UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL BUAH Phaleria...
Transcript of UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL BUAH Phaleria...
UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL
BUAH Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl TERHADAP
LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE
SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)
Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA KEDOKTERAN
OLEH :
AYU RESKIANINGSIH
NIM: 1111103000092
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI
SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1435 H/2014 M
v
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian ini. Penulis
menyadari bahwa laporan ini dapat terselesaikan tepat waktu berkat dukungan dan
bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada :
1. Prof. Dr (hc). dr. M. K. Tadjudin, SpAnd, dr.H.M. Djauhari Widjayakusumah,
AIF.,PFK, Dr.H.Arif Sumantri, SKM, M.Kes dan Dr. Delina Hasan, M.Kes, Apt
selaku Dekan dan pembantu Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. dr. Witri Ardini, M.Gizi, SpGK selaku Ketua Program Studi Pendidikan
Dokter atas bimbingan yang diberikan selama penulis menempuh pendidikan di
PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ini.
3. dr. Nurul Hiedayati, PhD selaku pembimbing 1 yang telah banyak mencurahkan
waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam melakukan
penelitian dan menyusun laporan penelitian ini. dr. Nurul Hiedayati, PhD juga
selaku PJ Laboratorium Farmakologi yang telah memberikan izin penggunaan
laboratorium bahkan walau telah lewat jam penggunaan.
4. Bapak Supandi, M.Si, Apt selaku pembimbing 2 yang telah memberikan masukan
judul penelitian dan banyak mencurahkan waktu, pikiran dan tenaga untuk
membimbing penulis dalam melakukan penelitian dan menyusun laporan
penelitian ini.
5. dr. Flori Ratna Sari, PhD selaku penanggungjawab modul riset yang selalu
mengingatkan penulis untuk segera menyelesaikan penelitian.
6. Kedua orang tua kami, Masnur, S.Pd dan E r n i, S.Pd yang selalu mencurahkan
kasih sayangnya, selalu memberikan bimbingan dan arahan dalam melakukan hal
kebaikan serta selalu memberikan semangat untuk dalam menempuh pendidikan.
7. Pusat Konservasi Tumbuhan-Kebun Raya Bogor, Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) yang telah bersedia memberikan surat keterangan tumbuhan
vi
sehingga buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl dapat digunakan dalam
penelitian ini.
8. Ibu Puteri Amelia, M.Farm, Apt selaku PJ laboratorium Farmakognosi dan
Fitofarmaka dan Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku PJ laboratorium Penelitian I yang
telah memberikan izin untuk penggunaan laboratorium.
9. Mbak Rani, Kak Lisna, Mas Rachmadi, Mas Panji, dan Mbak Ai sebagai laboran
yang telah bersedia membantu penulisan dalam pengambilan data.
10. Teman–teman sekelompok riset, Akbar Sepadan, Feby Wulandari dan Nurul
Khafidz S. Terima kasih atas kerja sama dan dukungannya selama 1 tahun untuk
menyelesaikan penelitian bersama–sama.
11. Teman-teman Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2011, dan semua pihak
yang telah membantu dan mendukung sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.
Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari kata sempurna.
Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik dari berbagai pihak. Demikian
laporan penelitian ini penulis susun, semoga dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan.
Ciputat, 15 September 2014
Penulis
vii
ABSTRAK
Ayu Reskianingsih. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak
Metanol Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl Terhadap Larva Artemia salina
Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2014
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) merupakan tumbuhan dari famili
Thymelaeceae. Tanaman ini mengandung beberapa senyawa aktif sehingga memiliki
potensi sebagai antikanker. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengetahui potensi
toksisitas akut ekstrak metanol buah mahkota dewa terhadap larva Artemia salina Leach
yang akan ditunjukkan oleh nilai LC50 dengan menggunakan metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT). Uji ini menggunakan 5 konsentrasi ekstrak yaitu 500 ppm, 100
ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm serta kontrol negatif dengan menggunakan air laut.
Tiap konsentrasi berisi 10 ekor larva. Dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Kematian
larva diamati setelah 24 pemberian ekstrak. Nilai LC50 dari ekstrak metanol buah
mahkota dewa adalah 81,09 ppm. Hasil LC50 < 1000 ppm menunjukkan bahwa ekstrak
metanol buah mahkota dewa bersifat toksik dan memiliki potensi sebagai antikanker.
Kata kunci : Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl), Uji Toksisitas Akut, Artemia salina
Leach, LC50
ABSTRACT
Ayu Reskianingsih. Medical Education Program. Acute Toxicity Test of Methanol
Extract of Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl on Artemia salina Leach Larva using
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. 2014
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) is a plant from Thymelaeceae
family. This plant contain some active chemical compunds that have potency as
anticancer. The aim of this study is to investigate acute toxicity potency of methanol
extract of mahkota dewa fruit on Artemia salina Leach Larva shown by LC50 using
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. Five concentrations of extract used in this
test: 500 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm and negative control using sea
water. Each concentration contain ten larvas and performed three replications. Death
of larva observed 24 hours after giving the extract. LC50 of methanol extract mahkota
dewa fruit is on 81,09 ppm. LC50 < 1000 ppm showed that methanol extract of mahkota
dewa fruit is toxic and have potency as anticancer.
Keywords: Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl), Acute Toxicity Test, Artemia salina
Leach, LC50
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL ................................................................................................ i
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................... ii
LEMBAR PENGESAHAN PEMBIMBING ..................................................... iii
PENGESAHAN PANITIA UJIAN ................................................................... iv
KATA PENGANTAR ......................................................................................... v
ABSTRAK ........................................................................................................vii
DAFTAR ISI ..................................................................................................... viii
DAFTAR TABEL ................................................................................................. x
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii
BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1
1.1. Latar Belakang .................................................................................................. 1
1.2. Rumusan Masalah............................................................................................. 2
1.3. Tujuan Penelitian .............................................................................................. 2
1.3.1. Tujuan umum ................................................................................................. 2
1.3.2. Tujuan khusus ................................................................................................ 2
1.4. Manfaat penelitian ........................................................................................ 2
1.4.1. Bagi masyarakat ............................................................................................ 2
1.4.2. Bagi instutusi ................................................................................................. 2
1.4.3. Bagi peneliti ................................................................................................... 3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 4
2.1. Landasan teori................................................................................................... 4
2.1.1. Obat tradisional............................................................................................ 4
2.1.2. Mahkota dewa (Phaeria macrocarpa (Scheff) Boerl) ................................ 5
2.1.3. Simplisia ...................................................................................................... 7
2.1.4. Ekstraksi ..................................................................................................... 9
2.1.5. Toksikologi ................................................................................................ 13
2.1.6. Uji toksisitas akut ..................................................................................... 14
2.1.7. Uji toksisitas jangka pendek ...................................................................... 14
2.1.8. Uji toksisitas jangka panjang .................................................................... 14
2.1.9. Penentuan LC50 .......................................................................................... 14
2.1.10. Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ............................................ 16
2.1.11. Larva udang Artemia salina Leach ............................................................ 17
2.2. Kerangka Konsep ........................................................................................... 23
2.3. Definisi Operasional ....................................................................................... 23
BAB 3. METODE PENELITIAN ...................................................................... 25
3.1. Desain Penelitian ............................................................................................ 25
3.2. Waktu dan Lokasi Penelitian .......................................................................... 25
3.3. Alat dan Bahan Penelitian ............................................................................. 25
3.3.1. Alat Penelitian ............................................................................................ 25
3.3.2. Bahan Penelitian .......................................................................................... 25
ix
3.4. Cara Kerja Penelitian ...................................................................................... 25
3.4.1. Determinasi tanaman ................................................................................... 25
3.4.2. Pembuatan ekstrak metanol buah mahkota dewa ....................................... 26
3.4.3. Penetasan larva udang ................................................................................. 26
3.4.4. Pembuatan konsentrasi ekstrak yang akan diuji ......................................... 26
3.5. Prosedur uji toksisitas dengan metode BSLT ................................................. 27
3.6. Pengolahan dan analisis data .......................................................................... 28
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 29
4.1. Hasil ekstraksi buah mahkota dewa................................................................ 29
4.2. Hasil uji BSLT ............................................................................................... 30
4.3. Penetapan LC50 .............................................................................................. 34
4.4. Keterbatasan Penelitian ................................................................................ 37
BAB 5. PENUTUP ............................................................................................... 39
5.1. Kesimpulan ..................................................................................................... 39
5.2. Saran ........................................................................................................39
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 40
LAMPIRAN ....................................................................................................... 45
x
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Ilustrasi konsentrasi ekstrak pada well plate ................................................. 28
Tabel 4.1 Data rendemen ekstrak buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl .............. 30
Tabel 4.2 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach ............................... 31
Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan menggunakan metode probit ................................ 34
Tabel 6.1 Tabel probit ................................................................................................... 46
Tabel 6.2 Transformasi persen-probit ........................................................................... 55
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Buah mahkota dewa yang masih di pohonnya ................................ 6
Gambar 2.2. Buah mahkota dewa ......................................................................... 7
Gambar 2.3. Morfologi Artemia salina Leach ................................................... 17
Gambar 2.4. Siklus hidup Artemia salina Leach ................................................. 18
Gambar 2.5. Tahap penetasan telur Artemia ....................................................... 19
Gambar 2.6. Nauplii tingkat Artemia salina Leach ............................................. 20
Gambar 2.7. Bagian tubuh Instar II .................................................................... 20
Gambar 2.8. Bagian tubuh dewasa Artemia ...................................................... 21
Gambar 4.1. Grafik persentase mortalitas larva Artemia salina Leach pada uji
toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff.)
