Tujuan : Membedakan bakteri gram positif dan gram negatif

Dasar Teori

Teknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter berkebangsaan Denmark, 1884). Pengecatan Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah)

Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Alat dan bahan :

- biakan bakteri

- larutan kristal violet

- larutan iodin

- larutan alkohol (etil alkohol 95%)

- kaca objek dan kaca penutup

- mikroskop

- jarum ose

- bunsen (lampu spiritus)

- aquadesh

Langkah Kerja :

1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api bunsen

2. Membuat olesan tipis bakteri dengan mengambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan diberi 1-2 tetes aquadesh. Kering anginkan dan melewatkannya pada nyala api bunsen (lampu sriritus)

3. Olesan tersebut dibubuhi kristal violet (Gram A = cat utama), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering

4. Dibubuhi dengan larutan iodin (Gram B = larutan mordan), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering

5. Melakukan dekolorisasi dengan dibubuhi etil alkohol 95% selama 10-20 detik, segera aliri dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan aktivitas dekolorisasi, dianginkan hingga kering

6. Olesan bakteri ditetesi dengan safranin selama 20-30 detik, dicuci dengan air mengalir selama beberapa detik untuk menghabiskan sisa-sisa cat. Selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan kering anginkan

7. Melakukan pengamatan dengan mikroskop dan sel-sel yang tampak, digambar pada lembar kegiatan

A.3. Pewarnaan Gram

Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.Berikut merupakan tabel prosedur pewarnaan Gram:

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:

· Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

· Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

1.1 Latar BelakangBakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan MasalahRumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan1.3 TujuanTujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut

BAB IITINJAUAN PUSTAKAMetode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.  Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.  Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Gambar Struktur Dasar Bakteri

Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif(Edukasi, 2008).Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni

dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).

BAB IIIMETODE PENELITIAN3.1 Waktu dan TempatPraktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.3.2 Cara Kerja3.2.1 Pewarnaan BakteriGelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1

menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri3.2.2 Pewarnaan EndosporaGelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Analisis ProsedurPewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.4.2 Data Hasil PenelitianNo.Nama dan GambarKarakteristikGram1.

Staphlococcus aereus

2.

Bacillus subtilis

3.

Escherichia coli

4.3 Analisis HasilPewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya berbentuk seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna merah.1.Staphylococcus aureus.

Gambar. Staphylococcus aerreusStaphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar seperti rantai memenjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel mencapai 1 µm, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008).Klasifikasi Staphylococcus aureus.Kingdom : Bakteri

Filum : FirmicutesKelas : CocciFamili : StaphylococcaaceaeGenus : StaphylacoccusSpesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008)2.Bacillus subtilis

Gambar Pengamatan Bacillus subtilis (1000 x)Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez 2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).Klasifikasi Bacillus subtilis.Kingdom : BakteriFilum : FirmicutesKelas : BacilliOrder : BacillalesFamili : BacillaceaeGenus : BacillusSpesies : Bacillus subtilis (itis, 2008)

3.Escherichia coli

Gambar 5. Pengamatan Escherichia coli. (1000 x)Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun seperti rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).Klasifikasi Escherichia coli.

Kingdom : BakteriaFilum : ProteobacteriaKelas : Gamma ProteobacteriaOrder : EnterobacterialesFamili : EnterobacteriaceaeGenus : EscheriachiaSpesies : E. coli (itis, 2008)4.Pewarnaaan endosporaKomponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008).Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki penngertian letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletk di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada endospora Bacillus subtilis berbeda dengan literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan pengidentifikasian.Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) :Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja

BAB VKESIMPULAN DAN SARAN5.1 KesimpulanTeknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan malakit. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah basil (Bacillus subtilis., Escherichia coli., Staphylococcus aereus), dan kokus (tidak ada). Bakteri yang termasuk gram positif adalah Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga memperbesar daya serap atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi. Karena itu organisme gram negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol.

5.2 SaranSebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama pada lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal. Pada saat pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah diangkat sehingga preparat apusan yang dihasilkan baik.

http://viramedika.blogspot.com

Sunday, March 9, 2008

Teknik pewarnaan gram

Pengecatan gram ini berguna untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.1. Sediaan diambil menggunakan objek glass. Misalnya pada pasien tersangka GO, sediaan diambil dengan cara duh tubuh yang keluar di muara urethra ditempelkan pada objek glass.2. Fiksasi. Sediaan apusan pada objek glass difiksasi dengan api bunsen (3-4x), dinginkan.

3. Stain pertama: objek glass posisi horizontal dituangi karbol gentian violet 0,5% atau kristal violet 2%. Biarkan tergenang 0,5 sampai 1 menit. Tuangi garam iodin atau lugol 1% biarkan 0,5 sampai 1 menit. Buang larutan, cuci dengan air mengalir, posisi ditegakkan.4. Decolorisasi. Tuangi alkohol 96% (aseton) sampai air yang mengalir tidak berwarna lagi. Cuci lagi dengan air mengalir.5. Stain counter/kontras. Tuangi air fuchsin lindi 0,35% (larutan netral red), larutan safranine 1%. Biarkan 10 detik sampai 1 menit. Buang dan cuci dengan air mengalir. Keringkan dalam posisi tegak.6. Periksa dengan mikroskop minyak inersi.

Hasilnya:gram positif: warna violet.Staphylococcus: kecil bulat tersusun seperti anggur.Streptococcus: lebih besar dari staphylococcus tersusun seperti rantai.Candida Sp: pseudohifa, sel tunas, sel ragi, klamidospora.

Gram negatif: merahsel leukosit PMN, sel epitel.Neisseria gonorrhoicae: diplococcus, seperti dua ginjal.Haemophylus ducreyi: streptobasil, bentuk khas seperti rel kereta api.