UE 8 – De l’agent infectieux à l’hôte Jean-Jacques HOARAU

Date : 08/02/2016 Plage horaire : 16h - 18hPromo : DFGSM2 2015-2016 Enseignant : Jean-Jacques HOARAU

Ronéistes : RAMJAUN Yassir SUMUN Mohamad

Génétique bactérienne

I. Définition

1. Origine de la génétique 2. Apports de la génétique bactérienne

II. Variations génotypiques et phénotypiques

1. Variations génotypiques 2. Variations phénotypiques

III. Transferts de matériel génétique

1. Transformation A. Transformation artificielleB. Transformation ou compétence naturelle

2. Conjugaison 3. Transduction

A. Transduction généraliséeB. Transduction spécialisée

IV. Essor de la génomique

V. Conclusion

On va voir comment les bactéries arrivent à faire évoluer leur génome et les mécanismes à leur disposition pour brasser un peu leurs allèles puisqu’il n’y a que des transferts horizontaux de matériel génétique entre les bactéries (pas de transfert vertical). On verra les variations génotypiques et phénotypiques et aussi les mécanismes de transfert du matériel génétique entre les bactéries. Il faut savoir que d’un point de vue purement génétique le plus simple c’est de s’intéresser à la transmission de caractère héréditaire autant que possible observable mais les bactéries sont trop petites. On terminera sur les apports de la génétique bactérienne à l’essor de la génomique de façon globale.

I. Définition

1. Origine de la génétique

La génétique (du grec genno = donner naissance) est la science qui étudie l’hérédité et les gènes. La génétique formelle ou mendélienne, s'intéresse à la transmission, apparition ou disparition des caractères héréditaires, de manière permanente entre des géniteurs et leur descendance.

Grégor Mendel : (1822-1884), contemporain de Charles Darwin (1809-1882) qui n’a pourtant pas utilisé ces travaux (sur les petits pois) pour étayer sa théorie de l’Evolution. Mendel publie les premières lois fondamentales de la génétique formelle en 1865 à partir d’études sur des organismes sexués. La théorie synthétique de l’évolution ou néo-darwinisme (Huxley, Fisher et Haldane 1942) est l’intégration des mécanismes de l’hérédité génétique mendélienne à la théorie originale de Charles Darwin.

La découverte de la structure de l’ADN ne date que de 1953. Donc même si on n’avait pas découvert le support de l’information génétique un peu avant 1953 on commençait déjà à avoir une idée de ce qui pouvait être le support de l’information génétique et on va voir qu’à partir des années 1900 les travaux sur les bactéries ont grandement aider à comprendre les mécanismes de transmission des caractères héréditaires.

L’épigénétique est la capacité de transmettre des caractères acquis, qui ne sont pas portés au niveau du matériel génétique. Il s'agit de modifications de l’ADN qui peuvent être transmises à la descendance mais qui ne sont pas liées à la succession des bases le long de la double hélice d’ADN. Il s’agit d’un nouveau domaine de la génétique qui encore actuellement controversé.

2. Apports de la génétique bactérienne

La génétique moderne (bien que commencée avec des mouches à fruits, maïs…) ; la nature de l’information génétique, la structure du gène, le code génétique, les mutations ont été élucidés par des expériences sur les bactéries.

Quand on veut étudier les évolutions génétiques, on s’intéresse au phénotype, c'est à dire quels aspects vont prendre les bactéries. Les bactéries présentent cependant des inconvénients : leur petite taille, les caractères morphologiques discrets (aspect de la colonie, auxotrophie / prototrophie est la capacité ou non de certaines bactéries à synthétiser certains éléments qui ne sont pas présent dans le milieu, résistance aux antibiotiques, sporulation) ; ce sont des caractères pas toujours faciles à mettre en évidence.

Le gros avantage avec les bactéries c’est leur temps de génération. On est capable de générer une descendance très rapidement. Si on prend le cas de l’une des bactéries les plus utilisées : E. coli, lorsqu’elle est dans les conditions optimales de croissance, elle peut se diviser toutes les 20 minutes, ce qui permet d’étudier plusieurs générations et très rapidement de voir l’acquisition de caractères dans des temps relativement limités.

Les travaux de F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff ont apportés des progrès majeurs en biologie moléculaire et en particulier dans la compréhension de la transmission et de la régulation de l’expression des gènes.

Le grand apport de la génétique bactérienne a été les travaux qui ont permis à Watson et Crick (1953) de déterminer la structure de l’ADN (cf. PACES : complémentarité des bases, structure en double hélice de l’ADN…).

II. Variations génotypiques et phénotypiques Vous avez 2 types de variations qui sont mesurables : les variations génotypiques qui vont affecter le génome et qui potentiellement peut entrainer des variations phénotypiques, des variations qui sont observables ou non.

1. Variations génotypiques

Les variations génotypiques qui ont lieu au niveau de la séquence génétique vont pouvoir influer sur les caractères phénotypiques qui sont les aspects que vont pouvoir prendre les bactéries.

Naturellement, les bactéries peuvent subir (comme n’importe quel génome procaryote, eucaryote ou viral) des modifications spontanées qui vont conduire à des mutations.

Une variation génotypique correspond à une modification :

- Spontanée ou induite par des facteurs physiques ou chimiques tels les UV ou autre cancérigène

- Discontinue : apparition aléatoire, selon la loi du tout ou rien- Stable qui peut être transmise à la descendance- Rare si elle est spontanée, avec une fréquence = 10-6 (probabilité d’1 / 1 000 000 paires de

bases)- Spécifique : la probabilité d’obtenir un double mutant = produit des probabilités de

chaque événement pris indépendamment = 10-12.

Si une bactérie devait se baser essentiellement sur des modifications spontanées pour faire évoluer son génome, ça prendrait énormément de temps.

Les bactéries utilisent d’autres mécanismes que simplement se baser sur des mutations spontanées pour faire évoluer leur génome (par exemple : l'intégration de virus, les éléments transposables : les transposons).

Mutation spontanée : acquisition d’une résistance à un antibiotique (fréquence : 10-6 pour une mutation ponctuelle).

L’intégration de virus est une autre cause de modification du génome bactérien. Vous avez des bactériophages qui en infectant des bactéries peuvent amener du matériel génétique qui peut s’intégrer au génome bactérien.

Les génomes bactériens possèdent également des éléments mobiles, des transposons qui peuvent se déplacer sur le génome et éventuellement activer ou inactiver certains gènes. Tous ces phénomènes sont extrêmement rares et pas forcément visualisable.

2. Variations phénotypiques

Particularité, notamment chez les bactéries : les variations phénotypiques ne dépendent pas que des variations génétiques. Donc il y a des variations phénotypiques qui ne sont pas d’origine génotypique. Par exemple la diauxie.

La diauxie est un mécanisme retrouvé chez Escherichia coli.

On cultive E. coli sur un milieu minimum, càd un milieu de base suffisant à la croissance bactérienne.Cela se fait assez facilement : on met les bactéries dans un milieu liquide et régulièrement vous prenez

un échantillon et vous faites une mesure de la densité optique ce qui vous permet d’avoir une mesure a 600nm de la densité des bactéries présentes.

Quand vous cultiver des bactéries sur un milieu qui contient du glucose et du lactose. Vous avez d’abord une courbe exponentielle et après vous avez un ralentissement de la croissance et après il y a la même structure de croissance exponentielle et puis à nouveau ça sature.

Cette croissance biphasique est liée à une adaptation des bactéries en fonction des sources nutritives qu’elles ont dans le milieu. Lorsqu’il y a du glucose dans le milieu, l’opéron lactose qui permet d’utiliser le lactose est réprimé. Lorsque le glucose arrive à épuisement, il y a une levée de l’inhibition de l’utilisation de l’opéron lactose, ce qui permet à la bactérie à ce moment-là d’utiliser le lactose.Tout ça est quantifiable.Il n’y a pas de mutation ici. On peut avoir une variation phénotypique chez une bactérie, sans que ça n’indique une variation génétique. Il s’agit simplement de la mise en action de mécanismes « physiologiques » dépendant de l’environnement dans lequel évolue la bactérie.

On peut également retrouver d’autres variations phénotypiques qui ne dépendent pas de variation génotypiques pour d’autres capacités des bactéries :

- Auxotrophe / prototrophe (Leu+ / Leu-)- Thermo sensibilité / résistance (Ts / Tr)- Sensibilité / résistance aux bactériophages- Sensibilité / résistance aux antibiotiques.

Prototrophe (toujours par rapport à quelque chose) : organisme vivant capable de proliférer dans un milieu de base (= milieu minimum) sans nécessité la présence de facteurs de croissance (acides aminés particuliers par exemple). Un organisme prototrophe est capable de synthétiser les substances nécessaires à sa prolifération à partir de ce milieu minimum.

Ex : une bactérie qui est dans un milieu qui ne contient pas de Leucine mais qui arrive à en synthétiser est dit prototrophe, donc elle va avoir le phénotype Leu+, puisqu'elle dispose de la machinerie et donc du gène qui permet de produire la Leucine.