Boerl ............................................................................................... 32
Gambar 4.2 Grafik analisis regresi Linier konsentrasi ekstrak metanol buah
Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl ........................................... 35
Gambar 6.1. Alur penelitian ............................................................................... 45
Gambar 6.2. Keterangan determinasi tanaman .................................................. 47
Gambar 6.3 Keterangan bahan penelitian telur artemia .................................... 48
Gambar 6.4 Penghalusan simplisia .................................................................... 49
Gambar 6.5. Destilasi pelarut metanol ............................................................. 49
Gambar 6.6. Proses pemasukan simplisia ke botol maserasi ............................. 49
Gambar 6.7. Botol maserasi .............................................................................. 49
Gambar 6.8. Proses evaporasi dengan rotatory evaporator .............................. 49
Gambar 6.9. Ekstrak kental buah mahkota dewa ............................................. 49
Gambar 6.10. Neraca analitik ............................................................................. 50
Gambar 6.11. Proses penyaringan ....................................................................... 50
Gambar 6.12. Larutan induk 20.000 ppm ............................................................. 50
Gambar 6.13. Larutan ekstrak berbagai konsentrasi uji ...................................... 50
Gambar 6.14. Wadah penetasan telur artemia ..................................................... 50
Gambar 6.15. Well plate uji BSLT ...................................................................... 50
Gambar 6.16. Larva Artemia salina Leach di bawah mikroskop ........................ 57
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Alur penelitian ............................................................................... 45
Lampiran 2 Metode probit ................................................................................ 46
Lampiran 3 Surat keterangan determinasi tanaman ......................................... 47
Lampiran 4 Keterangan bahan penelitian telur Artemia .................................. 48
Lampiran 5 Gambar alat dan bahan penelitian ................................................ 49
Lampiran 6 Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol nuah mahkota dewa .... 51
Lampiran 7 Perhitungan penggunaan DMSO .................................................. 53
Lampiran 8 Transformasi persen-probit ............................................................ 55
Lampiran 9 Identifikasi Larva Artemia salina Leach ....................................... 57
Lampiran 10 Daftar riwayat hidup ....................................................................58
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penggunaan suatu jenis tanaman sebagai obat herbal merupakan suatu alternatif yang
dilakukan oleh masyarakat untuk mendapatkan pengobatan. Tanaman herbal yang diduga
memiliki potensi untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit terlebih dahulu harus
melewati beberapa tahap sebelum akhirnya dapat dijadikan suatu sediaan obat. Sesuai
dengan Permenkes No.760/Menkes/Per/IX/1992, yang membahas tentang obat tradisional
dan fitofarmaka, maka setiap bahan alam yang akan digunakan sebagai sumber obat, harus
melewati beberapa pengujian sehingga dapat memenuhi syarat yang telah ditentukan dan
aman untuk dikonsumsi masyarakat luas.1
Mahkota dewa adalah salah satu tanaman yang diharapkan berkhasiat sebagai
antikanker. Mahkota dewa adalah tanaman yang paling banyak tumbuh di benua Eropa dan
Asia. Tanaman ini memiliki senyawa aktif yaitu alkaloid, flavonoid, fenol/difenol, tanin
dan senyawa sterol/terpenoid. Senyawa-senyawa tersebut telah terbukti memiliki
mekanisme apoptosis selular dan sebagai antiproliferasi. 1,2
Tanaman ini terdiri dari akar, batang, daun, buah, biji dan bunga. Hampir seluruh dari
bagian tanaman tersebut telah dimanfaatkan sebagai obat herbal, seperti kulit dan daging
buah mahkota dewa yang telah diteliti oleh Vivi L,dkk telah terbukti berkhasiat sebagai
antikanker. Menurut penelitian Vivi L,dkk tahun 2006, buah Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl memiliki potensi sebagai antiproliferasi dan memiliki fungsi sebagai apoptosis
selular dan LC50 dengan ekstrak metanol 2,46 ppm.1 Ekstrak kasar daging buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl juga memiliki aktivitas inhbisi yang tinggi untuk sel kanker
Leukimia L1210 juga disebutkan pada penelitian Vivi L tahun 2009. Ada juga fraksi etanol
dari Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl ternyata memiliki aktivitas sitotoksik terhadap
kanker serviks Ca Ski.2
Sebagai uji awal untuk mendeteksi kemampuan ekstrak buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl dilakukan uji tokisitas. Pada penelitian ini dilakukan uji toksisitas akut
ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa dengan metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT ). BSLT merupakan suatu metode uji toksisitas akut yang paling mudah, cepat dan
2
murah. Selain itu, BSLT juga merupakan suatu bioassay yang digunakan untuk menguji
senyawa bioaktif pada bahan alam yang diduga berkhasiat sebagai agen anti-tumor.3
Hasil
dari metode BSLT ini biasanya berhubungan dengan suatu uji spesifik sebagai agen anti-
tumor atau anti-kanker. Jika pada uji toksisitas menunjukkan LC50 dibawah 1000 ppm
berarti bahan tersebut memiliki potensi sebagai antikanker.4
Untuk membuktikan bahwa
ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl mempunyai efek anti kanker
yang sangat potensial maka dilakukan peneltian ini.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah ekstrak metanol daging buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki
aktivitas toksik terhadap larva Artemia salina Leach ?
1.3 Tujuan
1.3.1. Tujuan Umum
Untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daging buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.
1.3.2. Tujuan Khusus
1.3.2.1 Untuk mengetahui rendemen ekstrak metanol daging buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl.
1.3.2.2 Untuk mengetahui LC50 ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl.
1.4 Manfaat
1.4.1 Bagi Masyarakat
Menambah informasi mengenai tumbuhan mahkota dewa yang memiliki
potensi sebagai antikanker.
1.4.2 Bagi Institusi
a) Penelitian ini dapat menambah jumlah dan jenis penelitian yang telah
dilakukan oleh mahasiswa kedokteran di Fakultas kedokteran dan Kesehatan
3
Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah Jakarta.
b) Penelitian ini dapat menambah jumlah referensi dan kepustakaan bagi
penelitian berikutnya.
1.4.3 Bagi Peneliti
a) Mengetahui manfaat dari tanaman mahkota dewa khususnya dalam bidang
farmakologi.
b) Mendapatkan pengalaman melakukan penelitian dengan menggunakan metode
eksperimental terutama dalam bidang kesehatan khususnya bidang
farmakologi.
c) Penelitian ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana
Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
4
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Landasan Teori
2.1.1 Obat Tradisional
Obat tradisional adalah warisan bangsa Indonesia yang telah digunakan
sejak berabad-abad yang lalu untuk memelihara dan meningkatkan kesehatan
serta mencegah dan mengobati penyakit. Obat tradisional kini masih banyak
digunakan di Indonesia dan negara yang lain, obat ini telah membuktikan
khasiatnya sebagai obat herbal dalam memelihara kesehatan.5
WHO merekomendasikan penggunaan obat tradisional termasuk herbal
ditujukan pada penderita penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker, hal
tersebut untuk memelihara kesehatan masyarakat. Di Indonesia sendiri telah
berkembang berbagai macam obat tradisional, maka untuk mempermudah
mengontrol dan mengawas obat–obatan yang beredar Badan Pengawas Obat dan
Makanan (BPOM) mengelompokkan dalam tiga sediaan yaitu sediaan jamu,
sediaan herbal terstandar dan sediaan fitofarmaka. Dengan persyaratan masing–
masing sediaan yaitu pada sediaan jamu untuk pemakaiannya secara empirik
berdasarkan pengalaman, sediaan herbal terstandar bahan bakunya harus sudah
distandarisasi dan sudah diuji farmakologi secara eksperimental dan untuk
sediaan fitofarmaka sama dengan obat modern bahan bakunya harus
distandarisasi dan harus melalui uji klinik.6
Sesuai dengan Keputusan Menteri Kesehatan RI No.
761/Menkes/SK/IX/1992 tentang pedoman fitofarmaka. Fitofarmaka adalah
sediaan obat yang telah terbukti tingkat keamanan dan manfaatnya serta
simplisia atau sediaan galenik yang telah diuji dan memenuhi standar yang
berlaku merupakan bahan bakunya.7 Sedangkan obat–obat tradisional yang
sekarang beredar di masyarakat tidak semuanya terjamin keamanannya untuk
dikonsumsi sama halnya dengan obat kimia. Oleh karena itu, perlu dilakukan
berbagai macam uji untuk mengetahui tingkat keamanan dari suatu obat
tradisional untuk dijadikan sediaaan fitofarmaka.8
5
Karena fitofarmaka harus dipertanggung jawabkan keamanan dan
khasiatnya ketika digunakan oleh manusia maka dilakukan serangkaian tahap
pengujian dan pengembangan secara sistematik sebagai berikut :7
a) Pemilihan
b) Pengujian Farmakologik
c) Pengujian Toksisitas
d) Pengujian Farmakodinamik
e) Pengembangan Sediaan
f) Penapisan Fitokimia dan Standarisasi Sediaan
g) Pengujiaan klinik
Setelah fitofarmaka terbukti keamanan dan khasiatnya untuk penggunaan
oleh manusia maka perlu dilakukan penelitian dan pengembangan lebih lanjut.7
2.1.2 Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl)
Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl merupakan tanaman yang banyak
tumbuh daerah Papua.9 Adapun sistematika dari tanaman ini yaitu tanaman ini
tergolong dalam : 1
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Bangsa : Thymelaeales
Familia : Thymelaeceae
Marga : Phaleria
Jenis : Phaleria macrocarpa
6
Gambar 2.1 Buah mahkota dewa yang masih di pohonnya
Sumber : Dalimartha,S. Atlas tumbuhan obat Indonesia. Jakarta : Puspa Swara; 2003
Tanaman ini tumbuh di sekitar daerah tropis dengan tinggi kira–kira 1–6
meter. Bagian terdiri dari batang, daun, bunga dan buah. Bentuk buah yang
dimiliki yaitu ”eclipse” dengan diameter sekitar 3 cm. Buah dari Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl berwarna hijau saat masih muda dan akan berubah
menjadi berwarna merah ketika matang.10
Pada beberapa studi menyebutkan bahwa Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl memiliki khasiat pada berbagai penyakit seperti penyakit pada hati,
jantung, ginjal, diabetes melitus, kanker, impotensi, hemoroid, alergi, penyakit
vaskular, stroke, migran, jerawat dan berbagai penyakit kulit.1,9,10
Selain itu, Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl juga memiliki khasiat yang
lain yaitu antihistamin, efek hipoglikemik, antioksidan, antibakteri, antiinflamasi
dan antikanker.2,10,11,12,13
Dengan berbagai khasiat yang dimiliki oleh buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl telah menjadikannya salah satu tanaman yang memiliki potensial
untuk dijadikan obat baru. Maka dari itu, Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
merupakan salah satu tanaman yang paling banyak diteliti oleh para peneliti
obat.
7
Gambar 2.2 Buah mahkota dewa
Sumber : Dalimartha,S. Atlas tumbuhan obat Indonesia. Jakarta : Puspa Swara; 2003
Dari data yang ada menunjukkan bahwa buah Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl memiliki kemampuan untuk mengobati kanker.2 Pada salah satu sumber
dikatakan bahwa buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki
kemampuan untuk efek sitotoksik pada kanker leukimia dan kanker serviks Ca
Ski.2
Hal ini terjadi karena buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
mengandung flavonoid, terpenoid, saponin, polifenol, alkaloid, tanin dan
resin.2,13
Pada penelitian yang dilakukan oleh Vivi L dkk (2006), ekstrak kasar n-
heksan, etilasetat dan metanol dari buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
memiliki LC50 berturut–turut adalah 11,83 ppm, 10,99 ppm dan 2,46 ppm. Hal
ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar metanol memiliki efek toksik yang kuat.1
2.1.3 Simplisia
Menurut buku “Materia Medika Indonesia” simplisia adalah bahan alami
yang akan digunakan sebagai obat tetapi belum mengalami pengolahan apapun
selain pengeringan. Dalam fungsinya sebagai bahan baku obat, maka simplisia
harus memenuhi beberapa parameter standar umum yaitu : 14
a) Harus memiliki 3 kriteria mutu suatu bahan yaitu kebenaran jenis
(identifikasi), kemurnian (bebas dari kontaminasi kimia dan biologis) dan
aturan penstabilan (wadah, penyimpanan dan transportasi).
b) Memenuhi 3 kriteria paradigma obat pada umumnya yaitu Quality-Safety-
Efficacy (Mutu-Aman-Manfaat).
