ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA...
Transcript of ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA...
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
Bülent ZORLUGENÇ
ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantıacum
İLE AFLATOKSİN B1
ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA
MİKTARININAZALTILMASI
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
ADANA, 2009
I
ÖZ
DOKTORA TEZİ
ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantiacum İLE AFLATOKSİN B1 MİKTARININ AZALTILMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA
Bülent ZORLUGENÇ
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
Danışman : Prof.Dr. Bülend EVLİYA Yıl : 2009, Sayfa: 141 Jüri : Prof.Dr. Bülend EVLİYA
Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN
Bu çalışmada, Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 suşunun potasyum fosfat tamponu (PFT) ortamında ve sıklıkla aflatoksin sorunu yaşanan kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıkta aflatoksin B1 (AFB1)’i ortamdan uzaklaştırma yeteneği araştırılmıştır.
Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun triptik soy broth (TSB) besiyerinde ve 30oC inkübasyon sıcaklığındaki gelişimine ait gelişme eğrisi elde edilmiş ve doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun maksimum spesifik gelişme hızının 0.073 saat-1, lag süresinin ise 5.244 saat olduğu hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 45 saatte 2.7 log’luk bir artışla durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir.
İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB1 içeriğinde önemli bir değişim görülmezken, bakteri hücrelerini içeren PFT ve gıda ortamlarında AFB1 miktarında sürekli bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum, toksin miktarındaki azalmanın F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu meydana geldiğini göstermektedir.
F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki azalmanın “Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine” uygun olduğu tespit edilmiştir. Bu modele göre birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k” değeri en yüksek PFT ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün ürünlerde ise zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri sahip olmuştur.
Konsantrasyon ve boyut önemsenmeksizin, inkübasyon süresi sonunda ürünlerin AFB1 içeriğindeki azalma 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki soya fasulyesinde %84.28 ile en düşük ve 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta %99.84 ile en fazla olarak gerçekleşmiştir.
72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biber, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındık örnekleri Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB1 düzeylerine inebilmiştir.
Anahtar kelimeler: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoksin B1, Detoksifikasyon, Kinetik, Tahminsel
Mikrobiyoloji
II
ABSTRACT
PhD THESIS
A RESEARCH ON DEGRADATION OF AFLATOXIN B1 FROM
VARIOUS FOODS BY Flavobacterium aurantiacum
Bülent ZORLUGENÇ
DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
UNIVERSITY OF ÇUKUROVA
Supervisor :Prof.Dr. Bülend EVLİYA Year :2009, Pages: 141 Jury :Prof.Dr. Bülend EVLİYA
Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN
In this study, the ability of Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 strain to remove aflatoxin B1 in potassium phosphate buffer (PPB) solution and dry red pepper, corn, olive, soy bean, dry fig and also hazelnut, was investigated.
The activated F. aurantiacum NRRL B-184 strain was incubated in triptic soy broth (TSB) at 30°C and growing curve was obtained. According to non-linear regression analysis, Modified Gompertz model was fitted best with experimental data. The maximum specific growing rate (µmax) and lag time (λ) were found as 0.073 h-1 and 5.244 h, respectively. It was observed that F. aurantiacum NRRL B-184 strain increased by 2.7 log and reached to the stationary phase within 45 h. The bacteria were still in that phase at 95 h.
During incubation, aflatoxin B1 contents of control samples were not changed significantly. However in PPB and food mediums, the level of aflatoxin B1 was decreased continuously. This situation was indicated that, the reduction of aflatoxin B1 content was relevant to the activity of F. aurantiacum NRRL B-184 cells.
First order reaction kinetics was fitted best with the reduction kinetics. In PPB medium, the “k value” was found higher and followed by milled dry fig and whole olive. Also, the lower “k value” was found in soy bean samples.
At the end of incubation, the reduction of aflatoxin B1 content were resulted in the rate of % 84.28 and % 98.84 at whole soy bean (1000 ng g-1 AFB1) and milled hazelnut (500 ng g-1AFB1), respectively.
After incubation (72 h), aflatoxin content of milled red pepper, dry fig and hazelnut that contain 500 ng g-1 aflatoxin B1 and also whole hazelnut (1000 ng g-1 aflatoxin B1) decreased to permitted level of this toxin in Turkish Food Codex. Key words: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoxin B1, Detoxification, Kinetic, Predictive
Microbiology
III
TEŞEKKÜR
Lisans ve lisansüstü eğitimim boyunca bana yol gösteren, araştırmamın
düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesi sırasında yardımlarını
esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Bülend EVLİYA’ya teşekkürlerimi
sunarım.
Öğrenim hayatım boyunca ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr.
Hasan FENERCİOĞLU’na ve Yrd.Doç.Dr Sertaç ÖZER’e,
Manevi desteğinden dolayı eşim Arş. Gör. Feyza KIROĞLU
ZORLUGENÇ’e,
Bu araştırmanın gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkı ve
desteklerini gördüğüm; Sayın Prof.Dr. Halime PAKSOY’a, Doç.Dr. Hüseyin
ERTEN’e, Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR’a ve Yrd.Doç.Dr. Ahmet Doğan DUMAN’a,
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunu sağlayan United States Department of
Agriculture, Agricultural Research Service Midwest Area National Center for
Agricultural Utilization Research Labaratuvarı’na,
Toksin analizlerini yapabilmeme olanak sağlayan ve bu konudaki
deneyimlerini benden esirgemeyen Mersin İl Kontrol laboratuarından Gıda Yük.
Müh. İbrahim KARAYEL’e ve Ziraat Müh. Erhan DİNÇ ile Gaziantep İl Kontrol
laboratuarından Ziraat Yüksek Müh. Murat Reis AKKAYA’ya,
İlgi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli aileme,
Maddi ve manevi desteklerinden dolayı Ç.Ü. Araştırma Fonu ve Fen
Bilimleri Enstitüsü’ne,
teşekkürlerimi sunarım.
IV
İÇİNDEKİLER SAYFA
ÖZ ................................................................................................................................. I
ABSTRACT ................................................................................................................. II
TEŞEKKÜR ............................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... IV
ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................... VIII
ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................... XI
KISALTMALAR .................................................................................................... XVI
1. GİRİŞ ..................................................................................................................... 1
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ...................................................................................... 4
2.1. Aflatoksin ......................................................................................................... 4
2.2. Aflatoksinlerin Genel Özellikleri ..................................................................... 6
2.3. Aflatoksinler ve Biyosentezi ............................................................................ 8
2.4. Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri ............................... 10
2.5. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu .................................................................. 17
2.5.1. Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri ............................................. 17
2.5.2. Fiziksel Degradasyon Yöntemleri ............................................................ 18
2.5.2.1. Isı ..................................................................................................... 18
2.5.2.2. Işınlama ........................................................................................... 19
2.5.2.3. Adsorbsiyon .................................................................................... 19
2.5.2.4. Solventlerle Özütleme ..................................................................... 20
2.5.3. Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri .................................................... 21
2.5.3.1. Asit Uygulaması .............................................................................. 21
2.5.3.2. Hidroksit ile Alkali Uygulaması ..................................................... 22
2.5.3.3. Bisülfit Uygulaması ........................................................................ 23
2.5.3.4. Hipoklorit Uygulaması .................................................................... 24
2.5.3.5. Amonyak Uygulaması ..................................................................... 25
2.5.3.6. Ozon Uygulaması ............................................................................ 27
2.5.4. Biyolojik Detoksifikasyon ....................................................................... 29
3. MATERYAL VE YÖNTEM ............................................................................... 43
3.1. MATERYAL ................................................................................................. 43
V
3.1.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü ........................................ 43
3.1.2. PFT Çözeltisi ............................................................................................ 43
3.1.3. İnce Tabaka Plakası .................................................................................. 43
3.1.4. Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri ........................................ 43
3.1.5. Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler ........................................................... 43
3.2. YÖNTEM ....................................................................................................... 44
3.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok
Kültürlerin Hazırlanması .......................................................................... 44
3.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde
Edilmesi ................................................................................................... 44
3.2.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre
Süspansiyonunun Hazırlanması ............................................................... 44
3.2.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre
Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi .................. 45
3.2.5. Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile
Aşılanmış Ortamların AFB1 Konsantrasyonundaki Değişimin
Belirlenmesi ............................................................................................. 45
3.2.5.1. PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184’un AFB1’in
Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi .......................................... 45
3.2.5.2. PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum
NRRL B-184’ün AFB1’in Miktarı Üzerine Etkisinin
Belirlenmesi .................................................................................... 46
3.2.6. Aflatoksin Analizleri ................................................................................ 47
3.2.6.1. Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak
Belirlenmesi .................................................................................... 47
3.2.6.2. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB1
Analizi ............................................................................................. 47
3.2.6.2.(1). AFB1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması ............................... 47
3.2.6.2.(2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması ............................................... 47
3.2.6.2.(3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları ................................... 48
3.2.6.2.(4). AFB1’in Belirlenmesi .............................................................. 48
VI
3.2.6.3. Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi .............................................. 48
3.2.7. İstatistiksel Analizler ................................................................................ 49
3.2.8. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin
Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi ............................ 49
3.2.9. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB1 Degradasyon
Kinetiğinin Belirlenmesi ......................................................................... 49
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA .................................................. 50
4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi ...... 50
4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin
Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi ................................. 51
4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun
Belirlenmesi ................................................................................................... 54
4.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .......................................................... 55
4.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi .................................................... 55
4.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde
Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği ........................................................... 57
4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren
PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .............. 63
4.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının
Belirlenmesi ve Kinetiği .......................................................................... 63
4.5.1.1. AFB1’in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları ........ 63
4.5.1.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı
Biberde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ............................. 64
4.5.1.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde
Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği .................................................. 66
4.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................... 73
4.5.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi .............................................................. 73
VII
4.5.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Kinetiği ..................................................................... 75
4.5.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği ................................. 82
4.5.3.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ........................................... 82
4.5.3.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde
Aflatoksini Azaltma Kinetiği .......................................................... 84
4.5.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği ................................. 90
4.5.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ........................................... 90
4.5.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde
Aflatoksini Azaltma Kinetiği .......................................................... 92
4.5.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................... 99
4.5.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ........................................... 99
4.5.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde
Aflatoksini Azaltma Kinetiği ........................................................ 101
4.5.6. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................. 107
4.5.6.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ............................................................ 107
4.5.6.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltma Kinetiği ........................................................................... 109
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ................................................................................... 116
6. KAYNAKLAR .................................................................................................. 119
ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................. 135
EKLER ..................................................................................................................... 136
VIII
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA
Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve
Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson,
1974; Jay, 1992). .................................................................................. 6
Çizelge 2.2. Türkiye’de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin
Düzeyleri (µg kg-1) (TGK, 2009) ...................................................... 15
Çizelge 2.3. Avrupa Birliği’nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen
Aflatoksin Düzeyleri (µg kg-1) (EC, 2008) ........................................ 16
Çizelge 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30oC’de TSB
Besiyerindeki Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları ................... 50
Çizelge 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin
Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre
Hesaplanan Parametre Değerleri. ....................................................... 53
Çizelge 4.3. Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri
Süspansiyonunun 540 nm’deki Absorbans Değerleri ve
İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı. ........................................................... 54
Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184
Hücresi İçeren Diğer Örneklerde) AFB1
Konsantrasyonlarındaki (ng ml-1) Değişim ve % Azalma
Oranları .............................................................................................. 56
Çizelge 4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında
AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları. ........................................................................................... 60
Çizelge 4.6. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
ve Bütün Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları .............................................................................................. 65
Çizelge 4.7. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı
Biberde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon
Analizi Sonuçları. ............................................................................... 67
IX
Çizelge 4.8. Kırmızı Biberlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri .......................................................... 72
Çizelge 4.9. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları .............................................................................................. 74
Çizelge 4.10. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda
AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları ............................................................................................ 76
Çizelge 4.11. Mısır Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri .......................................................... 81
Çizelge 4.12. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları .............................................................................................. 83
Çizelge 4.13. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde
AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları ............................................................................................ 85
Çizelge 4.14. Siyah Zeytin Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri .......................................................... 90
Çizelge 4.15. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları .............................................................................................. 91
Çizelge 4.16. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya
Fasulyesinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon
Analizi Sonuçları ................................................................................ 93
Çizelge 4.17. Soya Fasulyelerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri .......................................................... 98
Çizelge 4.18. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin
X
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları ............................................................................................ 100
Çizelge 4.19. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde
AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları .......................................................................................... 102
Çizelge 4.20. Kuru İncirlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin
Altına İnme Süreleri ......................................................................... 107
Çizelge 4.21. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş
Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin
Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma
Oranları ............................................................................................ 108
Çizelge 4.22. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta
AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları. ......................................................................................... 110
Çizelge 4.23. Fındık Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri ........................................................ 115
XI
ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA
Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989). ............................... 7
Şekil 2.2. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve
Townsend, 2002). ................................................................................. 8
Şekil 2.3. Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan
genler (Sweeney ve Dobson, 1999). .................................................... 9
Şekil 2.4. AFB1’in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985). ...................... 12
Şekil 2.5. AFB1-N7-Gua kompleksi (Ueno, 1985). ............................................ 13
Şekil 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB
besiyerindeki gelişme eğrisi ............................................................... 51
Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun “Modifiye Gompertz”
ve “Modifiye Logistik” modellerinden yararlanılarak elde
edilen gelişme eğrileri ........................................................................ 52
Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu
seyreltilerine ait absorbans değerleri (540 nm’de) ile canlı
hücre sayısı arasındaki ilişki .............................................................. 55
Şekil 4.4. 500 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ..................... 61
Şekil 4.5. 1000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 62
Şekil 4.6. 2000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 62
Şekil 4.7. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 68
Şekil 4.8. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 69
XII
Şekil 4.9. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 69
Şekil 4.10. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 70
Şekil 4.11. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 70
Şekil 4.12. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 71
Şekil 4.13. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 77
Şekil 4.14. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 78
Şekil 4.15. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 78
Şekil 4.16. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri .......................... 79
Şekil 4.17. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ..................... 79
Şekil 4.18. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ..................... 80
Şekil 4.19. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 86
XIII
Şekil 4.20. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 86
Şekil 4.21. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 87
Şekil 4.22. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 87
Şekil 4.23. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 88
Şekil 4.24. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 88
Şekil 4.25. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 94
Şekil 4.26. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 95
Şekil 4.27. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde
aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre
azalış eğrileri ...................................................................................... 95
Şekil 4.28. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 96
Şekil 4.29. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 96
XIV
Şekil 4.30. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri ................................................................................................ 97
Şekil 4.31. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 103
Şekil 4.32. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 103
Şekil 4.33. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 104
Şekil 4.34. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 104
Şekil 4.35. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 105
Şekil 4.36. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 105
Şekil 4.37. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 111
Şekil 4.38. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 112
Şekil 4.39. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri .............................................................................................. 112
XV
Şekil 4.40. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ........................ 113
Şekil 4.41. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ................... 113
Şekil 4.42. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ................... 114
XVI
KISALTMALAR
AFB1 : Aflatoksin B1
AFB1a : Aflatoksin B1a
AFB2 : Aflatoksin B2
AFB2a : Aflatoksin B2a
AFG1 : Aflatoksin G1
AFG2 : Aflatoksin G1
AFM1 : Aflatoksin M1
AFM2 : Aflatoksin M2
PFT : Potasyum Fosfat Tamponu
TSB : Triptic Soy Broth
µm : Maksimum Spesifik Gelişme Hızı
λ : Lag Süresi
A : Asimtot
k : Reaksiyon Hız Sabiti
F : Regresyon Önem Aralığı
Co :Başlangıç Konsantrasyonu
Ct : t Zamanındaki Konsantrasyon
R2 : Belirtme Katsayısı
SEE : Tahminin Standart Hatası
RSS : Kalanların Kareler Toplamı
MSE : Hata Kareler Ortalaması
Exp : Üstel
P : Önem Düzeyi
Kob : Koloni Oluşturma Birimi
1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ
1
1. GİRİŞ
Küfler bir çok tarım ürününde; özellikle kırmızı biber, incir, fındık, mısır,
buğday, arpa, çavdar ve bir çok yağlı tohumda tarlada, bahçede, hasat sonrasında,
depolama süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri
sırasında doğal olarak gelişmektedirler.
Mikotoksinler; küflerin gelişimi sırasında normal metabolizması için önemli
bir role sahip olmayan, ancak insan ve hayvanlarda kanserojen, mutajen, teratojen ve
östrojenik etkiler gibi akut ve kronik etkilere neden olabilen ikincil metabolitlerdir.
Genel olarak, poliketid (aflatoksinler), terpen (trikotesenler), amino asit (aflatoksin)
ve trikarboksilik asit (rubratoksin) yolu gibi çeşitli biyokimyasal yollarla oluşan
düşük molekül ağırlıklı ve antijenik olmayan metobolitlerdir (Jay, 1992; Smith,
2001).
Bazı mikotoksinler yalnızca sınırlı sayıdaki küf türleri tarafından oluşurken
diğerleri birçok cinse ait çeşitli türler tarafından üretilebilmektedir. Laboratuar
koşullarında en az 300-400 mikotoksin izole edilmiş ve bunların yaklaşık 20
tanesinin önemli düzeyde ve sıklıkta gıdalarda ve yemlerde oluştuğu belirlenmiştir.
Bu mikotoksinlerin çoğunun hayvanlarda önemli toksisiteye neden olduğu
görülmüştür. Mikotoksinler genelde insan ve hayvan besin sistemine doğrudan ve
dolaylı olarak girmektedir. Doğrudan bulaşı, gıda veya yemin toksijenik küflerle
enfekte olması ve sonradan toksin oluşmasıdır. Dolaylı bulaşı ise daha önce toksin
üreten bir küf ile kontamine olmuş bir katkı maddesindeki küflerin kendiliğinden
ölmesi veya işleme sırasında ortamdan uzaklaşmasına rağmen mikotoksinin
çoğunlukla son üründe kalması durumudur (Smith, 2001).
Mikotoksin içeren gıdaların tüketimi “mikotoksikozis” olarak adlandırılan
toksik semptomların insanlarda ve hayvanlarda görülmesine neden olabilmektedir
(Van Genderen, 1997).
Çiftlik hayvanlarının oldukça fazla miktarda tahıl ve yağlı tohumları
tüketmeleri nedeniyle mikotoksinli yemlerin hayvan sağlığı ve üretkenliği üzerindeki
olumsuz etkilerinin bildirildiği çok sayıda çalışma mevcuttur. Ancak insanlarda
görülen mikotoksikozis tam olarak anlaşılmamakla birlikte son yıllarda teşhisi
1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ
2
giderek artmakta ve konu ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Smith, 2001, Richard,
2007).
Aflatoksinler; A. flavus, A. parasiticus türleri ve son yıllarda aflatoksikojenik
olduğu belirlenen üçüncü bir tür A. nomius tarafından üretilen hepatoksik (karaciğere
toksik) ve hepakarsinojenik (karaciğer kanseri etmeni) metabolitlerdir. Aynı
zamanda mutajenik (genetik değişim) ve teratojenik (embriyo üzerine etkili)
oldukları da bilinmektedir. (Banwart, 1989; İç ve Yavaş, 1993; Eley, 1996; Adams
ve Moss, 1997; Martins ve Martins, 1999; Das ve Mishra, 2000; Jaimez ve ark.,
2000; Preides ve ark., 2000).
Aflatoksin sorunu, insan sağlığı açısından büyük bir tehlike oluşturmasının
yanısıra, birçok ülke için ekonomik yönden de önem taşımaktadır. Aflatoksin
oluşmuş gıdaları ihraç etmek mümkün olmamakta ve çoğu kez ürün imha edilmek
zorunda kalınmakta veya denetim mekanizması yetersiz olan ülkelerde iç pazarda
tüketime sunulmaktadır. Bu durum ya ağır ekonomik kayıplara yol açmakta ya da
söz konusu ülkelerde insan sağlığı yönünden tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca yemlerde
bulunan toksin de, hayvanlarda ölüme kadar giden çok çeşitli etkilerin yanı sıra
verim düşüklüğüne yol açarak ekonomik sorunlara neden olabilmektedir (Özkaya,
2001). Ayrıca hayvanlara ait ürünlerin tüketilmesi de insanlarda sağlık sorunlarına
yol açabilmektedir.
Dünyadaki tarımsal ürünlerin yaklaşık % 25’i her yıl mikotoksinlerden farklı
düzeylerde etkilenmekte, bu durum çiftlik hayvanları ve tahıl üreticileri ile işleyiciler
ve tüketiciler için büyük ekonomik sorunlara neden olmaktadır. ABD ve Kanada’da
yalnızca yemlerde ve çiftlik hayvanlarında mikotoksinlerin neden olduğu yıllık
kaybın 5 milyar $ düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir (Smith, 2001).
Mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve sağlık sorunlarının farkına varılması,
önlem alma ve kontrol için uygun programların gerçekleştirilebilmesinde ilk
basamağı oluşturmaktadır. Bu programlar yalnızca tarım ürünlerinde mikotoksin
oluşumunu önlememeli ayrıca mümkün olması durumunda toksinlerin
detoksifikasyon veya yıkım yoluyla ortamdan uzaklaştırılmasını mümkün kılmalıdır
(Smith, 2001).
1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ
3
Aflatoksinlerin gıda maddesinden detoksifikasyonu için uygulanan fiziksel ve
kimyasal yöntemlerin sonuç vermemesi ve insan sağlığına zararlı etkileri nedeniyle;
biyolojik detoksifikasyon yöntemleri ve bunların ticari uygulamalarda
kullanılabilirliği üzerinde durulmaktadır (El Nezami ve ark., 1998a, b; Özkaya ve
ark., 1999; Peltonen ve ark., 2000).
Biyolojik detoksifikasyon amacıyla çeşitli mikroorganizmalar kullnaılmasıyla
ilgili gelişmeler mevcuttur. Bunlardan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile
AFB1’in azaltılması ve toksik etkisinin giderilmesi konusunda yapılmış sınırlı sayıda
araştırma olmakla birlikte; mevcut çalışmalarda bu bakteriden aflatoksinin biyolojik
detoksifikasyonu amacıyla yararlanılabileceği ifade edilmiştir (Ciegler ve ark., 1966;
Hao ve Brackett, 1988).
Bu çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun TSB besiyeri
ortamında gelişme eğrisi belirlenmiş ve bakteriyel gelişimi ifade etmede
matematiksel modellerden yararlanılarak gelişme hızı ve lag süresi hesaplanmıştır.
Yüksek toksik ve kanserojenik aktiviteye sahip olan AFB1’in PFT
çözeltisinde ve model matriks olarak kuru kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya
fasulyesi, kuru incir ve fındık gibi ticari potansiyeli olan ürünlerde F. aurantiacum
NRRL B-184 bakteri suşu ile biyolojik olarak detoksifikasyonu amaçlanmıştır.
Ayrıca AFB1’in degradasyon kinetiği incelenerek reaksiyon hızları hesaplanmıştır.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
4
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
Tarımsal ürünler, işlenmiş gıdalar ve yemler için önemli bir bulaşı olan
küfler, toprakta ve havada yaygın olarak bulunmaktadır. Bazı küflerin, gıdaların ve
ilaçların üretiminde insanlara olumlu olarak hizmet etmelerinin yanısıra tarımsal
ürünlerin üretimlerinden hasat, depolama ve tüketimlerine kadar olan her evrede
bozulmalara sebep olmaları da söz konusudur.
Küfler metabolik etkinlikleri sırasında birincil ve ikincil metabolitler olarak
adlandırılan çeşitli ürünler üretmektedirler. Birincil metabolitler, organizmanın
gelişimi için gerekli olup; bunlar arasında yağ asitleri, steroller, proteinler ve
aromatik aminoasitler yer almaktadır. İkincil metabolizma ürünlerinin, küflerin
normal metabolik faaliyetleri açısından bir öneme sahip olmadığı ve logaritmik
gelişme fazının sonlarında sentezlendiği ifade edilmektedir (Heathcote ve Hibbert,
1978; Jay, 1992; Moss, 1992; Deacon, 1997; Pitt, 2000).
Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinler, insanlarda ve hayvanlarda
akut ve kronik toksik (karsinojenite, mutajenite, teratojenite ve östrojenik) etkilere
neden olabilmektedirler. Mikotoksin içeren ürünlerin, insanlar ve hayvanlar
tarafından tüketilmesi “mikotoksikozis” olarak bilinen toksik sendromla
sonuçlanmaktadır (Van Genderen, 1997).
Küf bulaşısı, gelişimi ve mikotoksin üretimi çevre koşullarına (hava ve nem)
bağlı olarak tarlada, hasat, işleme, depolama ve nakliye sırasında oluşabilmektedir.
Isı ve yüksek nem içeriği küf gelişiminde ani artışlara neden olabilmektedir. Küfler,
hasar görmüş tohumu istila ederek orada çoğalabilmekte ayrıca kuraklık veya başka
çevresel stresler de bitkilerde küf ve böcek zararını teşvik edici etki göstermektedir
(Omaye, 2004).
2.1. Aflatoksin
Aflatoksinler, A. flavus, A. parasiticus ve A. nomius’un bazı suşları tarafından
üretilen ikincil metabolizma ürünleri olup en önemli mikotoksinlerdendir (Moss,
1992; Doyle ve ark., 1997; Jaimez ve ark., 2000).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
5
Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus’un aksine Aspergillus nomius’un
doğada yaygın olarak bulunmaması nedeniyle, bu küf üzerine az sayıda çalışma
yapılmış ve izolatlarının toksijenitesi tam olarak belirlenememiştir (Doyle ve ark.,
1997).
Aflatoksinler hakkında ilk bilginin elde edilmesi 1960’lara kadar
uzanmaktadır. İngiltere’de, Güney Amerika ve Afrika’dan ithal edilen yerfıstığı
küspesi ile beslenen 100.000 hindi palazının ölmesi üzerine yapılan çalışmalarda
yemlerden Aspergillus flavus izole edilmiş ve bu organizma tarafından oluşturulan
toksin ise aflatoksin (Aspergillus flavus Toxin – A-fla-toxin) olarak adlandırılmıştır.
Oluşan toksik bileşiklerin yapısı üzerine yapılan çalışmalar sonunda 4 bileşik (AFB1,
AFB2, AFG1, AFG2) belirlenmiştir (Detroy ve ark., 1971; Jay, 1992; Karadeniz ve
Ekşi, 2002).
Aflatoksinlerin keşfinden sonra mikotoksinler üzerine yapılan araştırmalar hız
kazanmış ve günümüze kadar yapılan çalışmalarda, toksik etki gösteren pek çok küf
metaboliti tanımlanmıştır.
Bu mikotoksinlerden bazıları mutajenik, bazıları kanserojenik iken bazıları
belirli organlar üzerine toksik etkiye sahiptir. En azından 14 mikotoksinin kanserojen
olduğu bilinmekte ve mikotoksinler arasında kanserojen etkisi en fazla olanın da
aflatoksin olduğu bildirilmektedir (Jay, 1992; FAO, 1993; Karadeniz ve Ekşi, 2002).
AFB1, insan gıdalarında ve hayvan yemlerinde sıklıkla rastlanan bir
mikotoksindir. Yüksek dozları akut toksik etki göstererek, önemli sağlık sorunlarına
ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Düşük dozları ise güçlü bir
hepatokarsinojen, mutajen ve teratojen olup ayrıca bağışıklık sistemini de
baskılamaktadır. Memelilerin, kuşların ve balıkların birçok türü aflatoksinin olumsuz
etkilerine karşı hassastırlar (Stark, 2001).
Oluşumu ve toksisitesi göz önüne alındığında AFB1 en önemlilerinden biri
olup bunu sırasıyla AFG1, AFB2 ve AFG2 izlemektedir. Aflatoksinlerin kendileri
karsinojenik özellikte olmayıp bunların bazı metabolitleri bu etkiye sahiptirler (Van
Genderen, 1997).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
6
2.2. Aflatoksinlerin Genel Özellikleri
Aflatoksinler kimyasal yapı olarak lakton bağı ve bifuran halkası içeren
difurano kumarin türevleridir (Altuğ, 1991; Papp ve ark., 2002; Özkarslı, 2003).
Aflatoksinlerin belirlenmiş önemli 4 tipi AFB1, AFB2, AFG1 ve AFG2’dir.
Ultraviyole ışığı altında mavi veya yeşil floresans vermelerine dayandırılarak bu
şekilde adlandırılmışlardır (Omaye, 2004). AFB1 ve AFG1 difuran halkası içerirken
AFB2 ve AFG2 ise tetra bifuran halkası içermektedir (Sweeney ve Dobson, 1999).
Aflatoksinlerin kimyasal yapısı Şekil 2.1’de verilmiştir.
G serisi aflatoksinler de üçüncü lakton halkası, siklopentan halkasının yerine
geçmiştir. AFB1 ve AFG1 de merkezdeki furan halkasının 8. ve 9. karbon atomları
arasında çift bağ bulunmaktadır (Jaimez ve ark., 2000).
AFM1 ve AFM2 ise AFB1 ve AFB2’nin hidroksil formları olup bir adet
hidroksil grubu içerirler (Tunail, 2000). Aflatoksinlerin kapalı formülleri, erime
noktaları ve ultroviyole ışığı altında verdikleri renkler Çizelge 2.1.’de verilmiştir.
Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson, 1974; Jay, 1992).
