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Étude de la flore bactérienne et de sa résistance auxantibiotiques des produits de la pêche et de l’aquaculture
Arnaud Briet
To cite this version:Arnaud Briet. Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux antibiotiques des produits de lapêche et de l’aquaculture. Sciences et techniques des pêches. Université du Littoral Côte d’Opale,2018. Français. �NNT : 2018DUNK0494�. �tel-02021052�
Université Littoral Côte d’Opale
Ecole Doctorale des Sciences de la Matière, du rayonnement et de l’Environnement
Thèse de doctorat
Présentée par : Arnaud Briet
Etude de la flore bactérienne et de sa
résistance aux antibiotiques des
produits de la pêche et de l’aquaculture
Sous la direction de : Dr. Graziella MIDELET
Soutenue le : 11/12/2018
Devant le jury composé de :
Pr. PILET Marie-France Professeur, Oniris, Nantes Rapporteur
Pr. LINA Gérard Professeur des universités, Université Lyon 1, Lyon Rapporteur
Dr. MADEC Jean-Yves Directeur de recherche, ANSES, Lyon Examinateur
Pr. HOCQUET Didier Professeur des universités, Université de Franche-Comté, Besançon Examinateur
Dr. GRANIER Sophie Chargée de recherche, ANSES, Maisons-Alfort Co-encadrante
1
Remerciement
Cette thèse a été possible grâce au soutien financier de l’ANSES et de la région Haut-de-France. Je
tiens à remercier Laurent Laloux, directeur du Laboratoire de sécurité des aliments de l’ANSES et
Anne Brisabois, directrice adjointe et responsable du département des produits de la pêche et de
l’aquaculture de m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire.
Je tiens également à remercier le Pr Marie-France Pilet et le Pr Gérard Lina, d’avoir accepté d’être
rapporteur de ces travaux de thèse. Merci également au Dr Jean-Yves Madec et au Pr Didier Hocquet
d’être examinateur de mes travaux de thèse.
La thèse quelle aventure ! Je tiens à remercier chaleureusement Graziella Midelet, qui a dirigé cette
thèse et qui m’a beaucoup apporté, autant scientifiquement que professionnellement et
humainement. Ensuite, merci à Sophie Granier de m’avoir encadré sur la partie antibiorésistance, tes
connaissances et ta pédagogie m’ont beaucoup apporté. Vous m’avez, toutes les deux, par votre
rigueur et votre complémentarité aidé à faire ce que cette thèse a été : beaucoup de travail, mais
toujours dans la bonne humeur.
Je tiens à remercier mes compagnons de thèse, d’abord ceux qui sont passés dans le bureau des
doctorants ( THE bureau), Estelle et notre passion commune des bébés goélands, Julia et nos
conversation « philosophique » du vendredi matin et surtout Ludo, nous nous sommes supportés
pendant ces trois ans, un véritable exploit !
Mes autres compagnons de thèse, Nicolas, Sylvain et Sarah, merci de m’avoir supporté comme
maître de stage, toujours un peu désorganisé et dans l’improvisation. Votre travail et votre bonne
ont également amené cette thèse où elle est.
Aux membre de l’équipe B3PA, Thomas et tes embuscades à l’Alcazar qui remontent le moral ☺,
Mélanie et nos discussions toujours intéressantes (surtout quand tu débarques dans le bureau pour
2
te joindre aux débats des doctorants !), Cindy et nos rendez-vous du lundi matin, Sabine et Guylaine
et votre bonne humeur (sisi je vous ai vu sourire), Stéphanie, Virginie, Odile et nos conversations
autours d’un café ou d’un gâteau je vous remercie tous profondément. Merci également aux
membres de l’équipe qui nous ont quittés, Clémence, Régine et Nina vous avez fait vivre ce
laboratoire.
Karine, Corinne et Sophie (Z et K), merci pour les discussions que nous avons pu avoir, ça fait toujours
du bien de se vider la tête avec vous. Alexandre, une petite kasdédi parce que tu le vaux bien ! Enfin
merci à Sylvie, Guillaume, Charlotte, Marie et Gaëlle pour les discussions que nous avons pu avoir au
détour d’un couloir.
Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont travaillé de près ou de loin sur ces travaux, vos
petites attentions, aides sont toujours agréables.
Mes amis, Mélody, Maleaume, Romain, Anne, Marion, Flavien, Benoit, Alisson, Gaël et Tiphaine vos
passages à Boulogne et nos soirées aux quatre coins de la France ont toujours été un plaisirs et ça fait
toujours du bien de vous voir et vos petites têtes d’EBIste ( et celles des pièces rapportées :p )
Enfin ma petite famille, mes soutiens de toujours, Maman, Papa, Emilie, Coline merci de m’avoir
toujours porté et soutenu, moi le petit dernier de la famille. Merci également à Adrien (mon futur
beauf) et William (mon beauf), vous rendez toujours les réunions familliales plus épicées et
pétillantes ! Enfin mes petites bouilles de Loris et Malia, mon neveu et ma nièce, vous êtes de vrais
rayon de soleil ( et de vrais tempêtes du désert aussi).
3
Sommaire
Liste des abréviations ......................................................................................................................... 7
Liste des tableaux ............................................................................................................................... 9
Liste des figures ................................................................................................................................ 13
Introduction ............................................................................................................................... 17
Étude bibliographique ................................................................................................................ 23
I. Consommation, production et commerce international des produits de la pêche et point
sur la réglementation .................................................................................................. 24
II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la pêche ...................... 27
II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi-infections
alimentaires et résistance aux antibiotiques.......................................................... 27
II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de l’aquaculture .............. 31
II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques ............................ 34
II.4. Techniques d’isolement et d’identification de la flore bactérienne des produits
aquatiques .............................................................................................................. 36
III. La résistance aux antibiotiques : Dissémination et détection .......................................... 39
III.1. Les éléments génétiques mobiles et les intégrons ................................................... 41
III.1.A. Les Plasmides ............................................................................................................. 41
III.1.B. Les ilôts génomiques : integrative and conjugative element (ICE) et integrative and
mobilisable element (IME) .......................................................................................... 42
III.1.C. Transposon ................................................................................................................. 43
III.1.D. Les intégrons .............................................................................................................. 44
III.1.E. Imbrication des éléments génétiques mobiles........................................................... 45
III.2. La transduction et la transformation ........................................................................ 46
III.3. Diffusion des bactéries résistantes aux antibiotiques et sureveillance .................... 47
III.4. Techniques de détection phénotypique et génotypique de la résistance aux
antibiotiques ........................................................................................................... 50
III.4.A. Techniques de détection phénotypique ................................................................... 50
III.4.B. Interprétation des résultats phénotypiques selon les référentiels du CLSI et EUCAST
..................................................................................................................................... 51
III.4.C. Techniques de confirmation et d’identification des mécanismes de résistance et de
leurs supports génétiques ........................................................................................... 55
Chapitre 1 : Isolement et identification de la flore bactérienne mésophile cultivable des produits de
la pêche et de l’aquaculture .............................................................................................. 59
I. Contexte .............................................................................................................................. 60
II. Matériel et méthodes ........................................................................................................ 63
II.1. Préparation des broyats ............................................................................................. 63
II.2. Isolement des bactéries ............................................................................................. 64
II.3. Identification bactérienne par la technique MALDI-TOF et par l’amplification et le
séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB, rpoB et tuf) ........................... 66
4
II.3.A. Technique MALDI-TOF ................................................................................................ 66
II.3.B. Techniques d’amplification et de séquençage de gènes de ménage de l’ADNr 16S,
gyrB, rpoB et tuf .......................................................................................................... 67
III. Comparaison des performances de différentes techniques d’identification bactérienne 70
III.1. Techniques MALDI-TOF vs amplification et séquençage de l’ADNr 16S ................... 70
III.2. Complément d’identification par les autres gènes de ménage gyrB, rpoB et tuf .... 74
III.3. Discussion ................................................................................................................. 74
IV. Identification des souches isolées des produits de la pêche et performance de la
sélectivité des géloses ................................................................................................. 78
IV.1. Identification des isolats ........................................................................................... 78
IV.2. Performance de la sélectivité des géloses ................................................................ 79
IV.3. Discussion ................................................................................................................. 89
V. Diversité de la flore bactérienne des produits de la pêche et de l’aquaculture ............... 91
V.1. Diversité et proportion des bactéries Gram positif isolées des produits de la pêche
et de l’aquaculture ................................................................................................. 91
V.1.A. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Bacilliales .................. 93
V.1.B. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Lactobacilliales .......... 96
V.1.C. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Micrococcales............ 98
V.2. Diversité et proportion des bactéries Gram négatif isolées des produits de la pêche
et de l’aquaculture ................................................................................................. 98
V.2.A. Diversité bactérienne des γ-proteobacteria ............................................................. 100
V.2.B. Diversité bactérienne des souches appartenant aux α-proteobacteria :
Caulobacteriales, Flavobacteriales, Rhizobiales et Sphingobacteriales .................... 104
V.3. Discussion ................................................................................................................ 104
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins ... 113
I. Contexte ............................................................................................................................ 114
II. Antibiorésistance de la flore des produits de la pêche et de l’aquaculture .................... 116
II.1. Matériel et méthodes .............................................................................................. 116
II.1.A. Sélection des souches ............................................................................................... 116
II.1.B. Antibiogramme par diffusion .................................................................................... 117
III. Etude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées dans les produits de la
pêche et de l’aquaculture .......................................................................................... 122
III.1. Contexte .................................................................................................................. 122
III.2. Enterococcus ........................................................................................................... 123
III.2.A. Contexte ................................................................................................................... 123
III.2.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 123
III.2.C. Détermination de la population non-sauvage ......................................................... 123
III.2.D. Multi-résistance ....................................................................................................... 127
III.2.E. Discussion ................................................................................................................. 128
III.3. Staphylococcus ........................................................................................................ 132
III.3.A. Contexte ................................................................................................................... 132
III.3.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 132
5
III.3.C. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase positif
................................................................................................................................... 133
III.3.D. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase négatif
................................................................................................................................... 134
III.3.E. Multi-résistance ........................................................................................................ 136
III.3.F. Discussion ................................................................................................................. 137
III.4. Exiguobacterium ..................................................................................................... 140
III.4.A. Contexte ................................................................................................................... 140
III.4.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 140
III.4.C. Détermination de la population non-sauvage ......................................................... 140
III.4.D. Multi-résistance ....................................................................................................... 142
III.4.E. Discussion ................................................................................................................. 143
III.5. Pseudomonas .......................................................................................................... 145
III.5.A. Contexte ................................................................................................................... 145
III.5.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 145
III.5.C. Détermination de la population non-sauvage ......................................................... 146
III.5.D. Multi-résistance ....................................................................................................... 148
III.5.E. Discussion ................................................................................................................. 149
III.6. Vibrio ....................................................................................................................... 151
III.6.A. Contexte ................................................................................................................... 151
III.6.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 151
III.6.C. Etude de la résistance aux antibiotiques.................................................................. 151
III.6.D. Discussion ................................................................................................................. 153
III.7. Proteus .................................................................................................................... 156
III.7.A. Contexte ................................................................................................................... 156
III.7.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 156
III.7.C. Etude de la résistance aux antibiotiques.................................................................. 156
III.7.D. Discussion ................................................................................................................. 159
IV. Antibiorésistance et produits de la pêche et de l’aquaculture ...................................... 160
IV.1. Contexte ................................................................................................................. 160
IV.2. Résultats ................................................................................................................. 160
IV.3. Discussion ............................................................................................................... 164
V. Bactérie (s) candidate(s) potentielle(s) indicatrice(s) de la résistance aux antibiotiques
dans les produits de la pêche et de l’aquaculture ..................................................... 167
V.1. Contexte .................................................................................................................. 167
V.2. Résultats .................................................................................................................. 170
V.3. Discussion ................................................................................................................ 171
Chapitre 3 : Étude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits
de la pêche et de l’aquaculture......................................................................................... 179
I. Contexte de l’étude ........................................................................................................... 180
II. Définition des seuils épidémiologiques avec la recherche des intégrons/SXT ................ 182
II.1. Contexte ................................................................................................................... 182
II.2. Matériel et méthodes .............................................................................................. 183
6
II.2.A. Sélection des souches ............................................................................................... 183
II.2.B. Antibiogramme par diffusion .................................................................................... 183
II.2.C. Interprétation des résultats ...................................................................................... 184
II.2.D. Recherche des intégrases des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase des ICE
SXT/R391 par PCR...................................................................................................... 184
II.3. Résultats ................................................................................................................... 187
II.3.A. Origine des souches .................................................................................................. 187
II.3.B. Définition des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) ................................ 188
II.3.C. Recherche d’intégrons .............................................................................................. 194
II.4. Discussion ................................................................................................................ 195
III. Caractérisation des résistances de la souche V. parahaemolyticus 16-B3PA-006 ......... 201
III.1. Contexte .................................................................................................................. 201
III.2. Matériel et méthodes ............................................................................................. 202
III.2.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines .............................. 202
III.2.B. Séquençage et analyse du génome total ................................................................. 203
III.2.C. Conjugaison bactérienne .......................................................................................... 203
III.3. Résultats .................................................................................................................. 205
III.3.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines .............................. 205
III.3.B. Séquençage du génome total et analyse bio-informatique ..................................... 206
III.3.C. Conjugaison bactérienne .......................................................................................... 206
III.4. Discussion ............................................................................................................... 208
Conclusion et perspectives ........................................................................................................ 215
Valorisation des travaux de thèse .............................................................................................. 225
Références bibliographiques ...................................................................................................... 227
Annexes .................................................................................................................................... 255
7
Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique
ALOA : Agar Listeria selon Ottaviani et Agosti
ANT : Aminoside nucléotidyltransférase
ARNr : Acide ribonucléique ribosomal
APH : Aminoside O-phosphotransphérase
ATCC: American Type Culture Collection
Bla: β-lactamase
BLSE: β-lactamse à spectre étendu
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
CDC: Centers for Disease Control and prevention
CFC: Cephalosporine Fucidine Cetrimide
CGE: Center for genomic epidmemiology
CIPARS: Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance Surveillance
CLSI : Clinical laboratory Standard Institute
CMI : Concentration minimale inhibitrice
COWT : Seuil épidémiologique expérimental
CXG : Céphalosporine Xème génération
DGAL : Direction générale de l’alimentation
ECOFF: epidemiological cut-off value (seuil épidémiologique)
ECV: epidemiological cut off value (seuil épidémiologique)
EFSA: European food Safety Authority
EMBL: European Molecular Biology Laboratory
EPT : Eau peptonée tamponnée
EPSA : Eau peptonée saline alcaline
EUCAST: European comitte on antimicrobial susceptibility testing
FAO: Food and Agriculture Organisation of the United Nations
GNS: Gélose nutritive salée
GSP: Glutamate Strach Phenol red
8
ICE: Integrative and conjugative element
IME: Integrative and mobilizable element
IMI: Imipenem-hydrolysing β-lactamase
IS: Insertion sequence
Kb: kilobase
Maldi-Tof: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight
MCR: plasmid-mediated colistin resistance
MLS: Macrolide lincosamide streptogramine
NARMS : National Antimicrobial Resistance Monitoring System for Enteric Bacteria
NCBI: National center for biotechnology information
NDM: New Delhi Metallo-β-lactamase
NPP : Nombre le plus probable
OIE : Organisation mondiale de la santé animale
OMS : Organisation mondiale de la santé
PEMBA: Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymol blue Agar
PCA: Plate count agar
PCR: Polymerase chain reaction
PLP : Protéine liant la pénicilline
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline
SCC: Staphylococcal Chromosomal Cassette
SGI: Salmonella Genomic Island
ST: Sequence type
TBX : Triptone Bile X-glucuronide
TCBS : Thiosulfate itrate bile saccharose
TIAC : Toxi-infection alimentaire collective
UFC : Unité formant colonie
USD: United States Dollar
VIM: Vérona imipénémase
VCC : Vibrio cholerae carbapenemase
VRBG : Milieu glucosé biliées au cristal violet et au rouge neutre
9
Liste des tableaux Tableau 1: Volume de consommation, de production et d'importation des produits aquatiques les
plus consommés par les français (moyenne 2013-2015) (FranceAgrimer, 2016). ...................... 60
Tableau 2: Conditions d’incubation pour l‘isolement et le repiquage des souches bactériennes. ...... 65
Tableau 3:Abbréviation des noms des géloses sélectives. .................................................................... 66
Tableau 4: Couples d'amorces utilisés pour la PCR et le séquençage. .................................................. 68
Tableau 5: Conditions de PCR utilisées ................................................................................................. 68
Tableau 6: Comparaison des résultats d’identifications des isolats obtenus par la technique MALDI-
TOF et par amplification et séquençage de l'ADNr 16S (n = 501). Gen : identification au genre,
Esp : identification à l’espèce, - : aucune identification. Lorsqu’aucune comparaison des
résultats n’était possible, les cases ont été grisées. .................................................................... 70
Tableau 7: Taux d’identification des genres bactériens principaux (n>10) par la technique MALDI-TOF
et de l’amplification et du séquençage de l’ADNr 16S (n= 373). ................................................. 72
Tableau 8: Nombre d'isolats pour chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés (n =
1882). Les cases grises correspondent à l’absence d’isolats, les cases vertes aux genres
bactériens ciblés par les géloses sélectives, les cases orange aux genres bactériens non ciblés
mais décrits dans les fiches techniques des géloses et les cases blanches aux genres bactériens
non décrits dans les fiches techniques des géloses. .................................................................... 80
Tableau 9: Nombre d'isolats par gélose des espèces bactériennes. Les espèces présentées
appartiennent aux genres bactériens avec plus de 100 isolats et aux genres bactériens dont au
moins une espèce est potentiellement un pathogène alimentaire. Les espèces bactériennes en
rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont
des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ............................................................................... 84
Tableau 10: Proportion des genres bactériens Gram positif dans les produits de la pêche et de
l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules,
Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=978). .... 92
Tableau 11: Bacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=
crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches
représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels
pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène
dans les aliments. ......................................................................................................................... 94
Tableau 12: Lactobacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons
plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases
10
blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes soulignées sont des
marqueurs d’hygiène dans les aliments. ..................................................................................... 97
Tableau 13: Micrococcales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats,
Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches
représentent l’absence d’isolats. ................................................................................................. 98
Tableau 14 : Proportion des genres bactériens Gram négatif dans les produits de la pêche et de
l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules,
Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=640). .... 99
Tableau 15: Enterobacteriales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=
crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches
représentent l’absence de souches. Les espèces bactériennes en rouge sont les potentiels
pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène
dans les aliments. ....................................................................................................................... 101
Tableau 16: Pseudomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=
crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches
représentent l’absence de souches. .......................................................................................... 102
Tableau 17: Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles et Xanthomonadales
isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard,
Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de
souches....................................................................................................................................... 103
Tableau 18: α-proteobacteria, Sphingobacteriia et Flavobacteriia isolées des produits aquatiques. Ca=
cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-
Jacques. Les cases grisées représentent l’absence de souches. ................................................ 104
Tableau 19: Population bactérienne Enterococcus spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les
seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ;
COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait
pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil
S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement
intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de
données. ..................................................................................................................................... 124
Tableau 20 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Enterococcus spp. (n = 38). ............................ 127
Tableau 21 : Population bactérienne Staphylococcus aureus (n=8) ayant acquis des résistances selon
les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ;
COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait
pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil
11
S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement
intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de
données. ..................................................................................................................................... 133
Tableau 22 : Population bactérienne de Staphylococcus spp. coagulase négatif (n=35) ayant acquis
des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique
définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la
distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :
écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des
populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont
pour une absence de données. .................................................................................................. 134
Tableau 23 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Staphylococcus spp. (n = 29). ......................... 136
Tableau 24: Population bactérienne Exiguobacterium spp. (n=40) ayant acquis des résistances selon
les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car
la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :
écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ............ 141
Tableau 25: Cumul de phénotype-non sauvage pour Exiguobacterium spp. (n = 22) ........................ 142
Tableau 26 : Population bactérienne Pseudomonas spp. (n =54) ayant acquis des résistances selon les
seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la
distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :
écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ............ 146
Tableau 27 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Pseudomonas spp. (n = 27). ........................... 148
Tableau 28: Population bactérienne Vibrio spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils
épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé
car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :
écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des
populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont
pour une absence de données. .................................................................................................. 152
Tableau 29: Population bactérienne Proteus spp. (n=32) ayant acquis des résistances selon les seuils
épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé
car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :
écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des
populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont
pour une absence de données. .................................................................................................. 157
12
Tableau 30: Caractéristiques des genres bactériens dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée
selon les critères pour être une bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques. ECOFF=
seuils épidémiologiques définis pas EUCAST. ............................................................................ 170
Tableau 31: Amorces pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et l’intégrase des ICE SXT/R391
et la confirmation de l’espèce V. parahaemolyticus. ................................................................. 185
Tableau 32: Conditions de PCR pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase SXT.