Auxotrophe : organisme incapable de synthétiser ses facteurs de croissance à partir d’un milieu minimum.

Ex : une bactérie auxotrophe à la Leucine elle va avoir un phénotype Leu-, donc si on met ces bactéries dans un milieu où il n'y a pas de Leucine, elles ne pourront pas croître.

L'auxotrophie et la prototrophie se retrouve pour différents acides aminés essentiels, différentes vitamines, différents acides gras essentiels...

Les différents caractères phénotypiques que l'on peut étudier sont extrêmement larges, comme la thermorésistance ou la thermosensibilité, la résistance à certains virus en particuliers aux bactériophages (ex : phage lambda pour E.coli), ou la résistance à certains antibiotiques. Ces caractères éventuellement peuvent être transmis à d’autres bactéries.

Question d’élève : La diauxie et ces différentes variations phénotypiques dépendent-elles uniquement du génome de la bactérie ?

Ces variations phénotypiques dépendent du génome de la bactérie, de l’ADN génomique, mais également de l’éventuelle présence de plasmide qui apporte des gènes complémentaires à ceux de la bactérie. Ces variations phénotypiques sont des caractéristiques soit intrinsèques, portées par le génome de la bactérie ; soit des caractéristiques qu’elle va pouvoir acquérir.

Les variations phénotypiques dépendent du matériel génétique présent au sein de la cellule.

De nombreuses études montrent que des modifications phénotypiques apparaissent beaucoup plus fréquemment que lorsqu'on se base que sur les fréquences liées aux mutations. On a remarqué que ces évolutions du génome sont liées aussi à des transferts horizontaux de matériel génétique.

Du coup, ça nous amène aux premiers travaux qui nous permettent de mettre en évidence la façon donc les bactéries s’échangent du matériel génétique et qui passent par les mécanismes de transfert horizontaux.

Ce transfert horizontal de nouvelles séquences d’ADN se fait entre 2 bactéries ou si la bactérie puise dans le milieu extérieur.

Frederick Griffith (1928), est le 1er à avoir mis en évidence ce transfert horizontal.A partir de ses expériences sur Streptococcus pneumoniae, il identifia en culture 2 souches différentes :

la souche R avirulente et la souche S virulente.

La souche R injectée à des souris ne tue pas ces souris alors que la souche S tue les souris. Lorsqu’il a pris la souche virulente, qu’il l’a chauffé pour l’inactiver puis l’a injecté aux souris, les souris ne mourraient

pas, la virulence ayant été perdue. Si on met ces bactéries sur un milieu de culture, elles ne croissent plus, car elles sont mortes.

Sa 3ème expérience consiste à prendre des bactéries virulentes qu’il inactive par la chaleur, puis il mélange ces bactéries avec des bactéries avirulentes. Ce mélange tue les souris, ce qui signifie qu’il y a eu un transfert de la virulence entre les bactéries virulentes inactivées et les bactéries avirulentes.

Griffith parle de principe transformant. C’est-à-dire que quelque chose était capable de transformer des bactéries non-virulentes en bactéries virulentes. Il ne savait pas si c’était une protéine, un ADN etc.

En 1944, Avery (Rockefeller Institute) a essayé de vérifier quelle était la nature de l’agent transformant. A partir des bactéries virulentes, on a extrait différents constituants : des protéines, des ARN et l’ADN. On a testé si les souches R (avirulentes) étaient transformées ou pas par ces constituants.

En présence de protéase: il y a bien transformation.

En présence d’ARNase : il y a bien transformation. Si on dégrade l’ADN de ces souches virulentes par des ADNase, il n’y a pas de transformation

des souches avirulentes.

Le support de l’information qui confère la virulence est donc porté par de l’ADN.En 1944, ces expériences posèrent problème car on considérait que les protéines étaient le support de

l’information génétique et non pas l’ADN. Il a fallu attendre quelques années (1953) pour que l’on confirme que l’ADN est le support de l’information génétique, et qu’il est porteur des gènes capables de conférer la virulence.

En 1997, Stanley Prusiner reçu le prix Nobel de médecine pour ses travaux sur le pouvoir infectieux des protéines notamment par des prions.

Chez les bactéries l’évolution des génomes est essentiellement liée à des transferts horizontaux de l’ADN qui va pouvoir passer de bactérie à bactérie ou de l'environnement à la bactérie, ou de virus à bactérie.

III. Transferts horizontaux de matériel génétique Le problème qui se pose au niveau des bactéries est qu’elles n’ont pas de vie sexuelle.

Généralement, les caractères héréditaires chez les organismes supérieurs sont transférés au cours de la méiose, or les bactéries ne font pas de méiose. Ce qui veut dire que lorsque les bactéries vont être transformées, il va y avoir un transfert horizontal de gènes (TGH) qui va permettre de combiner différents allèles à l’infini entre différentes bactéries ; c’est ce qu’on appelle la sexualité chez les bactéries.

3 mécanismes vont permettre de brasser des allèles et d’apporter de nouveaux caractères chez les bactéries :

1. La transformation bactérienne est la capacité qu’on les bactéries a absorbé un ADN dans le milieu extérieur quel que soit l’origine de cet ADN qu’on va appeler un ADN nu, un exogénote. Dans le milieu environnant une bactérie entre en contact avec du matériel génétique et certains bactéries on la capacité à capter cet ADN et à l’intégrer.

2. La conjugaison bactérienne c’est le mécanisme où interviennent les pilis sexuels. Cela permet à des bactéries de changer de façon active du matériel génétique.

3. La transduction bactérienne fait intervenir des virus de bactéries qui sont capable de véhiculer du matériel génétique à l’intérieur d’une capside virale et donc de permettre un transfert de matériel génétique.

Quand une bactérie est en présence de matériel génétique qu’elle a trouvé dans le milieu extérieur ou qu’on lui a donné de force, qu’on appelle un exogénote (donc qui n’est pas initialement présent dans la cellule), le devenir de cet ADN peut être multiple, que ce soit par transformation, conjugaison ou transduction.

Question 2016 : Il vient d’où l’exogénote ?

De certaines bactéries mortes qui libèrent leur matériel génétique dans le milieu extérieur. Certaines bactéries vont pouvoir rentrer en contact avec cette ADN et l’absorber.

Question 2016 : L’ADN est libéré sans être dégradé ?

Si, vous le verrez d’ailleurs que quand c’est de l’ADN qui est pris comme ça dans le milieu extérieur, les bactéries ne vont pas pouvoir intégrer un fragment d’ADN très long. Elles vont fragmenter l’ADN en petits bouts. Alors ce qui va être intégrer ce n’est jamais la totalité du génome. Après si c’est de la conjugaison bactérienne c’est un transfert de la totalité du plasmide. Si vous avez un plasmide bactérien qui peut s’intégrer au génome de la cellule bactérienne, lorsqu’il va mettre en place le pilus sexuel et le transfert du génome il va se transférer lui-même mais il va transférer une partie du génome. Alors là on est à l’intérieur de la cellule. Et ça on peut le faire aussi artificiellement, on verra ça après. Càd faire entrer de l’ADN étranger de force dans une cellule.

A partir du moment où un exogénote est rentré dans une cellule, naturellement ou pas, l’évolution va dépendre de la capacité ou pas de l’exogénote de se maintenir dans la cellule. Soit elle s’intègre au génome de la cellule hôte par des mécanismes de recombinaison via un échange d’une portion du génome si vous avez des régions homologues. Donc une partie de la cellule d’origine va être remplacé par l’exogénote. Soit l’exogénote est un plasmide qui a la capacité de se maintenir naturellement et il peut même être transmis à la descendance. Sinon ce matériel va être dégradé et perdu.

Généralement, si l’exogénote est un matériel plasmidique circulaire autonome, il peut se maintenir dans la cellule. S’il est linéaire, il doit s’intégrer au génome de la cellule receveuse pour ne pas être dégradé.

Peu importe la nature de ces mécanismes, pour qu’une bactérie soit transformée, elle va devoir acquérir du matériel génétique étranger, appelé exogènote. L’exogènote peut être de l’ADN circulaire comme par exemple les plasmides ; des fragments d’ADN linéaire simple ou double brin(s) présents soient dans le milieu extérieur, soient apportés par d’autres bactéries. Cet ADN exogènote va devoir être transféré dans la cellule receveuse.

Quand l’ADN est transféré dans une cellule receveuse, il peut avoir plusieurs évolutions. Le plus souvent il va être dégradé, il n’y aura donc pas d’intégration, pas de transfert au long terme, et donc pas d’évolution de la bactérie receveuse.

Pour qu’une nouvelle caractéristique génétique ou phénotypique soit acquise, il y a 2 possibilités.Soit l’exogènote absorbé n’a pas la capacité à s’auto-répliquer (cas de tous les ADN de nature

linéaire) à se maintenir de façon autonome dans la cellule receveuse ; dans ce cas-là le seul moyen pour qu’il

y ait acquisition d’un nouveau caractère est que l’exogènote s’intègre au génome de la bactérie receveusesinon elle est détruite.