AFLATOKSİN KİMYASAL FORMÜL ERİME NOKTASI (oC) RENK
B1 C17 H12 O6 268-269 Mavi
B2 C17 H14 O6 286-289 Mavi
G1 C17 H12 O6 244-246 Yeşil
G2 C17 H17 O7 237-240 Yeşil-Mavi
M1 C17 H12 O7 299 Mavi-Menekşe
M2 C17 H14 O7 293 Menekşe
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
7
O
O O
Furan Halkası Kumarin
OO
O
O O
OCH3
OO
O
O O
OCH3 Aflatoksin B1 (AFB1) Aflatoksin B2 (AFB2)
OO
O O
OO
OCH3
OO
O O
OO
OCH3 Aflatoksin G1 (AFG1) Aflatoksin G2 (AFG2)
OHO
O
O
O O
OCH3
OHO
O
O O
OO
OCH3
Aflatoksin B2a (AFB2a) Aflatoksin G2a (AFG2a)
OO
O
OO
OH
OCH3
OO
O
OO
OH
OCH3 Aflatoksin M1 (AFM1) Aflatoksin M2 (AFM2)
Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
8
Aflatoksinler, kloroform ve metanol gibi polar çözücüler ve özellikle
dimetilsülfoksitte çözünebilmektedir. Aflatoksinler yüksek sıcaklıklara karşı oldukça
dayanıklı olup, normal pişirme sıcaklıklarında ve pastörizasyon sıcaklıklarına karşı
oldukça dayanıklıdır. Ayrıca aflatoksinin yapısında bulunan lakton halkası bu
molekülün alkali hidrolizine karşı hassas olmasını sağlamaktadır (McLean ve
Dutton, 1995).
2.3. Aflatoksinler ve Biyosentezi
Aflatoksinler poliketit yolu içinde sentezlenirler. Bir asetil ünitesi (Asetil
CoA) ile malonil (Malonil CoA) ünitesi karbondioksit kaybederek kısalır ve yağ
asidi sentez yolu ile hekzonat’a dönüşür. Hekzonat birbirini izleyen 7 malonoat
ünitesi ile tepkimeye girer ve poliketit sentezi sonucu norsolorinik asit oluşur
(Hocking, 1997). Şekil 2.2’de Poliketit yolu içinde norsolorinik ait oluşumu
verilmiştir.
Şekil 2.2. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve Townsend,
2002).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
9
Bu poliketit, yaklaşık 12-17 kadar enzimatik değişimden geçer ve
Versicolorin B oluşur. Versicolorin B oluşumunu takiben enzimatik yol ikiye ayrılır.
1. kolda Versicolorin A oluşumunu takiben dimetil sterigmatosistinden AFB1 ve
AFG1 sentezlenir. Diğer kolda ise dihidro dimetil sterigmatosistinden AFB2 ve AFG2
sentezlenir (Swedney ve Dobson, 1999). Aflatoksin biyosentezinde düzenleyici gen
AfζR genidir. AfζR geni aflatoksin biyosentezini harekete geçirir ve aflatoksin
üretimini artırır (Papp ve ark., 2002). Aflastoksin biyosentez yolu ve biyosentezde
rol oynayan genler Şekil 2.3’de verilmiştir.
Şekil 2.3. Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan genler (Sweeney
ve Dobson, 1999).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
10
2.4. Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri
Aflatoksinler, Aspergillus ve Penicillium cinslerinin ürünleri olup insanlarda
ve hayvanlarda oldukça güçlü akut toksik etki göstermektedirler. Sindirim sistemi
yoluyla vücuda alınan aflatoksinler bir çok canlıda akut toksisite ve karsinojeniteye
neden olmakla birlikte, etkilenen başlıca organ karaciğer olmaktadır. Diyetle alınan
aflatoksin karaciğerden kurtularak kolayca diğer organlara dağılabilir ve orada
metabolize olarak toksik veya karsinojenik etki gösterebilmektedir. Bazı türlerin
AFB1’in neden olduğu karsinojeniteye dayanıklı olması, genellikle AFB1’i
detoksifiye etme yeteneği ile ilişkilendirilmektedir ki, bu durum glutatyon ile
birleşmesine dayandırılmaktadır (Stark, 2001). Akut toksisite, tüketimi takip eden 3
hafta içerisinde oluşabilmektedir (Omaye, 2004).
Uganda ve Tayland’da ortaya çıkan akut aflotoksikozis sonucunda insanlarda
kusma, karın ağrısı, akciğer ödemi, karaciğerde nekroz ve yağlanma gibi
semptomplar görülmüştür. Yaklaşık 200 kadar Hindistan köyünde 6-16 mg L-1
aflatoksin içeren mısırların tüketilmesi ile özellikle gastrointestinal kanamaya bağlı
%25’in üzerinde ölüm vakası görülmüştür (Shank, 1977; Van Rensburg, 1977;
Shank, 1981). Akut aflatoksikozisin semptomları; karaciğer, böbrek ve kalpte gelişen
yağlanma ve beyin ödemiyle ilişkili olan kusma, çırpınma, koma ve ölüm olup
Reye’s sendromundan ayırt edilememektedir. Tayland (Shank, 1971) ve Amerika
Birleşik Devletleri’nde (Nelson, 1980) Reye’s sendromundan kaynaklandığı öne
sürülen 23 ölüm vakasının 22’sinde karaciğer, böbrek, beyin, safra ve gastrointestinal
sistemde AFB1 tespit edilmiştir (Stark, 2001).
Gıdalarda ve yemlerde yaygın olarak bulunmalarına ilave olarak aflatoksinler
havada da bulunabilmektedir. Örneğin, aflatoksinli tahılların tozlarına maruz kalan
yerfıstığı işleyen fabrikaların işçilerinde akciğer veya diğer organlarda görülen
kanser sebebiyle ölüm vakalarında önemli artış gözlenmiştir (Van Nieawenhaize,
1973; Sorenson, 1981; Hayes, 1984; Dvorackava, 1986). Akciğerler, aflatoksinlerin
diyetle alınması durumunda da risk altındadır (Stark, 2001).
Karaciğer kanseri gelişmekte olan ülkelerde çok yaygın olarak görülmekte ve
diyetle alınan aflatoksin ile karaciğer kanseri arasında doğrusal bir ilişkinin mevcut
olduğu bildirilmektedir (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). Küflü tahılların
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
11
tüketilmesi sonucu Hindistan’da ve Afrika’da karaciğer kanseri görülme oranının
yüksek olduğu bildirilmiştir (Omaye, 2004).
Yapılan son çalışmalar, aflatoksine maruz kalan insanlarda karaciğer kanseri
görülme oranının yüksek olmasına kronik enfeksiyonların da neden olabileceğini
ortaya koymuştur. AFB1’in deney hayvanlarında hücre bağışıklığını baskıladığı
görülmüştür (Van Genderen, 1997). Bağışıklık sisteminin baskılanması akut
aflatoksin intoksikasyonunun (zehirlenme) bir diğer belirleyici özelliğidir (Stark,
2001).
Aflatoksinin LD50’si 0.5 mg kg-1 (vücut ağırlığı) dır ve 72 saat içinde
karaciğer hasarı, bağırsak sisteminde ve karın boşluğunda kanama nedenleriyle ölüm
gerçekleşmektedir (Omaye, 2004).
Birkaç günle birkaç hafta arasında subletal (yarı öldürücü) konsantrasyonda
aflatoksin tüketimi orta ya da şiddetli karaciğer hasarına yol açmaktadır. Karaciğerde
görülen hasarlar veya karaciğerin safra kanalı bölgesinde aşırı hücre gelişimi (biliary
hyperplasia)’dir. Ayrıca yaygın olarak yağ birikimi ve karaciğerin renginin mor-
kırmızıdan sarı-kırmızıya dönüştüğü görülür. Epidemiyolojik çalışmalar, dünyanın
çeşitli bölgelerinde diyetle alınan aflatoksin miktarı arasında doğrudan bir ilişki
olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hepatit B virüsü ile karaciğer kanseri arasında
ilişki olduğu ortaya koyulmuştur (Omaye, 2004).
Aflatoksinler, akut toksik ve karsinojenik etki gösterebilmeleri için oksidatif
metabolizmaya uğramalıdırlar (Stark, 2001). Aflatoksin metabolizması, esas olarak
karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulumunda bulunan sitokroma bağlı enzimler
ile O2 ve NADPH’a bağımlı enzimlerin karmaşık bir organizasyonu sonucu
oluşmaktadır (Groopman ve ark., 1988). Aktivasyon düzeyi, DNA’ya bağlanma,
mutasyona uğrama sıklığı ve belirli hücre tiplerinde akut toksik etkilere karşı
hassasiyet, sitokrom P-450’nin tipine ve bunların bu hücrelerdeki düzeyine bağlı
olarak değişmektedir (Mace, 1997; Stark, 2001).
Aflatoksin molekülünün 8, 9 konumu oksidasyon sonucu Aflatoksin-8, 9-
oksite dönüşür, sonra da kovalent bağla; DNA, RNA ve proteine bağlanır.
Aflatoksinin hidroksillenmesiyle ayrıca AFM1, AFP1, AFQ1, AFB2a ve aflatoksikol
oluşur. Bunlar Aflatoksin-8, 9- oksit’den daha az toksik ve karsinojenik olup
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
12
aflatoksinin detoksifikasyon metabolitleridirler. Aflatoksin-8, 9- oksit,
detoksifikasyon enzimi olan epoksit hidrolaz tarafından 8, 9-dihidrodiol’e
dönüştürülmektedir. 8, 9-dihidrodiol ve hidroksillenmiş aflatoksinler glutatyon
(GSH) transferaz tarafından glutatyon konjugatlarına dönüşür ve merkapturik asit
olarak idrarla atılırlar. Ayrıca, AFB1-8, 9-diol ve AFB2a enzimatik olmayan yolla
fenolat iyonu formuna dönüşerek kovalent bağla proteinlere de bağlanabilmektedir
(Stark, 2001). Bu sistemlerde AFB1’in metabolizma yolları ve biyotransformasyonu
Şekil 2.4’de verilmiştir.
OO
O
O O
OO
O
O O
OCH3
OO
O
OCH3
OO
OH
OO
O
O O
OH
OO
O
O O
OH
OO
O
O O
O
OCH3
SitoplazmikRedüktazSistemi
İndirgeme
KaraciğerMikrosomasındaMeydana Gelen
Oksitleyici Sistemler
Hidroksillenme
P450
P448
OCH3
Aflatoksin Q
Aflatoksin M1Demetilasyon
Aflatoksin P1OCH3
Epoksidasyon
Afkatoksin B1 - epoxide
Şekil 2.4. AFB1’in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985).
AFB1’in oksidatif metabolizması sonucu stabil olmayan, oldukça reaktif
epoksid metabolitler oluşmaktadır. Hidroksillenmiş metabolitlerin sülfat veya
glukuronik asit ile enzimatik konjugasyonu sonucu suda çözünür sülfat veya
glukuronid esterler oluşur ve bunlar idrar veya safra ile dışarı atılırlar. Böylece
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
13
AFB1’in detoksifikasyonu gerçekleşmiş olur. AFB1’in organizmadan
uzaklaştırılmasındaki diğer bir yol ise epoksid metabolitin glutatyon ile enzimatik
olarak reaksiyona girmesi ve safra ile dışarı atılmasıdır (Groopman ve ark., 1988).
Sitokrom P450 vasıtasıyla aflatoksinin 8, 9-epoksid formuna dönüşmesi ile
bazı metabolitler etkinleşir ve ana bileşikten farklı olarak kanser etmeni özellik
kazanırlar (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). AFB1’in metabolizması sırasında
reaktif elektrofilik epoksid, DNA, RNA ve protein gibi hücresel makro moleküllerin
çeşitli nükleofilik merkezleri ile örneğin DNA’nın N7 konumundaki guanine
kovalent bağ ile bağlanabilmektedir (Şekil 2.5). Bu aktivasyon reaksiyonu sonucu,
hücre veya organizma için potansiyel bir biyolojik tehlike olarak görülen toksik,
karsinojenik ve genotoksik etkiler ortaya çıkmaktadır (Groopman ve ark., 1988).
NH
N N
N
NH2
OOO
OHO
O O
OCH2
Şekil 2.5. AFB1-N7-Gua kompleksi (Ueno, 1985).
Yüksek miktarda AFB1’e maruz kalan insanlarda görülen karaciğer
kanserlerinde p53 geninin 249 kodonunda mutasyon görülmüştür. Ancak AFB1’den
hiç etkilenmeyen veya düşük dozda etkilenen kişilerde bu mutasyonun
gerçekleşmediği tespit edilmiştir (Stark, 2001).
AFB1’in ayrıca enzimleri inhibe ederek ATP üretimini azalttığı ve buna ek
olarak DNA sentezini, DNA’ya bağlı RNA polimeraz aktivitesini, mRNA ve protein
sentezini inhibe ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1997; Wang ve Groopman, 1999).
Aflatoksin, 1993 yılında Dünya Sağlık Örgütü ile Uluslararası Kanser
Araştırma Kurumu (WHO-IARC) tarafından kanserojenik madde olarak kabul
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
14
edilmiş ve AFB1 yapılan sınıflandırmada insan kanserojeni olarak 1A grubunda
yeralmıştır (El-Nezami ve ark., 1998a; El-Nezami ve ark., 2000; Hussein ve Brasel,
2001).
Bugün dünyada hemen hemen bütün ülkeler, bu tehlikelerden korunmak ve
ihraç ettikleri ürünlerin geri dönüşünü azaltmak amacı ile yasal bazı sınırlamalar
getirmektedirler. Ülkemizde Türk Gıda Kodeksi’nde (TGK, 2009) gıdalar, için
aflatoksin limitleri belirlenmiştir. Çizelge 2.2’de Türkiye’de gıdalarda bulunmasına
izin verilen aflatoksin düzeyleri ve Çizelge 2.3’de ise Avrupa Birliği’nde gıda
maddelerinde bulunmasına izin verilen en yüksek aflatoksin düzeyleri (EC, 2008)
verilmiştir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
15
Çizelge 2.2.Türkiye’de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri
(µg kg-1) (TGK, 2009)
No GIDA MADDELERİ B1 Toplam
(B1+B2+G1+G2) M1
1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya
gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce
sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi
tutulacak olan)
8 15 -
2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler,
yerfıstığı, yağlı tohumlar, kuru meyveler ve
bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar
- 10 -
3 Tahıllar (Karabuğday (Fagopyrum sp.) dahil ve
bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar (Doğrudan
tüketilen veya gıda bileşeni olarak kullanılan)
2 4 -
4 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda
bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma,
ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak
olan)
5 10 -
5 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin
üretiminde kullanılan süt
- - 0.050
6 Baharatların aşağıdaki türleri için ;
- Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil)
- Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil)
- Hindistan cevizi / Muskat (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa)
5 10 -
7 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk
gıdaları
0.1 - -
9 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek
sütleri ve devam sütleri dahil)
- - 0.025
9 Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0.1 - 0.025
10 Diğer gıda maddeleri (bulunması muhtemel riskli
gıdalar)
5 10 0.5
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
16
Çizelge 2.3. Avrupa Birliği’nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg-1) (EC, 2008)
No GIDA MADDELERİ B1 Toplam
(B1+B2+G1+G2) M1
1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)
8 15 -
2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler, yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)
5 10 -
3 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler (Doğrudan insan tüketimine sunulan veya gıda bileşeni olarak kullanılan ve bunların işlenmiş ürünleri)
2 4 -
4 Kuru meyveler (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)
5 10 -
5 Kuru meyveler ve bunların işlenmiş ürünleri (Doğrudan insan tüketimine veya gıda bileşeni olarak kullanılması düşünülen ve bunların işlenmiş ürünleri)
2 4 -
6 Tüm tahıllar ve bunlardan üretilen ürünler (7,10, 12’de listelenen gıdalar hariç)
2 4 -
7 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)
5 10 -
8 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin üretiminde kullanılan süt
- - 0.050
9 Baharatların aşağıdaki türleri için ; - Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların
kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil)
- Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil)
- Hindistan cevizi (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa)
5 10 -
10 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk gıdaları
0.1 - -
11 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek sütleri ve devam sütleri dahil)
- - 0.025
12 Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0.1 - 0.025
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
17
2.5. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu
Toksik ve kanserojen özellikte olmaları nedeniyle aflatoksin oluşmuş
ürünlerin, insan ve hayvanlar tarafından tüketilmesi önemli sağlık sorunları ve
ekonomik kayıplara yol açabilmektedir. Bu nedenle, aflatoksin kontrol ve izleme
programlarına ihtiyaç duyulmaktadır.
Aflatoksin sorununu çözmede temel ve öncelikli prensip aflatoksin
oluşumunu önleyici tedbirleri almaktır. Ancak, toksin oluşmuş olan bir üründe
aflatoksini uzaklaştırmaya, parçalamaya, azaltmaya ve bağlamaya yönelik
çalışmalar da aflatoksinlerin keşfinden bu yana yapılmaktadır.
Detoksifikasyon işlemlerinde,
1. Toksin tamamen uzaklaştırılmalı, inaktive edilmeli veya parçalanmalı,
2. Üründe hiçbir toksik, karsenojenik ve mutajenik kalıntı kalmamalı ve
herhangi bir yeni toksik madde oluşmamalı,
3. Ürünün fiziksel ve duyusal özellikleri ile besin değerinde olumsuz değişimler
oluşmamalı,
4. Küf sporlarının ve misellerinin yok edilerek mikotoksin oluşumu
önlenebilmeli,
5. Teknik ve ekonomik olarak uygulanabilir olmalıdır (Rustom, 1997; Piva ve
ark., 1995; Scott, 1998; Bata ve Lasztity, 1999; Galvano ve ark., 2001).
Ancak, bugüne kadar bütün bu özellikleri karşılayan bir detoksifikasyon
yöntemi bulunamamıştır. Çoğu yöntemin sonuçları henüz toksikolojik yönden
incelenmemiştir (Özkaya ve ark., 1999).
2.5.1. Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri
Mikotoksin oluşmuş bir üründe, bozuk, kırık, zedeli tanelerin ayıklanmasının,
kabuk, kepek ve yabancı maddelerin temizlenmesinin mikotoksin düzeyini önemli
ölçüde azaltığı görülmüştür. Gelişmiş ülkelerde bu ayıklama işlemlerinde elektronik
göz ve optik cihazlar kullanılmaktadır (Goldblatt ve Dollear, 1977; Heatcote ve
Hibbert, 1978; Özay, 1988; Scott, 1998; Özkaya ve ark., 1999; Yılmaz ve Özay,
2001; Karadeniz ve Ekşi, 2002). Antep ve yerfıstığı gibi iri taneli ürünlerde bozuk
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
18
olan “koyu renkli tanelerin” el ile veya fotoelektrik hücrelerden geçirilmesiyle
aflatoksinli taneler ayrılabilmektedir (Özay, 1988; Anonim, 2002).
Mikotoksin oluşmuş ürünün çoğu kez mikotoksin oluşmamış ürüne göre
farklı fiziksel özellik göstermesi nedeniyle, küçük taneli ürünlerde ve özellikle
mısırda yoğunluğa göre ayrım uygulanabilmektedir (Huff ve Hagler, 1982; Özay,
1988; Özkaya ve ark., 1999; Bata ve Lasztity, 1999; Placinta ve ark., 1999)
Ayrıca; mısır, pamuk tohumu ve kuru incir gibi bazı ürünlerde aflatoksin
nedeniyle UV (365 nm) ışığı altında parlak yeşilimsi sarı (BGY) bir floresans
meydana gelmektedir. Bu floresans ile ürünün aflatoksin içeriği arasında sıkı bir
ilişki bulunmuş olup, floresans veren tanelerin ayıklanması ile etkili bir
dekontaminasyon sağlanabilmektedir. Bu yöntem, ülkemizde kuru incir ihracatındaki
dar boğazın aşılmasını sağlamıştır (Çoksöyler, 1994; Hocking, 1997; Scott, 1998;
Özkaya ve ark., 1999).
2.5.2. Fiziksel Degradasyon Yöntemleri
Isı, ışınlama ve adsorbsiyon, mikotoksinler üzerindeki etkilerinin araştırıldığı
üç fiziksel faktördür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).
2.5.2.1. Isı
Aflatoksinler, 237 ile 306°C arasında değişen yüksek dekompozisyon
sıcaklıklarına sahip olmaları nedeniyle ısıya oldukça dayanıklıdırlar. Aflatoksinlerin
kısmen parçalanabilmeleri için sıcaklığın 150oC’nin üzerinde olması gereklidir.
Aflatoksinin ısı ile degradasyonunda kritik faktör ürünün nem içeriğidir. Nem
içeriğinin fazla olması aflatoksinin ısı ile inaktivasyonunu oldukça
kolaylaştırmaktadır. Nemin varlığı, AFB1’in lakton halkasının açılarak terminal
karboksilik asit oluşmasına neden olmaktadır. Daha sonra karboksilik asit ısının
etkisiyle dekarboksilasyona uğramaktadır (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve ark.,
1990).
Bu konuda yapılan bir çalışmada; yağlı tohum küspesinde ki nem artışının,
sıcaklık ve ısıtma süresinin sabit tutulması halinde aflatoksin miktarındaki azalışı
artırdığı görülmüştür. %30 nem içeren küspenin 100oC'de 2.5 saat tutulması, mevcut
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
19
toksinin yaklaşık %85’inin azalmasıyla sonuçlanmıştır. Aynı koşullarda %6.6 nem
içeren küspede ise aflatoksinin %50 oranında azaldığı bildirilmiştir (Doyle ve ark.,
1982; Özkaya ve ark., 1999).
2.5.2.2. Işınlama
AFB1, pH’nın 3’ten küçük ya da 10’dan büyük olması durumunda UV ışığına
karşı oldukça hassastır (Samarajeewa ve ark., 1990). Samarajeewa ve Gamage
(1988), UV ışığına maruz kalan AFB1’in 12 yeni toksik bileşiğe dönüştüğünü
bildirmişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada, 10 cm kalınlığındaki yerfıstığı küspesi 8
saat UV ışığına tutulmuş ve toksinin floresansında görünür bir değişiklik olmamıştır.
UV ile muamele edilen bu yerfıstığı ekstraktları, ördek yavrularına yedirildiğinde,
hayvanlar birkaç gün içerisinde ölmüş ve karaciğerlerinde aflatoksinin neden olduğu
karakteristik lezyonlar görülmüştür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).
Benzer sonuçlar 2,5 Mrad dozunda gama ışını verilen aflatoksin içeren
yerfıstığı küspesinde de elde edilmiştir. Bu işlemin etkisiz kalmasına, aflatoksin gibi
karmaşık organik maddelerin gama ışınlarından doğrudan etkilenmemelerinin neden
olabileceği belirtilmiştir. Oysaki, suyun ve başka basit bileşiklerin radyolizi sonucu
meydana gelen serbest radikallerin daha sonra organik moleküllerle reaksiyona
girmesi ışınlamanın dolaylı etkisini ortaya çıkarmaktadır. Suyun varlığı bu prosesin
etkinliğini belirleyen önemli bir faktördür (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve
ark., 1990; Rustom, 1997).
X-ışınları ve elektron ışınlamanın aflatoksinler üzerine etkileri de araştırılmış
ve aflatoksini etkili bir şekilde parçalamak için gerekli dozun ışınlanmış ürünü de
harap ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).
2.5.2.3. Adsorbsiyon
AFB1’in bir sıvı içerisinde bentonit tarafından adsorbe edilebildiği ve daha
sonra bentonitin uzaklaştırılması ile aflatoksinin tamamına yakınının
uzaklaştırılabildiği belirlenmiştir. Parçacık büyüklüğü ve ısıl işlem bentonitin
adsorblama yeteneğini etkilemektedir (Özkaya ve ark., 1999). Yapılan bir çalışmada,
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
20
bentonitin sütün içerisindeki aflatoksini %65-79 oranında azalttığı ve bentonit
miktarının artmasıyla adsorbsiyonun da arttığı belirtilmiştir (Doyle ve ark., 1982).
Bahar ve Altuğ (1997) yaptıkları bir çalışmada, kontamine kuru incirlerden
iki farklı teknikle elde edilen incir pekmezlerine aflatoksin geçiş düzeylerini
araştırmışlardır. Pekmez toprağı kullandıkları birinci teknikle elde edilen bütün incir
pekmezinde başlangıçtaki incirlere göre ortalama %62; öğütülmüş incir pekmezinde
ise ortalama %29 oranında azalma olduğunu belirtmişlerdir. Jelatin kullandıkları
ikinci teknikte ise elde edilen bütün incir pekmezinin toplam aflatoksin düzeyinde
%38’lik bir azalma görülmüştür.
2.5.2.4. Solventlerle Özütleme
Yağlı tohumların işlenmesinde uygulanan proses, aflatoksinlerin tamamına
yakın kısmının uzaklaşmasını sağlamaktadır (Goldblat ve Dollear, 1977). İşlem
sırasında tohumda mevcut olan aflatoksinin bir kısmı ham yağa geçmektedir. Yağa
geçen aflatoksin oranı genellikle işleme şekli, koşulları ve hammadde kalitesine
bağlıdır. Rafinasyon sırasında bitkisel yağlarda bulunan aflatoksinin uzaklaştırıldığı,
büyük bir kısmının ham yağın alkali ile muamelesinde "soapstock" ’ta kaldığı
belirtilmiştir (Parker ve Melnick, 1966).
Konvensiyonel rafinasyon ve ağartma proseslerinin uygulandığı ABD’de
yağlarda aflatoksin problemi bulunmamaktadır. Çünkü zeytinyağı dışında yenilebilir
ham yağ tüketilmemektedir. Fakat yağın, ham yağ olarak kullanıldığı yerlerde
özellikle yerfıstığının çok üretildiği ülkelerde örneğin Hindistan’da, rafine edilmemiş
ham yerfıstığı yağı ucuz oluşu, hoş aroma ve lezzeti ile geniş bir halk kesimi
tarafından tercih olunmaktadır. Ham yerfıstığı yağından aflatoksinin giderilmesi için
yağ koalin ile işleme sokulmuş, %1.0, 1.5, 3.0 oranında koalin 15-30 dakika 80oC'de
denemeler sonucu, %3'lük koalin ile 15 dakikalık süren işlemde en iyi sonuç
alınmıştır (Miller ve ark., 1985).
Solventlerle özütleme işlemi için sayısız solvent kombinasyonları
denenmiştir. Özellikle yağlı tohumlara uygulanabilen en etkin solvent sistemi su,
aseton, hekzan içermektedir (Gardner ve ark., 1968). Aseton+su (90:10 v/v) ikili
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
21
sistemi ile özütlemenin yerfıstığı, pamuk tohumu üzerinde %96-98 etkili olduğu
belirtilmiştir (Gardner ve ark., 1971).
Solventle özütleme işlemlerinin avantajları:
1. Aflatoksinin tamamına yakın kısmının üründen uzaklaştırılabilmesi,
2. Üründe yeni bozunma ürünlerinin oluşmaması,
3. Ürün proteinlerinin fazla tahrip olmaması,
4. Besin değerinin korunmasıdır (Özay, 1988).
2.5.3. Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri
Gıdalardaki aflatoksinlerin kimyasal detoksifikasyonu uygulanabilir bir hasat
sonrası yaklaşımıdır. Yapılan araştırmalar aflatoksinlerin degradasyonunda asitler,
bazlar, bisülfitler, klorlu bileşikler ve okside edici maddelerin kullanılabileceğini
göstermiştir.
2.5.3.1. Asit Uygulaması
Kuvvetli asitler, hidrasyon süresince aflatoksini hemiasetal formlarına
dönüştürerek degrade olmasına neden olmaktadırlar (Van Nieawenhuize, 1973).
Başka bir ifadeyle, AFB1’e suyun eklenmesiyle AFB2’nin hidroksi analoğu olan
AFB2a oluşmakta aynı şekilde AFG2a da AFG1’in asidülasyonu ile meydana
gelmektedir.
Pons ve ark. (1972) AFB1 ve AFG1’i daha az toksik olan formlarına yani
sırasıyla AFB2a ve AFG2a’ya asitlerle dönüştürme üzerine çalışmışlardır.
Araştırıcılar, pH’nın azalması veya sıcaklığın artışıyla dönüşüm oranının arttığını
bildirmişlerdir. Çalışmada, pH’sı 3.0 olan sulu çözeltideki AFB1’i hidroksi
anoloğuna %95 oranında dönüştürmek için 100oC’de 6 saate ihtiyaç duyulduğu
belirtilmektedir. Ayrıca, AFB2 ve AFG2’nin AFB1 ve AFG1 ile kıyaslandığında asit
degradasyonuna daha az duyarlı olduğu da ifade edilmiştir.
Williams ve Dutton (1988) asitlerin, doğal olarak kontamine olmuş yerfıstığı
ununda aflatoksinleri degrade etme üzerine etkilerini araştırmışlardır. Bir reaktör
içinde (129°C’de 160kPa basınçta) hidrolize sebze proteini üretimi sırasında 3M
hidroklorik asit ilavesinin aflatoksinlerin toksik veya mutajenik bileşik oluşturmadan
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
22
tamamen degrade olmasına neden olmuştur. Başka bir çalışmada ise, 100°C’deki yağ
banyosuna yerleştirilmiş ağzı kapalı deney tüplerindeki yerfıstığı unundaki AFB1, 5
N hidroklorik asit ilavesiyle tamamen parçalanmıştır (Wattanapat ve ark., 1995). Her
iki çalışmada, aflatoksinli yerfıstıklarından uygun şartlar altında aflatoksin içermeyen
hidrolize sebze proteini elde edilebileceğini göstermektedir.