.................................................................................................................................................... 186
Tableau 33: Définition des COwt de V. parahaemolyticus et des populations non-sauvages (n = 384).
ND non déterminé...................................................................................................................... 189
Tableau 34: Phénotypes non-sauvages des souches de V. parahaemolyticus (n = 60). ..................... 191
Tableau 35: Comparaison des COWT et seuils cliniques du CLSI pour V. parahaemolyticus (CLSI 2015).
ND : COWT non déterminé, S : sensible, I : intermédiaire, R : résistant. Les cases bleues
représentent l’absence de seuil. ................................................................................................ 193
Tableau 36: Comparaison des COWT pour Vibrio spp. et pour V. parahaemolyticus. ND : COWT non
déterminé, SP : présence sous-population dans la distribution, EC : écart-type non validé. Les
cases vertes montrent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V.
parahaemolyticus étaient identiques ou avaient une différence inférieure à l’incertitude de
mesure (±2 mm). Les cases roses représentent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio
spp. et V. parahaemolyticus avaient une différence supérieure à l’incertitude de mesure (±2
mm). ........................................................................................................................................... 194
Tableau 37: Concentrations d'antibiotiques utilisées pour la conjugaison bactérienne. ................... 204
13
Liste des figures Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016) .......... 24
Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016)
...................................................................................................................................................... 26
Figure 3: Lieu de vie des produits de la pêche ©IFREMER. .................................................................. 32
Figure 4: Structure mosaïque du plasmide R100. En jaune les gènes de résistance aux tétracyclines,
en jaune-orangé le gène de résistance aux aminosides (aadA1), en orange le gène de résistance
aux désinfectants (qacE), en rose vif le gène de résistance aux sulfamides (sul1) et en rose pâle
le gène de résistance aux phénicolés (cat). En marron rayé verticalement l’opéron de résistance
au mercure (mer). Les différents bleus montrent les différentes structures portant les gènes de
résistance (Gillings et Stokes). ..................................................................................................... 45
Figure 5: Distribution des diamètres d’inhibition de souches d’E. coli pour la ciprofloxacine. Les barres
bleues représentent les souches sensibles cliniquement, en vert les souches intermédiaires et
en rouge les souches résistantes cliniquement (Kronvall et al. 2011). ........................................ 52
Figure 6: Distribution des bactéries de l’espèce E. coli selon les diamètres d’inhibition de la
ciprofloxacine. Le seuil épidémiologique est 25 mm. Les barres noires représentent la
population bactérienne sauvage et les barres blanches la population non sauvage .................. 53
Figure 7:Antibiogramme des bactéries Gram positif. ......................................................................... 119
Figure 8 : Antibiogramme des bactéries Gram négatif. ...................................................................... 120
Figure 9:Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la rifampicine. .................. 126
Figure 10: Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la vancomycine. ............ 126
Figure 11: Antibiogramme d'une souche de S. aureus ATTC 25923 présentant un phénotype sauvage
à gauche et d’une souche de S. haemolyticus AF16-62-CCCH3 à droite présentant un phénotype
MLSB (en rouge). Pénicilline (PEN), céfoxitine (FOX), sulfamides (SSS), triméthoprime (TMP),
linézolide (LZD), vancomycine (VAN), acide fusidique (FUS), tétracycline (TET), kanamycine
(KAN), tobramycine (TOB), gentamicine (GEN), chloramphénicol (CHL), ciprofloxacine (CIP),
érythromycine (ERY), clindamycine (CLI) et rifampicine (RIF). .................................................. 135
Figure 12 : Distribution des diamètres d'inhibition de Staphylococcus spp. pour a) la pénicilline, b) le
triméthoprime. ........................................................................................................................... 136
Figure 13 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour la pénicilline. La ligne
rouge représente le COWT........................................................................................................... 141
Figure 14 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour le triméthoprime. La
ligne rouge représente le COWT. ................................................................................................. 142
Figure 15:Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’ampicilline ..................... 147
14
Figure 16 : Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour la tétracycline ................ 147
Figure 17: Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’acide nalidixique ........... 148
Figure 18: Antibiogrammes des souches de Pseudomonas spp. présentant un phénotype d’induction
de résistance à la ceftazidime. a) Souche AF16-309PEPE3. b) Souche AF16-280PECF1. Les
antibiotiques écrits en rouge sont ceux impliqués dans le phénotype. Ampicilline (AMP),
amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF),
céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine
(GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL),
ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)......................................................................................... 149
Figure 19: Distribution des diamètres d'inhibition de Vibrio spp pour l'ampicilline. .......................... 153
Figure 20 : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio spp. a) amoxicilline/clavulanate, b)
céfalotine. .................................................................................................................................. 153
Figure 21 : Distribution des diamètres d’inhibition de Proteus spp. pour l’ampicilline. ..................... 158
Figure 22 : Distribution des diamètres d'inhibition du chloramphénicol pour Proteus spp ............... 158
Figure 23: Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés en
fonction du mode de production des matrices d’isolement. Les produits issus de la pêche sont
les cabillauds, poissons plats, noix de Saint-Jacques et homards. Les produits issus
d’aquaculture sont les crevettes, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus,
Ex=Exiguobacterium, Pr=Proteus, Ps=Pseudomonas, Vr=Vibrio. ............................................... 161
Figure 24 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés selon le
lieu de production. Les produits importés sont les crevettes, Saint-Jacques et homards. La
production Européenne comprend les cabillauds, poissons plats, moules et huîtres.
St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus,
Vr=Vibrio. ................................................................................................................................... 162
Figure 25 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par matrice alimentaire et par genres
bactériens étudiés. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium,
Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio. .................................................................................. 163
Figure 26: Matrices d'origine des souches des souches de V. parahaemolyticus............................... 187
Figure 27: Origines géographiques des matrices dans lesquelles les souches de V. parahaemolyticus
ont été isolées. ........................................................................................................................... 188
Figure 28: Distribution des diamètres d'inhibition de V. parahaemolyticus par antibiotiques a)
ampicilline ; b) gentamicine ; c) tétracycline ; d) chloramphénicol. Les histogrammes
représentent la population sauvage et les histogrammes représentent la population non-
sauvage. Le trait rouge représente le COwt. ............................................................................... 190
15
Figure 29: Antibiogramme de la souche de V. parahaemolyticus 15-B3PA-0752 présentant un
phénotype sauvage à gauche et de la souche 16-B3PA-006 à droite présentant un phénotype
non-sauvage pour 9 molécules testées (en rouge). Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate
(AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline
(TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT),
tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine
(CST). .......................................................................................................................................... 192
Figure 30: Exemple de PCR de détection de l'intégrase intI1. La souche E. coli pTRC99A était le témoin
positif de la réaction. Les souches E. coli SXT, V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089
étaient les témoins négatifs. Les puits avec le mélange réactionnel étaient des témoins de
contamination de la PCR. MP : marqueur de poids moléculaire en paire de base. .................. 195
Figure 31: Résultats du CIM test. ........................................................................................................ 205
Figure 32: Antibiogrammes de la souche E. coli réceptrice UB 5201 et les deux phénotypes obtenus
après la conjugaison avec V. parahaemolyticus 16-B3PA-006. Ampicilline (AMP),
amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF),
céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine
(GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL),
ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)......................................................................................... 207
17
Introduction
18
La résistance aux antibiotiques est un des enjeux majeur de santé publique mondial, pouvant
augmenter la létalité de bactéries pathogènes et entrainer des pertes économiques. En 2007, en
Europe, il était estimé que les bactéries résistantes aux antibiotiques étaient responsables de 25 000
morts par an (Norrby et al. 2009). Sur la même année, le coût des infections avec des bactéries
résistantes était estimé à 1,5 milliard d’euros (surcoût pour les des systèmes de santé et perte de
productivité). En France, 158 000 patients contractent, chaque année, une infection par un germe dit
multi-résistant, avec près de 12 500 décès (Santé Publique France 2015). De plus, si rien n’est mis en
place pour lutter contre la résistance aux antibiotiques, il est prévu qu’en 2050 les bactéries
résistantes aux antibiotiques pourraient être responsables de 10 millions de morts par an dans le
monde dont 390 000 en Europe . Les pertes économiques mondiales s’élèveraient à 100 000 milliard
d’euros (O’Neill 2016).
Par conséquent, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) coopère avec l’Organisation
mondiale de la santé animale (OIE) et la Food and Agriculture Organisation (FAO) au sein du concept
« One Health », pour lutter contre la résistance aux antibiotiques et sa dissémination. En effet, les
résistances aux antibiotiques peuvent circuler entre l’Homme, les animaux et l’environnement.
L’Homme peut être exposé à des bactéries résistantes aux antibiotiques via son alimentation.
Il y a deux risques associés à la présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans
l’alimentation. Le premier est lié à la présence de bactéries pathogènes alimentaires résistantes aux
antibiotiques, il y a un risque d’échec thérapeutique si un traitement antibiotique est nécessaire. Le
second risque est le transfert des résistances aux antibiotiques entre la flore bactérienne de l’aliment
et la flore intestinale du consommateur. Il participe alors à la dissémination des résistances aux
antibiotiques.
Face à ce problème sanitaire, une surveillance de la résistance aux antibiotiques de la
« fourche à la fourchette » a été mise en place dans l’Union Européenne. La résistance aux
antibiotiques des bactéries isolées des animaux de rente et des viandes est étudiée. Cela concerne
19
des bactéries zoonotiques alimentaires pour l’Homme (Salmonella spp. et Campylobacter spp.) et les
bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques (Escherichia coli, Enterococcus faecalis et
Enterococcus faecium). Cependant, ces plans de surveillance ne concernent que les animaux et les
viandes des filières bovines, avicoles et porcines mais pas la filière de la pêche et de l’aquaculture. De
plus, les études sur la résistance aux antibiotiques de la flore bactérienne présente dans les produits
aquatiques sont peu nombreuses.
Pourtant, le milieu aquatique est une source alimentaire pour l’Homme, avec une
augmentation mondiale de la production des produits de la pêche et de l’aquaculture depuis les
années 1960. De plus, les effluents agricoles, d’aquacultures, urbaines, hospitalières et industrielles
contaminent le milieu aquatique avec des résidus d’antibiotiques et des bactéries résistantes aux
antibiotiques. Les effets de ces apports anthropiques sur la flore bactérienne du milieu aquatique
sont encore peu connus. Pourtant, le génome des bactéries aquatiques est particulièrement riche en
éléments génétiques mobiles impliqués dans la sélection et la dissémination de gènes de résistance.
Plusieurs publications mettent en évidence que des gènes de résistance à fort impact sur la santé
humaine sont issus du génome des bactéries d’origine aquatique. Pour exemple, qnrA et qnrS, gènes
de résistance plasmidique aux fluoroquinolones, ont été mobilisés à partir des génomes de
Shewanella algae et Vibrio splendidus. La découverte de nouveaux gènes de résistance dans le milieu
aquatique est souvent fortuite mais suggère que ce milieu est très favorable à la sélection de
bactéries résistantes. L’expérience acquise dans la surveillance des bactéries des filières terrestres,
montre que la circulation de la résistance au sein des agents zoonotiques ne peut être appréhendée
sans tenir compte de la circulation des éléments génétiques mobiles porteurs de gènes de résistance
au sein de bactéries sentinelles. Ainsi, il a été mis en évidence la circulation d’un unique plasmide
IncI1 porteur de BLSE chez des salmonelles de sérotypes variés isolées chez l’Homme et la volaille et
des E. coli commensaux de poulets (Cloaeckaert, 2010). Pour la filière halieutique et aquacole, si le
choix des bactéries zoonotiques à surveiller peut paraitre simple (Vibrio, Salmonella, Listeria,…), celui
des bactéries sentinelles pertinentes est moins documenté (Aeromonas, Shewanella …). Il y a un
20
risque de sélection de nouveaux gènes de résistance aux antibiotiques depuis des bactéries
aquatiques, comme cela s’est produit pour la β-lactamase blaOXA-48 provenant des bactéries du genre
Shewanella. Il y a également un risque de diffusion des résistances de la flore bactérienne des
effluents à la flore bactérienne aquatique et des animaux y vivant. Aucune étude ne permet de
retracer le devenir des activités anthropiques via les apports fluviaux et de relier l’antibiorésistance
en milieu dulçaquicole avec celle observée en milieu marin.
L’objectif principal de ces travaux de thèse a été de caractériser la résistance aux
antibiotiques des bactéries présentes sur des produits issus de la pêche et de l’aquaculture parmi les
plus consommés en France.
Dans un premier temps, nous avons réalisé une cartographie (isolement, identification) de la
flore bactérienne cultivable mésophile présentes sur 9 produits aquatiques parmi les plus
consommés en France (cabillaud, plie, limande, sole, moules, huîtres, noix de Saint-Jacques, homard,
crevettes).
Dans un second temps, nous avons caractérisé phénotypiquement la résistance aux
antibiotiques des genres bactériens les plus fréquemment isolés de ces produits dans deux objectifs :
- Déterminer les populations sauvages et non-sauvages de ces genres bactériens,
- Définir le(s) genre(s) bactérien(s) pouvant être de(s) potentiel(s) candidat(s) indicateur(s)
de la résistance aux antibiotiques des produits issus du milieu marin.
Dans un troisième temps, nous avons étudié la résistance aux antibiotiques d’une collection
de souches de l’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, espèce pathogène alimentaire indigène
du milieu marin, isolée principalement de crustacés et de coquillages. Nous avons caractérisé les
phénotypes de résistance de la collection et le potentiel de diffusion des souches phénotypiquement
résistante.
23
E tude bibliographique
Étude bibliographique
24
I. Consommation, production et commerce international des produits
de la pêche et point sur la réglementation
Les produits de la pêche et de l’aquaculture sont une part importante des apports en
protéines animales dans l’alimentation humaine. En 2014, ils représentaient 17 % de ces apports
dans le monde (FAO 2016). Ceci est le résultat d’une augmentation de la consommation des produits
aquatiques depuis 50 ans. Elle est passée de 9,9 kg/an/habitant dans les années 1960 à
20 kg/an/habitant en 2014. Cependant, la consommation de ces produits est inégale et dépend des
régions du monde. Les pôles de consommation principaux sont l’Europe du Nord et de l’Ouest, avec
25 kg/an/habitant, l’Amérique du Nord, la façade pacifique de l’Asie et l’Asie du Sud-Est
(Figure 1)(EUMOFA 2016). Au sein de l’union Européenne, il y a également des disparités de
consommation entre les pays. En 2015, les Portugais consommaient 60kg/an/habitant de produits
aquatiques alors qu’en Hongrie, la consommation était de 4,8kg/an/habitant (EUMOFA 2016) (Figure
1).
Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016)
Pour soutenir la consommation croissante des produits aquatiques, la production mondiale
des produits issus de la pêche a quadruplé, elle est passée de 20 millions de tonnes à près de
Étude bibliographique
25
80 millions de tonnes à la fin des années 1980 puis s’est stabilisée (FAO 2016). À partir de cette
stabilisation de la pêche de capture, la production de l’aquaculture a fortement augmenté. Elle a été
multipliée par 7, en passant de 10 millions de tonnes à la fin des années 1980 à 70 millions de tonnes
en 2014 (FAO 2016). Les pays asiatiques produisent près de 74 % des ressources de pêche et
d’aquaculture mondiale. Quatre pays concentrent 78 % de la production aquacole du monde : la
Chine (±45 469 000 t), l’Indonésie (±4 254 000 t), l’Inde (±4 881 000 t) et le Vietnam (±3 397 000 t). La
Chine, à elle seule représente 60 % des ressources aquacoles (FAO 2016).
L’Europe et les États-Unis produisent près de 10 % des ressources mondiales aquatiques
chacun, l’Afrique et l’Océanie sont à 5 et 1 % respectivement (EUMOFA 2016). En 2015, au sein de
l’Union européenne, 4 686 000 t de poissons ont été débarquées. Les principales espèces étaient le
hareng (720 750 t, 15%), le sprat (553 714 t, 12 %) et le maquereau (464 160 t, 10 %). En ce qui
concerne l’aquaculture, 80 % de la production aquacole européenne concernait l’élevage de
mollusques bivalves et salmonidés (saumon et truite)(38 % de moules, 15 % de truite, 11 % de
saumon et 7 % d’huîtres). En 2016, la France était le troisième producteur Européen de produits de la
pêche avec 785 000 tonnes, ce qui correspondait à 11 % de la production Européenne
(FranceAgriMer 2017c). Les principales espèces produites étaient le thon (102 880 t totalement
issues de la pêche), les huîtres (79 010 t entièrement issues de l’aquaculture) et les moules (77 040 t
très majoritairement issues de l’aquaculture).
