Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis Garcinia...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase

Virus Hepatitis C

SKRIPSI

PUTRI SYAJARWATI 10810200032

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA JANUARI 2013

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase

Virus Hepatitis C

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

PUTRI SYAJARWATI 10810200032

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA JANUARI 2013

v

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Putri Syajarwati NIM : 108102000032 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si, Apt ( )

Pembimbing II: A. Zaenal Mustopa, M.Si ( )

Penguji I : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )

Penguji II : Puteri Amelia, M.Farm., Apt ( )

Penguji III : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt ( ) Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 22 Januari 2013

Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. Dr.(hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp. And

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Putri Syajarwati Program Studi : Farmasi Judul : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia

mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C (HCV) merupakan penyebab penyakit hepatitis C yang mempunyai tingkat virulensi yang tinggi. Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini adalah menggunakan pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan ribavirin, namun memiliki efektivitas yang rendah sekitar 40% – 50%. Upaya penemuan obat terhadap infeksi HCV diantaranya adalah dengan pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi HCV, salah satunya adalah RNA helikase. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman tropis yang banyak dibudidayakan di Indonesia dan dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol kulit buah manggis sebagai inhibitor RNA helikase HCV. Aktivitas inhibisi dihitung berdasarkan pelepasan fosfat anorganik dengan metode kolorimetri ATPase. Kulit buah manggis diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Ekstrak kasar kulit buah manggis dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, dan 391 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak yang memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terdapat pada ekstrak metanol yaitu sebesar 71,57%. Sedangkan, ekstrak n-heksan memiliki aktivitas 41,79%, dan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas terendah yaitu sebesar 39,07%. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai inhibitor virus hepatitis C. Kata kunci : Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), Virus hepatitis C, Uji

kolorimetri ATPase.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Putri Syajarwati Program Study : Pharmacy Title : Activity Test of Mangosteen (Garcinia mangostana L.)

Pericarp Extract as Inhibitor of Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C virus (HCV) is the cause of chronic hepatitis C disease that has a high level of virulence. To date, there is no prophylactic vaccine and medicine avalaible to prevent and treat HCV infection. The current treatment therapy is involves the administration of pegylated interferon-α (IFN-α) in combination with ribavirin, but it has a low effectiveness rate of about 40% - 50%. Infectious disease drug discovery efforts include the search HCV inhibitor to an enzyme essential for viral replication of HCV, in example RNA helicase. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a tropical plant widely cultivated in Indonesia and has been used as traditional medicine. This study aims to examine the activity n-hexane, ethyl acetate, and methanol extracts of mangosteen pericarp as an inhibitor of HCV RNA helicase. Inhibitory activity was calculated based on the release of inorganic phosphate by the ATPase colorimetric assay. Pericarp of mangosteen was extracted using the n-hexane, ethyl acetate, and methanol. Crude extract dilution pericarp of mangosteen is made using absolute methanol with a concentration of 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, and 391 ppm. The results indicated that the highest inhibitory activity at a concentration of 3.125 ppm was observed in methanol extracts, 71.57%. While n-hexane has activity 41.79%, and the lowest activity of the ethyl acetate extract is equal to 39.07%. These results indicate that pericarp of mangosteen extract has potential as inhibitor of the HCV. Keywords: Mangosteen (Garcinia mangostana L.) pericarp, Hepatitis C Virus,

ATPase Colorimetric Assay.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur saya panjatkan kepada Allah SWT,

Zat Yang Maha Kasih dan Maha Penyayang yang telah melimpahkan rahmat dan

hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini

dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana

Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,

dari masa kuliah sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk

menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada :

(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Apon Zaenal

Mustopa, M.Si. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam proses

penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan

bimbingan ibu dan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

(2) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta

(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta

(4) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan

dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

(5) Teman seperjuangan dalam penelitian Yuni, dan keluarga besar Laboratorium

Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, Ibu Rifqiyah, Pak Ridwan, Ibu Linda,

Aksar, Kak Bobby, Kak Meita, Bia, Krishna, dan Hary, yang telah banyak

membantu penulis dalam penelitian.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(6) Teman-teman Farmasi angkatan 2008 dan sahabat-sahabat tercinta Berty, Sekar,

Sukma, dan Via yang berbagi suka, duka, keceriaan, dan semangat semasa kuliah

hingga penyelesaian tugas akhir ini.

(7) Adik-adik tersayang, Zaky, Hanna, Farih, yang tak henti memberikan dukungan

dan semangat.

(8) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda H.Najmudin dan Ibunda Hj.Siti Maemunah

yang tak pernah letih mencurahkan kasih sayangnya dalam setiap doa dan

dukungan yang diberikan kepada penulis, untuk menyelesaikan tugas akhir ini

semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh

lebih baik disisi-Nya.

Akhir kata, semoga Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua

pihak yang telah membantu. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih

jauh dari kata sempurna, untuk itu saran dan kritik tetap penulis harapkan untuk

menjadikan tulisan ini lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini membawa

manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan maupun sebagai tambahan informasi

untuk memperkaya ilmu di kemudian hari.

Jakarta, Januari 2013

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Putri Syajarwati NIM : 108102000032 Program Studi : Farmasi Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

UJI AKTIVITAS EKSTRAK KULIT BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.) SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta Pada Tanggal : 22 Januari 2013

Yang menyatakan,

(Putri Syajarwati)

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................... vi ABSRTACT .................................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................... viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... x DAFTAR ISI ................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv DAFTAR ISTILAH ....................................................................................... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 2 1.3 Hipotesis .................................................................................................. 2 1.4 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 3 1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................... 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 4 2.1 Manggis.................................................................................................... 4

2.1.1 Klasifikasi ...................................................................................... 4 2.1.2 Nama Daerah ................................................................................. 4 2.1.3 Penyebaran Geografi ...................................................................... 4 2.1.4 Deskripsi ........................................................................................ 5 2.1.5 Kandungan ..................................................................................... 6 2.1.6 Kegunaan ....................................................................................... 6

2.2 Ekstraksi ................................................................................................... 7 2.2.1 Metoda Ekstraksi ........................................................................... 7 2.2.2 Parameter Ekstrak .......................................................................... 9

2.3 Virus Hepatitis C...................................................................................... 9 2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................. 12 2.5 Kolorimetri ATPase ................................................................................. 15 2.6 SDS-PAGE .............................................................................................. 15

BAB 3. METODOLOGI ................................................................................ 17 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 17 3.2 Alat dan Bahan ......................................................................................... 17

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.1 Alat ................................................................................................. 17 3.2.2 Bahan ............................................................................................. 17

3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................. 18 3.3.1 Pengambilan Sampel ................................................................... 18 3.3.2 Determinasi Sampel .................................................................... 18 3.3.3 Pembuatan Simplisia ................................................................... 18 3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis .................................... 18 3.3.5 Penapisan Fitokimia .................................................................... 19 3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik ........................ 20 3.3.7 Produksi RNA Helikase HCV .................................................... 21 3.3.8 Konfirmasi Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV

dengan SDS-PAGE ..................................................................... 23 3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV .................................. 24 3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi terhadap RNA Helikase HCV .................. 24

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 26 4.1 Determinasi Sampel ................................................................................. 26 4.2 Rendemen Ekstrak ................................................................................... 26 4.3 Penapisan Fitokimia ................................................................................. 28 4.4 Parameter Standar Ekstrak ....................................................................... 31 4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C .............................................. 31 4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Garcinia mangostana L. terhadap

RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................ 35

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 40 5.1 Kesimpulan. ........................................................................................... 40 5.2 Saran ........................................................................................... 40

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 41 LAMPIRAN .................................................................................................... 45

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 2.1 Inhibitor RNA Helikase HCV .......................................................... 14 Tabel 4.1 Rendemen Ekstrak Kulit Buah Mangis ............................................ 27 Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis................. 28 Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak ............................................................... 31 Tabel 4.4 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA

Helikase HCV .................................................................................. 36

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Struktur Virus Hepatitis C ............................................................ 10 Gambar 2.2 Peta Genomik RNA Helikase HCV ............................................. 13 Gambar 2.3 Mekanisme Kerja RNA Helikase HCV ....................................... 13 Gambar 4.1 SDS-PAGE RNA Helikase HCV ................................................. 34 Gambar 4.2 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ............................................................................. 37

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Garcinia mangostana L .............................. 45 Lampiran 2. Alur Penelitian .......................................................................... 46 Lampiran 3. Skema Kerja Penyiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis ............. 47 Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV ................. 48 Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA Helikase

HCV dengan SDS-PAGE ......................................................... 49 Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV ........... 50 Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah

Manggis terhadap RNA helikase HCV .................................... 51 Lampiran 8. Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam

SDS-PAGE ............................................................................... 52 Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan ...... 53 Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis .............. 54 Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis. .............. 55 Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis .......... 57 Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis

terhadap Enzim RNA Helikase HCV ....................................... 59 Lampiran 14. Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah

Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ........................ 60 Lampiran 15. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ......................................... 61 Lampiran 16. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................ 62 Lampiran 17. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ........................... 63 Lampiran 18. Gambar Alat Penelitian ............................................................ 64

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

APS : Ammonium Per Sulfat ATP : Adenosin Trifosfat IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase IV : Inner volum HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin W : Washing

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Virus hepatitis C (HCV) menginfeksi lebih dari 170 juta orang di seluruh

dunia. HCV mengakibatkan peradangan hati, sirosis hati, dan kanker hati

(hepatocellular carcinoma) (Lee et al, 2010). Pasien yang menderita hepatitis C

akut dapat berkembang menjadi infeksi kronis. Hal ini yang menyebabkan

kematian ratusan ribu penderita setiap tahun (Kawo et al, 2012). Menurut data

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, pada tahun 2010 jumlah penderita

hepatitis C di Indonesia cukup tinggi sekitar 30 juta jiwa (Kemenkes RI, 2010).

Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan

mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini untuk hepatitis C kronis

adalah pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan nukleosida analog

ribavirin. Akan tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas sekitar 40% – 50%

terhadap infeksi HCV. Kombinasi ini memiliki efek samping seperti flu, anemia,

dan depresi, yang sering menyebabkan penghentian terapi. Dengan demikian,

diperlukan penelitian untuk menemukan agen baru dengan indeks terapi tinggi

dan efek samping minimal untuk mengobati infeksi HCV kronis (Lee et al, 2010,

Ravikumar et al, 2011).