Ağzı pamukla kapatılan erlen içerisine konulan sorguma (süpürge darısı)
ilave edilen 3 N’lik salisilik, sülfamik ve sülfosalisilik asit, 1 mg L-1 düzeyindeki
AFB1’in %90 oranında azalmasına neden olmuştur. Çalışmada ayrıca, 5 N
anthranilik, benzoik, borik, okzalik ve propionik asit ilavesiyle aynı
konsantrasyondaki AFB1’in %90 ve daha fazla oranda azalmasıyla sonuçlanmıştır.
Güçlü asitlerle muamele AFB1’in degrade edilmesinde etkili bulunurken, AFB2 ve
AFG2 üzerinde az etkili ya da etkisiz bulunmuş ve AFB2a’nın toksik etkisinin devam
ettiği görülmüştür (Hasan, 1996).
2.5.3.2. Hidroksit ile Alkali Uygulaması
Çeşitli araştırmalar, inorganik veya organik bazlı alkali uygulamalarının
aflatoksinlerin degradasyonunda etkili ve ekonomik olarak uygulanabilir bir metot
olduğunu göstermektedir. Alkaliler, AFB1’in lakton halkasının hidrolizine neden
olmaktadır. Bununla birlikte, yapılan çalışmalar hidrolize olan lakton halkalarının
asidik koşullar altında tekrar kapanabileceğini ve AFB1’in yeniden oluşabileceğini
göstermektedir (King ve Prudente, 2005).
Price ve Jorgensen (1985) alkali uygulamaların, mısırdan tortilla üretimi
sırasındaki koşullar nedeniyle aflatoksinlerin parçalanması üzerine etkilerini
araştırmışlardır. Mısırın %0.5’ten daha az kalsiyum hidroksit ile muamele
edilmesiyle aflatoksin içeriği %43 oranında azalmıştır. Asit uygulaması başlangıç
konsantrasyona dönüş ile sonuçlanmıştır.
Yapılan başka bir çalışmada; yüksek düzeylerdeki kalsiyum hidroksit
aflatoksin degradasyon oranını artırmamış ve çok güçlü alkali tat ile kokuya sahip
olması nedeniyle duyusal açıdan daha az kabul edilebilir bir ürün elde edilmiştir
(Arriola ve ark., 1988).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
23
Kalsiyum hidroksit ile muamele şartları, mısır ürünlerinin yalnızca pH
düzeylerinin yaklaşık olarak 7’ye yükselmesine neden olmuştur. Bu pH
derecelerinde aflatoksinin detoksifikasyon işlemi, asit uygulaması ile tersine
çevrilebilmiş ve bu durum orijinal aflatoksin yapısının yeniden oluşmasıyla
sonuçlanmıştır (Torres ve ark., 2001).
Arriola ve ark. (1988)’nın yaptıkları bir çalışmada doğal olarak 1600 ng g-1
toksinle kontamine olmuş mısır, 100°C’de 4 dk süreyle %3’lük sodyum hidroksit ile
kaynatılmış ve toplam AFB1 ve AFB2 düzeyleri %93 oranında azalmıştır. Aynı
mısırlar asitle muamele edildikten sonra orijinal AFB1 yapısına %18 oranında geri
dönüşüm gerçekleşmiştir. Ayrıca mısır çerezi yapmak için gerekli olan 196°C’de 15
dk kızartma işlemi ile otoklavlama ile yapılan ısıl işlem, ürünün aflatoksin içeriğinin
insan gıdası olarak kullanımını mümkün kılan bir düzeye (20 ng g-1’den daha az)
inmesine neden olmuş ve mutajenite gözlenmemiştir (Park, 1993).
Yapılan bir çalışmada örnek ağırlığına bağlı olarak %2 kalsiyum hidroksit ve
%0.5 metilamin kullanımının 400 ng g-1 aflatoksin içeren yerfıstığı ununda geri
dönüşüm olmaksızın toksin içeriğinin kabul edilebilir standartlar içerisine düştüğü
belirtilmiştir (Park ve ark., 1981).
Epsoy (1972), patentli bir çalışmada Ca(OH)2’yi su ile çamurlaştırarak yağlı
tohumları detoksifiye etmek için kullanmıştır. Bu işlem pratikte ABD’de kurutulmuş
hindistan cevizinin detoksifikasyonunda uygulanmaktadır. Mikotoksin oluşmuş
ürünlerde mikotoksinlerin kimyasal detoksifikasyonunda en etkin ve uygulamalarına
başlanmış bir yöntemdir.
2.5.3.3. Bisülfit Uygulaması
Bisülfit; enzimatik ve enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonları ile bir
çok mikroorganizmanın gelişimini engellemesi nedeniyle bazı gıdalarda yaygın
olarak kullanılan bir kimyasaldır (King ve Prudente, 2005).
Sodyum bisülfitin, terminal furan halkasının 8, 9 konumundaki çift bağ ile
reaksiyona girdiği ve toksinin suda daha çok çözünür hale geldiği varsayılmaktadır.
AFB2’de bu çift bağın olmayışı bisülfit ile degradasyonunu mümkün kılmamaktadır.
Sodyum sülfonat (B1S) oluşumu aflatoksin ile sülfonik asidin en önemli reaksiyon
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
24
ürünlerinden biri olduğunun kanıtı olarak görülmektedir (Hagler ve ark., 1983;
Yagen ve ark., 1989).
Nem içeriği, sodyum bisülfit miktarı, süre ve sıcaklık derecesi AFB1’in
degradasyonu üzerinde önemli etkiye sahip olup bu faktörler AFB2 üzerine etki
göstermemektedirler (King ve Prudente, 2005). Doyle ve Marth (1978) pH’nın 5.5
olduğu bir tampon sistemde sitrik asit veya metanol varlığında sodyum bisülfitin
aflatoksinleri parçalama oranının düştüğünü gözlemlemişlerdir. Yaklaşık 235 ng g-1
aflatoksin içeren mısırda %0.5 ve %1’den daha düşük konsantrasyondaki sodyum
bisülfitin AFB1’in parçalanmasında aynı düzeydeki sodyum hidroksit veya amonyak
çözeltisinden daha etkili bulunmuştur (Moerck ve ark., 1980).
Altuğ ve ark. (1990) 250 ng g-1 AFB1 ile kontamine olan incirler, %1’lik
bisülfit uygulamasından önce %0.2 hidrojen peroksit ile muamele edilmiş ve tek
başına bisülfit uygulaması ile kıyaslandığında 25°C’de 72 saat içinde AFB1’in
%57’den fazlası parçalanmıştır.
Doğal olarak toksinle kontamine olmuş yerfıstığı ezmesi sodyum bisülfit ve
sodyum hidroksit ile ayrı olarak muamele edilmiş ve 24 saatlik depolama sonunda
aflatoksin düzeyinde azalma görülmüştür. Ancak oda koşullarında 10 ve 20 gün
depolandıktan sonra örneklerin toplam aflatoksin miktarında artış gözlenmiştir. Bu
durum küflerin yeniden gelişim göstermesine bağlanmıştır. Aspergillus flavus
aşılanan yerfıstığı ezmeleri %10 nem içerecek şekilde %1’lik sodyum bisülfit ile
muamele edilmiş ve oda sıcaklığında küf gelişimi ile aflatoksin üretimi tamamen
engellenmiştir (Ghosh ve Chhabra, 1995).
2.5.3.4. Hipoklorit Uygulaması
Klorlu su, gıda işleme ekipmanlarının dezenfeksiyonu ile çeşitli
hammaddelerin işleme öncesinde yıkanmasında ve ayrıca bazı ülkelerde ağartıcı ve
okside edici madde olarak un endüstrisinde kullanılmaktadır (Wei ve ark., 1985;
Samarajeewa ve ark., 1990).
Sodyum hipokloritin, sodyum hidroksit veya amonyum hidroksit için gerekli
olan konsantrasyondan daha düşük miktarlarının bile florasanla belirlenen AFB1’in
düzeyinde oldukça etkili azalmaya neden olduğu belirtilmiştir. Sodyum hipokloritin
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
25
organizmalar üzerinde toksik etki göstermesi nedeniyle “Ames” analizi ile
toksisitesinin belirlenmesi mümkün olmamıştır (Draughon ve Childs, 1982).
Bandara ve ark. (1991) su içerisine daldırılan yarı pişmiş pirinçlerin AFB1
düzeylerinin arttığını gözlenmiş ancak 10 µg g-1 kalsiyum hipoklorit ilavesinin ise
AFB1 miktarında önemli derecede azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir.
AFB1’in degradasyonu ve OH radikalinin oksidasyonuna bağlı olarak mutajen
özelliğinde azalma açısından değerlendirildiğinde, hipoklorik asidin sodyum
hipokloritten daha çok etkili olduğu görülmüştür (Suzuki ve ark., 2002).
2.5.3.5. Amonyak Uygulaması
Amonyak uygulaması, mısır işleme endüstrisince kabul gören ve geniş çapta
kullanılan bir yöntemdir (Park ve Njapau, 1989; Weng ve ark., 1994). Amonyum
hidroksit veya amonyak gazı kullanılmasıyla mısır, yerfıstığı küspesi, pamuk tohumu
ve ürünlerinde aflatoksinin %99’dan fazla azalması sağlanmıştır (Özay, 1988). Bu
reaksiyon sonucu oluşan ürünler, AFB1’den çok daha az toksiktir. Ancak,
amonyaklanan üründen havalandırma ile amonyağın uçurulması gerekmektedir.
ABD’de Food and Drug Administration (USFDA) tarafından, amonyak işlemi
görmüş yem hammaddesinin (pamuk tohumu için) %20'den fazla katılmaması ve
uyarıların etikette bulunması gibi koşullarla geviş getiren hayvanlarda yem olarak
kullanımına izin verilmiştir (Özkaya ve ark., 1999). Amonyaklama diğer
detoksifikasyon yöntemlerine nazaran daha ekonomik olup büyük miktarda ürüne
uygulanabilmektedir. Toksisite denemeleri ile amonyaklanmış ürünün emniyetli
olduğu saptanmıştır (Özay, 1988).
Lee ve ark. (1984) %4 amonyak uygulanmış AFB1 içeren silika jelleri,
100°C’de 30 dk süreyle 40 psi basınç altında tutmuşlar ve uygulama sonunda
AFB1’in %99’unun degrade olduğunu bildirmişlerdir. Ancak, molekül ağırlıkları 286
ve 206 olan iki yeni bileşik oluşmuştur. Çözücü fraksiyonlar, amonyaklanmamış
AFB1’den 2000 ile 20000 kez daha az toksik etki göstermiştir (Haworth ve ark.
1989).
Amonyaklanmamış pamuk tohumu ununun metilen klorit fraksiyonunda
radyoaktif olarak işaretlenen ürünün %90’ı, amonyaklanan unda ise yalnızca %25’i
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
26
bulunmuştur (Park ve ark. 1984). Lawlor ve ark. (1985) yaptıkları çalışmada
radyoaktif olarak işaretlenen ürünlere protein bağlandığını bildirmişlerdir.
500 ng g-1 AFB1 ile kontamine olmuş kuru hindistancevizi, %20 nem içerecek
şekilde %1.5 amonyum hidroksit ile muamele edilmiş ve 5 gün sonunda ana bileşiğe
dönüş olmadan toksin miktarı 20 ng g-1’nin altına düşmüştür (Mercado ve ark.,
1991). Yapılan başka bir çalışmada; toksinin dekontamine edilmesindeki en önemli
faktörlerin, ürünün nem içeriği ile amonyaklama işleminin yapıldığı sıcaklık
derecesinin olduğu belirtilmiştir (Weng ve ark., 1994). Yüksek sıcaklık (121°C) ve
nem içeriğinin (%16) oldukça etkili olduğu, bu şartlar altındaki mısırlardaki toksinin
%99’unun giderildiği bildirilmiştir. Ayrıca, bu ürünlerin mide asidine karşı dayanıklı
oldukları ve % 0.05’ten azının aflatoksine geri dönüştüğü ifade edilmiştir (King ve
Prudente, 2005).
Ticari ölçekli bir çalışmada, aflatoksin içeren öğütülmüş pamuk tohumuna
99°C’de ve 0.7 bar buhar basıncında % 1 amonyak uygulanmış, kalitede bir değişim
olmaksızın %97 oranında detoksifikasyon sağlanmıştır (Ahmed ve ark., 1996). Başka
bir çalışmada ise, %2’lik amonyum persülfatın mısırlarda AFB1’in degradasyonunda
etkili olduğu ve bu durumun etanol üretimini etkilemediği ifade edilmiştir (Burgos-
Hernandes ve ark., 2002).
Burgos-Hernandes ve ark. (1996), fermentasyon işlemiyle etanol üretiminde 3
farklı pestisit ile amonyum persülfat kullanımının aflatoksinle kontamine mısırlarda
detoksifikasyona etkisini araştırmışlardır. Fermentasyon sırasında %2 ve üzerindeki
miktarlarda amonyum persülfat, ayrıca farklı aşamalarda H2O2, ozodicarbonamide ya
da benzyl peroxide ilave etmişlerdir. Aflatoksinin en çok %2 amonyum persülfat
kullanılması durumunda parçalandığı bildirilmiştir.
Mercado ve ark. (1991), aflatoksinle kontamine olmuş kurutulmuş hindistan
cevizinin amonyak ile kimyasal detoksifikasyonu üzerinde çalışmışlar ve %7-24
arasında nem içeren ürünlere ilave edilen %1.5’lik amonyum hidroksitin, 5’inci gün
sonunda toksin miktarında %67 oranında bir azalmaya neden olduğunu
belirtmişlerdir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
27
2.5.3.6. Ozon Uygulaması
Ozon, klor bazlı kimyasallar yerine geçerek özellikle et ve su endüstrilerinde
olmak üzere, gıda işlemede sanitasyon amaçlı olarak geniş çapta kullanılmaya
başlanmıştır (McKenzie ve ark., 1997).
Aflatoksinli pamuk tohumu ve yerfıstığı ununun %30 nemde ve 100°C’de 2
saat süreyle ozonlanmasıyla AFB1 tamamen degrade olurken, başlangıçtaki %9
oranındaki AFB2’nin aynen kaldığı bildirilmiştir (Dwarakanath ve ark., 1968).
Ozonlanmış yerfıstığı unu, yavru ördeklerin yemlerine %60 oranında karıştırılmış ve
bu ördeklerin vücut ağırlıklarının aflatoksinli yem yiyen ördeklere göre daha düşük
bulunduğu belirtilmiştir (Dollear ve ark., 1968). Aflatoksinli mısırla
karşılaştırıldığında, ozonla muamele edilen unlarda protein etkinlik oranının azaldığı
bulunmuştur. Bu sonuca, ya temel besin öğelerinin yıkımının ya da yeni toksinlerin
oluşumunun neden olduğu düşünülmektedir (King ve Prudente, 2005).
Maeba ve ark. (1988) saf AFB1, AFB2, AFG1 ve AFG2’nin ayrı ayrı %5’lik
çözeltilerini ozonla muamele etmişlerdir. AFB2 ve AFG2’nin ozonla oksidasyona
AFB1 ve AFG1’den daha dayanıklı olduğu ve oksidasyonları için daha yüksek
konsantrasyonlara ve uzun sürelere ihtiyaç duyulduğu belirtilmiştir. Ozonlanan
aflatoksinlerin civciv embriyo analiziyle toksik olmadığı tespit edilmiştir. Ames testi
ile de ozonlanan AFB1 ve AFG1’in mutajenik olmadığı bulunmuştur. Ozonlama ile
AFB1’in bağışıklığı azaltan aktivitesi de ortadan kaldırılmıştır (Chatterjee ve
Mukherjee, 1993).
Aflatoksinli tahılların dekontaminasyonunda daha sonra hayvan yemleri için
de kullanılabilecek yeni bir ozonlama işlemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, oksijen ve
elektrik akımı kullanılan geleneksel metotlardan farklıdır çünkü ozon, su ve
elektroliz hücresi kullanılarak üretilmektedir. Bu ozonlama yöntemi kullanılarak 30
kg mısır tanesi ile yapılan çalışmada 92 saatte örneklerin aflatoksin içeriği %95
oranında azalmıştır. Ozonla muamele edilen mısır, yerfıstığı ve bunların soya unu ile
karışımlarını tüketen hindi palazlarının ağırlık kazanımları, karaciğer ağırlıkları ve
kan kimyaları kontrol örneklerle aynı bulunmuş, aflatoksinli yemlerle beslenen
hayvanlarda ise olumsuz farklar görülmüştür (McKenzie ve ark., 1998). Bu sonuçlar
ozonlama öncesinde kontamine olan veya olmayan mısırlar için de benzer bulunmuş
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
28
olup, ozonlama işlemi ile zararlı bileşiklerin oluşmadığının bir göstergesidir (King ve
Prudente, 2005).
Aflatoksinsiz ve doğal olarak aflatoksin içeren mısır örnekleri ozonlanmadan
önce ve sonra AFB1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla analiz edilmiştir.
Ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinsiz mısırların 2 ng g-1’den daha az AFB1
içerdikleri, ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinli mısırların ise sırasıyla 48 ng g-1 ve
587 ng g-1 AFB1 içerdiği tespit edilmiştir. Çalışmada inaktif hale geçen aflatoksinin
ana bileşiğe geri dönmediğini göstermiştir (Prudente ve King, 2002).
Asidik bir ortama maruz kalan 47 ng g-1 AFB1 içeren ozonlanmış örneklerin
toksin içerikleri 29 ng g-1’ye düşmüştür. Asit uygulaması, AFB1’in furan halkasının
8, 9-olefinik bağının hidrasyonuna öncülük ederek AFB1’in 1/200’ü kadar az toksik
olan AFB2a’nın oluşmasına neden olmuştur (Samarajeewa ve ark., 1990). Hekzan
ekstraktları sürekli olarak saf AFB1’in potansiyel mutajenik etkisini azaltmaktadır
(Prudente ve King, 2002). Bu sonuç, mısırın kaba (crude) ekstraktları içindeki
mevcut maddelerin aflatoksinin mutajenik aktivitesini engellediğini
desteklemektedir. Ayrıca ozonlanmış aflatoksin içeren mısır ekstraktlarının diğer
ekstraktlarla karşılaştırıldığında daha az engelleyici etkisinin olduğu görülmüştür.
Elde edilen bulgular, ozonlama işlemi ile mutajenik etkiye sahip yeni reaksiyon
ürünlerinin oluşmuş ya da ozonlamanın toksinli mısırlardaki doğal mutajen
inhibitörlerini tahrip etmiş olabileceğini göstermektedir (Prudente ve King, 2002;
King ve Prudente, 2005).
Yapılan bazı çalışmalarda, linoleik asidin antimutajenik aktivite gösterirken
otooksidasyona uğrayan linoleik ve oleik asitlerin ise mutajenik aktivite gösterdiği
bildirilmiştir (Aikawa ve Komatsu, 1987; Aikawa, 1988; Ho ve ark., 1995). Prudente
ve King (2002) ozonla muamele edilen ve doğal olarak aflatoksin içeren mısırların
palmitik asit miktarlarının %15.8’den %18.2’ye çıktığını ve linoleik asitin
%58.7’den %56.2’ye düştüğünü belirtmişlerdir.
Zorlugenç ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada, ozonlama öncesi kuru
incirlerde mikotoksin oluşumuna neden olan A. flavus ve A. parasiticus’un
bulunduğunu ve 15 dakika süreyle ozon gazı ve ozonlu su ile muamele edilen incir
örneklerinde küflerin tamamen yok edildiklerini bildirmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca,
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
29
incirlerin AFB1 içeriklerinin 180 dakikalık ozon gazı ve ozonlu su uygulaması
sonrasında 21.00 ng g-1’dan sırasıyla 1.01 ve 2.39 ng g-1’a düştüğünü belirtmişlerdir.
2.5.4. Biyolojik Detoksifikasyon
Mikotoksinler ile kontamine olmuş tarımsal ürünlerin detoksifikasyonunda
mevcut fiziksel ve kimyasal metotların kullanımı, besin içeriğindeki kayıplar, sınırlı
etki ve maliyet gibi sorunlar nedeniyle kısıtlanmaktadır. Bu durum mikotoksin
sorununa karşı biyolojik yaklaşımı cazip hale getirmektedir (Bata ve Lasztity, 1999;
Shapira ve Paster, 2004).
Biyolojik degradasyonla ilgili ilk bulgular, aflatoksinin keşfedildiği 1960’lı
yıllarda, aralarında küf, maya, aktinomiset, bakteri ve alglerin bulunduğu yaklaşık
1000 mikroorganizmanın, AFB1 ve AFG1’i parçalama veya biyo-dönüşüme
uğratması yönünde etkilerinin olup olmadığının test edildiği çalışma ile elde
edilmiştir. Çalışmada, aflatoksin üzerine hiçbir maya, aktinomiset ve algin etkili
olmadığı belirlenmiştir. Bazı Pseudomanas türlerinin aflatoksini azalttığı görülmüşse
de, bunun ortam pH’sındaki yükselmeye bağlı olduğu belirtilmiştir. Küf ve küf
sporları ile yapılan denemelerde, Aspergillus niger suşlarının AFB1’i belli ölçüde
azalttığı, ancak bunun uzun bir inkübasyon süresince gerçekleştiği; Penicillium
raistrickii ve bazı küf sporlarının da, AFB1’in bir kısmını ince tabaka
kromotografisinde farklı Rf’lerde floresans veren maddelere dönüştürdüğü
bildirilmiştir. Ayrıca çalışmada Flavobacterium’un 7 farklı türü de dahil olmak üzere
test edilen bütün bakterilerin aflatoksin üzerinde etkisiz olduğu görülürken, yalnız F.
aurantiacum NRRL B-184 suşunun aflatoksini ortamdan uzaklaştırılabildiği
belirlenmiştir (Ciegler ve ark., 1966).
Mikotoksinlerin biyolojik detoksifikasyonu çoğunlukla, sorpsiyon veya
enzimatik degradasyon yolu ile gerçekleşmektedir. Canlı mikroorganizmalar
mikotoksini ya hücre duvarı bileşenlerine bağlamakta ya da aktif internalizasyon
(özümseme) ve akümülasyon ile absorbe etmektedirler. Ölü mikroorganizmalar da
mikotoksinleri absorbe edebilmekte ve bu durumdan akışkanların dekontaminasyonu
için biyofiltre oluşturmada veya probiyotiklerin bağlanarak bağırsaktan mikotoksini
uzaklaştırmalarında yararlanılabileceği belirtilmiştir (Shapira ve Paster, 2004).
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
30
Enzimatik degradasyon ise hücre dışı veya hücre içi enzimler tarafından
gerçekleşebilmektedir. Enzimatik degradasyon tamamlandığında son ürün CO2 ve su
olur. Diğer bir seçenek ise enzimatik modifikasyon ile toksinin başka bir forma
dönüşmesi, azalması veya tamamen yok olmasıdır (Shapira ve Paster, 2004).
Mikroorganizmaların AFB1’i bağlama yeteneklerinin araştırıldığı çeşitli
çalışmalarda, laktik asit bakterilerinin, bifidobakterlerin ve propionibacterium’ların
bazı suşlarının AFB1’i bağlayabildikleri tespit edilmiştir (El-Nezami ve ark., 1998a;
El-Nezami ve ark., 1998b; El-Nezami ve ark., 2000; Oatley ve ark., 2000; Haskard
ve ark., 2001).
F. aurantiacum NRRL B-184 dışında AFB1’i detoksifiye eden
mikroorganizmaların; Corynebacterium rubrum, Candida lipolytica, Aspergillus
niger, Trichoderma viride ve Mucor ambiguous ile bazı Rhizopus, Neurospora ve
Phoma türlerinin olduğu bazı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Mann ve Rehn,
1976; Nout, 1989; Shantha, 1989).
Flavobacterium, agarlı kültür besiyerinde sarı-kırmızı renkli kolonileri ile
karakterize olan ve karbonhidratlardan zayıf asit oluşturabilen, gram negatif,
fakültatif anaerob, çubuk şeklinde bir bakteri cinsidir (Holmes ve ark., 1984).
Flavobacterium cinsine giren türler genelde 30oC ve hemen altındaki sıcaklıklarda
gelişebilmektedir. Bu bakterinin çok az sayıdaki türünün 37oC’de üreyebildiği
belirtilmiştir (Weeks, 1974).
Bergey’s Manual’in sekizinci baskısında (Weeks, 1974) tür sayısı 12 olarak
belirtilmekle birlikte, 1984 yılında yayınlanan baskısında (Holmes ve ark., 1984)
Flavobacterium cinsi içine F. aquatile, F. breve, F. balustinum, F. meningosepticum,
F. odoratum, F. multivorum, F. spiritivorum olmak üzere 7 tür dahil edilmektedir.
Sözü edilen Bergey’s Manual baskılarında F. aurantiacum NRRL B-184 türüne ise
rastlanılmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu Amerika Birleşik Devletleri
“Kuzey Bölgesi Araştırma Laboratuarınca (Northern Regional Research Laboratory-
NRRL) tanımlanan ve isimlendirilen bir bakteridir (Özkaya, 2001).
Ciegler ve ark. (1966) yaptıkları bir araştırmada, “Flavobacterium
aurantiacum” olarak izole edilen ve “F. aurantiacum NRRL B-184” olarak
tanımlanan bu bakterinin Bergey’s Manual’in altıncı baskısında yer alan F.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
31
aurantiacum’un ve diğer Flavobacterium türlerinin özelliklerine tam uyum
göstermediğine değinmişlerdir. Araştırıcılar F. aurantiacum NRRL B-184 olarak
isimlendirilen bu bakterinin, aerobik, gram negatif, çubuk şekilli, hareketsiz bir
bakteri olduğunu ve “tryptone-glucose-yeast extract (TGY)” agarlı besiyerinde,
yuvarlak, parlak turuncu renkte, kubbeli, pürüzsüz ve sınırları belirgin koloniler
oluşturduğunu belirtmiştir. Ayrıca çalışmada, bakterinin jelatini sıvılaştırmadığı,
litmuslu süt besiyerinde 48 saatte 5mm’nin üzerinde alkali reaksiyon verdiği,
nitrattan nitrit oluşturmadığı, sitratta gelişmediği ve indol, nişasta hidrolizi, glukoz,
sukroz ve laktoz negatif özellik gösterdiği belirtilmiştir.
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun sınıflandırılmasıyla ilgili yapılan
çalışmalarda bakterinin sınıflandırılmasında hata yapıldığı belirlenmiş ve bakteri
Nocardia corynebacteriodes olarak yeniden adlandırılmıştır (Yassin ve Schaal,
2005).
Ciegler ve ark. (1966) tarafından yapılan çalışmada, 107-1010 kob ml-1
konsatrasyonda F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri hücresi tarafından, modifiye
TGY sıvı besiyerinde bulunan değişik konsantrasyondaki (270-5000 µg 50ml-1)
AFB1’in 44 saat içinde %38-74 arasında değişen oranlarda uzaklaştırıldığı
görülmüştür. Aflatoksinli ve aflatoksinsiz TGY sıvı besiyerinde geliştirilen durgun
faz hücreleri, aflatoksin içeren fosfat tamponunda inkübe edilmiş; her iki durumda da
toksinin ortamdan uzaklaştığı görülmüş ve toksinli besiyerinde geliştirilen hücrelerle,
toksinsiz olanlarda geliştirilen hücrelerin aflatoksini uzaklaştırma oranları benzer
bulunmuştur. Toksindeki azalma, hücre sayısı ve inkübasyon süresinin artırılmasıyla
orantılı olarak artmıştır. Çalışmada, otoklavlanmamış F. aurantiacum NRRL B-184
kültüründeki ölü hücrelerin, hücre sayısı ile orantılı olarak AFB1’i çözeltiden
uzaklaştırdığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada, 3x1012 kob 50 ml-1 hücreyle inkübe
edilen AFB1’in yaklaşık olarak %70’i uzaklaştırılmıştır. Ancak, ölü hücreler
çözeltiden uzaklaştırılıp, hücre peleti suyla yıkandığında toksinin tamamı geri
alınmıştır. Ayrıca, hücre sayısının ve inkübasyon süresinin artırılmasının toksinin
%70’inden daha fazlasının uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı görülmüştür.
Buna karşılık canlı durgun faz hücreleri (2x1013 kob 50ml-1), 1’er mg AFB1 ve G1
içeren sudaki toksinlerin tamamını 3-4 saat içerisinde uzaklaştırmışlardır. Canlı
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
32
hücrelerin ortamdan uzaklaştırdığı toksin, su ya da kloroformla yıkamayla veya sonik
işlemle dahi geri alınamamıştır. Canlı hücrelerin inkübasyondan sonra
otoklavlanması da toksinin geri dönüşünü sağlamamıştır. Bu nedenle araştırıcılar,
aflatoksinin geri dönüşümsüz olarak bağlanıp ortamdan uzaklaştırılabilmesi için F.
aurantiacum NRRL B-184’ün canlı hücrelerine gereksinim duyulduğu sonucuna
varmışlardır.
Aynı çalışmada aflatoksinin tamamının uzaklaştırıldığının ve degradasyon
ürünlerinin toksik olup olmadığının belirlenmesi amacıyla, AFB1 ve AFG1 ile inkübe
edilen F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin sulu süspansiyonları yavru
ördeklere verilmiştir. Tek başına 8 µg AFB1 ve 7 µg AFG1 verilen ördeklerde “Bile
Duct Hyperplasia” görülürken, canlı hücrelerle işlem görmüş 52.5 µg AFB1 veya 30
µg AFG1 verilen ördeklerde ise bu hastalık görülmediği gibi herhangi bir histolojik
değişiklik de gözlenmemiştir. Araştırıcılar, canlı F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin çözeltideki aflatoksini detoksifiye ettiğini ve yeni toksik parçalanma
ürünlerinin oluşmadığını belirtmişlerdir (Ciegler ve ark., 1966).