8
c) Mempunyai spesifikasi kimia yaitu informasi mengenai jenis dan kadar dari
senyawa yang terkandung di dalamnya.
Pembuatan simplisia terbagi 2 yaitu pembuatan simplisia secara umum dan
secara khusus. Pembuatan simplisia secara khusus dilakukan apabila simplisia
mengalami kondisi tertentu sesuai dengan asal simplisia. Sedangkan pembuatan
simplisia secara umum merupakan cara yang paling sering digunakan. Adapun
tahapan pembuatan simplisia adalah sebagai berikut : 15
a) Pengumpulan bahan baku
Pemilihan bahan baku simplisia berupa biji, buah, daun pucuk, daun tua,
kulit batang, umbi lapis, dan rimpang. Pengumpulan bahan baku ini
dilakukan sesuai dengan keperluan.
b) Sortasi basah
Sortasi basah untuk membersihkan kotoran yang menempel pada bahan
simplisia. Hal ini dilakukan untuk mengurangi kontaminasi mikrobiologi.
c) Pencucian
Pencucian juga bertujuan mengurang kontaminasi dari mikroba. Pencucian
dilakukan menggunakan air mengalir agar air hasil cucian langsung
terbuang dan tidak mengkontaminasi ulang bahan yang telah dicuci.
d) Perajangan
Perajangan dilakukan sebelum proses pengeringan, hal ini bertujuan untuk
memudahkan pengeringan. Perajangan dapat dilakukan dengan
menggunakan pisau ataupun mesin rajang.
e) Pengeringan
Pengeringan dapat membantu menjaga kualitas dari bahan simplisia. Karena
dapat mengurangi kandungan air, dengan begitu proses enzimatik yang
adapun terhenti. Pengeringan biasanya dilakukan pada suhu 30°–90° C
tetapi apabila bahan simplisia mengandung bahan aktif yang tidah tahan
panas maka suhu yang tepat adalah 30°-45° C.
f) Sortasi kering
Tahap ini bertujuan untuk memisahkan benda asing yang ada setelah
pengeringan.
9
Setelah melalui proses di atas, maka simplisia yang ada siap untuk proses
berikutnya. Tetapi ketika proses setelahnya belum dilaksanakan sebaiknya
simplisia di dalam wadah yang tertutup dan diletakkan di tempat yang memiliki
suhu kamar 15°-30° C.15
2.1.4 Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pemisahan bahan kimia dari campurannya dengan
menggunakan pelarut sehingga bahan yang terlarut akan berpisah dengan bahan
yang tidak terlarut.15,16
Sedangkan ekstrak adalah suatu bahan atau sediaan yang
diperoleh dari hasil ekstraksi tanaman obat.15
Ekstrak secara umum dibagi dalam beberapa kelompok yaitu :15
1. Ekstrak air
Menggunakan cairan pengekstraksi sebagai pelarut ekstrak. Adapun jenis–
jenis pembuatan ekstrak cair adalah sebagai berikut :
a. Decoctum
Cara ini dilakukan dengan menggunakan perbandingan dan derajat
kehalusan penyari. Kemudian penyari dipanaskan dengan suhu 90-95°
untuk 30 menit.
b. Infusum
Cara ini kurang lebih sama dengan decoctum hanya perbedaan pada
waktu ketika dilakukan penyarian yaitu sekitar 15 menit.
c. Coque
Penyarian dilakukan dengan merebus simplisia pada air yang berada
langsung di atas api lalu setelah itu dijadikan obat baik dengan ampas
maupun hanya cairannya saja.
d. Seduhan
Cara ini adalah dengan memasukkan simplisia ke dalam air mendidih
selama 5–10 menit. Lalu yang digunakan adalah hasil seduhannya.
e. Maserasi
Pada cara ini, simplisia direndam dengan menggunakan berbagai macam
pelarut dalam beberapa waktu pada suhu kamar.
10
2. Tinktura
Adalah ekstrak yang terbuat dari simplisia yang telah direndam
menggunakan berbagai konsentrasi etanol kemudian dilakukan penyarian.
3. Ekstrak cair
Ekstrak ini sama saja dengan tinktura yaitu sama–sama cair namun
perbedaannya adalah ekstrak ini lebih padat dibandingkan dengan tinktura.
4. Ekstrak encer
Sama dengan ekstrak cair namun simplisia dan hasil akhirnya memiliki
perbedaan konsentrasi.
5. Ekstrak kental
Ekstrak yang didapatkan dari ekstrak cair yang diuapkan untuk
menghilangkan penyarinya dan hanya meninggalkan bahan aktif.
6. Ekstrak kering
Ekstrak yang dikeringkan pada temperatur dan tekanan yang rendah, adapun
konsentrasinya tidak sesuai yang diinginkan maka bisa ditambahkan bahan
inert.
7. Ekstrak minyak
Simplisia yang ada disuspensi dengan perbandingan dan derajat halus
tertentu di dalam minyak yang telah dikeringkan secara maserasi.
8. Oleoresin
Sediaan yang dibuat dengan menggunakan pelarut yang sama seperti etanol-
etil asetat.
Proses pembuatan ekstrak terdiri dari 6 langkah yaitu :14
a) Pembuatan simplisia dan klasifikasinya
Pembuatan simplisia merupakan tahap awal untuk pembuatan ekstrak.
Derajat kehalusan simplisia dapat mempengaruhi mutu dari ekstrak tersebut
karena semakin halus serbuk simplisia maka proses ekstraksi semakin
efektif dan efisien.
11
b) Cairan pelarut
Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi harus mudah untuk menarik
senyawa aktif yang ada pada simplisia dan juga bersifat tidak merusak
bahan aktif itu sendiri. Faktor–faktor yang menjadi pertimbangan dalam
pemilihan pelarut adalah tingkat selektivitas, kemudahan dalam proses,
ekonomis, ramah lingkungan dan aman.
c) Separasi dan kemurnian
Hal ini dilakukan untuk memisahkan senyawa–senyawa lain yang dapat
mempengaruhi senyawa aktif yang diinginkan. Cara yang bisa dilakukan
adalah pengendapan, pemisahan dua cairan tak campur, sentrifugasi,
dekantasi, filtrasi serta proses absorbsi dan penukar ion.
d) Pemekatan/Penguapan (vaporasi/evaporasi)
Pada tahap ini ekstrak diuapkan untuk menguapkan pelarut dan memekatkan
partikel solute sampai ekstrak menjadi kental.
e) Pengeringan ekstrak
Pengeringan ekstrak akan menghasilkan serbuk, massa kering-rapuh, atau
tergantung dari proses yang digunakan untuk menghilangkan pelarut dari
ekstrak.
f) Rendemen
Rendemen ekstrak adalah membandingkan antara berat ekstrak dengan berat
awal simplisia.
Metode pembuatan ekstrak terdiri dari 2, yaitu :15
1. Ekstraksi dengan penggunakan pelarut
a. Cara dingin
Maserasi
Ektraksi yang dilakukan dengan menggunakan pelarut dan diletakkan
pada suhu ruangan. Selama proses perendaman dilakukan pengocokan
beberapa kali dengan tujuan agar pelarut dapat menarik zat aktif dari
bahan simplisia.
12
Perkolasi
Perendaman simplisia dengan menggunakan pelarut yang selalu baru dan
dilakukan pada suhu ruangan sampai didapatkan jumlah ekstrak 1-5 kali
bahan. Proses dari metode perkolasi dimulai dari tahapan pengembangan
bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetasan atau
penampungan ekstrak).
b. Cara panas
Refluks
Ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang mendidih selama waktu
tertentu dan dengan titik didihnya. Cara ini dilakukan secara berulang
sebanyak 3–5 kali untuk menjadi ekstrak yang sempurna (minyak astiri).
Soxhlet
Ekstraksi dengan memasukkan pada alat khusus sehingga ekstraksi
terjadi secarara kontinu dengan jumlah pelarut yang ada relatif konstan.
Digesti
Teknik ekstraksi secara maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu)
pada temperatur 40°–50° C.
Infus
Ekstraksi yang dilakukan di dalam penangas air (bejana infus tercelup
dalam penangas air mendidih) dengan menggunakan temperatur terukur
96°- 98° C selama 15–20 menit.
Dekok
Melakukan ektraksi dengan cara infus tetapi temperaturnya lebih tinggi
yaitu sampai titik didih air dan juga waktunya lebih lama.
2. Destilasi uap
Adalah suatu cara yang dilakukan dengan menguapkan bahan dengan uap
air sehingga kandungannya ikut terdestilasi.
Simplisia yang telah diekstrak akan menghasilkan bahan–bahan aktif.
Bahan–bahan aktif inilah yang akan digunakan untuk melakukan berbagai
percobaan. Bahan aktif yang ada berrgantung pada pelarut yang digunakan. Hal
13
ini karena pelarut yang digunakan akan menarik bahan aktif pada simplisia
ekstrak bergantung pada kepolaran dari senyawa.16
Pemilihan pelarut untuk ekstraksi bergantung pada jumlah kepolaran suatu
senyawa. Senyawa non polar akan larut pada pelarut non polar. Pelarut yang
termasuk pelarut non polar yaitu pelarut n-heksana. Etil-asetat merupakan
pelarut yang bersifat semi polar sehingga akan menarik senyawa yang bersifat
semi polar juga. Senyawa polar akan larut dalam pelarut yang bersifat polar.17
Metanol merupakan pelarut yang bersifat polar dan akan menarik senyawa–
senyawa yang bersifat polar. Seperti terpenoid, saponin, tanin, polifenol,
flavones, dan phenones.16
Setelah dilakukan maserasi, dilakukan pengukuran berat hasil ekstrak yang
didapatkan. Kemudian persentase rendemen ekstrak dihitung dengan
menggunakan rumus.17
Rendemen (%) = Berat ekstrak (gram) x 100 %
Berat Simplisia awal (gram)
2.1.5 Toksikologi
Toksikologi adalah cabang ilmu dari farmakologi yang mempelajari tentang
sifat toksik dari suatu zat kimia yang digunakan dan bagaimana mekanisme
terjadinya efek toksik tersebut baik saat digunakan maupun saat di lingkungan,
baik yang terpapar secara sengaja maupun tidak sengaja sehingga dapat
meminimalkan dampak negatif yang ada.18
Toksisitas merupakan kemampuan suatu zat kimia/beracun (xenobiotoik)
menimbulkan efek toksik tertentu pada makhluk hidup. Uji toksikologi dibagi
menjadi 3 kategori berdasarkan efek lamanya (waktu) pajanan, yaitu : 18
a. Uji toksisitas akut
b. Uji toksisitas jangka pendek (subakut/kronis)
c. Uji toksisitas jangka panjang
Pada penelitian ini, uji yang akan digunakan adalah uji toksisitas akut
sehingga yang akan lebih banyak dibahas adalah uji toksisitas akut.