Les pôles mondiaux de production et de consommation des produits aquatiques sont
différents. En effet, un tiers de la production halieutique mondiale est exportée. Les principales
espèces échangées, en termes de valeur, sont le saumon (16,6 %), les crevettes (15,3 %) et les
thonidés (10,2 %). En termes de volume, ce sont les morues, merlus, églefins (14,4 %) puis les autres
poissons pélagiques (12,7 %) et enfin les thonidés (8,3 %) (FAO 2016). Les flux de marchandises
aquatiques se font principalement des pays en développement vers les pays développés (Figure 2)
(FAO 2016). Les trois principaux pays exportateurs sont la Chine (20 980 millions d’USD), la Norvège
Étude bibliographique
26
(10 803 millions d’USD) et le Viet Nam (8 029 millions d’USD). En parallèle, l’Union Européenne est le
marché d’importation le plus important du monde (54 000 millions d’USD) devant les Etats-Unis
(20 317 millions USD) et le Japon (14 844 millions d’USD).
Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016)
Entrée en vigueur au 1er janvier 2006, la réforme de la réglementation européenne relative à
l’hygiène des aliments a simplifié et harmonisé les textes applicables dans l’Union européenne. Cet
ensemble de textes réglementaires, appelé « Paquet hygiène », concerne l’ensemble de la filière
agroalimentaire depuis la production primaire, animale et végétale jusqu’au consommateur pour
d'harmoniser le niveau de sécurité sanitaire. La consommation des produits aquatiques comporte
des dangers dont font partie les bactéries. En effet certaines peuvent être des pathogènes
alimentaires pour l’homme. En 2006, en Europe, l’Union Européenne a mis ne place un ensemble de
règlements appelé le « paquet hygiène » pour assurer la sécurité sanitaire des aliments, dont les
produits aquatiques. Il s’applique à l’ensemble des acteurs de la filière agro-alimentaire, de la
production à la distribution au consommateur. Ils doivent veiller à ce que les produits alimentaires
qu’ils vendent soit sain et sûr pour les consommateurs, sinon les produits non conformes doivent
être retirés du marché. Parmi l’ensemble des textes, les règlements 2073/2005 et 1441/2007
définissent les critères microbiologiques de sécurité sanitaire des aliments. Les produits aquatiques
concernés dans cette réglementation sont les fruits de mer (mollusques et crustacés) et les produits
Étude bibliographique
27
prêts-à-consommer. Les fruits de mer doivent contenir moins de 130 NPP Escherichia coli et aucune
Salmonella. Pour les produits prêts à consommer, moins de 100 ufc/g de Listeria monocytogenes
doivent être détecté en date limite de consommation (Commission européenne 2005 ).
En France, la direction générale de l’alimentation (DGAL) a défini que les produits aquatiques
importés disponible à la consommation ne doivent pas être porteurs de Vibrio cholerae possédant les
gènes des toxines cholériques, de V. parahaemolyticus porteur des gènes codant pour des
hémolysines ou de Vibrio vulnificus (DGAL 2014).
II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la
pêche
II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi-
infections alimentaires et résistance aux antibiotiques
La présence de bactéries pathogènes pour l’homme dans les aliments peut entraîner une
infection alimentaire. Aux États-Unis, entre 1999 et 2008, la moyenne annuelle d’infections
alimentaires dues à la consommation de produits aquatiques était de 664 021 personnes dont 100
morts et engendrait un coût estimé à 941 millions de dollars (Batz et al. 2012). En 2016, en Europe,
13,4% des TIAC avaient pour origine les produits aquatiques. Les principaux agents bactériens
responsables de ces TIAC étaient Salmonella et Vibrio parahaemolyticus (EFSA et ECDC 2017). Listeria
monocytogenes est également responsable de TIAC liée à la consommation de produits aquatiques
transformés et prêt-à-consommer comme du saumon fumé ou des poissons marinés (EFSA et ECDC
2017).
L’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, indigène du milieu aquatique, est considérée
comme la principale cause d’infection alimentaire bactérienne due aux produits aquatiques (Jaime et
al. 2018). Les infections à V. parahaemolyticus se traduisent par des gastroentérites et la guérison
est généralement spontanée. Pourtant pour les personnes à risque, notamment les personnes
Étude bibliographique
28
immunodéprimées ou souffrant de maladies hépatiques, l’infection peut évoluer en septicémie (Hou
et al. 2011). Une antibiothérapie à base de fluoroquinolones, de C3G ou d’azithromycine peut être
prescrite (Diemert 2006a, Hou et al. 2011, Chiou et al. 2015). Le Center for Disease Control and
prevention (CDC) estime que cette bactérie est responsable de plus de 45 000 cas par an aux Etats-
Unis du à l’alimentation (CDC 2017b). Au Japon, cette bactérie serait responsable de 20 à 30% des
infections alimentaires (Jahangir Alam et al. 2002). En Europe, l’incidence des infections à
V. parahaemolyticus est inconnue, exceptéé en Galice, où depuis les années 1990 des infections,
liées à la consommation de produits aquatiques sont reportées régulièrement (Jaime et al. 2018). En
Espagne, en 2004 et 2012, 80 et 100 personnes ont été contaminées en mangeant des crustacés.
Dans le premier cas, des crabes importés d’Angleterre étaient probablement la cause de la TIAC
(Jaime Martinez-Urtaza et al. 2005). Dans le deuxième cas, il y aurait eu une contamination croisée
entre des coquillages de Galice contaminés et des crevettes congelées via la glace utilisée pour
refroidir les aliments cuits (Martinez-Urtaza et al. 2016). En France, en 1997, une infection notable a
impliqué 44 personnes ayant consommées des crevettes importées d’Asie (Robert-Pillot et al. 2004).
L. monocytogenes n’est pas considérée comme une bactérie native du milieu aquatique. Sa
présence dans ce milieu serait causée par une contamination d’effluents terrestres (plantes en
décomposition, fèces de bétails)(Vázquez-Boland et al. 2001, Lyautey Emilie et al. 2007, Jami et al.
2014). L. monocytogenes contaminerait les produits aquatiques dans l’eau ou les ateliers agro-
alimentaires (Jami et al. 2014). Cette espèce bactérienne a été isolée de 0 à 34 % de saumons et
truites vivantes ou fraîches et de 0 à 79 % de saumons et truites fumées (Gram 2001).Ce pathogène
alimentaire est isolé d’environ 5 % des produits aquatiques transformés dans l’union européenne
(Jami et al. 2014). L’ingestion d’aliments contaminés par des personnes en bonne santé peut
déclencher des gastro-entérites. L’infection dure quelques jours et la guérison est spontanée. En
revanche, chez les personnes fragilisées (comme les nouveau-nés, les personnes âgées, les femmes
enceintes et les personnes immunodéprimées), la bactérie peut passer la barrière intestinale et se
propager dans le corps humain (septicémie, méningite) (Santé Publique France). Le taux de mortalité
Étude bibliographique
29
pour les sujets à risque est de 20% à 30 %(Vázquez-Boland et al. 2001). De plus, chez les femmes
enceintes la bactérie peut envahir le placenta et infecter le fœtus. Il y a alors un risque de fausse
couche ou que le nourrisson soit atteint de listériose. En cas d’infection, un traitement antibiotique à
base d’aminoside et de pénicilline peut être prescrit (Temple et Nahata 2000).
Entre 2008 et 2015, dans l’union Européenne, il y a eu 7 TIAC liées à la consommation de
produits aquatiques (viande de crabe, hareng marinés, saumon gravad et poissons
fumés/fermentés). Il y a eu 40 malades, dont 25 hospitalisations et 4 morts (Ricci et al. 2018).
Récemment, en 2017, la consommation de saumons fumés, produits en Pologne et contaminés par L.
monocytogenes, a causé une TIAC touchant 4 personnes (RASFF 2017, Vidal 2017).
Les bactéries du genre Salmonella sont responsables de près de 15 % et 21 % des TIAC aux
États-Unis et en Europe respectivement (Huang 2016, EFSA et ECDC 2017). Cependant, ces bactéries
ne sont pas natives du milieu aquatique, la contamination des produits issus de ce milieu se fait par
des eaux souillées ou une mauvaise hygiène dans les entreprises (Fernandes et al. 2018). Par
conséquent, en 2016, en Europe, Salmonella était l’agent causatif de 5 % des TIAC associées avec la
consommation des produits de la pêche, contre 40 % des TIAC associées à la consommation de
produits à base de viande (EFSA et ECDC 2017). Les symptômes des infections alimentaires causées
par cette bactérie sont généralement des gastro-entérites et le patient guérit spontanément.
Cependant, pour les individus à risque comme les enfants, les personnes âgées, les femmes
enceintes et les personnes immunodéprimées, les infections alimentaires peuvent entraîner des
complications, comme une septicémie et menacer la vie du patient (Santé Publique France , Chlebicz
et Śliżewska 2018). Un traitement antibiotique à base de fluoroquinolone, de C3G ou d’azithromycine
peut être prescrit (Diemert 2006a, Le Hello et al. 2011).En 2015, aux Etats-Unis, la consommation de
thon congelé, contaminé par Salmonella sérovar paratyphi B et Salmonella sérovar Weltevred, a
causé des infections alimentaires à travers 11 états. Au total, 65 personnes ont été malades avec
11 hospitalisations (Hassan et al. 2018). En 2016, en Arizona, 25 personnes ont été infectées par
Étude bibliographique
30
Salmonella sérovar javina et 17 hospitalisées après avoir mangé des produits aquatiques dans un
restaurant. Du fait du nombre d’aliments différents incriminés (crevettes, huîtres, poissons), une
contamination croisée dans le restaurant a été suspectée (Venkat et al. 2018).
Cependant, si les souches bactériennes responsables d’infections acquièrent des résistances
aux antibiotiques, alors il y a un risque d’ échec thérapeutique, pouvant mener au décès du patient. Il
n’y a pas de cas référencé de toxi-infection alimentaire avec des bactéries résistantes aux
antibiotiques liés à la consommation de produits aquatiques. Pourtant, le risque d’infection
alimentaire par une bactérie résistante aux antibiotiques n’est pas nul. En effet, une étude réalisée
entre 2000 et 2005 aux Etats-Unis, sur la contamination par Salmonella de produits aquatiques
importés d’Asie, a montré que 25 % des souches étaient résistantes à au moins un antibiotique (Khan
et al. 2009). De plus, des infections alimentaires impliquant d’autres aliments avec des bactéries
résistantes aux antibiotiques ont été décrites dans la littérature scientifique. En 2015, aux États-Unis,
192 personnes ont été infectées par Salmonella sérotype I 4,[5],12:i:- et infantis en mangeant de la
viande de porc. Les souches du sérovar I 4,[5],12:i:- étaient multirésistantes, elles avaient acquis des
résistances aux pénicillines (ampicilline), aminosides (streptomycine), tétracyclines (tétracycline),
sulfamides (sulfisoxazole) (CDC 2015). Suite à ces infections 30 personnes ont été hospitalisées et
aucune mort n’a été déclarée. De plus, depuis 2002 des souches de Salmonella sérotype Kentucky
ST198-X1 résistantes aux quinolones, pénicillines, phénicolés, aminosides, sulfamides et cyclines se
sont disséminées en Afrique (Egypte, Maroc, Nigéria), Asie (Inde, Bangladesh), Europe (Pologne,
Allemagne, France) (Le Hello et al. 2011). Entre 2000 et 2008, plus de 500 personnes ont été malades
à cause de la consommation d’aliments contaminés par ce clone en France, en Angleterre, au Pays de
Galle et au Danemark(Le Hello et al. 2011).Ce clone bactérien a été isolé de matrices alimentaires
comme de la viande, des épices ou des produits aquatiques, mais aussi de reptiles et de
prélèvements environnementaux (rivière, compost) (Le Hello et al. 2013).
Étude bibliographique
31
II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de
l’aquaculture
La flore bactérienne non pathogène présente dans les produits aquatiques est peu décrite
dans la littérature scientifique. Les quelques travaux ont montré que l’environnement (température,
salinité, …) impacte la composition de cette flore bactérienne. Il a été établi que les saisons influaient
la composition des flores bactériennes des poissons. En hiver, la flore digestive des saumons est
dominée par les bactéries à Gram positif et, en été, elle est dominée par les Vibrionaceae (Tarnecki
et al. 2017). En effet, les poissons, mollusques et crustacés sont des animaux dont la température
interne est variable et donc la flore bactérienne associée à ces animaux est également dépendante
de la température du milieu (Liston 1957, Georgala 1958, Chen et al. 2016). Il a été également
montré que la salinité de l’eau influence les flores bactériennes isolées des animaux marins. En effet,
les bactéries du genre Vibrio sont isolées des animaux marins (Kueh et Chan 1985, Tarnecki et al.
2017) tandis que celle du genre Aeromonas sont plus spécifiques aux animaux d’eau douce (Tarnecki
et al. 2017). De plus, l’origine géographique influe également la composition des flores bactériennes.
Par exemple, les bactéries du genre Vibrio sont associées aux animaux des eaux chaudes (Al-Harbi et
Uddin 2005, Baker-Austin et al. 2017). Les animaux vivants près des côtes comme les mollusques et
les poissons côtiers sont soumis directement aux pollutions microbiologiques anthropiques comme
bactéries les fécales par rapport aux animaux de pleine mer comme le cabillaud.
Par ailleurs, la position de l’animal dans la colonne d’eau peut également avoir un impact sur
sa flore bactérienne : les espèces benthiques comme les poissons plats et les mollusques bivalves
sont en contact avec la flore bactérienne sédimentaire, alors que les espèces pélagiques comme le
thon ne le sont pas (Figure 3). La composition des flores des animaux aquatiques semble donc être
multifactorielle, ce qui ne permet pas aux chercheurs de différencier une flore allochtone
(transitoire) d’une flore autochtone (résidente) (Cahill 1990, Austin 2006, Lyons et al. 2017, OIE
Étude bibliographique
32
2017a). Cependant certains auteurs émettent l’hypothèse d’une notion d’une flore de base, c’est-à-
dire que la diversité et la prévalence de certains genres bactériens sont spécifiques à des espèces ou
des groupes d’espèces d’animaux aquatiques (Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Larsen et al. 2013,
Tarnecki et al. 2017).
Figure 3: Lieu de vie des produits de la pêche ©IFREMER.
La plupart des études se concentrent sur le tube digestif des poissons d’élevage et de son
rôle en aquaculture sur la croissance des poissons (Leroi 2010). Pourtant, la chair des poissons est
considérée stérile et la contamination bactérienne se fait par contamination croisée avec la peau, les
branchies et/ ou le tube digestif lors de leur manipulation. Quelques études également ont décrit la
flore bactérienne isolée de la peau et des branchies des poissons issus de la pêche. Liston et al.
(1957) ont décrit la flore bactérienne de limandes (Pleuronectes microcephalus) pêchées au large de
l’Ecosse. Il a montré la présence de bactéries du genre Pseudomonas (57 %), Achromobacter (16,7
%), Alcaligenes (9,5 %), Flavobacterium (9,5 %) sur la peau. Ils ont montré que la flore bactérienne
dans les branchies et sur la peau étaient la même, mais pas celle présente dans le tube digestif. En
effet dans le tube digestif, les proportions bactériennes étaient différentes : Pseudomonas (34,6 %),
Étude bibliographique
33
Achromobacter (7,7 %), Alcaligenes (1,9 %), Flavobacterium (9,6 %). De plus ils ont montré la
présence des bactéries du genre Vibrio (34,6 %) et Corynebacterium (5,8 %) (Liston 1957). Georgala
et al. (1958), dans les mêmes conditions expérimentales, ont décrit sur la peau de cabillaud la même
flore bactérienne que sur la peau de limande. Ils ont montré en plus la présence des bactéries des
genres Vibrio (4,7 %), Corynebacterium (5,1 %) et Micrococcus (0,9 %). Le constat était le même pour
des poissons provenant de la Baie de Seattle. Les flores bactériennes de la peau et des branchies
étaient proches et il y avait une différence avec celle du tube digestif. Les genres bactériens décrits
étaient les mêmes que ceux isolés de limande et de cabillaud dans des proportions proches.
Cependant quelques genres supplémentaires ont été décrits comme Bacillus, Aeromonas, Proteus,
Brevibacterium, Arthrobacter, Photobacterium et Enterobacter mais ils étaient minoritaires (Colwell
1962). Des bactéries des genres Pseudomonas, Psychrobacter, Proteus, Vibrio, Pseudoalteromonas,
Shewanella, Vagococcus, Staphylococcus, Oceanisphaera, Synechococcus, Bizoni et Bacillus ont été
isolées de la peau, des branchies et des intestins de maquereaux d’Atlantique Nord sur une gélose
(Svanevik et Lunestad 2011). L’ensemble de ces flores décrites sont dominées par les bactéries à
Gram négatif : Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, et les
genres appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Toutefois dans d’autres travaux des
bactéries à Gram positif appartenant aux genres Micrococcus, Bacillus et Corynebacterium ont été
également isolées (Cahill 1990, Austin 2006, Leroi 2010).
Dans la flore bactérienne des mollusques bivalves, les genres bactériens fréquemment isolés
étaient Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Corynebacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus
(Colwell et Liston 1960, Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al.
2009, Amadi 2015). Cependant, les proportions de ces genres bactériens étaient différentes selon les
études. Par exemple, les bactéries du genre Pseudomonas représentaient 50 % des souches isolées
de moules et d’huîtres de Hong-Kong (Kueh et Chan 1985), 10 % des isolats de coquilles Saint-
Jacques et de moules, 20 % des isolats d’huîtres prélevées en Chine (Cao et al. 2009). La présence
d’Enterobacteriaceae était également fréquente dans la flore bactérienne des mollusques bivalves.
Étude bibliographique
34
Des souches d’E. coli et de Proteus spp. étaient notamment identifiées dans deshuîtres (Amadi 2015).
Cependant, une identification plus précise que la famille Enterobacteriaceae était rarement faite
(Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al. 2009, Amadi 2015). D’autres genres
bactériens, comme Moraxella et Lactobacillus peuvent être isolés de moules, d’huîtres et de Saint-
Jacques, Flavobacterium et Staphylococcus de moules et d’huîtres, Leuconostoc isolés de moules et
de Saint-Jacques (Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Amadi 2015). De plus, dans certaines études,
des souches de Shewanella et Enterococcus ont été isolées dans des huîtres (Colwell et Liston 1960,
Cao et al. 2009).
Les crustacés sont un sous-embranchement des arthropodes. Ils possèdent une carapace de
chitine. Ce polymère facilite l’adhésion de certains genres bactériens comme Vibrio (Carman et
Dobbs 1997). Les études décrivant la flore bactérienne des crustacés sont peu nombreuses et ne
concernent que les crevettes. Cependant, les bactéries des genres Bacillus et Staphylococcus étaient
systématiquement isolées, comme les bactéries appartenant aux bactéries lactiques (Enterococcus,
Lactococcus, Lactobacillus) et aux Enterobactericeae (Proteus, Serratia, Escherichia, Enterobacter)
(Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les genres
Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Flavobacterium,
Exiguobacterium étaient également fréquemment isolés dans les crevettes (Heinsz et al. 1988, Linton
et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les bactéries des genres Aeromonas, Vibrio,
Alcaligenes ont été isolées plus spécifiquement de crevettes pêchées en mer d’Irlande (Linton et al.
2003), Chryseobacterium, Loktanella, Planococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter de crevettes
pêchées en Mer du nord (Broekaert et al. 2013) et Kurthia, Macrococcus, de crevettes d’élevage
Béninois (Dabadé et al. 2016).
