UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASIL Nigella...
Transcript of UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASIL Nigella...
-
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASILEKSTRAKSI DARI JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)
TERHADAP TOTAL LEUKOSIT, JUMLAH LIMFOSITDAN MONOSIT, SERTA INTERLEUKIN-1 PADA
MENCIT BALB/C
Skripsi
Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)
TEGUH PRIYANTO
NIM : 108102000074
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1436 H/2015
-
i
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
UJI IMUNOMODULATOR POLISAKARIDA HASILEKSTRAKSI DARI JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)
TERHADAP TOTAL LEUKOSIT, JUMLAH LIMFOSITDAN MONOSIT, SERTA INTERLEUKIN-1 PADA
MENCIT BALB/C
Skripsi
Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)
TEGUH PRIYANTO
NIM : 108102000074
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1436 H/2015
-
ii
-
iii
-
iv
-
v
ABSTRAK
Judul : Uji imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi dari jinten hitam(nigella sativa L.) terhadap total leukosit, jumlah limfosit dan monosit, serta interleukin-1 pada mencit BALB/C
Nigella sativa L merupakan tanaman yang banyak mengandung zat-zat yang sangatampuh dalam mengobati penyakit. Bahkan tanaman ini direkomendasikan olehRasulullah SAW penggunaanya terutama dalam hal medisinal. Penelitian inibertujuan untuk menguji efek imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi Nigellasativa L. melalui pengukuran total leukosit, jumlah limfosit dan monosit, sertakadar Interlekuin 1 pada mencit Balb/c. Sebanyak 20 mencit yang diuji dibagimenjadi 4 kelompok: kontrol, dosis rendah (1,25 mg/BB mencit ), dosis sedang (2,5mg/BB mencit), dan dosis tinggi ( 5 mg/BB mencit). Polisakarida diberikan secaraoral selama 14 hari dan sampel darah diambil pada hari ke-7, ke-14 dan ke-21.Hasil rata-rata analisis statistik ANOVA menunjukan bahwa pemberian ekstrakpolisakarida pada ketiga dosis mampu meningkatkan total leukosit dan jumlahlimfosit secara signifikan dibandingkan kontrol, namun tidak mampumempengaruhi jumlah monosit. Dosis tinggi 5 mg / BB mencit memiliki aktifitasimunomodulator terbaik. Sedangkan pada uji interlekuin 1, mencit diberikanpolisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. secara oral selama 5 hari. Pada harikelima, dua jam setelah pemberian hasil ekstraksi Nigella sativa L. disuntikansecara i.p LPS 20 ug / BB mencit lalu diambil sampel darahnya setelah 6 jam. Hasiluji statistik kruskal Wallis menunjukan bahwa pemberian polisakarida Nigellasativa L. tidak mempengaruhi kadar interleukin -1 secara signifikan (p >0.05)
Kata kunci : Nigella sativa L., polisakarida, imunomodulator, mencit Balb/C.
-
vi
ABSTRACT
Title : The immunomodulator assay of polysaccharide, the result extraction ofblack seed (Nigella sativa L.) toward the total number of leukocytes,lymphocytes and monocytes, and interleukin 1 on mice BalB/C
Nigella sativa L. is a plant that contains many substances that very effective to treatthe disease. Moreover this plant was recommended by Rasulullah SAW to useespecially in medicinal treatment. This research is aim to test the effect ofimmunomodulator polysaccharide, the result extraction of black seed (Nigellasativa L.) through measuring the total number of leukocytes, lymphocytes andmonocytes, and the level of interleukin 1 on mice BALB/C. as many as 20 micethat have to test were divided into 4 groups : control, low doses (1,25 mg/BW mice),medium doses (2,5 mg/BW mice), and high doses (5 mg/BW mice). Polysaccharideextract was given orally during 14 days and the blood sample was taken in day 7th,14th, and 21th. The average result of statistical analysis ANOVA indicate that thegiving of polysaccharide extract on high doses can increase the total number ofleukocytes and lymphocytes significantly (P>0,05) if compared with control group,however it can not give effect to total number of monocytes. The high doses (5mg/BW mice) have the best immunomodulator activity. While for The test ofinterleukin-1, mice was given polysaccharide the result extraction Nigella sativaL. orally during 5 days. In day 5th, two hours after giving the result extractionNigella sativa L. that have been injection by i.p LPS 20 g/BW mice then the bloodsample was taken after 6 hours. The result of statistical Kruskal Wallis showed thatthe treatment of polysaccharides Nigella sativa L. not affect levels of interleukin1 significantly. (P>0,05).
Keyword : Nigella sativa L., Polysaccharide extract, Immunomodulator, Balb/Cmice.
-
vii
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Allah Subhanahu wa taala, yang telah memberikan
pertolongan dan kasih sayang-Nya sehingga kami penulis dapat menyelesaikan
penulisan skripsi ini. Makalah skripsi yang berjudul Uji Imunomodulator
Polisakarida hasil ekstraksi Jinten Hitam (Nigella sativa L.) Terhadap Total
Leukosit, Jumlah Limfosit, Jumlah Monosit, Dan Jumlah Interleukin-1 Pada
Mencit Balb/C dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah Skripsi, salah satu syarat
untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada penulisan ini, penulis juga ingin mengucapkan penghargaan dan
terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
(1) Farida Sulistiawati M.Si,Apt selaku dosen pembimbing pertama yang telah
menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran dalam menuntun penulis dalam
penyusunan skripsi ini.
(2) Drs. Umar Mansur M.Sc selaku dosen pembimbing kedua sekaligus Kepala
Program Studi Farmasi UIN Syarif hidayatullah Jakarta
(3) Zilhadia M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik selama pendidikan.
(4) Para dosen Farmasi UIN yang telah memberikan ilmu, pengalaman dan
wawasannya.
(5) Kementrian Agama dan pemerintah kabupaten Musi banyuasin yang telah
memberikan dukungan moril dan materil selama pendidikan. Ucapan beribu
terimakasih, semoga ilmu yang saya terima dapat bermanfaat.
(6) Orangtua, kakak, adik dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan,
semangat dan doa, Love you all.
(7) Rekan penelitian Zikriah, Sinti ayesa, Nia yuliani dewi, dan Azhari zikro yang
telah bersama dalam suka dan duka. Sahabat-sahabat Sukron, Farhan, Lukman
dll, yang telah memberikan dukungan dan keceriaan sehingga saya
bersemangat dan bisa menyelesaikan tugas akhir ini.
(8) Teman-teman seangkatan Farmasi 2008 yang telah menempuh pendidikan
bersama selama empat tahun, Semoga semangat dan kesuksesan bersama-sama
dengan kita semua.
-
viii
(9) Semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu
kelancaran pembuatan skripsi, Saya ucapkan terimakasih.
Saya menyadari bahwa dalam makalah skripsi ini masih terdapat banyak
kekurangan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang membangun
sehingga dapat menyempurnakan skripsi ini dan melaksanakan perbaikan di masa
yang akan datang. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan bagi
dunia pendidikan dan ilmu pengetahuan.
Ciputat, 3 April 2015
TEGUH PRIYANTO
-
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ..................................................................................HALAMAN PERNTAAN ORISINALITAS .............................................HALAMAN PERSETUJUAN PPEMBIMBING......................................LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................ABSTRAK ................................................................................xABSTRACT .............................................................................. xiKATA PENGANTAR................................................................................ iDAFTAR ISI .............................................................................. iiiDAFTAR GAMBAR ................................................................................vDAFTAR TABEL .............................................................................. viDAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... vii
BAB I PENDAHULUAN.........................................................................11.1 Latar Belakang ................................................................................11.2 Perumusan Masalah .......................................................................31.3 Tujuan Penelitian ............................................................................31.4 Manfaat Penelitian ..........................................................................3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................42.1 DESKRIPSI TANAMAN JINTAN HITAM (Nigella sativa L.).....4
2.1.1 Klasifikasi Tanaman.............................................................42.1.2 Nama Daerah .......................................................................42.1.3 Ciri-ciri tanaman ..................................................................42.1.4 Kandungan tanaman ............................................................52.1.5 Khasiat dan Kegunaan .........................................................7
2.2 EKSTRAK ................................................................................72.3 METODE EKSTRAKSI .................................................................8
2.3.1 Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut..............................82.3.2 Metode Ekstraksi Lainnya ..................................................9
2.4 IMUNOMODULATOR.................................................................102.5 LEUKOSIT ...................................................................................11
2.5.1 Limfosit ...........................................................................132.5.2 Monosit ...........................................................................132.5.3 Neutrofil ..........................................................................14
2.6 Interleukin 1 .................................................................................152.7 ELISA .....................................................................................162.8 HEWAN UJI (MENCIT/ Mus Muskulus) .....................................17
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................193.1 TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN.....................................193.2 BAHAN DAN ALAT ..................................................................19
3.2.1 Bahan ...................................................................................19a. bahan uji ..............................................................................19b. bahan kimia ........................................................................19
-
x
c. hewan uji ............................................................................193.2.2 Alat .....................................................................................19
3.3 PROSEDUR PENELITIAN ........................................................203.3.1 Optimasi Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L................20
a. Metode Ekstraksi Pertama (Hailat, et al. 1998 ) ..........20b. Metode Ekstraksi Kedua (Toneli, et al. 2008 )
3.3.2 Preparasi sampel ................................................................201. Pembuatan Larutan Na-CMC 5 % ...............................202. Penentuan Dosis (hussein el-taher, et al. 2006) ...........20
3.3.3 Perlakuan Hewan Uji .........................................................21a. Perlakuan Untuk Uji Total Leukosit, persentase Limfosit
Dan Persentase Monosit ..................................................21b. Perlakuan Untuk Uji Interlekuin 1 .................................22c. Pengambilan Darah (permatasari, 2012) ..........................23
3.3.4 Metode Uji ..........................................................................23a. Uji Total Leukosit, persentase limfosit, dan persentase
Monosit ..........................................................................23b. uji kadar Uji Interlekuin 1 ..............................................25
3.4 ANALISA DATA .........................................................................25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................264.1 HASIL OPTIMASI EKSTRAKSI ................................................264.2 TOTAL LEUKOSIT .....................................................................294.3 JUMLAH LIMFOSIT ...................................................................334.4 JUMLAH MONOSIT ...................................................................374.5 KADAR INTERLEUKIN 1 ........................................................40
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................425.1 KESIMPULAN ..............................................................................425.2 SARAN ..............................................................................42
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................43LAMPIRAN ..............................................................................47
-
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2. 1 Bentuk batang dan bunga Nigella sativa L .............................. 5Gambar 2.2 Komponen terbesar Nigella sativa L. (Paarrakh M, 2010) ........ 7Gambar 2.3 Beberapa jenis penampakan mikroskop dari leukosit
(Anonim, 2013) ......................................................................... 11Gambar 2.4 Bagan Pembentukan Sel Darah Dari Stema Sel (Theml, et al, 2004).