Il existe une période intermédiaire où même si c'est de l’ADN linéaire, l'endogénote et l'exogénote vont coexister et on parle de mérozygote.

Autre possibilité, il s’agit des ADN circulaires qui ont une capacité d’autoréplication autonome (ex : plasmides). Le plasmide peut se maintenir de façon autonome sans avoir à s’intégrer au génome de la cellule hôte (diploïde partiel), il peut ainsi apporter de nouvelles caractéristiques génétiques etphénotypiques à la cellule receveuse. Si le plasmide possède la machinerie d'intégration il pourra un moment donné s'intégrer au génome mais il n'y a pas obligation.

1. Transformation La transformation est la capacité des bactéries à acquérir un fragment d’ADN d’origine extérieur

appelé exogènote (de n'importe quelle origine : virale, humaine, bactérienne). Cet exogènote est le plus souvent d’origine plasmidique, mais il peut s’agir d’ADN chromosomique provenant d’autres bactéries ou de n’importe quel autre organisme vivant qui aurait de l’ADN dans le milieu.

Il existe actuellement 2 mécanismes de transformation :1. La transformation artificielle (la plus récente) : c’est un outil de génie génétique. On va faire

entrer de l’ADN (circulaire ou linéaire) de force dans une cellule.2. La transformation naturelle : certaines bactéries possèdent la capacité à prendre de l’ADN du

milieu extérieur et ça s’appelle la compétence naturelle. Toutes les bactéries ne sont pas capables de le faire.

A. Transformation artificielle

L’une des techniques de transformation artificielle la plus courante c’est l’électroporation. Vous prenez un ADN, généralement on utilise de l’ADN plasmidique parce que ça va tenir facilement dans les cellules qui vont être transformées. On va incuber l’exogénote avec les bactéries dans un milieu propice d’électroporation et on va appliquer un choc électrique aux bactéries et ça va entrainer des micros perforations au niveau de la membrane et de la paroi des bactéries et les plasmides vont pouvoir entrer librement. Ça dure pas très longtemps parce que les bactéries vont essayer de fermer les brèches mais on arrive quand même à faire entrer de l’ADN dans les bactéries et à leurs conférer des propriétés. Le but c’est que les plasmides soient porteurs d’une information génétique qui est d’intérêt pour apporter une nouvelle propriété à ces bactéries. Il suffit ensuite de cultiver les bactéries.

Voilà un plasmide bactérien type pUC 19 qui n’est pas très long (2686 pdb) dans lequel comme tout plasmide on va retrouver une origine de réplication. Généralement on prend des plasmides avec des marqueurs de sélection tels que par exemple ici un gène de résistance à l’ampicilline et surtout quand on veut insérer un gène d’intérêt on va sélection un site de clonage dans lequel on va insérer le fragment d’intérêt. Sur pUC 19 le site clonage se trouve au niveau du gène lac Z qui code pour la Beta-Galactosidase. Une fois qu’on a fait le mécanisme d’électroporation, les bactéries vont être sélectionnées par culture en présence d’ampicilline. Les bactéries sans plasmides vont mourir. On peut aussi utiliser le X-Gal vu la position de l’insère. Si le gène de la galactosidase est intact, la bactérie va métaboliser le X-Gal et les colonies vont devenir bleues alors que lorsque le gène d’intérêt que vous avez inséré inactive le gène lac Z, les bactéries sont blanches en présence de X-Gal.

Il faut récupérer les clones bactériens en blanc sur le schéma qui sont vos clones transformant puisqu’elles auront acquis le plasmide avec le gène d’intérêt.

Cette technique utilise très souvent des plasmides bactériens qui sont circulaires. Mais on peut très bien les faire avec de l’ADN bicaténaire qui est linéaire. Ce qui veut dire néanmoins que l’étape suivante ici nécessite la présence de mécanisme de recombinaison càd qu’on va insérer un fragment d’ADN avec des homologies de séquences entre le génome de la bactérie receveuse et l’exogénote. La machinerie cellulaire va faire une recombinaison càd échanger une partie u génome bactérien avec celui de l’exogénote.

Cette transformation on peut aussi l'obtenir par électroporation, mais on peut aussi l'obtenir de façon chimique.

Par exemple : en faisant prendre à la bactérie un bain de chlorure de césium. On peut rendre les bactéries compétentes chimiquement également. Il suffit d'incuber dans le chlorure de césium l'exogénote avec les bactéries, pas besoin d'incorporation et l'exogénote arrive à rentrer.

B. Transformation ou compétence naturelle

Les bactéries savent faire globalement la même chose naturellement, c’est ce qu’on appelle la compétence naturelle.

Toutes les bactéries ne sont pas naturellement compétentes, elles ne sont pas toutes capables d’aller absorber des exogénote pour modifier leur métabolisme. Voici une liste non exhaustive de bactéries connues compétentes : Streptococcus, Bacillus, Neisseria, Helicobacter, Pseudomonas, Thermoactynomyces, Haemophilus, Moraxella, Acinetobacter, Azotobacter…

De plus, toutes ces bactéries compétentes ne sont pas compétentes en permanence, la compétence naturelle est une propriété qu’acquièrent des bactéries à certains stades de leur développement dans des conditions bien particuliers.

En l’occurrence, la compétence est acquise lorsque les bactéries arrivent au bout de leur phase exponentielle de croissance (cf. courbe de croissance bactérienne).Lorsque le milieu extérieur devient restreint et que les bactéries ne trouvent plus suffisamment de constituants nécessaires à leur développement, c’est à ce moment-làqu’elles vont acquérir la compétence. On se rend compte qu'ils deviennent compétents quand ils sont en phase exponentielle de croissance et qu'ils atteignent en 10^7 ou 10^8 cellules par ml.

La raison étant que quand il arrive en bout de la phase exponentielle de croissance, les nutriments dans le milieu commence à devenir rare. Si les bactéries ne font rien tôt ou tard le milieu va s’épuiser et elles vont mourir. Donc, développer la compétence c’est essayer en absorbant du matériel génétique du milieu extérieur d’acquérir de nouvelle caractéristiques, prendre un gène qui vont les permettre d’exploiter un nouveau métabolite dans le milieu par exemple. Toutes les cellules ne deviennent pas compétentes. La fréquence est de l'ordre de 10^-3 càd qu'une bactérie sur 1000 devient compétente. C’est à ce même stade que certaines bactéries qui sont capables de faire de la sporulation, vont développer leurs capacités à émettre des spores. C’est aussi à ce moment-là que les bactéries vont se mettre à produire tout un ensemble d’enzymes cataboliques pour pouvoir aller dégrader leur environnement. La compétence a été beaucoup étudiée chez les streptococcus.

Photo d’une microscopie par fluorescence montrant la machinerie de capture« DNA uptake » qui va être mise en place aux niveaux des bactéries compétents et qui a était marqué en vert au niveau des pôles des cellules compétentes.

Les régions dans lesquelles les bactéries vont pouvoir absorber l’ADN extérieur ne sont pas uniformément distribuées au niveau de la bactérie, la compétence ne pourra se développer que dans des régions très localisées de la bactérie.

Alors on va entrer un peu plus dans la mécanistique de ce système. La transformation naturelle fait intervenir des mécanismes de recombinaison. On va prendre dans le milieu extérieur de l’ADN qui peut être linéaire ou circulaire pour acquérir de nouvelles propriétés. Cela nécessite d’intégrer l’exogénote au matériel génétique de la cellule et nécessite de faire des recombinaisons. A ce moment-là, il va y avoir en fonction de la nature de l’exogénote plusieurs recombinaisons peut être mises en place.Quand ce qui est pris dans le milieu extérieur est un fragment d’ADN linéaire, généralement on observe des mécanismes de combinaison

homologue avec des échanges dites réciproques ou non réciproque. Quand l’exogénote est de nature circulaire, généralement on va avoir des recombinaisons dites localisées avec une intégration totale de l’exogénote dans le génome de la cellule hôte ou alors on va avoir des phénomènes de transposition càd des échanges de morceaux d’ADN entre le génome et la cellule receveuse et celui de l’exogénote.

Mécanismes de recombinaison naturelle

Etape 1 : La paroi des bactéries compétentes contient des complexes enzymatiques qui vont permettre l’adsorption de cet ADN extérieur et le clivage de l’ADN. Les fragments d’ADN qui sont de trop grandes tailles ne vont pas directement être adsorbés, ils vont d’abord être découpés en fragments de 5 à 15 kilos paires de bases. Donc notamment si on prend le cas de streptococcus pneumoniae, même s’il trouve de long fragments d’ADN dans le milieu extérieur il va cliver cette ADN en fragment qui vont faire entre 5 et 15 Kpb pas plus.