II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques
La présence de résistance acquise aux antibiotiques dans la flore bactérienne, qu’elle soit
pathogène ou non pathogène, des produits de la pêche et de l’aquaculture présente un risque de
Étude bibliographique
35
transmission de gènes de résistance des bactéries présentes dans l’aliment à celles du tube digestif
humain. Ce phénomène peut alimenter le réservoir de gènes de résistance que constitue le
microbiote humain à partir du réservoir animal (Broaders et al. 2013). Ces gènes de résistance
peuvent être mobilisés ultérieurement de ce réservoir par une bactérie pathogène. De plus, les
individus porteurs de résistance peuvent la diffuser dans leur environnement.
Quelques travaux scientifiques ont mis en évidence la présence de bactéries porteuses de
résistance aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Une étude canadienne a décrit une
nouvelle carbapénémase, VCC-1, dans des souches de Vibrio cholerae isolées de crevettes
disponibles à la consommation (Mangat et al. 2016). Une autre étude a mis en évidence la présence
d’un gène de carbapénémase blaIMI chez Enterobacter cloacae et Enterobacter aerogenes isolés de
crevettes en provenance d’Asie du Sud-Est (Janecko et al. 2016). De plus, une souche E. coli
productrice de VIM-1 et une souche E. cloacae productrice de NDM-1 ont été isolées de palourdes
importées, d’Italie vers l’Allemagne pour la première, du Vietnam vers le Canada pour la seconde
(Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). Des résistances à d’autres classes d’antibiotiques ont
été retrouvées dans ces souches, notamment aux aminosides, quinolones, phénicolés et sulfamides
(Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). En 2014, une équipe canadienne a mis en évidence une
souche de Pseudomonas spp, isolée d’un calamar, produisant la carbapénémase VIM-2 (Joseph et al.
2014). Une étude japonaise a mis en évidence des souches Aeromonas hydrophila, isolées de
palourdes, de poisson empereur et de dorade japonaise, porteurs la β-lactamase blaPSE-1 et de gènes
de résistance aux aminosides et au triméthoprime (Ahmed et al. 2015). De plus, dans une ferme
aquacole française, au moment de l’abattage de truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), des
souches Aeromonas spp résistantes aux quinolones, sulfamides, aminosides et triméthoprime ont été
isolées (Naviner et al. 2011). De même, une bactérie du genre Citrobacter porteuse de β-lactamase
blaOXA-48 et des bactéries de l’ordre des Enterobacteriales porteuses de gènes de résistance aux
tétracyclines, et aux inhibiteurs de la synthèse des folates ont également été isolées des poissons
d’élevage en Lituanie (Ruzauskas et al. 2018).
Étude bibliographique
36
II.4. Techniques d’isolement et d’identification de la flore bactérienne
des produits aquatiques
Les conditions expérimentales des études sur la flore bactérienne des produits aquatiques
sont très différentes et dépendent des bactéries recherchées. Pour des études portant sur la flore
totale, des géloses non sélectives, comme des géloses trypcase soja (TSA), Plate Count Agar (PCA) ou
de l’eau de mer gélosé (SWA) peuvent être utilisées (Liston 1957, Svanevik et Lunestad 2011,
Broekaert et al. 2013). Pour des études portant sur des flores spécifiques (altération, contamination
fécale, pathogène pour l’animal,…) des géloses sélectives peuvent être utilisées pour les cibler. Par
exemple la gélose Iron Agar Lyngby est utilisée pour sélectionner les bactéries productrices de H2S, la
gélose de Man Rogosa Sharp (MRS) pour sélectionner la flore lactique, le milieu thiosulfate-citrate-
bile-saccharose (TCBS) pour isoler les bactéries du genre Vibrio ou encore la gélose glutamate starch
red phenol (GSP) pour isoler les bactéries du genre Aeromonas (Heinsz et al. 1988 , Linton et al. 2003,
Al-Harbi et Uddin 2005, Svanevik et Lunestad 2011, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016, Baron
et al.).
Les températures d’incubation des géloses ont également un rôle dans la sélection des
bactéries. Elles s’échelonnent de 0 à 37 °C (Georgala 1958, Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003,
Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Une étude montre que la flore cultivable des produits
aquatiques est moins importante à 37°C qu’à des températures inférieures à 20°C (Georgala 1958).
En effet, les animaux aquatiques étant des animaux à « sang-froid », leur température corporelle
dépend de la température de l’eau et la flore bactérienne associée à ces animaux est donc également
dépendante de cette température. C’est pourquoi, la plupart des études sur la flore des produits
aquatiques se font entre 0°C et 25°C(Liston 1957, Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Austin 2006).
En outre, les températures basses, comme par exemple le 8°C, sont utilisées pour étudier la flore
d’altération de ces produits (Leroi et al. 1998). La température de 37°C est utilisée pour sélectionner
les bactéries pouvant se développer chez les animaux à sang-chaud, dont l’Homme. Cette
température est utilisée pour détecter des bactéries pathogènes pour l’homme ou des marqueurs de
Étude bibliographique
37
contamination fécale. De plus, les temps d’incubation sont impactés par la température utilisée. En
général, plus la température est basse, plus le temps d’incubation est long, de 24 h jusqu’à deux
semaines, selon les études (Liston 1957, Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Austin 2006).
Les premiers travaux réalisés sur l’identification de la flore bactérienne ont utilisé des critères
morphologiques et biochimiques qui sont toujours utilisés (Liston 1957, Georgala 1958, Al-Harbi et
Uddin 2005, Hoel et al. 2015). Tout d’abord, la morphologie des colonies sur les géloses, et leur
couleur, permet de discriminer des colonies bactériennes selon des caractères biochimiques. Par
exemple sur la gélose GSP, les bactéries du genre Aeromonas sont jaunes et celles du genre
Pseudomonas sont mauves, ou alors les souches produisant du H2S sont noires sur les géloses TCBS
et Iron lyngy Agar. Ensuite, l’identification des souches est confirmée par des examens en
microscopie (coloration de Gram, mobilité, forme, …) et la réalisation des tests biochimiques
(catalase, oxydase, fermentation, utilisation de sucre,….). Ces tests ont été miniaturisés et
commercialisés, les galeries API® étant les plus anciennes (Smith et al. 1972, Janin 1973). Ces
systèmes nécessitent un temps d’incubation pour que les caractères de la bactérie puissent
s’exprimer (Janin 1973). Les techniques biochimiques sont très utilisées dans les laboratoires en
routine pour identifier les bactéries, mais elles ne sont utilisables que pour les bactéries dont les
caractéristiques biochimiques ont été décrites. Il est donc nécessaire de savoir quelles espèces
bactériennes sont recherchées. Aujourd’hui, il existe des appareils, VITEK® 2 Compact, BD Phoenix™,
permettant l’automatisation de la manipulation et de la lecture (BD , Biomerieux). En parallèle, des
techniques d’identification basées sur l’amplification et le séquençage de gènes de ménage et basées
sur l’analyse de spectres protéiques par spectrométrie ont été développées.
Les méthodes moléculaires s’appuient sur l’amplification et le séquençage de gènes de
ménage et la comparaison des séquences à des bases de données comme celles du National Center
for Biotechnology Information (NCBI) ou European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Les gènes
de ménage sont présents dans le génome bactérien avec des séquences qui peuvent être spécifiques
Étude bibliographique
38
à une espèce bactérienne. C’est le cas par exemple des gènes de l’ARNr16S, gyrA, gyrB, rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD (Mollet et al. 1997, Drancourt et al. 2000, Das et al. 2014). Le gène le plus utilisé pour
identifier les espèces bactériennes est celui de l’ARNr16S (Drancourt et al. 2000). Cependant, ce gène
est présent en plusieurs copies sur le chromosome bactérien avec des séquences hétérogènes et
l’amplification de ces copies va entrainer l’apparition de séquences chimériques. Ces séquences
seront différentes de celles présentes sur les génomes de référence (Wang et Wang 1997). Cela
entraine une perte de précision dans l’identification bactérienne. L’utilisation de ce gène de ménage
pour l’identification d’une souche à l’espèce bactérienne n’est pas « garantie », notamment pour les
souches appartenant à la famille des Enterobacteriaceae ou au genre Bacillus (Fox et al. 1992, Mollet
et al. 1997, Das et al. 2014). Le séquençage des autres gènes de ménage a été principalement utilisé
pour discriminer des espèces proches au sein d’un même genre bactérien, comme le gène gyrB qui a
été utilisé pour identifier les espèces du genre Pseudomonas (Yamamoto et Harayama 1995, Das et
al. 2014). Cependant, il n’existe pas d’amorces universelles permettant d’identifier tous les genres et
espèces bactériennes. Il est nécessaire de cibler les genres bactériens que l’on veut identifier pour
savoir quel(s) gène(s) et quelles amorces utiliser pour l’amplification et le séquençage.
Les techniques de spectroscopie sont des techniques d’identification bactérienne récentes.
La plus utilisée pour l’identification bactérienne est le Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
Time Of Flight ou MALDI-TOF. Cette technique permet d’obtenir un spectre protéique pour une
souche bactérienne. Ce spectre est comparé à des spectres de référence, cela permet l’identification
au genre ou à l’espèce. Cette technique est plus simple à mettre en place que l’amplification et le
séquençage des gènes de ménage. En effet, pour avoir un spectre protéique, il faut cultiver la souche
bactérienne, en extraire les protéines puis déposer les échantillons pour l’analyse dans l’appareil . De
plus, l’interprétation des résultats est automatisée par l’appareil. Cependant, les bases de données
des spectres de référence sont aujourd’hui construites avec des profils de souches cliniques et ceux
des souches environnementales et alimentaires sont peu présents. De plus, les spectres sont
dépendant des protocoles de préparation des échantillons et donc les comparaisons avec les
Étude bibliographique
39
spectres de référence ne peuvent se faire qu’avec un protocole identique (Bohme et al. 2010, Bohme
et al. 2011). D’autres techniques de spectroscopie existent comme la spectroscopie Raman et
infrarouge, mais elles sont peu développées et il n’existe ni de standardisation des protocoles, ni de
bases de données de spectres validées (Quintelas et al. 2018).
III. La résistance aux antibiotiques : Dissémination et détection
Dans ses travaux Sir Alexander Fleming a observé des espèces bactériennes naturellement
insensibles à la pénicilline (Fleming 1929). Ces résistances sont naturelles et sont caractéristiques de
toutes les souches d’une espèce bactérienne. Par exemple, toutes les bactéries à Gram négatif sont
résistantes aux glycopeptides car la membrane externe est imperméable à ces molécules. Toutes les
bactéries à Gram positif sont résistantes aux polymyxines, car la molécule ne pénètre pas à travers
leur peptidoglycane épais. Pour le traitement d’infection avec ces bactéries les antibiotiques
correspondant aux résistances naturelles ne sont pas prescrits et il n’est pas utile de surveiller la
résistance à ces antibiotiques car, si la bactérie est identifiée, ces résistances sont constitutives.
Au contraire, Sir Alexander Fleming et Selman Waksman ont observé, qu’en cultivant des
bactéries avec des concentrations non létales d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine) elles
avaient acquis une résistante à des concentrations thérapeutiques de ces molécules (Fleming 1945,
Waksman 1952). Ces résistances acquises, au contraire des résistances naturelles, sont des
caractères phénotypiques non-constitutifs. De plus, entre 1959 et 1961, des études japonaises
mettent en évidence le transfert de résistance aux antibiotiques par contact entre Shigella spp. et
Escherichia coli (Hawkey 2018). Ce mécanisme sera appelé conjugaison bactérienne, et il montre le
potentiel de diffusion des résistances aux antibiotiques. Les bactéries peuvent cumuler des
résistances à différentes familles d’antibiotiques. Lorsqu’une souche bactérienne acquiert au moins 3
résistances à des familles d’antibiotiques auxquelles elle est naturellement sensible, elle est dite
multi-résistante (Magiorakos et al. 2012). Dans le cadre d’un traitement, une résistance acquise à
l’antibiotique prescrit peut entrainer un échec thérapeutique. Par exemple en 1940, Abraham et al.
Étude bibliographique
40
(1940) ont découvert un mécanisme de résistance à la pénicilline, la production d’une enzyme
inactivant cette molécule, qu’ils appellent pénicillinases. Alors que l’introduction de la pénicilline
dans les années 1940 a permis de diminuer la mortalité des infections dues à Staphylococcus aureus,
la moitié des souches de cette espèce bactérienne étaient résistantes à la pénicilline à la fin de cette
décennie (Long 1952). À la fin des années 1960, 80 % des souches de Staphylocococus aureus étaient
résistantes à la pénicilline et aujourd’hui 90 % des souches de S. aureus sont productrices de
pénicillinase. Cet antibiotique n’est plus recommandé pour traiter les infections à S. aureus (Lowy
2003, Cattoir et Leclercq 2012). En 2015, le gène mcr-1, qui confère une résistance à la colistine a été
décrit dans des souches d’E. coli et de Klebsiella pneumoniae isolées de l’homme et d’animaux
d’élevage (Liu et al. 2016). Ce gène risque de diminuer l’efficacité de la colistine, qui est un
antibiotique de dernier recours dans le traitement des infections à bactérie Gram négatif multi-
résistante. Les résistances aux antibiotiques acquises sont au cœur de l’enjeu de santé publique que
représente la résistance aux antibiotiques.
Les bactéries peuvent devenir résistantes grâce à plusieurs mécanismes. Elles peuvent
acquérir des mutations sur un gène ou le système de régulation de l’expression des gènes. Par
exemple, la résistance aux quinolones peut s’obtenir en cumulant des mutations sur les sous-unités
de l’ADN gyrase et la topo-isomérase IV qui sont les cibles de cette famille d’antibiotique (Hawkey
2003). Les souches de Pseudomonas aeruginosa acquièrent des résistances à des antibiotiques de
familles différentes par la surexpression des systèmes d’efflux (Courvalin et Leclercq 2012). Ces
résistances sont transmises aux cellules filles, la transmission est dite verticale. Ces résistances
peuvent apparaître chez toutes les espèces bactériennes.
Elles peuvent aussi acquérir des gènes exogènes par transfert de gènes horizontaux. Le
mécanisme principal de transfert horizontal de gènes est la conjugaison bactérienne. Par ce
mécanisme les bactéries se transfèrent des éléments génétiques mobiles. Ces éléments peuvent
porter des gènes de résistance et participer à la diffusion de la résistance aux antibiotiques. Les
Étude bibliographique
41
autres mécanismes de transfert de gènes entre bactéries connus sont la transduction, qui met en jeu
la dissémination de gènes bactériens par les bactériophages et la transformation, qui permet
l’incorporation d’ADN libre dans le milieu dans le génome bactérien (Davies et Davies 2010).
III.1. Les éléments génétiques mobiles et les intégrons
Les éléments génétiques mobiles sont des fragments d’ADN capables de se mouvoir au sein
d’un même génome ou d’un génome bactérien à un autre. Les structures connues sont les plasmides,
les îlots génomiques et les transposons. Les intégrons ne sont pas des structures mobiles, mais ce
sont des systèmes de capture de gènes pouvant cumuler des gènes de résistance.
III.1.A. Les Plasmides
Les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires extra-chromosomiques ayant une taille
allant de quelques kilobases à plus de plusieurs centaines de kilobases. Plus de 4400 plasmides
bactériens entièrement séquencés sont disponibles dans la base de données Plasmid Genome du
NCBI (Shintani et al. 2015). Les plasmides peuvent être conjugatifs, c’est-à-dire qu’ils possèdent dans
leur séquence les gènes codant pour la machinerie nécessaire à la conjugaison, ou mobilisables,
c’est-à-dire qu’ils ne possèdent pas de système de conjugaison dans leur séquence. Pour leur
transfert par conjugaison ils dépendent de la machinerie d’un élément conjugatif. Selon les travaux
de Smilie et al. (2010), environ 15 % des plasmides séquencés seraient conjugatifs et 24 % serait
mobilisables. La réplication des plasmides est autonome et indépendante de celle du chromosome
bactérien. Il existe différents systèmes de réplication plasmidique, et des plasmides possédant le
même système de réplication ne peuvent pas coexister dans la même cellule bactérienne, ils sont
dits incompatibles. Les plasmides sont classés par groupe d’incompatibilité (Inc). Actuellement, 28
groupes d’incompatibilité ont été définis dans la famille Enterobacteriaceae, 14 dans le genre
Pseudomonas et 18 dans le genre Staphylococcus (Shintani et al. 2015).
Étude bibliographique
42
Les plasmides ne sont pas nécessaires à la survie de la bactérie, mais ils peuvent porter des
gènes ayant un rôle dans l’adaptation des bactéries à leur environnement (virulence, résistance aux
métaux et aux antibiotiques…).
III.1.B. Les ilôts génomiques : integrative and conjugative element (ICE) et
integrative and mobilisable element (IME)
Les îlots génomiques sont des éléments génétiques capables de s’intégrer et de s’exciser du
chromosome bactérien ou des plasmides (Wozniak et al. 2009, Bellanger et al. 2014). Comme pour
les plasmides certains îlots génomiques ont la capacité de conjuguer, ce sont les integrative and
conjugative elements, ou ICE. D’autres sont mobilisables, ce sont les integrative and mobilizable
elements. À la différence des plasmides, les ICEs et les IMEs ne peuvent pas se répliquer de manière
autonome, ils dépendent de la réplication du support génétique dans lequel ils sont intégrés. Leurs
tailles s’échelonnent de quelques dizaines de kilobases à plus de 600 kilobases (Bellanger et al. 2014,
Bañuelos-Vazquez et al. 2017, Burrus 2017, Cury et al. 2017).
Les ICEs comme les IMEs peuvent être porteur de gènes de résistance aux antibiotiques et
être acteurs dans la dissémination des résistances aux antibiotiques. Dans leurs travaux, Bellanger et
al. (2014) ont relevé 18 ICEs et 11 IMEs décrits dans la littérature portant des gènes de résistance aux
antibiotiques. L’ICE et l’IME Salmonella genomic island 1 (SGI1) sont les îlots génomiques associés à
de la multirésistance (Bellanger et al. 2014).
L’ICE SXT, fait partie de la famille des ICEs SXT/R391. L’îlot SXT a été découvert au sein
d’isolats cliniques de Vibrio cholerae O139 du sous-continent Indien qui leur a conféré la résistance
aux sulfamides, triméthoprime, chloramphénicol et à la streptomycine (Waldor et al. 1996). Ils ont
été ensuite regroupés avec les éléments génétiques R391, avec lesquelles ils avaient une structure
génétique et un fonctionnement proche (Beaber et al. 2002, Bioteau et al. 2018). L’élément R391 a
été découvert en 1967 en Afrique du Sud dans une souche de Providencia rettgeri et il conférait la
résistance à la kanamycine et au mercure (Coetzee et al. 1972). Une étude in silico sur 68 ICEs de
Étude bibliographique
43
cette famille a montré qu’il y en existait 4 types. Le type 1 comprend tous les ICEs s’insérant dans le
gène prfC et sont trouvés dans les génomes des Enterobacteriaceae et Vibrionaceae. Les ICEs de type
2, 3 et 4 s’intègrent dans le gène codant pour l’ARNt-Ser et ils ont été décrits dans le génome
d’espèces de Vibrio (Bioteau et al. 2018). L’activation de la réponse SOS de la cellule hôte induit
l’excision de ces ICEs du chromosome bactérien leur transfert vers une nouvelle cellule (Beaber et al.