................................................................................................... 12Gambar 2.5 Limfosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 13Gambar 2.6 Monosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 14Gambar 2.7 Monosit (Theml, H et all, 2004) ............................................. 15Gambar 2.8 Skema Ilustrasi Uji ELISA (Sino biological.inc, 2015)........... 16Gambar 2.9 Mencit Balb/C (Sino biological.inc, 2015) .............................. 17Gambar 3.1 Kamar hitung neubauer (Eki Putra, 2008) ............................... 24Gambar 3.2 Alur pengamatan microskop pada gelas objek ........................ 24Gambar 4.1 Hasil Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L metode pertama ...
................................................................................................ 24Gambar 4.2 Hasil uji Barfoed polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L ..
........................................................................................................ 27Gambar 4.3 Hasil uji benedict polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L
(terbentuk warna merah bata pada tabung tengah).................... 27Gambar 4.4 Hasil ekstraksi polisakarida metode kedua ............................. 28Gambar 4.5 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-7............................. 30Gambar 4.6 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-14........................... 31Gambar 4.7 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-21 .......................... 32Gambar 4.8 Grafik peningkatan jumlah hari ke-7 ...................................... 34Gambar 4.9 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-14 ...................... 34Gambar 4.10 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-21 .................... 35Gambar 4.11 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-7...................... 38Gambar 4.12 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-14.................... 38Gambar 4.13 Grafik Peningkatan Monosit hari ke-21 ................................. 39Gambar 4.14 Grafik hasil uji interleukin 1 ................................................ 41
-
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Konstituen Umum Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al 2006).......................................................................................................... 6
Tabel 2.2 Konstituen Minyak Nigella sativa (Hussein El- taher, et al 2006)................................................................................................................... 6
Tabel 3.1. Perlakuan kelompok uji total leukosit, limfosit, dan monosit................................................................................................................. 21
Tabel 3.2 Perlakuan Kelompok Uji Interlekuin 1 ..................................... 22Tabel 4.1 Hasil perhitungan total leukosit ................................................... 29Tabel 4.2 Rataan Jumlah Limfosit. .............................................................. 33Tabel 4.3 Rataan Jumlah Monosit................................................................ 37Tabel 4.4 Rata-rata Jumlah Nilai Il-1........................................................ 40
-
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kerangka Konsep Penelitian ...........................................................47Lampiran 2. Bagan ekstraksi pertama ....................................................................... 48Lampiran 3. Bagan ekstraksi kedua .....................................................................49Lampiran 4. Surat keterangan mencit ...................................................................50Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Abu Dan Kadar Air. ...............................................51Lampiran 6. Kegiatan Pengukuran Kadar Abu Dan Kadar Air ............................52Lampiran 7. Hasil Uji Karbohidran Total ekstraksi pertama ..............................53Lampiran 8: Hasil Uji Karbohidran Total ekstraksi kedua ..................................54Lampiran 9. Penentuan Besar Dosis .....................................................................55Lampiran 10. Pembuatan Larutan Induk................................................................56Lampiran 11. Kegitan penelitian : Pengambilan Darah .........................................57Lampiran 12. Kegitan penelitian : Pembuatan sediaan apus..................................60Lampiran 13. Kegitan penelitian : Penghitungan Leukosit....................................62Lampiran 14. Metode Uji ELISA .............................................................................63Lampiran 15. Hasil Pengamatan Mikroskop................................................................... 65Lampiran 16. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan
Limfosit hari ke -7................................................................................... 68Lampiran 17. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan
Limfosit hari ke-14 .........................................................................69Lampiran 18. Hasil Penghitungan total leukosit, Jumlah Presentase Monosit Dan
Limfosit hari ke-21 .........................................................................70Lampiran 19. Hasil uji interleukin 1-beta .............................................................71Lampiran 20. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit hari ke-7......................72Lampiran 21. Hasil Uji ANOVA Total Leukosit hari ke-7 ..................................73Lampiran 22. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) total leukosit
hari ke-7..........................................................................................74Lampiran 23. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit hari ke-14....................75Lampiran 24. Hasil Uji ANOVA Total Leukosit hari ke-14 .................................76Lampiran 25. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) total leukosit
hari ke-14........................................................................................77Lampiran 26. Hasil Uji homogenitas data Total Leukosit pada hari ke-21. .........78Lampiran 27. Hasil Uji non parametrik kruskal wallis Total Leukosit Hari ke-
21 ....................................................................................................79
Lampiran 28. Uji homogenitas perbandingan uji total leukosit perminggu...........80Lampiran 29. Uji ANOVA total leukosit per minggu...........................................81Lampiran 30. Uji Turkey HSD total leukosit perbandingan antar kelompok
perminggu ......................................................................................82Lampiran 31. Hasil uji homogenitas data jumlah limfosit hari ke-7......................83Lampiran 32. Hasil Uji ANOVA jumlah limfosit hari ke-7 ..................................84Lampiran 33. Hasil uji turkey HSD jumlah limfosit hari ke-7 ..............................85Lampiran 34. Hasil uji homogenitas data limfosit hari ke-14................................86Lampiran 35. Hasil uji Anova jumlah limfosit hari ke-14 ....................................87Lampiran 36. Hasil Uji Turkey HSD (Honest Significant Different) jumlah
limfosit hari ke-14 .........................................................................88Lampiran 37. Hasil uji homogenitas jumlah limfosit hari ke-21. ..........................89
-
xiv
Lampiran 38. Hasil uji kruskal wallis jumlah limfosit hari ke-21 .........................90Lampiran 39. Uji homogenitas data rata-rata limfosit perminggu.........................91Lampiran 40. Uji ANOVA data rata-rata perminggu limfosit. ..............................92Lampiran 41. Uji Turkey HSD rata-rata perminggu limfosit. ..............................93Lampiran 42. Uji homogenitas data monosit hari ke-7..........................................94Lampiran 43. Uji ANOVA Monosit hari ke-7 .......................................................95Lampiran 44. Uji kruskal walis monosit hari ke-7 ................................................96Lampiran 45. Uji Homogenitas Hari Ke-14 .........................................................97Lampiran 46. Uji ANOVA monosit hari ke-14 .....................................................98Lampiran 47. Uji kruskal walis monosit ke-14......................................................99Lampiran 48. Uji homogenitas data monosit hari ke-21......................................100Lampiran 49. Uji ANOVA monosit hari ke-21 ..................................................101Lampiran 50. Uji kruskal walis monosit hari ke-21.............................................102Lampiran 51. Uji homogenitas interleukin 1 .....................................................103Lampiran 52. Uji kruskal wallis interleukin 1 ...................................................104
-
1UIN Syarif hidayatullah Jakarta
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Tubuh manusia memiliki suatu sistem keamanan yang melindungi
tubuh dari bahaya lingkungan luar tubuh. Lingkuangan di sekitar manusia
banyak mengandung berbagai jenis patogen, seperti : jamur, bakteri, virus,
protozoa, dan, parasit yang dapat menyebabkan infeksi pada manusia.
Infeksi yang terjadi pada manusia pada umumnya terjadi dalam waktu yang
singkat dan jarang menimbulkan kerusakan permanen. Hal ini disebabkan
karena adanya sistem imun yang melindungi tubuh dari unsur-unsur patogen
tersebut.
Imunomodulator adalah obat yang dapat mengembalikan dan
memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan
yang fungsinya berlebihan (Handayani, 2010). Penggunaan
imunomodulator sering digunakan saat tubuh terserang suatu infeksi.
Senyawa ini diharapkan dapat membantu sistem imun tubuh dalam
mengatasi patogen yang masuk kedalam tubuh manusia.
Nigella sativa L. yang telah dikenal dengan nama jinten hitam
termasuk dalam family Ranunculaceae, telah banyak digunakan di berbagai
negara sebagai imunomodulator, termasuk negara-negara barat maupun
negara-negara timur (Haq A. et al, 1995). Berdasarkan sejarah, penelitian
mendalam mengenai jinten hitam (Nigella sativa L.) pertama kali
dikemukakan oleh Grenish melalui publikasi jurnalnya pada tahun 1880.
Dalam Nigella sativa L. terkandung 37 % minyak dan 4,1 % abu (garam
kalsium) (Hussein, et al., 2006).
Penggunaan jinten hitam (Nigella sativa L.) sebagai bahan obat
memang sudah tidak diragukan lagi, bahkan dalam suatu hadits Nabi
Muhammad SAW disebutkan bahwa jinten hitam (Nigella sativa L.) dapat
mengobati berbagai macam penyakit, kecuali kematian. Disebutkan di
dalam kitab Ath-thibun Nabawi, karya Ibnu Qayyim Al-Jauziyyah dari
riwayat Ibnu Umar, bahwasannya Rasulullah SAW bersabda :
-
2
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
.Hendaklah kalian mengkonsumsi jinten hitam, karena
sesungguhnya terkandung obat penyembuh dari segala macam penyakit,
kecuali kematian (HR. Ibnu Majah dan Nasai) (Ibn Qayyim Al-Jauziyah.
2003).
Jinten hitam (Nigella sativa L.) dapat meningkatkan jumlah, mutu,
kualitas dan aktivitas sel yang berfungsi sebagai imun tubuh. Sebagai
contoh pada pengujian tiga macam frase jinten hitam (Nigella sativa L.)
(ekstrak etanol, polisakarida, dan, volatil oil) terhadap respon antibodi tikus
yang telah divaksinasi dengan vaksin Brucella menunjukkan hasil yang
signifikan sebagai bahan tambahan vaksin Brucella Melitensis. Dari
percobaan tersebut ketiga fraksi memiliki peran yang signifikan
meningkakan titer antibodi, meskipun sebagai bahan tambahan dalam
vaksin. Hasil dari penelitian tiga frase diperoleh polisakarida sebagai fraksi
hasil ekstraksi yang paling paling efektif (Hailat, et al 1998).
Penelitian Nabil Hailat pada tahun 1998 menunjukkan bahwa
polisakarida jinten hitam (Nigella sativa L.) sebagai adjuvan memiliki
kemampuan yang lebih signifikan dibanding ekstrak lain. Sejauh ini
penelitian imunomodulator frase polisakarida tunggal belum pernah
dilakukan.
Polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)
diharapkan dapat berkhasiat sebagai imunomodulator yang dapat
meningkatan sistem respon imun secara humoral maupun selular dan
menurunkan reaksi sistem imun yang berlebih sehingga sistem imun tubuh
berada dalam kondisis seimbang. Peningkatan jumlah leukosit total
menunjukkan respon imun secara humoral dan selular dalam mengatasi
adanya zat asing (Erlinger, 2004). Pada penelitian Camalia G Michael dkk
tahun 2010 juga menyebutkan bahwa jinten hitam (Nigella sativa L.) juga
dapat menurunkan kadar interleukin-1 yang diinduksi CCl4. Senyawa ini
-
3
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
merupakan salah satu turunan sitokin yang berfungsi sebagai mediator
inflamasi.
Pada penelitian ini kami akan mencoba mengetahui efektifitas
imunomodulator polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa
L.) terhadap mencit Balb/C melalui penghitungan total leukosit, jumlah
limfosit dan monosit serta pengukuran kadar IL-1.
1.2 PERUMUSAN MASALAH
1. Apakah polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)
mempengaruhi total leukosit, jumlah limfosit, jumlah monosit dan IL-
1?
2. Dosis polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella sativa L.)
manakah yang akan memberikan efek imunomodulator yang lebih baik?
1.3 TUJUAN PENELITIAN
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mengetahui kemampuan polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam
(Nigella sativa L.) sebagai imunomodulator.
2. Mengetahui dosis polisakarida hasil ekstraksi jinten hitam (Nigella
sativa L.) yang memiliki efek imunomodulator terbaik.
1.4 MANFAAT PENELITIAN
Mengetahui gambaran umum tentang manfaat jinten hitam (Nigella sativa
L.) terhadap respon imun melalui total leukosit, jumlah limfosit dan
monosit, serta kadar IL-1.
-
4UIN Syarif hidayatullah Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. DESKRIPSI TANAMAN JINTEN HITAM (Nigella sativa L.)
2.1.1. Klasifikasi Tanaman
Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi tanaman jinten hitam
adalah sebagai berikut (Junaidi, et al 2011):
Kingdom : Plantae
Sub Kingdom : Traceabionta
Divisi : Spermatophyta
Kelas : Magnoliopsida dicotyledon
Subkelas : Magnolidae
Ordo : Ranunculales
Famili : Ranunculaceae
Genus : Nigella L.
Spesies : Nigella sativa L.
2.1.2. Nama Daerah
Jinten hitam dikenal dengan banyak nama, beberapa negara
mengenalnya dengan sebutan Black cummin atau Black caraway seed. Nabi
Muhammad SAW menyebutnya dengan sebutan Habbat Al-Baroka,
sedangkan di Rusia dan Rumania dikenal dengan sebutan Charmuska. Di
India dan Pakistan jinten hitam dikenal dengan nama Kalonji (Goreja,
2003). Bahasa yang akan digunakan agar tidak membingungkan dalam
bahasan ini adalah Nigella sativa L.
2.1.3. Ciri-Ciri Tanaman
Nigella sativa L. merupakan tanaman terna setahun berbatang tegak.
Batang tanaman biasanya berusuk dan berbulu kasar, rapat atau jarang-
jarang dan disertai dengan bulu. Daun bulu berkelenjar. Bentuk daun lanset
terbentuk garis panjang 1,5 cm sampai 2 cm. Ujung lancip terdapat tulang
daun. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas duduk. Daun
-
5
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
pembalut bunga kecil. Kelopak bunga 5, bundar telur ujungnya agak
melancip sampai agak tumpul pangkal mengecil membentuk sudut yang
pendek dan besar. Mahkota bunga pada umumnya berjumlah 8, agak
memanjang lebih kecil dari kelopak bunga, berbulu jarang dan pendek;
berbibir dua, bibir bagian atas pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk
benang. Ujung bibir bunga bagian bawah tumpul, benang sari banyak,
gundul; kepala sari jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat
telur atau agak bulat. Biji hitam, jorong bersudut tiga tak beraturan dan
sedikit berbentuk kerucut, panjang 3 mm berkelenjar (Junaidi, et al 2011).
Gambar 2. 1 Bentuk batang dan bunga Nigella sativa L.
2.1.4. Kandungan Tanaman
Nigella sativa L. mengandung banyak sekali zat-zat aktif
yang sangat berguna dalam kehidupan manusia. Zat-zat tersebut
termasuk golongan antioksidan, imunomodulator, antikanker,
antihistamin dan zat-zat lainnya. Berdasarkan penelitian Greenish
melalui publikasi jurnalnya pada tahun 1880, dalam Nigella sativa L.
terkandung 37 % minyak dan 4,1 % abu / garam kalsium. Komposisi
secara umum Nigella sativa L. adalah sebagai berikut:
-
6
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
Tabel 2.1 Konstituen Umum Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al
2006).
Konstituen % Range (w/w)
Oil 31 35,5
Protein 16 - 19,5
Karbohidrat 33 34
Fibrate 4,5 6,5
Ash 3,7 7
Saponin 0,013
Moisture 5 7
Sedangkan komposisi minyak dari Nigella sativa L. termasuk
senyawa volatilnya adalah sebagai berikut :
Tabel 2.2 Konstituen Minyak Nigella sativa L. (Hussein El- taher, et al
2006).
Konstituen % range (w/w)
Linoleic acid 44,7 56
Oleic acid 20,7 24,6
Linolenic acid 0,6 1,8
Arachidic acid 2 3
Palmitoleic acid 3
Eicosadic Acid 2 2,5
Palmitic acid 12 14,3
Stearic acid 2,7 3
Myristic acid 0,16
Sterol 0,5
-
7
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
Nigella sativa L. juga dilaporkan mengandung nigellone, Struktur
dari konstituen terbesar yang terisolasi seperti yang terlihat pada gambar
struktur di bawah ini :
Gambar 2.2 Komponen terbesar Nigella sativa L. (Paarrakh M,
2010).
2.1.5 Khasiat dan Kegunaan
Penelitian tentang manfaat Nigella sativa L. telah banyak dilakukan
dan banyak juga yang telah dipublikasikan. Dari sekian jurnal yang telah
dipublikasikan membuktikan efek positif yang menunjukkan betapa
besarnya potensi kegunaan dari Nigella sativa L.
Biji dari Nigella sativa L. yang telah dibuat bubuk yang diberikan
ke beberapa volunter pada dosis 1 g dua kali sehari selama 4 minggu
memberikan efek peningkatan rasio dari sel T helper ke sel T supressor
hingga 72 % dan meningkatkan fungsi dan jumlah dari Sel T Killer (Hussein
El- taher, et al 2006).
2.2. EKSTRAK
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati dan simplisia hewani menggunakan
pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan
dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga
memenuhi baku yang ditentukan, Sedangkan ekstraksi adalah kegiatan
penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan
-
8
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Depkes RI, 2010). Senyawa aktif
yang terdapat dalam simplisia dapat di golongkan dalam golongan minyak
asiri, alkaloid, flavanoid, dan lain-lain.
2.3. METODE EKSTRAKSI
Ekstraksi memiliki banyak metode tergantung pada sifat-sifat ekstrak
yang akan diambil.
2.3.1 Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut
1. Maserasi
Maserasi adalah metode ekstraksi simplisia dengan menggunakan
pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada
temperatur ruangan.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna (exhause extraction) yang umumnya dilakukan pada
temperatur ruangan. Proses biasanya terdiri dari tahapan pengembangan
bahan tahap maserasi antara tahap perkolasi sebenarnya, terus menerus
hingga diperoleh ekstrak yang jumlahnya 1-5 kali bahan.
3. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut dengan titik didihnya,
selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang terbatas yang relatif
konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan
pengulangan proses pada residu pertama sampai 3 -5 kali sehingga dapat
termasuk proses ekstraksi sempurna.
4. Sokhlet
Sokhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru
yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstaksi
kontinu. Dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya
pendingin balik.
-
9
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
5. Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik pada temperatur yang lebih tinggi
dari temperatur ruangan yaitu biasanya dilakukan pada temperatur 40
500C.
6. Infus
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur pemanas
air (bejana infus tercelup dalam bejana mendidih, temperatur terukur 96-
98o C) selama waktu tertentu. Selama waktu tertentu (15-20 menit).
7. Dekok
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (> 30 menit) dan
temperatur sampai pada titik didih air.
2.3.2 Metode Ekstraksi Lainnya
Beberapa cara ekstraksi dengan menggunakan cara-cara yang telah
dibahas di atas, ada juga ekstraksi yang lain sebagai cara penarik zat aktif
dari simplisianya, cara-cara yang digunakan diantaranya adalah: destilasi
uap, ekstraksi energi listrik, ekstraksi ultrasonik,dan superkritikal
karbondioksida.
Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak
asiri) dari bahan (segar atau simplisianya) dengan uap air berdasarkan
peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air
dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi
fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi
destilat air bersama kandungan senyawa yang memisah sempurna atau
memisah sebagian. Simplisia benar benar tidak larut dalam air namun benar-
benar dilalui uap air sehingga senyawa kandungan ikut terdestilasi (Depkes
RI, 2000).
Ekstraksi energi menggunakan medan listrik, ultrasonik dan
superkritikal karbon dioksida memiliki tujuan untuk memberikan tekanan
dan peningkatan permeabilitas dinding sel dari simplisia sehingga sehingga
zat aktif dari simplisia dapat di ambil.
-
10
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
2.4 IMUNOMODULATOR
Sistem imun dibagi atas dua jenis, yaitu sistem imun kongenital atau
non spesifik dan sistem imun didapat atau adaptif atau spesifik. Mekanisme
pertahanan tubuh oleh sistem imun kongenital bersifat spontan, tidak spesifik,
dan tidak berubah baik secara kualitas maupun kuantitas bahkan setelah
paparan berulang dengan patogen yang sama. Sedangkan sistem imun didapat
muncul setelah proses mengenal oleh limfosit (clonal selection), yang
tergantung pada paparan terhadap patogen sebelumnya. Adanya sistem imun
kongenital memungkinkan respons imun dini untuk melindungi tubuh selama
4-5 hari, yang merupakan waktu yang diperlukan untuk mengaktifkan limfosit
(Bratawidjaja, 2002).