Etape 2 : L’un des deux brins va être hydrolysé par un ensemble d’enzymes (ronéo de l’année dernière; des exonucléases) pour former un monobrin. La bactérie pourra ainsi absorber l’ADN de l’exogènote sous forme de monobrin qui n’était pas libre dans le milieu environnant.

Etape 3 : Ce monobrin va être transloqué au sein de la cellule par un mécanisme très énergivore faisant intervenir de l’ATP.

Etape 4 : Cet ADN simple brin va pouvoir être intégré au génome de la cellule par les mécanismes de recombinaison. Il s’agit ici d’une recombinaison qui va se faire avec le génome de la cellule receveuse, il y a donc bien intégration au génome, mais une recombinaison qui va se faire qu’avec l’un des monobrins du double brin de l’ADN génomique. C’est une recombinaison homologue non réciproque, il n’y a pas échange du double brin, mais essentiellement perte d’un monobrin remplacé par le monobrin de l’exogènote. Il doit probablement y avoir une homologie de séquence à cet endroit, de façon à ce que le brin exogène s’intègre.

Quand il y a de l’ADN double brin dans le milieu extérieur, ce n’est pas l’ADN double brin qui est absorbé et qui va entrainer une recombinaison, c’est un double brin qui va être transformé en monobrin. Ce monobrin va être intégré pour former un ADN hétéroduplex. Ce n’est que lorsque la bactérie va se diviser qu’une moitié va acquérir une propriété et l’autre pas.

Dans les autres mécanismes qui vont permettre aux bactéries d’acquérir du matériel génétique, d’autres recombinaisons vont également être utilisées. Ces mécanismes de recombinaisons permettent aux bactéries qui ne font pas de méiose de pouvoir combiner leur matériel génétique (allèles) avec de l’ADN provenant du milieu extérieur.

Parmi les mécanismes de recombinaison, il en existe 3 :- Recombinaison homologue avec échange réciproque ou non réciproque- Recombinaison localisée- Transposition

La recombinaison localisée et la transposition mettent en jeu de l’ADN circulaire.

Recombinaison homologue réciproque (ADN double brin linéaire) :

Le premier exemple qui vous est donné c’est la recombinaison homologue dite réciproque, quand il y a des ADN double brin linéaire qui est présent dans le milieu extérieur. Cet ADN provient par exemple d’une bactérie qui est morte. Donc l’ADN se retrouve dans le milieu extérieur. Il a probablement était dégradé en petits morceaux.

Donc une bactérie se retrouve en présence d’un fragment d’ADN qui porte la séquence qui permet de coder pour la synthèse de la leucine et vous avez une autre bactérie qui elle est leu- (càd qu’elle ne possède pas cette capacité). Cette bactérie va pouvoir activer sa machinerie « d’uptake » et puisqu’on va se retrouver avec des séquences homologues ici ou pourra procéder à la recombinaison homologue.

Il va pouvoir y avoir un échange réciproque, càd la partie leu- du génome va être remplacée par la région leu+. Donc vous avez une bactérie qui était phénotypiquement leu- et génotypiquement leu- qui va devenir une bactérie leu+. Elle va acquérir une nouvelle capacité notamment à produire de la leucine pour ses propres besoins.

Si on fait une électroporation avec dans le milieu de l’ADN double brin permettant de synthétiser de la leucine, il va pouvoir se produire un remplacement du double brin au niveau de sites de recombinaison. La région homologue de la cellule receveuse à l’exogènote va être remplacée par homologie de séquence. Il y a donc un remplacement par double recombinaison (cf. PACES : boucles de Holliday).

Question élève : Comment la cellule peut-elle faire une recombinaison avec de l’ADN double brin puisque la recombinaison naturelle ne se fait qu’avec du monobrin ?

Cette recombinaison homologue réciproque, l’échange d’un double brin exogènote qui va venir remplacer le double brin de la cellule receveuse ne peut se faire ici que dans le cas du mécanisme artificiel de l’électroporation.

Recombinaison homologue non réciproque (ADN simple brin linéaire) :

Ce mécanisme intervient dans le cas où une bactérie va récupérer de l’ADN dans le milieu extérieur et que cet ADN va être intégrer sous forme d’ADN linéaire simple brin.

Alors je vais vous expliquer cela et après je vais me corriger pour des raisons de simplification parce que l’ADN linéaire simple brin dans le milieu environnant généralement une bactérie ne va pas le prendre mais ça permet de simplifier.

Imaginez qu’une bactérie arrive à absorber de l’ADN linéaire simple brin, toujours avec un fragment homologue. Toujours par des mécanismes de recombinaison homologue mais cette fois si il va y avoir possibilité d’échange non pas d’un double brin mais d’un monobrin. Ce qui fait que la bactérie formée est phénotypiquement leu+ sachant qu’elle était leu- au départ. Mais ici le caractère n’est pas fixé, càd que quand vous avez un échange d’un monobrin, vous avez du leu- et leu+, et ça potentiellement vous ne savez pas ce que ça va donner.

Reprise de l’explication :Si on prend une bactérie de Leucine -, c.-à-d. auxotrophe pour la leucine, et qu’on lui rajoute un exogénote double brin, porteur de la forme Leu+. Si on a une recombinaison double, on va avoir perte du génome portant Leu-, remplacé par le génome Leu+. La bactérie est donc génotypiquement Leu + et phénotypiquement parlant Leu+.

Dans ce cas, on a ce mode de recombinaison naturel chez les bactéries, elles vont intégrer de l’ADN double brin en liberté, mais lorsqu’elles vont l’absorber vont le transformer sous forme monobrin.

Ce n’est que lorsque cette bactérie va se diviser que vous aurez une cellule fille leu+ et l’autre cellule fille va devenir leu-. Donc le nouveau caractère va concerner qu’une moitié de la population.

Je me corrige maintenant parce que ce mécanisme dit de recombinaison homologue non réciproque c’est visiblement le mécanisme de recombinaison homologue qu’utilisent naturellement les bactéries.

Question 2016 : Est-ce que les 2 gènes leu+ et leu- sont au même endroit ?

Vous imaginez ici que la bactérie va récupérer un monobrin qui est la séquence complémentaire du leu- que vous avez ici.

Vous imaginez ici que vous avez une séquence qui est probablement mutée, qui fait que la bactérie ne peut plus coder une enzyme qui lui permet de synthétiser la leucine mais elle a quand même la séquence. La séquence est peut être différente de celle qui permet de mettre la machinerie leucine en place mais il y a peut-être juste quelques points de mutation. Sur l’ensemble vous avez une homologie de séquence. Imaginez que le gène leu- ici est la même chose que leu+ sauf que vous avez 2-4 mutations ponctuelles qui font que ce gène est inactif. Cette bactérie va prendre un monobrin leu+ qui a une séquence quasiment identique à celle qui est ici.

Les petits morceaux qui ne s’apparient pas ne causent pas des modifications de la structure ?

Non, le fragment qui est ici va être retiré et remplacé par le fragment qui a été pris ici. Les séquences ne sont pas totalement complémentaires, vous allez avoir un hétéroduplex. Pour cette cellule, phénotypiquement parlant le gène reste probablement non fonctionnel. La capacité de synthétiser de la leucine ou pas ne sera fixée que lorsque cette cellule sera diviser parce que lors de la réplication du génome on aura effectivement la matrice double brin qui sera leucine. Là ici vous ne pouvez pas dire à l’ avance si cette bactérie est leu+ ou leu-.

Alors je vous disais que la diapo était trompeuse parce qu’une bactérie n’absorbe pas de l’ADN monocaténaire présent dans le milieu extérieur. C’est toujours de l’ADN double brin que va capturer donc l’exogénote de départ c’est toujours du double brin qui va être absorbé au niveau de la paroi cellulaire et là c’est des enzymes qui sont présentes au niveau de la paroi cellulaire et au niveau de la membrane cytoplasmique qui va transformer de l’ADN double brin en de l’ADN simple brin.

Cette technique pourrait être utilisée artificiellement pour faire de l’électroporation, en réalité, elle ne présente pas d’avantage donc on la laisse aux bactéries qui le font naturellement.

Seules celles qui seront Leu+ seront des bactéries transformantes et auront le phénotype et le génotype Leu+, alors que les autres bactéries qui auront répliqué leur génome à partir de la séquence Leu- elles seront toujours phénotype et génotype Leu-.

Questions provenant de ronéos précédentes

Question d’élève : Comment est le phénotype de la bactérie (celle transformée mais avant division) étant donné qu’il est hétérozygote… ?

Reprise de l’explication :Ici, on a une recombinaison réciproque ou seul un gène monobrin du gène leucine va être

remplacé. On aura sur un monobrin la séquence codant pour Leu+ alors que sur le brin complémentaire on Leu-. Une fois sous cette forme, on ne peut pas déterminer le phénotype de la bactérie (en fonction de si le brin a été intégré dans le sens codant, non codant …).