Ciegler ve ark. (1966), F. aurantiacum NRRL B-184’ü çeşitli gıdalar
üzerinde de denemişlerdir. Bu denemelerde, toksijenik bir A. flavus suşu
geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan ürünlerde çalışılmıştır. 1013 kob ml-1 canlı
F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28oC de 12 saatlik inkübasyon sonunda
soya fasulyesindeki 8 µg g-1 düzeyindeki AFB1 2 µg g-1’e düşmüş, inkübasyon süresi
uzatıldığında soya fasulyesinde kalan aflatoksininde giderildiği belirlenmiştir. Mısır
ve yerfıstığında, sırasıyla 16 ve 13 µg g-1 düzeyindeki AFB1’in %100 oranında
ortamdan uzaklaştığı belirtilmiştir. Süt, bitkisel yağ ve fıstık ezmesi gibi sıvı ve yarı
katı ürünlerde ise 2x1013 kob ml-1 bakteri hücresi ile 12-14 mg L-1 düzeyindeki
AFB1’in 2-3 saat gibi kısa sürelerde sıfıra veya iz miktarlara düştüğü ortaya
konulmuştur.
Lillehoj ve ark. (1967) AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri
üzerine etkisini ve toksinin organizmaya bağlanma miktarı ile bağlanma
mekanizmasını incelemişlerdir. Bu çalışmada, 5µg ml-1 ve daha yüksek
konsantrasyonda aflatoksin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin morfolojisinin değiştiği; hücre boyunun belirgin şekilde uzadığı, ipliksi
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
33
bir görünüm alan bu hücrelerde daha sonra da şişkinlik ve dallanmalar meydana
geldiği görülmüştür. Penisilin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinde de benzer morfolojik değişimlerin görüldüğü belirtilmiştir. Çalışmada,
test çözeltilerine eklenen %1 glikoz, 0,01M azid ve 1000 ünite ml-1 penisilinin,
AFB1’in uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı ifade edilmiştir. Aflatoksinin durgun
fazdaki hücreler tarafından uzaklaştırılmasının inkübasyon ortamının sıcaklığına ve
pH’sına karşı oldukça duyarlı olduğu ve en fazla azalmanın 35oC’de ve pH 6,75’de
gerçekleştiği belirtilmiştir.
Aynı çalışmada, 1011 kob ml-1 düzeyinde durgun faz hücresi içeren bir sıvı
ortama 7µg ml-1 AFB1 ilave edilmiş ve 4 saat’lik inkübasyonun sonunda toksinin tam
olarak uzaklaştığı belirtilmiştir. Toksinin canlı hücreden suyla yıkama ve sonik
uygulama ile geri alınamadığı da bildirilmiştir. Aynı deneme otoklavlanmış
hücrelerle yapıldığında AFB1’in yaklaşık olarak aynı oranda ortamdan
uzaklaştırıldığı, yıkama işlemi ile toksinin geri alınabildiği ve inkübasyon süresinin
uzaması durumunda toksin azalışının devam etmediği ifade edilmiştir.
Ayrıca, hücre duvarı öğütülmüş bakteri ve hücre duvarı preparatları da toksini
uzaklaştırmada kısmen başarılı bulunmuş, ancak bu preparatlar suyla yıkandığında
toksin geri alınabilmiştir. Bu durumun, aflatoksinin başlangıçta hücre dış yüzeyine
muhtemelen “Hidrojen” veya “Van Der Waals” bağlarıyla zayıf olarak bağlanması
ile açıklanmıştır. Araştırıcılar, toksinin canlı hücreler tarafından metabolik olarak
kullanıldığı ve geri dönüşümsüz olarak giderilmesi için sağlam ve tam hücre yapısına
ihtiyaç olduğu sonucuna varmışlardır.
Lillehoj ve ark. (1967), AFG1’in gelişme dönemindeki F. aurantiacum NRRL
B-184 hücreleri üzerine etkisi ile toksinin durgun faz ve otoklavlanmış hücrelerden
uzaklaştırılmasını inceledikleri çalışmada; 2.5 mg L-1 AFG1, F. aurantiacum NRRL
B-184’ün gelişmesi üzerine etki etmezken, 48 saatlik inkübasyon sonunda 7.5 ve
37.5 µg g-1 toksin, bakteri gelişiminin sırasıyla %55 ve %90 oranında azalmasına
neden olmuştur. Gelişme ortamındaki AFG1 konsantrasyonunun artması lag fazı
süresinin de artmasına neden olmuş ancak 96 saat sonrasında tüm kültürler için
toplam gelişme süresi benzer bulunmuştur. AFG1 ile karşılaştırıldığında AFB1’in test
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
34
mikroorganizmasının gelişimini engelleyici etkisinin 2-3 kat fazla olduğu
belirtilmiştir.
Araştırıcılar, AFB1 ve AFG1’in hücrenin aynı bölgesine bağlanıp
bağlanmadığını test etmek için hücreleri AFG1 ortamına ilave etmeden önce AFB1 ile
muamele etmişlerdir. Deneme sonucunda hücrelerin AFB1’i bağladıktan sonra
AFG1’i de ortamdan uzaklaştırabildiği bu durumun her iki toksinin hücrenin farklı
bölgelerinde tutulduğunu gösterebileceğini belirtmişlerdir.
Lillehoj ve ark. (1971), F. aurantiacum NRRL-184’ ün gelişme ve durgun
fazdaki hücrelerinin AFM1’in giderilmesi üzerine etkilerini inceledikleri çalışmada 8
μg ml-1 AFM1 içeren sıvı ortama 5x1010 kob ml-1 olacak şekilde durgun fazda hücre
inkübe edilmiş ve dört saat sonra AFM1 tamamen uzaklaştırılmıştır. AFM1’in
gelişme dönemindeki hücreler üzerindeki olumsuz etkisinin ise AFG1 ve AFB1’den
daha az olduğu belirtilmiştir.
Hao ve Brackett (1988) 109 kob ml-1 durgun faz hücresini içeren fosfat
tamponu ile yağlı ve yağı kısmen uzaklaştırılmış yerfıstığı sütünden F. aurantiacum
NRRL B-184’ün AFB1’i uzaklaştırma yeteneğini araştırmışlardır. 24 saat’lik
inkübasyon sonunda, aflatoksin miktarının fosfat tamponunda %40, yağı alınmamış
ve yağı %50 azaltılmış olan yerfıstığı sütünde sırasıyla %23 ve %74 oranında
azaldığını belirtmişlerdir.
Hao ve Brackett (1989) tarafından yapılan diğer bir çalışmada ise, F.
aurantiacum NRRL B-184’ün, durgun faz hücrelerinin elde edilmesi için uygun olan
besiyeri belirlenmiş ve bu bakterinin yerfıstığı sütündeki gelişme karakteristikleri
incelenmiştir. Durgun faz hücrelerinin elde edilmesinde en uygun besiyerinin, ticari
olarak bulunabilen bir ürün olması, kullanımı sırasında özel bir hazırlık
gerektirmemesi ve en iyi gelişimin bu besiyerinde gerçekleşmesi nedeniyle TSB
olduğu belirtilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184’ün yağlı yerfıstığı sütünde, yağ
miktarı yaklaşık %50 oranında azaltılmış olana göre daha yavaş durgun faza ulaştığı
ve bakterinin stabilitesinin en iyi pH 7.0’de korunduğu ifade edilmiştir.
Line ve ark. (1994)’nın F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından
gerçekleştirilen aflatoksin degradasyonunun mekanizmasını belirlemeye yönelik
yaptıkları çalışmada, radyoaktif olarak işaretlenmiş olan AFB1, canlı ve ölü bakteri
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
35
hücreleri ile 72 saat süreyle inkübe edilmiştir. Örnekler kloroformla ekstrakte edilmiş
ve belirli periyotlarla sulu ve polar olmayan fazlar 14C içeriği yönünden analiz
edilmiştir. Kloroformda çözünen [14C] AFB1’in canlı F. aurantiacum NRRL B-184
hücreleri tarafından hızla suda çözünür ürünlere dönüştürüldüğü görülmüştür. Canlı
hücrelerin varlığında 6 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin yalnızca
%24.1’i kalmıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi içermeyen kontrol
örneklerinde ise 72 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin %99.7’si
kalmıştır. Denemenin sürdürüldüğü zaman içerisinde radyoaktividedeki azalma ile
suda çözünür degradasyon ürünlerinin oluşum hızlarının benzer olduğu görülmüştür.
Sabit biyokütlede ve sürekli olarak azalan substrat düzeylerinde hız, kalan substratın
konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Bu durum, topraktaki ve sudaki birçok bileşiğin
dekompozisyonunda da görülen birinci derece kinetiğe uygun bulunmuştur.
Araştırıcılar ayrıca, bir miktar aflatoksinin ölü F. aurantiacum NRRL B-184
hücreleri tarafından bağlandığını ancak suda çözünür bileşiklere ya da karbon
dioksite dönüştürülemediğini ifade etmişlerdir.
Line ve Brackett (1995a) AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından
uzaklaştırılmasını etkileyen faktörleri inceledikleri çalışmada kültür yaşı ve hücre
sayısının aflatoksinin degradasyonunda etkili olduğu ifade edilmiştir. 24 saatlik
kültürün aflatoksini uzaklaştırmada tamamen etkisiz bulunduğu, 48 saatlik durgun
faz kültürünün ise toksin üzerinde etkili olarak AFB1’i 24 saat içerisinde %19
oranında azalttığı bildirilmiştir. Ayrıca, 72 saatlik geç durgun faz kültürünün toksini
ortamdan %33 oranında uzaklaştırdığı da belirtilmiştir. Araştırıcılar bu durumun tam
olarak anlaşılamadığını ancak, yaşlanmaya bağlı olarak hücrenin bazı
konformasyonal veya metabolik değişiklik geçiriyor olmasına bağlanabileceğini
belirtmişlerdir. 1x1010 kob ml-1 hücrenin, 1x109 kob ml-1 hücre ile kıyaslandığında
aflatoksini ortamdan daha hızlı olarak uzaklaştırdığı ancak uzaklaştırılan toplam
toksin miktarında bir değişiklik görülmediği de ifade edilmiştir.
Line ve Brackett (1995b) tarafından yapılan başka bir araştırmada, F.
aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB1’in mikrobiyel dönüşümü üzerine toksin
konsantrasyonunun ve ikinci karbon kaynağının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla
bakteri hücresi içeren fosfat tamponu veya TSB test çözeltilerinin bir kısmına
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
36
radyoaktif olarak işaretlenmiş AFB1, diğer bir kısmına da hem işaretlenmiş hem de
işaretlenmemiş AFB1 eklenmiş ve 28oC’de 72 saat inkübe edilmiştir. Radyoaktif
karbondioksitin ve hücre süpernatantının suda ve kloroformda çözünen kısımlarının
analiz edilmesiyle, ilave olunan besin öğelerinin ve işaretlenmemiş toksinin AFB1’in
mikrobiyel dönüşümü üzerine önemli bir etkisinin bulunmadığı ortaya koyulmuştur.
Araştırıcılar çalışmadan elde edilen sonuçları, AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184
tarafından degradasyonunun ko-metabolizma ile ilişkili olmadığı ancak,
organizmaların hem karbon hem de enerji kaynağı olarak tek bir bileşikten
yararlandığı metabolizma şekli olan “mineralizasyon” sonucu meydana gelebileceği
şeklinde yorumlamışlardır. Bu çalışmayla ileri sürülen “degradasyonun bir
mineralizasyon prosesi içerisinde gerçekleştiği ve dışarıdan bir enerji kaynağına
ihtiyaç göstermediği” hipotezinin doğrulanmasının bu yöntemle detoksifiye edilen
gıdalarda ve yemlerde besin kalitesinin olumsuz etkilenmeyeceğini düşündürmüştür.
D’souza ve Brackett (1998) degradasyon prosesleri ile ilişkili olduğu
düşünülen enzim sistemlerinde yer alan bazı metal ko-faktörlerin (Cu+2, Mn+2, Zn+2
ve Co+2), F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB1’in degradasyonunda etkili
olup olmadığını ve bu etkinin Etilendiamintetraasetikasit (EDTA) ve 1,10 fenantrolin
(OPT) varlığında da sürüp sürmediğini araştırmışlardır. 1 ve 10 mM
konsantrasyonlarda iki değerlikli bakır içeren ortamlarda; 4, 24 ve 48 saatlik, 0.1 mM
konsantrasyonda ise 24 ve 48 saatlik inkübasyondan sonra AFB1’in
degradasyonunun kontrollerden önemli ölçüde düşük olduğu görülmüştür. 1mM
EDTA veya 1mM OPT ilavesi, Cu+2’nin AFB1’in degradasyonu üzerindeki inhibe
edici etkisini önleyememiştir. Araştırıcılar Cu+2’nin bakteriler üzerine toksik etki
gösterebileceğini, yaptıkları ön denemelerde 0.1, 1 ve 10 mM Cu+2 içeren ortamlarda
48 saat inkübe edilen hücrelerin sayısında 1.5-2 log düzeyinde bir azalma
gördüklerini bildirmişlerdir. Ancak bu toksik etkinin bir enzim veya enzim sistemi
üzerinde de olabileceği ve AFB1 degradasyonuyla ilişkili bir redüktaz sistemini
inhibe etme olasılığı üzerinde de durulmuştur.
0.1 mM Mn+2 ilavesinin toksin degradasyonu üzerine etkisi önemli
bulunmazken, 1 ve 10 mM konsantrasyonda ise 4 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra
degradasyonda önemli bir azalma olduğu görülmüştür. Ön çalışmalarda Mn+2
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
37
bulunan ortamlarda hücre sayısında azalma gözlendiğinden yüksek
konsantrasyonlardaki iki değerlikli manganın, AFB1 degradasyon sisteminin
genlerini baskılayabileceği veya enzimin degradasyon için inaktif veya daha düşük
affiniteye sahip bir hale dönüşmesine neden olabileceği belirtilmiştir.
Yalnızca Mn+2 ilavesi ile karşılaştırıldığında 1mM Mn+2’nin 1mM EDTA
veya OPT tarafından bağlanması, 4 ve 24 saat sonra AFB1’in degradasyonunu
önemli ölçüde artırırken, 1 mM OPT’nin 10 mM Mn+2 içeren ortama eklenmesi ise
artırmamıştır. Bu bulgu araştırıcılar tarafından, Mn+2’nin AFB1 degradasyonu
üzerine inhibisyon etkisinin yalnız yüksek konsantrasyonlarda olduğu şeklinde
değerlendirilmiştir.
İki değerlikli çinko eklenen örneklerde de degradasyon, 1 ve 10 mM
konsantrasyonlarda; 4, 24 ve 48 saat sonra önemli ölçüde azalırken, 0.1 mM Zn+2
varlığında önemli bir değişiklik görülmemiştir. 1 mM EDTA, 1 ve 10 mM Zn+2’nin
bu inhibitör etkisini önleyemezken, OPT Zn+2 ’ye bağlanmış ve degradasyonun
inhibisyonunu önlemiştir. Ancak, 10 mM konsantrasyondaki Zn+2 varlığında OPT
yalnız Zn+2 bulunanlara göre daha yüksek bir degradasyon sağlanmıştır. Buna
rağmen, yalnız AFB1 bulunan ortamdaki kontrol hücrelerinin degradasyon oranından
daha az degradasyon gerçekleşmiştir. Zn+2’nin degradasyon ile ilişkili olan enzim
veya enzim sisteminde konformasyonal bir değişikliğe neden olarak aktiviteyi
etkileyebileceği üzerinde de durulmuştur. Çalışmada Co+2’nin degradasyonda hiçbir
değişikliğe neden olmadığı görülerek başka denemeler yapılmamıştır.
Araştırıcılar sonuç olarak, Cu+2, Mn+2 ve Zn+2’nin degradasyonda gösterdiği
inhibisyonun, AFB1 degradasyonu ile ilişkili özel bir enzim veya enzim sisteminin
kesin kanıtlarını sağlamadığını; ancak bir redüktaz sisteminin bu organizma
tarafından aflatoksinin degradasyonunda rol oynadığını öne sürebileceklerini ifade
etmişlerdir. Ayrıca bu katyonların ham (crude) enzim preparatları üzerine etkisini
belirlemede hücresel fraksiyonların kullanıldığı ilave araştırmalara gerek görüldüğü
de belirtilmiştir.
D’souza ve Brackett (2000) yaptıkları çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-
184 tarafından AFB1’in degradasyonunda kalsiyum ve magnezyumun rolü ile şelatlar
ve ayrıca şelatların varlığında iki değerlikli katyonların etkilerinin belirlenmesi
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
38
amaçlanmıştır. Araştırmada Ca+2 ve Mg+2’nin kullanılma nedeni olarak, bu
elementlerin enzimlerin büyük bir bölümünde doğal aktivatörler olmaları
gösterilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184’ün 72 saatlik kültürü üzerine 10 µg ml-1
AFB1 ilave edildikten sonra 0.1, 1 ve 10 mM Ca+2 eklenip 48 saat süreyle inkübe
edilmiştir. Süre sonunda Ca+2 ilave edilmemiş hücrelerle kıyaslandığında toksin
miktarında sırasıyla %11.8, 13.5 ve 14.0 oranında azalma görülmüştür. Aynı
konsantrasyonlardaki Mg+2 ilavesi ise sırasıyla %13.8, 13.3 ve 13.1’lik bir azalmaya
neden olmuştur. Her iki katyon için 16 ve 24 saatlik inkübasyon süresi aflatoksinin
degradasyonunda önemli bir etkiye sahip bulunmamıştır. 0.1, 1 ve 10 mM EDTA ile
0.1 ve 1 mM OPT ilavesinin 24 saat sonunda AFB1’in degradasyonunda önemli bir
artışa neden olduğu bildirilmiştir. 10 mM OPT kullanılması durumunda ise daha az
toksin degrade edilebilmiştir. AFB1 ile inkübe edilmiş kontrol örnekler ile Ca+2 ya da
Mg+2 içeren kontrol örneklerde önemli bir toksin degradasyonu gerçekleşmemiştir.
Aflatoksin degradasyonundaki artışın, ilave edilen bu divalent katyonların glikoliz ve
trikloroasetik asit döngüsündeki çeşitli dehidrogenazlar ve dekarboksilazların önemli
kofaktörleri olmalarına bağlı olabileceği ifade edilmiştir.
Divalent katyonlar (Ca+2 ve Mg+2) olmaksızın EDTA (0.1, 1 ve 10 mM)
ilavesi ile 24. saatteki degradasyon önemli ölçüde artmış, 16. ve 48. saatlerdeki
artışlar ise önemli bulunmamıştır. Aynı şekilde 0.1 ve 1 mM OPT ilavesi de 24 saat
inkübasyondan sonra önemli ölçüde yüksek degradasyon sağlamıştır. Ancak 10 mM
OPT ilave edilen örnekte 16 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra bir azalma
görülmüştür. 1 mM EDTA bulunan ortama ilave edilen Ca+2 toksin degradasyonunda
önemli bir değişikliğe neden olmamıştır. Buna karşın 1 mM OPT ile Ca+2’nin birlikte
bulunması durumunda degradasyonda azalma görülmüştür. En yüksek degradasyon 1
mM OPT varlığında 10 mM Ca+2 ilavesi ile gerçekleşirken yine 1 mM OPT
varlığında 0.1 ve 1 mM Ca+2 ilavesi degradasyonda azalma ile sonuçlanmıştır.
Kontrol örneklerle karşılaştırıldığın d a, 1 mM EDTA v eya 1 mM OPT varlığında
Mg+2 ilavesi AFB1’in degradasyonunda önemli derecede azalmayla sonuçlanmıştır.
Elde edilen bu sonuçlar, Ca+2 ve Mg+2’un AFB1’in F. aurantiacum tarafından
degradasyonunu teşvik ettiğini, bu katyonların şelatörlerle bağlanması durumunda F.
aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından kullanılamadığını ve böylelikle
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
39
toksinin degradasyonunda azalma meydana geldiğini göstermiştir. Araştırıcılar
AFB1’in degradasyon mekanizması üzerine; bir redüktaz-dehidrogenaz enzim sistemi
yoluyla furan halkası oluşumunda meydana gelen azalmanın, dekarboksilazlar
aracılığı ile AFB1’in kumarin halkasının dekarboksilasyona uğramasının ve ayrıca
birden fazla enzimin etkili olabileceğini belirtmişlerdir.
Araştırıcılar, degradasyon mekanizması ve meydana gelen degradasyon
ürünlerinin tam olarak anlaşılamaması durumunda, bu yöntemin uygulamaya
sokulmasının mümkün olmadığı sonucuna varmışlardır. Ancak degradasyon ile
ilişkili enzim veya enzim sistemleri belirlendikten sonra; enzimlerin gen
kodlamasının yapılarak, plazmidlerin içine yerleştirilebileceği ve dekontaminasyon
işlemlerinde kullanılmak üzere başka bir organizmaya transfer edilebileceği ya da
dirençli ürünler elde etmek amacıyla genetik materyalin doğrudan bitkide
kullanılmasına olanak sağlayacak çalışmaların yapılabileceği belirtilmektedir.
Smiley ve Draughon (2000), F. aurantiacum NRRL B-184’ün ham protein
ekstraktlarının sulu çözeltide AFB1’i degrade etme yeteneğini belirlemeyi
amaçladıkları çalışmada proteinaz K, DNase I ve pH’nın degradasyon üzerindeki
etkileri de incelenmiştir. Protein ekstraktları (800 μg toplam protein/ml) sulu
çözeltilerdeki AFB1’i % 75 oranında ortamdan uzaklaştırmıştır. Isıl işlem görmüş
ham protein ekstraktı ise AFB1’i yalnızca % 5.5 oranında degrade edebilmiş ve bu
oran kontrol ile benzer bulunmuştur. Araştırıcılar bu bulgunun, diğer hücre
bileşenlerinin ve yapılarının da sıcaklığa dayanıklı olmaması nedeniyle,
degradasyonun bir enzime bağlı olduğunun kesin kanıtı olamayacağı görüşüne
varmışlardır. Proteinaz K ile işlem görmüş protein ekstraktlarının AFB1’i %34.5
oranında azalttığı görülmüştür. Proteinaz K spesifik olmayan bir proteazdır ve
protein ektraktında bulunan bütün proteinler ile reaksiyona girmektedir. Protein
ekstraktındaki diğer proteinlerde proteinaz K için substrat olabileceğinden, AFB1’in
degradasyonun tamamen inaktive olması beklenilmemiştir. Araştırıcılar proteinaz K
ile işlem görmüş protein ekstraktlarının degradasyon aktivitesinin azalmasının,
degradasyonun bir proteine ve belki de bir enzime bağlı olduğunu gösterdiğini ifade
etmişlerdir. Toksin degradasyonun, bakterinin genomik DNA’sına spesifik olmayan
bir bağlanmayla ilişkili olup olmadığını anlamak amacıyla ham protein ekstraktı
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
40
DNase I ile muamele edilmiştir. İşlem sonucunda degradasyon %80.5 oranında
gerçekleşmiştir. DNase I, 3'- hidroksil oligonükleotidleri üreten tek ve çift heliksli
DNA’yı parçalayan bir enzimdir. DNase I ile muamele sonrasında degradasyonda
azalmanın olmaması aflatoksinin F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından
uzaklaştırılmasının bakterinin kromozal DNA’sına bağlanmayla ilgisi olmadığını
açıkça ortaya koymuştur. AFB1’in DNA’ya bağlanmadan önce epoksi forma
dönüşmesi gerekmektedir, ancak bakterinin mikrosomal enzimleri olmadığı için
epoksidasyon da beklenmemekte ve böylelikle DNA’ya bağlanma
gerçekleşmemektedir. Degrade edilen AFB1 miktarı üzerine pH’nın etkisini
belirlemek amacıyla çözelti pH’sı 5, 6, 7 ve 8 ayarlanarak denemeler yapılmış ve
degradasyonun en fazla pH 7’de gerçekleştiği ifade edilmiştir. Araştırıcılar, AFB1
degradasyonu ile pH arasında bulunan ilişkiyi tipik bir enzimatik reaksiyon olarak
değerlendirmişlerdir.
D’souza ve Brackkett (2001), yaptıkları başka bir araştırmada indirgenme
koşulları ile seril ve sülfidril grubu inhibitörlerin AFB1 degradasyonu üzerine etkisini
araştırmışlardır. Araştırmada, redüksiyon koşullarının etkisini incelemek amacıyla
0.1, 1 ve 10 mM L-sistein kullanılmış ancak degradasyon üzerine bir etkisi
görülmemiştir. Bu sonuç, L-sisteinin, F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından
gerçekleştirilen AFB1 degradasyonunda etkili bir redüksiyon ajanı olmadığı ya da
redüksiyon koşullarının degradasyonda önemli olmadığı şeklinde değerlendirilmiştir.
Seril ve sülfidril gruplarının degradasyondaki önemini anlayabilmek amacıyla da, bu
grupların inhibitörleri olan, sırasıyla fenilmetilsulfonil florür (PMSF) ve Cd+2
kullanılmıştır. 1 ve 10 mM Cd+2 varlığında inhibisyon meydana gelmiş; 1mM EDTA
ve 1 mM OPT eklenmesi de inhibisyonu önleyememiştir. PMSF ile inkübe edilen
hücrelerde de 1 mM konsantrasyonda önemli inhibisyon görülmüştür. Araştırıcılar
inhibisyona; degradasyonla ilişkili enzim sistemindeki seril ve sülfidril gruplarının
inaktif hale gelmesinin ya da metabolizması için ihtiyaç duyduğu seril ve sülfidril
gruplarını inaktif hale getirerek mikroorganizmanın kendisine de toksik etki
gösteriyor olmasının neden olabileceğini belirtmişlerdir. Sonuç olarak, seril ve
sülfidril gruplarının önemli olduğu belirlenmiş, bunların degradasyonla ilişkisini
ortaya koyacak başka çalışmaların yapılması gerektiği ifade edilmiştir.
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
41
Özkaya (2001), tarafından yapılan Türkiye’de aflatoksin sorunu yaşanan
yerfıstığı ve kırmızı biberlerde AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 ile giderilmesi
konulu araştırmada; F. aurantiacum NRRL B-184 suşu AFB1’i 48 saat içinde fosfat
tamponu çözeltisinde %79-98.9 oranında, yerfıstığı ortamında %92.6-99.8 oranında,
kırmızı biber ortamında ise %88.7-100 oranlarında azaltmıştır. Regresyon analizleri,
AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bulunan her üç ortamdaki azalışın birinci
derece reaksiyon kinetiğine uygunluk gösterdiğine işaret etmektedir. F. aurantiacum
NRRL B-184 suşunun AFB1 içeren bu ortamlarda canlılığını inkübasyon süresince
başlangıç düzeylerindekine yakın olarak koruduğu bildirilmiştir.
Üreme eğrisi ile ilgili yapılan çalışmalarda ise F. aurantiacum NRRL B-184
suşunun durgun faza 45-50 saatte ulaştığı ve generasyon süresinin gıdalarda gelişen
birçok bakteriye göre uzun (8.15-8.66 saat) olduğu bildirilmiştir.
Bütün bu sonuçlar değerlendirildiğinde; F. aurantiacum NRRL B-184
suşundan kırmızı biber ve yerfıstıklarında bulunan AFB1’i uzaklaştırmada
yararlanılabileceği ve bu konuda yapılacak daha ayrıntılı araştırmalarla da olumlu
sonuç alınması durumunda F. aurantiacum NRRL B-184 kullanılarak
biyodegradasyona uğratılmış kırmızı biber ve yerfıstıkları, gıda katkısı veya salça,
sos ve ezme gibi gıdalar şeklinde değerlendirilebileceği; ancak öncelikle söz konusu
gıdalarda oluşan yeni metabolitlerin toksik olmadığının ortaya konulması gerektiği
vurgulanmıştır.
AFB1’in Rhodococcus erythropolis ile biyolojik degradasyonu hücre
içermeyen ekstraktlarla sıvı ortamda gerçekleştirilmiştir. R. erythropolis hücrelerinin
varlığında 48 saat sonunda aflatoksinin %17’si ve 72 saat sonunda ise %3-6’sı
kalmıştır. Dört bakteri suşunun R. erythropolis (DSM 14303), Nocardia
corynebacteriodes (DSM 12676), N. corynebacteriodes (DSM 20151) ve
Mycobacterium fluarantherivarans sp nov. (DSM 44556T)’ın hücre içermeyen
ekstraktları, bakteri hücrelerinin french basınç hücresinde parçalanması ile
üretilmiştir. AFB1, dört bakteri suşunun hücre içermeyen suşları ile de etkili bir
şekilde degrade olmuştur. N. corynebacteriodes (DSM 12676) (-ki daha önceden
yanlışlıkla F. aurantiacum NRRL B-184 olarak sınıflandırılmıştır) ile 24 saat
sonunda AFB1 degradasyonu %60 düzeylerinde görülürken N. corynebacteriodes
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ
42
(DSM 20151) ile aynı sürede %90’ın üzerinde degradasyon gözlenmiştir. R.
erythropolis ve M. fluarantherivarans, 30oC’de 4 saatte AFB1’in %90’ından fazlasını
degrade etmiş ve 8 saat sonunda ise AFB1 tespit edilememiştir. Yüksek degradasyon
oranı ve geniş bir sıcaklık aralığında degrade edebilmeleri nedeniyle R. erythropolis
ve M. fluarantherivarans gıda ve yem işleme uygulamaları için bir potansiyele sahip
bulunmuştur (Teniola ve ark., 2005).