Upaya penemuan obat penyakit infeksi HCV diantaranya adalah dengan

pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi virus HCV

salah satunya adalah RNA helikase. RNA helikase berperan dalam pembukaan

untai ganda RNA. RNA helikase memiliki tiga aktivitas yaitu, aktivitas ikatan

RNA (RNA binding), pengikatan ATPase (RNA-stimulated ATPase), dan

pembukaan rantai RNA. Proses pembukaan untai ganda RNA virus sebagai

materi genetik apabila tidak dilakukan, maka proses translasi informasi genetik

tidak dapat berjalan, sehingga siklus hidup HCV terhenti. Hal ini menujukkan

bahwa dengan penghambatan enzim RNA helikase HCV, maka dapat

dikembangkan potensi penemuan obat anti HCV (Utama et al, 2000).

2


Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi saat ini menjadikan obat

herbal cukup menjadi perhatian untuk dikembangkan menjadi bagian dari

pengobatan formal di Indonesia (Wasito, 2011). Manggis (Garcinia mangostana

L.) merupakan tanaman tropis yang memiliki aktivitas biologis yang menarik

dengan aplikasi terapi yang potensial. Manggis banyak dibudidayakan di hutan

hujan tropis seperti Indonesia, yang secara tradisional digunakan untuk

pengobatan sakit perut, diare, astringent, disentri, infeksi luka, nanah, maag

kronis, keputihan dan gonore (kencing nanah) (Moongkarndi et al, 2003).

Spesies Garcinia dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon. Santon

ditemukan dalam kulit buah, buah utuh, kulit kayu, dan daun manggis (Chaverri

et al, 2008). Pada kulit buah manggis terdapat senyawa tanin, santon, isoflavon,

flavon, dan senyawa bioaktif lainnya (Yu et al, 2006). Senyawa bioaktif yang

terkandung dalam ekstrak kulit buah manggis telah diteliti memiliki aktivitas

sebagai anti oksidan, anti tumor, anti inflamasi, anti alergi, anti bakteri, anti fungi,

anti virus, dan anti malaria (Chaverri et al, 2008). Sedangkan penelitian terdahulu

mengenai anti virus yaitu ekstrak etanol sampel Garcinia mangostana L.

memiliki potensi sebagai inhibitor HIV-1 protease (Chen et al, 1996) dan

inhibitor HIV-1 reverse transkriptase (Chin et al, 2008). Berdasarkan hal tersebut,

maka penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas ekstrak kulit buah manggis

(Garcinia mangostana L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

1.2 Rumusan Masalah

Belum diketahui apakah ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) memiliki aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis

C.

1.3 Hipotesis

Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) mampu berperan

sebagai inhibitor enzim RNA helikase virus hepatitis C.

3


1.4 Tujuan Penelitian

Mengetahui aktivitas ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana

L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

mengenai pemanfaatan bahan alam, khususnya kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) sebagai inbitor RNA helikase virus hepatitis C.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2. 1. Manggis (Garcinia mangostana L.)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman

Menurut United States Departement of Agricultural, klasifikasi dari

Manggis (Garcinia mangostana L. ) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Sub Kingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Dilleniidae

Ordo : Theales

Famili : Clusiaceae

Genus : Garcinia

Spesies : Garcinia mangostana L.

2.1.2 Nama Daerah

Manggis dalam bahasa Belanda disebut manggistan, Perancis

mangoustan, sedangkan dalam bahasa Inggris adalah mangosteen. Di Indonesia

sendiri di Aceh dikenal dengan nama manggoita, Batak dikenal dengan nama

manggisto, manggus, atau manggusta, di Jawa manggis, di Sunda disebut

manggu, dan secara keseluruhan di Indonesia dikenal dengan nama manggis

(Heyne, 1987).

2.1.3 Penyebaran Geografi

Manggis tersebar di Asia Tenggara, yaitu dari Indonesia ke Timur

sampai Nugini dan Kepulauan Mindanao (Filipina), dan ke Utara melalui

Semenajung Malaysia ke bagian selatan Thailand, Myanmar, Vietnam, dan

5


Kamboja. Hanya dalam 2 abad terakhir tanaman ini tersebar ke negara-negara

tropis lainnya, termasuk Sri Lanka, India Selatan, Amerika Tengah, Brazil, dan

Australia (Verheij, 1997). Di Indonesia, ditanam diseluruh Nusantara, di Jawa

dapat ditemukan hampir semua desa di bawah ketinggian 1500 m diatas

permukaan laut (Heyne, 1987).

2.1.4 Deskripsi

Manggis merupakan pohon yang bersifat dioesis, tingginya 6 - 25 m,

berbatang lurus, bercabang-cabang simetris, membentuk tajuk piramid

beraturan, sesuai dengan model arsitektur Attims. Semua bagian tanaman

mengeluarkan getah kuning jika dilukai. Daunnya berhadapan, dengan

tangkainya yang memeluk pucuk, sehingga pasangan teratas menutupi kuncup

terminalnya, lembaran daun berbentuk lonjong atau jorong, berukuran (15-25)

cm x (17-13) cm, menjangat dan tebal, pinggirannya rata, bagian ujungnya

loncos (cuspidate), lembaran sebelah bawah berwarna hijau-kuning, dengan urat

tengah yang hijau muda, menonjol pada kedua belah daun, dan memiliki banyak

samping yang menonjol dan berjarak sama. Bunga-bunganya menyendiri atau

tidak berpasang-pasangan, berada di ujung ranting, bergagang pendek dan tebal,

berdiameter kira-kira 5,5 cm; daun kelopak 4 helai, tersusun dalam 2 pasang;

daun mahkota 4 helai juga, tebal dan berdaging, berwarna hijau-kuning, dengan

pinggiran kemerah-merahan; benang sari semu biasanya banyak, berseri 1 – 2,

panjangnya kira-kira 0,5 cm; bakal buah tak bertangkai, berbentuk agak bulat,

beruang 4 – 8. Buahnya bertipe buah buni yang bulat dan berkulit licin,

berdiameter 4 – 7 cm, sewaktu matang berubah menjadi lembayung tua, dengan

daun kelopak yang tetap menempel dan tetap dihiasi oleh cuping kepala putik;

daging buah tebalnya kira-kira 0,9 cm, berwarna lembayung; 0 – 3 ruang berisi

biji yang berkembang sempurna, terbungkus oleh aril yang berwarna putih

(Verheij, 1997).

6


2.1.5 Kandungan

Kulit buah manggis kaya akan pektin, dan juga berisi tanin, katekin,

rosin, dan zat warna hitam (Verheij, 1997). Yu et al, 2007 menyebutkan bahwa

kulit buah manggis mengandung senyawa tanin, santon, isoflavon, flavon, dan

senyawa bioaktif lainnya, sedangkan dalam penelitian Pasaribu et al, 2012

dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid,

flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid. Metabolit sekunder khas

yang melipah pada kulit buah manggis adalah santon (Yu et al, 2007). Menurut

Chaverri et al, 2008 pada manggis terdapat konstituen utama santon seperti α-

mangostin, β-mangostin, γ-mangostin, gartanine, garcinone E, 8-

deoxygartanine. Sedangkan pada penelitian lain juga disebutkan bahwa

konstituens utama yang diperoleh dari kulit buah manggis adalah

tetrahydroxanthone, garcimangosxanthone (Zhang et al, 2010).

2.1.6 Kegunaan

Kulit Buah Manggis memiliki banyak kegunaan, yaitu sebagai

astringen, berupa obat dalam bentuk seduhan ataupun dikeringkan dan digerus

menjadi serbuk. Sebagai obat luar antara lain injeksi annal pencuci perut. Obat

seduhan digunakan untuk mengobati diare, disentri kronis, peradangan saluran

kemih kronis, pendarahan usus, dan sebagai obat cacing. Penggunaan luar untuk

wasir, terhadap borok, terhadap tonsil bengkak, tumor rongga mulut dan

kerongkongan, pembentukan ludah berlebihan, beser putih (flour albus) dan

sebagainya (Heyne, 1987). Sedangkan berdasarkan penelitian, santon yang

merupakan kandungan utama kulit buah manggis, dilaporkan memiliki aktivitas

sebagai anti oksidan, anti inflamasi, anti kanker ( kanker payudara, kanker hati,

kanker darah, dan kanker paru-paru), anti tumor, anti alergi, anti bakteri, anti

fungi, anti virus, dan anti malaria (Zhang et al, 2010, Wang et al, 2011,

Chaverri et al, 2008).

7


2.2 Ekstraksi

2.2.1 Metoda Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia

dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode ekstraksi senyawa

bukan atom dipergunakan oleh beberapa faktor, yaitu sifat jaringan tanaman,

sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip

ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non

polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara

berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang

kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang

bersifat polar (metanol atau etanol) (Chaudri, 2001).

Prosedur Ekstraksi : (Tiwari et al, 2011)

1. Plant tissue homogenization (Homogenisasi Jaringan Tumbuhan)

Homogenisasi Jaringan Tumbuhan menggunakan pelarut telah banyak

digunakan dalam penelitian. Simplisia kering maupun basah, dihaluskan

menjadi serbuk, sejumlah tertentu pelarut dimasukkan dan dikocok selam 5-

10 menit atau didiamkan hingga 24 jam kemudian ekstrak disaring dan

filtratnya dikeringkan dalam vakum.

2. Exhautive extraction

Merupakan metoda umum yang lain ekstraksi berturut-turut

menggunakan peningkatan polaritas pelarut, dari pelarut yang tidak polar

(heksan) menjadi pelarut polar (metanol). Untuk memastikan berbagai macam

polaritas senyawa dapat diekstraksi. Beberapa penelitian menggunakan

ekstraksi soxlet dari simplisia kering menggunakan pelarut organik. Metoda

ini tidak dapat digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang

berkepanjangan dapat menyebabkan degradasi senyawa.

3. Ekstrasi soxlet

Ekstraksi soxlet hanya digunakan pada senyawa yang memiliki

kelarutan tertentu dan adanya pengotor yang larut dalam suatu pelarut.

8


Apabila senyawa yang diinginkan memiliki kelarutan kelarutan yang tinggi

dalam pelarut maka dapat menggunakan filtrasi sederhana dengan

memisahkan senyawa dari pengotor yang tidak larut. Metode ini tidak dapat

digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang berkepanjangan

dapat menyebabkan degradasi senyawa.

4. Maserasi

Serbuk simplisia diberi pelarut dalam wadah tertutup dan dilakukan

pengadukan hingga senyawa terekstrak dalam pelarut. Metode ini sesuai

digunakan untuk senyawa termolabil.

5. Dekok

Metode ini digunakan untuk senyawa yang larut dalam air dan stabil

dalam pemanasan. Simplisia direbus dalam air selama 15 menit.