14
2.1.6 Uji Toksisitas Akut
Toksisitas akut merupakan efek berbahaya yang timbul setelah pemberian
suatu zat atau kombinasi zat dalam dosis tunggal atau berulang selama 24 jam.
Sedangkan uji toksisitas akut adalah suatu cara yang digunakan untuk
menentukan dosis letal median (LC50, LD50) suatu zat serta mekanisme dan
target organnya. LC50 atau LD50 didefinisikan sebagai suatu dosis yang dapat
mematikan 50 % hewan coba dengan dosis tunggal atau berulang dalam waktu
24 jam.18
2.1.7 Uji Toksisitas Jangka Pendek (subakut/subkronik)
Uji toksisitas yang dilakukan dengan pemberian zat secara berulang–ulang,
dilakukan setiap hari tau 5 kali setiap minggu selama waktu kurang 10 % masa
hidup hewan, yaitu 3 bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk anjing. Uji ini
dilakukan untuk mengetahui pengaruh paparan suatu zat pada dosis atau
konsentrasi yang tidak toksik atau yang kemungkinan akan diberikan pada
manusia. Terkadang dosis dinaikkan untuk melihat efek toksik yang lebih
cepat. 18,19
2.1.8 Uji Toksisitas Jangka Panjang (kronis)
Merupakan suatu uji yang dilakukan dengan memberikan zat kimia terhadap
hewan coba secara berulang–ulang selama masi hidup hewan coba atau
disebagian besar masa hidup hewan coba. Misalnya 18 bulan untuk mencit, 24
bulan untuk tikus, dan 7–10 tahun untuk anjing dan monyet. 18,19
Perbedaan antara uji toksisitas akut dan kronis adalah uji toksisitas akut
dilakukan untuk mengetahui efek toksik dari suatu zat kimia sedangkan untuk uji
toksisitas kronis dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan suatu obat.20
2.1.9 Penentuan LC50
Untuk menentukan LC50 dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu :18,19,21
a. Cara Weil
Cara atau metode Weil ini menggunakan tabel Weil yang telah ada, dimana
tabel tersebut berisi tentang respons dan koefisien nomor/angka. Pada tabel
15
Weil juga terdiri dari beberapa kelompok subjek untuk tiap dosis obat,
dimana 4 atau lebih kelompok dosis yang beda dapat digunakan dan jika
diukur tiap kelompok menjadi sama merupakan syarat pada tabel Weil.
Rumus :
Log m = log D + d (f + 1)
Ket :
m = nilai LC50
D = dosis terkecil yang digunakan
d = log dari kelipatan dosis
f = suatu nilai dalam tabel weil, karena angka kematian tertentu (r)
b. Metode Probit
Analisis probit merupakan suatu metode yang telah digunakan secara luas
untuk menghitung toksisitas dengan cara membandingkan setiap konsentrasi
ataupun dosis.20
Metode probit ini terutama digunakan untuk menghitung
nilai LD5 atau LD95, atau jika persentase kematian yang didapatkan pada uji
toksisitas menujukkan kurang dari 16 % atau lebih dari 84 %.
Dalam penggunaan metode probit syaratnya adalah :
1. Mempunyai tabel probit.
2. Menentukan nilai probit dari setiap % kematian tiap kelompok hewan uji.
3. Menentukan log dosis tiap–tiap kelompok.
4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan
log dosis.
5. Memasukkan nilai 5 (probit 50 % kematian hewan uji) pada persamaan
garis lurus.
Persamaannya :
Y = mX + b
Ket :
Y = 5 = nilai probit dari 50 % kematian hewan coba
X = merupakan nilai LC50 ketika diubah menjadi antilog X.
16
c. Cara Farmakope Indonesia III ( FI III)
Jika menggunakan cara FI III, maka syarat yang harus dipenuhi adalah :
1. Dosis yang digunakan merupakan seri dari kelipatan yang tetap
2. Hewan uji yang digunakan harus sama untuk setiap kelompok uji
3. Dosis yang digunakan untuk uji harus mematikan hewan uji mulai dari 0
%-100 % dan hitungan terbatas pada rentang tersebut.
Rumus :
M = a–b (∑ pi–0,5)
Ket :
M = log LD50
A = logaritma dosis terendah yang masih menyebabkan jumlah kematian
100 % tiap kelompok
b = beda log dosis yang berurutan
pi = jumlah hewan yang mati menerima dosis i dibagi jumlah hewan
seluruhnya yang menerima dosis i
2.1.10 Metode BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test )
BSLT adalah suatu metode yang digunakan untuk menentukan toksisitas
suatu senyawa dan terkadang digunakan untuk bioassay untuk mengisolasi
senyawa dari ekstrak tumbuhan.21
Metode ini juga biasa digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa
aktif yang terkandung dalam ekstrak tanaman.22
Metode ini dilakukan dengan
menggunakan larva udang Artemia salina Leach. Kemudian diberikan ekstrak
tanaman dan diinkubasi selama 24 jam, lalu dilakukan penghitungan LC50
berdasarkan kematian 50 % larva udang. Hasil LC50 yang didapat dimasukkan ke
dalam kategorinya, LC50 yang lebih dari 1000 ppm termasuk dalam kategori
tidak toksik, LC50 30–1000 ppm termasuk dalam kategori toksik dan LC50 yang
kurang dari 30 ppm termasuk dalam kategori sangat toksik.21,1
Beberapa keuntungan menggunakan metode BSLT adalah :1
a. Metode yang telah teruji untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di
dalam ekstrak kasar tumbuhan dengan tingkat kepercayaan 95 %.
17
b. Metode penapisan farmakologi awal yang mudah, cepat, dan murah.
c. Sering digunakan untuk pencarian senyawa antikanker.
d. Digunakan sebagai tahap awal isolasi toksik yang terkandung dalam suatu
ekstrak.
2.1.11 Larva Udang Artemia salina Leach
Artemia salina Leach adalah hewan uji yang sering digunakan yang biasa
disebut brine shrimp Artemia. Hewan ini adalah sejenis udang–udang primitif.
Udang ini pertama kali ditemukan oleh seorang Geografer dari Iran pada tahun
982 di Danau Urnia, lalu oleh Schlosser pada tahun 1976. Kemudian pada tahun
1758 diberi nama Cancer salinus oleh Linnaeus,dan yang terakhir 61 tahun
berikutnya nama udang tersebut diganti menjadi Artemia salina oleh Leach pada
tahun 1819.23
Artemia salina Leach hidup sebagai plankton di perairan dengan
kadar garam yang tinggi sekitar 15-300 per mil. Suhu sekitar 25-30° C, lalu
kadar oksigen sekitar 3 mg/L dan hidup pada daerah dengan pH 7,3–8,4. Untuk
mekanisme pertahanan hidupnya Artemia salina Leach hanya mengandalkan
lingkungan sekitar, dimana hewan ini dapat hidup pada kondisi air dengan kadar
garam yang tinggi sehingga pemangsanya tidak dapat bertahan hidup pada
kondisi tersebut. 24
Adapun morfologi dari larva ini, bisa dilihat pada gambar di bawah ini : 24
Gambar 2.3 Morfologi Artemia salina Leach
Sumber : Abatzopoulos,Th.J et al. Artemia : Basic and Apllied Biology Volume 1 dari Biologi
of Aquatic Orgaism. Netherland : Springer Netherland;2010
18
Klasifikasi dan Morfologi Artemia salina Leach : 23
Kingdom : Animalia
Filum : Arthropoda
Subfilum : Crustacea
Kelas : Branchiopoda
Subkelas : Sarsostraca
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Spesies : Artemia salina Leach
Morfologi dari larva Artemia salina Leach akan berubah–ubah sesuai
dengan fase pada siklus hidupnya. Siklus hidup Artemia salina Leach.24
Gambar 2.4 Siklus Hidup Artemia salina Leach
Sumber : Abatzopoulos,Th.J et al. Artemia : Basic and Apllied Biology Volume 1 dari Biologi of
Aquatic Orgaism. Netherland : Springer Netherland;2010
19
Secara umum memiliki 3 fase yaitu fase telur, larva (nauplii) dan artemia
dewasa. Telur Artemia salina Leach atau biasa disebut kista memiliki bentuk
bulat dengan ukuran 0,2–0,3 mm. Kemudian akan berubah menjadi larva. Telur
yang memiliki kualitas yang baik akan menetas setelah dimasukkan ke dalam air
laut atau air dengan kadar garam yang tinggi selama 18–24 jam.24
Gambar 2.5 Tahap penetasan telur Artemia
Sumber : Baraja M, Uji Toksisitas ekstrak daun Ficus elastica Nois ex Blume terhadap larva
Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis, (Skiripsi). Surakarta :
Universitas Muhammadiyah Surakarta;2008.
Pada tahapan penetasan Artemia yang terjadi adalah hidrasi sehingga akan
menjadi bulat dan embrio yang di dalamnya akan menjadi aktif sehingga sekitar
24 jam kemudian cangkang kista akan pecah dan munculah embrio yang masih
dibungkus dengan selaput dan disebut nauplii. Nauplii tingkat I disebut Instar I.
Instar I yang baru menetas berbentuk bulat lonjong dengan ukuran panjang 400
mikron dan lebar 170 mikron serta beratnya 0,002 mg. Pada awalnya nauplii
akan berwarna orange kecokelatan karena masih mengandung kuning telur.
Selain itu, pada saat fase ini nauplii tidak akan makan, karena mulut dan anusnya
20
belum terbentuk dengan sempurna. Lalu kemudian setelah 12-24 jam menetas,
para nauplii ini akan melakukan pembelahan menjadi tahap instar II dan
akhirnya memulai makan.24,25
Gambar 2.6 Nauplii tingkat I Artemia salina Leach
Sumber : Mudjiman,A. Udang resik air asin. Jakarta : Bhrata Karya Aksara;1995
Kemudian selanjutnya akan terus bermetamorfosis menjadi nauplii ke
tinggat lebih tinggi. Pada tahap instar III akan terbentuk sepasang mata majemuk
dan akan berangsur–angsur tumbuh tunas-tunas kakinya. Setelah menjadi instar
III, instar IV, instar V hingga sampai instar XV dan kemudian menjadi dewasa.