Imunomodulator adalah obat yang dapat mengembalikan dan
memperbaiki sistem imun yang fungsinya terganggu atau untuk menekan yang
fungsinya berlebihan. Obat golongan imunomodulator bekerja menurut 3 cara,
yaitu melalui:
Imunorestorasi
Imunorestorasi adalah suatu cara mengembalikan fungsi sistim
imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistim imun,
seperti : imunoglobulin dalam bentuk immune serum globulin (ISG),
hyperimmune serum globulin (HSG), plasma, transplantasi sumsum tulang,
jaringan hati, timus, plasmaferesis, dan leukoferesis (Djajakusumah, 2010).
Imunostimulasi
Imunostimulasi adalah cara memperbaiki fungsi sistim imun dengan
menggunakan bahan yang merangsang sistim tersebut. Bahan yang
termasuk imunostimulator itu dapat dibagi sebagai berikut :
1. Biologik, seperti hormon timus, limfokin, interferon, antibodi
monoklonal, transfer factor/ekstrak leukosit, sel LAK, bahan biologik
asal bakteri dan asal jamur.
2. Sintetik seperti levamisol, isoprinosin, muramil dipeptid (MDP),
biological respons modifier (BRM), hidroksiklorokuin, arginin,
antioksidan dan bahan-bahan lain seperti bahan yang masih dalam
-
11
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
percobaan klinik antara lain azimekson, siamekson, bestati, tuftsin,
maleic anhydride,divynil ether copolymer, dan 6-phenyl-pyrimidinole
(Djajakusumah, 2010).
Imunosupresi
Merupakan suatu tindakan untuk menekan respons imun.
Kegunaannyadi klinik terutama pada transplantasi untuk mencegah reaksi
penolakan dan pada berbagai penyakit inflamasi yang menimbulkan
kerusakan atau gejala sistemik, seperti autoimun atau auto-inflamasi
(Bratawidjaja, 2002).
Imunorestorasi dan imunostimulasi disebut imunopotensiasi atau up
regulation, sedangkan imunosupresi disebut down regulation (Bratawidjaja,
2002).
2.5 LEUKOSIT.
Leukosit adalah sel darah yang mengandung inti, disebut juga sel
darah putih. Di dalam darah manusia, normal didapati jumlah leukosit rata-
rata 5000-9000 sel/mm3 (Efendi,Z 2003). Jika dilihat dalam mikroskop
cahaya maka akan terlihat inti dalam sitoplasmanya yang mempunyai bentuk
inti bermacam-macam, Ada kalanya tidak mempunyai granula,
sitoplasmanya homogen dengan inti bentuk bulat atau bentuk ginjal.
Gambar 2.3 Beberapa jenis penampakan mikroskop dari leukosit (Anonim,
2013)
-
12
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
Menurut dr Zurkesti Efendi, leukosit terbagi menjadi 2 jenis yaitu
granular (memiliki granula) dan agranular (tidak memiliki granula).
Leukosit granular terbagi menjadi 3 macam turunan leukosit (diferensial
leukosit) yaitu: neutrofil, basofil dan eusinofil. Sedangkan leukosit agranular
Terdapat dua: limfosit sel kecil, sitoplasma sedikit; monosit sel agak besar
mengandung sitoplasma lebih banyak.
Pada dasarnya seluruh sistem darah dalam tubuh manusia berasal
dari turunan stema sel. Dengan adanya faktor tempat terbentuknya dan faktor
humoral, stema sel berubah menjadi beberapa bentuk sel. erythropoiesis dan
thrombopoiesis dibentuk secara tersendiri setelah fase stema sel, sedangkan
monocytopoiesis dan granulocytopoiesis berkaitan antara keduanya.
Pembentukan limfosit tidak terkait dengan pembentukan sel-sel lainnya.
Granulosit, monosit dan limfosit secara bersamaan membentuk sel leukosit
(Theml, H et al, 2004).
Gambar 2.4 Bagan pembentukan sel darah dari stema sel (theml, H
et al, 2004).
-
13
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
2.5.1 Limfosit
Limfosit merupakan sel yang sferis, garis tengah 6-8 um, 20-30%
leukosit darah. Normal, inti relatif besar, bulat sedikit cekungan pada satu
sisi, kromatin inti padat, anak inti baru terlihat dengan elektron mikroskop.
Limfosit dalam sirkulasi darah normal dapat berukuran 10-12 um ukuran
yang lebih besar disebabkan sitoplasmanya yang lebih banyak (Efendi,Z
2003).
Gambar 2.5 Limfosit (Theml, H et al, 2004)
Leukosit mempunyai peran dalam pertahanan seluler dan humoral
organisme terhadap zat-zat asing. Leukosit dapat melakukan gerakan
amuboid dan melalui proses diapedisis leukosit dapat meninggalkan kapiler
dengan menerobos antara sel-sel endotel dan menembus jaringan
penyambung. Jumlah leukosit pada manusia permikroliter adalah 4000-
11000, waktu lahir 15000-25000, dan menjelang hari keempat turun sampai
12000. Pada usia 4 tahun jumlah leukosit akan sesuai kadar normal
(Efendi,Z 2003).
2.5.2 Monosit
Merupakan sel leukosit yang besar 3-8% dari jumlah leukosit
normal, diameter 9-10 um tapi pada sediaan darah kering diameter mencapai
20 um atau lebih. Inti biasanya eksentris, adanya lekukan yang dalam
berbentuk tapal kuda. Kromatin kurang padat, susunan lebih fibriler, ini
merupakan sifat tetap monosit Sitoplasma relatif banyak dengan pulasan
wrigh berupa bim abu-abu pada sajian kering. Granula azurofil, merupakan
lisosom primer, lebih banyak tapi lebih kecil. Ditemui retikulim endoplasma
-
14
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
sedikit. Juga ribosom, pliribosom sedikit, banyak mitokondria. Aparatus
Golgi berkembang dengan baik, ditemukan mikrofilamen dan mikrotubulus
pada daerah identasi inti (Efendi,Z 2003).
Gambar 2.6 Monosit (Theml, H et al, 2004)
Monosit dapat ditemukan di dalam darah, jaringan penyambung, dan
rongga-rongga tubuh. Monosit tergolong mononuklear fagosit (sistem
retikuloendotel) dan mempunyai tempat-tempat reseptor pada permukaan
membrannya untuk imunoglobulin dan komplemen. Monosit memfagosit
mikroorganisme, sel mati, partikel asing (contohnya debu yang masuk ke
dalam paru-paru). Monosit beredar melalui aliran darah, menembus dinding
kapiler kemudian masuk ke dalam jaringan penyambung.
Monosit dalam sistem imun berfungsi sebagai makrophage, yaitu
menelan dan menghancurkan sel, mikroorganisme dan benda asing yang
bersifat patogen dengan cara menelan dan menghancurkannya. Monosit
akan merespon adanya tanda-tanda inflamasi dengan cara bergerak cepat
(kira-kira 8-12 jam) ke tempat yang terinfeksi, mengirimkan makrofag
untuk merangsang respons imun, dan mengeluarkan substansi yang
mempengaruhi terjadinya proses peradangan kronik (Lestari, et al, 1993).
2.5.3 Neutrofil
Neutrofil berkembang dalam sumsum tulang dikeluarkan dalam
sirkulasi, sel-sel ini merupakan 60 -70 % dari leukosit yang beredar. Garis
tengah sekitar 12 um, satu inti dan 2-5 lobus (Efendi, Z, 2003).
-
15
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
Gambar 2.7 Neutrofil (Theml, H et al, 2004)
Neutrofil berfungsi untuk fagositosis yaitu menghancurkan benda
asing dari luar tubuh. Proses ini dibagi menjadi 4 tahap yaitu kemotaksis,
perlekatan, penelanan, dan pencernaan. Apabila ada infeksi neutrofil akan
bergerak menuju tempat infeksi. Pergerakan ini dinamakan proses
kemotaksis. Respons terjadi apabila ada substansi yang dihasilkan oleh
bakteri sehingga merangsang neutrofil untuk mendekat, selain itu opsonin
atau antibodi juga akan merangsang proses kemotaksis.
2.6 INTERLEUKIN 1
Interleukin-1 secara umum pada mulanya dikenal sebagai polipeptida
yang merupakan derivat dari fagosit mononuklear yang meningkatkan
respons dari timosit terhadap aktivator poliklonal khususnya sebagai ko-
stimulasi dari aktifasi sel T (Syamhudi, et la 2005). IL-1 diproduksi
terutama antara lain oleh : makrofag, sel endotel, limfosit granuler, sel B,
fibroblas, sel epitel, astrosit, dan osteoblas. IL-1 juga dapat disintesis oleh
hampir semua sel berinti. IL-1 bekerja terutama sebagai mediator pada
imunitas non-spesifik bersama interferon dan tumor necrosis factor. IL-1
termasuk dalam golongan Sitokinin.
Saat ini telah jelas bahwa fungsi IL-1 secara umum adalah sebagai
mediator dari respons inflamasi imunitas natural yaitu mengaktifkan sel T,
merangsang sel T untuk memproduksi limfokin, co-factor untuk haemoptik
-
16
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
growth factor, menimbulkan panas, pelepasan ACTH, neutrofil dan respons
akut sistemik lainnya, merangsang sintesis limfokin kolagen dan
kolagenase, mengaktifkan sel endotel dan makrofag, perantara dalam
inflamasi, proses katabolik dan resistensi non spesifik terhadap bakteri.
2.7 ELISA
ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay) merupakan metode
analisis yang diguanakan untuk menganalisa sitokin dan sejenisnya secara
spesifik dan mempunyai sensitifitas yang tinggi. Metode ini pertam kali
diterapkan pada tahun 1971 dan semenjak tahun tersebut metode ini banyak
digunkan secara luas.
Uji ini menyertakan monoclonal antibody yang digunakan sebagai
pelapis microtiter plate. Setelah penambahan sampel, antibodi yang spesifik
yang ada di plate akan menangkap protein yang yang sesuai. (misal : sitokin)
lalu monoclonal antibody yang digunakan sebagai pendeteksi akan mengikat
epitop yang lain pada protein tersebut. Deteksi antibodi diberi label dengan
biotin, yang memungkinkan ikatan subsquen enzim streptavidin-terkonjugasi.
reagen yang tidak berikatan akan terbuang saat proses washing. Setelah
penambahan substrat, reaksi warna yang terbentuk berbanding lurus dengan
jumlah protein terikat. Konsentrasi protein dalam sampel ditentukan denagn cara
dibandingkan dengan kurva standar konsentrasi protein yang telah dibuat
berdasarkan standar (Sino biological.inc, 2015).