6. Infus

Simplisia dimaserasi dengan waktu singkat menggunakan air dingin

atau mendidih.

7. Digesti

Digesti merupakan jenis maserasi yang menggunakan suhu hangat

selama proses ekstraksi.

8. Perkolasi

Prosedur ini paling sering digunakan mengekstraksi senyawa aktif

dalam simplisia. Pelarut ditambahkan untuk membasahi simplisia dan

didiamkan selama 4 jam dalam perkolator yang tertutup. Sejumlah tertentu

pelarut ditambahkan kembali hingga simplisia terendam dalam perkolator dan

didiamkan selama 24 jam , selanjutnya perkolator dibuka dan cairan dibiarkan

menetes perlahan.

9. Sonikasi

Prosedur ini menggunakan gelombang ultrasonik dengan frekuensi

antara 20-2000 kHz, hal ini menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding

9


sel. Kelemahan dari prosedur ini adalah terjadinya efek yang merusak

senyawa aktif dari simplisia dengan pembentukan radikal bebas.

2.2.2 Parameter Ekstrak

1. Susut pengeringan

Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada

temperatur 105°C selama 30 menit atau sampai berat konstan yang dinyatakan

sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal

(rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai

untuk susut pengeringan jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10%

(Depkes RI, 2000).

2. Kadar Abu

Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur dimana

senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa

unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran

tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal

sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera

dalam monografi (Depkes RI, 2000).

2.3 Virus Hepatitis C

Hepatitis merupakan penyebab peradangan hati. Hepatitis dapat

disebabkan oleh virus hepatotropik (hepatotropic virus), yang terutama

mempengaruhi sel-sel hati, mekanisme autoimun, atau gangguan sistemik

lainnya. Virus hepatotropik meliputi virus hepatitis A (HAV), virus hepatitis B

(HBV), hepatitis B terkait virus delta (HDV), virus hepatitis C (HCV), dan

hepatitis E virus (HEV). Meskipun semua virus tersebut menyebabkan hepatitis

akut, namun berbeda dalam modus penularan dan masa inkubasi; mekanisme,

derajat, dan kronisitas kerusakan hati; dan kemampuan untuk masuk ke keadaan

karier (Porth, 2009).

10


HCV adalah penyebab paling umum dari hepatitis kronis, sirosis, dan

kanker hepatoseluler di dunia. Sekitar 3,9 juta orang Amerika memiliki antibodi

terhadap HCV, dan 70% dari orang-orang ini memiliki bukti infeksi kronis yang

ditentukan oleh adanya DNA dalam serum darah. Sebelum tahun 1990,

penularan HCV tejadi melalui transfusi darah, hubungan seksual, dapat juga

ditularkan melalui jarum suntik, sedangkan penularan dari ibu ke janinnya

terjadi sekitar 4,6% - 10% (Porth, 2009).

HCV adalah virus RNA beruntai tunggal yang memiliki sifat mirip

dengan Flavivirus, sebuah genus dari keluarga Flaviviridae seperti demam

kuning dan virus ensefalitis St Louis. Genom ini berisi reading frame tunggal

terbuka yang menyandikan poliprotein dari sekitar 3000 asam amino. Virus ini

secara genetik tidak stabil, yang menyebabkan beberapa genotip dan sub tipe.

Keanekaragaman genotip berperan pada patogenisitas virus, yang

memungkinkan terjadinya kesulitan dalam pengembangkan obat dan penemuan

vaksin ( Porth, 2009).

Gambar 2. 1. Struktur virus hepatitis C (HCV) (Solga et al, 2007)

11


Masa inkubasi untuk infeksi HCV berkisar 2 - 26 minggu (rata-rata, 6

sampai 12 minggu). Anak-anak dan orang dewasa yang terinfeksi biasanya

tidak menunjukkan gejala (60% sampai 70%) atau memiliki gejala yang tidak

spesifik ditandai dengan kelelahan, malaise, anoreksia, dan penurunan berat

badan. Jaundice (penyakit kuning) jarang terjadi, dan hanya 25% sampai 39%

orang dewasa memiliki gejala ini. Gejala ini biasanya berlangsung selama 2

sampai 12 minggu. Gagal hati fulminan jarang terjadi dan hanya beberapa kasus

telah dilaporkan. Sebagian kecil dari orang-orang yang baru terinfeksi HCV

akan sembuh dari infeksi, tetapi sebagian besar (60% sampai 85%) terus

berkembang menjadi hepatitis kronis (Porth, 2009).

Pengobatan pada penderita hepatitis C kronis adalah kombinasi

pegylated interferon (alfa-2b atau alfa-2a) ditambah ribavirin (Porth, 2009).

Ribavirin adalah analog guanin yang di fosforilasi dalam sel oleh enzim sel

penjamu. Meskipun mekanisme kerjanya belum sepenuhnya jelas, ribavirin

tampaknya menggangu sintesis guanin trifosfat, menghambat capping mRNA

(RNA perantara) virus, dan menghambat polimerase RNA. Ribavirin trifosfat

menghambat replikasi sejumlah besar virus DNA dan RNA, termasuk influenza

A dan B, parainfluenza, respiratoty syncytial virus, paramiksovirus, HCV, dan

HIV-1 (Katzung, 2010).

Pengobatan dengan pegylated interferon dan ribavirin memerlukan biaya

yang besar, dan memiliki efek samping, gejala seperti flu merupakan gejala

yang umum terjadi. Efek samping yang lebih serius, yang meliputi gejala

kejiwaan (depresi), disfungsi tiroid, dan depresi sumsum tulang. Transplantasi

hati adalah pilihan pengobatan untuk penyakit hati stadium akhir akibat virus

hepatitis. Meskipun terkadang terjadi infeksi baru, penyakit ini tampaknya

berkembang lebih lambat (Porth, 2009).

12


2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C

Helikase merupakan protein pertama kali ditemukan pada Escherichia coli

pada tahun 1976. Selanjutnya RNA dan DNA helikase dengan fungsi yang

beragam telah ditemukan di semua organisme. Helikase dapat mengikat dan

menghidrolisis untai komplemeter dari untai ganda asam nukleat, atau

mengkatalisis homolog DNA rekombinan. Fungsi helikase juga diperlukan untuk

replikasi, dan rekombinasi genom. Demikian pula, fungsi helikase memfasilitasi

proses metabolisme RNA seperti transkripsi, biogenesis ribosom, translasi,

penyambungan RNA (RNA splicing), tranportasi RNA (RNA transport), dan

degradasi RNA (RNA degradation) (Patel and Donmez, 2006).

Virus hepatitis C adalah virus RNA beruntai tunggal yang diklasifikasikan

ke dalam genus Hepacivirus, famili Flaviviridae. HCV memiliki genom 9,6 kb

yang menyandikan poliprotein tunggal. HCV terdiri dari empat protein struktural

(C, E1, E2, dan p7) dan enam protein nonstruktural (NS2, NS3, NS4A, NS4B,

NS5A dan NS5B) (Lee et al., 2010). Protein non struktural tersebut berfungsi

dalam reaksi enzimatis yang berperan dalam replikasi virus. NS1 berinteraksi

dengan NS4 dibutuhkan untuk replikase RNA. NS2A bersifat hidrofobik

berfungsi dalam perakitan virion (partikel virus baru) dan pelepasan partikel

virus. NS2B membentuk kompleks dengan NS3 berperan sebagai kofaktor bagi

serin protease dari NS3. Protein NS3 mengkodekan RNA helikase yang berperan

dalam replikase virus. NS5A merupakan daerah yang sensitif terhadap interferon,

sedangkan NS5B berperan dalam aktivitas RNA-dependent RNA polimerase

(RdRp) (Tellinghuisen et al, 2007).

13


Gambar 2.2. Peta genomik RNA helikase HCV

(Tellinghuisen et al, 2007)

Gambar 2.4. Mekanisme kerja RNA helikase HCV

(Utama et al, 2005)

Protein resisten IFN

RNA Polimerase

NS2 NS3 NS4A NS5B NS5A NS4B

Protein transmembran

Metalloprotease Serin protease RNA helikase

Kofaktor

C E1 E2

Nukleokapsid

Pelindung

Glikoprotein

P7

Protein Nonstruktural Protein Struktural 5’ 3’

14


Mekanisme kerja RNA helikase HCV secara umum adalah pertama-

tama helikase akan berikatan pada ujung 3’ RNA utas ganda. Tahap kedua, ATP

akan berikatan pada sisi aktif RNA helikase dan dihidrolisis pada gugus fosfat

terluar menghasilkan ADP dan fosfat anorganik (Pi). Pada proses hidrolisis

ATP ini mengeluarkan energi yang cukup besar dan digunakan untuk

memisahkan RNA utas ganda menjadi utas tunggal. Pemisahan RNA utas ganda

dilakukan dengan pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua utas

tersebut. Pembukaan ikatan utas ganda tersebut sangat berperan dalam replikasi

dan kelangsungan hidup HCV, apabila tidak berlangsung maka siklus hidup

HCV terhenti (Utama et al, 2005).

RNA helikase HCV saat ini menjadi target obat yang essensial untuk

infeksi virus hepatitis C. Oleh karena itu terjadi pengembangan riset dalam

mencari agen yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase. Berikut tabel riset

mengenai agen yang digunakan sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

Tabel 2.1. Inhibitor RNA helikase HCV

No Inhibitor Persen

Inhibisi

Pustaka

1 Protein kapang endofit CgKTm SF 89,45% Paturohman, 2011

2 Ekstrak metanol buah tanaman

mangrove Avicennia marina (Forsk)

Vierb.

76,705 % Kusumawati, 2011

3 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011a

4 Bakteriosin asam laktat S34 64,20 % Putri, 2011b.

5 Ekstrak rimpang temulawak

(Curcuma zanthorrhiza Roxb.)

73,60 % Setianingsih, 2011

15


2.5 Kolorimetri ATPase

Uji kolometrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak

berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang

tidak menyerap cahaya. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang berwarna

seperti malachite green dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan

mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang

dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan

warna yang muncul karena suatu zat warna tidak berwarna ditambah dengan

pereaksi sehingga produknya berwarna (Utama et al, 2000).

2.6 SDS - PAGE

SDS-PAGE (Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

adalah suatu teknik yang banyak digunakan dalam biokimia, forensik, genetika,

dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas

elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau bobot molekul). Sampel

elektroforesis gel SDS memiliki muatan identik per satuan massa akibat

pengikatan sampel dengan SDS dan di fraksinasi berdasarkan ukuran (Deyl,

1983).

Prinsip elektroforesis gel SDS poliakrilamid adalah protein yang akan

dianalisis dicampur dengan SDS yang merupakan sebuah deterjen anionik.