2003).
L’îlot génomique SGI1 a été décrit pour la première fois dans une souche de Salmonella
enterica sérovar typhimurium de lysotype DT104. Cet IME confère une résistance aux
aminopénicillines, aminosides, phénicolés, sulfamides et tétracyclines (Boyd et al. 2001). Il s’intègre
dans le chromosome bactérien en 3’ du gène trmE, et il a été montré qu’il pouvait également
s’intégrer, in vitro, au niveau des gènes sodB et purR. Ne possédant pas de machinerie pour
conjuguer, la mobilité de SGI1 est dépendant d’un élément conjugatif. Drouet et al. (2010) ont
montré que les plasmides de type IncA/C sont capables de le mobiliser. Cet îlot génomique a
également été décrit dans les génomes d’autres sérovars de Salmonella enterica dont Salmonella
enterica sérotype Kentucky, mais il a aussi été détecté dans des souches de Proteus mirabilis (Ahmed
et al. 2007, Le Hello et al. 2013).
III.1.C. Transposon
Les transposons sont les principaux éléments génétiques mobiles intracellulaires. Ils sont
caractérisés par la présence d’un gène codant pour une transposase et flanqués de deux séquences
inversées répétées. L’ensemble est appelé séquence d’insertion (IS). La transposase de l’IS reconnait
et coupe de manière spécifique les séquences inversées répétées. Deux IS peuvent encadrer des
gènes de résistance aux antibiotiques, ce sont des transposons composites (Siguier et al. 2006). La
mobilité de ces transposons composites se fait par l’activité combinée des deux IS. Ce mécanisme
permet aux résistances de se déplacer au sein du génome bactérien, entre le chromosome et des
plasmides ou entre des éléments génétiques mobiles par exemple. Les transposons dépendent de
Étude bibliographique
44
leur support pour se déplacer d’une cellule à une autre. De plus, des gènes de résistance naturelle
présents sur un chromosome bactérien peuvent être recrutés par ce mécanisme. En effet, la β-
lactamase chromosomique OXA-48 a été recrutée depuis le chromosome des bactéries du genre
Shewanella par un transposon composite Tn1999 vers des plasmides. Les plasmides ont ensuite
diffusé dans les Enterobacteriaceae (Poirel et al. 2012b).
III.1.D. Les intégrons
Les intégrons sont des structures génétiques de capture et d’expression de gènes, qui sont
sous forme de cassette (Gillings 2014). Ils possèdent au minimum un gène codant pour une intégrase
(intI) permettant d’intégrer et exciser les gènes cassettes, un site de recombinaison (attI) où les
cassettes s’intègrent et un promoteur (Pc) permettant l’expression des gènes cassettes (Gillings
2014). Les intégrons sont classés selon la séquence de leur intégrase, mais plus d’une centaine de
variants du gène existent (Gillings 2014).Les cassettes de gène sont de petites molécules d’ADN
codant pour un gène et possédant un site de recombinaison attC. Ce site permet l’intégration de la
cassette dans l’intégron par recombinaison avec le site attI (Partridge et al. 2009). Le niveau
d’expression des cassettes diminue de façon proportionnelle avec son éloignement du promoteur Pc
(Jove et al. 2010). Les cassettes sont un réservoir de gènes pour des fonctions diverses, plus de 65 %
des gènes compris dans ces cassettes n’ont pas d’homologues connus dans les bases de données
(Boucher et al. 2007). De plus, au moins 130 cassettes portant un gène de résistance aux
antibiotiques ont été décrits (Partridge et al. 2009). Les intégrons peuvent être chromosomiques, ils
sont notamment présents sur les chromosomes des bactéries du genre Vibrio ou Pseudomonas
(Rowe-Magnus et al. 2003, Gillings 2014). D’autres intégrons sont présents sur des éléments
génétiques mobiles comme des transposons, îlots génomiques ou plasmides. Ils dépendent de leur
support pour disséminer au sein de population bactérienne. Cinq classes d’intégrons sont présents
sur des éléments génétiques mobiles et sont associés avec des cassettes de gènes de résistance aux
antibiotiques. Les intégrons de classe 1, 2 et 3 sont les plus étudiés (Partridge et al. 2009, Barraud et
al. 2010). Ces intégrons peuvent cumuler 4 à 5 cassettes et, par leur présence sur des éléments
Étude bibliographique
45
génétiques mobiles, participer à la diffusion des résistances aux antibiotiques et des cassettes de
gènes associées (Domingues et al. 2012). Ils sont utilisés comme des marqueurs de l’acquisition de
résistance aux antibiotiques dans l’environnement (Stalder et al. 2012)
III.1.E. Imbrication des éléments génétiques mobiles
Les gènes de résistance, les intégrons et les éléments génétiques mobiles peuvent être
imbriqués les uns dans les autres comme des matriochka, donnant des structures mosaïques. Le
plasmide R100, porteur de plusieurs gènes de résistance, en est un bon exemple. D’un côté les gènes
de résistance à la tétracycline tet (R), tet (A), tet (C) et tet (D) sont sur un transposon Tn10 qui est
dans le plasmide. De l’autre côté, les gènes de résistance aux sulfamides sul1 et aux aminosides
aadA1 sont dans un intégron de type 1 qui est lui-même dans un transposon Tn402. Ce dernier est
inclus, avec un opéron de résistance au mercure mer, dans un autre transposon Tn21 qui est lui-
même intégré dans un transposon Tn9 avec le gène cat qui donne une résistance aux phénicolés.
Cette dernière structure est portée par le plasmide (Figure 4).
Figure 4: Structure mosaïque du plasmide R100. En jaune les gènes de résistance aux tétracyclines, en jaune-orangé le gène de résistance aux aminosides (aadA1), en orange le gène de résistance aux désinfectants (qacE), en rose vif le gène de résistance aux sulfamides (sul1) et en rose pâle le gène de résistance aux phénicolés (cat). En marron rayé verticalement l’opéron de résistance au mercure (mer). Les différents bleus montrent les différentes structures portant les gènes de résistance (Gillings et Stokes).
Étude bibliographique
46
III.2. La transduction et la transformation
La transduction est un mécanisme de transfert d’ADN entre bactérie par les bactériophages.
Ce mécanisme résulte de l’encapsidation d’ADN non viral lors du cycle lytique des bactériophages. Ce
mécanisme de transmission de gènes de résistance joue un rôle dans la dissémination de la
résistance aux antibiotiques. Volkova et al. (2014)ont estimé, par un modèle mathématique, que la
fréquence de transmission des gènes de résistance est 1000 fois moins élevée par le phénomène de
transduction que par la conjugaison bactérienne.
En parallèle, des travaux ont montré que les gènes de résistance tet(A), aphA1, floR et blaTEM
ont été transférés par transduction de souches d’E. coli isolées de viande de poulet vers des souches
sensibles aux antibiotiques (Shousha et al. 2015). De plus, deux phages conférant à Bacillus anthracis
la résistance à la fosfomycine ont été décrits. Ce sont les seuls bactériophages connus portent dans
leur génome un facteur de résistance aux antibiotiques (Schuch et Fischetti 2006, Enault et al. 2017).
La transformation est l’acquisition d’ADN libre (chromosomique ou plasmidique) présent
dans l’environnement de la bactérie (Lorenz et Wackernagel 1994). Si les morceaux d’ADN
contiennent des gènes de résistance aux antibiotiques, ils sont ajoutés au génome bactérien. De plus,
il peut aussi y avoir une recombinaison entre la molécule d’ADN acquis et celle de la bactérie. Ce
mécanisme permet la formation de séquences mosaïques. Les bactéries du genre Streptococcus sont
capables d’acquérir des fragments d’ADN codant pour la PLP d’autres Streptococcus. En recombinant
ces fragments d’ADN avec son gène codant pour une PLP, il en résulte une séquence mosaïque.
L’expression de ce gène mosaïque peut conférer une résistance aux β-lactamines (Spratt 1994). Des
travaux ont montré que les bactéries du genre Vibrio étaient capables d’acquérir des plasmides libres
et d’exprimer la résistance aux aminosides qu’ils codaient à des fréquences allant de 10-7 à 10-10
transformant par cellule réceptrice (Frischer et al. 1990, Paul et al. 1991). D’autres genres bactériens
ont montré des capacités de transformation dont les espèces du genre Aeromonas, Bacillus et
Salmonella mais aussi pour des souches des espèces E. coli (Lorenz et Wackernagel 1994, Huddleston
Étude bibliographique
47
et al. 2013). Cependant, la transformation bactérienne nécessite que les cellules bactériennes soit
dans un état physiologique permettant d’assimiler de l’ADN exogène, si c’est le cas elles sont dites
compétentes (Lorenz et Wackernagel 1994).
III.3. Diffusion des bactéries résistantes aux antibiotiques et
sureveillance
Les mécanismes de sélection et de dissémination des résistances acquises aux antibiotiques
sont complexes et multifactorielles (Webb et al. 2017). C’est pourquoi la surveillance de la résistance
aux antibiotiques est importante pour suivre l’émergence et l’évolution des résistances acquises au
sein des populations bactériennes.
En 2015, en Chine, lors d’un programme de surveillance de la résistance aux antibiotiques de
souches d’E. coli isolées d’animaux d’élevage, le premier gène de résistance à la colistine
transmissible, mcr-1 (Liu et al. 2016) a été démontré. Des études rétrospectives sur la prévalence du
gène mcr-1 ont montré que ce gène était déjà présent dans des souches d’E. coli isolées de volailles
depuis les années 1980 en Chine (Shen et al. 2016). Pendant les 20 ans qui ont suivi, ce gène n’a pas
été détecté. C’est à partir des années 2000 que ce gène a diffusé dans le monde. Il a été observé
dans des souches d’Enterobacteriaceae isolées d’animaux de rente et d‘aliments en Europe, en Asie,
en Afrique et en Amérique (Wang et al. 2018). L’alimentation est une des voies possible de
dissémination de ce gène entre l’animal et l’Homme. Des cas humains de personnes porteuses de ce
gène ont aussi été détectés chez l’Homme en Europe, Asie, Moyen-Orient, Amérique (Pham Thanh et
al. 2016, Webb et al. 2017). Des souches porteuses de mcr-1 ont également été isolées dans
l’environnement, à partir d’animaux sauvages et d’échantillons d’eau (Webb et al. 2017, Drali et al.
2018, Wang et al. 2018). Des études génétiques ont montré que le gène mcr-1 avait été mobilisé
dans un transposon composite ISApl1-mcr-1-orf-ISApl1 sur un plasmide (Wang et al. 2018). Cette
structure génétique a ensuite transposée sur des plasmides de type IncX4, IncI2 et IncHI2 pour
diffuser plus largement au sein de Enterobacteriaceae (Matamoros et al. 2017, Wang et al. 2018).
Étude bibliographique
48
La diffusion de la β-lactamase blandm-1 est un autre exemple de diffusion de résistance aux
antibiotiques par des éléments génétiques mobiles. La diffusion de cette carbapénèmase est un
enjeu de santé publique car elle capable d’hydrolyser toutes les β-lactamines, dont les carbapénèmes
qui sont des antibiotiques de dernier recours. Elle a été décrite pour la première fois en Suède en
2008 dans une souche de Klebsiella pneumoniae isolée d’un patient revenant d’Inde (Yong et al.
2009). Les bactéries productrices de cette enzyme sont principalement décrites en Asie, au Moyen-
Orient et dans les Balkans (Dortet et al. 2014). Des travaux ont montré que ce gène se trouvait sur un
transposon composite Tn125. Ce transposon a été identifié dans des souches cliniques et
environnementales d’Enterobacteriaceae, d’Acinetobacter, et de Vibrio (Dortet et al. 2014). La
dissémination de ce gène n’est pas spécifiquement n’est pas liée spécifiquement à un plasmide, une
espèce ou une souche bactérienne.
En parallèle de la diffusion de la résistance aux antibiotiques par les éléments génétiques
mobiles, certaines souches bactériennes ayant acquis des résistances ont diffusé dans le monde. Le
cas de Salmonella enterica sérotype Kentucky ST198-X1 résistante à la ciprofloxacine en est un
exemple (Le Hello et al. 2011). Ce clone bactérien a été initialement isolé d’un élevage de volaille en
Egypte dans les années 1990 et n’avait pas acquis de résistance. Il a par la suite cumulé des
mutations sur les gènes gyrA et parC, le rendant résistant aux quinolones et il a acquis un îlot
génétique Salmonella Genomic Island (SGI) portant une région de multi-résistance aux antibiotiques
pénicillines, phénicolés, aminosides, sulfamides, cyclines. La présence d’ISVCh4 issue de Vibrio
cholerae dans l’îlot SGI montre que l’acquisition des résistances s’est faite dans le milieu aquatique,
plus précisément au sein d’un élevage aquacole qui produisait des farines de poissons pour nourrir
des volailles (Le Hello et al. 2011). A partir de 2002, la souche s’est disséminée à travers le monde au
sein de troupeaux de volailles, en 2006 en Ethiopie, en 2008 au Nigeria et au Maroc, en 2010 au
Bengladesh, en France, en Allemagne et en Pologne (Le Hello et al. 2013). Ce clone bactérien a
également été isolé de matrices alimentaires comme de la viande, des épices ou des produits
Étude bibliographique
49
aquatiques, mais aussi de reptiles et de prélèvements environnementaux (rivière, compost) (Le Hello
et al. 2013).
Le risque lié à la dissémination de la résistance aux antibiotiques dans l’alimentation et dans
la chaîne de production alimentaire est pris en compte dans quelques régions du monde. En
Amérique du Nord, il y a les plans de surveillance du National Antimicrobial Resistance Monitoring
System (NARMS) aux Etats-Unis et du Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance
Surveillance CIPARS au Canada. En Europe, depuis le milieu des années 2000, la commission
Européenne demande à l’European Food Safety Authority (EFSA) de recueillir les données sur la
résistance aux antibiotiques de bactéries pathogènes alimentaires pour l’Homme comme Salmonella
spp, Campylobacter coli et C. jejeuni dans les filières bovines, porcines, volaille (Commission
Européenne 2013). D’un autre côté, il est également demandé de surveiller la résistance aux
antibiotiques des bactéries commensales Escherichia coli et Enterococcus spp dans ces filières à
l’abattoir et au niveau de la distribution. Ces bactéries servent d’indicatrices de la résistance aux
antibiotiques de la flore bactérienne des produits carnés et des animaux d’élevage dont ils sont issus.
Toutefois, les plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques ne concernent que les
filières animales terrestres : les volailles, les porcs et les bovins mais pas la filière des produits
aquatiques. La résistance aux antibiotiques de pathogènes alimentaires pour l’Homme comme
Listeria monocytogenes et Vibrio spp n’est pas surveillé par ces plans (EFSA et ECDC 2018). De plus,
les bactéries indicatrices du milieu terrestre E. coli ou Enterococcus spp. sont peu décrites dans les
flores des produits aquatiques. Elles ne peuvent pas être utilisées comme indicatrices de la résistance
aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Les bactéries des genres Aeromonas et Vibrio ont été
proposées comme indicateur de la résistance aux antibiotiques pour le milieu aquatique (Banerjee et
Farber 2018).
Étude bibliographique
50
III.4. Techniques de détection phénotypique et génotypique de la
résistance aux antibiotiques
III.4.A. Techniques de détection phénotypique
Les tests phénotypiques sont des tests in vitro permettant de visualiser la sensibilité d’une
souche bactérienne par rapport à un antibiotique. Le principe est de déterminer la plus petite
concentration d’antibiotique inhibant la croissance bactérienne, la concentration minimale inhibitrice
ou CMI de façon directe ou indirecte. Deux organismes internationaux ont standardisés des
protocoles pour tester la sensibilité de souches bactériennes aux antibiotiques par antibiogramme le
Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) et l’EUropean Comitee on Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST). Les protocoles ont été développés principalement pour les bactéries pathogènes
pour l’homme ou les animaux domestiques. Les conditions expérimentales sont les mêmes pour les
deux référentiels : utilisation du milieu Mueller-Hinton ou Mueller-Hinton supplémentée en sang,
une température d’incubation de 35 °C et un temps d’incubation de 16-20h (CLSI 2016b, EUCAST
2018).
La méthode de référence pour attester d’un phénotype de résistance est la microdilution en
milieu liquide (ISO 2007). Le principe est de soumettre une souche bactérienne à une gamme de
concentration croissante de l’antibiotique testé. La dernière concentration pour laquelle aucune
croissance bactérienne n’est détectée à l’œil nu correspond à la CMI pour l’antibiotique testé.
D’autres méthodes existent pour mesurer la CMI. Il y a la dilution en milieu solide. Le principe
est le même que pour la microdilution en milieu liquide, sauf que le milieu est gélosé (EUCAST 2000).
Cette différence entraîne des difficultés pour l’étude de certains antibiotiques comme la
daptomycine. En effet, l’activité de cet antibiotique varie en fonction de la concentration en ions
Ca2+, qui ne peut pas être maitrisée précisément dans un milieu gélosé (Courvalin et Leclercq 2012).
Enfin, en 1988, la société suédoise AB biodisk a mis au point une bandelette permettant de mesurer
la CMI par diffusion en milieu gélosé, le E-test®. L’antibiotique diffuse à partir d’une bandelette sur
Étude bibliographique
51
laquelle différentes quantités d’antibiotiques ont été placées. Plusieurs gradients de concentration
vont se former, et une zone d’inhibition en forme d’ellipse va être créée. La bandelette est graduée
en fonction des CMI et la graduation où la limite de croissance croise la bandelette correspond à la
CMI (Hall et Parshall). Cette méthode n’est pas recommandée pour tester la résistance à certains
antibiotiques comme la colistine (EUCAST 2016).
Cependant la méthode la plus couramment utilisée en microbiologie clinique est la diffusion
en milieu gélosé (Courvalin et Leclercq 2012). Le principe est de déposer un disque imprégné d’une
quantité d’antibiotique connue sur une gélose préalablement ensemencée avec la souche à tester.
L’antibiotique va diffuser dans la gélose en créant un gradient de concentration autour du disque
d’antibiotique. Lorsque la concentration de l’antibiotique est supérieure à la CMI, la croissance
bactérienne va être inhibée. Si elle est inférieure à la CMI les bactéries vont se diviser ce qui va
former une zone d’inhibition de croissance de la bactérie autour du disque d’antibiotique. Le
diamètre de cette zone d’inhibition de croissance est mesuré. Cette technique ne permet pas de
connaître directement la CMI, mais repose sur la corrélation entre le diamètre d’inhibition et la CMI
(Kronvall et Ringertz 1991). Cependant, pour certains antibiotiques, la méthode de diffusion par
disque n’est pas appropriée, comme pour les glycopeptides et les polypeptides, qui diffusent mal
dans la gélose.