Gambar 2.8 Skema ilustrasi uji ELISA (Sino biological.inc, 2015).
Ada beberapa macam jenis ELISA yang biasa digunakan dalam analisis,
diantaranya yaitu :
-
17
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
1. Direct ELISA
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik
ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik
(monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada
sampel yang diuji.
2. Indirect ELISA
ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta
antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.
3. Competitive ELISA
Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor
ke dalam lubang mikrotiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi.
4. Sandwich ELISA
Teknik ELISA yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada
teknik ELISA ini, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan
enzim yang berfungsi sebagai signal.
2.8 HEWAN UJI ( Mencit / Mus Muskulus )
Penggunaan hewan uji dalam penelitian terus digunakan hingga massa
sekarang, penggunaannya bertujuan sebagai model dari subjek yang
sebenarnya. Dalam penelitian ini hewan yang akan digunakan sebagai objek
percobaan adalah mencit.
Gambar 2.9 Mencit Balb/C (Sino biological.inc, 2015)
-
18
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
Mencit adalah hewan pengerat, yang termasuk golongan mamalia. Hal
tersebut akan lebih jelas pada taksonomi mencit berikut :
Kingdom : Animalia
Phylum : Cordata
Sub phylum : Vertebrta
Class : Mamalia
Ordo : Rodentin
Sub ordo : Myomorpha
Family : Muridae
Sub family : Murinae
Genus : Mus
Spesies : Musculus
Morfologi mencit yang kecil memiliki panjang tubuh 75 100
milimeter dan luas permukaan tubuh 36 cm2 pada berat badan 20 gram
sehingga dalam ruangan yang relatif kecil dapat dipelihara atau digunakan
untuk penelitian dalam jumlah yang banyak (Harkness, 1983).
-
19UIN Syarif hidayatullah Jakarta
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 WAKTU DAN TEMPAT PELAKSANAAN
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Animal House FKIK UIN
Jakarta, laboratorium Bioavaibility & Bioequivalensi (PBB) UIN Jakarta dan
laboratorium Drugs Research & Development (PDR) UIN Jakarta pada Bulan
Oktober sampai Bulan Desember 2013.
3.2 BAHAN DAN ALAT
3.2.1 Bahan
a. Bahan Uji
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji
Nigella sativa L yang diperoleh dari PT. Lantabura Internasional, Depok,
berasal dari negara Etiopia.
b. Bahan Kimia
n-heksan, etanol p.a 96 %, eter, larutan NaCl, pewarna giemsa,
minyak emersi, metanol, pewarna gentian violet, asam asetat glasial,
aquadest, Na-CMC, LPS (lipopolysacharide) dari bakteri E coli (Sigma
aldrich).
c. Hewan Uji
Sebanyak 20 Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah
mencit galur balb/c berumur 6 8 minggu dengan berat badan 25 30 gram
yang diperoleh dari laboratorium terpadu UGM dan diberikan makan berupa
berupa butiran (pelet) dan minuman ad libitum.
3.2.2 Alat
Alat yang digunakan adalah perangkat gelas yang biasa digunakan
dalam laboratorium, Elysa kit (Foster biological Technology.,LTD),
timbangan analitik (wiggen hauser), mikroskop (nikon), kamar hitung
(hematocyte) (mariendfeld germany), pipet Micro, timbangan hewan,
kandang hewan uji, pipa kapiler (hematokrit), Rotary evaporator (eyela),
sentrifugator (ependorf centrifuge 5417 R), blender, tabung EDTA, tabung
ependorf.
-
20
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
3.3 PROSEDUR PENELITIAN
3.3.1 Optimasi Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L
a. Metode Ekstraksi pertama (Hailat, et al. 1998 ).
Sebanyak 500 mg biji jinten hitam (Nigella sativa L.) yang telah
dikeringkan diblender (dihaluskan) kemudian diekstraksi dengan
menggunakan sodium bicarbonat 5% (perbandingan pelarut dan serbuk
jinten hitam adalah 3 : 1) pada suhu ruangan selama 24 jam. Larutan
hasil ekstraksi 24 jam disaring dan hasil saringanya di endapkan dengan
etanol 96 % sebanyak 3 liter (perbandingan larutan dan etanol adalah 1
: 1)
b. Metode Eksraksi kedua (Toneli, et al 2008)
Polisakarida diperoleh dengan cara 30 gram serbuk Nigella
sativa L. (telah dihilangkan lemaknya dengan n-heksan) dipanaskan
dengan 2,1 L aquadest (1 :70) dalam waterbath suhu 800C selama 1 jam
dan biarkan semalam. Larutan disentrifus pada 5000 rpm selam 20
menit dan disaring. Supernatan ditambahkan etanol 90 % (1 : 1) dan
dibiarkan semalam hingga terbentuk endapan. Endapan kemudian
diuapkan dengan evaporator.
3.3.2 Preparasi sampel
1. Pembuatan Larutan Na CMC 5 %
Sebanyak 500 mg Na CMC ditimbang dan dilarutkan dengan
aquadest hangat. Kemuadian larutan terus diaduk dan ditambahkan
aquadest hingga diperoleh volume 100 ml.
2. Penentuan Dosis (Hussein El- taher, et al 2006)
Penentuan besar dosis polisakarida Nigella sativa L. Diperoleh
dari penelitian terhadap rasio sel limposit T helper. Serbuk Nigella sativa
L. diberikan kepada beberapa volunter pada dosis 1 g dua kali sehari
yang diberikan selama 4 minggu. Hasil dari penelitian tersebut Nigella
sativa L terbukti dapat meningkatkan rasio sel limposit T helper. Dari
hasil penelitian tersebut dijadikan dasar penentuan dosis. Dosis manusia
2 gram sehari diubah kedalam dosis mencit, kemudian setelah diperoleh
-
21
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
dosis mencit lalu disesuaikan dengan hasil rendemen polisakarida hasil
ekstraksi (Lampiran 10).
3.3.3 Perlakuan Hewan Uji Dan Metode Uji
Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, mencit balb/c
diaklimatisasi terlebih dahulu selama 30 hari agar dapat beradaptasi dengan
lingkungan laboratorium hewan dan dapat dikontrol kondisi kesehatannya.
a. Perlakuan Untuk Uji Total Leukosit, Limfosit, Dan Monosit
Jumlah sampel setiap kelompok berdasarkan Research Guidelines
For Evaluation The Safety And Efficiacy Of Herbal Medicines dari WHO
tiap kelompok adalah 5 ekor, sehingga mencit balb/c yang digunakan untuk
penelitian uji leukosit, limfosit dan monosit adalah 5 ekor perkelompok.
Mencit yang telah diaklimatisasi ditimbang berat badanya dan
dicatat untuk ditentukan besar dosis ekstrak yang diberikan. Setelah data
berat badan mencit diperoleh, mencit diberi polisakarida hasil ekstraksi
Nigella sativa L berdasarkan kelompok dosis dan berat badannya selama 14
hari percobaan. Setelah itu dilakukan pengambilan darah pada hari ke-7, ke-
14, dan ke-21.
Tabel 3.1. Perlakuan kelompok uji total leukosit, limfosit, dan monosit
No Kelompok Perlakuan
1 Kontrol negatif Hanya diberi Na Cmc
2 Dosis rendah Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 1,25 mg / g BB mencit selama
14 hari. Kemudian diambil darahnya hari ke-
7, ke-14, dan ke-21
3 Dosis sedang Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 2,5 mg / g BB mencit selama 14
hari. Kemudian diambil darahnya pada hari
ke-7, ke-14, dan ke-21
4 Dosis tinggi Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 5 mg / g BB mencit selama 14
-
22
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
hari. Kemudian diambil darahnya pada hari
ke-7, ke-14, dan ke-21
b. Perlakuan untuk uji interlekuin 1
Untuk uji interlekuin 1 jumlah mencit untuk tiap kelompok jumlah
sampel 5. Setelah diaklitimasi selama 1 minggu, mencit diberikan ekstrak
polisakarida secara oral selama 5 hari. Pada hari ke-5 mencit disuntik
dengan LPS 20 g/mencit setelah 2 jam pemberian ekstrak, kemudian 6
jam sesudahnya diambil darahnya untuk diambil plasmanya. Tabung yang
digunakan untuk menampung darahnya adalah tabung EDTA. Kemudian
ditentukan nilai Il-1 menggunakan ELISA kit.
Tabel 3.2. Perlakuan Kelompok Uji Interlekuin 1.
No Kelompok Perlakuan
1 Normal Hanya diberi Na Cmc secara oral, pada hari
ke-5 diambil darahnya.
2 Kontrol negatif Diberi Na Cmc secara oral disuntikan secara
i.p LPS. setelah 6 jam diambil darahnya.
2 Dosis rendah Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 1,25 mg / g BB mencit selama 5
hari. Pa da hari ke-5 disuntikkan i.p LPS lalu
setelah 6 jam diambil darahnya.
3 Dosis sedang Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 2,5 mg / g BB mencit selama 5
hari. Pa da hari ke-5 disuntikkan i.p LPS lalu
setelah 6 jam diambil darahnya.
4 Dosis tinggi Diberikan oral polisakarida Nigella sativa L
dengan dosis 5 mg / g BB mencit selama 5
hari. Pa da hari ke-5 disuntikkan i.p LPS lalu
setelah 6 jam diambil darahnya.
-
23
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
c. Pengambilan Darah (Permatasari, 2012 )
1. Sebelum pengambilan darah persiapkan terlebih dahulu eter, handscon,
kapas dan tisu.
2. Mencit yang akan diambil darahnya dianestesi menggunakan eter.
3. Posisikan mencit dengan nyaman dengan memegang tengkuk dan
kepala agar tidak banyak bergerak, kemudian Mikrohematokrit
digoreskan pada medial canthus mata di bawah bola mata ke arah
foramen opticus.
4. Mikrohematokrit diputar sampai melukai plexus, jika diputar 5 kali
maka harus dikembalikan 5 kali.
5. Tampung darah yang keluar melalui kapiler di tabung EDTA hingga
mencapai 500ul. Setelah mikrohematokrit dilepas mata mencit dilap
dengan tisu agar darah yang masih keluar segera berhenti.
