1

Profa Roberta Lourenço Ziolli

Laboratório de Estudos Ambientais e Toxicologia (LEATox)

Departamento de Química, PUC-Rio

e-mail: rlziolli@puc-rio.br

Profa Roberta Lourenço Ziolli

Laboratório de Estudos Ambientais e Toxicologia (LEATox)

Departamento de Química, PUC-Rio

e-mail: rlziolli@puc-rio.br

UFMG - Instituto de Ciências Exatas - Departamento de Química

II Jornada de Inverno de Química

27 a 30 de julho de 2010

Mini-curso:

Introdução à Química AmbientalUm olhar ...Um olhar ...Um olhar ...Um olhar ...

Mini-curso:

Introdução à Química AmbientalUm olhar ...Um olhar ...Um olhar ...Um olhar ...

Para refletir (até amanhã, rsrsrs):

Qual(is) composto(s) monitorar?Para quê?Como?Onde?

Uma Introdução à Avaliação da Qualidade das Águas

Legislação esferas municipal, estadual e federal

Padrões de Qualidade de Águae

Efluentes

Usos da água

Abastecimento doméstico;Abastecimento Industrial;Irrigação;Recreação;Lazer;Geração de energia;Transporte e navegação;Diluição de despejos;outros.

2

Parâmetros Indicadores da Qualidade da Água

A qualidade da água pode ser avaliada por meio de diversos parâmetros que traduzem suas principais características físicas, químicas e biológicas (conforme definido pela legislação). Seguem alguns exemplos:

Indicadores físicos: CorTurbidezSabor e odorTemperatura

Indicadores químicos: SalinidadeODSais mineraisMatéria orgânica

Indicadores biológicos: AlgasMicroorganismos patogênicos

Qualidade das águas foi (ainda é) baseada principalmente nos parâmetros físico-químicos e estabelecendo limites para determinadas espécies.

Questão: Como foram estabelecidos esses limites ???

Limites permissíveis de poluentes são determinados por

Ensaios de Toxicidade

rlziolli@puc-rio.br

LEA – Laboratório de Estudos AmbientaisDepartamento de Química, PUC-Rio

Medidas de toxicidadeOs Ensaios de Toxicidade com organismos aquáticos têm sido utilizados, desde a década de 40, para prever o impacto do lançamento de efluentes em recursos hídricos, e, estabelecer as concentrações

de vários compostos/substâncias que teoricamentepoderiam ser dispostos sem prejuízo do equilíbrio natural do ambiente.

Toxicologia Ambiental

Ensaios de Toxicidade

São ensaios utilizados para determinar o potencial tóxico de um agente químico, mensurados pela resposta de organismos-teste.

1. Diluições da substância + controle

2. Adição do organismo-teste(algas, bactérias, peixes, etc)

3. Tempo:24h, 48 h ou 96 h – agudo1/10 a 100% ciclo vital – crônico

4. Respostas: mortalidade (letal); redução da fecundidade; redução crescimento;motilidade, deformação, (sub-letais)

5. CL50 ou NOEC

Critérios de Avaliação da toxicidade

a) Peso dos órgãos, expresso em % do peso corporal

b) Crescimento do animal

c) Testes fisiológicos (toxicidade hepática, função renal)

d) Testes bioquímicos

e) Avaliação do comportamento, estudo da ação e dos efeitos do tóxico sobre os reflexos

f) Efeito sobre fertilidade e fetos

g) CL50

Tipos de testes

• Agudo: resposta rápida e brusca no organismo, sendo normalmente a imobilidade e/ou a letalidade;

• Crônico: efeitos deletérios nos organismos, afetando seu crescimento, reprodução, comportamento;

3

Cálculo da CL50

• Vários programas estatísticos;

• Estima a concentração que mata 50% dos organismos

• Normas: CETESB (1986), ABNT (1987) DIN 38409 (1989) e DIN 38412 (1989).

Exemplos:Testes de toxicidade usando peixes como organismo-teste

Efeitos sobre o estágio larval e embrionário

do peixe: número de embriões mortos, peso

e comprimento das larvas, etc

Estudo do ciclo de vida:

260 a 300 dias

Critério de seleção para os testes de toxicidade

1) Espécies que existam em abundância e disponíveis devem ser consideradas

2) Espécies representantes do ecossistema que pode ser afetado

3) Espécies importantes do ponto de vista ecológico e comercial

4) Espécies devem ser fáceis de manusear dentro do laboratório para facilitar os testes

5) Espécies com considerável quantidade de informações já coletadas anteriormente

Entretanto, ao longo dos anos 70, alguns pesquisadores observaram que os teores estabelecidos para os diversos agentes isoladamente poderiam, não preservar, efetivamente a qualidade das águas devido à mistura dos

compostos constituintes da matriz (efeitos sinérgicos e antagônicos).(pudera! Efluente de indústria têxtil ~ 6 compostos orgânicos e 50 inorgânicos)

Em 1987 a CETESB relatou que na grande São Paulo efluentes tratados (de acordo com os padrões de emissão) apresentaram, na maioria dos

casos, toxicidade semelhante àqueles efluentes sem tratamento.