Par contre, une fois la bactérie divisée, une bactérie va partir avec la forme Leu+ et l’autre avec la forme Leu-. Donc la moitié des bactéries seront génotypique Leu+ et l’autre partie Leu- et phénotypiquement, celles qui étaient Leu+ sont Leu+ et les Leu- restent Leu-.

Tout dépend du fragment qui a été dégradé, tout dépend du sens d’insertion. Il y a peu de chances pour que le gène Leu + s’exprime chez ces bactéries, donc le phénotype n’est pas fixé. Le phénotype n’est exprimé que lorsque la bactérie qui a subi la modification se sera divisée et ce n’est que chez les cellules filles qu’on le verra.

Question d'élève: l'ADN rentrera comment dans la bactérie?L’ADN qui va être capté par une cellule bactérienne, c'est toujours de l’ADN double brin. Imaginez que

la bactérie acquière sa compétence naturelle, elle va exprimer des complexes enzymatiques au niveau de son enveloppe.

Les enveloppes sont différentes selon bactérie Gram + ou Gram - . Les bactéries Gram – ont tout un complexe au niveau de leur membrane externe, si c'est des bactéries Gram +, ils vont se mettre au niveau de la membrane cytoplasmique. Les complexes vont permettre d'adsorber l’ADN d'un exogène qui est toujours de nature double brin au niveau de l'enveloppe.

À ce moment-là un premier traitement de cet ADN va être fait par la cellule bactérienne. Cette ADN va être fragmenté en fragments qui font au maximum entre 5 et 15 kilo de pair de base. À partir de là l’ADN double brin peut soit être incorporé directement dans la cellule par recombinaison homologue réciproque.

Soit il peut être traité par des endonucléases pour procéder à l'hydrolyse de l'un des deux brins de l’ADN, ce qui fait que ce qui est transféré dans les cellules est essentiellement de l’ADN simple brin. Donc on va avoir le mécanisme de recombinaison homologue dit non-réciproque, seul l'un des brins de la double hélice va être remplacé. Il y aura momentanément un ADN hétéroduplex ce qui fait que le caractère ne sera fixé qu’à la génération suivante.

C'est un mécanisme très consommateur d'énergie sous forme d'ATP pour la cellule, c'est un mécanisme actif.

La recombinaison localisée

C'est un remplacement d'une partie du génome de la cellule hôte par une partie du génome porté par l'éxogénote. Cette recombinaison localisée passe par des mécanismes de recombinaison simple ou double qui utilise obligatoirement des ADN double brin circulaires.

Remplacement par recombinaison localisée simple / double (ADN double brin circulaire) :

Dans les 2 schémas précédents, on a vu la possibilité de faire de la transformation en fonction des ADN linéaires. Quand on a affaire à des ADN circulaires, type plasmide, qu’est-ce qu’on a comme possibilités ? Il y a 2 possibilités pour ces plasmides lorsqu’ils vont transformer une bactérie.

On a soit une recombinaison simple qui va conduire à l’intégration de la totalité du plasmide dans le génome de la cellule receveuse. On aura ici une région d’homologie qui est réduite entre le génome bactérien et celui du vecteur plasmidique. Reprenons le schéma de l’acquisition de nouvelles caractéristiques, et notamment la capacité à reproduire de la leucine.

Si on prend une bactérie Leu-, et un exogènote plasmidique qui est Leu+, après la recombinaison simple, on va se retrouver avec des bactéries qui sont Leu- / Leu+ au niveau génotypique, mais au niveau phénotypique, elles seront Leu+ puisqu’elles auront la capacité dans un milieu qui ne contient pas de leucine de pouvoir croître néanmoins en synthétisant leur propre leucine.Les bactéries qui sont génotypiquement, comme par exemple ici, Leu + / Leu -, sont dites mérodiploides.

L’autre possibilité de recombinaison, c’est la recombinaison double, c'est à dire qu’à ce moment-là, ce n’est pas la totalité du plasmide qui est intégré, mais juste la région d’homologie qui correspond à la leucine. Si les bactéries étaient Leu-, il va y avoir un remplacement du double brin portant l’allèle leucine par Leu+, et la recombinaison double va entraîner l’apparition de bactéries qui sont au niveau génétique Leu+ et au niveau phénotypique Leu+. Les régions d’homologie sont beaucoup plus importantes ici.

Question : Donc en fait, tout le gène de la bactérie s’en va ?Réponse : Tout à fait ! Dans la recombinaison double, la totalité du gène Leu- est enlevée et remplacé par Leu+.

Mutation par intégration ou transposition :

Pour pousser un peu plus loin, il existe un cas particulier de ce mode de recombinaison simple et qui est dit localisée. La recombinaison simple localisée s’effectue à l’intérieur d’un gène qui est responsable du phénotype.

Par exemple, si cette recombinaison localisée s’effectue au sein du gène qui code la leucine, peu importe si l’intégration se fait par recombinaison simple ou double, cela va entraîner une une inactivation du gène de la leucine. Si la bactérie receveuse était Leu+, elle deviendra Leu-. L’intégration se fait au niveau de séquences typique des intégrations. On distingue donc ce mécanisme de transposition, car les séquences d'insertions ici sont des séquences d'insertions typiques qu'on retrouve chez certains virus ou bacteriophages.

Reprise de l’explication :Ici on a affaire à de la recombinaison avec de l’ADN double brin. Si on a une recombinaison simple, c.-à-d. que la totalité du plasmide est intégrée dans le génome bactérien. Si la bactérie était Leu-, puisque le plasmide apporte le gène Leu+, on va retrouver dans le génome bactérien les gènes Leu- et Leu+. Puisqu’elle va être prototrophe pour la leucine, phénotypiquement, elle est Leu+.

Dans le cadre de l’autre, on a recombinaison double. Donc, si la bactérie était Leu-, on va avoir un remplacement de l’allèle Leu- par Leu+. Donc la bactérie qui va en être issue est génotypiquement et phénotypiquement Leu+.

Reprise de l’explication :Dans le cadre de la mutation par intégration, il y a un cas particulier : intégration à partir d’un gène fonctionnel, par exemple ici Leu+. On va avoir un phénotype, puisqu’il va y avoir inactivation du gène, si c’était une bactérie prototrophe pour la leucine, elle devient automatiquement auxotrophe. Par contre, phénotypiquement on ne peut pas dire ce que c’est puisque le gène Leu+ n’est plus dans sa totalité (plus de Leu+ ni de Leu-)On peut avoir une diversité et un brassage qui peut être très important.

On peut imaginer toutes les combinaisons possibles de recombinaison qui vont pouvoir entrainer une modification du génome de la cellule receveuse, modifications qui seront transmissibles à la descendance.

2. Conjugaison

La conjugaison bactérienne est un mécanisme qui nécessite le contact entre deux bactéries : c’est un mécanisme de transfert de gènes qui nécessite deux bactéries qui vont se mettre en contact direct, physique et temporaire, établir un pont entre elles pour pouvoir transférer du matériel génétique.

La conjugaison bactérienne a été mise en évidence par deux scientifiques en 1946 : Lederberg et Tatum. Ils ont utilisé des souches bactériennes multi-auxotrophes.

Attention à ne pas s’emmêler les pinceaux entre « prototrophe » et « auxotrophe » !!

Sur la partie gauche du schéma, on voit « Bio -», « Phe -», « Cys -» : c’est-à-dire que nous avons des bactéries qui sont auxotrophes pour la biotine, la phénylalanine, la cystéine. Ces bactéries ne sont pas capables de synthétiser la biotine, la phénylalanine et la cystéine. Donc si on est dans un milieu sans biotine et/ou sans phénylalanine et/ou sans cystéine, ces bactéries ne vont pas croître. Par contre, elles sont prototrophes pour Bio, Phe et Cys et qui était auxotrophe « Thr », « Leu » et « Thi », donc pour la thréonine, la leucine et la thiamine.

Lederberg et Tatum ont utilisé cette première souche bactérienne et de l’autre côté une autre souche bactérienne qui était l’inverse (c’est-à-dire prototrophes pour la biotine, la phénylalanine et la cystéine et auxotrophes pour les trois autres acides aminés).

Leur expérience consistait à mélanger ces deux souches bactériennes et à incuber l’ensemble sur un milieu minimum qui ne contenait aucun de ces acides aminés et néanmoins, les bactéries sesont mises à pousser. Ça veut dire que les bactéries qui étaient auxotrophes sont devenues prototrophes (« Bio+, Phe+, Cys+, Thr+, Leu+ et Thi+ ») pour l’ensemble de ces six caractères. On en déduit que les caractères présents chez chacune d’elles ont été transférés chez les bactéries.

Si les bactéries ne s’étaient pas échangées leurs informations génétiques, elles auraient dû mourir : les facteurs d’auxotrophie ont été perdus et elles sont devenues prototrophes pour les six caractères (« Bio+, Phe+, Cys+, Thr+, Leu+ et Thi+ »).