3.3.3 Metode Uji
a. Uji Total Leukosit, Persentase Limfosit, dan Presentase Monosit
Darah dihisap dengan pipet leukosit sampai pada tanda 0,5 pada
pipet dan disusul dengan larutan turk sampai pada tanda 11, kemudian
salah satu ujung pipet ditutup dengan menggunakan satu ibu jari dan
yang lain dengan telunjuk selama 1- 3 menit, satu sampai dua tetes
pertama dibuang kemudian pipet ujung mikro ditempelkan pada salah
satu sisi bilik hitung yang telah diberi gelas penutup dan kertas tisu pada
sisi lawannya. Darah yang ada pada 4 bilik W (white) diamati di bawah
microskop dengan perbesaran 400. Perhitungan terhadap leukosit yang
terdapat dalam persegi 1, 2, 3, 4 atau kamar hitung hemacytometer.
Jumlah leukosit tersebut dihitung per mm3 dengan ketentuan rumus yang
telah ditentukan rumus untuk menghitung jumlah leukosit per mm3 darah
dengan ketentuan :
Luas persegi panjang : 4 mm2
tinggi kamar hitung : 0,1 mm
pengenceran : 20 kali
N : Jumlah Total Leukosit
-
24
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
jumlah leukosit per mm3 adalah , x 20 x N = 50 N (Suharti,et al 2010)
Gambar 3.1 Kamar hitung neubauer (Eki putra, 2008)
Untuk uji limfosit dan monosit Sampel darah segar diteteskan pada
gelas obyek dan dibuat preparat hapus dengan menggunakan tangan kanan
diletakkan gelas obyek lain di depan tetesan darah tersebut dengan sudut 30
- 400 C. Gelas obyek kedua didorong ke depan hingga membentuk hapus
tipis. Setelah kering preparat hapus tersebut difiksasi dengan metanol
selama 3-5 menit, dibiarkan mengering di udara. Preparat kemudian
diwarnai dengan larutan Giemza dengan pengenceran 1 : 9 selama 30 menit
(pH bufer fosfat 6,8 - 7,2). Selanjutnya preparat dicuci dengan aquades dan
dibiarkan mengering di atas rak. Setelah kering preparat diperiksa di bawah
mikroskop dengan perbesaran 100x dihitung setiap jenis leukosit
menggunakan blood counter tabulator. Sel yang dihitung paling sedikit 100
sel dan dilakukan perhitungan jumlah monosit dan limfosit (Suharti, et al
2010).
Gambar 3.2 Alur pengamatan mikroskop pada gelas objek
-
25
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
b. Uji Kadar Il-1
Untuk menentukan kadar Interlekuin-1 dalam penelitian ini
digunakan ELISA Kit (Mouse IL-1 ELISA Kit, Foster biological
Technology.,LTD). Prosedur ELISA pada tahap ini mengikuti Protokol For
ELISA Kit yang disertakan pada paket ELISA Kit.
3.4 ANALISA DATA
Untuk mengetahui efektivitas imunomodulator polisakarida Nigella
sativa L melalui pengukuran jumlah Interleukin 1 , jumlah total leukosit,
limfosit, dan monosit mencit balb/c digunakan uji analisa varian (ANOVA)
satu arah. Sebelum diuji menggunakan ANOVA data terlebih dahulu diuji
tingkat kenormalan homogenitas data dan varian datanya terlebih dahulu.
Kemudian dilihat tingkat signifikan datanya menggunakan uji turkey HSD
(Pratisto, 2010).
Hipotesis :
Ho : Tidak ada perbedaan yang signifikan antar tiap kelompok
Hi : Terdapat perbedaan yang signifikan antar tiap kelompok
Kriteria Pengujian :
Bila nilai sig < 0,05 Ho ditolak, berarti terdapat perbedaan yang signifikan
Bila nilai sig > 0,05 Ho diterima, berarti tidak terdapat perbedaan yang
signifikan.
-
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 HASIL OPTIMASI EKSTRAKSI
Bahan Nigella sativa L. yang digunakan untuk penelitian ini telah diuji
pada penelitian sebelumnya dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense,
pusat penelitian biologi LIPI, Bogor Jawa barat. Hasil determinasi menunjukan
bahwa sampel yang digunakan adalah jinten hitam (Nigella sativa L.) famili
Ranunculae (Alawiyah, 2012 ).
Metode ekstraksi pertama dilakukan dengan menggunakan metode
penelitian Nabil Hailat tahun 1998. Dari 500 gram Nigella sativa L yang
digunakan untuk proses ekstraksi didapat rendemen sebanyak 200 gram
polisakarida. Hasil ekstraksi polisakarida hitam pekat dengan bau khas Nigella
sativa L.
Gambar 4.1 Hasil ekstraksi polisakarida Nigella sativa L metode pertama.
Identifikasi awal polisakarida hasil ekstraksi ini adalah dengan uji
kualitatif. Uji pertama yang digunakan adalah metode reaksi Barfoed. Uji ini
dilakukan dengan cara menambahkan 1 ml larutan polisakarida dengan larutan
Barfoed sebanyak 2 ml, kemudian dipanaskan hingga beberapa saat. Jika
terdapat kandungan sakarida akan terbentuk endapan warna merah bata.
Semakin lama terbentuknya lapisan merah bata menunjukan semakin komplek
susunan sakarida yang ada di dalam larutan. Hasil uji ini menunjukan bahwa
ada warna merah bata pada lapisan ekstrak. Hal ini menunjukan adanya
karbohidrat jenis tertentu.
-
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.2 Hasil uji Barfoed polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.
Warna merah bata terbentuk karena adanya gugus aldehid atau keton
(gula pereduksi) bebas dalam molekul karbohidrat. Umumnya yang
teridentifikasi dengan uji ini adalah golongan monosakarida dan disakarida.
Selain uji Barfoed dilakukan juga uji Benedict. Uji ini tidak berbeda
jauh hasilnya dengan uji barfoed. Hasil uji ini juga menunjukan hasil warna
merah bata pada hasil ekstraksi polisakarida yang diperoleh.
Gambar 4.3 Hasil uji Benedict polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.
(terbentuk warna merah bata pada tabung tengah)
Uji selanjutnya dengan metode kuantitatif. Pengujian ini dilakukan di
laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech, Bogor. Metode yang digunakan
untuk mengetahui kadar polisakarida terutama karbohidratnya adalah dengan
menggunakan metode luff schoorl. Hasil uji menunjukan kadar karbohidrat
total yang diperoleh dari metode ekstraksi ini adalah sebesar : 3,81 %,
-
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sedangkan kadar inulin sebesar : 0,08 % yang diperoleh dengan metode
pengukuran dengan alat HPLC.
Metode ekstraksi polisakarida yang kedua menggunakan metode
penelitian Toneli pada tahun 2008. Ekstraksi polisakarida Nigella sativa L.
dilakukan sebanyak 3 kali (90 gram) ekstraksi, hasil dari ekstraksi sebanyak
14,5 gram polisakarida (rendemen hasil ekstraksi sebesar16,5 %). Polisakarida
hasil ekstraksi yang dihasilkan berwarna putih keabu-abuan memiliki bau
khas Nigella sativa L.
Gambar 4.4 Hasil Ekstraksi Polisakarida Nigella sativa L.
Pengukuran kadar air yang diperoleh dari hasil percobaan ini adalah
18,12 %. Pengujian kadar air dilakukan untuk menetapkan residu air setelah
proses pengentalan atau pengeringan. Kadar air merupakan standar acuan
sebagai indikasi mutu ekstrak. Hasil ekstraksi polisakarida Nigella sativa L ini
merupakan ekstrak kental sesuai dengan kriteria dari VOIG yaitu 5 30 %.
Kadar abu polisakarida yang diperoleh dari hasil ekstraksi ini
adalah sebesar 6,8 %. Kadar abu dilakukan bertujuan untuk memberi gambaran
kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari Kadar abu yang
diperoleh dari proses awal sampai akhir terbentuknya ekstrak. Pada proses ini
ekstrak dipanaskan pada suhu senyawa organik terdekstruksi hingga tersisa
unsur mineral dan anorganik saja. Data ini menunjukkan bahwa kadar abu
polisakarida jinten hitam (Nigella sativa L.) dibawah kadar maksimal
persentase kadar abu untuk ekstrak berdasarkan materia medika indonesia
sebesar 14 % (Depkes, 1980).
-
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dari hasil uji analisa di laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech
bogor diperoleh hasil kadar karbohidrat dari metode ekstraksi kedua ini adalah
sebesar 3,98 %, sedangkan inulin sebesar 3,19 %. Hasil ini lebih besar
dibandingkan dengan metode ekstraksi pertama, sehingga dalam penelitian ini
metode yang kedua digunakan sebagai metode baku yang dipakai untuk
ekstraksi polisakarida karena diduga inulin merupakan zat aktif yang
berkhasiat sebagai imunomodulator.
4.2 TOTAL LEUKOSIT
Setelah dilakukan penelitian selama 21 hari maka diperoleh data
sebagai berikut:
Tabel 4.1 Hasil perhitungan total leukosit
Setelah dilakukan penghitungan, jumlah total leukosit berkisar antara
3,8 + 0,4 hingga 8,6 + 3,0 x 103 per mm3. Jumlah terkecil terlihat pada
kelompok kontrol pada hari ke-7, sedangkan nilai tertinggi terlihat pada
kelompok dosis tinggi hari ke-21. Peningkatan tersebut sesuai dengan
peningkatan dosis yang diberikan dan lamanya pemberian ekstrak.
Berdasarkan penelitian Arrington tahun 1972, kisaran normal jumlah total
leukosit pada mencit Balb/C adalah 4 12 x 103 per mm3.
Hasil penghitungan jumlah total leukosit hari ke-7 dianalisa dengan
menggunakan program SPSS 16. Hasil uji homogenitas data menunjukkan
bahwa homogenitas data hari ke-7 memenuhi syarat untuk dilakukan uji
ANOVA (p>0,05). Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa terdapat perbedaan
yang bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok uji p=0,000
(p
-
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok
kontrol dengan dosis rendah (p=0,049), kelompok kontrol dengan dosis sedang
(p=0,016), dan kelompok kontrol dengan kelompok dosis tinggi (p=0,000).
Gambar 4.5 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-7
Jumlah total leukosit pada hari ke-14 pemberian polisakarida hasil
ekstraksi Nigella sativa L. pada dosis rendah, dosis sedang, dan dosis tinggi
yang dibandingkan dengan kelompok kontrol berada dalam kisaran jumlah
normal total leukosit. Kenaikan jumlah total leukosit sejalan dengan
peningkatan dosis polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. yang diberikan
ke mencit. Pada kelompok dosis tinggi menghasilkan jumlah total leukosit
tertinggi dibanding kelompok dosis lainya.