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
43
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. MATERYAL
3.1.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü
F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri kültürü Amerika Birleşik Devletleri
Tarım Bakanlığı, National Center for Agricultural Utilization Research, Microbial
Genomics & Bioprocessing Research Unit Laboratuarından liyofilize formda temin
edilmiştir.
3.1.2. PFT Çözeltisi
PFT çözeltisi 0.067 M ve pH 6.7 olacak şekilde hazırlanmıştır (Lurie, 1975).
3.1.3. İnce Tabaka Plakası
Çalışmada 20x20 cm ebatlarında silica jel 60 kaplı ince tabaka plakaları
(TLC, Merck 5553) kullanılmıştır.
3.1.4. Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri
Araştırmada kullanılan mısır, soya, siyah zeytin, fındık ve kuru incir
Adana’dan, kuru kırmızıbiber ise Kahramanmaraş’tan temin edilmiştir.
3.1.5. Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler
Çalışmada kullanılan AFB1 standardı Sigma (Almanya), TSB, TSA, agar agar
Merck (Almanya), methanol, hekzan, diklorometan, fosforik asit, kloroform,
asetonitril, dietileter Merck (HPLC grade, Almanya), sodyum klorür, susuz sodyum
sülfat, Merck (Almanya); immnooaffinite kolonlar Aflaprep (R-Biopharm Rhone,
Glasgow, Scotland), Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kolonları Ace
(ABD) firmalarından sağlanmıştır.
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
44
3.2. YÖNTEM
3.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok
Kültürlerin Hazırlanması
Liyofilize formdaki F. aurantiacum NRRL B-184 suşu, 50 ml TSB bulunan
erlenmayerde aşılanmış ve 30oC’de 48 saat süreyle inkübe edilmiştir. Bu süre
sonunda gelişen kültürlerden bir öze dolusu alınarak, 50 ml steril TSB bulunan
erlenmayere aşılanmış ve aynı koşullarda inkübe edilmiştir.
TSB kültüründen stok kültür hazırlamak üzere, tüpteki yatık TSA besiyerine
aktarımlar yapılmış ve yine aynı koşullarda inkübasyonları sağlanmıştır. Stok
kültürler kullanım öncesinde, TSB’den yararlanılarak üç kez transfer edilmiş ve
canlandırılmaları sağlanmıştır. Stok kültürün muhafazası ve aktifleştirilmesinde Hao
ve Bracklett (1988)’den yararlanılmıştır.
3.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde Edilmesi
TSB’de aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 kültüründen erlenmayer
içindeki 100 ml steril TSB besiyerine 1ml ekim yapılmış ve erlenmayer 30oC’de 50
rpm’de çalkalamalı su banyosunda inkübasyona bırakılmıştır. Ekimin yapıldığı
andan başlayarak (0. saat) inkübasyonun 96. saatine kadar belirli periyotlarla birer ml
örnek alınarak kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir (Temiz, 1994). Bu amaçla, ilk
önce örneklerin seri dilüsyonları hazırlanmış ve her bir dilüsyondan içerisinde TSA
besiyeri bulunan 2 petri kutusuna drigalski özesi kullanılarak yüzeye yayma
yöntemiyle ekimler yapılmış ve 30oC’de 48 saat inkübasyonları sağlanmıştır.
İnkübasyon sonunda sayım için en uygun dilüsyona ait petriler sayılmış ve iki paralel
petrideki sayımların ortalaması dilüsyon faktörü de dikkate alınıp hesaplanarak
sayım sonuçları kob ml-1 olarak belirlenmiştir.
3.2.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre
Süspansiyonunun Hazırlanması
Bu amaçla içinde 50 ml TSB bulunan erlenmayerlere aktifleştirilmiş F.
aurantiacum NRRL B-184 kültüründen 1 ml aşılanmış ve erlenmayer 30oC’deki
çalkalamalı su banyosunda (Memmert) 72 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
45
sonunda kültür sıvısı 3500 rpm’de 20 dakika santrüfüj edilmiş ve üstteki sıvı faz
(süpernatant) kısmı atılmıştır. Bakteri hücre peleti steril potasyum fosfat tamponu
(0.067M; pH 6.7) ile yıkanmış, ardından santrüfüjleme ve yıkama işlemi
tekrarlanmıştır. Bunu takiben elde edilen son hücre peleti PFT ile yeniden süspanse
edilmiştir.
3.2.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre
Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi
Bölüm 3.2.3’de belirtildiği şekilde hazırlanan F. aurantiacum NRRL B-184
suşunun durgun faz hücre süspansiyonu PFT çözeltisi (0.067 M; pH 6.7) ile 1/5, 2/5,
3/5, 4/5 ve 1/10 oranlarında seyreltilmiş ve UV-visible spektrofotometrede
(Shimadzu) 540 nm dalga boyunda absorbans değerleri ölçülmüştür (Lillehoj ve ark.,
1967). Bunun yanısıra hücre süspansiyonu seyreltilerinin her birinden, ayrıca uygun
seri dilüsyonlar hazırlanarak petri kutusundaki TSA besiyerinde yüzeye yayma
yöntemiyle kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir. Kültürel sayım sonuçları
(kob ml-1), absorbans değerlerine karşı grafiğe geçirilerek regresyon eğrisi ve eşitliği
elde edilmiştir. Bu regresyon eğrisinden belirli bir absorbans değerine karşılık gelen
hücre sayısının belirlenmesinde yararlanılmıştır.
3.2.5. Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile Aşılanmış
Ortamların AFB1 Konsantrasyonundaki Değişimin Belirlenmesi
3.2.5.1. PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184’un AFB1’in Miktarı
Üzerine Etkisinin Belirlenmesi
Üç farklı konsantrasyonda (500, 1000 ve 2000 ng ml-1) AFB1 çözeltisi ilave
edilen erlenler, toksin standardında bulunan çözücünün uzaklaştırılabilmesi için
30oC’de azot gazı (N2) altında tamamen kurutulmuştur. Kalıntılar üzerine 50’şer ml
steril PFT çözeltisi eklenerek toksin çözündürülmüştür. Toksin içeren erlenlerden
kontrol grubu dışında kalanlarına bölüm 3.2.3. ve 3.2.4.’e göre hazırlanan F.
aurantiacum NRRL B-184 durgun faz hücre süspansiyonlarından yaklaşık 107
kob ml-1 hücre içerecek şekilde aşılama yapılmıştır. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
46
2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı
ayrı uygulanmıştır.
Erlenlerin tamamı 30oC’deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm’de
inkübasyona alınmış ve 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerde aflatoksin
konsantrasyonları yönünden bölüm 3.2.6.2’ye göre aflatoksin analizine tabi
tutulmuşlardır.
3.2.5.2. PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum NRRL B-
184’ün AFB1’in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi
F. aurantiacum NRRL B-184’ün PFT içerisinde bulunan gıda ürünlerinin
AFB1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla; öncelikle içerisinde öğütülmüş (50 g) ve
bütün halde (50 g) gıda ürünleri içeren 250 ml hacimli alüminyum folyoya sarılı
rodajlı erlenler 121oC’de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Gıda örneklerinin her biri
için örnekler üzerine; 500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeyinde olacak şekilde AFB1
çözeltisi ilave edilmiştir. Dairesel hareketlerle karıştırma işlemi yapılarak toksinin
örneklerin tüm yüzeyleri ile teması sağlanmaya çalışılmıştır. Daha sonra karanlık ve
serin bir ortamda yaklaşık 2 saat boyunca toksinin örneklere homojen olarak nüfuz
etmesi için beklenilmiştir (Das ve Mishra 2000). Toksin konsantrasyonları ayarlanan
steril kırmızı biber, soya fasulyesi, fındık, incir, mısır ve siyah zeytin besi
ortamlarının kontrol örneği dışındakilerine F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun
durgun faz hücre süspansiyonundan yaklaşık 107 kob ml-1 hücre içerecek şekilde
aşılama yapılmış ve örneklere akışkanlık sağlayacak 1/1 oranında steril PFT çözeltisi
eklenmiştir. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve 2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu
işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı ayrı uygulanmıştır.
Erlenmayerler 30oC’deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm’de inkübasyona
alınmış ve inkübasyonun 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerinde aflatoksin analizi için
örnekler alınmış ve bölüm 3.2.6.2’ye göre aflatoksin analizine tabi tutulmuşlardır.
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
47
3.2.6. Aflatoksin Analizleri
3.2.6.1. Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak
Belirlenmesi
Gıda ürünlerinin denemelerde kullanılmadan önce AFB1 içeriklerinin kalitatif
olarak belirlenmesinde “alternatif metot” yöntemi ile ekstraktlar elde edilmiş
(Anonim, 1998) ve sonra İnce Tabaka Kromatografisi ile aflatoksin analizi
yapılmıştır (Takahashi, 1993; Lin ve ark., 1998). Analiz sonucunda, aflatoksin
içermeyen örnekler denemelerde kullanılmıştır.
3.2.6.2. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB1 Analizi
3.2.6.2.(1). AFB1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması
AFB1 kristaleri toluen-asetonitril (98:2, v/v) karışımında çözündürülerek stok
çözelti hazırlanmıştır. AFB1 kalibrasyon standartlarının konsantrasyonları 0.08 ng g-1
ile 4 ng g-1 arasında olacak şekilde hazırlanmıştır. Toluen-asetonitril çözeltileri oda
sıcaklığında azot gazı (N2) altında tamamen kurutulmuştur.
Her şişeye, 4 ml MeOH ilave edilerek karıştırılmış ve ultra saf su ile 10 ml’ye
seyreltilerek yeniden karıştırılmıştır. Çözeltiler; koruyucu giysi, eldiven ve gaz
maskesi kullanılarak çeker ocak altında hazırlanmıştır. Çalışma alanı ve aflatoksinle
temas eden cam malzemeler %5’lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile yıkanmıştır. Atık
çözeltiler ise çamaşır suyu içerisinde etkisiz hale getirilmiştir.
3.2.6.2.(2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması
900 ml ultra saf su içerisine 0.2 g potasyum klorit, 0.2 g potasyum dihidrojen
fosfat, 1.16 g susuz disodyum hidrojen fosfat ve 8 g sodyum klorit ilave edilerek
çözündürülmüştür. 0.1 M HCl veya 0.1 M NaOH kullanılarak pH 7.4’e ayarlanmış
ve ultra saf su ilavesi ile çözelti hacmi 1000 ml’ye tamamlanmıştır (AOAC, 2000).
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
48
3.2.6.2.(3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları
AFB1’in gıda örneklerinden ekstrakte edilmesinde ekstraksiyon çözeltisinin
su içeriği örneğin içerisinde bulunduğu fosfat tamponu miktarına göre yeniden
ayarlanarak AOAC (2000) yöntemi kullanılmıştır.
Temizleme aşaması immünoaffinite kolonlar için verilen talimatlara uygun
olarak gerçekleştirilmiştir. 5 ml PBS immünoaffinite kolonundan akış hızı dakikada
3 ml olacak şekilde geçirilmiştir. Kolon 10 ml’lik ultra saf su ile 2 kez yıkandıktan
sonra kalan su vakum ile uzaklaştırılmıştır. 1 ml metanol akış hızı dakikada 1 ml
olacak şekilde kolondan geçirilerek AFB1 kolondan uzaklaştırılmış ve amber renkli
bir şişede toplanmıştır. Kolondan 1 ml ultra saf su geçirilmiş ve aynı şişede
toplanmıştır. Eluat, direkt olarak HPLC’de analiz edilmiştir.
3.2.6.2.(4). AFB1’in Belirlenmesi
AFB1, AOAC 999.07 (2000) metodu kullanılarak belirlenmiştir. 100 µl örnek
HPLC’ye enjekte edilerek AFB1 düzeyi Hewlett Packard HPLC sistemi (Hewlett
Packard, Agilent 1100, Palo Alto, USA) kullanılarak tahrik dalga boyu 360 nm ve
emisyon dalga boyu ise 440 nm olacak şekilde floresans dedektör kullanılarak tespit
edilmiştir. Ayırım, Ace 5 C18 (25cm-4.6mm i.d.) (Advanced Chromatography
Technologies, Aberdeen, Scotland) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, 120
mg L-1 potasyum bromid ve 350 µl nitrik asit ilave edilen asetonitril-metanol-su
(2:3:6, v/v/v) karışımı olup ve akış hızı dakikada 1 ml’dir. Kolon sonrası
türevlendirme Kobra Cell (Rhone Diagnostics, Glasgow, UK) kullanılarak
gerçekleştirilmiştir.
Bazı örneklerin AFB1analizine ait HPLC kromatogramları EK-1’de
verilmiştir.
3.2.6.3. Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi
Geri kazanım oranının belirlenmesi için, analizi yapılmış ve aflatoksinsiz
olduğundan emin olunan gıda ürünleri parçalanarak 50’er gramlık analiz örnekleri
hazırlanmıştır. Öğütülen örneklerin üzerine 10 ve 50 ng g-1 aflatoksin olacak şekilde
AFB1 standardından ilave edilmiştir. Örneklere uygulanan ekstraksiyon ve temizleme
3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ
49
işlemleri aynen uygulanarak AFB1 içeriği HPLC kullanılarak belirlenmiş ve ilave
edilen aflatoksinin geri kazanım oranı hesaplanarak bulunmuştur.
3.2.7. İstatistiksel Analizler
Üç tekerrürlü olarak yürütülen araştırma bulguları SPSS (10.0) istatistik
yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktörlerin etkisini belirlemek
amacıyla varyans analizi uygulanmış ve önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar
Duncan çoklu karşılaştırma testi ile %95 önem düzeyinde belirlenmiştir.(Watts ve
ark., 1989)
3.2.8. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin
Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi
Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik eşitliklerinin gelişme verilerine
uyumu Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak doğrusal olmayan regresyon analizi
sonuçlarına göre belirlenmiştir.
3.2.9. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB1 Degradasyon Kinetiğinin
Belirlenmesi
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun AFB1’i değişik gıda maddelerinde
azaltma kinetiği Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak belirlenmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
50
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi
Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun TSB besiyerinde ve
30oC’deki gelişimine ait üreme eğrisinin elde edilmesinde yararlanılan kültürel sayım
sonuçları Çizelge 4.1’de verilmiştir.
Çizelge 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30oC’de TSB Besiyerindeki
Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları Süre (Saat) Sayım Sonucu
kob ml-1 Sayım Sonucu Log kob ml-1
0 1.32 x 107 7.12
5 1.60 x 107 7.20
10 4.50 x 107 7.65
15 8.00 x 107 7.90
20 1.40 x 108 8.15
25 3.70 x 108 8.57
30 6.00 x 108 8.78
35 8.50 x 108 8.93
40 1.92 x 109 9.28
45 4.30 x 109 9.63
50 4.45 x 109 9.65
55 4.90 x 109 9.69
70 7.20 x 109 9.86
75 8.40 x 109 9.92
85 4.75 x 109 9.68
90 4.75 x 109 9.68
95 4.70 x 109 9.67
Bir bakterinin gelişme eğrisi; lag (gecikme), log (logaritmik), durgun (sabit)
ve ölüm olmak üzere dört ana faz sergilemektedir. Bakterilerin gelişme eğrileri, üs
cinsinden üreme gösterdikleri dikkate alınarak, çoğunlukla üremenin (log N/No)
zamana karşı grafiğe geçilmesiyle elde edilmektedir (No: İnkübasyonun
başlangıcındaki canlı bakteri sayısı, N: İnkübasyonun belirli bir periyodundaki canlı
bakteri sayısı) (Şahin, 1990).
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
51
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme
eğrisi Şekil 4.1’de verilmiştir.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 20 40 60 80 100
Süre (Saat)
Log
(N/N
o)
Şekil 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme
eğrisi
4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel
Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi
Belirli fiziksel veya kimyasal koşullar altında mikroorganizmaların
gelişimlerinin tanımlanmasında matematiksel modellerden yararlanılmaktadır. Bu
modeller, ürünlerin mikrobiyal güvenliğinin veya raf ömrünün tahmin edilmesi ile
üretimin kritik kısımlarının ve prosesteki dağılımının tespitini mümkün kılmaktadır
(Zwietering ve ark., 1990; Giannuzzi ve ark., 1997). Simülasyon çalışmaları, pahalı
ve zaman alan deneylerin sayısında azalmaya neden olması nedeniyle proses tasarımı
ve optimizasyonunda oldukça yarar sağlamaktadır (Van Impe ve ark., 1992).
F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini tanımlamada
sigmoidal fonksiyonlardan “Modifiye Gompertz” ve “Modifiye Logistik”
modellerinden yararlanılmış ve elde edilen gelişme eğrileri Şekil 4.2’de verilmiştir.
Zwietering ve ark. (1990) tarafından tanımlanan 3 parametreli Modifiye
Gompertz ve Modifiye Logistik modellerine ait eşitlikler aşağıdaki gibidir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
52
Modifiye Gompertz Model; ( )
+−
⋅−= 1expexp t
Ae
Ay m λµ
( 4.1 )
Modifiye Logistik Model; ( )
+−+
=2
4exp1 t
A
Aym λ
µ ( 4.2 )
Gelişme eğrisi, popülasyon büyüklüğünün (y = LogNt /No) logaritmasının
zamana karşı bir fonksiyonu olarak tanımlanmaktadır. Gelişme eğrisinin lag, log ve
durgun fazı üç parametre ile açıklanmaktadır. Bunlar,
1. Maksimum spesifik gelişme hızı (µm): Bükülme noktasının tanjantı,
2. Lag süresi (λ): Bu tanjantın x eksenini kestiği nokta,
3. Asimptot (A): Ulaşılan en yüksek değer’dir (Zwietering ve ark.,1990).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Süre (Saat)
Log
(N/N
o)
Deneysel Gompertz Logistic
Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun “Modifiye Gompertz” ve “Modifiye
Logistik” modellerinden yararlanılarak elde edilen gelişme eğrileri
Bu eşitliklerin gelişme verilerine uyumunu belirlemede doğrusal olmayan
regresyon analizinden yararlanılmıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
53
Deneysel olarak elde edilen gelişme verilerini ifade etmede kullanılacak en
uygun modelin belirlenmesinde “tahminin standart hatası (SEE)”, “kalanların
kareleri toplamı (RSS)”, “hata kareler ortalaması (MSE)” ve “belirtme katsayısı
(R2)” değerlerinden yararlanılmıştır.
Çizelge 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre Hesaplanan Parametre Değerleri.
Model A µm
(saat-1) λ
(saat) SEE RSS MSE R2
Modifiye Gompertz 2.693 0.073 5.244 0.120 0.201 0.012 0.987
Modifiye Logistik 2.651 0.072 6.393 0.125 0.218 0.013 0.985
Çizelge 4.2’de, her iki modele ait A değeri ile maksimum spesifik gelişme
hızı değerlerinin benzer olduğu, lag süresinin ise Gompertz modelinde 5.244 saat,
Logistik modelinde ise 6.393 saat olduğu görülmektedir. Tahminin standart hatası,
kalanların kareleri toplamı ile hata kareler ortalaması değerlerinin en küçük ve
belirtme katsayısı en büyük olan modelin deneysel verileri daha iyi ifade ettiği göz
önüne alındığında F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini
tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna
varılmıştır.
Modifiye Gompertz modelinden elde edilen sonuçlara göre, başlangıç hücre
sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bir saatlik
periyotlar içerisinde bir önceki popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek
45 saatte 2.7 log’luk bir artışla durgun faza geçmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin 95. saat sonunda hala durgun fazda oldukları belirlenmiştir. Hao ve
Brackett (1989) tarafından yapılan çalışmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun
aynı besiyeri ve koşullardaki inkübasyonu sonucunda da benzer bir üreme eğrisi elde
edilmiştir. Araştırıcılar, durgun faza 36. saatten sonra geçildiğini ve ölçümün
sonlandırıldığı 72. saatte de durgun fazda olduğunu ifade etmişlerdir. Aynı bakteri
suşu ile çalışılan başka bir araştırmada ise maksimum spesifik gelişme hızı 0.085
saat-1 olarak bulunmuş ve 45-50 saatlik bir sürede 2 log’luk bir artış göstererek
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
54
durgun faza ulaşıldığı belirtilmiştir. Ayrıca çalışmada lag süresinin güvenli olarak
tespit edilemediği bildirilmiştir.
4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun
Belirlenmesi
Mikrobiyolojide spektrofotometrik sayım yöntemi, direkt sayım yöntemleri
arasında yer almakta ve bu yöntemden özellikle saf mikroorganizma kültürlerinin
konsantrasyonu hakkında hızlı bilgi edinebilmek amacıyla yararlanılmaktadır
(Temiz, 1994).
Bu çalışmada, denemelerde kullanılacak olan bakteri süspansiyonunun hücre
yoğunluğunu hesaplayabilmek amacıyla değişik oranlarda seyreltilmiş olan F.
aurantiacum NRRL B-184 hücre süspansiyonlarının hem spektrofotometrede
absorbansları ölçülmüş, hem de bu seyreltilerden kültürel sayımlar yapılmıştır. Farklı
oranlarda seyreltilmiş olan tampon çözelti içerisindeki F. aurantiacum NRRL B-184
hücre süspansiyonlarına ait absorbans değerleri ve kültürel sayım sonuçları Çizelge
4.3’de verilmiştir.
Çizelge 4.3. Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Süspansiyonunun 540 nm’deki Absorbans Değerleri ve İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı.
Seyreltme Oranı Absorbans Bakteri Sayısı (kob ml-1)
4/5 0.425 5.40x 107
3/5 0.327 4.80 x 107
2/5 0.267 3.76 x 107
1/5 0.148 1.91 x 107
1/10 0.060 1.16x 107
Çizelge 4.3’de verilmiş olan absorbans değerleri ve canlı hücre sayısı
arasındaki ilişki Şekil 4.3’de görülmektedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
55
y = 1E+08x + 3E+06R2 = 0,978
0,0E+00
1,0E+07
2,0E+07
3,0E+07
4,0E+07
5,0E+07
6,0E+07
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450
Absorbans
kob/
ml
Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu seyreltilerine ait
absorbans değerleri (540 nm’de) ile canlı hücre sayısı arasındaki ilişki
Çizelge 4.3 ve Şekil 4.3’de görüldüğü gibi, 540 nm’deki absorbans değeri ile
canlı hücre arasındaki ilişkiye ait R2 değeri yüksek (0.978) bulunmuştur. Bu nedenle,
denemelerde kullanılmak üzere hazırlanan bakteri süspansiyonlarının hücre
konsantrasyonu elde edilen;
68 10310 ×+= χy ( 4.3 )
regresyon denklemine göre hesaplanmıştır.
4.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi
500, 1000 ve 2000 ng ml-1 düzeylerinde aflatoksin içeren PFT çözeltilerinde;
bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanmış diğer
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
56
örneklerin 0-72. saatler arasındaki AFB1 konsantrasyonlarındaki değişim
Çizelge 4.4’de verilmiştir.
Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184 Hücresi
İçeren Diğer Örneklerde) AFB1 Konsantrasyonlarındaki (ng ml-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Süre (Saat)
500 1000 2000
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
0 502.56 509.80 0.00 1013.30 997.80 0.00 2008.20 2012.40 0.00
2 495.00 401.00 21.34 996.40 800.00 19.82 1995.50 1800.00 10.55
4 490.00 300.00 41.15 990.30 650.00 34.86 1990.70 1377.00 31.57
6 498.50 268.00 47.43 998.50 561.00 43.78 1998.80 1246.00 38.08
8 487.10 239.00 53.12 987.10 500.00 49.89 1987.30 929.00 53.84
12 489.60 173.57 65.95 990.60 345.00 65.42 1990.10 658.59 67.27
24 478.40 64.00 87.45 978.40 157.00 84.27 1978.60 267.00 86.73
36 495.90 31.73 93.78 996.90 69.54 93.03 1996.70 115.00 94.29
48 488.70 15.00 97.06 988.70 34.00 96.59 1988.00 73.00 96.37
72 493.20 2.37 99.53 993.20 5.90 99.41 1993.80 10.11 99.50
Çizelge 4.4’de görüldüğü gibi, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu
aşılanmamış üç farklı konsantrasyonda AFB1 içeren kontrol örneklerinin inkübasyon
süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim olmazken, F. aurantiacum
NRRL B-184 suşu aşılanmış olan PFT çözeltilerinin aflatoksin içeriğinde sürekli bir
azalma gerçekleşmiştir. Kontrol grubu dışındaki bütün örneklerin AFB1 içeriklerinde
8. saat sonunda %49.89-53.84’lük, 36. saat sonunda %93.03-94.29’luk ve 72. saatin
sonunda ise %99’dan fazla azalma meydana gelmiştir.
F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin PFT çözeltisi içinde AFB1
miktarını azaltması üzerine aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin
etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05).
AFB1’in ortamdaki F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerine ait enzim veya
enzim komplekslerinin substratı olduğu düşünüldüğünde, araştırmadan elde edilen
bulgulara göre toksin miktarının enzimler için doygunluk düzeyine ulaşmadığını
söylemek mümkündür. Bu durum yüksek toksin düzeylerinde neden daha çok
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
57
toksinin degrade olduğunu açıklar niteliktedir. Buna göre, ortama bakterilerin
aşılandığı ilk anda toksin en yüksek düzeyde olduğu için en fazla parçalanma ilk
zaman dilimlerinde olmuştur. Daha sonraki zaman dilimlerinde ise ortamda daha az
toksin kaldığından ve degradasyon da o anda var olan toksin konsantrasyonu ile
orantılı olduğundan daha az azalma meydana gelmektedir.
4.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini
Azaltmasının Kinetiği
F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB1 içeriğinde
önemli bir değişimin görülmemesi, bakteri hücrelerini içeren PFT ortamında oluşan
aflatoksin azalmasının F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu
meydana geldiğini göstermektedir. Aflatoksinin, canlı F. aurantiacum NRRL B-184
hücreleri tarafından hücre duvarına zayıf bağlarla bağlanıp daha sonra da
biyotransformasyon için hücre içine taşındığı ya da hücre duvarına bağlanmadan
doğrudan hücre içine aktarıldığı konusunda tartışmalar mevcuttur (Özkaya, 2001).
Bu bakteri ile yapılan sınırlı sayıdaki çalışmada aflatoksin degradasyonu
üzerine enzim veya enzim sistemlerinin etkili olabileceği ileri sürülmüştür. İleri
sürülen düşünceye göre; aflatoksin, bu enzim ya da enzim sistemleri tarafından
substrat olarak kullanmaktadır (D’souza ve Brackett, 1998; D’souza ve Brackett,
2000; Smiley and Draugon, 2000; D’souza ve Brackett, 2001).
Enzimatik reaksiyonlar doygunluk kinetiği gösteren reaksiyonlardır. Diğer bir
ifadeyle, bu reaksiyonların hızları belli bir düzeye kadar substrat konsantrasyonu ile
birlikte artar, ancak daha yüksek konsantrasyonlarda reaksiyon hızları daha fazla
artmayarak bir doygunluğa ulaşır ve hız sabit kalır.
Enzimatik reaksiyonlar genel olarak Michealis-Menten denkliği olarak anılan
aşağıdaki eşitliğe uygun olarak gerçekleşir.
[ ][ ]SKSV
Vm +
= max ( 4.4 )
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
58
Bu eşitlikte V reaksiyon hızını, [S] ise substrat konsantrasyonunu ifade
etmektedir. Michealis-Menten sabiti olarak tanımlanan Km ve maksimum reaksiyon
hızı olan Vmax reaksiyon koşularında sabit değerlerdir.
Bu eşitlik [S]’nin paydada Km’nin yanında ihmal edilmesine imkan verecek
kadar düşük değerleri için;
[ ]SK
VV
m
×
= max ( 4.5 )
şeklinde yaklaşır ve reaksiyon hızının substrat konsantrasyonuna bağlı olarak arttığı
birinci derece kinetiğine uygun hareket eder. Bu küçük değerlerde substrat miktarı ile
enzim hızı arasında doğrusal bir ilişki vardır ve substrat konsantrasyonundaki
artışlar, hızda orantısal artışlara neden olur.
Buna karşılık; eşitlik substrat konsantrasyonunun paydada Km’nin ihmal
edilmesine imkan verecek kadar büyük değerleri için;
maxVV = ( 4.6 )
olarak sabit bir değerde kalarak sıfırıncı dereceden reaksiyon kinetiğine benzerlik
gösterir (Gözükara, 1997; Kalaycıoğlu ve ark., 1998).
Farklı reaksiyon derecelerini tanımlayan çeşitli matematiksel modellerin
tümünün temelini “genel hız yasası” oluşturmaktadır. Bu yasaya göre, bir reaksiyon
sonucu ortamdaki bir bileşiğin miktarının azalması aşağıdaki eşitlikle 4.7
tanımlanmaktadır.
nnCk
dtdCV =−= ( 4.7 )
Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin
konsantrasyonunun sıfırıncı kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara “sıfırıncı
dereceden reaksiyon” denilmektedir. 4.7 no’lu diferansiyel eşitliğin sıfırıncı derece
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
59
reaksiyon için integrali alınırsa, zamana göre sıfırıncı derece reaksiyonu tanımlayan
4.8 no’lu eşitlik elde edilmektedir.
tkCC to .=− ( 4.8 )
Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin
konsantrasyonunun birinci kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara “birinci dereceden
reaksiyon” denilmektedir. 4.8 no’lu diferansiyel eşitliğin birinci derece reaksiyon
için integrali alınırsa, zamana göre birinci derece reaksiyonu tanımlayan 4.9 no’lu
eşitlik elde edilmektedir.
tkCC to .lnln =− veya ( ) tkCC tO .ln = ( 4.9 )
Bu eşitliklerde Co başlangıç AFB1 konsantrasyonunu, Ct belli bir süre
sonunda AFB1 konsantrasyonunu, k reaksiyon hız sabitini, t ise süreyi ifade
etmektedir (Tebbutt,1995).