A partir dessa observações, duas abordagens foram especificadas:(i) Controle da substância específica: usa os critérios de qualidade de

água e de padrões de efluentes para substâncias específicas.(ii) Controle como um todo: usa testes de toxicidade (em complementação

as análises químicas).

Qualidade deveria considerar os efeitos tóxicos da matriz através de testes de toxicidade e não apenas considerar a

concentração de seus constituintes específicos

→ No estado de SP, Resolução da CETESB de 2000 (“força de lei”) , contemplando os testes de toxicidade no controle dos poluentes.

→ Na Europa os testes de toxicidade foram regulamentados pelos orgãosoficiais em 1993 e, nos Estados Unidos, pela EPA desde 1985.

ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE COM Artemia sp.

ENSAIOS DE ECOTOXICIDADE COM Artemia sp.

Pontifícia Universidade Católicado Rio de Janeiro

Departamento de Química

Pontifícia Universidade Católicado Rio de Janeiro

Departamento de Química

4

Artemia sp

� É um crustáceo da ordem Anostraca (sem carapaça).

� Vive em lagos de água salgada e salinas do mundo todo.

� Tolera grandes variações de salinidade de 3,5 a 70 ‰.

� Fácil obtenção de cistos e de manuseio em laboratório.

Teste de Toxicidade Aguda

� Tem como objetivo determinar a concentração letal média (CL50) de

uma determinada substância frente a um organismo-teste em um curto

espaço de tempo.

� O ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp é um teste rápido, de

baixo custo, eficiente e que requer pequenas quantidades de amostra.

� Este tipo de ensaio tem boa correlação com atividade citotóxica de

tumores humanos sólidos e levou à descoberta de uma nova classe de

agentes antitumorais ativos. (McLaughlin, 1998)

- utilizado em testes de toxicidade de novos compostos;

- utilizado em monitoramento de efluentes;

- utilizado no monitoramento ambiental;

- ...

ENSAIO COM ARTEMIA sp. ENSAIO COM ARTEMIA sp.

⇒ Eclosão dos cistos – 48 h;

ENSAIO COM ARTEMIA sp.

⇒ Transferência dos náuplios para novo recipiente – 48 h;

⇒ Exposição dos náuplios ao composto de interesse – 48 h;

⇒ Contagem dos indivíduos mortos e vivos.

TESTES DE TOXICIDADE com Daphnia sp

microcrustáceo � espécie do zooplâncton de água doce altamente sensível à variação física e química do meio

Daphnia magna

5

Daphnia magna

Testes de toxicidade têm uma importante, mas limitada função, em estudos de poluição. Por quê?

Então, o adequado seria considerarmos os testes de toxicidades junto aos padrões de qualidade estabelecidos na legislação ???

Os testes de toxicidade podem fornecer:

• Os limites permissíveis de poluentes na água;

• Os efeitos biológicos de um determinado efluente frente a um organismo;

• Indicar quais os constituintes de um efluente são provavelmente responsáveis pelo impacto observado.

Mas, embora úteis ... eles não fornecem o impacto real de um efluente no ambiente natural ...

Para refletir (até amanhã, rsrsrs):

Qual(is) composto(s) monitorar?Para quê?Como?Onde?

Sistema real: Baía de Guanabara, RJ.

Alterações ambientais na Baía de Guanabara e em sua bacia de drenagem: início no século XVI pelo processo de ocupação urbana do Rio de Janeiro

ECOTOXICOLOGIA

6

Ecotoxicologia

Paradigma do Bumerangue: “O que você joga fora pode voltar e machucar você”

Ciência que estuda os efeitos das substâncias naturais ou sintéticas sobre os organismos vivos, populações e comunidades, animais ou

vegetais, terrestres ou aquáticos, que constituem a biosfera, incluindo assim a interação das substâncias com o meio nos quais os organismos

vivem num contexto integrado

AS BASES TOXICOLÓGICAS DA ECOTOXICOLOGIA

Ecotoxicologia

Ensaios de toxicidade

Biomarcadores

AS BASES TOXICOLÓGICAS DA ECOTOXICOLOGIA

Definição Biomarcador

“Resposta a um químico ou químicos que da uma medida de exposição e, algumas vezes, também, de efeito tóxico”

Peakall, 1994

“Qualquer resposta biológica a um químico no nível de indivíduo ou abaixo que demonstre um desvio do estado normal”

Walker et. al., 2001

Quatro etapas da Ecotoxicologia

Substância é liberada no ambiente: quantidades, formas e locais das liberações devem ser conhecidos

Substância é transportada geograficamente e para dentro de diferentes biotas, e, possivelmente, quimicamente transportada, dando lugar a compostos cujos padrões de comportamento ambiental são um pouco diferentes

Exposição de um ou mais organismos-alvo

Deve ser avaliada a resposta de um organismo individual, população ou comunidade ao poluente específico em um período apropriado

Perspectiva histórica dos biomarcadores

7

Uso e valor dos Biomarcadores em Ecotoxicologia

• Tornam possível uma avaliação integrada no tempo de no espaço dos poluentes biologicamente disponíveis.

