Laporan Praktikum Jurnal Mikrobiologi (Poltekkes Manado Jurusan Farmasi)
Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi pada Produk Farmasi ...
Transcript of Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi pada Produk Farmasi ...
Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologipada Produk Farmasi dan Makanan
Marlia Singgih Wibowo
Jenis Uji
• Uji langsung• Teknik kultur• Metode Enumerasi• Metode Alternatif• Metode Cepat
Uji Langsung
• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik)
• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik)
• Metode pewarnaan• DEFT (Direct Epifluorescent Filter
Technique)
• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) : morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk koloni
• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua jenis mikroskop : optik dan fase kontras
• Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri
• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel disaring dengan filter, bakteridiwarnai dengan zat warna tertentu lalu dilihatdi bawah mikroskop epifluoresens
DEFT (Direct Epifluorescent FilterTechnique)
• Filter membran polikarbonat• Zat warna senyawa fluorokromatis yang
berfluoresensi setelah berikatan• Acridine orange :
Ikatan denan dsDNA : hijauIkatan dengan ssRNA : oranyeIkatan dengan sel hidup : kuningIkatan dengan sel mati : hijau terang
Teknik Kultur• Walaupun berbagai metode analisis
cepat dan sensitif telahdikembangkan untuk identifikasi dankarakterisasi mikroba patogen, teknik pembiakan mikroba di dalammedium mikrobiologi masihdiperlukan terutama untukkonfirmasi identitas. Media mikrobiologi yang sering digunakanumumnya adalah medium padatatau cair. Medium padat umumnyamengandung agar.
Kultur pada media agar• Tujuan Isolasi• Tujuan Determinasi• Tujuan
Penyimpanan• Tujuan
Pertumbuhan• Tujuan Produksi• Tujuan Analisis
Metode Enumerasi
• Plate Count : metode perhitunganmikroba yang ditumbuhkan di atascawan petri
• MPN Count (Most probable Number) : metode perhitungan relatifberdasarkan fenomena kekeruhan
• Analisis Fisikokimia : metodeperhitungan mikroba berdasarkankomponen sel atau metabolit yang dihasilkan
Metode Alternatif
• Dye-reduction Test• Electrical Methods• ATP Determination
Dye-reduction Test• Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna
(dye)• Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem
biologi yang aktif dan akan menghasilkanperubahan warna
• Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarnadan bentuk tereduksi tidak berwarna
• Contoh dye yang sering digunakan : metilenblue, resazurin, trifeniltetrazolium klorida
Electrical Methods
• Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan menyebabkanperubahan komposisi medium dan olehkarenanya akan merubah sifat elektriknya.
• Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi, kapasitans, dan impedansi
Penetapan ATP
• ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidupyang melakukan metabolisme
• Diukur melalui aktivitas enzim luciferasedan substrat luciferin menghasilkanpendaran cahaya (chemiluminesence)
Metode cepat
• Metode Imunokimia• Metode molekuler
Metode Imunokimia
• Prinsip analisis : berdasarkan reaksiAntigen-Antibodi
• Komponen sel atau metabolit selmikroba bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan pereaksi (suatu Abyang spesifik) menghasilkan kompleksAg-Ab
• Kompleks Ag-Ab divisualisasi denganberbagai cara yang dapat diukur(spektrofotometri spektofluorometri dll )
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)
Antigen
Antibodi
KompleksAg-Ab
Konjugatenzim padaAg-Ab
Substrat
Produkberwarna
Reaksienzimatik
Jenis Metode Imunokimia
• EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)• RIA (Radio Immuno Assay)• IFA (Immuno Fluoresence Assay)• LIA (Luminescence Immuno Assay)
Metode Molekuler
• Cara Hibridisasi• Cara Amplifikasi
Teknik hibridisasi
• Proses denaturasi dsDNA menjadissDNA menggunakan pemanasan
• Kombinasi ssDNA tersebut dengansuatu segmen ssDNA lain yang telah diberi probe (label)
• Hibrid DNA yang telah mengandunglabel dapat dideteksi dengan berbagai
Teknik Hibridisasi
dsDNAdenaturasi
ssDNA dgn probe
ssDNA
Hibrid DNA berlabel
ssDNA
Teknik amplifikasi
• PCR (polymerase chain reaction) : reaksipolimerisasi berantai
• DNA target didenaturasi menggunakan panas• Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek)
yang komplemen dengan salah satu ujungssDNA
• Sintesis DNA yang diawali dari primer• Proses pengulangan 20 – 50 x
3’ 5’3’5’
Denaturasi pada 94 °C
3’5’
3’ 5’
3’ 5’
3’5’
Annealing primer pd 72°C
3’ 5’
3’5’Polimerisasipada 72 °C
3’5’
3’ 5’ dsDNA baru
dsDNA baru
Proses berulang
Denaturasi
Annealing
Polimerisasi
Proses setelah PCR
• Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat dideteksi
• Produk PCR dapat dideteksi denganelektroforesis
• Pita-pita DNA dibandingkan denganmarker DNA
Elektroforesis DNA
DNA marker
ProdukPCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of
Preservation with Mr Primer
©M. Ryan
L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in water , 12-16 cryopreserved, 17 control
Instrumen dan Bahan untukanalisis PCR
• DNA Thermal cycler• DNA target• Primer• DNA polimerase• Nukleotida• Larutan Mg 2+
• Alat Elektroforesis
Biochemical Methods: Enzymes
©M. Ryan
Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase, trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase, glucuronidase, proteases, fucosidase.
An APIZYM strip
Biochemical Methods: Metabolites
Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites
(Example of Patulin production by Penicillium spp.)