On apprend que les bactéries sont capables de s’échanger du matériel génétique, mais cette expérience ne montre pas la nécessité de contact entre les bactéries pour que les caractères soient transmis.

C’est un autre scientifique Bernard Davis en 1950 qui démontre que la conjugaison nécessite un contact entre cellules donneuse et receveuse.

Il a utilisé un tube en U dans lequel il a introduit deux autres souches bactériennes avec d’autres caractères phénotypiques : la résistance à l’ampicilline (Ap r) pour la souche A d’une part et la résistance au chloramphénicol (Cm r) pour la souche B d’autre part. Il y avait une résistance pour deux antibiotiques différents. Le tube en U était séparé par un filtre poreux de diamètre inférieur à

1 micron, les bactéries ne pouvaient donc pas passer ce filtre et ne pouvaient pas être en contact. Il a ensuite laissé incuber pendant un certain temps. Il a aussi utilisé un système d’aspiration et de refoulement pour empêcher les bactéries d’être en contact. Puis, s’il mettait les bactéries de la souche A en culture sur un milieu contenant du chloramphénicol et de l’ampicilline, il n’y avait rien qui poussait.

Ce qui veut dire que si les bactéries ne sont pas en contact les unes avec les autres, il n’y a pas de transfert. D’où la nécessité d’un contact ! Donc la conjugaison bactérienne nécessite un contact entre cellules qui sont considérées d’une part comme donneuses et d’autre part comme receveuse.

Comment ce mécanisme de conjugaison bactérienne se fait ?Hayes en 1953 a montré que ce mécanisme de conjugaison faisait appel à deux bactéries et nécessitait

l’établissement entre ces bactéries de pili sexuels. Donc il y a bien la nécessité d’établir un contact via pili sexuel qui permet un échange ou le transfert de matériel génétique plasmidique et non pas chromosomique. Ces pili sexuels permettent de mettre en place des systèmes de sécrétion qui sont à sens unique.

1) Ce transfert ne se fait que entre bactéries fertiles et bactéries non fertiles (cf. plasmides fertiles F), dans le sens des bactéries fertiles (donc qui possèdent un plasmide F) vers des bactéries qui sont F- (qui ne possèdent pas de plasmides fertiles). Ce n’est qu’à cette seule condition que le pont ou pili sexuel va pouvoir s’établir entre ces deux types bactériens, il ne s'établira jamais entre 2 bactéries F+.

D’autant plus que ce pont ou pili sexuel est gouverné par des gènes qui sont portés par le plasmide (le plasmide code pour les facteurs nécessaires à la formation de ce pili sexuel) tout comme des gènes pour assurer le transfert du plasmide.

Ce pili sexuel permet d’établir la connexion entre deux bactéries et va permettre également de tirer les bactéries l’une vers l’autre comme un système de traction de façon à ce que la distance entre les deux bactéries soit la plus courte possible (rapprochement).

A gauche, on a un exemple de pili sexuel qui a été établi entre deux bactéries.

2) Ensuite, nous n’avons pas de transfert de plasmide de la bactérie F+ vers la bactérie F- !

Dans la bactérie F+, il y a un plasmide F fertile qui va être ouvert au niveau d’une origine particulière : l’origine de transfert (pas au niveau de l’origine de réplication !). Il y aura donc à ce niveau une cassure de type monobrin permettant la mise en place d’un complexe enzymatique : le relaxosome. Ce relaxasome va permettre de couper (coupure monobrin) le plasmide au niveau de l'origine de transfert.

Le relaxasome va aussi dérouler le plasmide et il y aura mise en place d’un complexe réplicatif avec de l’ADN polymérase et un complexe enzymatique : la relaxase. Lorsque l’ADN polymérase va venir répliquer le plasmide ouvert, la relaxase va permettre de transférer le monobrin ouvert du plasmide vers l’autre cellule pendant que le plasmide se réplique pour se retrouver sous sa structure double brin.

Au final, on a un brin parental du plasmide de la cellule fertile qui est transféré dans la cellule F- pendant que le plasmide se réplique de façon à rester sous sa structure double brin.

3) Evidemment, un monobrin transféré dans la cellule F- implique la mise en place d’un mécanisme dans cette cellule pour fabriquer le brin complémentaire, réaliser la ligation pour que le plasmide se retrouve sous sa forme double brin, circulaire dans ce plasmide F-.La cellule F- devient à son tour F+. On se retrouve avec une copie identique du plasmide F+ dans la bactérie F-. L’échange de matériel génétique entre les bactéries dans la nature est un phénomène peu fréquent car ça se produit quand les bactéries sont dans des conditions assez défavorables.

Questions Ronéo de 2013-2014 :

Question : Au final, les deux plasmides auront la même information génétique alors ?Réponse : Oui ! Sauf que ces bactéries F- ont acquis un nouveau phénotype. Toute l’information

génétique présente sur le plasmide F+ (caractéristique que n’avait pas cette bactérie F-), la bactérie F- va l’acquérir. Le plasmide reçut par F- est identique à celui donné par F+. D’autant que ces deux bactéries F+ et F- peuvent être de famille ou de genre totalement différent (on peut avoir un transfert d’E.Coli et du streptococcus pneumoniae). Il y a bien transfert d’un nouveau caractère puisque toute l’information génétique apportée par le plasmide est acquise par un nouveau type bactérien.

Question : C’est que les bactéries qui ont des plasmides qui peuvent avoir des pili ?Réponse : Alors seules les bactéries qui possèdent un plasmide dit fertile (plasmide F+) ont la capacité

d’établir un pont (un pili sexuel) avec une autre bactérie.

Question : Donc, le pili appartient à la bactérie ?Réponse : Ca appartient oui, puisque c’est la bactérie fertile qui le développe. La bactérie devenue F+

peut alors faire un pili sexuel (chose qu’elle ne pouvait pas faire avant). Donc c’est une information incluse dans le plasmide et qui ne vient pas du génome de la bactérie elle-même.

Question : Le rôle du complexe relaxasome ?Réponse : Une fois que le pili sexuel est établi, le relaxasome qui se met en place ici va d’une part

permettre de répliquer le plasmide F+ puisqu’il y a été clivé au niveau de son origine de transfert. Donc l’un des brins est transféré donc l’autre brin a besoin d’être répliqué. En plus, il y a un complexe (que l’on voit ici) qui est en contact entre les deux bactéries (le système de relaxase) qui va assurer le transfert du monobrin qui a été clivé dans l’autre bactérie et assurer ce transfert.

Le premier type de conjugaison, c’est donc entre bactéries qui possèdent un plasmide fertile qui va permettre de transférer justement ce plasmide dans sa totalité vers une bactérie qui elle est non fertile. Particularité de ce transfert : que le plasmide est transféré ! Le matériel génétique de la cellule (de la bactérie) n’est absolument pas affecté. Si on veut avoir un brassage des allèles de la bactérie, ça serait quand même préférable que les bactéries puissent échanger leur propre matériel chromosomique. Cela est possible par un mécanisme qui fait toujours appel à ces plasmides fertiles et qui passe par un autre type de souches bactériennes : les souches Hfr (souches à Haute fréquence de recombinaison).

Ces souches sont appelées souches à haute fréquence de recombinaison, car malgré le fait qu’elles ne transfèrent pas la totalité du facteur de fertilité, elles n’empêchent pas les bactéries d’acquérir de nouvelles caractéristiques.

Pour que du matériel chromosomique (génétique) d’une bactérie puisse être transféré vers une autre bactérie, cela passe par la nécessité d’une recombinaison simple du chromosome bactérien avec un plasmide F fertile qui s’est intégré en totalité dans le génome de la bactérie. Donc si on a eu ce mécanisme de recombinaison simple, on obtient une bactérie à haute fréquence de recombinaison qui possède tout l’arsenal nécessaire pour faire le pili sexuel et mettre en place le relaxosome et donc toute la machinerie de transfert et une partie du génome bactérien. L’ensemble du chromosome bactérien recombinant se comporte alors comme un plasmide au cours de la conjugaison.

Par la suite, la règle reste toujours la même : le transfert ne pourra se faire qu’entre une souche HFR et une bactérie non fertile (F-). La coupure va venir se faire toujours au niveau de l’origine de transfert par un relaxase et un monobrin va être transféré entraînant avec lui un monobrin provenant du génome de la bactérie. Cette fois-ci, une partie du plasmide est transférée à partir de son origine de transfert, l’autre partie du plasmide est à l’autre bout donc emmène avec elle un monobrin correspondant au matériel chromosomique de la bactérie.

Une fois que ce monobrin a été transféré, (un peu comme dans le cas du plasmide F qui a été transféré), le brin complémentaire va être synthétisé. On va se retrouver avec des brins d’homologies et l’on va pouvoir avoir des mécanismes de recombinaison entre l’exogénote double brins et le chromosome circulaire de la bactérie F-. On aura remplacement d’une partie du génome par celui de l’exogénote.