• Podem integrar o efeito de estressores múltiplos e auxiliar na elucidação de mecanismos de efeitos.

• Oferecem um sinal de aviso de um desvio do estado saudável induzido por poluição.

• Especificidade das respostas e a compreensão dos mecanismos da contaminação são maiores nos níveis mais baixos do que nos mais altos de organização biológica.

Sinais

Biomarcador

Efeito sinalizador de stress induzido por poluição.

Detecção antecipada dos

efeitos poluentes no tempo

Detecção de respostas abaixo

daquelas que causam efeitos

irreversíveis

Metabolismo em peixes dos xenobióticos:

Questão IV. O que acontece com um composto quando ele é ingerido por (entra em) um organismo aquático?

Xenobiótico

Metabolizado por enzimas

Formação de compostos polares

Excretado

⇓⇓⇓⇓

⇓⇓⇓⇓

⇓⇓⇓⇓

BIOTRANSFORMAÇÃO

Conjunto de alterações químicas que as substâncias sofrem no

organismo com o objetivo de formar derivados mais polares,

facilitando a eliminação renal.

• As enzimas são as responsáveis pelas reações de biotransformação e

encontram-se presentes em todo o organismo, principalmente no fígado

• constituem o sistema monoxigenases ou sistema citocromo P450

• possui importantes funções metabólicas, sistema de sentinela que

primeiro apreende e transforma vários xenobióticos no organismo

METABOLISMO DE XENOBIÓTICOS

Metabolismo em peixes:

FASE I FASE II

Xenobiótico ProdutosPrimários

ProdutosSecundários

Excreção

Lipofílico Hidrofílico

Oxidação,Redução, Hidrólise

Glicuronidação,Sulfoconjugação,

Conjugação com GSH

Monooxigenases do Cit. P-450Monoaminooxidases (MAO)

flavinas monooxigenases (FMO)

GST, UGT, ST

GST: glutation S-transferasesUGT: uridina difosfoglicuronosil transferasesST: sulfotransferases

HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS: BIOATIVAÇÃO

Mecanismo de ativação:

8

METABOLISMO DO PIRENO

FASE I FASE II

pireno 1-hidroxi-pireno

pireno-1-glicuronídeo

BIOTRANSFORMAÇÃO

Hidroxilaçãoaromática

- produzida no fígado;

- atua na digestão e absorção de gorduras;

- excreção de xenobióticos;

- composição:

• água;• ácidos biliares;

• colesterol;

• sódio e bicarbonato;

• pigmentos biliares.

HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS: EXCREÇÃO

Bílis: principal rota de excreção dos HPAs

Usada no monitoramento ambiental

ANÁLISE DE HPAs EM PEIXES

• Tecido: Extração e clean up;

• Bílis:

A assimilação dos xenobióticos na cadeia alimentar é determinada por sua disponibilidade à biota. Assimilação direta (guelras, pele) ou indireta (alimentos, água)

Exemplo:• Organismo pode ser estudado como um sistema de óleo-água

• Coeficiente de partição: Kow

• Teor de lipídeos

Teor de lipídeos x Bioacumulação

Alguns compostos são difíceis de excretar e tendem a acumular no organismo por serem lipossolúveis. Assim, apresentam-se em concentrações mais altas nos tecidos mais gordurosos.

Isto apresenta 2 riscos:

Influências: idade, estágio de maturação, sexo, etc

• Nas ocasiões de uma alimentação precária, os animais usam as suas reservas, aumentando a concentração do xenobiótico no corpo.

• Possibilidade de transmissão através da cadeia alimentar ocorrendo a biomagnificação.

9

Toxicologia Ambiental Molecular

Bioconcentração: descreve a assimilação de um xenobióticoem um organismo por contato direto com o contaminante (do meio).

Bioacumulação: descreve a acumulação de um xenobióticoem um organismo.

Biomagnificação: descreve a acumulação de uma substância em um organismo através da cadeia alimentar.

Fatores que interferem na absorção

Tamanho do organismo Disponibilidade Fatores ambientaisTamanho da molécula

Fatores que afetam a velocidade da excreção

Teor lipídicoTamanho do organismo

Fatores externos e internos que interferem no potencial de bioconcentração de substâncias orgânicas

Metabolismo

As fases da intoxicação (divisão apenas didática)

a) Fase da exposição: fase de contato do organismo com o toxicante. Importante nesta fase é a biodisponibilidade.

b) Fase da toxicocinética: inclui processos envolvidos desde a biodisponibilidade química até a concentração do toxicante nos orgãos-alvo (absorção, distribuição, armazenamento, biotransformação e eliminação das substâncias inalteradas e/ou metabólitos)

c) Fase da toxicodinâmica: compreende os mecanismos de interação entre o toxicante e os sítios de ação do organismo, assim como o aparecimento dos efeitos nocivos decorrentes da ação tóxica.

d) Fase clínica: evidências de sinais e sintomas ou alterações detectáveis por provas diagnósticas que caracterizam os efeitos deletérios causados ao organismo.