Biasanya waktu yang dibutuhkan menjadi larva menjadi dewasa adalah 2
minggu.25
Gambar 2.7 Bagian tubuh Instar II
Sumber : http://www.ecotao.co.za/html/artemia.html
21
Gambar 2.8 Bagian tubuh Dewasa Artemia
Sumber : http://www.ecotao.co.za/html/artemia.html
Pada saat dewasa, memiliki panjang tubuh tubuh umunya sekitar 8-10 mm,
tapi ada juga yang mencapai 15 mm. Terdiri dari 20 segmen dan 10 pasang
phyllopodia pipih yang merupakan alat gerak menyerupai daun dan bergerak
dengan ritme yang teratur. Pada saat dewasa Artemia salina Leach berwarna
putih pucat, merah muda, hijau atau transparan dan hanya dapat bertahan hidup
dalam hitungan bulan.25
Selain itu, artemia yang telah dewasa memiliki morfologi yang lebih
sempurna dan lebih mirip dengan udang kecil, panjang badannya sekitar 1 cm
dengan kaki yang dilengkapi dengan 10 pasang torakopoda yang merupakan alat
gerak dari artemia. Artemia dewasa baik jantan maupun betina memiliki
sepasang antena, dimana antena I berfungsi sebagai sebagai alat peraba dan
antena II untuk jantang berfungsi sebagai alat bantu dalam perkawinan dengan
artemia betina sedangakan antena II untuk betina tetap berfungsi sebagai alat
peraba juga. Pada daerah belakang kaki torakopoda, artemia jantan memiliki
penis sedangkan pada betina memiliki sepasang ovarium yang masing–masing
letaknya disebelah kanan dan kiri saluran pencernaannya.25
Untuk lingkungan hidup dari Artemia salina Leach harus sesuai dengan : 24,26
a. Suhu yang tidak kurang dari 6° C dan lebih dari 35° C karena spesies ini
tidak bisa hidup pada suhu tersebut. Suhu terbaik 25-30° C.
b. Kadar garam yang tinggi adalah salah satu pertahanan diri untuk larva. Air
dengan kadar garam yang bisa menjadi tempat artemia berkisar 2,9–3,5 %
(seawater) sampai 25–35 % (the great salt lake) bahkan masih ada yang bisa
22
hidup pada kadar garam 50 %.25,26
Kadar garam pada air yang digunakan
untuk hidrasi kista yaitu sekitar 5 %-70 %.
c. Oksigen dibutuhkan kista agar perkembangan embrio menjadi baik. Kadar
oksigen minimal adalah 3 ppm. Baik untuk hidrasi kista maupun perawatan
kista hingga menjadi artemia dewasa.
d. Saat penetasan dilakukan makan dibutuhkan pula penyinaran pada wadah
penetasan. Hal ini dilakukan dengan alasan bahwa cahaya juga dapat
merangsang pengaktifan dari perkembangan embrio dalam kista.
Selain itu, pada dasarnya perilaku dari udang artemia ini yaitu bersifat
fototaksis yang berarti menyukai cahaya. Hal ini yang menyebabkan ketika
siang hari udang–udang ini akan terlihat pada permukaaan air atau
mendekati ke arah cahaya.
e. Selain hal di atas, perlu diperhatikan juga pH pada air laut yang digunakan.
Hal ini berguna pada enzim-enzim yang bekerja pada metamorfosis dari
artemia. Dimana enzim tersebut akan bekerja secara optimum pada pH 8,0–
9,0.
Alasan mengapa Artemia salina Leach digunakan pada metode BSLT
adalah karena spesies ini memiliki kesamaan dengan mamalia. Dimana tipe
DNA-dependent RNA polimerase yang dimiliki oleh Artemia salina Leach
sama dengan mamalia. Sebagaiamana fungsi yang dimiliki oleh DNA-dependent
RNA polimerase yaitu untuk pembentukan protein dan protein merupakan
komponen utama semua sel. Jadi ketika DNA-dependent RNA polimerase
dihambat makan tidak akan terjadi pembukaan pilinan DNA menjadi RNA, lalu
tidak terjadi juga penerjemahan kodon pada tiap–tiap kodon yang ada di RNA
tersebut sehingga tidak dapat terbentuk protein baru. Penghentian pembentukan
protein ini akan menyebabkan gangguan metabolisme dan akhirnya
menyebabkan kematian sel.25
Seperti manusia, Artemia salina Leach juga
berespon terhadap stresor di lingkungan.27
23
2.2 Kerangka Konsep
Ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
Memiliki senyawa kimia yang berpotensi bioaktivitas
Uji toksisitas akut
Dengan metode BSLT
Hewan uji larva udang Artemia salina Leach
Menghitung persentase kematian larva
Mencari nilai LC50
2.3 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Cara ukur Alat
Ukur
Skala
Ukur
Hasil
Ukur
1
2
Konsentrasi
ekstrak
metanol buah
Phaleria
macrocarpa
(Scheff) Boerl
Persentase
kematian larva
Artemia salina
Leach
Konsentrasi
ekstrak dalam
ppm ( 1 µg/ml )
Hasil perkalian
rasio dengan
100 % , jumlah
larva yang mati
dibagi jumlah
seluruh larva
dikali 100 %.
V1M1=V2 M2
Jumlah larva
yang mati
dibagi jumlah
seluruh larva
-
-
Numerik
Numerik
1000 ppm
500 ppm
250 pm
100 ppm
50 ppm
25 ppm
10 ppm
Persentase
Kematian
larva
24
3 LC50 Konsentrasi
yang diberikan
sekali (tunggal)
atau beberapa
kali dalam 24
jam dari suatu
zat yang secara
statistik
diharapkan
dapat
mematikan 50
% hewan uji.
Dihitung dari
persamaan
garis lurus
Y=mX+b, lalu
memasukkan
angka 5
sebagai probit
dari 50 %
kematian
hewan uji
sehingga
didapatkan X
sebagai log,
dan antilog X
sebagai LC50
-
Numerik LC50
terbagi 3
kategori
yaitu,
lebih dari
1000 ppm
tidak
toksik,30-
1000 ppm
bersifat
toksik dan
dibawah
30 ppm
sangat
toksik
4 Rendemen
Ekstrak
Hasil bagi antara
berat ekstrak
dengan berat
simplisia dan
dikalikan 100 %
Berat ekstrak
dibagi berat
simplisia dikali
100 %
- Numerik Persentase
rendemen
ekstrak
25
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan eksperimental dengan pendekatan post test-only
control group design di laboratorium dengan perlakuan pemberian ekstrak
metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina
Leach ( BSLT ).
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2014 sampai dengan bulan
Agustus 2014 di Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka FKIK,
Laboratorium Penelitian dan Laboratorium Farmakologi Universitas Islam Negeri
Syarif Hidayatullah.
3.3 Alat dan Bahan Penelitian
3.3.1 Alat Penelitian
Rotatory evaporator Eyela, corong, bejana maserasi, blender, mikropipet 10
ml, mikropipet 5 ml, mikropipet 1 ml, neraca analitik, pipet tetes, tabung reaksi,
seperangkat alat penetasan telur (wadah plastik dan sterofoam), erlenmeyer 250
ml, erlenmeyer 100 ml, lup, kaca arloji, cawan penguap,spatula dan well plate.
3.3.2 Bahan Penelitian
Simplisia Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl, metanol teknis, telur udang
Artemia salina Leach, aluminium foil, air laut, kertas saring, aquades dan DMSO.
3.4 Cara Kerja Penelitian
3.4.1 Determinasi Tanaman
Identifikasi terhadap daging buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
untuk mengetahui identitas taksonominya di Herbarium Bogoriense, Balai
Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan
Biologi, LIPI Bogor.
26
3.4.2 Pembuatan Ekstrak Metanol Buah Mahkota Dewa
Pembuatan ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa)
menggunakan metode maserasi (memakai pelarut dengan beberapa kali
pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan) dengan metanol sebagai
pelarutnya. Buah mahkota dewa dengan berat 3 kg dirajang kemudian dijemur.
Buah mahkota dewa yang kering dengan berat 368 gram dihaluskan menggunakan
blender. Serbuk simplisia sebanyak 72,6 gram dimaserasi dengan menggunakan
pelarut metanol di dalam bejana maserasi. Sebelum digunakan metanol yang ada
didestilasi terlebih dahulu untuk menghilangkan faktor-faktor pengotor.
Proses maserasi dilakukan selama 2 hari lalu kemudian disaring untuk
memisahkan filtrat dan ampasnya. Ampasnya diambil dan direndam lagi
menggunakan metanol. Sedangakan filtratnya dimasukkan ke dalam rotatory
evaporator dengan suhu 48° C yang bertujuan untuk mengentalkan ekstrak.
Ekstrak yang kental kemudian dimasukkan ke cawan penguap.
3.4.3 Penetasan Larva Udang
Untuk penetasan larva udang menggunakan 2 wadah plastik. Wadah plastik
yang pertama dibagi menjadi 2 bagian yaitu bagian gelap (ditutupi dengan
aluminium foil) yang merupakan tempat telur dan bagian terang merupakan
bagian tempat larva yang sudah menetas. Lalu dimasukkan air laut sebanyak 1
liter untuk 1gram telur Artemia salina Leach. Air laut yang digunakan memiliki
pH sekitar 8–9.
Untuk penetasan telur diberikan penerangan selama 48 jam. Larva yang
telah menetas dan berumur 24 jam dipindahkan pada wadah yang kedua. Larva
dikembangkan lagi sampai berumur 48 jam. Larva yang digunakan pada
penelitian ini adalah larva yang masih aktif bergerak dan berusia 36-48 jam.
3.4.4 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji
Mulanya untuk mendapatkan konsentrasi uji yang digunakan pada metode
BSLT dilakukan trial atau uji orientasi konsentrasi. Konsentrasi yang digunakan
untuk uji trial yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm.
27
Ekstrak kental buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl ditimbang
menggunakan neraca analitik hingga mencapai berat 2000 mg. Dilakukan
pengenceran menggunakan DMSO sebanyak 2 ml. Lalu ditambahkan aquades
sebanyak 98 ml. Sehingga ekstrak yang didapatkan 100 ml dengan konsentrasi
20.000 ppm yang akan digunakan sebagai larutan induk.
Pembuatan larutan uji dengan menggunakan rumus pengenceran:
V1 M1 = V2 M2
Keterangan :
V1 = Volume awal
M1 = Konsentrasi awal
V2 = Wolume akhir
M2 = Konsentrasi akhir
3.5 Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Pada uji BSLT akan digunakan plate yang berisi sumur–sumur. Di dalam 1
plate terdapat 24 sumur. Langkah pertama yang dilakukan adalah membagi 5
kelompok sumur untuk masing–masing konsentrasi dan 1 untuk kontrol negatif
(air laut). Percobaan ini dilakukan pengulangan 3 kali (triplo) sehingga masing–
masing konsentrasi mendapatkan 3 sumur.
Memasukkan 1 ml masing–masing konsentrasi pada setiap sumur dan pada
kontrol negatif yang dimasukkan adalah air laut sebanyak 1 ml. Memindahkan
larva udang ke cawan petri untuk memudahkan penghitungan. Pemindahan larva
dengan menggunakan lup. Memasukkan 10 ekor larva ke dalam masing–masing
sumur dicampur 1 ml air laut. Sehingga volume dalam 1 sumur menjadi 2 ml
yaitu 1 ml ekstrak dan 1 ml air laut.