III.4.B. Interprétation des résultats phénotypiques selon les référentiels du CLSI
et EUCAST
Les résultats de CMI et de diamètre d’inhibition sont interprétés par rapport à des valeurs
seuils. Il en existe deux catégories, les seuils cliniques et les seuils épidémiologiques.
Les seuils cliniques, ou clinical breakpoints, définissent la résistance clinique d’une souche à
un antibiotique. Ils sont utilisés par les cliniciens pour prédire la réussite d’un traitement
antibiotique. Ces seuils sont définis par rapport au trio antibiotique/bactérie/hôte et permettent de
détecter les mécanismes de résistance ayant un impact clinique (Silley 2012, Baron et al. 2017a). Ils
Étude bibliographique
52
séparent les résultats en 3 catégories, sensible, intermédiaire et résistant (Figure 5). Si une souche
est dite sensible, le traitement antibiotique a de forte chance de fonctionner, si la souche est dite
résistante il y a de forte chance que le traitement antibiotique ne fonctionne pas, si la souche est dite
intermédiaire, la réussite du traitement antibiotique est inconnue. Les seuils cliniques sont établis
par les référentiels du CLSI et de l’EUCAST (CLSI 2015, CLSI 2016b, EUCAST 2018).
Figure 5: Distribution des diamètres d’inhibition de souches d’E. coli pour la ciprofloxacine. Les barres bleues représentent les souches sensibles cliniquement, en vert les souches intermédiaires et en rouge les souches résistantes cliniquement (Kronvall et al. 2011).
Les seuils épidémiologiques définissent la résistance microbiologique d’une souche à un
antibiotique. Ils sont utilisés par les microbiologistes/épidémiologistes pour détecter les souches
ayant acquis un mécanisme de résistance, sans prendre en compte l’efficacité clinique de
l’antibiotique. Ces seuils sont déterminés par rapport au couple antibiotique/bactérie et permettent
de détecter l’émergence de résistance au sein d’une population bactérienne mais n’a aucune valeur
clinique. Ils séparent la population sauvage qui a le phénotype naturel vis-à-vis d’un antibiotique de
la population non sauvage qui a acquis une résistance (Figure 6). Les référentiels du CLSI et de
l’EUCAST ont définis des seuils épidémiologiques ou epidemiological cut-off value, (ECV pour CLSI et
ECOFF pour l’EUCAST). Cependant, par rapport aux seuils cliniques, peu de seuils épidémiologiques
ont été déterminés et concernent majoritairement les espèces bactériennes pathogènes pour
l’Homme (EUCAST , CLSI 2014, CLSI 2016b).
Étude bibliographique
53
Figure 6: Distribution des bactéries de l’espèce E. coli selon les diamètres d’inhibition de la ciprofloxacine. Le seuil épidémiologique est 25 mm. Les barres noires représentent la population bactérienne sauvage et les barres blanches la population non sauvage
Pour déterminer des seuils épidémiologiques, pour un couple antibiotique/bactérie,
plusieurs études indépendantes avec les mêmes conditions expérimentales sont nécessaires (CLSI
2016b). Les seuils épidémiologiques sont calculés par des méthodes statistiques se basant sur l’étude
de la distribution des diamètres d’inhibition ou des CMI (Figure 6) (Turnidge et al. , Kronvall 2010,
Baron et al. 2017a). Les seuils cliniques et épidémiologiques ont été définis dans les référentiels pour
les bactéries pathogènes isolées du milieu terrestre à une température de 35°C. Cependant, cette
température n’est pas optimale pour la croissance de toutes les bactéries isolées du milieu
aquatique, ce qui pose des difficultés pour l’étude de la résistance aux antibiotiques des celles-ci. Le
CLSI a mis en place des lignes directrices pour tester la résistance aux antibiotiques de ces bactéries,
par la dilution en milieu liquide et par diffusion. Deux températures d’incubation sont utilisées 22°C
et 28°C, les durées d’incubation sont de 44-48 h ou 24-28 h, respectivement. Cependant, ces lignes
directrices ont été développées pour étudier les bactéries présentes dans les produits aquatiques
provenant de l’élevage (aquaculture), et plus particulièrement les bactéries pathogènes des animaux.
De plus, les classes d’antibiotiques étudiées sont celles utilisées pour leur traitement : β-lactamines,
quinolones, aminosides, macrolides, phénicolés, tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates
(CLSI 2006a, CLSI 2006b, CLSI 2014). Des seuils cliniques ont été établis uniquement pour Aeromonas
Diamètre d’inhibition (mm)
% d
e so
uch
es
Étude bibliographique
54
salmonicida à 22°C (44-48h) pour l’oxytétracycline et l’acide oxolinique pour le traitement du
saumon Atlantique.
En parallèle, des seuils épidémiologiques expérimentaux, non validés par les référentiels, ont
été calculés dans différents travaux en s’appuyant sur les lignes directrices du CLSI. Ces seuils ont été
définis par diffusion A. salmonicida à 22 °C pendant 44/48 h (Ruane et al. 2007, Smith 2012),
Edwerdsiella tarda et Vibrio harveyi à 28 °C pendant 24/28 h(Lim et al. 2016) et par microdilution
pour Aeromonas spp. à 22 °C pendant 24 h (Baron et al. 2017a), et Vibrio ichthyoenteri à 22 °C
pendant 24/28 h (Lee et al. 2012). Ces seuils expérimentaux n’ont pas été définis dans les mêmes
conditions expérimentales (dilution/diffusion, 22 °C/28 °C, 24-28 h/44-48 h) et ne sont utilisables que
dans les mêmes conditions expérimentales.
De plus, il a été montré que plus la température d’incubation des antibiogrammes est basse
et plus le temps est élevé ce qui conduit à une perte de précision des résultats obtenus par la
méthode de diffusion alors que cela n’impacte pas ceux obtenus par la méthode par dilution (Smith
et al. 2018). En comparant les diamètres d’inhibition de souches de référence (Enterococcus faecalis,
Escherichia coli, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae et Streptococcus pyogenes), de 9 laboratoires dans différentes conditions,
Smith et al. (2015) ont remarqué une variation des écart-types moyens selon les conditions
d’incubation. À 35 °C pendant 18 h l’écart-type moyen était de 1,5 mm, à 28°C 24 il était de 1,9 mm,
à 22 °C 24h, l’écart-type moyen était de 2,4 mm et à 22 °C 48 h l’écart-type moyen était de 2,9 mm.
De plus, la perte de précision dans la mesure des diamètres d’inhibition entraine une
variabilité dans le calcul de seuils épidémiologiques expérimentaux. Par exemple, à 22 °C et 44/48 h,
les seuils épidémiologiques pour A. salmonicida pour l’acide oxolinique allaient de 30 à 36 mm selon
les études (Smith 2012, Smith et Kronvall 2015, Smith et al. 2018). Cette variabilité et le nombre
faible d’études complique l’établissement de seuils épidémiologiques « universels » pour la méthode
de diffusion par disque (CLSI 2014, Smith et al. 2018). De ce fait, il est recommandé, pour des
Étude bibliographique
55
antibiogrammes à des températures inférieures à 22°C, d’utiliser la méthode de dilution en milieu
liquide car ni la température d’incubation, ni la durée n’ont d’impact sur la précision des CMI
mesurées.
III.4.C. Techniques de confirmation et d’identification des mécanismes de
résistance et de leurs supports génétiques
Les seuils épidémiologiques et cliniques sont utilisés pour détecter in vitro des souches
résistantes aux antibiotiques. Dans le but d’étudier et d’identifier les mécanismes menant à des
résistances, différentes techniques phénotypiques, biochimiques et moléculaires ont été
développées.
La méthode de diffusion permet d’observer à l’œil nu des interactions entre les antibiotiques
et d’observer la présence de mécanismes de résistance inductibles ou engendrant des phénotypes
particuliers. Par exemple, les gènes de résistance aux antibiotiques erm sont détectables par une
image d’antagonisme entre un macrolide et la clindamycine (Leclercq 2012a). La présence de β-
lactamase à spectre étendu (BLSE) se visualise par l’apparition d’une synergie entre un disque
contenant de l’acide clavulanique et un disque de céphalosporine 3ème génération (Jarlier et al. 1988).
Cependant, d’autres β-lactamases, comme les céphalosporinases et les carbapénémases, qui ne sont
pas sensibles à l’acide clavulanique, masquent la synergie et empêchent la détection des BLSE.
Les méthodes biochimiques sont utilisées principalement pour détecter l’activité
enzymatique des β-lactamases. Des méthodes chromogènes comme le test à la nitrocéfine® ou le
test NP ont été développées (O'Callaghan et al. 1972, Nordmann et al. 2012b). La nitrocéfine® est
une céphalosporine incolore qui devient rouge lors de son hydrolyse par une β-lactamase
(O'Callaghan et al. 1972). Le test NP permet de visualiser l’acidification du milieu par l’activité d’une
β-lactamase, il est principalement utilisé pour détecter l’activité d’une carbapénèmase. Un lysat
bactérien est mélangé à une solution contenant un carbapénème et un indicateur coloré. S’il n’y a
pas de carbapénémase la solution est rouge, si une carbapénémase est présente la solution devient
Étude bibliographique
56
jaune (Nordmann et al. 2012b). Une autre manière de mettre en évidence l’activité d’une
carbapénémase est le CIM test (Carbapenemase inactivation method). Le principe de ce test est
d’incuber un disque de carbapénème dans une suspension bactérienne à tester. Si la souche testée
ne produit pas de carbapénémase, le carbapénème sera toujours actif. Le disque est ensuite posé sur
une gélose ensemencée avec une souche E.coli sensible aux carbapénèmes. L’antibiotique présent
dans le disque va créer une zone d’inhibition. Le test sera négatif. Si la souche testée produit une
carbapénémase, l’antibiotique dans le disque perd son activité et la souche E. coli va pousser au
contact du disque. Le test sera positif (van der Zwaluw et al. 2015).
L’amplification des gènes de résistance par PCR est utilisée pour leur détection et leur
identification (Visser et Fluit 1995, Fluit et al. 2001). Cependant, ces techniques ciblent de manière
spécifique un gène ou une famille de gènes et sont utilisées pour des études ciblées sur des
mécanismes de résistance. De plus, face à des résistances dont le nombre de gènes décrits est très
important, comme les β-lactamases ( plus de 1 000 ont été décrites), des méthodes de criblage,
comme des puces à ADN, ont été développées (Chopra et Roberts 2001, Fluit et al. 2001, Randegger
et Hächler 2001, Call et al. 2003, Byrne-Bailey et al. 2009, Bush 2012). L’amplification par PCR a
également été utilisée pour détecter des éléments génétiques mobiles en ciblant des marqueurs
épidémiologiques. Par exemple, différents travaux ont développé des PCR ciblant les intégrases des
intégrons de classe 1,2 et 3 ou des ICEs SXT/R391 (Ceccarelli et al. 2006, Barraud et al. 2010). Ces
techniques permettent de mettre en évidence la présence d’éléments génétiques mobiles.
Cependant, ces techniques de détection ne permettent pas d’associer les gènes de résistance aux
antibiotiques aux éléments génétiques mobiles.
Afin d’étudier les structures génétiques de résistance présentes dans une souche
bactérienne, un séquençage du génome total et l’analyse des séquences obtenues peut être réalisé.
Les gènes de résistance peuvent être identifiés directement avec l’aide de bases de données de
Étude bibliographique
57
séquences de gènes de résistance aux antibiotiques, comme the Comprehensive Antibiotic Resistance
Database (CARD) ou ResFinder (Jia et al. 2017) (Zankari et al. 2012). De même, des bases de données
ont été développées pour identifier les éléments génétiques mobiles dans les génomes, comme
Integrall pour identifier les intégrons (Moura et al. 2009), PlasmidFinder pour les plasmides (Carattoli
et al. 2014) ou ICEberg pour identifier les ICEs (Bi et al. 2012). De plus, dans un but épidémiologique,
l’annotation de l’ensemble du génome est nécessaire pour identifier le contexte génétique des gènes
de résistance. Le NCBI a développé des algorithmes comme procaryotic genome annotation
pipeline(PGAP) pour annoter les génomes par rapport aux séquences présentes dans sa base de
données de gènes (Zhao et al. 2012). Cependant, les techniques de séquençage du génome total sont
chères et l’analyse prend du temps. Ces techniques sont utiles pour caractérisation génotypique des
souches d’intérêt (multi-résistantes ou présentant des phénotypes de résistance aux antibiotiques
critiques).
59
Chapitre 1 : Isolement et identification de la flore bacte rienne me sophile cultivable des produits de
la pe che et de l’aquaculture
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
60
I. Contexte
Les produits aquatiques sont une source alimentaire importante pour les Français, ils en
consomment 34 kg/an/habitant, ce qui équivaut à la consommation annuelle de viande de porc
(FranceAgriMer 2016, FranceAgriMer 2017b). Les produits les plus consommés sont décrits dans le
Tableau 1. Ils et font partis de différentes catégories de matrices importées ou produit en France. En
effet, certains animaux sont principalement pêchés comme le thon, le cabillaud ou les Saint-Jacques
et sont des produits importés. Au contraire, le saumon ou les crevettes proviennent principalement
de l’aquaculture et sont également des produits importés. Par contre, la France est un des leaders
européens dans la production de mollusques bivalves (moules et huîtres).
Tableau 1: Volume de consommation, de production et d'importation des produits aquatiques les plus consommés par les français (moyenne 2013-2015) (FranceAgrimer, 2016).
Nom vernaculaire Consommation apparente
(t) Production française
(t) Importation
(t)
Thon 267 210 102 880 256 310
Moule 184 690 79 010 110 050
Cabillaud 178 530 12 680 173 070
Saumon 178 440 1 520 208 480
Saint-Jacques 121 210 24 240 116 290
Crevette 120 860 380 136 780
Huître 74 060 77 040 5 980
Sardine 62 900 24 730 42 030
Merlu 62 860 39 160 32 520
Hareng 49 780 30 450 20 480
De plus, ces animaux sont organisés selon leur position dans la colonne d’eau. Ils peuvent
vivre sur le fond marin en contact avec les sédiments (Saint-Jacques) et la flore bactérienne des
sédiments, ils sont dits benthiques, ils peuvent être à différents niveaux dans la colonne d’eau et en
contact avec la flore bactérienne aquatique (thon), ils sont dits pélagiques. Les animaux proches du
fond marin sont dits démersaux (cabillaud).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
61
L’essentiel des travaux scientifiques sur les flores bactériennes des produits aquatiques
ciblait la flore pathogène et la flore d’altération, et leurs évolutions lors de la transformation et la
conservation des produits aquatiques (Gram et Huss 1996, Leroi et al. 1998 , Gram 2001 , Gram et
Dalgaard 2002, Jaime Martinez-Urtaza et al. 2005, Böhme et al. 2013 , Parlapani et al. 2015, Calliauw
et al. 2016, Fernandes et al. 2018 , Lopatek et al. 2018 ). Les flores d’altération décrites sont
principalement psychrophiles et sont capables de se développer à la température de conservation
des aliments (0 à 8°C). Cette flore se composait principalement de bactéries lactiques (Lactococcus
spp., Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Carnobacterium spp., Vagococcus spp.) et de bactéries
Gram négatif (Shewanella putrefaciens, Phtobacterium phosphoreum, Pseudomonas spp,
Vibrionaceae, Enterocateriaceae) (Leroi et al. 1998 , Gram et Dalgaard 2002, Leroi 2010, Parlapani et
al. 2015 , Calliauw et al. 2016). Mais il y a peu de données sur la flore mésophile cultivable des
produits de la pêche et de l’aquaculture crus les plus consommés.
Ces travaux avaient pour objectif de faire un état des lieux de la flore mésophile cultivable
présente sur les produits de la pêche et de l’aquaculture parmi les plus consommés en France et
reflétant la diversité de nature et d’origine de ces produits. Pour cela, nous avons sélectionné et
analysé les produits suivants :
- Le cabillaud car c’est un poisson démersal de pleine mer,
- Des poissons plats (soles, limandes, plies) car ce sont des poissons benthiques et côtiers
et près de 10 000 t de ces poissons sont consommés annuellement (FranceAgriMer
2017b),
- Des mollusques bivalves (moules, Saint-Jacques et huîtres). Les moules et les huîtres sont
produites par conchyliculture alors que les Saint-Jacques sont pêchées. De plus, dans le
cas des moules et huîtres toute la chaire est consommée alors que dans les Saint-Jacques
seul le muscle adducteur, ou noix, et les gonades, ou corail, sont consommés,
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
62
- Des crustacés (crevettes, homard). La quasi-totalité des crevettes est importée
d’aquaculture de pays tropicaux, dont 50 % proviennent d’Equateur, d’Inde et du
Vietnam (FranceAgriMer 2017a). Par contre, le homard est importé de pêcheries de pays
tempérées, dont plus de la moitié d’Amérique du Nord (FranceAgriMer 2017a).
Des espèces animales différentes peuvent être commercialisées, comme les pectinidés (Pecten
maximus, Pecten jacobeus, Placopecten magellanicus, Chlamys islandica,…) sous la dénomination
Saint-Jacques (OMC 1996). Dans la suite de ces travaux, les noms courants des animaux plutôt que
leurs noms scientifiques, ont été utilisés.
Les prélèvements ont été réalisés sur la peau et les branchies ont été étudiées. Les viscères
n’ont pas été étudiées car dans le référentiel de l’OIE : « la flore digestive des animaux aquatiques
est transitoire et ne doit pas être étudiée en antibiorésistance » (OIE 2017a). De plus des études
préliminaires, dans le laboratoire ont montré que la flore présente dans le tube digestif n’avait pas
de croissance dans nos conditions expérimentales.
Les flores bactériennes mésophiles, cultivables, pathogènes et non pathogènes des différents
produits marins sélectionnés ont été étudiées. Les bactéries ciblées étaient Bacillus spp.,
Enterococcus spp., Listeria spp., Staphylococcus spp., Aeromonas spp., E.coli, Pseudomonas spp.,
Salmonella spp., Vibrio spp. et les bactéries résistantes présentant un enjeu majeur en santé
publique comme Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM), Enterococcus résistant à la
vancomycine (VRE), Enterobacteriales producrice de β-lactamase à spectre étendu (BLSE) ou de
carbapénémase. La flore mésophile a été sélectionnée par un enrichissement à 30°C, puis sur 14
milieux sélectifs. Les colonies bactériennes ont été isolées selon leurs morphologies sur chaque
milieu.