Particularité de ce mécanisme : généralement, le temps de contact entre les bactéries est trop court pour que la totalité du génome bactérien soit transférée. À un moment donné, seule une partie du génome est transférée, l’autre partie, ne l’est pas.

Il y aura alors deux conséquences :

- d’une part, le matériel génétique (génome de la cellule donneuse) d’une bactérie n’est jamais transféré en totalité dans une deuxième bactérie, car le pili sexuel ne peut-être maintenu indéfiniment, chez E.coli, le contact ne dure qu’une dizaine de minutes alors qu’il faut quasiment 100 min pour qu’il y ait le transfert.

- le restant du plasmide F n’est pas transféré Après intégration, la nouvelle souche bactérienne recombinante n’est pas fertile, elle

ne devient jamais F+, elle reste toujours F- et ne peut donc pas créer de pili sexuel avec d'autres cellules. Les cellules qui résultent donc de la recombinaison ne deviennent jamais fertiles sauf si elle rencontre un plasmide fertile F+!

Toujours est-il que nous avons quand même eu un brassage des allèles et donc une nouvelle souche bactérienne recombinante qui n’existait pas avant, totalement nouvelle qui apparaît. Les caractéristiques vont être fixées et cette bactérie n’est pas fertile.

Question : Quand ça se casse c’est au niveau de l’origine de transfert et pas de F- ?Réponse : Alors où est-ce que ça va se casser ? Quelle portion du génome de la cellule F+ va être

transféré ? Tout dépend du temps de contact entre les deux bactéries. Et c’est l’objet de la figure juste après.

Ce temps de contact est plus ou moins variable de quelques minutes. On estime que pour que le transfert puisse commencer, il faut minimum 3 à 10 minutes. Ce temps dépasse rarement les 40 minutes. En 40 minutes, on a très peu de chances de tout transférer.

Les gènes se trouvant à proximité de l’origine de transfert ont plus de chances d’être transférés. Donc ici, l’origine de transfert (en rouge), tous les gènes qui se trouvent directement à sa suite vont être transférés. On a sur ce schéma un code des couleurs : trait rouge « azir » = zone de résistance pour l’azide qui était transféré au bout de 10 min ; ensuite donc différents gènes de résistance.

Et lorsque l’on regarde sur le schéma de droite, la fréquence de transformation des bactéries receveuses est plus importante : plus les gènes sont près de la zone de transfert, plus ils vont avoir la chance de faire de la recombinaison. Alors que les gènes qui sont très éloignés (plus loin de l’extrémité de transfert) ont très peu de chances d’être transférés et d’entraîner des recombinaisons.

La transformation que va subir la bactérie receveuse va dépendre :

• de la distribution des gènes qu’elle a à proximité de l’origine de transfert

• du temps qu’elle aura eu pour permettre ce transfert (le temps que le pili est resté)

Question/Réponse (arrangée par la ronéïste car les phrases du prof allaient dans tous les sens, mais il me semble que ce qu’il voulait dire c’est) : La bactérie receveuse ne devient pas fertile dans ce cas, pourquoi ? Rappelons que le transfert se fait à partir de l’origine de transfert qui coupe le plasmide en deux parties et que ce plasmide est intégré au chromosome de la bactérie fertile. À la fin du transfert, il reste un bout de chromosome + plasmide dans la bactérie fertile puisque les deux bactéries ne restent pas proches assez longtemps pour terminer le transfert de tout le chromosome + plasmide. Le plasmide entier donne la fertilité à la bactérie. N’ayant pas sa deuxième partie de plasmide, la deuxième bactérie ne peut donc pas être fertile.

Question : Quelle différence avec le schéma précédent (cf schéma entre bactéries F+ et F-)?Réponse : Dans le schéma précédent, on ne transfère que le plasmide alors qu’ici on transfère du

matériel génétique chromosomique de la bactérie et les séquences correspondantes au plasmide de transfert sont perdues. Donc ça permet de brasser les allèles provenant de chromosomes bactériens et ça n’est pas un transfert de plasmide au final.

Donc en fonction des bactéries et des gènes qui se trouvent à la suite de l’origine de transfert, on aura des séquences de transformation qui seront plus ou moins importantes.

En conclusion, pour revenir à ces deux modes de conjugaison :

Transfert horizontal de gènes par conjugaison (TGH par conjugaison) : • Nécessite un contact dans tous les cas• Passage du facteur F vers une cellule receveuse qui est F- (Interrompue par agitation)• Orientée (F+ -> F-) : le transfert se fait toujours dans ce sens• Phénotype de la cellule receveuse devient F+

Mécanisme à haute fréquence de recombinaison (pour la recombinaison): • Requiert intégration du facteur F dans le chromosome du donneur (F+ -> Hfr)

donc nécessite que la bactérie ait intégré le plasmide fertile dans son génome (cette souche ne s’appelle plus F+ mais Hfr (à haute fréquence de recombinaison)

• Hfr transfère ses gènes séquentiellement à partir de oriT (origine de transfert) vers la bactérie F-

• Orientée (Hfr -> F-)• Phénotype de la cellule receveuse reste F- et la bactérie receveuse reste F-

Son phénotype va être cependant modifié.

Pourquoi on appelle ces techniques « à Haute fréquence de recombinaison » ?

Car cette bactérie Hfr va pouvoir établir des contacts avec d’autres bactéries et comme ces temps de contact sont différents, les souches bactériennes receveuses ne vont pas toutes être identiques. En fonction des temps de contact et des gènes qui vont être transférés, on aura tout un ensemble de recombinants qui seront différents les uns des autres. Malgré le fait que ces souches Hfr ne transfèrent pas la totalité du facteur de fertilité, elles n’empêchent pas les bactéries d’acquérir de nouvelles caractéristiques.

C’est pour ça qu’on les appelle des souches à haute fréquence de recombinaison.

3. Transduction

C’est le dernier mécanisme permettant l’apport de diversification génétique : le mécanisme de transduction.

Lederberg en 1951 a donné son nom à ce mécanisme qui fait appel à un autre type d’agent infectieux, notamment les virus. Ils vont transférer du matériel génétique d’une bactérie à une autre. Ce type de virus est particulier : les bactériophages (ou de manière classique les phages) qui peuvent infecter les bactéries.

Les bactériophages sont constitués d’une capside dans laquelle on va retrouver du matériel génétique qui peut aussi bien être de l’ARN de L’ADN. Le reste du corps du bactériophage est constitué d’une queue (fibre caudale qui lui permet de s'accrocher) qui va permettre d’injecter du matériel génétique à la bactérie. En temps normal, le bactériophage veut injecter son propre matériel génétique pour se répliquer. Mais, dans cette capside, lors de l’empaquetage des bactériophages, il peut y avoir de l’ADN bactérien qui pourra s’intégrer à la place de l’ADN du bactériophage. La capside servira alors de véhicule pour le transport de matériel génétique d’une bactérie à une autre.

Mécanismes infectieux associés aux bactériophages :

Il existe 2 modes d’infection des bactériophages :

• Quand le bactériophage infecte une cellule, elle peut se mettre directement à répliquer son génome et à produire de nouveaux virus : on parle de phages virulents, c.-à-d. que lorsque suffisamment de nouveaux virus ont été produits par la cellule, elle va éclater, mourir et libérer les nouveaux virions.

• L’autre mode d’infection se fait par des phages tempérés. C.-à-d. que suite à l’infection, le virus ne va pas se répliquer directement, mais s’intégrer au génome chromosomique de la cellule hôte. On parle à ce moment de prophage, on aura un génome dormant. A chaque fois que la cellule va se répliquer elle va répliquer le matériel du phage mais le phage reste dormant, c'est la phase lysogénique.Dans des conditions de stress ou autre, le matériel génétique viral va s’activer. Le matériel génétique prophagique est alors excisé du génome et rentre dans une phase lytique, avec production de protéines virales et de réplication du génome (puis formation de nouveaux virions et retour à la phase lytique). Dans les phages tempérés, il y a donc succession de phase lysogénique et de phase lytique.

Ces deux modes peuvent être utilisés pour transférer du matériel génétique (transfert horizontal de gènes) d’une bactérie à une autre. Le premier mécanisme, qu’on appelle la transduction généralisée peut faire intervenir aussi bien des phases lytiques (virulents) que des phages tempérées.

A. Transduction généralisée (phage virulent et quelques phages tempérés)

Cette transduction fait généralement appel à des phages virulents mais on peut aussi utiliser des phages tempérés (extrêmement rare). Cette expérience a été réalisée par Lederberg en 1951, où il a reproduit ce mécanisme avec des tubes en U avec ce filtre ne permettant pas aux bactéries de passer, et en utilisant 2 souches bactériennes poly, auto et auxotrophes, pour des AA différents. Ici, il a fait un système d’agitation qui empêchait tout contact entre bactéries, et donc toute vie sexuelle. A une fréquence très faible de 10-6 on obtenait des colonies transformantes.