28
Tabel 3.1 Ilustrasi Konsentrasi Ekstrak pada Well Plate
1 ml ekstrak
1000 ppm +
1 ml air laut
1 ml ekstrak
1000 ppm +
1 ml air laut
1 ml ekstrak
1000 ppm +
1 ml air laut
1 ml ekstrak
50 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
50 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
50 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
250 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
250 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
250 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
25 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
25 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
25 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
100 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
100 ppm + 1
ml air laut
1 ml ekstrak
100 ppm + 1
ml air laut
2 ml air laut
2 ml air laut
2 ml air laut
Plate dibiarkan di udara terbuka selama 24 jam. Lalu dilakukan
penghitungan larva yang mati. Ciri larva yang mati adalah larva yang terlihat
sudah tidak bergerak lagi dalam beberapa detik pengamatan. Larva yang mati
dihitung dengan mengurangkan jumlah total larva pada tiap konsentrasi dengan
jumlah larva yang masih hidup.
3.6 Pengolahan dan Analisis Data
Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan metode probit. Hasil
kematian dari larva Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam tabel probit. Lalu
dihitung nilai probitnya dengan melalui persentase kematian dan nilai logaritma
dari konsentrasi yang digunakan. Adapun contoh tabel probit terdapat lampiran 2.
Selain itu, bisa juga menggunakan metode analisis pada Mirosoft Office
Excel dengan membuat persamaan garis lurus yang menghubungkan antara nilai
log konsentrasi dengan nilai probit dari persentase kematian. Setelah mendapatkan
persamaannya, maka Y diganti dengan angka 5 sebagai probit dari 50 % kematian
hewan uji yang nantinya akan menghasilkan X sebagai log konsentrasi. Antilog X
merupakan nilai LC50.
29
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Ekstraksi Buah Mahkota Dewa
Simplisia yang digunakan pada peneltian ini adalah benar tumbuhan mahkota
dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.) yang telah melalui proses
identifikasi taksonomi oleh Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan
Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor.
Surat identifikasi taksonomi tumbuhan dengan Nomor Surat
887/IPH.3/KS/III/2014 (lampiran 3).
Serbuk simplisia yang didapatkan dari hasil pengeringan dan penghalusan
dengan berat 72,6 gram, digunakan untuk proses esktraksi. Proses ekstraksi yang
digunakan adalah dengan metode maserasi. Metode maserasi merupakan cara
ekstraksi yang mudah dilakukan dan dalam tahapannya tidak dilakukan proses
pemanasan sehingga menghindari kerusakan dari zat aktif yang dikandung oleh
simplisia.15
Metode ini merupakan cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut,
sedangkan pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah metanol. Metanol
yang digunakan terlebih dahulu didestilasi untuk mengurangi faktor pengotor
yang ada sehingga yang digunakan untuk perendaman simplisia adalah metanol
murni yang didapatkan dari hasil destilasi.
Metanol merupakan pelarut yang bersifat polar sehingga dapat bercampur
dengan air, jenis alkohol lain dan pelarut organik lainnya.28
Metanol sangat
mudah menguap pada titik didihnya yaitu 65° C.29
Sehingga pada saat cairan
maserasi dimasukkan ke dalam rotatory evaporator metanol akan menguap dan
terpisah dengan zat aktif buah mahkota dewa yang ditarik saat perendaman.15
Setelah proses maserasi maka ekstrak dimasukkan ke dalam alat rotatry
evaporator. Dengan alat ini, ekstrak yang masih bercampur dengan pelarut
dipisahkan sehingga didapatkan ekstrak kental yang akan digunakan untuk uji
BSLT dengan larva Artemia salina Leach sebagai hewan ujinya.
Dari hasil ekstraksi dengan metode maserasi yang telah dilakukan maka
didapatkan :
30
Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.
Nama Simplisia Bobot ekstrak Bobot simplisia Rendemen
ekstrak
Ekstrak metanol buah
Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl.
19,8 gram 72,6 gram 27,27 %
Setelah didapatkan ekstrak yang akan digunakan pada penelitian, selanjutnya
dilakukan pembuatan larutan konsentrasi ekstrak untuk uji BSLT. Larutan
pertama yang dibuat adalah larutan induk dengan konsentrasi 20.000 ppm
sebanyak 100 ml.
Pada proses ini dilakukan pengenceran ekstrak kental buah mahkota dewa
yang telah ditimbang sebanyak 2000 mg menggunakan aquades. Namun pada
penelitian ini dilakukan penambahan bahan inert yaitu dimetisulfoksida (DMSO).
Penggunaan bahan inert ini bertujuan untuk membantu melarutkan ekstrak.
DMSO merupakan salah satu zat yang bersifat toksik. Namun pada penelitian ini
kadar DMSO yang digunakan tidak termasuk dalam kategori yang toksik karena
DMSO yang digunakan ≤ 2 %, sedangkan efek toksik baru akan timbul ketika
DMSO dimasukkan sebanyak ≥ 7,5 %. 30
4.2 Hasil Uji BSLT
Larutan induk dari ekstrak kental metanol buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl yang telah dibuat terlebih dahulu kemudian diencerkan menjadi
menjadi 5 konsentrasi, yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm
yang akan digunakan untuk uji orientasi konsentrasi terlebih dahulu. Selain itu
dibuat pula kontrol negatif berupa air laut dan larva udang tanpa penambahan
ekstrak. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut maupun faktor lain
terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva
hanyalah akibat dari penambahan ekstrak yang dilakukan.
Setelah dilakukan uji orientasi konsentrasi untuk mendapatkan persentase
kematian larva pada rentang 10 %-90 % maka didapatkan konsentrasi uji yaitu
1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm.
31
Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali replikasi/pengulangan (triplo) dengan
tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih akurat. Larva yang telah
berumur 36-48 jam dimasukkan ke dalam well plate masing-masing 10 ekor larva
yang ditambahkan 1 ml air laut. Kemudian memasukkan masing-masing
konsentrasi uji sebanyak 1 ml ke dalam well plate. Setelah 24 jam pasca
penambahan ekstrak, dilakukan pengamatan kematian larva.
Hasil kematian larva Artemia salina Leach pada setiap sumur dibandingkan
satu sama lain termasuk pada sumur kontrol negatif. Berikut ini adalah hasil
penelitian dari uji konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.
Tabel 4.2 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.
Sumur ke
Angka Kematian Larva Artemia salina Leach Kontrol
negatif Konsentrasi ekstrak pada tabung uji (ppm)
12,5 25 50 125 500
1 1 2 4 4 9 0
2 1 2 3 7 8 0
3 1 2 4 7 10 0
Total Kematian 3 6 11 18 27 0
Rata-Rata
kematian
0,10 ±
0 0,20 ± 0
0,36 ±
0,5774
0,60 ±
1,7321
0,90 ±
1,1547 0,00 ± 0
Persentase
Kematian (%) 10 20 36 60 90 0
Total larva yang digunakan pada percobaan ini dengan 3 kali percobaan
sebanyak 30 ekor. Sehingga total larva yang digunakan pada seluruh percobaan
adalah 180 ekor. Total kematian diperolah dengan menjumlah kematian karva
pada setiap konsentrasi. Rata–rata kematian diperoleh dari total kematian dibagi
total larva yang digunakan tiap konsentrasi. Persentase kematian didapatkan
dengan mengalikan rata–rata kematian dengan 100.
32
Dari data pada tabel 4.1 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara
konsentrasi ekstrak dengan total kematian larva.
Gambar 4.1 Grafik Persentase mortalitas larva Artemia salina Leach pada uji
toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl
Berdasarkan grafik di atas maka menunjukkan bahwa jumlah kematian larva
pada konsentrasi 12,5 ppm adalah 10 % sedangkan pada konsentrasi 25 ppm
sebanyak 20 %, hal ini menunjukkan peningkatan kematian larva sebesar 10 %.
Lalu pada konsentrasi 50 ppm, total kematian larva yaitu 36 %. Jika dibandingkan
dengan total kematian larva pada konsentrasi 125 ppm, maka akan terlihat
peningkatan angka kematian sebesar 24 %. Lalu pada konsentrasi 500 ppm angka
kematiannya juga meningkat jika dibandingkan dengan konsentrasi 125 ppm yaitu
sebesar 30 %. Sehingga bisa disimpulkan bahwa peningkatan konsentrasi yang
semakin tinggi akan meningkatkan kematian larva.
Penggunaan larva Artemia salina Leach pada uji BSLT ini karena larva ini
memiliki kesamaan dengan mamalia. Seperti memiliki DNA-dependent RNA
polimerase yang sama seperti yang dimiliki oleh mamalia.25
33
Sedangkan telur Artemia salina Leach yang digunakan pada percobaan yaitu
larva yang berusia 36-48 jam. Hal ini disebabkan karena setelah berumur 24 larva
akan memasuki fase instar I dimana pada tahap ini larva belum bisa makan karena
mulut dan saluran pencernaannya belum terbentuk secara sempurna.
Lalu setelah 12-24 jam setelah menetas instar I akan bermetamorfosis
menjadi instar II, dimana instar II sudah memiliki mulut dan sistem
pencernaannya telah sempurna.24,25
Sehingga ekstrak yang ada di lingkungan larva
masuk ke dalam tubuh larva dan menyebabkan kematian larva. Lalu pada saat
larva menjadi instar III atau lebih dari 48 jam, tubuhnya akan bermetamorfosis
lebih lanjut dan meningkatkan ketahanan tubuh larva. Oleh karena itu, pada
penelitian ini digunakan larva yang berumur 36–48 jam.
Pada buah mahkota dewa mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder
seperti alkaloid, terpenoid, polifenol, saponin, tanin, resin dan flavonoid.
Senyawa–senyawa inilah yang menyebabkan kematian pada larva.
Mekanisme kematian pada larva disebabkan oleh adanya alkaloid, terpenoid
dan glikosid yang berperan sebagai stomach poisoning (racun perut). Proses ini
menyebabkan larva mengalami gangguan pada saluran cernanya. Selain itu,
senyawa ini juga menghambat reseptor rasa yang berada di permukaan mulut
larva sehingga larva tidak bisa mendeteksi makanan dan akhirnya mati karena
kelaparan.31,32
Berdasarkan kriteria standar larva dikatakan mati apabila larva tidak bergerak
selama 10 detik observasi.33
Observasi kematian larva dilakukan setelah 24 jam
pemberian ekstrak. Namun untuk memastikan bahwa larva benar-benar telah mati
maka dilakukan pewarnaan larva menggunakan trypan blue. Dimana larva yang
mati akan menyerap warna biru sehingga larva akan terlihat berwarna biru ketika
dilihat dengan menggunakan mikroskop.34
34
4.3 Penetapan LC50
Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan menggunakan Metode probit.
m = ∑ (X) ∑ (Y) – n ∑(XY) = 2,3786
(∑ (X))2 - n ∑ (X
2)
b = ∑ (X) ∑ (XY) - ∑ (X2) ∑ (Y) = 0,5542
(∑ (X))2
- n ∑ (X2)
Nilai di atas dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus y = mX + b, dimana
nilai y merupakan nilai probit 50 % dari persentase kematian lalu X merupakan
log konsentrasi serta antilog X merupakan LC50.