Hasil uji homogenitas data untuk analisa hari ke-14 menunjukkan nilai
probabilitas lebih besar dari 0,05 (p=0,602). Hasil ini menunjukkan bahwa
semua kelompok uji memiliki varian yang sama sehingga memenuhi syarat
untuk uji ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitasnya lebih
kecil dari 0,05 (p=0,000). Hasil uji ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan
yang bermakna antara kontrol dengan kelompok uji. Kemudian untuk
mengetahui tingkat kemaknaan antar kelompok dilakukan uji turkey HSD.
Hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna antar kelompok
3830
5400 5705
7030
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
hari ke 7
per m
m3
perbandingan kelompok dosis
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kontrol dengan dosis rendah (p=0,015), kelompok kontrol dengan dosis sedang
(p=0,001), dan kelompok kontrol dengan dosis tinggi (p=0,000).
Gambar 4.6 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-14
Pemberian ekstrak diberikan selama 14 hari, setelah itu pemberian
ekstrak dihentikan. Namun pengambilan darah dilakukan hingga hari ke 21.
Jumlah total leukosit pada hari ke 21 memiliki kisaran yang masih normal. Jika
diperhatikan jumlah total leukosit meningkat berdasarkan besar dosis dan lama
hari pemberian. Kelompok dosis tinggi memiliki jumlah total leukosit paling
tinggi dibanding kelompok lainya.
Hasil uji total leukosit hari ke-21 dianalisa menggunakan uji
homogenitas data. Hasil uji menunjukkan nilai homogenitas hari ke-21
memiliki nilai lebih kecil dari 0,05 (p=0,022). Nilai probabilitas uji
homogenitas data hari ke-21 tidak memenuhi syarat untuk uji ANOVA. Uji
analisa dilakukan dengan metode kruskal wallis agar diketahui kemaknaan
nilai total leukosit kontrol dengan dosis uji. Hasil Uji Kruskal Wallis
menunjukkan nilai dibawah 0,05 (p=0,037). Hasil uji ini menunjukkan bahwa
pemberian kelompok dosis pada hari ke-21 memiliki efek yang bermakna
terhadap kelompok kontrol mencit Balb/C.
4120
61856890
7975
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
hari ke 14
per m
m3
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.7 Grafik peningkatan total leukosit hari ke-21
Perbandingan rata-rata kelompok total leukosit pada hari ke-7 hari ke-
14 dan hari ke-21 yang di analisa dengan uji ANOVA memiliki nilai bermakna
tiap minggunya (p=0,001). Setelah dilakukan analisa tingkat kemaknaan rata-
rata antar kelompok menggunakan turkey HSD diketahui bahwa terdapat
perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dengan dosis rendah
(p=0,025), kelompok dosis rendah dengan kelompok dosis tinggi (p=0,045),
dan kelompok kontrol dengan dosis tinggi (p=0,001).
Dari pemaparan data diatas menunjukkan bahwa pemberian
polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L pada mencit Balb/C mampu
meningkatkan jumlah total leukosit, dan semakin tinggi dosis pemberian
ekstrak jumlah total leukosit semakin meningkat. Peningkatan jumlah sel ini
tidak melebihi rentang jumlah sel leukosit normal untuk mencit Balb/C.
Leukosit merupakan mekanisme pertahanan imun non spesifik tubuh.
Umumnya sel ini berperan dalam mempertahankan tubuh dari penyusupan
benda asing (Sadikin, 2002). Jumlah total leukosit yang berada pada batas
tertinggi normal menunjukkan sistem imun memproduksi jumlah total leukosit
yang cukup dalam sirkulasi darah untuk melawan infeksi. Peningkatan jumlah
total leukosit menunjukkan kemampuan sistem imun untuk melawan infeksi
atau benda asing (Viera, 2011 ).
4170
6695 6935
8640
0100020003000400050006000700080009000
10000
hari ke 21
per m
m3
perbandingan perlakuan kelompok dosis
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.3 JUMLAH LIMFOSIT
Setelah penghitungan total leukosit penelitian dilanjutkan dengan
menghitung kembali jumlah limfosit. Dari pengamatan didapatkan hasil dalam
bentuk persentase lalu dikalikan dengan jumlah total leukosit. Sehingga
didapatkan data jumlah limfosit dalam bentuk rata-rata perkelompok sebagai
berikut:
Tabel 4.2 Rata-rata Jumlah Limfosit.
Hasil uji menunjukkan bahwa nilai limfosit mencit Balb/C pada tabel
diatas berada pada kisaran normal jumlah limfosit pada mencit Balb/C. yaitu
3.300 - 14.250 per mm3 (research animal resources university of minnesota).
Jumlah limfosit hari ke-7 dianalisa menggunakan SPSS 16. Analisa
dimulai dengan uji homogenitas. Uji ini untuk mengetahui uji yang sesuai
dipakai untuk melihat kemaknaan antara kontrol dengan kelompok pemberian
dosis.
Hasil uji homogenitas data hari ke-7 menunjukkan nilai
probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=0,449). Hal ini menunjukkan dari
setiap kelompok uji memiliki varian yang sama, sehingga bisa dilakukan uji
ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa nilai probabilitas data yang
diperoleh lebih kecil dari 0,05 (p=0,000). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat
perbedaan yang bermakna antara kelompok uji dengan kelompok kontrol.
Kemudian untuk mengetahui kemaknaaan antar kelompok masing masing hasil
penelitian dianalisa menggunakan uji Turkey HSD. Hasil uji ini menunjukkan
bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dengan
kelompok dosis renda (p=0,043), kontrol dengan dosis sedang (p=0,039), dan
kontrol dengan dosis tinggi (p=0,000).
DosisRata-rata jumlah total limfosit (x 103 per mm3)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol 3,4 + 0,5 3,8 + 0,5 4,4 + 0,6
Dosis rendah 4,8 + 0,7 5,5 + 1,4 6,6 + 0,8
Dosis sedang 4,8 + 1,2 5,5 + 1,08 6,8 + 2,5
Dosis tinggi 6,2 + 1,1 7,0 + 1,2 8,5 + 4,3
-
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.8 Grafik peningkatan jumlah hari ke-7
Pada uji homogenitas data hari ke-14 diperolah nilai probabilitas
data sebesar 0,935, sehingga bisa dilakukan Uji ANOVA. Setelah dilakukan
uji ANOVA didapatkan hasil nilai probabilitas datanya lebih kecil dari 0,05
(p=0,003). Hasil ini menunujukan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna
antara kelompok kontrol dengan kelompok dosis. Kemudian uji dilanjutkan
dengan uji Turkey HSD untuk mengetahui tingkat kemaknaan antar
kelompoknya. Hasil analisis Turkey HSD yang diperoleh menunjukkan bahwa
kelompok kontrol berbeda secara bermakna dengan kelompok dosis tinggi
(p=0,001).
Gambar 4.9 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-14
3416,4
4827,6 4894,9
6256,7
0,0
1000,0
2000,0
3000,0
4000,0
5000,0
6000,0
7000,0
hari ke 7
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis limfosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
3807
5542 5526
7114
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
hari ke 14
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis limfosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hasil uji homogenitas data hari ke-21 menunjukkan bahwa nilai
homogenitas datanya dibawah 0,05 (p=0,039), hal ini menunjukkan bahwa
hasil pengamatan hari ke-21 tidak dapat diuji menggunakan Uji ANOVA,
alternatif uji yang digunakan untuk mengetahui kemaknaan suatu analis setelah
Uji ANOVA adalah uji Krusskal Wallis. Hasil uji kruskal wallis menunjukkan
bahwa nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=0,063). Data hasil uji
ANOVA dan Kruskal Wallis tidak menunjukkan hasil yang signifikan untuk
pengamatan hari ke-21, namun jika diamati hasil grafiknya hasil uji hari ke-21
memiliki grafik yang meningkat.
Gambar 4.10 Grafik peningkatan jumlah limfosit hari ke-21
Perbandingan rata-rata peningkatan limfosit tiap kelompok hari ke-
7, hari ke-14 dan hari ke-21 diuji menggunakan ANOVA menunujukan hasil
yang signifikan (p=0,011). Dari beberapa dosis yang diberikan ke mencit
Balb/C, dosis tinggi (5mg/g BB mencit) memberikan efek yang paling
signifikan (p=0,007). Peningkatan efek imunostimulan tersebut berbanding
lurus dengan besar dosis yang diberikan.
Limfosit adalah sel yang menghasilkan antibodi terhadap berbagai
benda atau senyawa asing (Sadikin, 2002). Sel-sel limfosit ini mempunyai
peran yang sangat penting dalam mekanisme pertahanan atau imunitas spesifik.
4119,96
6641,44 6879,52
8588,16
0100020003000400050006000700080009000
10000
hari ke 21
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis limfosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sel limfosit tubuh terdiri dari tiga macam sel yaitu: natural killer cell, limfosit
T, dan limfosit B (lichman, et al. 2007). Sel-sel ini dihasilkan di sumsum
tulang, namun tempat pematangan selnya berbeda. Limfosit T dimatangakan
di timus setelah keluar dari sumsum tulang. Sel ini akan bekerja secara selular
dan akan menyerang antigen yang ada di sel. Berdasarkan fungsinya limfosit T
dibedakan menjadi 3 macam : sel T helper,sel T killer, dan supresor sel T. Sel
B yang dimatangkan di susmsum tulang mempunyai fungsi imunitas secara
humoral. Sel ini menghasilkan antibodi serta dapat menyimpan memori untuk
mengenali antigen yang pernah masuk dalam tubuh. Sedangkan sel natural
killer memiliki sifat yang tidak spesifik, sel ini kan mendestruksi sel sel yang
terinfeksi.
Pada penelitian ini polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.
dapat meningkatkan jumlah dari sel limfosit secara signifikan. Dari pemaparan
sebelumnya peningkatan sel limfosit terlihat mulai dari pengamatan hari ke-7.
Hal ini menunjukan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. sangat
efektif dalam peningkatan imun spesifik. Pada pengamatan hari ke-14 jumlah
limfosit terus meningkat berbanding lurus dengan jumlah dosis yang diberikan.