AFB1 konsantrasyonunun zamana karşı değişimini değerlendirmede “en
küçük kareler yöntemine” dayanan regresyon analizinden yararlanılmıştır. Verilerin
doğrusal bir eğriye ne kadar iyi uyduğunun ölçütü, regresyon işlemi ile hesaplanmış
olan “belirtme katsayısı” yani R2 değeridir. R2 değerinin 1’e eşit olması, deneysel
verilerin kusursuz bir doğrusal eğri sağladığının kanıtıdır.
Her iki regresyon analizinde de, başlangıç konsantrasyonu (Co), hız sabiti (k),
k’nın güven aralığı, regresyonun önem aralığını gösteren F değeri ve verilerin
modele uygunluğunu gösteren R2 değeri hesaplanmış olup, sonuçlar Çizelge 4.5’te
verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
60
Çizelge 4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları.
Konsantrasyon
(ng ml-1)
Reaksiyon
Derecesi
C0
(ng ml-1) k*
k için güven
aralığı F Değeri** R2 Değeri***
500 Sıfırıncı 329.893 6.106 7.520-4.746 18.642 0.700
Birinci 6.188 0.093 0.099-0.033 826.944 0.990
1000 Sıfırıncı 673.696 12.343 15.017-9.669 21.309 0.727
Birinci 6.869 0.085 0.089-0.081 1711.361 0.995
2000 Sıfırıncı 1399.511 25.977 31.940-20.014 18.979 0.704
Birinci 7.625 0.091 0.097-0.085 1572.392 0.995 * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng ml-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade
etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
61
Deneysel olarak elde edilen verilerin modele uygunluğunu gösteren R2 değeri
sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modelinde AFB1’in her üç konsansantrasyonu için
oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2
değerleri 0.990-0.995 arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını
gösteren F değeri, birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan
değerlendirmede daha yüksek bulunmuştur.
Şekil 4.4, 4.5 ve 4.6’da 500, 1000 ve 2000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT
ortamlarında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri görülmektedir.
y = 486,853e-0,093x
R2 = 0,990
y = -6,106x + 329,893R2 = 0,700
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g m
l-1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.4. 500 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
62
y = 961,820e-0,085x
R2 = 0,995
y = -12,343x + 673,696R2 = 0,727
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g m
l-1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.5. 1000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 2049,465e-0,091x
R2 = 0,995
y = -25,977x + 1399,511R2 = 0,704
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 20 40 60 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g m
l-1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.6. 2000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
63
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunmasının yanısıra şekil 4.4, 4.5 ve 4.6’daki kinetik modellere ait azalış
eğrilerinden de görüldüğü üzere; PFT ortamında F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin neden olduğu AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha
uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
Line ve Brackett (1995a) bir çalışmalarında, radyoaktivite ile izledikleri suda
çözünebilir degradasyon ürünlerinin artış hızı ve oranı ile, kloroform fazında
çözünenlerin azalma hızı ve oranının hemen hemen aynı olduğunu ve azalışı tipik
“Birinci Derece Reaksiyon” kinetiğine uygun bulduklarını belirtmişlerdir. Özkaya
(2001)’da PFT içerisinde 8.4x109 ile 6.6x1012 kob ml-1 bakteri içeren denemelerinde
aflatoksin miktarındaki azalışın “Birinci Derece Reaksiyon” kinetiğine uygun
olduğunu bildirmiştir.
Birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k”
değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede
istatistiksel olarak güvenli bulunmuş (p<0.05) ve 500, 1000 ve 2000 ng ml-1 AFB1 ile
yapılan denemelerde sırasıyla 0.093, 0.085 ve 0.091 saat-1 olarak hesaplanmıştır.
4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren
PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının
Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.1.1. AFB1’in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları
AFB1’in standart eğrisinin belirtme katsayısı 0.9998 olarak bulunmuştur.
Örnekler yapay olarak AFB1 ile iki farklı konsantrasyonda (10 ve 50 ng g-1)
kontamine edilmiştir. Ortalama geri kazanım (n=12) oranları kuru kırmızı biber için
%87±4.33, mısır için %92±3.52, siyah zeytin için %93±3.66, soya fasulyesi için
%90±3.26 ve fındık için %95±4.12 olarak hesaplanmıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
64
4.5.1.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı Biberde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi
Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile F. aurantiacum NRRL B-
184 suşu aşılanan öğütülmüş ve bütün halde kırmızı biber içeren PFT çözeltilerine
500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin
inkübasyon sırasındaki değişimi ve azalma oranları Çizelge 4.6’da verilmiştir.
İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde istatistiksel olarak
önemli bir değişim olmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan
gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin
içeriklerinde ise sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu
dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak
azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş kırmızı biber
örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %99.17, %98.65 ve %96.52 düzeylerinde
azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %96.78,
%95.99 ve %95.00 oranında azalma gerçekleşmiştir.
Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum
NRRL B-184 hücrelerinin kırmızı biberde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi
istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli
bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak
etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi
istatistiksel açıdan önemsizdir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
65
Çizelge 4.6. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün
Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon
(ng g-1)
Süre
(Saat)
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 447.45 435.11 0.00 453.60 440.53 0.00
6 452.21 358.08 17.70 468.12 398.25 9.60
12 435.54 209.36 51.88 442.52 259.11 41.18
24 424.67 82.44 81.05 439.76 168.34 61.79
36 448.02 39.23 90.98 454.67 93.41 78.80
48 452.71 21.42 95.08 461.10 43.04 90.23
72 441.80 3.62 99.17 460.00 14.18 96.78
1000
0 923.40 870.22 0.00 949.80 881.78 0.00
6 914.60 796.12 8.52 902.50 817.88 7.25
12 890.30 469.28 46.07 915.34 512.11 41.92
24 896.45 290.37 66.63 894.12 352.02 60.08
36 873.12 101.39 88.35 871.30 177.33 79.89
48 906.87 53.40 93.86 894.50 112.44 87.25
72 893.60 11.79 98.65 886.50 35.37 95.99
2000
0 1823.54 1740.36 0.00 1816.43 1752.36 0.00
6 1891.34 1622.20 6.79 1795.45 1634.36 6.73
12 1787.45 983.23 43.50 1792.01 1226.80 29.99
24 1874.07 658.39 62.17 1804.23 752.40 57.06
36 1873.21 348.27 79.99 1827.34 456.34 73.96
48 1836.87 193.22 88.90 1814.50 239.41 86.34
72 1833.60 60.54 96.52 1792.78 87.59 95.00
F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, kırmızı biberlerin AFB1 içeriklerini
azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Benzer bulgular, F. aurantiacum
NRRL B-184’ün kırmızı biberdeki aflatoksini azaltma yeteneği üzerine Özkaya
(2001)’nın çalışmasında da mevcuttur. Araştırmacı, yaklaşık 300, 500 ve 1500 ng g-1
doğal AFB1 içeren steril bulamaç halindeki kırmızı biber örneklerinde 48 saat
sonunda sırasıyla %92.8, %99.9 ve %98.3’lük bir azalma meydana geldiğini ifade
etmiştir. Bu çalışmada elde edilen azalma oranlarının Özkaya (2001)’nın yapmış
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
66
olduğu çalışmadan elde edilen oranlardan daha düşük bulunmasına örneğe aşılanan
F. aurantiacum NRRL B-184 hücre sayılarındaki farklılığın neden olabileceği
düşünülmektedir.
4.5.1.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde Aflatoksini
Azaltmasının Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki kırmızı biberlerde AFB1’in azalma kinetiğini
inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizlerinde,
Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2 değerleri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge
4.7’de verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
67
Çizelge 4.7. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı Biberde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları.
Ürün Konsantrasyon
(ng g-1)
Reaksiyon
Derecesi
C0
(ng g-1) k*
k için güven
aralığı F Değeri** R2 Değeri***
Öğü
tülm
üş
500 Sıfırıncı 330.524 5.881 7.397-4.365 15.054 0.751
Birinci 6.124 0.062 0.068-0.056 305.595 0.984
1000 Sıfırıncı 721.431 12.411 15.095-9.727 21.389 0.811
Birinci 6.835 0.051 0.058-0.044 177.281 0.973
2000 Sıfırıncı 1483.513 24.133 28.852-19.414 26.157 0.840
Birinci 7.517 0.044 0.049-0.039 200.812 0.976
Büt
ün
500 Sıfırıncı 375.366 6.115 7.238-4.992 29.638 0.856
Birinci 6.137 0.044 0.048-0.040 306.735 0.984
1000 Sıfırıncı 756.539 12.156 14.449-9.863 28.092 0.849
Birinci 6.834 0.043 0.048-0.038 224.827 0.978
2000 Sıfırıncı 1575.835 24.655 28.491-20.819 41.312 0.892
Birinci 7.533 0.038 0.041-0.035 314.040 0.984
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
68
Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda
AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün kırmızı biberlere ait R2 değerleri oldukça düşük
bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2 değerleri öğütülmüş
kırmızı biberlerde 0.973-0.984, bütün haldeki biberlerde ise 0.978-0.984 arasında
değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece
reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.
Şekil 4.7, 4.8, 4.9’da öğütülmüş, Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12’de ise bütün kırmızı
biberlerdeki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
görülmektedir.
y = 456,821e-0,062x
R2 = 0,984
y = -5,881x + 330,524R2 = 0,751
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.7. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
69
y = 929,393e-0,051x
R2 = 0,973
y = -12,411x + 721,431R2 = 0,811
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.8. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1839,425e-0,044x
R2 = 0,976
y = -24,133x + 1483,513R2 = 0,840
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.9. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
70
y = 462,734e-0,044x
R2 = 0,984
y = -6,115x + 375,366R2 = 0,856
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.10. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 929,242e-0,043x
R2 = 0,978
y = -12,156x + 756,539R2 = 0,849
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.11. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
71
y = 1869,142e-0,038x
R2 = 0,984
y = -24,655x + 1575,835R2 = 0,892
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.12. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre R2 ve F değerleri daha
yüksek bulunmuş olup şekillerdeki (Şekil 4.7, 4.8, 4.9, 4.10, 4.11 ve 4.12) kinetik
modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere, kırmızı biber ortamında izlenen
F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından AFB1 azalışının birinci derece
reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
“k” değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan
değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g-1
AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biber kullanılan ortamlar için sırasıyla 0.062, 0.051
ve 0.044 saat-1; bütün kırmızı biber kullanılan ortamlar için ise 0.044, 0.043 ve 0.038
saat-1 olarak hesaplanmıştır.
72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş
kırmızı biber örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite
ulaşılmıştır. Bu süre sonunda, 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı
biberler ile 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin
içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi Gazete,
2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
72
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kırmızı
biberlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan
süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.8’de verilmiştir.
Çizelge 4.8. Kırmızı Biberlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul
Edilebilir
ng g-1
Süre (Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin)
1000 ng g-1
AFB1 İçin)
2000 ng g-1
AFB1 İçin)
Öğü
tülm
üş K
ırmız
ı
Bib
er
k=0.062 k=0.051 k=0.044
İnsan
Tüketimi İçin
2 87,60 120,42 155,09
5 72,82 102,45 134,27
Hayvan Yemi İçin
5 72,82 102,45 134,27
10 61,64 88,86 118,51
20 50,46 75,27 102,76
Büt
ün K
ırmız
ı Bib
er k=0.044 k=0.043 k=0.038
İnsan
Tüketimi İçin
2 123,73 142,81 180,00
5 102,90 121,50 155,88
Hayvan Yemi
İçin
5 102,90 121,50 155,88
10 87,15 105,38 137,64
20 71,40 89,26 119,40
Çizelge 4.8’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren kırmızı
biberde aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş
kırmızı biberlerde 87.60 ile 155.09 saat; bütün kırmızı biber örneklerinde ise 123.73
ile 180.00 saat arasında değişmektedir.
Kırmızı biberlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan
inkübasyon sürelerinin 50.46 ile 155.88 saat arasında olacağı hesaplanmıştır
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
73
4.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi
Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan
öğütülmüş ve bütün halde mısır içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1
düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki
değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.9’da verilmiştir.
İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde önemli bir
değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek
öğütülmüş gerekse bütün haldeki mısır örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir
azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma,
başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng
g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş mısır örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %97.44,
%96.09 ve %95.96 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan
örneklerde ise sırasıyla %95.25, %94.01 ve 94.15 oranında azalma gerçekleşmiştir.
Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum
NRRL B-184 hücrelerinin mısırda AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi
istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli
bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak
etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi
istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
74
Çizelge 4.9. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon
(ng g-1)
Süre
(Saat)
Uygulama
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 498.03 460.34 0.00 504.61 468.90 0.00
6 470.43 363.64 21.01 489.12 391.25 16.56
12 481.87 242.87 47.24 471.62 284.03 39.43
24 502.15 138.33 69.95 465.91 168.69 64.02
36 493.38 76.98 83.28 474.43 102.04 78.24
48 467.21 45.80 90.05 484.03 59.02 87.41
72 485.04 11.80 97.44 491.54 22.26 95.25
1000
0 917.67 920.30 0.00 935.67 925.52 0.00
6 945.29 736.08 20.02 912.32 783.70 15.32
12 915.98 463.60 49.63 937.82 522.99 43.49
24 947.56 278.46 69.74 948.04 326.60 64.71
36 938.04 150.55 83.64 917.23 185.92 79.91
48 972.19 87.83 90.46 928.19 126.54 86.33
72 928.39 36.02 96.09 948.61 55.41 94.01
2000
0 1914.28 1840.41 0.00 1895.78 1853.00 0.00
6 1894.24 1614.87 12.25 1917.46 1699.98 8.26
12 1828.78 1031.09 43.97 1873.05 1234.13 33.40
24 1882.37 678.82 63.12 1848.41 761.23 58.92
36 1872.04 318.40 82.70 1819.72 393.91 78.74
48 1903.03 195.85 89.36 1857.06 253.16 86.34
72 1893.36 74.34 95.96 1861.93 108.44 94.15
F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, mısır örneklerinin AFB1
içeriklerini azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark. (1966)’da
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun mısırdaki aflatoksinin uzaklaştırılmasında
etkili olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar, toksijenik bir A. flavus suşu geliştireerek
aflatoksin oluşumu sağlanan mısırda 1013 kob ml-1 canlı F. aurantiacum
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
75
NRRL B-184 hücresi ile 28oC’de 12 saatlik inkübasyon sonunda 16 ng g-1
düzeyindeki AFB1’in %100 oranında ortamdan uzaklaştığını belirtmişlerdir.
4.5.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini
Azaltmasının Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki mısırda AFB1’in azalmasıyla ilgili kinetiği
inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri
sonucunda elde edilen sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiğine ait regresyon
verileri (Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2) Çizelge 4.10’da verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
76
Çizelge 4.10. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları
Ürün Konsantrasyon
(ng g-1) Reaksiyon
Derecesi C0
(ng g-1) k*
k için güven aralığı
F Değeri** R2 Değeri*** Ö
ğütü
lmüş
500 Sıfırıncı 361.281 6.006 7.279-4.733 22.274 0.817
Birinci 6.146 0.050 0.052-0.050 1565.949 0.997
1000 Sıfırıncı 717.229 11.857 14.508-9.206 20.003 0.800
Birinci 6.839 0.051 0.054-0.048 751.977 0.993
2000 Sıfırıncı 1526.917 24.922 29.899-19.945 25.081 0.834
Birinci 7.557 0.046 0.050-0.042 352.451 0.986
Büt
ün
500 Sıfırıncı 388.989 6.196 7.333-5.059 29.711 0.856
Birinci 6.173 0.043 0.045-0.041 1611.221 0.997
1000 Sıfırıncı 757.074 11.984 14.402-9.566 24.555 0.831
Birinci 6.852 0.044 0.047-0.041 630.023 0.992
2000 Sıfırıncı 1624.955 25.610 30.096-21.124 32.595 0.867
Birinci 7.583 0.040 0.043-0.037 340.862 0.986
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
77
Üç farklı konsantrasyonda AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün haldeki
mısırların; sıfırıncı derece reaksiyon kinetiğine göre yapılan regresyon analizi sonucu
elde edilen R2 ve F değerleri, birinci derece reaksiyon kinetiğine göre daha düşük
bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiğine göre; hem öğütülmüş hem de bütün
haldeki mısırların R2 değerleri 0.986-0.997 arasında değişmiştir.
Şekil 4.13, 4.14, 4.15’de öğütülmüş mısırda, Şekil 4.16, 4.17 ve 4.18’de ise
bütün mısırdaki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış
eğrileri görülmektedir.
y = 466,640e-0,050x
R2 = 0,997
y = -6,006x + 361,281R2 = 0,817
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.13. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
78
y = 933,641e-0,051x
R2 = 0,993
y = -11,857x + 717,229R2 = 0,800
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.14. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1915,026e-0,046x
R2 = 0,986
y = -24,922x + 1526,917R2 = 0,834
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.15. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
79
y = 479,777e-0,043x
R2 = 0,997
y = -6,196x + 388,989R2 = 0,856
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.16. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 945,673e-0,044x
R2 = 0,992
y = -11,984x + 757,074R2 = 0,831
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.17. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
80
y = 1963,647e-0,040x
R2 = 0,986
y = -25,610x + 1624,955R2 = 0,867
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.18. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından mısır ortamındaki
AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna
varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 ve 4.18) kinetik modellere
ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon
kinetiğine uyumu daha net görülebilmektedir.
500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısır kullanılan ortamlarda
“k”değeri sırasıyla 0.050, 0.051 ve 0.046 saat-1; bütün mısırlarda ise 0.043, 0.044 ve
0.040 saat-1 olarak hesaplanmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre
yapılan değerlendirmede çalışılan tüm mısır örneklerine ait “k” değerleri istatistiksel
olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur.
Denemeye alınan mısır örneklerinin AFB1 düzeyleri, 72 saatlik inkübasyon
sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen sınır
değere ulaşamamıştır. Bu süre sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısır
örneklerninin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de
(Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
81
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda
mısırların AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan
süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.11’de verilmiştir.
Çizelge 4.11. Mısır Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin
Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul Edilebilir
Limit
(ng g-1)
Süre (Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin
1000 ng g-1
AFB1 İçin
2000 ng g-1
AFB1 İçin
Öğü
tülm
üş M
ısır
k=0.050 k=0.051 k=0.046
İnsan Tüketimi İçin
2 109,06 120,51 149,21
5 90,73 102,54 129,29
Hayvan Yemi
İçin
5 90,73 102,54 129,29
10 76,87 88,95 114,23
20 63,01 75,36 99,16
Büt
ün M
ısır
k=0.043 k=0.044 k=0.040
İnsan
Tüketimi İçin
2 127,44 139,97 172,25
5 106,13 119,15 149,34
Hayvan Yemi
İçin
5 106,13 119,15 149,34
10 90,01 103,40 132,01
20 73,89 87,64 114,68
Çizelge 4.11’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren
mısırların aflatoksin içeriklerinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş
mısırlarda 109.06 ile 149.21 saat; bütün mısır örneklerinde ise 127.44 ile 172.25 saat
arasında değişmektedir.
Mısırların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon
sürelerinin 63.01 ile 149.34 saat arasında olacağı belirlenmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
82
4.5.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.3.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi
Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan
öğütülmüş ve bütün halde siyah zeytin içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng
g-1 düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki
değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.12’de verilmiştir.
Kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir
değişim görülmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek
öğütülmüş gerekse bütün haldeki zeytin örneklerinin toksin içeriklerinde ise sürekli
bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma
oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000
ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş zeytin örneklerinde 72. saat sonunda
sırasıyla %98.69, %98.14 ve %99.14 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak
denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %98.06, %95.63 ve %96.01 oranında
azalma gerçekleşmiştir.
AFB1 miktarının azalması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ile inkübasyon
süresinin etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun
etkisi önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi toksin
miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve süre-boyut
ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
83
Çizelge 4.12. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon
(ng g-1)
Süre
(Saat)
Uygulama
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 478.41 465.08 0.00 484.21 471.66 0.00
6 458.02 377.33 18.87 472.33 391.77 16.94
12 463.91 218.10 53.10 477.38 228.08 51.64
24 492.52 123.11 73.53 489.81 124.17 73.67
36 471.21 73.97 84.10 463.06 88.68 81.20
48 482.04 32.16 93.09 491.54 40.79 91.35
72 457.22 6.08 98.69 472.08 9.13 98.06
1000
0 938.76 930.25 0.00 956.81 937.82 0.00
6 945.92 771.51 17.06 961.42 791.62 15.59
12 921.51 437.19 53.00 928.19 451.53 51.85
24 942.89 270.61 70.91 951.21 308.54 67.10
36 967.31 184.87 80.13 948.03 206.50 77.98
48 929.58 71.69 92.29 939.12 106.06 88.69
72 928.54 17.31 98.14 943.05 41.02 95.63
2000
0 1893.89 1860.37 0.00 1954.17 1874.55 0.00
6 1867.42 1569.97 15.61 1871.37 1607.26 14.26
12 1902.03 911.61 51.00 1909.21 966.14 48.46
24 1851.34 558.44 69.98 1894.87 630.03 66.39
36 1866.47 356.63 80.83 1890.07 473.78 74.73
48 1913.21 144.94 92.21 1882.19 197.42 89.47
72 1873.67 15.97 99.14 1902.03 74.84 96.01
Zeytin üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu
göstermektedir. Zeytinle ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi bir
karşılaştırma yapmak mümkün olmamıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
84
4.5.3.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini
Azaltma Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki siyah zeytinlerde AFB1’in azalma kinetiğinin
sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek için
regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen Co, k, k’nın
güven aralığı, F ve R2 değeri Çizelge 4.13’te verilmiştir.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda
AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün zeytinlere ait R2 değerleri, sıfırıncı derece reaksiyon
kinetiği verilerine göre daha yüksek bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon
kinetiğinde R2 değerlerinin öğütülmüş zeytinlerde 0.983-0.988, bütün haldeki
zeytinlerde ise 0.979-0.985 arasında değiştiği görülmüştür. Regresyonun
tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelinin deneysel verilere
uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci derece reaksiyon
kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.
Şekil 4.19, 4.20, 4.21’de öğütülmüş zeytinlerde, Şekil 4.22, 4.23 ve 4.24’te
ise bütün haldeki zeytinlerde AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere
göre azalış eğrileri görülmektedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
85
Çizelge 4.13. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları
Ürün Konsantrasyon
(ng g-1) Reaksiyon
Derecesi C0
(ng g-1) k*
k için güven aralığı
F Değeri** R2 Değeri*** Ö
ğütü
lmüş
500 Sıfırıncı 358.687 6.136 7.556-4.716 18.668 0.788
Birinci 6.157 0.055 0.060-0.050 417.345 0.988
1000 Sıfırıncı 729.359 12.233 14.959-9.507 20.134 0.801
Birinci 6.856 0.052 0.057-0.047 280.007 0.983
2000 Sıfırıncı 1481.542 25.015 30.341-19.689 22.060 0.815
Birinci 7.557 0.051 0.056-0.046 305.130 0.984
Büt
ün
500 Sıfırıncı 368.890 6.202 7.618-4.786 19.194 0.793
Birinci 6.182 0.053 0.058-0.048 319.965 0.985
1000 Sıfırıncı 746.262 12.024 14.657-9.391 20.857 0.807
Birinci 6.857 0.047 0.052-0.042 233.356 0.979
2000 Sıfırıncı 1524.586 24.485 29.469-19.501 24.138 0.828
Birinci 7.555 0.045 0.050-0.040 253.578 0.981
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
86
y = 476,678e-0,055x
R2 = 0,988
y = -6,136x + 358,687R2 = 0,788
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.19. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 949,854e-0,052x
R2 = 0,983
y = -12,233x + 729,359R2 = 0,801
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.20. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
87
y = 1913,998e-0,051x
R2 = 0,984
y = -25,015x + 1481,542R2 = 0,815
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.21. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 484,068e-0,053x
R2 = 0,985
y = -6,202x + 368,890R2 = 0,793
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.22. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
88
y = 950,532e-0,047x
R2 = 0,979
y = -12,024x + 746,262R2 = 0,807
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.23. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1909,609e-0,045x
R2 = 0,981
y = -24,485x + 1524,586R2 = 0,828
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.24. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
89
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.19, 4.20, 4.21, 4.22, 4.23 ve 4.24) kinetik
modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere zeytin örneklerinde AFB1
azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna
varılmıştır.
“k” değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan
değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur. 500, 1000 ve
2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş zeytin ortamında toksinin azalma hızı sırasıyla
0.055, 0.052 ve 0.051 saat-1; bütün haldeki zeytinlerde ise 0.053, 0.047 ve 0.045
saat-1 olarak hesaplanmıştır.
Denemeye alınan zeytin örneklerinin AFB1 düzeyleri 72 saatlik inkübasyon
sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen düzeye
ulaşmadığı belirlenmiştir. Bu süre sonunda, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün
haldeki zeytinler haricindeki diğer örneklerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen
Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen
sınırlara ulaşmıştır.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda
zeytinlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan
süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.14’de verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
90
Çizelge 4.14. Siyah Zeytin Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir
Limitlerin Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul
Edilebilir
Limit (ng g-1)
Süre (Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin
1000 ng g-1
AFB1 İçin
2000 ng g-1
AFB1 İçin
Öğü
tülm
üş Z
eytin
k=0.055 k=0.052 k=0.051
İnsan
Tüketimi İçin
2 99,34 118,52 134,59
5 82,68 100,90 116,62
Hayvan Yemi
İçin
5 82,68 100,90 116,62
10 70,08 87,57 103,03
20 57,48 74,24 89,44
Büt
ün Z
eytin
k=0.053 k=0.047 k=0.045
İnsan Tüketimi İçin
2 103,56 131,15 152,49
5 86,27 111,65 132,12
Hayvan Yemi
İçin
5 86,27 111,65 132,12
10 73,20 96,90 116,72
20 60,12 82,15 101,32
Çizelge 4.14’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren siyah
zeytinlerin aflatoksin seviyelerinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre,
öğütülmüş zeytinlerde 99.34 ile 134.59 saat; bütün haldeki zeytin örneklerinde ise
103.56 ile 152.49 saat arasında değişmektedir.
Zeytinlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon
sürelerinin 57.48 ile 132.12 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.
4.5.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde
Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi
Kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde soya
fasulyesi içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeylerinde AFB1 ilave
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
91
edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki değişim ve % azalma
oranları Çizelge 4.15’de verilmiştir.
Çizelge 4.15. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon (ng g-1)
Süre (Saat)
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 482.18 470.41 0.00 486.60 477.23 0.00
6 494.64 392.22 16.62 492.20 407.80 14.55
12 477.08 301.24 35.96 473.00 329.30 31.00
24 468.31 225.91 51.98 468.20 245.57 48.54
36 487.34 167.30 64.44 486.10 180.08 62.27
48 461.90 113.81 75.81 494.20 133.12 72.11
72 467.80 45.56 90.31 488.10 68.47 85.65
1000
0 966.24 940.23 0.00 981.34 950.44 0.00
6 964.70 793.12 15.65 985.60 821.30 13.59
12 969.10 637.55 32.19 978.20 677.29 28.74
24 951.30 463.70 50.68 968.19 523.66 44.90
36 971.30 368.61 60.80 943.50 374.41 60.61
48 956.56 253.10 73.08 958.57 285.43 69.97
72 932.67 130.73 86.10 946.78 149.37 84.28
2000
0 1912.56 1880.05 0.00 1958.45 1893.65 0.00
6 1909.43 1615.59 14.07 1925.14 1715.31 9.42
12 1877.89 1241.82 33.95 1882.03 1441.82 23.86
24 1893.90 958.70 49.01 1911.93 948.40 49.92
36 1889.60 688.70 63.37 1904.67 698.10 63.13
48 1876.65 478.19 74.57 1876.72 505.83 73.29
72 1922.76 238.01 87.34 1882.14 285.80 84.91
İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan
gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki soya fasulyesi örneklerinin AFB1
içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. Kontrol örneklerinin aflatoksin
düzeylerinde ise önemli bir değişim belirlenmemiştir. 72 saat sonunda kontrol grubu
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
92
dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak
azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş soya fasulyesi
örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %90.31, %86.10 ve %87.34 düzeylerinde
azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %85.65,
%84.28 ve %84.91 oranında azalma gerçekleşmiştir.
Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum
NRRL B-184 hücrelerinin soya fasulyesinde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi
istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli
bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikteki
etkisi önemli (p<0.05), konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkileri ise istatistiksel
açıdan önemsiz bulunmuştur.
Bu çalışmada, soya fasulyesinin AFB1 miktarının azaltılması üzerine F.
aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin etkili olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark.
(1966)’nın yaptıkları çalışmada da aynı bakterinin soya fasulyesindeki aflatoksini
azaltma yeteneğine sahip olduğu belirtilmiştir. Araştırıcı, toksijenik bir A. flavus suşu
geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan soya fasulyesinde; 1013 kob ml-1 canlı F.
aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28oC de 12 saatlik inkübasyon sonunda 8 mg
g-1 düzeyindeki AFB1’in 2 mg g-1’a düştüğünü, inkübasyon süresi uzatıldığında soya
fasulyesinde kalan aflatoksinin de giderildiğini bildirmişlerdir.