Soodium dodesil sulfat mendenaturasi struktur tersier, sekunder dan ikatan non-

sulfida. Elektroforesis gel SDS poliakrilamid menerapkan muatan negatif untuk

setiap protein dalam proporsi dengan massanya. Pemanasan sampel pada suhu

kurang lebih 60°C memecah molekul dan membantu SDS untuk mengikat

sampel. Penanda berupa pewarna dapat ditambahkan ke dalam larutan protein

untuk memungkinkan eksperimen dalam melihat migrasi protein melalui gel

selama elektroforesis dijalankan. Pewarna berukuran lebih kecil dibandingkan

ukuran protein (Laemmeli, 1970)

16


Medan Listrik listrik diterapkan di seluruh gel, menyebabkan protein

bermuatan negatif bermigrasi di gel menuju anoda. Setiap protein akan bergerak

secara berbeda melalui matriks gel. Protein pendek akan lebih mudah melalui

pori-pori pada gel, sedangkan yang lebih besar akan memiliki sulit melalui pori.

Setelah mencapai waktu yang ditentukan, protein akan bermigrasi berdasarkan

ukuran. Protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauah di bawah gel, sedangkan

yang lebih besar akan lebih dekat ke titik asal. Oleh karena itu, protein dapat

dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekulnya. Glikoprotein tertentu

berperilaku sebaliknya pada gel SDS.

Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu

Comassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi pita protein dengna

konsentrasi 50 mg protein. Pewarnaan perak (Silver Staining) meningkatkan

sensitivitas pewarnaan biasanya 50 kali. Banyak variabel yang dapat

mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan

sendiri (Hempelmann, 1984).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pharmacy Drug and

Research (PDR), Laboratorium Pharmacy Natural Analyzing (PNA), dan

Laboratorium Pharmacy Medicinal Chemitry (PMC) Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,

Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian

Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor, pada bulan Juni sampai dengan September

2012.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator

(Eyela), autoklaf tipe vertikal (mode TA – 630), ultrasentrifus (Sorvall RC - 26

plus), microplate reader (Multiscan EX Thermo), microtiter plate (Polycarp),

pipet mikro (Gilson), Laminar Air Flow (ESCO), sonikator (LabSonic), shaker

incubator (N-Biotek), freezer -20°C (Sansio), SDS-PAGE [ATTO], hot plate

magnetic stirrer (Cimarec), timbangan analitik (Acis), tabung 1,5 mL

(Eppendorf), tabung 50 mL (Falcon), spatula, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur

(Duran), corong (Duran), dan kertas saring.

3.2.2 Bahan

Kulit buah manggis, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol teknis,

bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS - RNA helikase HCV rekombinan (koleksi

Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), akuades, media Luria-Bertani (LB),

ampisilin, IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase) 0,3 M, dapar B (Tris

HCl 10 mM pH 8,5, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%), resin TALON,

18


dapar elusi (imidazola 400 mM dalam bufer B), Tris-HCl 1,5 M pH 8,8,

akrilamid 30%, sodium dedosil sulfat (SDS) 10%, TEMED, amonium persulfat

(APS) 10%, comassie blue, loading dye, adenosin trifosfat (ATP) 0,1 mM, 4-

asam morfolinopropana sulfonat (MOPS) 0.1 mM, MgCl2 1 mM, larutan

malachite green, polivinil alkohol 2,3%, amonium molibdat, natrium sitrat, dan

metanol absolut.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel

Buah manggis (Garcinia mangostana L.) diperoleh dari Kecamatan

Wanayasa, Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat. Adapun bagian yang

digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah (pericarp) manggis.

3.3.2 Determinasi Sampel

Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di

Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.

3.3.3 Pembuatan Simplisia

Buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebanyak 5 kg disortir dan

dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, lalu ditiriskan agar

terbebas dari sisa air cucian. Kemudian bagian kulit buahnya (pericarp),

dirajang tipis, dan diangin-anginkan di udara terbuka hingga kering. Simplisia

yang sudah kering kemudian digiling dan diayak untuk mendapatkan serbuk

halus, lalu simplisia disimpan pada wadah yang kering dan tertutup rapat.

3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)

Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) dimaserasi dengan 5 x 800 mL n-heksan teknis yang telah

didestilasi, selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh

19


dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga

diperoleh ekstrak kental n-heksan. Ampas n-heksan yang diperoleh diuapkan di

udara terbuka hingga kering, kemudian dilakukan kembali maserasi berturut-

turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat diuapkan dengan

rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan

metanol yang kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat

simplisia awal (Materia Medika, 1989).

Rendemen = ( ) ( ) x 100%

3.3.5 Penapisan Fitokimia

1. Identifikasi Alkaloid

Ekstrak ditambahkan dengan 5 mL ammonia 30%, digerus dalam mortir,

lalu tambahkan 20 mL kloroform dan digerus kembali dengan kuat, campuran

tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik di ambil

(sebagai larutan A), sebagian dari larutan A (10 mL) diekstraksi dengan 10 mL

larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan bagian

atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan

disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Draggendorff, terbentuk warna merah

ataupun jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid.

Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi

Dragendrorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi

Dragendrorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan adanya

senyawa golongan alkaloid (Farnsworth, 1966).

2. Identifikasi Flavonoid

Ekstrak ditambahkan 100 mL air panas, kemudian dididihkan selama 5

menit dan disaring dengan kertas saring. Sebanyak 5 mL filtrat yang didapat

ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium dan 1 mL HCl pekat serta 5 mL

amil alkohol, kemudian dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah.

20


Terbentuknya warna dalam larutan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa

flavonoid (Farnsworth, 1966).

3. Identifikasi Saponin

Ekstrak ditambahkan 10 mL akuades dalam tabung reaksi. Kemudian

diguncang selama 1 - 2 menit. Adanya saponin diindikasikan oleh terbentuknya

buih setinggi 1 cm yang stabil selama 30 menit (El Kamali et al, 2010).

4. Identifikasi Tanin

Ekstrak dilarutkan dalam 20 mL akuades. Filtrat sebanyak 2 mL

ditambahkan 3 tetes FeCl3 10%. Terbentuknya warna biru kehitaman atau hijau

kehitaman mengindikasikan adanya tanin. Cara yang lain adalah 2 mL filtrat

ditambahkan 1 mL larutan brom, apabila terdapat endapan maka positif

mengandung tanin (Adegboye et al, 2008).

5. Identifikasi Steroid

Ekstrak dilarutkan dalam 3 mL CHCl3 kemudian disaring. H2SO4

ditambahkan ke dalam filtrat. Terbentuknya cincin coklat kemerahan

menandakan positif adanya steroid (Magadula and Tewtrakul, 2010).

6. Identifikasi Kumarin

Ekstrak dilarutkan dalam air panas. Setelah dingin, larutan dibagi ke

dalam dua tabung reaksi yaitu tabung 1 sebagai blanko dan tabung 2 ditambah

0,5 mL NH3 10%. Adanya pijaran yang kuat dibawah sinar UV menunjukkan

adanya kumarin dan turunannya (Indrayani et al, 2006).

3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik Ekstrak Kulit Buah

Garcinia mangostana L.

1. Pemeriksaan organoleptik

Pemeriksaan organoleptik dilakukan menggunakan pancaindra untuk

mendeskripsikan bentuk, warna, dan bau dari ekstrak kulit buah manggis.

21


2. Susut Pengeringan

Ekstrak kulit buah manggis ditimbang dengan seksama sebanyak 1 gram

dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya

telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak

diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol,

hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm,

kemudian dimasukkan ke dalam oven, dibuka tutupnya. Pengeringan

dilakukan pada suhu penetapan 105°C hingga diperoleh bobot tetap lalu

ditimbang. Sebelum setiap pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan

tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes RI, 2000).

3. Kadar Abu

Ekstrak ditimbang seksama sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam

krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu ekstrak diratakan.

Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, lalu ditimbang.

Jika arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring dengan

menggunakan kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa abu dan kertas saring

dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan,

dipijarkan hingga bobot tetap lalu ditimbang. Ditimbang kadar abu terhadap

bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).

3.3.7 Produksi RNA helikase virus hepatitis C (HCV) (Utama et al, 2000)

Media LB (Luria –Bertani) dibuat dengan volume 10 mL dan 400 mL

(lampiran 9a). Perkultur dibuat dalam media LB sebanyak 10 mL. Media LB

diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 10 µL dan dihomogenkan. Lalu

diinokulasikan bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase rekombinan,

kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan

kecepatan 200 rpm selama semalam.

Hasil prekultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang telah

diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 410 µl, kemudian diinkubasi dalam

22


shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30

menit atau hingga OD600 (optical density) mencapai ± 0,3. Selanjutnya

ditambahkan 0,3 M IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase), kemudian

diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37°C dengan kecepatan 150

rpm selama 3 jam atau hingga OD600 mencapai ± 1.

Hasil kultur disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000

rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair,

kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang terbentuk disimpan dalam

temperatur -20°C.

Pelet hasil sentrifugasi selanjutnya dikeringbekukan (freeze-thawing)

sebanyak tiga kali. Pelet diresuspensi dengan dapar B kemudian disonikasi

sebanyak 3 kali pengulangan dengan amplitudo 40; siklus 0,5; selama 15 detik,

dengan interval waktu 1 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada temperatur 4°C

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit.

Supernatan yang diperoleh kemudian dipurifikasi dengan kromatografi

afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µL resin TALON (resin

ekuilibrasi), kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 3 jam,

kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 7

menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebagai inner volume (IV) disimpan

pada temperatur 4°C untuk SDS-PAGE. Pelet diresuspensi dengan 10 mL

larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500

rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebagai washing 1. Pelet yang

terbentuk kemudian diresuspensi kembali dengan 10 mL larutan dapar B dan

disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.

Supernatan diambil sebagai washing 2. Hasil washing 1 (W1) dan washing 2

(W2) kemudian disimpan pada temperatur 4°C dan digunakan pada SDS-

PAGE.

Pelet kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin

dengan menambahkan 150 µL larutan dapar elusi dan diinkubasi pada rotator

23


cold room (4°C) selama satu malam. Kemudian disentrifugasi pada temperatur

4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh

diambil sebagai elusi 1 (E1) sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan dapar

elusi kembali, kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 1 jam.

Kemudian disentrifugasi kembali pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000

rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai elusi 2 (E2).