Konsentrasi
Log Persentase
Probit (Y) X2 Y
2 XY Konsentrasi
(X) Kematian
12.5 1.09 10 3.72 1.19 13.83 4,05
25 1.39 20 4.17 1,39 17.39 5,79
50 1.69 36 4.64 2.87 21.53 7,84
125 2.09 60 5.25 4.37 27.56 10,97
500 2.69 90 6.28 7.24 39.44 16,89
Jumlah 8,95 24.06 17,06 119,75 45,54
35
Gambar 4.2 Grafik Analisis Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Metanol
Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
Analisis Probit
Y = mX + b
Y = 1,596x + 1,953
5 = 1,596x + 1,953
1,596x = 3,047
X = 3,047 / 1,596 = 1,909
LC50 = antilog X = 81,09 ppm
Hasil uji toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl
yang ditunjukkan oleh grafik di atas dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi
konsentrasi suatu ekstrak maka akan semakin tinggi tingkat kematian larva.
Perhitungan LC50 dengan menggunakan Microsoft Office Excel didapatkan
persamaan garis lurus Y = 1,596x + 1,953, lalu dimasukkan angka 5 pada nilai Y
sehingga didapatkan LC50 81,09 ppm. Perhitungan melalui kedua metode ini
menghasilkan LC50 yang sama–sama termasuk ke dalam kategori toksik. LC50
yang dikatakan toksik adalah dengan nilai kurang dari 1000 ppm.
Sedangkan dari penelitian Vivi L, dkk pada tahun 2006 disebutkan bahwa
LC50 dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl adalah 2,46
36
ppm. Hal penelitian tersebut sangat berbeda jauh dengan hasil yang didapatkan
pada penelitian ini. Hal ini dikarenakan metode ekstrak yang dilakukan pada
penelitian tersebut merupakan ekstraksi bertingkat. Sehingga ekstrak yang
didapatkan merupakan ekstrak yang lebih banyak mengandung zat aktif dari buah
Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl baik jumlah maupun senyawa-senyawanya.1
Sehingga dari analisis data dan perhitungan nilai LC50 menunjukkan bahwa
ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki potensi
toksik dan dapat digunakan sebagai anti-kanker.
Potensi antikanker tersebut diduga karena buah mahkota dewa memiliki
berbagai macam kandungan senyawa- senyawa metabolit sekunder yang bersifat
toksik. Salah satu senyawa yang terkandung di dalam buah mahkota dewa adalah
flavonoid. Berdasarkan beberapa teori, flavonoid memiliki beberapa efek pada sel
kanker yaitu : 35,36,37,38
1. Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menimbulkan terjadinya fragmentasi
DNA yang disebabkan oleh adanya oksigen reaktif seperti radikal hidroksil
sehingga mengaktifkan jalur apoptosis sel.
2. Flavonoid juga menghambat transduksi sinyal ke inti melalui inhibisi protein
kinase sehingga menghambat proliferasi sel kanker.
3. Menghambat pertumbuhan suatu keganasan dengan menginhibisi reseptor
tirosin kinase. Reseptor ini merupakan reseptor yang berperan dalam
meningkatkan pertumbuhan keganasan.
4. Meningkatkan sensitivitas agen kemoterapi dan menurunkan angka resistensi
agen kemoterapi.
Selain karena adanya kandungan flavonoid yang diduga sebagai senyawa
toksik yang dikandung oleh buah mahkota dewa, senyawa–senyawa lain juga
berperan potensinya sebagai antikanker. Oleh karena itu, dengan LC50 < 1000 ppm
buah mahkota dewa dikatakan sebagai obat yang memiliki potensi sebagai
antikanker.21,1
Namun sebelum dijadikan sebagai obat antikanker, terlebih dahulu tanaman
ini harus melewati beberapa tahap uji farmakologi yang telah ditentukan untuk
membuktikan kualitas, keamanan dan efek samping yang ditimbulkan. Selain itu,
37
bahan baku yang digunakan harus memenuhi standar yang telah ditetapkan juga,
sehingga menjamin keamanan saat digunakan oleh masyarakat. Hal inilah yang
membuat setiap bahan alam yang akan dikembangkan menjadi obat selain
melewati beberapa tahap uji farmakologi, harus melwati uji klinik juga.6,7,8
4.4 Keterbatasan Penelitian
4.4.1 Waktu
Pada penelitian ini, sebenarnya masih banyak yang harus dilakukan untuk
mendapatkan hasil yang lebih baik. Tetapi karena keterbatasan waktu penelitian
maka ada beberapa hal yang tidak dilakukan seperti penghitungan susut
pengeringan, kadar abu dan kadar air ekstrak.
Lalu pada proses untuk memastikan kematian larva, yang pada umumnya
menggunakan trypan blue tidak dilakukan pada penelitian ini. Hal ini disebabkan
karena keterbatasan waktu dan tempat untuk mendapatkan trypan blue.34
Selain itu, pada awalnya penelitian ini akan dibandingkan dengan obat
antikanker yaitu methotrexate. Namun setelah penelitian ini berjalan, tidak
terdapat cukup waktu untuk mengerjakannya.
4.4.2 Jenis Pelarut Tunggal
Pelarut yang digunakan pada penelitian ini hanya satu yaitu metanol. Hal ini
disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi
biasa, bukan dengan metode maserasi bertingkat. Metanol merupakan pelarut
yang polar sehingga hanya akan menarik senyawa aktif yang larut dalam pelarut
polar juga. Oleh karena itu, pada penelitian ini LC50 yang didapatkan berbeda
dengan penelitian sebelumnya.
Jika hanya dengan menggunakan satu jenis pelarut lalu menghasilkan LC50
yang masuk dalam kategori toksik (kurang dari 1000 ppm), maka hasil yang
didapatkan dengan menggunakan beberapa jenis pelarut akan menghasilkan LC50
yang lebih toksik (kurang dari 30 ppm).
38
4.4.3 Konsentrasi ekstrak yang untuk dosis aman
Pada penelitian ini yang dilakukan adalah untuk menentukan nilai LC50 suatu
ekstrak. Untuk penentuan dosis aman tidak dilakukan pada penelitian ini karena
keterbatasan waktu. Namun jika untuk mengetahui bahwa suatu ekstrak
mempunyai aktivitas toksik maka bisa ditentukan dengan melihat LC50 yang lebih
dari 1000 ppm.
39
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
1. Rendemen ekstrak dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl adalah 27,27 %.
2. Ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki aktivitas
sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach LC50nya adalah 81,09 ppm
sehingga masuk dalam kategori toksik karena memiliki LC50 < 1000 ppm.
5.2 Saran
1. Untuk mendapatkan hasil hitungan kematian larva yang tepat, sebaiknya
perhitungannya kematian larva dilakukan oleh 2 orang atau lebih.
2. Dilakukan penelitian dengan membandingkan ekstrak metanol buah Phaleria
macrocarpa (Scheff) Boerl dengan obat anti-kanker sebagai kontrol
positifnya.
3. Dilakukan penelitian dengan pengukuran susut pengeringan, kadar air, kadar
abu serta penggunaan trypan blue dalam memastikan kematian larva.
40
DAFTAR PUSTAKA
1. Lisdawati V, Wiryowidagdo S dan Kardono LB. Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji makota dewa
(Phaleri macrocarpa). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 34 No. 3; 2006: 111-118.
2. Lisdawati V. Kajian terhadap prospek pengembangan bahan bioaktif buah
mahkota dewa (P. macrocarpa) sebagai kandidat New Chemical Entity untuk
pengobatan kanker (Sitostatika). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 37 No. 1; 2009:
23-32.
3. Pisutthanan S, et al. Brine Shrimp lethality activity of thai medicinal plant in the
Family Maliaceae. Naresuan University Journal Vol.12 No.2; 2004: 13-18.
4. Meyer BN, et al. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant
constituent. Planta Medica; 1982.
5. Menkes RI. Farmakope Herbal Indonesia Edisi Pertama. Jakarta: Menkes; 2009.
6. Sukandar EY. Tren dan paradigma dunia farmasi. Industri-klinik-teknologi
kesehatan. Bandung : Institut Teknologi Bandung; 2004.
7. Menkes RI. Pedoman Fitofarmaka. Jakarta: Menkes; 1992.
8. Yuningsih R. Pengobatan tradisional di unit pelayanan kesehatan. Info singkat
kesejahteraan sosial Vol. IV No. 05/I/P3DI/Maret/2012; 2012: 9-12.
9. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal bahan alam Indonesia
Vol. 4 No. 1; 2005: 223-227.
41
10. Hendra R, et al. Antioxidant, Anti-inflammatory and cytotoxicity of Phaleria
macrocarpa (Boerl.) Scheff fruit. BMC complementary & alternative medicine,
Vol. 11, No.110; 2011.
11. Meiyanti, et al. Efek hipoglikemik daging buah mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap kadar gula darah pada manusa sehat
setelah pembebanan glukosa. Universa medicina Vol. 25 No. 3; 2006: 114-120.
12. Rohyami Y. Penentuan Kandungan flavonoid dari ekstrak metanol daging buah
mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl). [Skripsi]. Yogyakarta:
Universitas Islam Indonesia; 2008
13. Dewanti T, Wulan SN dan Nur Indira. Aktivitas antioksidan dan antibakteri
produk kering, instan dan effervescent dari buah mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa (Scheff.) Boerl). Malang: Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 6 No. 1
Universitas Brawijaya; 2005: 29-36.
14. Anonim. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta: Departemen
Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan
Makanan, Direkorat Pengawasan Obat Tradisional; 2000: 3-6 dan 9-12.
15. Agoes, Goeswin. Teknologi bahan alam. Bandung: Penerbit ITB Press; 2007: 11-
14 dan 21-23.
16. Tiwari P, et al. Phytochemical screening and extraction: A review. Internationale
Pharmaceutica Sciencia (IPS) Vol. 1. Jan-March 2011.
17. Amelia P. Isolasi, elusidasi struktur dan aktivitas antioksidan senyawa kimia dari
daun Garcinia benthami Pierre. [Tesis]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia; 2011.
18. Priyanto. Toksikologi: mekanisme, terapi antidotum, dan penilaian resiko.
Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia (LESKONFI); 2009.
42
19. Harmita dan Radji M. Buku ajar analisis hayati Edisi 3. Jakarta : EGC; 2008.
20. Landis, Wayne G. Introduction to environmental toxicology molecular
substuctures to ecological landscape. Fourth edition. USA: CRC Press; 2011: 52.
21. McLauughlin JL dan Rogers LL. The use of biological assays to evaluate
botanicals. USA: Drug Information Journal Vol. 32; 1998: 512-524.
22. Widianti A dan Suhardjono. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah cabai rawit
(Capsicum frutescens) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine
shrimp lethality test (BST). Semarang : Universitas Diponegoro; 2010
23. Asem A, Pouyani NR dan Escalente PD LR. The genus Artemia Leach, 1819
(Crustaceae: Branchiopoda). True and false taxonomical descriptions. Iran : Lat.
Am. J Aquat Res Vol. 38; 2010: 501-506.
24. Ramdhini, RN. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan toksisitas akut
komponen bioaktif Pandanu conoideus var. Conoideus Lam sebagai kandidat
antikanker. [Skripsi]. Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010.