4.5.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde
Aflatoksini Azaltma Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki soya fasulyesinin AFB1 içeriğindeki azalmanın
kaçıncı dereceden reaksiyon kinetiğine uyduğunu belirleyebilmek amacıyla
regresyon analizleri yapılmıştır. Yapılan regresyon analizleri ile Co, k, k’nın güven
aralığı, F ve R2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge 4.16’da verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
93
Çizelge 4.16. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya Fasulyesinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları
Ürün Konsantrasyon
(ng ml-1) Reaksiyon Derecesi
C0 (ng g-1)
k* k için güven
aralığı F Değeri** R2 Değeri***
Öğü
tülm
üş
500 Sıfırıncı 406.007 5.685 6.457-4.913 54.299 0.916
Birinci 6.141 0.030 0.031-0.029 943.536 0.995
1000 Sıfırıncı 821.846 10.939 12.481-9.477 56.009 0.918
Birinci 6.832 0.028 0.029-0.027 1333.065 0.996
2000 Sıfırıncı 1648.957 22.433 25.453-19.413 55.191 0.917
Birinci 7.534 0.029 0.030-0.028 1108.662 0.996
Büt
ün
500 Sıfırıncı 421.013 5.583 6.307-4.859 59.406 0.922
Birinci 6.161 0.027 0.028-0.026 2911.651 0.998
1000 Sıfırıncı 852.009 11.021 12.316-9.726 72.439 0.935
Birinci 6.854 0.026 0.027-0.025 3893.854 0.999
2000 Sıfırıncı 1726.720 23.223 26.369-20.077 54.507 0.916
Birinci 7.576 0.028 0.029-0.027 884.581 0.994
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
94
Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda
AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün soya fasulyelerine ait R2 ve F değerleri birinci
derece reaksiyon kinetiği modelinden oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece
reaksiyon kinetiği modelinde R2 değerleri öğütülmüş soya fasulyelerinde 0.995-
0.996, bütün soya fasulyelerinde ise 0.994-0.999 arasında değişmiştir.
Şekil 4.25, 4.26, 4.27’de öğütülmüş, Şekil 4.28, 4.29 ve 4.30’da ise bütün
halde bulunan soya fasulyelerindeki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik
modellere göre azalış eğrileri görülmektedir.
y = 464,427e-0,030x
R2 = 0,995
y = -5,685x + 406,007R2 = 0,916
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.25. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı
ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
95
y = 927,412e-0,028x
R2 = 0,996
y = -10,939x + 821,846R2 = 0,918
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.26. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1870,481e-0,029x
R2 = 0,996
y = -22,433x + 1648,957R2 = 0,917
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.27. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin
sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
96
y = 473,922e-0,027x
R2 = 0,998
y = -5,583x + 421,013R2 = 0,922
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.28. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 947,549e-0,026x
R2 = 0,999
y = -11,021x + 852,009R2 = 0,935
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.29. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
97
y = 1950,109e-0,028x
R2 = 0,994
y = -23,223x + 1726,720R2 = 0,916
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.30. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunması AFB1 miktarındaki azalmanın bu kinetik modele daha uygun olduğunu
göstermektedir. Kinetik modellere ait azalış eğrilerinin birinci derece reaksiyon
kinetiğine daha uygun olduğu şekillerden de (Şekil 4.25, 4.26, 4.27, 4.28, 4.29 ve
4.30) görülebilmektedir.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen “k” değerleri
istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren
öğütülmüş soya fasulyesi ortamında toksinin degradasyon hızı sırasıyla 0.055, 0.052
ve 0.051 saat-1; bütün halde soya fasulyesi içeren ortamda ise 0.053, 0.047 ve 0.045
saat-1 olarak bulunmuştur.
Soya fasulyesi örneklerinin 72 saat sonunda içerdiği AFB1 düzeyleri Türk
Gıda Kodeksinde bu ürün için izin verilen sınır değerlere ulaşamamıştır. İnkübasyon
süresi, soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak ta kullanımı için de yeterli olmamıştır.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda soya
fasulyelerinin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
98
Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için
gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.17’de verilmiştir.
Çizelge 4.17. Soya Fasulyelerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin
Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul
Edilebilir
Limit (ng g-1)
Süre (Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin
1000 ng g-1
AFB1 İçin
2000 ng g-1
AFB1 İçin
Öğü
tülm
üş S
oya
Fasu
lyes
i
k=0.030 k=0.028 k=0.029
İnsan
Tüketimi İçin
2 181,60 219,24 235,89
5 151,05 186,52 204,30
Hayvan Yemi
İçin
5 151,05 186,52 204,30
10 127,95 161,76 180,39
20 104,84 137,01 156,49
Büt
ün S
oya
Fasu
lyes
i
k=0.027 k=0.026 k=0.028
İnsan Tüketimi İçin
2 202,51 236,96 210,10
5 168,58 201,71 177,38
Hayvan Yemi
İçin
5 168,58 201,71 177,38
10 142,90 175,05 152,62
20 117,23 148,39 127,87
Çizelge 4.17’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren soya
fasulyesinin aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre,
öğütülmüş soya fasulyesi örneklerinde 181.60 ile 235.89 saat; bütün haldeki soya
fasulyesi örneklerinde ise 202.51 ile 210.10 saat arasında değişmektedir.
Soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan
inkübasyon sürelerinin 104.84 ile 204.30 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
99
4.5.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi
Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan
öğütülmüş ve bütün halde incir içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1
düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasında aflatoksin içeriğindeki
değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.18’de verilmiştir.
İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde önemli bir
değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek
öğütülmüş gerekse bütün haldeki incir örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir
azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma,
başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng
g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş kuru incir örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla
%99.34, %98.30 ve %97.83 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye
alınan örneklerde ise sırasıyla %98.17, %95.80 ve %95.25 oranında azalma
gerçekleşmiştir.
Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum
NRRL B-184 hücrelerinin incirde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi
istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli
bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak
etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi
istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
100
Çizelge 4.18. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon (ng g-1)
Süre (Saat)
Uygulama
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 482.42 450.08 0.00 478.12 460.14 0.00
6 463.22 340.10 24.44 487.82 355.44 22.75
12 487.52 234.92 47.80 489.45 244.88 46.78
24 478.11 131.64 70.75 451.64 159.36 65.37
36 478.78 50.95 88.68 474.87 80.99 82.40
48 441.31 33.72 92.51 461.39 43.02 90.65
72 455.36 2.95 99.34 465.46 8.42 98.17
1000
0 954.82 900.03 0.00 987.41 912.58 0.00
6 925.45 688.87 23.46 996.29 728.21 20.20
12 927.75 471.39 47.63 984.67 564.80 38.11
24 986.79 278.04 69.11 908.78 317.33 65.23
36 932.89 82.06 90.88 975.16 149.11 83.66
48 935.49 64.28 92.86 926.51 76.60 91.61
72 921.36 15.28 98.30 934.41 38.37 95.80
2000
0 1978.17 1800.22 0.00 1981.56 1821.35 0.00
6 1984.32 1430.99 20.51 1992.54 1571.26 13.73
12 1969.69 909.72 49.47 2020.41 1256.69 31.00
24 1882.38 561.40 68.81 1962.71 684.80 62.40
36 1993.71 162.05 91.00 1879.23 347.62 80.91
48 1845.32 138.93 92.28 1928.18 188.28 89.66
72 1941.31 39.15 97.83 1935.08 86.57 95.25
Kuru incir üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu
göstermektedir. Kuru incir ile ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi
bir karşılaştırma yapmak mümkün olamamıştır.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
101
4.5.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini
Azaltma Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki incirlerde AFB1’in azalma kinetiğini
inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Her iki regresyon
analizinde de, Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar
Çizelge 4.19’da verilmiştir.
Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda
AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün incirlere ait R2 değerleri oldukça düşük
bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2 değerleri öğütülmüş
incirlerde 0.990-0.997 bütün haldeki incirlerde ise 0.988-0.996 arasında değişmiştir.
Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece reaksiyon
kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.
Şekil 4.31, 4.32, 4.33’te öğütülmüş incirlerdeki, Şekil 4.34, 4.35 ve 4.36’da
ise bütün haldeki incirlerdeki AFB1’in, sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere
göre azalış eğrileri görülmektedir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
102
Çizelge 4.19. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları
Ürün Konsantrasyon
(ng g-1) Reaksiyon
Derecesi C0
(ng g-1) k*
k için güven aralığı
F Değeri** R2 Değeri*** Ö
ğütü
lmüş
500 Sıfırıncı 346.595 5.969 7.262-4.676 21.297 0.810
Birinci 6.123 0.054 0.056-0.052 1942.260 0.997
1000 Sıfırıncı 695.395 11.959 14.616-9.302 20.263 0.802
Birinci 6.821 0.054 0.057-0.051 832.739 0.994
2000 Sıfırıncı 1397.671 23.946 29.406-18.486 19.234 0.794
Birinci 7.521 0.054 0.058-0.050 503.765 0.990
Büt
ün
500 Sıfırıncı 363.827 6.033 7.210-4.856 26.262 0.840
Birinci 6.135 0.048 0.050-0.046 1597.683 0.997
1000 Sıfırıncı 744.672 12.251 14.630-9.872 26.519 0.841
Birinci 6.841 0.046 0.048-0.044 1102.971 0.996
2000 Sıfırıncı 1567.220 25.323 29.848-20.798 31.316 0.862
Birinci 7.559 0.042 0.045-0.039 403.667 0.988
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
103
y = 456,316e-0,054x
R2 = 0,997
y = -5,969x + 346,595R2 = 0,810
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.31. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 916,646e-0,054x
R2 = 0,994
y = -11,959x + 695,395R2 = 0,802
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.32. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
104
y = 1846,475e-0,054x
R2 = 0,990
y = -23,946x + 1397,671R2 = 0,794
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.33. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 461,821e-0,048x
R2 = 0,997
y = -6,033x + 363,827R2 = 0,840
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.34. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
105
y = 935,878e-0,046x
R2 = 0,996
y = -12,251x + 744,672R2 = 0,841
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.35. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1916,987e-0,042x
R2 = 0,988
y = -25,323x + 1567,220R2 = 0,862
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.36. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
106
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.31, 4.32, 4.33 4.34, 4.35 ve 4.36) kinetik
modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere incir ortamındaki AFB1
azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna
varılmıştır.
“k” değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan
değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g-1
AFB1 içeren öğütülmüş incirlerde sırasıyla 0.054, 0.054 ve 0.054 saat-1; bütün
haldeki incirlerde ise 0.048, 0.046 ve 0.042 saat-1 olarak hesaplanmıştır.
72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş
kuru incir örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite
ulaşılmıştır. 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g-1 AFB1 içeren
bütün haldeki kuru incirlerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara
ulaşmıştır.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kuru
incirlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan
süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.20’de verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
107
Çizelge 4.20. Kuru İncirlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul
Edilebilir
Limit (ng g-1)
Süre(Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin
1000 ng g-1
AFB1 İçin
2000 ng g-1
AFB1 İçin
Öğü
tülm
üş İn
cir
k=0.054 k=0.054 k=0.054
İnsan
Tüketimi İçin
2 100,55 113,48 126,44
5 83,58 96,51 109,47
Hayvan Yemi
İçin
5 83,58 96,51 109,47
10 70,75 83,67 96,64
20 57,91 70,84 83,80
Büt
ün İn
cir
k=0.048 k=0.046 k=0.042
İnsan Tüketimi İçin
2 113,37 133,65 163,47
5 94,28 113,73 141,66
Hayvan Yemi
İçin
5 94,28 113,73 141,66
10 79,84 98,66 125,15
20 65,40 83,59 108,65
Çizelge 4.20’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren kuru
incirlerin aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş
kuru incirlerde 100.55 ile 126.44 saat; bütün haldeki kuru incirlerde ise 113.37 ile
163.47 saat arasında değişmektedir.
Kuru incirlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan
inkübasyon sürelerinin 57.91 ile 141.66 saat arasında değiştiği belirlenmiştir.
4.5.6. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği
4.5.6.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltmasının Belirlenmesi
Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan
öğütülmüş ve bütün halde fındık içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1
düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki
değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.21’de verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
108
Çizelge 4.21. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları
Konsantrasyon
(ng g-1)
Süre
(Saat)
Uygulama
Öğütülmüş Bütün
Kontrol AFB1 %
Azalma Kontrol AFB1
%
Azalma
500
0 487.87 475.33 0.00 481.50 479.78 0.00
6 475.78 351.12 26.13 498.30 403.58 15.88
12 465.67 201.44 57.62 498.12 288.91 39.78
24 488.21 82.40 82.66 489.54 117.21 75.57
36 487.09 53.70 88.70 478.91 67.23 85.99
48 476.04 28.30 94.05 475.23 34.47 92.82
72 462.70 0.78 99.84 483.65 11.08 97.69
1000
0 974.56 950.34 0.00 981.51 963.74 0.00
6 975.78 842.28 11.37 975.67 876.31 9.07
12 963.70 505.89 46.77 987.57 609.07 36.80
24 965.79 290.08 69.48 967.43 351.60 63.52
36 957.21 116.20 87.77 991.17 178.42 81.49
48 986.14 59.10 93.78 983.31 112.30 88.35
72 982.74 5.04 99.47 956.94 18.19 98.11
2000
0 1986.12 1900.20 0.00 1958.05 1914.30 0.00
6 1997.34 1706.15 10.21 1967.43 1793.13 6.33
12 1928.04 1109.28 41.62 1932.56 1279.51 33.16
24 1913.37 658.01 65.37 1915.24 790.90 58.68
36 1895.09 289.61 84.76 1902.23 414.21 78.36
48 1904.33 134.28 92.93 1958.02 255.28 86.66
72 1921.00 18.19 99.04 1912.91 67.40 96.48
Kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir
değişim gerçekleşmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek
öğütülmüş gerekse bütün haldeki fındık örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir
azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma
oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000
ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş fındık örneklerinde 72. saat sonunda
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
109
sırasıyla %99.84, %99.47 ve %99.04 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak
denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %97.69, %98.11 ve %96.48 oranında
azalma gerçekleşmiştir.
F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından fındık örneklerinin AFB1
miktarının azaltılması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ve inkübasyon süresinin
etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). Fındık boyutunun etkisi ise
istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak
etkisi toksin miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve
süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur.
Fındıklarla yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184
hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğu
görülmüştür. Bu bakterinin fındıkta bulunan aflatoksin üzerine etkisinin araştırıldığı
başka bir çalışmanın olmaması; bu çalışmadan elde edilen verilerin
karşılaştırılmasını mümkün kılmamıştır.
4.5.6.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini
Azaltma Kinetiği
Öğütülmüş ve bütün haldeki fındıklarda AFB1’in azalma kinetiğinin sıfırıncı
ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek amacıyla
regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen Co, k, k’nın
güven aralığı, F ve R2 değeri Çizelge 4.22’de verilmiştir.
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
110
Çizelge 4.22. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi
Sonuçları.
Ürün Konsantrasyon
(ng ml-1) Reaksiyon Derecesi
C0 (ng g-1)
k* k için güven
aralığı F Değeri** R2 Değeri***
Öğü
tülm
üş
500 Sıfırıncı 342.026 6.066 7.690-4.442 13.949 0.736
Birinci 6.183 0.067 0.072-0.017 670.437 0.993
1000 Sıfırıncı 775.047 13.416 16.313-10.519 21.445 0.811
Birinci 6.914 0.053 0.059-0.047 240.890 0.980
2000 Sıfırıncı 1598.952 27.156 32.442-21.870 26.390 0.841
Birinci 7.610 0.048 0.053-0.043 266.875 0.982
Büt
ün
500 Sıfırıncı 387.652 6.623 8.090-5.156 20.370 0.803
Birinci 6.224 0.052 0.057-0.047 347.284 0.986
1000 Sıfırıncı 830.739 13.664 16.123-11.205 30.872 0.861
Birinci 6.931 0.044 0.048-0.040 311.231 0.984
2000 Sıfırıncı 1700.112 27.202 31.740-22.664 35.929 0.878
Birinci 7.624 0.040 0.044-0.036 269.297 0.982
* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.
** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
111
Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda
AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün fındıklara ait R2 değerleri oldukça düşük
bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2 değerleri öğütülmüş
fındıklarda 0.982-0.993, bütün haldeki fındıklarda ise 0.982-0.986 arasında
değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelin
deneysel verilere uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci
derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.
Şekil 4.37, 4.38, 4.39’da öğütülmüş fındıklardaki, Şekil 4.40, 4.41 ve 4.42’de
ise bütün halindeki fındıklarda AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere
göre azalış eğrileri görülmektedir.
y = 484,527e-0,067x
R2 = 0,993
y = -6,066x + 342,026R2 = 0,736
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.37. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
112
y = 1006,536e-0,053x
R2 = 0,980
y = -13,416x + 775,047R2 = 0,811
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.38. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 2017,716e-0,048x
R2 = 0,982
y = -27,156x + 1598,952R2 = 0,841
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.39. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve
birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
113
y = 504,967e-0,052x
R2 = 0,986
y = -6,623x + 387,652R2 = 0,803
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.40. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
y = 1023,625e-0,044x
R2 = 0,984
y = -13,664x + 830,739R2 = 0,861
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.41. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
114
y = 2046,973e-0,040x
R2 = 0,982
y = -27,202x + 1700,112R2 = 0,878
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Süre (Saat)
Afla
toks
in M
ikta
rı (n
g g-
1)
AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece
Şekil 4.42. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci
derece kinetik modellere göre azalış eğrileri
R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek
bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından fındık ortamındaki
AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna
varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.37, 4.38, 4.39, 4.40, 4.41 ve 4.42) kinetik modellere
ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon
kinetiğine uyumu daha iyi görülebilmektedir.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen “k” değerleri
istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren
öğütülmüş fındık kullanılan ortamlar için toksinin azalma hızı sırasıyla 0.067, 0.053
ve 0.048 saat-1; bütün haldeki fındıklarda ise 0.052, 0.044 ve 0.040 saat-1 olarak
hesaplanmıştır.
72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren
öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan
limite ulaşılmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000
ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki fındıkların toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen
4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ
115
Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen
sınırlara ulaşmıştır.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak
107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda
fındıkların AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler
Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan
süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.23’de verilmiştir.
Çizelge 4.23. Fındık Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin
Altına İnme Süreleri
Ürün Tüketim
Amacı
Kabul Edilebilir
Limit
(ng g-1)
Süre (Saat)
500 ng g-1
AFB1 İçin
1000 ng g-1
AFB1 İçin
2000 ng g-1
AFB1 İçin
Öğü
tülm
üş F
ındı
k
k=0.674 k=0.053 k=0.048
İnsan Tüketimi İçin
2 81,94 117,37 144,10
5 68,26 100,09 125,01
Hayvan Yemi
İçin
5 68,26 100,09 125,01
10 57,92 87,01 110,57
20 47,57 73,93 96,13
Büt
ün F
ındı
k
k=0.052 k=0.044 k=0.040
İnsan
Tüketimi İçin
2 106,36 141,77 173,27
5 88,74 120,94 150,36
Hayvan Yemi
İçin
5 88,74 120,94 150,36
10 75,41 105,19 133,04
20 62,08 89,44 115,71
Çizelge 4.23’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren
fındıkların aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş
fındıklarda 81.94 ile 144.10 saat; bütün fındıklarda ise 106.36 ile 173.27 saat
arasında değişmektedir.
Fındıkların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon
sürelerinin 47.57 ile 150.36 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.
5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ
116
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Küfler bir çok tarımsal üründe; hasat öncesinde ve sonrasında, depolama
süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri sırasında doğal
olarak gelişmektedirler.
Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve
sağlık sorunlarının farkına varılarak çeşitli önlemlerin alınmasının önemi büyüktür.
Mikotoksin sorununun çözümünde ilk hedef bu toksinlerin oluşumunun önlenmesi
olmalıdır. Nevarki, mikotoksin oluşumunun hasat öncesinde, depolama ve işleme
sırasında önlenmesi her zaman mümkün olmamaktadır. Bu nedenle, mikotoksinlerin
degradasyon ve detoksifikasyon yöntemleri ile miktarlarının azalması veya daha az
tehlikeli ya da tehlikesiz ürünlere dönüşümünü sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesi
büyük öneme sahiptir.
Bu amaçla çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun PFT
ortamında ve çeşitli gıda ürünlerinde AFB1’in detoksifikasyonu üzerine etkisi
araştırılmıştır.
Çalışmadan elde edilen bulgulara göre;
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme
eğrisi elde edilmiş ayrıca doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre
gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu
sonucuna varılmıştır.
Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun
maksimum spesifik gelişme hızının 0.073 saat -1, lag süresinin ise 5.244 saat olduğu
hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan
F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun bir saatlik periyotlar içerisinde bir önceki
popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek 45 saatte 2.7 log’luk bir artışla
durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir.
F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmamış kontrol örneklerinin
inkübasyon süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim belirlenmemiştir.
Ancak durgun fazda 107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan
PFT çözeltisi ile kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındık
5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ
117
ortamlarında, konsantrasyon ve boyut farkı olmaksızın aflatoksin miktarında sürekli
bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum meydana gelen azalmanın F. aurantiacum
NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu olduğunu göstermektedir.
F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki
azalmanın “Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine” uygun olduğu tespit edilmiştir.
Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, birim zamanda
konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k” değeri en yüksek PFT
ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün
ürünlerde ise siyah zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan
tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri
sahip olmuştur. Aflatoksin konsantrasyonunun artmasının ve ürünlerin bütün halde
olmalarının “k” değerlerinde genel olarak azalmaya neden olduğu görülmüştür.
72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı
biber, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g-1 AFB1
içeren öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan
gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB1 düzeylerine ulaşılabilmiştir.
Bu süre sonunda; 500 ile 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500
ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biber örnekleri, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş
mısır örnekleri, 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g-1 AFB1
içeren bütün haldeki zeytin örnekleri, 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve
500 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki kuru incirler ile 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1
içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki fındıkların AFB1
düzeyleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de hayvan yemi için
belirtilen limitlerin altına düşmüştür.
Birinci dereceden reaksiyon kinetiğine ait model parametrelerinden
yararlanılarak 107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması
durumunda örneklerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksinde bu ürünler için
belirtilmiş olan 5 ng g-1’a düşürülebilmesi için ürün çeşidine bakılmaksızın
öğütülmüş örneklerde 68-204 saat, bütün haldeki örneklerde ise 86-177 saatin
gerekebileceği hesaplanmıştır. AFB1 içeriklerinin 2 ng g-1’a düşürülebilmesi için
öğütülmüş örneklerin 82-236 saat ve bütün haldeki örneklerin ise 104-210 saat
5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ
118
süreyle F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile inkübe edilmesinin gerekebileceği
belirlenmiştir.
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre;
Kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıklarda bulunan
AFB1’i uzaklaştırmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşundan yararlanılabileceğini
göstermektedir. Bu yöntemin ticari olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kabul
edilebilmesi için öncelikle detoksifiye edilen ürünlerde yeni toksik bileşiklerin
oluşup oluşmadığının daha ileri analiz teknikleri veya hayvan deneyleri ile açıklığa
kavuşturulması gerekmektedir.
Bu bakteri ile yapılmış daha önceki çalışmalar dikkate alındığında,
detoksifikasyon süresinin kısaltılabilmesi için kullanılan bakteri sayısının artırılması
önerilebilir.
Aflatoksin içeren bir üründe; başka mikotoksinlerin de var olabileceği
düşünülerek, bu bakterinin diğer mikotoksinler üzerine etkileri de araştırılmalıdır.
Ayrıca, F. aurantiacum B-184 suşunun aflatoksini enzimatik olarak
detoksifiye ettiği düşünülürse, ileri genetik çalışmalar ile bu enzim veya enzimlerin
üretimi ile ilgili genlerin başka mikoorganizmalara (starter kültürler gibi) ya da
toksin sorunu yaşanan bitkilere aktarılması durumunda aflatoksin sorununa çözüm
olabileceği düşünülmektedir.
119
6. KAYNAKLAR
ADAMS, M.R., MOSS, M.O., 1997. Food Microbiology. The Royal Society of
Chemistry. Cambridge. p:230-234.
AHMED, M.A., SHAMSUDDING, Z.A., KHAN, B.A., 1996. Elimination of
Naturally Occurring Aflatoxins in Cottonseed Meal. Pak, J. Sci. Ind. Res., 39,
183–185.
AIKAWA K., KOMATSU Y., 1987. Antimutagenic Effects of Autoxidized
Linoleic and Oleic Acids on UV-induced Mutagenesis in Escherichia coli.
Agric. Biol. Chem., 51(10), 2717–2720.
AIKAWA K., 1988. Effect of s-9 Mmix on Antimutagenic Activity of Autoxidized
Linoleic Acid, Agric. Biol. Chem., 52(8), 2115–2116.
ALTUG, T., YOUSEF, A.E., MARTIN, E.H., 1990. Degradation of Aflatoxin B1
in Dried Figs by Sodium Bisulfite with or without Heat, Ultraviolet Energy or
Hydrogen Peroxide. J. Food Prot., 53, 581–582, 628.
ALTUĞ, G., 1991. Laboratuar Ortamında Aflatoksin Üretimi ve Aspergillus spp’nin
Plasmid Transferine Etkisinin Araştırılması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü
Yüksek Lisans Tezi. Adana. 39s.
ANONİM, 1998. Laboratuvar Analiz Föyü. Tarım Orman ve Köyişleri Bakanlığı. İl
Kontrol Laboratuvarı. Adana.
ANONİM, 2002. Discussion Paper on Aflatoxins in Pistachios. Codex Alimentarius
Commission. CX/FAC 02/22. Joint FAO/WHO Food Standards Programme
Rotterdam, Netherlands.
AOAC, 2000. AOAC Official Method 999.07. Aflatoxin B1 and Total Aflatoxins in
Peanut Butter, Pistachio Paste, Fig Paste, and Paprika Powder.
Immunoaffinity Column Liquid Chromatography with Post-Column
Derivatization First Action 1999.
120
ARRIOLA, M.C., PORRES, E de, CABRERA, S de, ZEPEDA, M de, ROLZ,
C., 1988. Aflatoxin Fate During Alkaline Cooking of Corn for Tortilla
Preparation. J. Agr. Food Chem., 36:530-533.
BAHAR, M.B., ALTUĞ, T., 1997. Kontamine Kuru İncirlerden İki Farklı Teknikle
Elde Edilen İncir Pekmezlerine Aflatoksin Geçiş Düzeylerinin İncelenmesi.
Gıda Mühendisliği III. Ulusal Sempozyumu. 1995-1996 Araştırmaları,
s:53-58. Ankara.
BANDARA, J.M.R.S., VİTHANEGE, A.K., BEAN, G.A., 1991. Effect of
Parboiling and Bran Removal on Aflatoxin Levels in Sri Lankan Rice,
Mycopathologia, 115, 31–35.
BANWART, G.J., 1989. Basic Food Microbiology. Second Edition, Published by
Van Nostiond Reinhold, New York-Tokyo, 399-320.
BATA, A., LASZTITY, R., 1999. Detoxification of Mycotoxin-Contaminated Food
and Feed By Microorganisms. Trends in Food Sci. & Tech. 10: 223-228.
BURGOS-HERNANDEZ, A., JORGENSEN KORNMAN, K., PRICE, R.L.,
1996. Detoxification of Aflatoxin-Contaminated Corn by Ammonium
Persulfate and The Effect of Three Peroxides on The Ethanol Production in a
Fermentation Process. 1996 IFT Annual Meeting, Book of Abstracts, p.27,
ISSN 1082-1236.
BURGOS-HERNANDEZ, A., PRICE, R.L., JORGENSEN-KORNMAN, K.,
LOPEZ-GARCIA, R., NJAPAU, H., PARK, D.L., 2002. Decontamination
of Aflatoxin B1 Contaminated Corn by Ammoniation Persulphate During
Fermentation. J. Sci. Food Agric., 82, 546–552.
CHATTERJEE, D., MUKHERJEE, S.K., 1993. Destruction of Phagocytosis-
suppressing Activity of Aflatoxin B1 by Ozone. Lett. Appl. Microbiol., 17:52-
54.
CIEGLER, A., LILLEHOJ, E.B., PETERSON, R.E., HALL, H.H., 1966.
Microbial Detoxification of Aflatoxin. Applied Microbiology. 4 (6):934-939.
121
ÇOKSÖYLER, N., 1994. Türkiye’de Mikotoksin Problemi. II. Gıda Mühendisligi
Kongresi. 21-23 Eylül 1994 Gaziantep. s: 234-239.
D’SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., 1998. The Role of Metal Ions in Aflatoxin B1
Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of Food Prot. 61 (12) 1666-
1669.
D’SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., 2000. The Influence of Divalent Cations and
Chelators on Aflatoxin B1 Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of
Food Prot. 63 (1) 102-105.
D’SOUZA, D.H., BRACKKETT, R.E., 2001. Aflatoxin B1 degradation by F.
aurantiacum in the Presence of Reducing Conditions and Seryl and
Sulfhydryl Group Inhibitors. J. of Food Prot. 64(2), 268-271.