3.3.8 Konfirmasi kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan SDS – PAGE

Plat kaca yang digunakan terdiri dari short plate & spacer plate

dibersihkan dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer

plate dan diberi casting frame pada bagian tengah dengan dikunci dengan

menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan gel separating

(lampiran 8a). Larutan tersebut dimasukan di antara celah short plate & spacer

plate sampai dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan akuades.

Kemudian ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit. Selanjutnya

larutan gel stacking dibuat sesuai prosedur (lampiran 8b). Akuades pada gel

separating dibuang dan diisikan dengan larutan stacking, kemudian dipasang

comb, ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit.

Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada

casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly

dengan posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam

clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.

Lower inner chamber dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan

working solution (Dapar Elektroforesis SDS 1X pH 8.3).

Masing-masing sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase

HCV (inner volum, whasing, dan elusi enzim) diambil 4 µl lalu dicampur

dengan 2 µl loading dye (lampiran 8c). Campuran didenaturasi di water bath

pada suhu 95˚ C selama 15 menit. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4

µl/gel dimasukan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur

24


dengan loading dye, dimasukan ke dalam well sebanyak 5 µl/well. Gel

dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam

dalam Commasie Blue G-250 Staining Solution (lampiran 8d) selama 1 jam

sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-

250 Destaining Solution (lampiran 8e) ± 20 menit, dilakukan dua kali. Gel

dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4°C.

3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000)

Uji aktivitas enzim RNA helikase dilakukan dengan metoda ATPase

kolorimetri. Sebanyak 50 µL campuran reaksi yang mengandung 5 µL dapar

MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O,

dan 5 µL RNA helikase HCV, dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well.

Campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar

10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari

0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan

2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1 (lampiran 9d). Setelah

masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate

96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit.

Setelah masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25

µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan

referensi 405 nm.

3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA

helikase HCV (Utama et al, 2000)

Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA

helikase dilakukan dengan menggunakan ATPase kolorimetri. Sebelum

dilakukan pengukuran absorbansi, terlebih dahulu ekstrak kulit buah manggis

pada fase n-heksan, etil asetat, dan metanol masing-masing dilarutkan

menggunakan metanol absolut dengan beberapa konsentrasi yaitu 100.000

25


ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781 ppm,

391 ppm.

Pada pengukuran absorbansi enzim RNA helikase ini dilakukan

dengan menambahkan 5 µL ekstrak kulit buah manggis dengan berbagai

konsentrasi pada setiap sumur dalam campuran reaksi. Volum akhir reaksi

adalah 50 µL yang terdiri dari 45 µL campuran reaksi (5 µL dapar MOPS 10

mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL

RNA helikase HCV). Reaksi kemudian dimasukkan ke dalam microtiter plate

96-well. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10

menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari

0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan

2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi

selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well

sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit. Setelah

masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na

sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm.

Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung

presentasi inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV.

Perhitungan persen penghambatan sampel ekstrak kulit buah manggis

terhadap RNA helikase dilakukan berdasarkan perhitungan :

% inhibisi = – x 100 %

Dimana :

A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor

I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Sampel

Determinasi buah manggis dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang

Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan

bahwa sampel buah manggis yang diperoleh dari Kecamatan Wanayasa,

Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat, merupakan spesies Garcinia

mangostana, famili Clusiaceae, keterangan hasil determinasi dapat dilihat pada

lampiran 1.

4.2 Rendemen Ekstrak

Ekstraksi yang digunakan adalah dengan cara maserasi. Ekstraksi dengan

cara maserasi digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan.

Keuntungan dari teknik ini adalah peralatan yang digunakan sederhana,

sedangkan kerugiannya adalah pengerjaanya lama, pelarut yang digunakan

banyak, serta proses penyarian yang kurang sempurna.

Maserasi terhadap kulit buah manggis dilakukan dengan cara bertingkat

dari pelarut non polar hingga polar, yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol. Hal

ini bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa yang bersifat non polar hingga

polar yang terdapat pada kulit buah manggis.

Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buat manggis diekstraksi

menggunakan pelarut n-heksan teknis sebanyak 5 x 800 mL, masing -masing

selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh dipekatkan

dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga diperoleh

ekstrak kental n-heksan. Terhadap ampas n-heksan kemudian dilakukan kembali

maserasi berturut-turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat

diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan,

etil asetat, dan metanol (Materia Medika, 1989).

27


Tabel 4.1 Hasil rendemen ekstrak kulit buah manggis

Ekstrak Bobot ekstrak kering Rendemen

n-heksan 5,20 gram 1,06 %

Etil asetat 47,40 gram 9,67 %

Metanol 42,18 gram 8,61 %

Rendemen yang diperoleh dari proses ekstraksi terlihat pada tabel 4.1.

Hasil perhitungan rendemen menunjukkan bahwa pelarut etil asetat memiliki

nilai persentase rendemen tertinggi dibanding pelarut n-heksan dan metanol,

dimana pelarut n-heksan memiliki nilai rendemen yang paling rendah. Berat

ekstrak kering yang diperoleh menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan

mampu melarutkan bahan alami terseleksi dari padatannya.

Dari hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa pelarut etil asetat lebih

banyak melarutkan senyawa atau zat yang mempunyai potensi bioaktif. Prinsip

pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like, dimana

prinsipnya adalah pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non

polar akan melarutkan senyawa non polar sesuai dengan pernyataan Melki

(2003). Sehingga dapat dikatakan bahwa kulit buah manggis memiliki senyawa

semi polar dan senyawa polar yang lebih banyak dibandingkan senyawa non

polar.

Pelarut yang digunakan bersifat volatil, sehingga pada saat filtrasi

(penyaringan) diduga terdapat bagian pelarut yang menguap yang menyebabkan

perbedaan jumlah rendemen yang dihasilkan. Faktor-faktor lain yang

berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu, dan jenis

pelarut yang digunakan (Ismet, 2007).

28


4.3 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak kulit buah Garcinia

mangostana bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang

terdapat dalam ekstrak pada masing-masing pelarut. Menurut Pasaribu et al,

2012, dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid,

flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid.

Hasil identifikasi yang telah dilakukan memperlihatkan perbedaaan pada

setiap pelarut yang digunakan. Hal ini diduga dikarenakan pelarut yang

digunakan berbeda tingkat kepolarannya, sehingga berbeda pula senyawa yang

terekstrak. Sesuai pernyataan Ismet (2007) yang menyatakan bahwa salah satu

faktor yang mempengaruhi ekstraksi adalah jenis pelarut yang digunakan. Hasil

penapisan fitokimia pada masing-masing ekstrak dapat dilihat pada tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis

Ekstrak n-heksan Etil asetat Metanol

Alkaloid + + +

Flavonoid + + +

Steroid + + -

Tanin - - +

Saponin - - +

Kumarin - + +

Identifikasi senyawa alkaloid memberikan hasil positif pada ketiga

ekstrak. Hasil ini ditunjukkan dengan adanya endapan merah bata pada masing-

masing ekstrak dengan penambahan pereaksi Dragendorff, dan juga

menghasilkan endapan putih ketika bereaksi dengan Mayer. Alkaloid merupakan

golongan zat tumbuhan sekunder terbesar. Alkaloid mencakup senyawa yang

bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen. Alkaloid sering

beracun bagi manusia dan banyak memiliki aktivitas fisiologi sehingga secara

29


luas digunakan dalam bidang pengobatan sebagai anti mikroba, anti diare, dan

antelmintik (obat cacing) (Harborne, 1987, Tiwari, 2011).

Pada identifikasi senyawa flavonoid diperoleh hasil yang positif pada

ketiga ekstrak. Uji flavonoid positif ditandai dengan terbentuknya warna pada

lapisan amil alkohol. Pada ekstrak n-heksan dan etil asetat terbentuk warna

kekuningan, sedangkan pada ekstrak metanol terbentuk warna jingga pada

lapisan amil alkohol. Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol

(Harborne, 1987). Flavonoid memiliki aktivitas anti mikroba dan anti diare,

golongan senyawa ini dapat larut dalam etanol, metanol, dan aseton (Tiwari,

2011).

Steroid merupakan tripterpen yang kerangka dasarnya sistem cincin

siklopentana perhidropenantrena (Harborne, 1987). Secara farmakologi steroid

memiliki aktivitas sebagai anti diare (Tiwari, 2011). Hasil identifikasi steroid

terdapat pada ekstrak n-heksan dan etil asetat, ditandai dengan terbentuknya

cincin coklat kemerahan pada sampel dalam kloroform yang ditambahkan asam

sulfat. Sedangkan pada ekstrak metanol menunjukkan hasil yang negatif karena

tidak terbentuk cincin merah. Menurut Tiwari, 2011, senyawa golongan

steroid/triterpenoid dapat larut dalam air, etanol, metanol, kloroform, dan eter.

Namun hasil identifikasi menunjukkan ekstrak metanol tidak terdapat steroid, hal

ini dapat dikarenakan steroid/triterpenoid terkandung dalam jumlah yang sedikit,

sehingga hanya terekstrak oleh n-heksan dan etil asetat.

Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae

terdapat khusus dalam jaringan kayu. Menurut batasannya, tanin dapat bereaksi

dengan proteina membentuk kopolimer yang tak larut dalam air (Harborne,

1987). Hasil identifikasi tanin menunjukkan hasil positif pada ekstrak metanol,

dengan terbentuknya warna biru kehitaman pada ekstrak yang diberi FeCl3.

Sedangkan pada n-heksan dan etil asetat menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa tanin

30


merupakan golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga

pada penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol.

Saponin merupakan senyawa yang bersifat seperti sabun, serta dapat

dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel

darah (Harborne, 1987). Identifikasi senyawa saponin positif pada ekstrak

metanol. Ekstrak metanol yang ditambahkan akuades kemudian dikocok selama

1 menit, memperlihatkan hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya

busa yang stabil. Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa saponin merupakan

golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga pada

penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol. Saponin memiliki efek

farmakologi sebagai anti diare, anti kanker, dan antelmintik (obat cacing).

Kumarin merupakan senyawa fenol, yang memiliki aktivitas farmakologi

sebagai antivirus dengan berinteraksi dengan DNA eukariot (Tiwari, 2011).

Identifikasi kumarin menujukkan hasil positif pada ekstrak kulit buah manggis

pada fase etil asetat dan metanol. Sampel yang berpendar berwarna kebiruan

yang diamati pada sinar UV menunjukkan ekstrak etil asetat dan metanol

mengandung kumarin.

31


4.4 Parameter Standar Ekstrak

Parameter standar yang diidentifikasi dari kulit buah manggis dapat

dilihat dari tabel 4.3.

Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak

Jenis Karakteristik Ekstrak

n-heksan

Ekstrak

etil asetat

Ekstrak

metanol

Menurut literatur

Parameter Spesifik :

a.Organoleptik

- Bentuk

-Warna

Parameter Non

spesifik :

a.Susut pengeringan

b. Kadar abu

Ekstrak

kental

Kuning

0,5%

0,4%

Ekstrak

kental

Kuning

2,1%

0,7%

Ekstrak

kental

Coklat

9,3%

2,2%

max10% (DepkesRI,2000)

-

4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C

Produksi denganRNA helikase HCV dilakukan dengan tujuan untuk

mendapatkan enzim RNA helikase yang murni yang digunakan sebagai

komponen dalam penentuan aktivitas inhibisi terhadap aktivitas ATPase.

Ekspresi RNA helikase dilakukan dengan cara mengultur bakteri

Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV. Tahapannya dimulai

dengan pre kultur yang dilakukan dalam medium cair Luria-Bertani (LB) yang

merupakan media yang sesuai dengan bakteri Escherichia coli, karena

mengandung zat kompleks (tripton, yeast extract, dan natrium klorida) untuk

pertumbuhan bakteri. Media LB terlebih dahulu diberikan ampisilin yang

berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E. coli BL21 (DE3)

pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten

32


ampisilin, sehingga hanya bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase

HCV rekombinan yang membawa gen RNA helikase HCV saja yang dapat

tumbuh. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada temperatur 37°C

dengan kecepatan 200 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi

optimum untuk pertumbuhan bakteri (Pelzar & Chan,1986).

Tahap berikutnya merupakan pemindahan kultur pada medium LB yang

lebih besar, medium yang telah diberi ampisilin kemudian ditambahkan pre

kultur dan diinkubasi kembali pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm

hingga nilai OD600 (optical density) mencapai 0,3 atau pada saat bakteri mencapai

fasa logaritmik, fase ini merupakan fasa awal dimana bakteri Escherichia coli

tumbuh. Pada fasa ini, kultur ditambahkan IPTG (Isopropyl-β-D-

Thiogalaktopiranosidase) sebagai penginduksi untuk menghasilkan ekspresi

berlebih pada kultur, sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih

besar hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al,

2000).

Bakteri E. coli dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4°C

dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan sel E. coli

dengan media LB. Setelah disentrifugasi sel E. coli akan mengendap sebagai

pelet, sedangkan medium LB akan terpisah menjadi supernatan. Pelet yang

terbentuk kemudian disimpan dalam freezer dengan temperatur -20°C untuk

menjaga stabilitas RNA helikase HCV yang terekspresi secara intraseluler dalam

pelet.

RNA helikase yang terkandung dalam pelet harus dipurifikasi terlebih

dahulu sebelum menjadi target analisis. Untuk memurnikannya sel pelet

dipecahkan dengan cara mekanik, yaitu dengan cara freeze-thaw dan sonikasi.

Freeze-thaw atau pengeringbekuan dilakukan menempatkan sel pada temperatur

-20°C dan suhu ruang secara bergantian, masing-masing selama 20 menit

sebanyak tiga kali pengulangan. Freeze-thaw menyebabkan terbentuknya kristal

es pada sel pelet sehingga akan melunakkan dinding sel bakteri yang

33


mempermudah dalam pelisisan sel. Tahap selanjutnya merupakan sonikasi yang

dilakukan menggunakan sonikator. Proses sonikasi akan merusak organel sel

namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Pada tahap

sonikasi, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar

B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl

berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase

sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk menghilangkan

kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA

helikase (Vanz et al, 2008). Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik

yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid

bipolar akan menyebabkan disosiasi membran sel dengan bagian hidrofobik dari

RNA helikase yang sebelumnya menempel pada lipid bipolar tersebut (Sigma

aldrich, 2008).

Enzim selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas (metal

affinity). Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Co2+ yang

dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag yang terdapat pada ujung RNA

helikase. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan

metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan

3500 rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung

RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Pelet

ditambahkan dapar elusi (imidazol dalam dapar B) ditambahkan untuk

menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat

dalam dapar elusi ini memutuskan ikatan antara RNA helikase dengan resin

TALON. Imidazol berperan sebagai analog residu His yang terdapat pada enzim

yang telah diikat oleh logam Co2+. Sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan

3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim

yang telah murni. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan

enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).

34


Kemurnian enzim RNA helikase HCV dapat dikonfirmasi dengan

menggunakan SDS-PAGE, berdasarkan protein target yang dituju. Elektroforesis

dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8%. Hasil SDS-PAGE

pada gambar 4.1 menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa.

sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase telah berhasil dipurifikasi dan

sesuai dengan hasil seperti yang dilaporkan Utama et al, 2000 yang menyatakan

bahwa bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pertama

berupa marker BIORAD® yang digunakan. Inner volum (IV) merupakan

supernatan hasil sentrifugasi pada proses pemecahan sel yang belum dimurnikan

dengan resin TALON sehingga banyak mengandung metabolit interseluler yang

menyebabkan penumpukan pita protein. Washing 1 dan washing 2 merupakan

hasil pencucian binding resin TALON tidak terdapat pita protein, karena

supernatan hanya terdapat dapar B.

Gambar 4.1. SDS – PAGE RNA helikase HCV

Keterangan : M = Marker, E1 = Elusi 1, E2 = Elusi 2, IV = Inner Volum, W1 = washing 1, W2 = washing 2

54 kDa

M E1 E2 IV W1 W2

50 kDa

75 kDa

100 kDa

150 kDa

250 kDa

35


4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis Terhadap RNA Helikase

Virus Hepatitis C

Aktivitas ekstrak kulit buah Garcinia mangostana terhadap RNA helikase

virus hepatitis C dilakukan dengan metoda Kolorimetri ATPase. Ekstrak pada

masing-masing pelarut hasil maserasi yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol,

dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut dengan konsentrasi

100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm,

1.562 ppm, 761 ppm, 391 ppm, kemudian diuji dengan metoda ATPase.

Uji kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji enzim yang

aktivitasnya bergantung pada adanya ATP sebagai sumber energi, yang

melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh

enzim RNA helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang

terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan

ADP dan Pi (fosfat anorganik).

Pengujian ekstrak kulit buah manggis yang telah diencerkan

menggunakan larutan master mix yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl2, dan

ATP. Air suling berfungsi sebagai pelarut, MOPS (asam 4-morfolinopropana

sulfonat) berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. MgCl2 yang

digunakan berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan ATP merupakan

substrat atau donor energi yang berperan dalam pengujian ATPase kolorimetri

(Utama et al, 2000).

Larutan pewarna diberikan untuk memvisualisasi reaksi pada pengujian.

Larutan perwarna malachite green yang terdiri dari ammonium molibdat akan

berikatan dengan fosfat anorganik yang terhidrolisis menghasilkan kompleks

fosfomolibdat dan malachite green. Warna yang terbentuk sebanding dengan

konsentrasi fosfat anorganik yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP.

Semakin banyak fosfat anorganik yang bereaksi dengan larutan pewarna semakin

keruh warna yang dihasilkan (Chan et al, 1986).

36


Pengukuran absorbansi dilakukan menggunakan microplate reader

Multiscan EX. Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang

gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk

penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum

untuk penyerapan warna kekuningan. Warna kebiruan merupakan kompleks yang

dihasilkan larutan pewarna dan fosfat organik yang terbentuk dari hidrolisis ATP,

sedangkan warna kekuningan terbentuk dari larutan pewarna yang tidak

berikatan dengan fosfat anorganik. Kedua panjang gelombang ini digunakan agar

perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih akurat. Perhitungan

konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel menggunakan

perbandingan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986). Reaksi

enzimatis yang terbentuk dihentikan dengan penambahan Na sitrat. Penambahan

Na sitrat bertujuan untuk mencegah terbentuknya reaksi enzimatis yang

berlebihan.

Tabel 4. 4. Aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV

Konsentrasi

(ppm)

% inhibisi

Ekstrak n-

heksan

% inhibisi

Ekstrak etil

asetat

% inhibisi

Ekstrak

metanol

3.125 41.79 39.07 71.57

1.562 33.98 27.26 68.70

781 20.73 20.78 58.75

391 10.45 15.58 22.17

Gambar 4.2. Aktivitas inhibisi ekstterhadap

Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dalam pelarut metanol

absolut digunakan beberapa konsentrasi. Konsentrasi yang diuji dimulai dari

konsentrasi 100.000 ppm

3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, hing

pada konsentrasi 100.000 ppm hingga 6.250 ppm tidak menghasilkan nilai

absorbansi, dikarenakan terlalu larutan uji terlalu pekat. Sehingga konsentrasi

yang digunakan adalah pada 3.125 ppm hingga 391 ppm.

Hasil uji aktivitas inhi

tabel 4.4. Pada tabel dapat dilihat bahwa ekstrak kulit buah manggis (

mangostana L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara

vitro menggunakan uji kolometri ATPase. Ku

inhibisi yang berbeda pada ketiga ekstrak

heksan memiliki persentasi inhibisi sebesar 41,79%, sedangkan etil asetat dan

metanol memiliki persentasi inhibisi sebesar 39,07% dan 71,57

Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada lampiran 17. Dalam

grafik tersebut terlihat aktivitas enzim yang tidak ditambahkan inhibitor adalah

pada uji aktivitas ekstrak

0

10

20

30

40

50

60

70

80

3.125 ppm


ktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV



100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm,

3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, hingga 391 ppm. Hasil yang terlihat bahwa



yang digunakan adalah pada 3.125 ppm hingga 391 ppm.

ivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat pada

tabel 4.4. Pada tabel dapat dilihat bahwa ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara

menggunakan uji kolometri ATPase. Kulit buah manggis memiliki aktivitas

inhibisi yang berbeda pada ketiga ekstrak. Pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak


metanol memiliki persentasi inhibisi sebesar 39,07% dan 71,57%.



pada uji aktivitas ekstrak n-heksan adalah 565,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol

1.562 ppm 781 ppm 391 ppm

n-heksan

etil asetat

metanol

37




, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm,

ga 391 ppm. Hasil yang terlihat bahwa



bisi ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat pada

Garcinia

L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara in

lit buah manggis memiliki aktivitas

Pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak n-




pmol fosfat/mL/menit/pmol

38


protein sedangkan setelah ditambahkan ekstrak n-heksan 3.125 ppm aktivitas

enzim menjadi 305,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein. Sedangkan pada uji

aktivitas ekstrak etil asetat dan metanol, aktivitas enzimnya adalah 575,3 pmol

fosfat/mL/menit/pmol protein, dan setelah ditambahkan ekstrak etil asetat dan

metanol aktivitas enzim berkurang menjadi 325,7 dan 137,2 pmol

fosfat/mL/menit/pmol protein. Hal ini menunjukkan bahwa jika pada enzim

ditambahkan inhibitor, maka enzim akan mengalami penurunan aktivitas. Nilai

aktivitas enzim ini berbanding terbalik dengan nilai persentasi inhibisi, semakin

tinggi persen inhibisi oleh ekstrak yang digunakan, maka akan semakin rendah

aktivitas enzim, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persen inhibisi oleh

ektrak yang digunakan, maka semakin tinggi aktivitas enzimnya. Hal ini

dikarenakan dengan semakin tinggi persen inhibisi, maka fosfat yang dihambat

semakin besar sehingga aktivitas enzim akan pengalami penurunan.