Sedangakan pada hari ke-21 jumlah limfosit terus meningkat namun secara
statistik nlainya tidak bermakna. Hal ini disebabkan karena jumlah limfosit
pada beberapa individu mencit mulai mencapai jumlah maksimal nilai normal
limfosit, sedangkan limfosit memiliki rentang umur yang panjang yaitu
berkisar antara 1 minggu hingga beberapa bulan (Britanica, 2015). Nilai
limfosit terus berada pada kisaran normal karena jumlah limfosit dijaga
kestabilanya oleh limfosit T supresor, jumlah limfosit akan terus pada kondisi
normal selama tidak ada paparan patogen.
-
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4 JUMLAH MONOSIT
Penghitungan jumlah monosit yang dilakukan dengan metode yang sama
pada penghitungan limfosit didapatkan hasil sebagai berikut:
Tabel 4.3 Rata-rata Jumlah Monosit.
Hasil perhitungan jumlah monosit dari pengamatan hari ke-7, hari ke-
14, dan hari ke-21 menunjukkan bahwa Jumlah monosit terkecil terlihat pada
kelompok dosis tinggi hari ke-21, sedangkan nilai tertinggi terlihat pada
kelompok dosis tinggi hari ke-14. Rata-rata jumlah monosit mencit normal
berada pada kisaran antara 0,060 0,600 x103 per mm3 (Research animal
resources, University Of Minnesota). Untuk mengetahui pengaruh aktifitas
polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. terhadap jumlah monosit mencit
Balb/C maka dilakukan analisa uji statistik. Uji ini diawali dengan uji
homogenitas data kemudian jika memenuhi syarat dilakukan uji ANOVA, dan
jika nilai homogenitas data tidak memenuhi syarat uji ANOVA, maka
dilakukan uji kruskal wallis (Sopiyudin, 2001).
Hasil uji honogenitas data hari ke-7 menunjukkan nilai probabilitas uji
homogenitas data hasil pengamatan lebih besar dari 0,05 (p=0,166), nilai ini
memenuhi untuk uji ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai
probabilitasnya lebih besar dari 0,05 (p=380). Karena nilai probabilitas data
lebih besar dai 0,05 uji dilanjutkan ke uji non parametrik kruskal wallis. Hasil
uji kruskal wallis menunjukkan nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05
(p=0,555). Hal ini menunjukkan tingkat dosis hari ke-7 tidak mempengaruhi
jumlah monosit.
Dosis
Rata-rata jumlah jumlah monosit (x 103 per
mm3)
Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21
Kontrol 0,25 + 0,08 0,26 + 0,23 0,05 + 0,08
Dosis rendah 0,51 + 0,28 0,50 + 0,283 0,053 + 0,156
Dosis sedang 0,45 + 0,27 0,52 + 1,174 0,055 + 0,08
Dosis tinggi 0,49 + 0,314 0,54 + 0,527 0,034 + 0,034
-
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.11 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-7
Uji homogenitas data hari ke-14 menunjukkan nilai probabilitas
datanya lebih besar dari 0,05 (p=0,075). Kemudian dilanjutkan uji ANOVA.
Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih besar dari
0,05 (p=0368). Karena nilai uji anova tidak memenuhi syarat, maka uji
dilanjutakn ke uji non parametrikKruskal wallis. Hasil uji kruskal wallis
menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih besar dari 0,05 (p=0,128). Hasil
uji ini menunjukkan bahwa Variasi dosis yang diberikan ke mencit Balb/C
tidak mempengaruhi kadar jumlah monosit.
Gambar 4.12 Grafik peningkatan jumlah monosit hari ke-14
252,78
518,4456,4
492,1
0
100
200
300
400
500
600
hari ke 7
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis monosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
263,68
507,17 523,64542,3
0
100
200
300
400
500
600
hari ke 14
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis monosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Uji homogenitas data hari ke-21 menunjukkan bahwa nilai
probabilitas datanya lebih besar dari 0,243. Hasil uji ini memenuhi syarat uji
ANOVA. Hasil uji ANOVA menunjukkan nilai probabilitas datanya lebih
besar dari 0,05 (p=0,910). Karena hasil uji ANOVA nilai probabilitasnya
terlalu besar, maka uji dilanjutkan ke uji non parametrik kruskal wallis. Hasil
uji kruskall wallis menunjukkan nilai probabilitasnya lebih besar dari 0,05
(p=0,128). Hai ini menunjukan bahwa pengujian polisakarida hasil ekstraksi
Nigella sativa L. pada hari ke-21 tidak memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap jumlah monosit mencit Balb/C.
Gambar 4.13 Grafik Peningkatan Monosit hari ke-21
Monosit berfungsi sebagai fagosistik mononuklear. Sel ini
dimatangkan di sum-sum tulang selama 1 sampai 3 hari, kemudian bersirkulasi
di darah sangat singkat (kurang lebih 1,5 hari) dan akhirnya berpindah ke
jaringan untuk mengambil peranya sebagai makrofag (Nicholis, et al 1971).
Sel makrofag memiliki peran melakukan fagositosis dan menghancurkan
partikel asing dan jaringan mati serta mengolah bahan asing tersebut untuk
dapat merangsang sistem tanggap kebal di tubuh sehingga terbentuk komplek
antigen antibodi (Eki Putra, 2008). Hal inilah yang diindikasikan mengapa
jumlah leukosit pada hari ke-21 mengalami penurunan. Sel-sel monosit yang
ada di darah telah berpindah ke jaringan karena siklus hidup monosit memang
sangat pendek ada di darah. Selain itu, lamanya penelitian (selama 21 hari)
50,0453,56 55,48
34,56
0
10
20
30
40
50
60
hari ke 21
per m
m3
perbandingan antar kelompok dosis monosit
kontrol dosis rendah dosis sedang dosis tinggi
-
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
memicu mencit menjadi lemah sehingga mempercepat proses perpindahan
monosit ke jaringan.
4.5 KADAR INTERLEUKIN 1
Analisa Interlekuin 1 tidak dilakukan pengulangan seperti pada uji
total leukosit. Pengujian hanya dilakukan pada hari ke 5 saja.
Tabel 4.4 Rata-rata Jumlah Nilai Il-1
Hasil uji ELISA menunjukan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella
sativa L. terlihat meningkatkan kadar interleukin 1 dalam darah mencit.
Peningkatan ini berbanding lurus dengan bertambah besarnya dosis yang
diberikan. Kelompok kontrol negatif yang telah diinduksi dengan LPS
menunjukan peningkatan jumlah interleukin-1 sebesar 71,3 % (27,2 g/ml)
dari jumlah total interleukin kelompok kontrol (7,8 g/ml). Peningkatan ini
karena pemberian lipopolisakarida dari dinding sel yang memicu terjadinya
inflamasi dalam tubuh mencit. Pada reaksi inflamasi dalam sistem imun terjadi
pelepasan sitokin pro inflamasi (TNF dan IL 1). Pelepasan sel-sel ini dalam
tubuh dimaksudkan untuk memacu vasodilatasi, melonggarkan hubungn sel-
sel endotel, meningkatkan adhesi neutrofil dan migrasi sel-sel ke jaringan
sekitar untuk memakan mikroba (bratawijaya, 2010). Meskipun perkembangan
respon inflamasi efektif berperan penting pada pertahanan tubuh namun respon
tersebut menimbulkan kerusakan. Alergi, penyakit auto imun, infeksi mikroba,
transplantasi dan luka bakar dapat mengawali respon inflamasi kronis
(Bratawijaya, 2010). Dalam penelitian ini diharapkan pemberian ekstrak
DosisRata-rata jumlah total Interleukin 1
(g/ml)
Normal 7,8 (+ 0,0)
Kontrol negatif 27,2 ( + 25,9)
Dosis rendah 33,8 ( + 22,0)
Dosis sedang 158,4 ( + 136,2)
Dosis tinggi 262,5 ( + 264,1)
-
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. diharapkan dapat menekan
produksi interleukin 1 pada mencit balb/c yang telah diinduksi dengan LPS.
Pada pemberian polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. kelompok
dosis rendah menunjukkan bahwa ekstrak ini tidak dapat menurunkan jumlah
kadar interleukin-1. Hasil pengamatan pada dosis rendah ini justru
menunjukan hasil sebaliknya. Hasil pengamatan menunjukan peningkatan
kadar sebesar 33,8 (g/ml). Peningkatan kadar interleukin-1 juga terjadi pada
kelompok dosis sedang dan pada dosis tinggi sebesar 158,4 (g/ml) dan 262,5
(g/ml).
Gambar 4.14 Grafik hasil uji interleukin 1.
Jika dianalisa berdasarkan hasil uji statistika, nilai homogenitas data
uji kadar interleukin 1 memiliki nilai lebih kecil dari alfa (p=0,000). Hal ini
mengindikasikan bahwa data tidak dapat dilakukan uji ANOVA. Uji statistik
untuk data yang homogenitasnya tidak normal adalah menggunakan krusial
Wallis. Namun setelah dilakukan uji statistik krusial-Wallis nilai
probabilitasnya lebih besar dari alfa (P=0,319), sehingga dapat diambil
kesimpulan bahwa polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. tidak memiliki
pengaruh yang bermakna terhadap jumlah kadar interleukin 1.
7,827,2 33,8
158,4
262,5
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
(g/
ml)
kadar interleukin
normal kontrol negatif dosis 1 dosis 2 dosis 3
-
42UIN Syarif hidayatullah Jakarta
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 KESIMPULAN
1. polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. dosis 1,25 mg/BB mencit,
2,5 mg /BB mencit dan 5 mg /BB mencit mampu mempengaruhi jumlah
total leukosit dan jumlah limfosit dan tidak mempengaruhi jumlah
monosit.
2. Dosis polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L. yang memiliki efek
imunomodulator paling baik adalah dosis tinggi (5 mg/BB mencit).
3. Pada uji interleukin 1 belum bisa disimpulkan datanya, karena
berdasarkan analisa statistika datanya tidak sigifikan.
5.2 SARAN
Perlu dilakukan uji lanjutan terhadap hewan percobaan yang lebih
besar seperti tikus guna melihat terjadinya penurunan jumlah total leukosit
dan limfosit setelah pemberian polisakarida hasil ekstraksi Nigella sativa L.
-
43
UIN Syarif hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Alawiyah arifiani, Aulina. 2012. Karakterisasi Simplisia Dan Standardisasi
Ekstrak Etanol Biji Jinten Hitam (Nigella Sativa L.). Program Studi
Farmasi, Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah. Jakarta
Bratawidjaja, Imunologi dasar. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit FKUI ;2002.
Bratawidjaja, Immunologi Dasar. Edisi 9 Jakarta: Balai Penerbit FKUI ;2010.
Britanica, Ensikl