25. Panjaitan, RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex)
dengan metode brine shrimp lethality test (BST). [Skripsi]. Yogyakarta:
Universitas Sanata Dharma; 2011.
26. Panggabean, MG. Teknik penetasan dan pemanenan Artemia salina Leach.
Jakarta: Pusat Penelitian Ekologi Laut, Lembaga Oseanologi Nasional-LIPI.
Oseana Vol IX No. 2; 1984: 57-65
27. Gajardo, Gonzola M dan Beardmore, John A. The brine shrimp Artemia : adapted
to critical life conditions. Chile: Frotiers in Physiology; 2012.
28. Utomo, DP. Analisis matematis dan ekonomis penggunaan metanol dan etanol
pada kompor “HD”. Malang: Jurnal teknik industri, Vol 11 No 1; Februari 2011:
50-55.
43
29. Anonim. Methanol. Europe: International Programme on Chemical Safety (IPCS)
and European Commission; 2012.
http://www.inchem.org/documents/icsc/icsc/eics0057.htm (Diunduh September
2014)
30. Amalia FR, et al. Pengaruh Glutathione terhadap kualitas semen kambing Boer
Post Thawing dalam pengencer yang mengandung Dimetylsulfoxie (DMSO).
Malang: Universitas Brawijaya; 2012.
31. Rita WS, Suirta IW, Sabikin A. Isolasi & Identifikasi Senyawa Yang Berpotensi
Sebagai Antitumor Pada Daging Buah Pare (Momordica charantia L.). Jurusan
Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran. Jurnal Kimia Vol.2; 2008.
32. Nguyen HH, Widodo S. Momordica L. In: Medicinal and Poisinous Plant
Research of South-East Asia 12. De Padua L. S. N. Bunyapraphatsana and R.H.
M. J. Lemmens (eds.). Pudoc Scientific Publisher. Wageningen, the Netherland;
1999: 353-359.
33. Rolliana, ER. Uji toksisitas akut ekstrak etanol Daun Kamboja (Plumeria alba L)
terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test
(BST). [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2010.
34. Perry SW, et al. In Situ Trypan blue staining of monolayer cell cultures for
permanent fixation and mounting. New York: University of Rochester Medical
Center. BioTechniques Vol. 22 No.2; 1997.
35. Ogata S, et al. Apoptosis induced by the flavonoid from lemon fruit (citrus limon
BURM. F.) and its metabolites in HL-60 cells. Japan: Biosci Biotechnol Vol 64
No 5; 2000: 1075-1078. PMID 10879486. Available from: http://www.ncbi.nlm
44
36. Vizcaino F, et al. The flavonoid quercetininduced apotosis and inhibits JNK
activation in intimal vascular smooth muscle cells. London: Biochemical and
Biophysical Research communications Vol 346 No 3; 4 Agustus 2006: 919-925.
Available from: http://www.sciencedirect.com.
37. Ren W, et al. Tartary Buckwheat Flavonoid Activates caspase 3 And Induces Hl-
60 Cell apoptosis. China: Clin Pharmacol Vol 23 No 8; 2001: 427-432. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11838316.
38. Demeule M et al. Grean tea catechin as novel antitumor and antiangiogenic
compounds. Canada: Curr. Med. Chem-Anti-Cancer Agent Vol 2 No 4; 2002:
441-463. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12678730.
45
LAMPIRAN
Lampiran 1
Alur penelitian
Gambar 6.1 Alur penelitian
1 gram telur Artemia salina Leach
Penetasan telur Artemia salina Leach
Pengambilan larva secara random
Sumur A: 10 larva + 1 ml ekstrak 1000 ppm + 1 ml air laut
Sumur B : 10 larva + 1 ml ekstrak 500 ppm + 1 ml air laut
Sumur C : 10 larva + 1 ml ekstrak 250 ppm + 1 ml air laut
Sumur D : 10 larva + 1 ml ekstrak 100 ppm + 1 ml air laut
Sumur E : 10 larva + 1 ml ekstrak 50 ppm + 1 ml air laut
Sumur F : 10 larva + 1 ml ekstrak 25 ppm + 1 ml air laut
Sumur G : 10 larva + 1 ml ekstrak 10 ppm + 1 ml air laut
Sumur 22 – 24 : 10 larva + 2 ml air laut
Volume akhir masing-masing sumur adalah 2 ml
Dilakukan replikasi 3 kali pada tiap konsentrasi
Setelah 24 jam pemberian ekstrak, dilakukan penghitungan jumlah larva yang mati
Menghitung persentase kematian larva pada tiap konsentrasi
Menentukan LC50 dengan metode probit
Larva Artemia salina berumur 48 jam
Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara
penyediaan yang sama dan telah bersifat homogen
46
Lampiran 2
Metode probit
Tabel 6.1 Tabel probit
Konsentrasi
Log
Konsentrasi
(X)
%
Kematian
Probit
(Y) X
2 Y
2 XY
∑
Baik konsentrasi maupun persentase kematian dimasukkan ke dalam tabel
probit seperti di atas. Lalu melakukan log dari setiap konsentrasi dan mencari nilai
probit dari setiap persentase kematian dengan menggunakan tabel probit.
Setelah mengisi semua bagian tabel, maka dilakukan penghitungan dengan
menggunakan persamaan garis lurus : y = mX + b.
Dimana Y merupakan angka probit dan X adalah nilai log konsentrasi serta antilog X
adalah nilai LC50.
Nilai slope (m) dihitung dengan rumus :
m = ∑ (X) ∑ (Y) – n ∑(XY)
(∑ (X))2 - n ∑ (X
2)
Nilai Intersep (b) dihitung dengan rumus :
b = ∑ (X) ∑ (XY) - ∑ (X2) ∑ (Y)
(∑ (X))2 - n ∑ (X
2)
47
Lampiran 3
Surat Keterangan Determinasi Tanaman
Gambar 6.2 Keterangan Determinasi Tanaman
48
Lampiran 4
Keterangan Bahan Penelitian Telur Artemia
Gambar 6.3 Keterangan bahan penelitian telur artemia
49
Lampiran 5
Gambar Bahan dan Alat Penelitian
Gambar 6.4 Penghalusan simplisia Gambar 6.5 Destilasi pelarut metanol
Gambar 6.6 Proses pemasukan simplisia Gambar 6.7 Botol Maserasi
ke botol maserasi
Gambar 6.8 Proses evaporasi dengan Gambar 6.9 Ekstrak kental buah
rotatory evaporator mahkota dewa
50
Lanjutan...
Gambar 6.10 Neraca analitik Gambar 6.11 Proses Penyaringan
Gambar 6.12 Larutan Induk 20.000 ppm Gambar 6.13 Larutan ekstrak berbagai
Konsentrasi uji
Gambar 6.14 Wadah penetasan telur artemia Gambar 6.15 Well plate uji BSLT
51
Lampiran 6
Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Metanol Buah Mahkota Dewa
Konsentrasi = ekstrak metanol buah mahkota dewa
Volume aquade (mL)
20.000 ppm = x = 2.000.000 µg = 2000 mg
100
Untuk mendapatkan ekstrak dengan konsentrasi 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm dan 50 ppm
dan 25 ppm maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan rumus V1 M1 = V2 M2.
a) Konsentrasi ekstrak 1000 ppm
V1 M1 = V2 M2
20000 µg/mL x V1 = 1000 µg/mL x 10 mL
V1 = 10.000 µg = 0,5 mL
20.000 µg/mL
Maka kita mengambil 0,5 mL larutan ekstrak 20.000 ppm
b) Konsentrasi ekstrak 250 ppm
V1 M1 = V2 M2
1000 µg/mL x V1 = 250 µg/mL x 4 mL
V1 = 1000 µg = 1 mL
1000 µg/mL
Maka kita mengambil 1 mL larutan ekstrak 1.000 ppm
c) Konsentrasi ekstrak 100 ppm
V1 M1 = V2 M2
1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 4 mL
V1 = 400 µg = 0,4 mL
1000 µg/mL
Maka kita mengambil 0,4 mL larutan ekstrak 1.000 ppm
52
d) Konsentrasi ekstrak 50 ppm
V1 M1 = V2 M2
1000 µg/mL x V1 = 50 µg/mL x 4 mL
V1 = 200 µg = 0,2 mL
1000 µg/mL
Maka kita mengambil 0,2 mL larutan ekstrak 1.000 ppm
e) Konsentrasi ekstrak 25 ppm
V1 M1 = V2 M2
1000 µg/mL x V1 = 25 µg/mL x 4 mL
V1 = 100 µg = 0,1 mL
1000 µg/mL
Maka kita mengambil 0,2 mL larutan ekstrak 1.000 ppm
53
Lampiran 7
Perhitungan Penggunaan DMSO
Pembuatan larutan DMSO induk 20.000 ppm :
2 ml DMSO = 0,02
100 ml aquades
Sehingga persen DMSO yang digunakan untuk larutan induk 20.000 ppm yaitu 0,02 x 100 %
= 2 %, kadar DMSO dilakukan pengenceran sesuai dengan pembuatan konentrasi ekstrak.
a) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1.000 ppm.
V1 M1 = V2 M2
0,5 x 2 % = 10 x M2
M2 = 1 = 0,1 %
10
Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 1.000 ppm adalah 0,1 %.
b) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 250 ppm.
V1 M1 = V2 M2
1 x 0,1 % = 4 x M2
M2 = 0,1 = 0,025 %
4
Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 250 ppm adalah 0,025 %.
c) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 100 ppm.
V1 M1 = V2 M2
0,4 x 0,1 % = 4 x M2
M2 = 0,04 = 0,01 %
4
Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 100 ppm adalah 0,01 %.
54
d) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 50 ppm.
V1 M1 = V2 M2
0,2 x 0,1 % = 4 x M2
M2 = 0,02 = 0,005 %
4
Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 50 ppm adalah 0,005 %.
e) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 25 ppm.
V1 M1 = V2 M2
0,1 x 0,1 % = 4 x M2
M2 = 0,01 = 0,0025 %
4
Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 25 ppm adalah 0,0025 %.
55
Lampiran 8
Tabel 6.2 Transformasi Persen-Probit
56
Lanjutan...
57
Lampiran 9
Identifikasi Larva Artemia salina Leach
Gambar 6.16 Larva Artemia salina Leach di bawah mikroskop
58
Lampiran 10
Keterangan Daftar Riwayat Hidup
DAFTAR RIWAYAT HIDUP
Nama : Ayu Reskianingsih
Tempat, tanggal lahir : Malili, 21 Desember 1993
Alamat : Jl. Dr. Sam Ratulangi
Perumahan BTN Wija Virgo Kel. Puncak Indah, Kec.
Malili, Kab. Luwu Timur, Prov. Sulawesi Selatan.
No. HP : 081242030607
Email : [email protected]
Riwayat Pendidikan :
1. SDN No. 221 Malili (2000-2005)
2. SMP Neg. 1 Malili (2005-2008)
3. SMA Neg. 1 Malili (2008-2011)
4. PSPD FKIK UIN Jakarta (2011-sekarang)