Kulit buah manggis dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon.

Santon merupakan senyawa yang memiiliki aktivitas antioksidan ditemukan

dalam kulit buah manggis (Chaverri et al, 2008, Yu et al, 2007). Santon

merupakan senyawa polar (Zarena et al, 2011), sehingga diduga terkandung

dalam ekstrak metanol. Dalam penelitian ini, santon diperkirakan memiliki

aktivitas sebagai antivirus yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase virus

hepatitis C.

Penelitian Chen et al, 1996 meunjukkan bahwa ekstrak etanol dari

Garcinia mangostana L. memiliki potensi dalam menghambat HIV-1 protease.

Dalam penelitian ini dinyatakan bahwa hasil purifikasi ekstrak Garcinia

mangostana L. diperoleh dua senyawa aktif. Senyawa aktif tersebut dianalisis

dan diperoleh mangostin yang memiliki IC50 5,12 +/- 0,41 microM dan gamma-

magostin dengan IC50= 4,81 +/- 0,32 microM. Selain itu, penelitian lain juga

menyatakan ekstrak Garcinia mangostana L. berpotensi sebagai HIV-1 reverse

transkriptase, meskipun tidak signifikan (Chin et al, 2008). Selain antivirus,

Garcinia mangostana L. juga memiliki aktivitas sebagai penghambat kanker

39


payudara, anti tumor , anti inflamasi seperti yang dijabarkan oleh Chaverri et al,

2008. Hasil penelitian sebelumnya memberikan gambaran Garcinia

mangostana memiliki potensi besar sebagai anti virus.

Dalam mekanismenya sebagai inhibitor RNA helikase, terdapat dua

kemungkinan yang terjadi : (1) inhibitor menempel pada RNA helikase tidak

pada sisi aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim yang

mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat

(Borowski et al. 2008). (2) inhibitor berikatan pada sisi aktif enzim (RNA

binding-site) sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang

menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai ganda

RNA (Yamashita et al. 2012).


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) memiliki potensi

sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

2. Aktivitas penghambatan yang tertinggi pada konsentrasi 3.125 ppm terdapat

pada ekstrak metanol, yaitu sebesar 71,57%. n-heksan memiliki aktivitas

41,79%, sedangkan aktivitas terendah pada ekstrak etil asetat yaitu sebesar

39,07%.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemurnian ekstrak kulit buah

manggis (Garcinia mangostana L.) sehingga dapat diketahui senyawa aktif yang

berkhasiat menghambat aktivitas virus hepatitis C.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dari ekstrak kulit buah manggis (Garcinia

mangostana L.) untuk mengetahui aktivitas penghambatan terhadap virus

hepatitis C secara in vivo.


DAFTAR PUSTAKA

Adegboye, M. F., Akinpelu, D. A., Okoh, A. I. (2008). The Bioactive and Phytochemical properties of Garcinia kola (Heckel) Seed Extract on Some Pathogens. African Journal of Biotechnology Vol. 7 (21) : 3934-3938. Borowski P et al. (2008). Viral NS3 helicase activity is inhibited by peptides reproducing the Arg-rich concerved motif of the enzyme (motif VI). Biochemical Pharmacology 76: 28-38 Chaudri R.D. (2001). Herbal Drugs Industry. Easther Publisher G-59, Greater Kailash. New Delhi India: 373-387. Chaverri, J. P., Rodriguez, N. M., Ibarra, M. O., Rojas, J. M.,. (2008). Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana). Food Chem Toxicol 46 : 3227 – 3229. Chan, K. M., Delfert D., Junger K. D. (1986). A direct colorimetric assay for Ca2+ stimulated ATPase activity. Analytical Biochemistry157: 375-380. Chen, S.X., Wan, M., Loh B. M., (1996). Active constituents againts HIV-1 protease for Garcinia mangostana. Planta medica 62 : 381 – 382. Chin, Y. W., and Kinghorn, A. D. (2008). Structural Characterization, Biological Effect, and Synthetic Studies on Xanthones from Mangosteen (Garcinia mangostana) A Popular Botanical Dietary Suplement. Mini Rev Org Chem 5(4): 355–364 Departemen Kesehatan RI. (1989). Materia Medika Indonesia jilid I. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta Departemen Kesehatan RI. (2000). Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta. Deyl, Z. (1983). Electrophoresis : A survey of techniques and application. New York : Elsevier. El-Kamali, H. H., El-Amir, M. Y. (2010). Antibacterial and phytochemical Screening of Ethanolic Extracts Obtained from Selected Sudenese Medical Plants. Research Journal of Biological Sciences 2(2) : 143-146. Farnsworth, N. R. (1969). Biological and phytocemical screening of plants. Journal Pharmaceutical Science.

42


Harborne, J.B. (1987). Metode fitokimia : penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung : ITB Hempelmann, E., Schuulze, M., Gotze, O. (1984). Free SH-groups are important for the polychromatic staining of proteins with silver nitrat. Neuhof V (ed) Electrophoresis 84 Verlag Chemie Weinheim 1984 : 328-330. Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta : Yayasan Sarana Wana Jaya. Indrayani L., Soetjipto H., Sihasale L. (2006). Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach [skripsi]. Berk Penel Hayati : 12 (57-61) Ismet, M. S., Soedhama, D., Aktani, U. (2007). Penapisan Senyawa Bioaktif Spons Aaptos aaptos dan Petrosia sp. dari Lokasi yang Berbeda. Prosiding Konferensi Sains Kelautan dan Perikanan Indonesia I : IPB Dramaga Katzung, Bertram G. (2010). Farmakologi Dasar & Klinik ed 10. Jakarta : EGC Kawo, A.H. et al. (2012). Sero Prevalence Study of Hepatitis C Virus Infection Among Blood Donors Attending Selected Blood Banks in some Local Government Areas in Kano, Nigeria. Journal of public Health and Epidemiology vol 4(6) : 178 -183. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. (2010). Menkes Meluncurkan program pendataan penyakit hepatitis C tahap II. http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release. Diakses tanggal 13 Juni 2012. Kusumawati, I.S. (2011). Isolasi dan Identifikasi Pendahuluan Bahan Bioaktif sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Ekstrak Metanol Buah Tanaman Mangrove Avicennia marina (Forsk) Vierb [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. Laemmli, UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227 : 680-685. Lee, J.C. et al. (2011). Anti- hepatitis of Acacia confusa Extract Via Suppressing Cyclooxygenase - 2. Antiviral Research 89 : 35 - 42. Magadula, J., Tewtrakul,S. 2010. Anti – HIV – 1 Protease Activities of Crude extract of some Garcinia Species Growing in Tanzania. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12) : 1848-1852.

http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release

43


Melki. (2010). Efektivitas ekstrak mangrove sebagai antibiotic pada penyakit vibrosis udang windu [tesis]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Moongkarndi, P. et al. 2004. Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. Journal of Ethnopharmacology 90 : 161 – 166. Pasaribu, F., Sitorus, P., Bahri, S. (2012). Uji ekstrak etanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap penurunan kadar glukosa darah. Journal of Pharmaceutics and Pharmacology Vol 1 : 1-8 Patel, S. S. and Donmez, I. (2006). Mechanism of Helicases. The Journal of Biological Chemistry vol 281 No 27 pp : 18265 – 18268. Paturohman, M. (2011). Optimasi Pemurnian Protein Kapang Endofit CgKTm SF sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Pelczar, M.J. dan Chan E. C. S. (1988). Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et al., penerjemah. Jakarta : UI Press. Terjemahan dari: Element of Microbiology. Porth, C. M., Matfin, G. (2009). Pathophysiology : Concept of Altered Health States Eighth ed. Wolters Kluwer Health : Lippincott Williams & Wilkins. Putri, P. H. (2011a). Isolasi dan Pemurnian Bahan Aktif dari Mikroalga BTM 11 sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Putri, S. F. (2011b). Isolasi dan Purifikasi Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Bakteriosin Bskteri Asam Laktat [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Ravikumar, Y. S. et al. (2011). Inhibition of Hepatitis C Virus Replication by Herbal Extract : Phyllanthus amarus as Potent Natural Source. Virus Research 158 : 89–97. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: a laboratory manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2344 hlm. Setianingsih, D. (2011). Isolasi dan Identifikasi Awal Senyawa Aktif dari Ekstrak Rimpang Temulawak (Curcuma zanthorrhiza Roxb.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. SIGMA-ALDRICH. (2008). Detergents and solubilization reagents. Biofiles 3(3): 1-36.