Enfin, les isolats bactériens ont été identifiés par amplification et séquençage de gènes de ménage
(ADNr 16S, gyrB, rpoBet tuf) et par la méthode Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of
Flight ou MALDI-TOF.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
63
II. Matériel et méthodes
II.1. Préparation des broyats
En 2016, trente poissons ont été achetés auprès de coopératives de pêcheurs : 15 cabillauds,
2 plies, 6 limandes, 7 soles et nous les avons identifiés comme « poissons plats » dans cette étude. Ils
étaient achetés entiers non éviscérés. Les prélèvements (mucus sur la peau et les ouies) ont été
réalisés sur chaque individu. Une éponge stérile imbibée d’eau peptonée tamponnée (EPT) (3M,
Cergy-Pontoise, France) a été passée sur la peau de chaque poisson pour récupérer le mucus. L’EPT
était récupérée en essorant l’éponge puis diluée au 1/2 avec de l’EPT (Oxoid, Dardilly, France)
supplémentée à 20 % v/v de glycérol (VWR, Fontenay-sous-bois, France) et mis dans un cryotube qui
était conservé à -20°C. Pour les branchies prélevées stérilement dans les cabillauds, la dilution au 1/2
avec de l’EPT (m/m) a été effectuée dans un sachet stérile avec un dilueur gravimétrique
(Interscience, St Nom la Bretèche, France) puis broyée pendant 1 min à l’aide d’un stomacher
(Biomerieux, Marcy l’étoile, France). Pour les autres poissons, la dilution au 1/2 avec de l’EPT (m/m) a
été réalisée dans un pot stérile puis agitée au vortex pendant 1 min. Les broyats obtenus ont été
supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol dans un cryotube et conservés à -20°C.
En 2015-2016, quarante-cinq lots de mollusques bivalves ont été préparés (15 lots de moules
françaises fraîches, 15 lots d’huîtres françaises fraîches et 15 lots de noix de Saint-Jacques congelées
importées). Les prélèvements ont été réalisés soit directement sur les produits frais soit après
décongélation. Ving-cinq grammes de chair ont été prélevés stérilement puis dilués au 1/10 avec de
l’EPT dans un sachet stérile avec un dilueur gravimétrique puis broyés pendant 1 min avec un
stomacher. Les broyats étaient ensuite supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol puis mis dans un
cryotube et conservés à -80°C. Les broyats des noix de Saint-Jacques ont été incubés à 37°C pendant
18 h puis supplémentés avec 20 % de glycérol dans un cryotube et conservés à -80°C.
Les broyats de cent six lots de crustacés congelés importés (15 lots de homards en 2015-2016
et 91 lots de crevettes tropicales crues en 2013) ont été préparés. Les homards ont été
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
64
préalablement décongelés puis 25 g de chair ont été prélevés et dilués au 1/10 (m/m) avec de l’eau
peptonée saline alcaline (EPSA) (Peptone/NaCl, Oxoid) dans un sachet stérile avec un dilueur
gravimétrique puis broyés pendant 1 min avec un stomacher. Les broyats ont été incubés à 37°C
pendant 18 h puis supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol dans un cryotube et conservés à -80°C.
Pour les crevettes, le céphalothorax a été retiré stérilement, 50 g de l’abdomen ont été dilués au 1/3
dans de l’EPT et broyés dans un bol waring puis supplémenté avec 10 % (V/V) de glycérol et congelés
à -20°C.
II.2. Isolement des bactéries
Chaque broyat a été décongelé puis dilué dans 2 mL d’EPSA ou 2 mL d’EPT pour obtenir une dilution
finale de 1/10. Les tubes ont ensuite été incubés une nuit à 30°C. Les suspensions bactériennes
enrichies dans l’EPSA ont été ensemencées sur les géloses sélectives suivantes : Thiosulfate Citrate
Bile Saccharose (TCBS, Oxoid), Glutamate Strach Phenol red (GSP, Merk, Darmstadt, Allemagne),
Chapman (Oxoid), ChromID® MRSA (Biomérieux)(Tableau 2). Les suspensions bactériennes enrichies
dans l’EPT ont été ensemencées sur les géloses sélectives suivantes : Triptone Bile X-glucuronide
(TBX, Oxoid), Cephalosporine Fucidine Cetrimide (CFC, Oxoid), Brillance Salmonella agar (Oxoid),
Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymol blue Agar (PEMBA, Oxoid), Agar Listeria selon
Ottaviani et Agosti (ALOA, Biomérieux), Slanetz & Bartley (Oxoid), ChromID® VRE (Biomérieux),
ChromID® BLSE (Biomérieux ), ChromID® OXA-48 (Biomérieux ), ChromID® Carba (Biomérieux).
Ensuite, les géloses GSP et CFC ont été incubées à 25°C pendant 48 h, la gélose TBX à 41°C pendant
24 h, la gélose PEMBA à 30°C pendant 48 h, les géloses ALOA et Slanetz & Bartley à 37°C pendant 48
h et les géloses TCBS, Chapman, Brillance Salmonella et celles de la gamme ChromID® à 37°C pendant
24 h.
Sur chaque gélose, une colonie de morphologie différente (couleur et/ ou forme) était repiquée sur
une gélose nutritive : plate count agar (PCA, Oxoid) pour les géloses dont l’enrichissement a été fait
dans de l’EPT et de la gélose nutritive salée à 1 % (GN, Biorad, Marnes-la-Coquette, France, NaCl,
Oxoid) pour les géloses dont l’enrichissement a été fait dans de l’EPSA. Les températures et les temps
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
65
d’incubation appliqués étaient identiques à ceux des milieux sélectifs initiaux. Chaque souche
repiquée était conservée à -80°C dans du bouillon cœur cervelle (BCC, Biomérieux) supplémenté avec
20 % (v/v) de glycérol et dans une gélose longue conservation (Bio-rad).
Tableau 2: Conditions d’incubation pour l‘isolement et le repiquage des souches bactériennes.
Bouillons Géloses sélectives Conditions
d’incubation
des géloses
Géloses de
repiquage
Conditions
d’incubation
des géloses
Bactérie(s) ciblée(s)
EPT TBX 41±1°C/24±2h PCA 37±1°C/24±2h E. coli
Brillance salmonella 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Salmonella spp.
Chrom ID ESBL 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae
productrice de β-
lactamase à spectre
étendu
ChromID OXA-48 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae
productrice de l’enzyme
OXA-48
ChromID Carba 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae
productrices de
carbapénémases
ChromID VRE 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterococcus résistant à
la vancomycine
Slanetz & Bartley 37±1°C/48±2h 37±1°C/24±2h Enterococcus spp.
ALOA 37±1°C/48±2h 37±1°C/24±2h Listeria spp.
PEMBA 30±1°C/48±2h 30±1°C/24±2h Bacillus spp.
CFC 25±1°C/48±2h 25±1°C/24±2h Pseudomonas spp.
EPSA Chapman 37±1°C/24±2h GNS 37±1°C/24±2h Staphylococcus spp.
TCBS 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Vibrio spp.
GSP 25±1°C/48±2h 25±1°C/24±2h Aeromonas spp. et
Pseudomonas spp.
ChromID MRSA 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Staphylococcus aureus
résistant à la méticilline
Chaque souche a été codifiée comme suit :
AF[Année]-[N° d’échantillon][Type de tissu]-[Nom de milieu isolé][Numéro de souche]
Liste des occurrences pour chaque catégorie :
[Année] : 2016, 2017
[N° d’échantillon] : Le numéro s’incrémentait
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
66
[Type de tissu] : Peau (PE), Chair (CH), Ouïes/branchies (OU), Chair + Carapace (CC).
[Nom du milieu d’isolement] : Tableau 3
Tableau 3:Abbréviation des noms des géloses sélectives.
Nom des géloses
sélectives
Abréviations du nom des
géloses sélectives
GSP GS
TCBS TC
CFC CF
Brillance Salmonella SA
TBX TB
ALOA AL
PEMBA PE
Chapman CH
Slanetz & Bartley SL
ChromID® VRE VRE
ChromID® ESBL ESBL
ChromID® MRSA MRSA
ChromID® OXA-48 OXA
ChromID® Carba CARBA
[Numéro de souche] : En fonction du nombre de souches de morphologies différentes isolées.
Exemple : Pour la souche du projet AntibioFish de 2016 isolée à partir de la chair (CH) de l’échantillon
1 sur le milieu TBX, le nom attribué sera : AF16-1CH-TB1.
II.3. Identification bactérienne par la technique MALDI-TOF et par
l’amplification et le séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB,
rpoB et tuf)
II.3.A. Technique MALDI-TOF
Les isolats préparés dans les géloses de longue conservation ont été envoyés à la plateforme MALDI-
TOF de l’ANSES (Nancy, France) pour leur identification à partir des spectress protéiques qui ont été
obtenus. Les souches bactériennes ont été repiquées en suivant les conditions données dans le
tableau 2. Une colonie ou un extrait protéique de chaque souche était analysé par le spectromètre
MALDI-TOF (Microflex®Bruker V4.0.0.1_4613-5627). Les spectres protéiques obtenus étaient
comparés à ceux présents dans la base de données de l’appareil Bruker. Un score était
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
67
automatiquement assignait par l’appareil à chaque comparaison de spectre. Pour chaque isolat, seul
le meilleur score était pris en compte comme suite :
- Si le score était strictement inférieur à 1,7 : aucune identification possible,
- Si le score était compris entre 1,7 et 2 : l’identification se faisait au genre bactérien,
- Si le score était supérieur ou égal à 2 : l’identification se faisait à l’espèce bactérienne.
II.3.B. Techniques d’amplification et de séquençage de gènes de ménage de l’ADNr
16S, gyrB, rpoB et tuf
II.3.B.a. Extraction de l’ADN
A partir d’un cryotube, les souches ont été repiquées comme décrit dans le Tableau 2.
Ensuite, plusieurs colonies étaient suspendues dans 200 μL d’InstaGeneTM Matrix (Bio-rad) dans un
tube Eppendorf. La suspension était incubée pendant 30 min à 56°C puis agitée pendant 10 s et
incubée pendant 8 min à 100°C. Enfin, les tubes étaient centrifugés pendant 5 min à 13 000 x g. Les
solutions d’ADN pouvaient être utilisées immédiatement ou conservées à -20°C. Par contre pour les
solutions congelées, elles devaient être agitées et centrifugées 5 min à 13 000 x g avant leur
utilisation.
II.3.B.b. Amplification de l’ADN par polymerase chain reaction (PCR)
Cinq couples d’amorces ont été utilisés pour l’identification des isolats (Tableau 4).
La PCR amplifiant le gène de l’ADNr 16S a été réalisée pour identifier toutes les souches
bactériennes. Les PCR amplifiant les gènes gyrB, ropB et tuf ont été effectuées pour confirmer et
identifier les espèces du genre Vibrio, Pseudomonas et Staphylococcus respectivement. Le mélange
réactionnel de chaque PCR était préparé comme suit : 40,75 µL de nuclease free water (Qiagen,
Courtaboeuf, France), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL de dNTP à 100 mM (Eurobio, Les Ulis,
France), 0,25 µL de chaque amorce à 50 µM (Eurobio) et 0,25 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à
5 U.µL-1 (Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti dans une plaque avec 47,5 µL par puits auquel
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
68
était ajouté 2,5 µL de l’extrait d’ADN. Les conditions de PCR utilisées sont indiquées dans le
tableau 5.
Tableau 4: Couples d'amorces utilisés pour la PCR et le séquençage.
Gènes ciblés Amorces Séquences
5’->3’
Taille de l’amplicon
(pb)
Références
ADN 16S ENV1 AGAGTTTGATIITGGCTCAG 1 484 (Olofsson et al.
2007) ENV2 CGGITACCTTGTTACGACTT
gyrB gyrB3F TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 957 (Yanez et al.
2003) gyrB14R TTGTCCGGGTTGTACTCGTC
UP-1 CAYGCNGGNGGNAARTTYGA 1 200 (Yamamoto et
Harayama
1995)
UP-2r CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT
UP-1S GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA Utilisé pour le
séquençage UP-2Sr AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC
rpoB LAPS TGGCCGAGAACCAGTTCCGCGT 1 247 (Ait Tayeb et al.
2005) LAPS27 CGGCTTCGTCCAGCTTGTTCAG
tuf FTuf ACHGGHRTHGARATGTTCCG 299 adapté de
(Tanaka et al.
2010)
RTuf GTTDTCRCCHGGCATNACCAT
Tableau 5: Conditions de PCR utilisées
Gènes ciblés (amorces) Conditions de PCR
ADNr 16S 95°C/1min ; 35x( 94°C/45s ; 48°C/45s; 72°C/1min); 72°C/10min
gyrB (gyrB3F et gyrB14R) 95°C/1min ; 35x( 94°C/30s ; 55°C/30s; 72°C/1min); 72°C/10min
gyrB (UP1 et UP2r) 95°C/5 min ; 30 x (96°C/1 min ; 56°C/1 min ; 72°C/1 min) ; 72°C/7 min
rpoB 95°C/15min; 35x (94°C/30s; 55°C/30s; 72°C/1min); 72°C/10min
tuf 95°C/15min ; 35x (95°C/10s ; 60°C/1min ; 72°C/1min) ; 72°C/10min
II.3.B.c. Séquençage et analyses bio-informatique
Quinze µL de l’amplicon était mélangé à du tampon de charge (Eurobio) puis déposé dans un gel
d’agarose (Eurobio) à 0,8% (m/v) préparé avec du tampon Tris-Borate-EDTA 10X (Eurobio)
préalablement dilué au 1/10 auquel était ajouté du bromure d’éthidium à 1% (v/m) (BET, Eurobio).
La migration s’effectuait à 125 V pendant 90 min puis le gel était visualisé sous UV. Chaque
échantillon avec un amplicon à la taille attendue (tableau 4) était envoyé à la plateforme Genoscreen
(Lille, France) pour être séquencé par la méthode Sanger. Le séquençage a été réalisé avec l’amorce
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
69
ENV-2 pour les amplicons de la PCR ADNr 16S, les amorces gyrB3F,gyrB14R, UP-1S et UP-2Sr pour les
amplicons de la PCR gyrB, les amorces LAPS et LAPS27 pour les amplicons de la PCR rpoB et les
amorces FTuf et RTuf pour les amplicons de la PCR tuf. Après réception des séquences, elles étaient
nettoyées en supprimant les extrémités comportant des bases non identifiées. Les séquences de
l’ADNr 16S étaient ensuite comparées à la base ADNr 16S du NCBI par l’algorithme BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) et les autres séquences à la base des génomes de référence
(refseq) du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov//refseq/). Seul le résultat avec le pourcentage
d’identité le plus élevé était pris en compte comme suit :
- Si le pourcentage d’identité était supérieur ou égal à 97 % : l’identification était au genre
bactérien
- Si plusieurs résultats avaient un score et un pourcentage d’identité identiques (supérieur ou
égal à 97 %) mais que les genres bactériens correspondants étaient différents :
l’identification n’était pas possible.
- Si le pourcentage d’identité était supérieur ou égal à 99 % : l’identification était à l’espèce
bactérienne.
- Si plusieurs résultats avaient un même score, un pourcentage d’identité de 99 % ou plus et
que les espèces correspondantes étaient différentes, mais le genre bactérien identique :
l’identification se faisait au genre bactérien.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
70
III. Comparaison des performances de différentes techniques
d’identification bactérienne
Les résultats d’identification bactérienne ont été obtenus par la technique MALDI-TOF et par
l’amplification et le séquençage du gène de l’ADNr 16S sur un panel de 501 souches isolées des
produits de la pêche. En premier lieu, l’identification des isolats a été validée après l’analyse des
résultats obtenus par ces deux techniques. En second lieu, elle a pu être complétée et/ou confirmée
par le séquençage d’autres gènes de ménage.
III.1. Techniques MALDI-TOF vs amplification et séquençage de l’ADNr
16S
Au total, 469 isolats ont été identifiés au genre sur les 501 analysées (94 %) par les deux
techniques (Tableau 6). Parmi ces 469 souches, 148 (32 %) ont été identifiées au genre bactérien et
321 (68 %) à l’espèce bactérienne. En examinant les résultats d’identifications bactériennes obtenues
par chaque technique, la technique MALDI-TOF a conduit à l’identification au genre pour 81 % des
isolats et à l’espèce bactérienne pour 50 % des souches alors qu’avec le séquençage de l’ADNr 16S,
c’était 91 % au genre et 37% à l’espèce bactérienne.
Tableau 6: Comparaison des résultats d’identifications des isolats obtenus par la technique MALDI-TOF et par amplification et séquençage de l'ADNr 16S (n = 501). Gen : identification au genre, Esp : identification à l’espèce, - : aucune identification. Lorsqu’aucune comparaison des résultats n’était possible, les cases ont été grisées.
Nombre de
souches
Résultats de l'identification
par technique
Comparaison des résultats
d’identification
par les deux techniques
Validation de
l’identification
MALDI-TOF ADNr 16S Genre Espèce
75 Gen Gen Gen = Gen
Identification au genre
50 - Gen - = Gen
Identification au genre
3 Gen - - = Gen
Identification au genre
20 Esp Eps Gen = Gen Esp ≠ Esp Identification au genre
86 Esp Esp Gen = Gen Esp = Esp Identification à l’espèce
42 - Esp - = Gen - = Esp Identification à l’espèce
38 Esp - Gen = - Esp = - Identification à l’espèce
44 Gen Esp Gen = Gen - = Esp Identification à l’espèce
111 Esp Gen Gen = Gen Esp = - Identification à l’espèce
5 - -
Non identifiée
27 Esp Esp Gen ≠ Gen Esp ≠ Esp Non identifiée
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
71
En comparant les résultats d’identification obtenus par les deux techniques utilisées, trois
scenarii ont conduit à la validation de l’identification au genre bactérien pour 148 des 501 isolats
analysés :
- Pour 51% des isolats, les résultats des deux techniques étaient identiques et ont permis
d’identifier les souches au genre bactérien,
- Pour 36% des souches, une seule des deux techniques a donné un résultat et a permis
d’identifier les souches au genre bactérien,
- Pour 13% des isolats, les résultats d’identification à l’espèce bactérienne étaient discordants
entre les 2 techniques mais identiques au genre bactérien, ce qui a validé l’identification au
genre.
Pour 321 des isolats analysés, trois cas de figures ont permis de les identifier à l’espèce
bactérienne :
- Pour 27% des souches, les résultats d’identification étaient identiques à l’espèce bactérienne
par les deux techniques,
- Pour 25 % des isolats, une seule des deux techniques donnait un résultat d’identification au
genre bactérien et également à l’espèce bactérienne. Nous avons décidé de valider
l’identification à l’espèce bactérienne,
- Pour 48% des isolats, les résultats d’identification étaient identiques au genre bactérien par
les deux techniques mais une seule des techniques donnait aussi un résultat à l’espèce
bactérienne. L’identification était validée à l’espèce bactérienne.
Pour 30 isolats, aucune identification n’a pu être validée car :
- Aucun résultat d’identification n’a été obtenu par les deux techniques pour 13 % des
souches,
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
72
- Les résultats d’identification obtenus étaient discordants pour le genre et l’espèce
bactérienne pour 87 % des souches.
Au total, 44 genres bactériens ont été définis par les 2 techniques. Nous avons analysé plus en
détail les taux d’identification de 12 genres bactériens dont le nombre d’isolats était supérieur à 10
(Tableau 7). Si la proportion de souches identifiées était supérieure à 75 %, nous avons considéré que
le taux d’identification de la technique était bon soit au genre soit à l’espèce. Pour les proportions
comprises entre 25 et 75 %, nous avons considéré que le taux d’identification était moyen et si elles
étaient inférieures à 25%, le taux d’identification était mauvais.
