido esteárico 0-4.17 1.39* 1.40* 1.57

Ácido oléico 18.6-46 22.8 23.1 23.3

Ácido linoleico 34-70 63.0* 62.4 61.7

Ácido linolénico 0-2.0 1.14 1.15* 1.07


Tabla II.5. Resumen de análisis amino ácidos en granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)



Metionina 0.1-0.46 0.20 0.19 0.19

Cisteína 0.08-0.32 0.23 0.22 0.22

Lisina 0.05-0.55 0.28 0.29 0.28

Triptófano 0.04-0.13 0.06* 0.06 0.06

Treonina 0.21-0.58 0.38 0.41* 0.37

Isoleucina 0.19-.071 0.34* 0.35* 0.33

Histidina 0.15-0.40 0.26* 0.28* 0.25

Valina 0.21-0.85 0.46* 0.48* 0.45

Leucina 0.43-2.41 1.33* 1.38* 1.28

Arginina 0.22-0.64 0.29* 0.30* 0.28

Fenilalanina 0.04-0.83 0.56* 0.59* 0.54

Glicina 0.24-0.50 0.35 0.36* 0.33

Alanina 0.37-1.20 0.82 0.83* 0.80

Ácido aspártico 0.37-0.95 0.69 0.70* 0.66

Ácido glutámico 0.89-3.04 2.03 2.08* 1.97

Prolina 0.43-1.46 0.96* 0.98* 0.91

Serina 0.24-0.91 0.51 0.54* 0.50

Tirosina 0.11-0.79 0.24* 0.26* 0.21


Tabla II.6. Resumen de análisis de vitaminas de granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)



Beta-caroteno 1.0, 2.53 7.62 7.74 6.87

Vitamina B1 1.0-8.6 5.45 5.93 5.77

Vitamina B2 0.25-16.5 ND4 ND ND

Ácido fólico 0.147-1.209 0.593* 0.603 0.634

Vitamina E5 1.5-6.87 6.59* 6.60* 5.65

1 Porcentaje del peso seco2 Promedios de mínimos cuadrados 3 Solo se consiguieron 2 valores de referencia4 ND=No Detectado.5 Medido como α-tocoferol * Diferencias estadísticamente significativas entre granos DAS-59122-7 y granos Control (P<0.05)

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Tabla II.7. Resumen de metabolitos y antinutrientes secundarios de granos de maíz DAS-59122-7 (en 6 sitios) (FSANZ, 2005)



Metabolitos secundarios

Inositol NI3 0.022 0.022 0.021

Rafinosa 0.08-0.31 0.13 0.13 0.12

Furfural NI ND4 ND ND

Ácido ρ-coumárico 0.003-0.058 0.014 0.014 0.015

Ácido ferúlico 0.02-0.37 0.177 0.176 0.182

Antinutrientes

Ácido fítico 0.29-1.29 0.877 0.798 0.798

Inhibidor de la tripsina (TIU/g)

1.1-7.18 2.82 2.84 2.84

1 Porcentaje del peso seco2 Promedios de mínimos cuadrados 3 NI=no informado4 ND=no detectado.

Un análisis de la seguridad ambiental de las proteínas...

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