tugas regen - vektor.docx

7/23/2019 tugas regen - vektor.docx

http://slidepdf.com/reader/full/tugas-regen-vektordocx 1/15

PENGERTIAN DAN MACAM-MACAM VEKTOR

Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan

yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan

memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut.

Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot khususnya E. coli, adalah

plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YAs dan Y!ps

dapat digunakan pada khamir. "lasmid #i, ba$ulovirus, SV%&, dan retrovirus

merupakan vektor'vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.

Syarat yang harus dimiliki oleh vektor yaitu(

). *ampu memindah se$ara efisien

+. Dapat diekspresi se$ara stabil

. #idak mengganggu metabolisme dan merusak gen sel target

%. -kuran pemasukan rata'rata kb/(

a. "lasmid0 %.&&&.

b. 1ambda0 +&.&&&.

$. 2osmid0 %&.&&&.

d. Yeast Artifisial chromosome0 %&&.&&&.

A. Plasmid

Se$ara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler

untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. "lasmid

1



tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari

sekitar ) kb hingga lebih dari +3& kb ) kb 0 )&&& pb/. Agar dapat digunakan

sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat'syarat berikut ini(

). *emiliki ukuran relatif ke$il bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang

sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

+. *emiliki sekurang'kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk

tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

. *emiliki tempat pengenalan restriksi sekurang'kurangnya di dalam salah satu

marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

%. *emiliki titik awal replikasi 456/ sehingga dapat melakukan replikasi di dalam

sel inang.

Salah satu $ontoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning

gen adalah p75++. "lasmid ini dikonstruksi oleh 8. 7olivar dan kawan'kawanya

pada tahun )9::. -rutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat

marker maupun pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sayangnya, tempat

pengenalan !$o56, salah satu en;im restriksi yang sangat umum digunakan,

terletak di luar marker . 4leh karena salah satu marker akan menjadi tempat

penyisipan fragmen DNA asing, maka !$o56 tidak dapat digunakan untuk

memotong p75++ di tempat penyisipan tersebut. Namun, saat ini telah

dikonstruksi derivat'derivat p75++ yang memiliki tempat pengenalan !$o56 di

dalam marker , misalnya plasmid p75+% dan p75+3 yang masing'masing

memiliki tempat pengenalan !$o56 di dalam gen struktural kolisin dan di dalam

gen resisten kloramfenikol.

amp5 !$o56 tet5

2



<ambar ). "lasmid p75,++

amp5 0marker resisten ampisilin

tet5 0 marker resisten tetrasiklin.

*isalnya kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten

ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan en;im restriksi tertentu

selain !$o56. "lasmid p75++ yang tersisipi oleh fragmen DNA akan kehilangan

sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih memiliki sifat resistensi

terhadap tetrasiklin. 4leh karena itu, ketika plasmid p75++ rekombinan ini

dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni E. coli, bakteri transforman ini tidak

mampu tumbuh pada medium yang mengandung ampisilin, tetapi tumbuh pada

medium tetrasiklin. Se$ara alami E. coli tidak mampu tumbuh baik pada medium

ampisilin maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat dengan mudah

dibedakan dengan sel nontransforman yang tidak mengandung p75++ sama

sekali. Sementara itu, E. coli transforman yang membawa plasmid p75++ utuh

religasi/ mampu tumbuh pada kedua medium antibiotik tersebut. =adi, untuk

memperoleh sel E. coli transforman yang membawa DNA rekombinan di$ari

koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Se$ara teknis pekerjaan

ini dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating .

3

.)%:

4.363 kb

456



"lasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya p75++

tidak dapat digunakan pada bakteri gram positif. Namun, saat ini telah tersedia

plasmid untuk kloning pada bakteri gram positif, misalnya p#)+: dan p)9%,

yang dikonstruksi oleh S.D. !rli$h pada tahun )9:: dari bakteri Staphylococcus

aureus. Demikian juga, telah ditemukan plasmid untuk kloning pada eukariot,

khususnya pada khamir, misalnya yeast integrating plasmids Y6ps/, yeast

episomal plasmids Y!ps/, yeast replicating plasmids Y5ps/, dan yeast

centromere plasmid Yps/.

B. Baktei!"a#

7akteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur

hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai

vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa ma$am bakteriofag yang

biasa digunakan sebagai vektor kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut

ini.