En analysant le milieu, il a alors identifié dans le milieu des phages particuliers, les phages P22, qui sont des phages à cycle lytique qui peuvent englober environ 1% du génome bactérien dans leur capside (on ne peut donc pas intégrer tout un génome). Ces petits fragments du génome bactérien ont alors pu être transférés aux souches auxotrophes pour la thréonine ou la leucine, et les a rendues prototrophes (ils ont levé la multi-auxotrophie). Il existe plusieurs types de phage avec des capacités variables.

Ce système passe par le fait que lorsque les phages p22 infectaient ces bactéries, au moment de l’empaquetage du génome, c’est de l’ADN bactérien qui était empaqueté à la place du génome p22. Il a pu être transféré à travers le filtre de l’autre côté, à des bactéries et apporter de nouveaux caractères. Ce mécanisme de transduction généralisée est très peu fréquent même si on peut l’observer. En effet même s'il permet à des virus de transférer du matériel génétique, on se rend compte que 70 à 90% du génome n'est pas intégré. Cependant même s'il n’est pas intégré il peut s'exprimer temporairement et on obtient alors des bactéries diploïdes partiels avec des transduits dit abortif (le phénotype va apparaître puis disparaître).

Le phage P1 de E.Coli peut intégrer 2 – 2,5 % de la taille du génome bactérien de E.Coli.

B. Transduction spécialisée (phage tempéré)

Un autre mécanisme, plus fréquent, est le mécanisme de transduction spécialisée, réalisée par les phages tempérés. Ils possèdent dans leur génome des sites particuliers d’intégration, qui sont des sites d’attachement dits Att (viral ou bactérien), ou sites donneurs, qui sont capables de s’associer à des sites receveurs particuliers au niveau du génome des bactéries.

Lorsque le virus quitte sa phase lysogénique et rentre dans la phase lytique, ces sites d'attachements se rompent et on se retrouve avec des sites d'attachements viraux ou comme ici barté Dans le fonctionnement normal des prophages, lors d’un stress, ce génome est sensé repartir dans sa version d’origine et donc reformer les sites Att donneurs, et le génome de la bactérie se reconstitue au niveau de ces sites d’intégration receveur. Il peut arriver que le prophage reparte avec un bout d’ADN bactérien.

On se retrouve avec une structure qui va intégrer la capside virale mais qui ne comporte pas la totalité du génome du prophage, mais qui a un bout d’ADN bactérien. Ce qui est intéressant est de connaître le bout d’ADN (l’information génétique) qui a été pris à la bactérie. Parfois la moitié d'un site d'attachement bactérien reste collée à un site d'attachement viral, on obtient alors un site d'intégration hybride, cependant une fois injecté dans la cellule, le site est non fonctionnel car il faut que le site soit compatible avec le site de la cellule hôte.Si la cellule a déjà été infectée par un autre phage dit auxiliaire, il va donner indirectement les sites d'attachements qui vont le rendre compatible.

Chez E.Coli, au niveau du site d’attachement receveur, on retrouve les gènes Gal+ et Bio +. Très souvent, c’est le gène Gal+ qui est emporté et va permettre d’apporter un nouveau caractère à la cellule receveuse.

Le mécanisme n’est pas simple : pour qu’il y ait une bonne intégration du matériel phagique au sein du génome d’une bactérie, il faut un site d’intégration Att qui soit purement phagique. Lorsque l’on a une erreur d’excision du matériel phagique, on a un système d’insertion à moitié phagique et à moitié bactérien. Mais ce mécanisme ne permet pas à lui seul aux virus recombinants de s’intégrer dans d’autres bactéries.

Cela impose un mécanisme plus complexe : il faut que la bactérie à infecter ait déjà été modifiée par un bactériophage helper (‘bactériophage hunter’ dans le ronéo de l’année dernière) qui permettra d’apporter une compatibilité entre les sites Att moitié phagique et bactérien, et la bactérie receveuse. Ce mécanisme complexe n’est pas si rare que cela. Enormément de génomes bactériens sont déjà infectés par les bactériophages helpers et possèdent déjà un site compatibilité pour l’intégration du bactériophage modifié. Ainsi, on peut intégrer un matériel génétique provenant d’une autre bactérie via un virus.

Dans la figure C, la totalité du génome du prophage est intégrée. Il y aussi la possibilité où tout n’est pas intégré, on a alors une recombinaison simple. Mais on peut avoir uniquement une recombinaison double : seule portion de gène apportée d’origine bactérien (gène Gal) peut être intégrée par recombinaison homologue/double : le reste du matériel génétique provenant du phage est lui, perdu.

Voilà comment des phages tempérés peuvent acquérir des propriétés liées à des erreurs lors de l’initiation de la phase lytique. Particularité de ces phages tempérés : ils permettent d’augmenter la fréquence de transformation (de l’ordre de 0,1 - 0,5) des cellules bactériennes et on obtiendra des souches dites à haute fréquence de transduction : souche Hft.

Voilà les trois mécanismes principaux dont disposent les bactéries pour pouvoir évoluer vers une diversification génétique et phénotypique : transformation bactérienne, conjugaison bactérienne et transduction :

Naturellement, les mécanismes qui semblent agir le plus sont la transformation et la conjugaison. Lesmécanismes de transduction sont considérés comme des épiphénomènes dans les études et comme étant plus rares.

IV. Essor de la génomique

Quelle utilité pour tout ça ?

L’utilité de ces mécanismes de brassage génétique : ils ont été très utilisés jusqu’à y à 20-30 ans, lorsque l’étude de ces mécanismes de recombinaison et notamment les mécanismes de brassage via les mécanismes à haute fréquence de recombinaison, ont permis d’établir les premières cartes des génomes plasmidiques. En effet, lorsque le transfert entre bactérie se faisait à partir d’une origine de transfert, il suffisait tout simplement d’étudier en fonction du temps (avec différents temps d’incubation entre les bactéries Hfr et les bactéries non fertiles), on regardait quel caractère était transmis, ce qui permettait de déterminer la succession des gènes qui suivaient l’origine de transfert. Les premières cartes étaient ainsi graduées en minutes en fonction du temps de transfert nécessaire pour connaître à quelle distance en minute se situait un gène d’un autre. On a ainsi localisé de façon relative des gènes (grâce aux souches Hfr), notamment les sites Att intégrés au génome bactérien. On a aussi pu établir les lésions génétiques, quels gènes étaient prêts d’autres gènes.

Aujourd’hui, heureusement, il existe un moyen beaucoup plus simple qui va beaucoup plus vite : le séquençage. Des années 40 à la fin des années 90, on a utilisé ces nombreux mécanismes pour pouvoir déterminer les gènes et leur distribution sur les différents plasmides, les génomes des différentes bactéries.

Maintenant, puisqu’on sait faire du séquençage, un grand nombre de génomes complets de bactéries sont disponibles sur des banques de données (aujourd’hui plus de 10 000). Cela permet de connaître la succession des bases mais aussi d’identifier les fonctions associées aux différents gènes chez les bactéries, notamment ceux impliqués dans la pathogénicité et de rechercher des mutations ponctuelles.

Ça permet d'abord de savoir quels sont les gènes qui sont présents dans une séquence de génome bactériens mais surtout de déterminer la position, d’étudier l'expression des gènes, de connaître les mécanismes de régulation de l'expression génétique de ces gènes.

La grosse difficulté aujourd’hui, ce n’est plus de séquencer les génomes, c’est plutôt de les analyser.Cela nécessite aujourd’hui d’avoir des outils d’analyse qui sont extrêmement importants (la bioinformatique).

Question\réponse :La recombinaison localisée c'est toujours à partir d'un ADN circulaire alors que la non localisée c'est à partir d'un simple brin linéaire, mais le mécanisme est le même.

V. Conclusion La génétique bactérienne a permis de mettre en évidence les transferts horizontaux de gènes Voilà ce qu’a permis et permet encore de faire aujourd’hui la génétique bactérienne.

Ces transferts horizontaux sont considérés comme fondamentaux en Biologie de l’Evolution (arbres en réseaux)

Voilà ce qu’est la sexualité bactérienne : 3 mécanismes qui permettent de faire des transferts horizontaux entre bactéries, qui ne font pas de méiose à proprement dit (ne sont pas bisexuées).

La transformation artificielle chez E.Coli est un outil de génie génétique utilisé par tous les biologistes moléculaires (eucaryotes ou procaryotes)

Ces mécanismes sont largement utilisés aujourd’hui de façon artificielle pour transformer des bactéries (ex : synthèse d’antibiotiques qui passe énormément par la biologie moléculaire). Ce genre de transformation (transfert et modification) est aujourd’hui également possible chez les eucaryotes, grâce aux expériences chez procaryotes.

Des recombinants peuvent être obtenus : - par recombinaison double (remplacement) - par recombinaison simple (méro diploïde)

Aujourd’hui, on est capable de faire différents types de recombinaison, et notamment de pouvoir intégrer directement des fragments d’ADN au sein de génomes, ce qui est particulièrement important chez les procaryotes pour la transmission de ces caractères.