44


Solga, S., Poordad, FF., Rai, R., Norwitz, L., Kalloo, A.N. (2007). Rational design of dual-functional aptamers that inhibit the protease and helicase activities of HCV NS3. J. Biochem. 137 : 339-347 Tellinghuisen T. L., Evans M.J., Hahn T., You S., dan Rice C.M. (2007). Studying hepatitis C virus: making the best of a bad virus. J. Virology 81(17): 8853-8867 Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H. (2011). Phytochemical screening and extraction : a review. International Pharmaceutica Sciencia Vol. 1 Issue 1 United State Departement of Agriculture. (2012). Plants profile Garcinia mangostana L. http://plants.usda.gov/java/nameSearch Diakses tanggal 23 Juli 2012. Utama A et al. (2005). Skrining inhibitor RNA helikase terhadap virus Japanese Encephalitis. Poster Program Kompetitif LIPI. Utama, A. et al. (2000). Identification and characterization of the RNA helicase activity of japanese enchepalitis virus NS3 protein. FEBS Letter 456:74-78 Verheij, E.M.W, dan Coronel, R.E. (1997). Sumber Daya Nabati Jilid 2. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Wang, J., Sanderson, B.J.S., Zhang, W. (2011). Cytotoxic effect of xanthone from pericarp of the tropical fruit mangosteen (Garcinia mangostana Linn.) on human melanoma cells. Food and Chemical Toxicology 49 : 2385 -2391. Wasito, Hendri. (2011). Obat Tradisional Kekayaan Alam Indonesia. Yogyakarta: Graha Ilmu. Yamashita, A et al. (2012). Inhibition of hepatitis C virus replication and viral helicase by ethyl acetate extract of the marine feather star Alloeocomatella polycladia. Marine Drugs 10: 744-761. Yu, L., Zhao, M., Yang, B., Zhao, Q., Jiang, Y. (2007). Phenolic from hull of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities. Food Chemistry 104 : 176 - 181. Zang, Y., Song, Z., Hao, J., Qiu, S., Xu, Z. (2010). Two new prenylated xanthones and a new prenylated tetrahydroxanthone from pericarp of Garcinia mangostana. Fitoterapia 81 : 595 – 599. Zarena, A. S., Sachindra, N. M., Sankar, K. U. (). Optimisation of ethanol modified supercritical carbon dioxide on the extract yield and antioxidant activity from Garcinia mangostana L. Food Chemistry 130 : 203 – 208.

http://plants.usda.gov/java/nameSearch

45


Lampiran 1. Hasil Determinasi Garcinia mangostana L.

46


Lampiran 2. Alur Penelitian

Ekspresi enzim RNA helikase

virus hepatitis C

Pembuatan seri pengenceran

ekstrak dengan metanol absolut

Analisis kemurnian

enzim RNA helikase HCV dengan SDS

PAGE

Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit

buah manggis

Purifikasi enzim RNA helikase

virus hepatitis C

Uji aktivitas enzim RNA

helikase virus hepatitis C

Maserasi bertingkat dengan pelarut

n-heksan, etil asetat, dan metanol

Skrining Fitokimia Ekstrak

Ekstrak kental n-heksan, etil asetat,

dan metanol

% inhibisi

Uji aktivitas inhibisi ekstrak

dengan kolorimetri ATPase

Enzim RNA helikase virus

hepatitis C terpurifikasi

47


Lampiran 3. Skema Kerja Penyiapan Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L)

Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut metanol, masing-masing selama 3 hari

Filtrasi

Residu Filtrat 2

Evaporasi

Filtrasi

Filtrat 3 Residu

Ekstrak n -heksan

Evaporasi

Ekstrak etil asetat

Ekstrak etil asetat

Residu

Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut etil asetat, masing-masing selama 3 hari

Filtrasi

Filtrat 1

Evaporasi

Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut n - heksan, masing- masing selama 3 hari

Serbuk kulit buah manggis sebanyak

490 gram

Buah manggis sebanyak 5 kg,

dibersihkan dengan air mengalir

Dikumpulkan bagian kulit

buah (perikarp) manggis

Dirajang dan diangin-anginkan di udara terbuka

Dihaluskan denga

blender

48


Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Induksi IPTG

Afinitas kromatografi

Uji aktivitas enzim RNA helikase dengan kolorimetri ATPase

SDS PAGE

Enzim RNA helikase terpurifikasi

Kultur E.coli BL21(DE3)pLysS - RNA helikase rekombinan dalam media LB

Koleksi pelet, disimpan pada suhu -20 °C

Sonikasi

Fraksi terlarut

Freeze-thawing

49


Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE

Commasie blue staining

Hasil SDS PAGE

Destain for commasie blue

Denaturasi

Preparasi gel ( stacking dan separating)

Running SDS PAGE

Sample + loading dye

50


Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV

Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6

M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)


Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm

Tambahkan 25 µL Na Sitrat

Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL

MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

51


Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV


Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6

M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)


Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan

405 nm

Tambahkan 25 µL Na Sitrat

Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM,

38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV) ditambahkan dengan 5 µL ekstrak kulit buah manggis

Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781

ppm, 391 ppm

52


Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE

Larutan-larutan Komposisi

A Larutan separating

8%

• H2O 7,25 mL

• 1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS 3,75 mL

• 30% Akrilamid 4 mL

• 10% Amonium Persulfat 0,05 mL

• TEMED 0,015 mL

B Larutan stacking

3,9%

• H2O 3,05 mL

• 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25 mL

• 30% Akrilamid 0,65 mL

• 10% Amonium Persulfat 0,025 mL

• TEMED 0,005 mL

C Dapar sampel SDS

2X (Loading Dye)

• 4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL

• Gliserol 20 mL

• SDS 4 g

• β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL

• Bromphenol blue 1 mg

• H2O sampai 100 mL

D Commasie Blue G-

250 Staining

Solution (500 mL)

• 45% H2O 225 mL

• 45% Metanol 225 mL

• 10% Asam asetat glacial 50 mL

• 0,05% Commasie brilliant blue 250 mg

E Commasie Blue G-

250 Destaining

Solution (1000 mL)

• 50% H2O 500 mL

• 10% Asam asetat glacial 100 mL

• 40% Metanol 400 mL

53


Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan

Larutan, dapar, medium Komposisi dan Cara Pembuatan

A Media LB (Luria-Bertani) cair

Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masing-masing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit.

B Dapar B Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.

C Dapar Elusi Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan

D Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M

Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus. Disimpan pada -20°C.

E Ampisilin 100 mg/mL

Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C

F Malachite green 0,081%

Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring

G Polivinil alkohol 2,3%

Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan dengan pemanasan

H Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N

Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan

I Natrium Sitrat 30%

Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan

54


Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis

Rendemen = ( ) ( ) X 100%

Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis

Rendemen = , X 100% = 1,061%

Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis

Rendemen = , X 100% = 9,673%

Ekstrak metanol kulit buah Manggis

Rendemen = , X 100% = 8,608%

55


Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis

1. Susut pengeringan = ( ) ( ) x 100%

Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir

n – heksan 1,0002 0,9952

Etil asetat 1,0003 0,9795

Metanol 1,0003 0,9073


Susut pengeringan = , – , , X 100% = 0,50%


Susut pengeringan = , , , X 100% = 2,08%


Susut pengeringan = , , , X 100% = 9,30%

56


(Lanjutan)

2. Kadar abu = ( ) ( ) x 100%

Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir

n – heksan 2,0004 0,008

Etil asetat 2,0432 0,0145

Metanol 2,0103 0,0437


Kadar abu = , , X 100% = 0,39%


Kadar abu = , , X 100% = 0,71%


Kadar abu = , , X 100% = 2,17%

57


Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis

Pembuatan larutan Ekstrak Kulit buah manggis dibuat larutan stock dengan

melarutkan sejumlah ekstrak dengan metanol absolut. Larutan Stock yang dibuat

adalah :

Konsentrasi = = . , = 100.000 ppm

Larutan Stock yang diperoleh kemudian diencerkan menjadi beberapa pengenceran.

Rumus Pengenceran :

V1 x N1 = V2 x N2

Dimana, V1 = volume yang diambil dari larutan stock

N1 = konsentrasi larutan stock

V2 = volume larutan yang akan dibuat

N2 = konsentrasi larutan yang akan dibuat

Pengenceran 2x (50.000 ppm)

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 100.000 ppm = 1 mL x 50.000 ppm

V1 = 0,5 mL

Artinya 0,5 mL sampel dari larutan stock + 0,5 mL metanol


V1 x 50.000 ppm = 1 mL x 25.000 ppm

V1 = 0,5 mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 2x + 0,5 mL metanol


V1 x 25.000 ppm = 1 mL x 12.500 ppm

V1 = 0,5 mL


58


(Lanjutan)


V1 x 12.500 ppm = 1 mL x 6.250 ppm

V1 = 0,5 mL



V1 x 6.250 ppm = 1 mL x 3.125 ppm

V1 = 0,5 mL



V1 x 3.125 ppm = 1 mL x 1.562 ppm

V1 = 0,5 mL


Pengenceran 128x (761 ppm)

V1 x 1.562 ppm = 1 mL x 761 ppm

V1 = 0,5 mL


Pengenceran 256x (391 ppm)

V1 x 761 ppm = 1 mL x 391 ppm

V1 = 0,5 mL


59


Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Ekstrak Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi

tanpa

inhibitor

(enzim)

Absorbansi

dengan

inhibitor

(enzim +

inhibitor)

%Inhibisi

n-heksan Kontrol negatif 1.20 1.15 3.78

3.125 0.65 41.79

1.562 0.75 33.98

781 0.91 20.73

391 1.03 10.45

Etil asetat Kontrol negatif 1.22 1.17 3.96

3.125 0.69 39.07

1.562 0.84 27.26

781 0.92 20.78

391 0.98 15.58

Metanol Kontrol negatif 1.22 1.17 3.96

3.125 0.30 71.57

1.562 0.33 68.70

781 0.45 58.75

391 0.90 22.17

60


Lampiran 14. Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Cara Perhitungan :

% inhibisi = – x 100

A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor

I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor.

Contoh perhitungan pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 3.125 ppm :

% inhibisi = . – . . x 100

= 75,553307%

Absorbansi aktivitas inhibisi dikurangi dengan kontrol negatif

= 75,53307% - 3.963888 %

= 71,569182%

61


Lampiran 15. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase)

Data :

Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi 405 nm

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

Grafik :

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Abs

620

/405

nm

[K2HPO4] (mM)

y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989

62


Lampiran 16. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C

Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 14)

Sampel didilusi 40x

OD pada 620 nm = 1,21933

Masa inkubasi 45 menit

1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase

Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL

1 pmol = 0,05

Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab : y = 1,020x + 0,010

1,21933 = (1,020x) + 0,010

x = 1,18562 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,18562 mM fosfat x 40

= 47,4248 x 10-6 mol fosfat/mL

Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit = , x 10-6 mol fosfat/mL

= 1,05388 x 10-6 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL

= 91,6 µg = 1832 pmol protein

Aktivita enzim RNA helikase = , / /

= 575,263 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein

63


Lampiran 17. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

0.0

100.0

200.0

300.0

400.0

500.0

600.0

700.0

3.125 ppm 1.562 ppm 781 ppm 391 ppm enzim tanpa senyawa inhibitor

Akt

ivit

as E

zim

(pm

ol fo

sfat

/mL/

men

it/p

mol

pro

tein

)

Konsentrasi Ekstrak Kulit Buah Manggis

Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

n-heksan

etil asetat

metanol

Lampiran 18. Gambar Alat Penelitian

Microplate reader

[Multiscan EX Thermo]

Sonikator

[LabSonic]


. Gambar Alat Penelitian

[Multiscan EX Thermo]

Ultrasentrifus

[Sorvall RC-26 plus]

SDS-PAGE

[Atto]

64


Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis Garcinia...

Documents

Transcript of Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis Garcinia...