). 7akteriofag >

7akteriofag > atau fag > merupakan virus kompleks yang menginfeksi

bakteri E. coli. 7erkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat

memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa'masa awal

perkembangan rekayasa genetika. DNA yang diisolasi dari partikel fag ini

memiliki konformasi linier untai ganda dengan panjang %?,3 kb. Namun, masing'

masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang )+ pb yang komplementer

satu sama lain sehingga memungkinkan DNA untuk berubah konformasinya

4



menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai

tunggal sepanjang )+ pb tersebut dinamakan k!s.

Seluruh urutan basa DNA telah diketahui. Se$ara alami terdapat lebih dari

satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap en;im restriksi yang biasa

digunakan. 4leh karena itu, DNA tipe alami tidak $o$ok untuk digunakan sebagai

vektor kloning. Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat'derivat

DNA yang memenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua ma$am vektor

kloning yang berasal dari DNA, yaitu(

a. Vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing.

b. Vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang

sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan

menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

Di antara kedua ma$am vektor tersebut, vektor substitusi lebih banyak

digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga

+ kb. Salah satu $ontohnya adalah vektor @!S, yang memiliki mutasi pada tiga

gen esensial, yaitu gen @, !, dan S. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel

inang yang dapat menekan mutasi tersebut.

ara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan

dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap en;im restriksi. =ika suatu en;im

restrisksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen

DNA di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan

oleh fragmen DNA asing. =ika pembuangan segmen DNA tidak diikuti oleh

substitusi fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA yang

kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi sema$am ini

5



tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu

mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan

vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

a$

b$

<ambar +. DNA bakteriofag

a/ konformasi linier di luar sel inang/

b/ konformasi sirkuler di dalam sel inang/.

7akteriofag memiliki dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.

"ada fase litik, transfeksi sel inang istilah transformasi untuk DNA fag/ dimulai

dengan masuknya DNA. yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan

mengalami replikasi se$ara independen atau tidak bergantung kepada kromosom

sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA. sirkuler,

masing'masing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk

protein kapsid kepala/. Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas pa$kaged/ dalam

6



kapsid sehingga dihasilkan partikel baru yang akan keluar dari sel inang untuk

menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA. akan

terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung

kepada kromosom sel inang. 8ase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel

inang.

Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk

plak plaue/ berupa daerah bening di antara koloni'koloni sel inang yang

tumbuh. 4leh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan

melihat terbentuknya plak tersebut.

+. 7akteriofag *)

Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. 7erbeda

dengan > yang memiliki struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini memiliki

struktur berupa filamen. ontoh yang paling penting adalah *), yang memiliki

genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang B.%&? basa. 6nfeksinya pada

sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma.

2etika berada di dalam sel inang genom *) berubah menjadi untai ganda

sirkuler yang dengan $epat akan bereplikasi menghasilkan sekitar )&& salinan.

Salinan'salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian

bergerak ke permukaan sel inang. Dengan $ara seperti ini DNA *) akan

terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang

infektif tanpa menyebabkan lisis. 4leh karena fag *) terselubungi dengan $ara

pembentukan kun$up pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA

asing yang dapat disisipkan kepadanya. 6nilah salah satu keuntungan penggunaan

7



*) sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan >. 2euntungan

lainnya adalah bahwa *) dapat digunakan untuk sekuensing penentuan urutan

basa/ DNA dan mutagenesis tapak terarah site directed mutagenesis/ karena untai

tunggal DNA *) dapat dijadikan $etakan templat / di dalam kedua proses

tersebut.

*eskipun demikian, *) hanya memiliki sedikit sekali daerah pada

DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan

restriksinya pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat *) telah dikonstruksi

untuk mengatasi masalah tersebut.

C. K!smid

2osmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos

dari DNA > dengan plasmid. 2emampuannya untuk membawa fragmen DNA

sepanjang + hingga %: kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag

> dan plasmid.

D. %asmid

Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan

antara plasmid dan fag >. Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa segmen

DNA > yang berisi tempat att. #empat att digunakan oleh DNA > untuk

berintegrasi dengan kromosom sel inang pada fase lisogenik.

E. Vekt! &ACs

8



Seperti halnya kosmid, YAs yeast artifisial chromosomes atau kromosom

buatan dari khamir/ dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid

dan segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang

digunakan terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.

YAs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari ) *b.

4leh karena itu, YAs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia,

misalnya gen penyandi $ysti$ fibrosis yang panjangnya +3& kb. Dengan

kemampuannya itu YAs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti

yang dilakukan pada "royek <enom *anusia.