DAS, C., MISHRA, H.N., 2000. Effect of Aflatoxin B1 Detoxification on
Physicochemical Properties and Quality of Ground Nut Meal. Food
Chemistry. (70):483-487.
DEACON, J. W., 1997. Modern Mycology. Third Edition, Blackwell Science Ltd.
303 p.
DETROY, R. W., LILLEHOJ, E. B., CIEGLER, A., 1971. Aflatoxin and Related
Compounds. In: A. Ciegler, S. Kadis & S. J. Ajl, eds. Microbial Toxins 8, 4
178. Academic Press, New York.
DOLLEAR, F.B., MANN, G.E., CODIFER, L.P., GARDNER, Jr.H.K.,
KOLTUN, Jr.S.P., VIX, H.L.E, 1968. Elimination of Aflatoxins from
Peanut Meal. J. Am. Oil Chem. Soc. 45:862-865.
DOYLE, M.P., APPLEBAUM, R.S., BRACKETT, R.E., MARTH, E.M., 1982.
Physical, Chemical and Biological Degradation of Mycotoxins in Foods and
Agricultural Commodities. J. Food Prot., 45:964-971.
DOYLE, M.P., BEUCHAT, L.R., MONTVILLE, T.J., 1997. Food Microbiology
Fundementals and Frontiers. 768p.
122
DOYLE, M.P., MARTH, E.H., 1978. Bisulfite Degrades Aflatoxin: Effect of
Temperature and Concentration of Bisulfite. J. Food Prot. 41:774-780.
DRAUGHON, F.A., CHILDS, E.A., 1982. Chemical and Biological Evaluation of
Aflatoxin After Treatment with Sodium Hypochlorite, Sodium Hydroxide
and Ammonium Hydroxide. J.Food Prot. 45:703-706.
DVORACKOVA, I., 1986. Aflatoxin Inhalation and Alveolar Cell Carcinoma. Br.
Med. J., 1:691.
DWARAKANTTH, C.T., RAYNER, E.T., MANN, G.E., DOLLER, F.G., 1968.
Reduction of Aflatoxin Level in Cottonseed and Peanut Meals by Ozonation.
J. Am. Oil. Chem. Soc. 45:93-95.
EC, 2008. Commission Regulation (EC) No 2006R1881 of 23.07.2008 Setting
Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs.
ELEY, R.A., 1996. Microbial Food Poising. Chapmen & Hall London. 211p.
EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998a.
Physicochemical Alterations Enhance the Ability of Dairy Strains of Lactic
Acid Bacteria to Remove Aflatoxin from Contaminated Media, J. Food Prot.,
61(4), 466–468.
EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998b.
Ability of Lactic Acid Bacteria to Bind a Common Food Carcinogen,
Aflatoxin B1, Food Chem. Toxicol., 36(4), 321–6.
EL-NEZAMI, H., MYKKANEN, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S.,
AHOKAS, J., 2000. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium Strains
to Remove Aflatoxin B1 from the Chicken Duodenum. J. Food Prot.., 63(4),
549–552.
EPSOY, H.M., 1972. Detoxification of Corn Containing Aflatoxin by Teratment
with Calcium Hydroxide (Alınmıştır, Özay,1988. Gıdalarda Mikotoksinler ve
Detoksifikasyonu. Gıda (13) 137-141.). U.S. Patent, 3, 689, 275.
123
FAO, 1993. Sampling Plans for Aflatoxin Analysis in Peanut and Corn. Food and
Agriculture Organization of The United Nations.Report of an FAO Technical
Consultation Rome, 3,6 May 1993.77p.
GALVANO, F., PIVA, A., GALVANO, G., 2001. Dietary Strategies to Counteract
the Effects of Mycotoxins: A Review. J.Food Prot., 64:120-131.
GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., DOLLEAR, F.G., RAYNER, E.T., 1971.
Inactivation of Aflatoxins in Peanut and Cottonseed Meals by Ammoniation
J. Am. Oil Chem. Soc. 48, 70-73.
GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., H.L.E. VIX, 1968. Solvent Extraction of
Aflatoxins from Oilseed Meals. J. Agric. Food Chem., 990-993.
GHOSH, M.K., CHHABRA, A., 1995. Aflatoxin Detoxification in Naturally
Contaminated Groundnut Cake. Indian J. Animal Nutr., 12, 105–107.
GIANNUZZI, L., PINOTTI, A., ZARITZKY, N., 1997. Modelling of Microbial
Growth in Potato Homogenate. J.Sci.Food.Agric. 73, 425-431.
GOLDBLATT, L.A., DOLLEAR, F.G., 1977. Detoxification of Contaminated
Crops: Mycotoxins in Human and Animal Health. Rodricks, J.V., Hesseltine,
C.W., Mehlman, M.A. (Eds.), Pathotox Publishers, Inc., Park Forest South,
Ilinois. p:139-150.
GÖZÜKARA, E.M., 1997. Biyokimya, 2. Cilt, 3.Baskı, Nobel Tıp Kitapevleri,
1225s.
GROOPMAN, J.D., CAIN, L.G., KENSLER, T.W., 1988. Aflatoxin Exposure in
Human Populations: Measurements and Relationship to Cancer. Crit. Rev.
Toxicol., 19:113-146.
GÜRGÜN, V., HALKMAN, A.K., 1990. Mikrobiyolojide Sayım yöntemleri, Gıda
Teknolojisi Derneği Yayın No:7. 2. Baskı. Basım&Grafik. 146s. Ankara.
HAGLER, W.N., HUTCHINS, Jr.J.E., HAMILTON, P.B., 1983. Destruction of
Aflatoxin B1 with Sodium Bisulfite: Isolation of the Major Product Aflatoxin
B1S. J.Food Prot. 46:295-300.
124
HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., 1988. Removal of Aflatoxin B1 from Peanut Milk
Inoculated with F. aurantiacum. J. Food Prot., 53(5), 1384-1386.
HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., 1989. Growth and Survival of F. aurantiacum in
Peanut Milk. J. Food Prot. 52(3) 165-168.
HASAN, H.A.H., 1996. Destruction of Aflatoxin B1 on Sorghum Grain with Acids,
Salts and Ammonia Derivatives, Crypogamie Mycol., 17, 129–134.
HASKARD, C.A., EL-NAZEMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S.,
AHOKAS, J.T., 2001. Surface Binding of Aflatoxin B1 by Lactic Acid
Bacteria, Appl. Environ. Microbiol., 67(7), 3086–91.
HAWORTH, S.R., LAWLOR, T.E., ZEIGER, E., PARK, D.L., 1989. Mutagenic
Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in a Model
System. J.Am.Oil Chem.Soc., 66:102-104.
HAYES, R.B., 1984. Aflatoxin Exposures in the Industrial Setting: an
Epidemiological Study of Mortality. Food Chem. Toxicol., 22:39–43.
HEATHCOTE, J.G., HIBBERT, J.R., 1978. Aflatoxin Chemical and Biological
Aspects. Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Netherlands,
212p.
HO, K.I., SOOK, C.H., WHA, M.T., 1995. Constituents of Antimutagenic Factor
from Brown Rice. Agric. Chem. Biotechnol., 38(5), 478–483.
HOCKING, A.D., 1997. Toxigenic Aspergillus Species. (Edited by Doyle,
L.R.;Beuchat, T.J.) Montuille Food Microbiology Fundamentals and
Frontiers. Chapter21. p:393-405.
HOLMES, B., OWEN, R.J., Mc MEEKIN, T.A., 1984. Bergey’s Manuel
Systematic Bacteriology, Vol.1, Krieg, N.r.; Holt, J.G. (Eds), The Williams &
Wilkins Company, Baltimore, p:351-361.
HUFF, W.E., HAGLER, Jr.W.M., 1982. Evaluation of Density Segregation as a
Means to Estimate the Degree of Aflatoxin Contamination of Corn. Cereal
Chem., 59:152-153.
125
HUSSEIN, H.S., BRASEL, J.M., 2001. Toxicity, Metabolism and Impact of
Mycotoxins on Humans and Animals. Toxicol., 167:101-134.
İÇ, E., YAVAŞ, İ., 1993. Şaraplarda Aflatoksin Miktarı Üzerine Bir Araştırma. Gıda
(5) 283-287.
JAIMEZ, J., FENTE, C.A., VAZQUEZ, B.I., FRANCO, C.M., CEPEDA, A.,
MAHUZIER, G., PROGNON, P., 2000. Application of the Assay of
Aflatoxins by Liquid Chromatography with Floroscence Detection in Food
Analysis. Journal of Chromatography a. 882:1-10.
JAY, J.M., 1992. Modern Food Microbiology. Chapmen and Hall. London. 675p.
JOHNSON, A.H., PETERSON, M.S., 1974. Encyclopedia of Food Technology.
Vol. 2. The Avi Publishing Company Westport-Connecticut. p:12-15.
KALAYCIOĞLU, L., SERPEK, B., NİZAMLIOĞLU, M., BAŞPINAR, N.,
TİFTİK, A.M., 1998. Biyokimya. Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi
Yayınevi, ISBN:975-448-135-0, Konya, 781s.
KARADENİZ, F., EKŞİ, A. 2002. Gıdalarda Mikotoksin Oluşumu ve Azaltılması.
Dünya Gıda. 7-8: 104-110.
KING, J.M., PRUDENTE, Jr.A.D., 2005. Chemical Detoxification of Aflatoxins in
Food and Feeds (Edited by Hamed K. Abbas). Aflatoxin and Food Safety
CRC Press, ISBN 0-8247-2303-1, p:543-554.
LAWLOR, T.E., HAWORT, S.R., ZEIGLER,E., PARK, D.L., LEE, L.S., 1985.
Mutagenic Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in
Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc., 62:1136-1138.
LEE, L.S. KOLTUN, S.P., STANLEY, J.B., 1984. Ammoniation of Aflatoxin B1
in a Pressure “Chamber Used to Decontaminate Toxin Containing Cottonseed
Meal”, J. AOCS, 61, 1607–1608.
LILLEHOJ, E.B., CIEGLER, A., HALL, H.H., 1967. Aflatoxin B1 Uptake by F.
aurantiacum. J. Bacteriology. 93(1), 464-471.
126
LILLEHOJ, E. B., STUBBLEFIELD, R. D., SHANNON, G. M., SHOTWELL,
O. L., 1971. Aflatoxin M1 from aqueous solutions by Flavobacterium
aurantiacum. Mycopathologia and Mycologia Applicata, 45, 259–264.
LIN, L., ZHANG, J., WANG, P., WANG, Y., CHEN, J., 1998. Thin-Layer
Chromatography of Mycotoxins and Comparison with Other
Chromatographic Methods. Journal of Chromatography A, 815 (1998) 3-20.
LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995a. Factors Affecting Aflatoxin B1 Removal
by Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:1 p:91-94.
LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995b. Role of Toxin Concentration and Second
Carbon Source in Microbial Transformation of Aflatoxin B1 by
Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:9 p:1042-1044.
LINE, J.E., BRACKETT, R.E., WILKINSON R.E., 1994. Evidence for
Degradation of Aflatoxin B1 by F. aurantiacum, J. Food Prot., 57(1), 788-
791.
LURIE, J., 1975. Handbook of Ansalytical Chemistry (translated from Russian by
Nicholas Bobrow), MIR Publishers, Moscow, USSR, 488p.
MACE, K., 1997. Aflatoxin B1-induced DNA Adduct Formation and p53 Mutations
in CYP-450-expressing Human Liver Cell Lines. Carcinogenesis, 18:1291–
1297.
MAEBA, H., TAKAMOTO, Y., KAMIMURA, M., MIURA, T., 1988.
Destruction and Detoxification of Aflatoxins with Ozone, J. Food Sci., 53,
667–668.
MANN, R., REHM, H.J., 1976. Degradation Products from Aflatoxin B1 by
Corynebacterium rubrum, Aspergillus niger, Trichoderma viride and Mucor
ambiguous, Eur. J. Appl.Microbiol., 2, 297–306.
MARTINS, M.L., MARTINS, H.M., 1999. Naturel and In Vitro Co-pruduction of
Cyclopiazionic Acid and Aflatoxins. J.Food Prot. Volume 62 No:3, p:292-
294.
127
McKENZIE, K.S., SARR, A.B., MAYURA, K., BAILEY, R.H., MILLER, D.R.,
ROGERS, T.D., NORRED, W.P., VOSS, K.A., PLATTNER, R.D.,
KUBENA, L.F., PHILIPS, T.D., 1997. Oxidative Degradation and
Detoxification Using a Novel Source of Ozone. Food Chem.Toxicol., 35:807-
820.
McKENZIE, K.S., KUBENA, L.F., DENVIR, A.J., ROGERS, T.D.,
HITCHENS, G.D., BAILEY, R.H., HARVEY, R.B., BUCKLEY, S.A.,
PHILLIPS, T.D., 1998. Aflatoxicosis in Turkey Poults is Prevented by
Treatment of Naturally Contaminated Corn with Ozone Generated by
Electrolysis, Poultry Sci., 77, 1094–1102.
McLEAN, M., DUTTON, M.F., 1995. Cellular Interactions and Metabolism of
Aflatoxin: an Update. Pharmac Ther. Vol.65, p:163-192.
MERCADO, C.J., REAL, M.P.N., ROSARIO, R.R. DEL, 1991. Chemical
Detoxification of Aflatoxin Containing Copra. J. Food Science, 56 (3) 733-
735.
MILLER, N., PRETORIOUS, H.E., TRINDER, D.W., 1985. Determination of
Aflatoxins in Vegetable Oils. J. Assoc. Off. Ana. Chem. 68: 136–139.
MOERCK, K.E., McELFRESH, P.A., WOHLMAN, HILTON, B.W., 1980.
Aflatoxin Destruction in Corn Using Sodium Bisulfite, Sodium Hydroxide
and Aqueous Ammonia. J. Food Prot. 43:571-574.
MOSS, M.O., 1992. Secondory Metabolism and Food Intoxification, Moulds.
J.Applied Bact. Symposium Supplement. 73:80-88.
NELSON, D.B., 1980. Aflatoxins and Reye’s Syndrome: a Case Control Study.
Pediatrics, 66:865–869.
NOUT, M.J.R., 1989. Effect of Rhizopus and Neurospora spp. on Growth of
Aspergillus flavus and A. parasiticus and Accumulation of Aflatoxin B1 in
Groundnut. Mycol. Res. 93, 518–23.
128
OATLEY, J.T., RARICK, M.D., JI, G.E., LINZ, J. E., 2000. Binding of Aflatoxin
B1 to Bifidobacteria in Vitro, J. Food Prot. 63(8), 1133–6.
OMAYE, S.T., 2004. Food and Nutritional Toxicology. CRC Press, ISBN 1-58716-
071-4, 308p.
ÖZAY, G. 1988. Gıdalarda Mikotoksinler ve Detoksifikasyonu. Gıda (13) 137-141.
ÖZKARSLI, M., 2003. Yer Fıstıklarında AFB1 Üzerine Geleneksel Kavurma ve
Mikrodalgada Kavurmanın Etkisi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi. 81s.
ÖZKAYA, Ş., 2001. Ülkemizde Aflatoksin Sorunu Yaşanan Bazı Gıdalarda
AFB1’in Azaltılması veya Giderilmesinde Flavobacterium aurantiacum’un
Etkinliğinin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Doktora Tezi. Ankara. 86s.
ÖZKAYA, Ş., TAYDAŞ, E. E., BAŞARAN, A., AVCI, B., HIZLI, S., 1999.
Mikotoksin Kurs Notları. Tarım Orman ve Köy İşleri Bakanlığı, Ankara İl
Kontrol Labaratuvarı 7-14 Ağustos 1999. Mikotoksin Analiz Kursu. Ankara.
PAPP, E., H-OTTA, K., ZAROY, G., MINSOVICS, E., 2002. Liquid
Chromotografic Determination of Aflatoxins. Microchemical Journal.
(73):39-46.
PARK, D.L., 1993. Controlling Aflatoxin in Food and Feed. Food Tech.. 47:92-96.
PARK, D.L., JEMMALI, M., FRAYSSINET, C., LA-FARGE- FRAYSSINET,
C., YVON, M., 1981. Decontamination of Aflatoxin-contaminated Peanut
Meal Using Monomethylamine-calcium Hydroxide. J. Am. Oil Chem. Soc.
58:995-1002.
PARK, D.L., LEE, L.S., KOLTUN, S.P., 1984. Distribution of Ammonia Treated
Aflatoxin Reaction Products in Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc.
61:1071-1074.
PARK, D.L., NJAPAU, H., 1989. Contamination Issues and Padding. J. Am. Oil
Chem. Soc., 66:1402-1405.
129
PARKER, W.A., MELNICK, D., 1966. Absence of Aflatoxin from Refined
Vegetable Oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 43, 635-638.
PELTONEN, K., EL NEZAMI, H., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 2000.
Binding of Aflatoxin B1 by Probiotic Bacteria. J.Food and Agric., 80: 1942-
1945.
PITT, J.I., 2000. Toxigenic fungi: Which are Important? Medical Mycology,
38: 17-22.
PIVA, G., GALVANO, F., PIETRI, A., PIVA, A., 1995. Detoxification Methods
of Aflatoxin. A Review. Nutr. Res., 15(5):767-776.
PLACINTA, C.M., D’MELLO, J.P.F., Mac DONALDS, A.M.C., 1999. A
Review of Worldwide Contamination of Cereal Grains and Animal Feed with
Fusarium Mycotoxins. Anim. Feed Sci. Technol., 78:21-37.
PONS, Jr.W.A., CUCULLU, A.F., LEE, L.S., JANSSEN, H.J., GOLDBLATT,
L.A., 1972. Kinetic Study of Acid Catalyzed Conversion of Aflatoxin B1 and
G1 to B2a and G2a. J.Am.Oil Chem.Soc. 49:124-128.
PREIDES, M., EL NEZAMI, H., PELTANEN, K., SALMINEN, S., AHOKAS,
J., 2000. Ability of Dairy Strains of Lactic Acid Bacteria to Bind AFM1 in a
Food Model. J.Food Prot.. Vol. 63, No.65, p:645-650.
PRICE, R.L., JORGERSEN, K.V., 1985. Effects of Processing on Aflatoxin
Levels and on Mutagenic Potential of Tortillas Made from Naturaly
Contamined Corn. J.Food Sci., 50:347-349.
PRUDENTE, A.D., KING, J.M., 2002. Efficacy and Safety Evaluation of
Ozonation to Degrade Aflatoxin in Corn. J. Food Sci., 67(8), 2866–2872.
RESMI GAZETE, 2008. Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğ. Tebliğ
No: 2008/34. Resmi Gazete 11.06.2008 – 26903.
RICHARD, J. L., 2007. Some Major Mycotoxins and their Mycotoxicoses-An
Overview. International J.Food Microbiology, 119:3–10.
130
RUSTOM, I. Y. S., 1997. Aflatoxin in Food and Feed: Occurrence, Legislation and
Inactivation by Physical methods. Food Chem., Vol. 59 No. 1, p:57-67.
SAMARAJEEWA, U., GAMAGE, T.V., 1988. Combination of Solvent and
Radiation Effects on Degradation of Aflatoxin B1. Mircen J. Appll.
Microbiol. Biotechnol. 4:203-208.
SAMARAJEEWA, U., SEN, A.C., COHEN, M.D., WEI, C.I., 1990.
Detoxification of Aflatoxins in Foods and Feeds by Physical and Chemical
Methods. J.Food Prot., 53(6):489-501.
SCOTT, P.M., 1998. Industrial and Farm Detoxification Methods of Aflatoxins. A
Review. Nutr. Res., 15:767-776
SHANK, R.C., 1971. Aflatoxins in Autopsy of Specimens from Thai Children with
an Acute Disease of Unknown Etiology. Food Cosmet. Toxicol., 9:501–507.
SHANK, R.C., 1977. Epidemiology of Aflatoxin Carcino Genesis, in Environmental
Cancer (Kraybill, H.F. and Mehlman, M.A., Eds.). John Wiley & Sons, New
York, p:291–318.
SHANK, R.C.,1981. Mycotoxins and N-Nitroso Compounds: Environmental Risks.
Vol. I, Shank, R.C., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 107–140.
SHANTHA, T., 1999. Fungal Degradation of Aflatoxin B1, Nat. Toxins, 7(5), 175–
178.
SHAPIRA, R.; PASTER, P., 2004. Control of Mycotoxins in Storage and
Techniques for Their Decontamination (Edited by N. Magan and M. Olsen),
Mycotoxins in Food: Detection and Control, CRC Press Boca Raton Boston
New York Washington, DC, p:190-213.
SMILEY, R.D., DRAUGHON, F.A., 2000. Preliminary Evidence that Degradation
of Aflatoxin B1 by Flavobacterium is Enzymatic. J.Food Prot. 63(3), 415-
418.
SMITH, J.E., 2001. Mycotoxins, (Edited by David H. Watson) Food Chemical
Safety, CRC Press ISBN 0-8493-1210-8, p:234-255.
131
SORENSON, W.G., 1981. Aflatoxin in Respirable Corn Dust Particles. J. Toxicol.
Environ. Health, 7:669–672, 1981.
STARK, A.A., 2001. Mechanisms of Action of Aflatoxin B1 at the Biochemical and
Molecular Levels. (Edited by Charles L. Wilson and Samir Droby.),
Microbial Food Contamination. CRC Press. ISBN 0-8493-2229-4, p:81-94.
SUZUKI, T., NORO, T., KAWAMURA, Y., FUKUNAGA, K., WATANABE,
M., OHTA, M., SUGIUE, H., SATO, Y., KOHNO, M., HOTTA, K.,
2002. Decontamination of Aflatoxin Forming Fungus and Elimination of
Aflatoxin Mutagenicity with Electrolyzed NaCl Anode Solution. J. Agric.
Food Chem., 50, 633–641.
SWEENEY, M.J., DOBSON, A.D.W., 1999. Molecular Biology of Mycotoxin
Biosynthesis. FEMS Microbiology Letters. 175:149-163.
ŞAHİN, İ., 1990. Mikrobiyolojiye Giriş. Eser Matbaası. 237s
TAKASHI, T., 1993. Aflatoxin Contamination in Nutmeg: Analysis of Interfering
TLC Spots. J.Food Sci.Vol. 58 No:1 p:197.
TEBBUTT, P., 1995. Basic Mathematics For Chemists. John Willey&Songs,
Chichester, England, 244p.
TEMİZ, A., 1994. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Şafak Matbaacılık
Ltd. Şti. Birinci Baskı.266s. Ankara.
TENIOLA, O.D., ADDO, P.A., BROST, I.M., FÄRBER, P., JANY, K.D.,
ALBERTS, J.F., VAN ZYL, W.H., STEYN, P.S., HOLZAPFEL, W.H.,
2005. Degradation of Aflatoxin B1 by Cell-Free Extracts of Rhodococcus
erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov. DSM44556T.
International Journal of Food Microbiology, 105:111 – 117.
TGK, 2009. Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri
Hakkında Tebliğ (TEBLİĞ NO: 2008/26) Resmi Gazete Tarihi: 16 Şubat
2009 - Sayı : 27143.
132
TORRES, P., GOMEZ-ORTIZ, M., RAMIREZ-WENG, B., 2001. Revising the
Role of pH and Thermal Treatments in Aflatoxin Content Reduction During
the Tortilla and Deep Frying Processes. J. Agric. Food Chem., 49, 2825–
2829.
TUNAİL, N., 2000. Mikrobiyel Enfeksiyonlar ve İntoksikasyonlar. (Editör:
A.Ü.Z.F. Gıda Müh. Öğretim Üyeleri) Gıda Mikrobiyolojisi ve
Uygulamaları. Geliştirilmiş 2. Baskı. Sim Matbaacılık Ltd. Şti. Ankara s:81-
185.
UENO, Y. 1985. The Toxicology of Mycotoxins. Critical Reviews in Toxicology.
14(2):99-132.
VAN GENDEREN, H. 1997. Adverse Effects of Naturally Occurring Nonnutritive
Substances (Edited by John De Vries). Food Safety and Toxicity, CRC Press,
ISBN 0-8493-9488-0, p:153-168.
VAN IMPE, J.F., NICOLAI, B.M, MARTENS, T., DE BAERDEMAEKER, J.,
VANDEWALLE, J., 1992. Dynamic Mathematical Model to Predict
Microbial Growth and Inactivation during Food Processing, Appl. Environ.
Microbiol., 58(9):2901-2909.
VAN NIEUWENHUIZE, J.P., 1973. Aflatoxinen: Epidemiologish Onderzoek Naar
Carcino Geniteit bij Langdurige “Low Level” Exposite van eon
Fabriekspopulatie. T. Soc. Geneesk, 51:754–760.
VAN RENSBURG, S.J., 1977. Role of Epidemiology in Causation of Mycotoxin
Health Risk, in Mycotoxins in Human and Animal Health, Rodricks (J.V.,
Hesseltine, C.W., and Mehlman, M.A., Eds.) Pathotox, Park Forest South, IL,
pp. 699–711.
WANG, J.S., GROOPMAN, J.D., 1999. DNA Damage by Mycotoxins. Mutation
Researh. 424:167-181.
WATANABE, C.M.H., TOWNSEND, C.A., 2002. Initial Characterization of a
tType I Fatty Acid Synthase and Polyketide Synthase Multienzyme Complex
NorS in the Biosynthesis of Aflatoxin B1. Chem Biol. ;9 (9):981-988.
133
WATTANAPAT, R., NAKAYAMA, T., BEUCHAT, L.R., 1995. Characteristics
of Acid Hydrolysate from Defatted Peanut Flour. J. Food Sci., 60, 443–445.
WATTS, B.M., YLIMAKI, G.L., JEFFERY, L.E., ELIAS, L.G., 1989. Basic
Sensory Methods for Food Evaluation. The International Development
Research Center Ottowa, Canada, 160p.
WEEKS, O.B., 1974. Flavobacterium: Bergey’s Manuel of Determinative
Bacteriology, Vol:1, (Edited by Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E.) The
Williams & Wilkins Company, Baltimore, p:357-364.
WEI, C.I., COOK, D.L., KIRK, J.R., 1985. Use of Chlorine Compounds in the
Food Industry. Food Technol. 39:107-115.
WENG, C.Y., MARTINEZ, A.J., PARK, D.L., 1994. Efficacy and Permanency of
Ammonia Treatment in Reducing Aflatoxin Levels in Corn. Food Addit.
Contamin. 11, 649–658.
WILLIAMS, K.R., DUTTON, M.F., 1988. Destruction of Aflatoxin During the
Production of Hydrolysed Vegetable Protein, J. Food Prot., 51, 887–891.
YAGEN, B., HUTCHINS, J.E., COX, R.H., HAGLER, W.M., HAMILTON,
P.B., 1989. Aflatoxin B1S: revised Structure for the Sodium Sulfanate
Formed by Destruction of Aflatoxin B1 with Sodium Bisulfite. J. Food Prot.
52:574-577.
YASSIN, A.F., SCHAAL, K.P., 2005. Reclassification of Nocardia
corynebacterioides Serrano et al. 1972 (Approved Lists 1980) as
Rhodococcus corynebacterioides comb. nov. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology (2005), 55, 1345–1348.
YILMAZ, A., ÖZAY, G., 2001. Gıda ve Yemlerde Mikotoksin Detoksifikasyonu.
Gıda Dergisi, 7:80-84.
ZORLUGENÇ, B., KIROĞLU ZORLUGENÇ, F., ÖZTEKİN, S., EVLİYA,
İ.B., 2008. The Influence of Gaseous Ozone and Ozonated Water on
134
Microbial Flora and Degradation of Aflatoxin B1 in Dried Figs. Food and
Chem. Toxicology. 46, 3593-3597. DOI: 10.1016/j.fct.2008.09.003
ZWIETERING, M.H., JONGENBUGER, I., ROMBOUTS, F.M., VAN’T
RIET, K., 1990. Modelling of the Bacterial Growth Curve. Appl. Environ.
Microbiol. 56:1875-1881.
135
ÖZGEÇMİŞ
1971 yılında Adana’da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi aynı şehirde
tamamladım. 1990 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünü
kazandım ve 1994 yılında bu bölümden mezun oldum. Aynı yıl Çukurova
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında yüksek
lisans öğrenimime başladım. 1996 yılında Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında
araştırma görevlisi olarak göreve başladım. 1999 yılında yüksek lisans öğrenimi
tamamladım ve aynı yıl Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında Doktora
öğrenimine hak kazandım. 2005 yılında doktora öğrenimime ara vererek askerlik
görevimi tamamladım. 2009 yılında, Ç.Ü. Ziraat Fakültesine mühendis olarak
atandım. Halen Ç.Ü. Biyoteknoloji Merkezinde, Gıda Yüksek Mühendisi olarak
çalışmaktayım.
EK-1
136
EKLER
2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 0. saat kontrol (öğütülmüş fındık) örneğine ait
kromatogram
500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 6. saat PFT örneğine ait kromatogram
EK-1
137
500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 24.saat bütün kırmızı biber örneğine ait kromatogram
1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 24. saat öğütülmüş kırmızı biber örneğine ait
kromatogram
EK-1
138
2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 48. saat bütün mısır örneklerine ait kromatogram
500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 6. saat bütün siyah zeytin örneğine ait kromatogram
EK-1
139
500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat bütün soya fasulyesine ait kromatogram
1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat öğütülmüş soya fasulyesine ait kromatogram
EK-1
140
500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 0. saat öğütülmüş kuru incir örneğine ait
kromatogram
1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat bütün kuru incir örneğine ait kromatogram
EK-1
141
2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 48. saat öğütülmüş fındık örneğine ait kromatogram