%. Vekt! &E's

Vektor'vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada

Sa$$haromy$es $erevisiae diran$ang atas dasar plasmid alami berukuran + Cm,

yang selanjutnya dikenal dengan nama plasmid + mikron. "lasmid ini memiliki

sekuens DNA sepanjang B kb, yang men$akup titik awal replikasi dan dua gen

yang terlibat dalam replikasi.

Vektor'vektor yang diran$ang atas dasar plasmid + mikron disebut Y!ps

yeast episomal plasmids/. Segmen plasmid + mikronnya membawa titik awal

replikasi, sedangkan segmen kromosom khamirnya membawa suatu gen yang

berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen 1!-+ yang terlibat dalam

biosintesis leusin. *eskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada umumnya,

Y!ps dapat terintegrasi ke dalam kromosom khamir inangnya.

G. Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens

9



Sel'sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan

sebagai vektor kloning. Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium

tumefaciens, yang membawa plasmid berukuran +&& kb dan disebut plasmid #i

tumor indu$ing atau penyebab tumor/. 7akteri A. tumefaciens dapat menginfeksi

tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya

padi. 2etika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid #i, yang disebut #'DNA,

akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya

pertumbuhan sel'sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akan terbentuk

tumor atau crown gall .

"lasmid #i rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah

#' DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. <en target

ini selanjutnya akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam

praktiknya, ukuran plasmid #i yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi.

Namun, ternyata apabila bagian #'DNA dipisahkan dari bagian'bagian lain

plasmid #i, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan #'DNA

dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A. tumefa$iens.

Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya

dilakukan pada #'DNA dengan $ara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid

!.$oli. Selanjutnya, plasmid #'DNA rekombinan yang dihasilkan

ditransformasikan ke dalam sel A. tumefaciens yang membawa plasmid #i tanpa

bagian #'DNA. "erbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen'gen

pembentuk tumor yang terdapat pada #'DNA.

(. Ba)*l!+i*s

10



7a$ulovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satu protein

penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan

terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nuklei sel'sel serangga yang

diinfeksi karena gen tersebut memiliki promoter yang sangat aktif. "romoter ini

dapat digunakan untuk mema$u overekspresi gen'gen asing yang diklon ke dalam

genom ba$ilovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak

jumlahnya di dalam kultur sel'sel serangga yang terinfeksi.

I. Vekt! Kl!,i,# 'ada Mamalia

Vektor untuk melakukan kloning pada sel'sel mamalia juga dikonstruksi

atas dasar genom virus. Salah satu di antaranya yang telah $ukup lama dikenal

adalah SV%&, yang menginfeksi berbagai spesies mamalia. <enom SV%&

panjangnya hanya 3,+ kb. <enom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan

pa$kaging/ sehingga pemanfaatan SV%& untuk mentransfer fragmenfragmen

berukuran besar menjadi terbatas.

5etrovirus memiliki genom berupa 5NA untai tunggal yang ditranskripsi

balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi. DNA ini kemudian

terintegrasi dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga retrovirus

telah digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. 5etrovirus memiliki beberapa

promoter yang kuat.

11



TGA TERTRKTR

REKA&AA GENETIKA

/e,is-0e,is da, Cii-)ii Vekt!

12



Ole12

A,##i M Mas*s3i

NIM. A4547486

emeste2

Ga,0il 748

KEMENTERIAN RIET9 TEKNO5OGI DAN PENDIDIKAN TINGGINIVERITA /ENDERA5 OEDIRMAN

%AK5TA PERTANIANPR:OKERTO

748

TGA TERTRKTR

REKA&AA GENETIKA

Tek,ik Is!lasi Ge,

“Penapisan Differensial”

13



Ole12

A,##i M Mas*s3i

NIM. A4547486

emeste2

Ga,0il 748

KEMENTERIAN RIET9 TEKNO5OGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

NIVERITA /ENDERA5 OEDIRMAN


748

TGA TERTRKTR

REKA&AA GENETIKA

Da"ta /*mla1 K!m!s!m Ta,ama,

14



Ole12

A,##i M Mas*s3i

NIM. A4547486

emeste2

Ga,0il 748

KEMENTERIAN RIET9 TEKNO5OGI DAN PENDIDIKAN TINGGINIVERITA /ENDERA5 OEDIRMAN


748

15

tugas regen - vektor.docx

Documents

Transcript of tugas regen - vektor.docx