Tableau 7: Taux d’identification des genres bactériens principaux (n>10) par la technique MALDI-TOF et de l’amplification et du séquençage de l’ADNr 16S (n= 373).
Genres bactériens (nombre de souches)
Proportion de souches identifiées par MALDI-TOF (%)
Proportion de souches identifiées par ADNr 16S (%)
Genre Espèce Genre Espèce
Aerococcus (11) 82 73 100 18
Bacillus (155) 86 46 92 22
Brevundimonas (11) 100 73 91 27
Enterococcus (49) 100 100 92 86
Exiguobacterium (55) 29 4 100 89
Lactococcus (10) 100 100 90 80
Macrococcus (11) 91 64 91 0
Proteus (12) 100 58 100 67
Pseudomonas (16) 81 13 94 13
Staphylococcus (15) 93 73 100 80
Stenotrophomonas (18) 78 56 72 17
Vagococcus (10) 80 80 90 50
Total souches analysées (373)
80 52 93 44
Le genre bactérien a été identifié par la technique MALDI-TOF pour toutes les souches de
Brevundimonas, Enterococcus, Lactococcus et Proteus. Au contraire, le taux d’identification des
souches du genre Exiguobacterium était le plus mauvais avec 29 %. Les taux d’identification des
autres genres bactériens étaient bons car ils étaient compris entre 78 % et 93 %. De même, la
technique MALDI-TOF a donné une bonne identification à l’espèce bactérienne pour toutes les
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
73
souches des genres Enterococcus (100 %), Lactococcus (100 %) et Vagococcus (80 %). Par contre, la
technique MALDI-TOF n’était pas efficace pour identifier des espèces dans les genres
Exiguobacterium (4%) et Pseudomonas (13 %). Pour les autres genres bactériens, les taux
d’identification étaient compris entre 46 % et 73 %.
Par la technique du séquençage de l’ADNr 16S, les taux d’identification des genres bactériens
étaient bons pour 11 genres, avec même 100% pour Aerococcus, Enterococcus, et Proteus, et
intermédiaire pour Stenotrophomonas. Par ailleurs, les taux d’identification des espèces bactériennes
étaient bons pour les espèces des genres Exiguobacterium (89 %), Enterococcus (86 %), Lactococcus
(80%) et Staphylococcus (86 %). Par contre, aucune espèce du genre Macrococcus n’a été identifiée
par le séquençage de l’ADNr 16S. De plus, les taux d’identification des espèces étaient mauvais pour
les genres Pseudomonas (13 %), Stenotrophomonas (17 %), Aerococcus (18 %) et Bacillus (22 %).
En outre, il y a 27 des souches pour lesquelles les 2 techniques n’ont pas donné le même
genre bactérien. Pour 9 de ces 27 isolats, il y a des discordances au niveau de l’identification entre
des genres Gram positif et Gram négatif comme par exemple pour 5 isolats qui sont identifiés au
genre Gram négatif Exiguobacterium par la technique du séquençage de l’ADNr 16S et identifiés
comme des genres Gram positif (Bacillus, Macrococcus, Staphylococcus, Lactococcus) par la
technique MALDI-TOF.
De plus, des discordances ont été observées lors de l’identification à l’espèce au sein d’un
même genre bactérien comme par exemple dans les genres Enterococcus et Proteus. En effet,
4 isolats du genre Enterococcus ont été identifiés à l’espèce comme E. casselifavus et 4 isolats du
genre Proteus comme P. vulgaris par la technique MALDI-TOF alors qu’ils étaient identifiés comme
E. gallinarum et P. terrae par le séquençage de l’ADNr 16S.
Enfin, 1 % des souches n’ont pas été identifiés par aucune des deux techniques.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
74
III.2. Complément d’identification par les autres gènes de ménage gyrB,
rpoB et tuf
L’identification par l’amplification et le séquençage des gènes de ménage gyrB, rpoB et tuf a
été réalisée pour confirmer les espèces bactériennes de 33 souches. Les amorces du gène gyrB ont
été utilisées pour amplifier et séquencer le genre Vibrio., rpoB pour Pseudomonas et tuf pour
Staphylococcus.
Le séquençage du gène gyrB a été effectué pour 2 souches du genre Vibrio mais aucune
identification n’a été possible.
De même, l’amplification et le séquençage du gène rpoB a été effectué sur 16 souches de
Pseudomonas. L’identification du genre Pseudomonas a été confirmée pour 6 souches. De plus, une
souche identifiée au genre par la technique MALDI-TOF et le séquençage de l’ADNr 16S a été
identifiée à l’espèce P. alcaliphila par le séquençage du gène rpoB.
L’amplification et le séquençage du gène tuf a été réalisés sur 15 souches du genre
Staphylococcus. Le genre bactérien a été confirmé pour 13 souches et l’espèce bactérienne a
également été confirmée pour 6 souches.
III.3. Discussion
L’identification bactérienne par la technique MALDI-TOF a montré l’avantage d’être rapide et
simple d’utilisation. Cependant, cette technique est basée sur la comparaison du spectre protéique
de la souche à identifier aux spectres de référence présents dans une base de données.
L’identification au genre était bon (81 %) sur le panel étudié par cette technique mais moins
performant (50%) pour l’espèce bactérienne. Les conditions de culture (gélose, température et
temps d’incubation) et d’extraction des protéines des isolats influent fortement les spectres
protéiques obtenus. C’est pourquoi il est important que les souches à identifier soient préparées
dans les mêmes conditions que celles utilisées pour établir les spectres de référence (Bohme et al.
2010, Bohme et al. 2011). Dans ces travaux, la flore bactérienne a été isolée et cultivée à des
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
75
températures variables qui ne sont pas automatiquement celles utilisées pour l’obtention des
spectres de référence (de 25 °C à 37°C). Ces différences ont pu entraîner une perte de précision ou
des erreurs d’identification de certaines souches par la technique MALDI-TOF. Elles peuvent
également expliquer les désaccords d’identification observés lors de la comparaison entre les
résultats obtenus par la technique MALDI-TOF et ceux avec les techniques d’amplification et de
séquençage des gènes de ménage.
L’amplification et le séquençage de gènes de ménage pour l’identification bactérienne est
une technique couramment utilisée. Ces gènes sont présents dans le génome de toutes les bactéries
et leurs séquences peuvent être spécifiques à une espèce bactérienne (Mollet et al. 1997, Drancourt
et al. 2000). Le séquençage du gène de l’ADNr 16S est le plus utilisé. Plusieurs travaux scientifiques
sur la flore bactérienne de truites, de baudroies, ou de filets de dorade ont utilisé ce gène pour
l’identification bactérienne (Haygood et al. 1992, Kim et al. 2007, Parlapani et al. 2015). Dans nos
travaux, le taux d’identification au genre était bon (91 %) et supérieur à celui obtenus par la
technique MALDI-TOF. Par contre, pour l’identification à l’espèce bactérienne, la technique
d’amplification et de séquençage de l’ADNr 16S était faible (37 %) vs la technique MALDI-TOF.
Cependant, des résultats d’identification à l’espèce ou au genre étaient différents entre les deux
techniques. Ces différences peuvent être dues à une imprécision interne à la technique
d’identification utilisée comme des séquences ou de spectres protéiques de différentes espèces trop
proches pour être discriminées, erreurs dans les spectres/chromatogrammes de référence, absence
de références. De plus, le gène de l’ADNr 16S est présent en plusieurs copies avec des séquences
hétérogènes sur le chromosome bactérien. L’amplification par PCR de ce gène va entraîner
l’apparition de plusieurs amplicons de séquences différentes. Le chromatogramme obtenu par le
séquençage donne une séquence compilant les différentes séquences des amplicons. Il en résulte
une perte d’information avec les séquences de l’ADNr 16S des différentes copies du gène. La
comparaison de cette séquence « chimère » avec celles des génomes de référence dans les bases de
données peut entraîner une identification moins précise (Wang et Wang 1997).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
76
De plus, la technique du MALDI-TOF et celle de l’amplification et du séquençage des gènes de
ménage ont des difficultés à discriminer des espèces dans certains genres bactériens. C’était le cas
par exemple pour les genres Bacillus, Pseudomonas et Aeromonas. La faible diversité de spectres de
référence de certaines espèces bactériennes présentes dans la base de données de l’appareil MALDI-
TOF peut entrainer une identification à l’espèce faussement précise. En effet, la technique MALDI-
TOF a permis d’identifier des souches à l’espèce Bacillus altidunis, à la différence du séquençage de
l’ADNr 16s qui ont identifié ces mêmes souches comme B. altidunis, B. xianamensis, B. aerius ou B.
stratosphaericus, or les trois dernières espèces bactériennes ne sont pas présentes dans la base de
données du MALDI-TOF.
Des discordances d’identification ont également été observées entre les 2 techniques c’est
pourquoi nous avons amplifié et séquencé d’autres gènes de ménage comme gyrB, et rpoB qui sont
en monocopie et le gène tuf qui est en une ou deux copies (Venkateswaran et al. 1998, Ait Tayeb et
al. 2005, Tanaka et al. 2010). L’amplification du gène gyrB n’a pas été efficace pour identifier le genre
Vibrio. Pourtant lors d’études préliminaires au laboratoire, nous avions eu une bonne identification
des espèces V. parahaemolyticus et V. alginolyticus. Ces différences peuvent s’expliquer par le fait
que le genre Vibrio comporte 142 espèces donc potentiellement 142 structures différent du gène qui
seront plus ou moins bien ciblés par les amorces que nous avons utilisé. De plus, à l’origine les
amorces ont été dessinées pour pouvoir identifier le genre Aeromonas ou des espèces du groupe
Pseudomonas putida, et il semble que ces amorces ne soient pas utilisables pour identifier toutes les
espèces du genre Vibrio (Yamamoto et Harayama 1995, Yanez et al. 2003). En ce qui concerne le
genre Pseudomonas, Ait Tayeb et al. (2005) ont montré que le séquençage du gène rpoB était plus
efficace que celui du gène de l’ADNr 16S pour identifier les différentes espèces du genre
Pseudomonas. Cependant, même si plus de souches de Pseudomonas ont été identifiées à l’espèce
par le séquençage du gène rpoB que par le séquençage du gène de l’ADNr 16S, des différences
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
77
d’identification d’espèces entre les gènes ADNr 16S et rpoB ont été observées. Ces différences
concernaient principalement les espèces du groupe P. fluorescens. Enfin, les amorces dessinées pour
amplifier et séquencer le gène tuf ont été efficaces pour identifier les espèces de Staphylococcus.
L’espèce S. aureus a pu être identifiée grâce aux amorces utilisées pour le gène tuf alors que ni la
technique MALDI-TOF, ni l’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S ne les avait identifiées.
Toutefois, la pertinence des identifications par la technique MALDI-TOF et celle de
l’amplification et du séquençage des gènes de ménage est liée aux spectres/séquences de référence,
à la taille des bases de données et à leur fiabilité. En effet, l’identification bactérienne par la
technique MALDI-TOF a d’abord été développée pour l’identification de bactéries isolées de patients
dans le milieu médical. La base de données contient donc majoritairement des spectres de référence
d’espèces bactériennes pathogènes pour l’homme, et il y a peu de spectres de souches bactériennes
environnementales et alimentaires. En outre, les chromatogrammes obtenus lors du séquençage
sont comparées à des bases de données comme par exemple celle de la collection de nucléotide du
NCBI qui est publique. Des erreurs d’annotations sont possibles, diminuant la fiabilité de ces bases
pour l’identification bactérienne. Il est important que des critères de fiabilité soient définies au
niveau international pour que les bases de données de séquences puissent être curées afin d’avoir
une bonne identification des souches. De plus, la base de données de l’appareil MALDI-TOF est plus
récente et moins développée que celles des séquences de l’ADNr 16S. En effet, il y avait 2 185
espèces dans la base de données du MALDI-TOF, plus de 14 800 séquences d’ADNr 16S d’espèces
différentes et plus de 52 483 génomes de références bactériens dans les bases du NCBI. Par exemple,
il y avait une bonne identification des espèces Enterococcus spp. par la technique MALDI-TOF et celle
du séquençage de l’ADNr 16S. Au contraire, la technique MALDI-TOF n’était pas capable d’identifier
les souches Exiguobacterium spp. et le séquençage de l’ADNr 16S l’était. D’ailleurs, seule l’espèce
Exiguobacterium aurantiacum était présente dans la base de données du MALDI-TOF.
L’enrichissement des bases de données de spectres protéiques pour la technique du MALDI-TOF
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
78
permettrait de donner de la force à cette technique pour l’identification d’isolats bactériens
environnementaux.
Les techniques que nous avons employé, dans ces travaux, pour identifier les souches
bactériennes à l’espèce ont chacune leurs avantages et leur inconvénients. En conclusion, il apparait
que l’utilisation de deux techniques soit le minimum pour une bonne identification de la flore
bactérienne cultivable de l’écosystème marin. En effet, il apparait important d’employer une
technique comme le séquençage de l’ADNr 16S pour identifier un large spectre de genres bactériens
et une technique, comme par exemple MALDI-TOF, autres gènes de ménage rpoB/tuf/gyrB, pour
identifier/confirmer à l’espèce selon le genre bactérien obtenu. Cependant, des difficultés
demeurent pour identifier les espèces bactériennes de certains genres comme Pseudomonas ou
Bacillus et de nombreuses souches n’ont pas pu être identifiées au genre ou à l’espèce bactérienne.
IV. Identification des souches isolées des produits de la pêche et
performance de la sélectivité des géloses
Les échantillons de produits de la pêche ont été préparés et un enrichissement dans un bouillon
nutritif à 30°C a été effectué. Suite à l’enrichissement et à l’isolement sur des milieux sélectifs, une
colonie de chaque morphologie différente a été gardée et identifiée par la technique MALDI-TOF
et/ou par séquençage de gènes de ménage.
IV.1. Identification des isolats
La technique MALDI-TOF a été utilisée pour l’identification des souches isolées des lots de
crevettes, de homards, de mollusques bivalves et des poissons plats et sur les géloses TBX, Brillance
Salmonella, Slanetz & Bartley et ChromID®. Au total, 548 isolats ont été identifiés par cette technique
dont 200 identifiés au genre bactérien et 348 à l’espèce bactérienne.
En parallèle, l’identification bactérienne par l’amplification et le séquençage du gène de
l’ADNr 16S a été effectuée sur tous les isolats de cette étude (n = 1882 souches). Parmi ces souches,
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
79
692 (37 %) ont été identifiées au genre et 763 (41 %) à l’espèce. De plus, ces résultats ont été
complétés pour 289 souches par l’amplification et le séquençage des gènes de ménage gyrB, rpoB et
tuf. Le séquençage du gène gyrB a confirmé 7 souches au genre Vibrio sur 63 analysées. De plus, une
identification plus précise à l’espèce V. metschnikovii a été obtenue pour deux souches. Deux
souches n’ont pas été confirmées Vibrio mais ont été identifiées comme Acinetobacter sp. et
Morganella morganii. De même, l’amplification et le séquençage du gène rpoB a été effectué sur
150 souches de Pseudomonas. Nous avons pu obtenir une identification au genre bactérien pour
80 souches. L’espèce bactérienne obtenue par la technique MALDI-TOF et/ou séquençage de
l’ADNr 16s a été confirmée pour 2 souches (P. stutzeri et P. putida). Treize souches ont été identifiées
à l’espèce par le séquençage du gène rpoB (5 isolats P. fluorescens, 4 souches P. putida, 2 souches
P. fragi, 1 souche P. alcaliphila et 1 souche P. synthaxa). Cependant, 6 autres souches ont été
identifiées P. fluorescens par le séquençage du gène rpoB alors que les techniques MALDI-TOF et/ou
séquençage de l’ADNr 16S les avaient identifiées P. brennerii ou P. helmanticensis. L’amplification et
le séquençage du gène tuf a été réalisé sur 76 souches de Staphylococcus. Le genre bactérien a été
confirmé pour 68 souches et l’espèce bactérienne a également été confirmée pour 30 souches. De
plus, 18 souches ont pu être identifiées jusqu’à l’espèce grâce à cette technique, dont l’espèce
S. aureus (10 souches) qui n’a pas été identifiée par le séquençage de l’ADNr 16S.
IV.2. Performance de la sélectivité des géloses
Dans ces travaux, la sélectivité des milieux sélectifs a été étudiée. Les bactéries isolées des
produits de la pêche et de l’aquaculture sur les milieux sélectifs ont été comparés à ceux décrits dans
les fiches techniques des géloses. Au total, 1882 colonies ont été isolées à partir des 14 géloses
sélectives (Tableau 8).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
80
Tableau 8: Nombre d'isolats pour chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés (n = 1882). Les cases grises correspondent à l’absence d’isolats, les cases vertes aux genres bactériens ciblés par les géloses sélectives, les cases orange aux genres bactériens non ciblés mais décrits dans les fiches techniques des géloses et les cases blanches aux genres bactériens non décrits dans les fiches techniques des géloses.
Ordres bactériens Genres bactériens
(n=1882)
Géloses sélectives* Géloses ChromID®* Total
souches TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Bacilliales
Bacillus 94 22 1 74 7 24 222
Brochothrix 4 4
Exiguobacterium 8 54 57 1 1 121
Halobacillus 3 3
Kurthia 2 1 5 8
Lysinibacillus 8 8 1 17
Macrococcus 16 11 1 28
Paenibacillus 1 1
Planococcus 1 1
Salinicoccus 1 1
Savagea 1 1
Staphylococcus 1 25 1 15 14 32 1 1 90
Virgibacillus 1 6 7
Micrococcales
Arthrobacter 4 11 15
Cellulosimicorbium 2 2
Kocuria 1 1
Microbacterium 7 1 8
Micrococcus 2 2 4
Rothia 5 1 1 7
Lactobacilliales
Aerococcus 19 28 2 13 33 3 98
Carnobacterium 8 8
Desemzia 1 13 15 1 30
Enterococcus 3 27 76 11 5 1 1 6 4 2 15 151
Lactococcus 10 10 2 2 1 25
Streptococcus 4 7 11
Vagococcus 47 13 11 7 27 105
Enterobacterales
Citrobacter 3 9 1 1 1 15
Enterobacter 2 2 1 5
Escherichia 4 4 8
Hafnia 1 2 3
Klebsiella 2 1 3
Kluyvera 3 2 1 6
Lelliottia 3 3
Moellerella 1 1 1 3
Morganella 11 10 8 3 9 41
Pantoea 4 1 5
Proteus 6 14 21 21 17 1 12 1 93
Providencia 2 4 4 2 2 1 1 16
Serratia 8 5 5 1 3 7 29
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
81
Ordres bactériens Genres bactériens
(n=1882)
Géloses sélectives* Géloses ChromID®* Total
souches TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Rahnella 1 1 2
Yersinia 1 1 2 4
Pseudomonadales
Acinetobacter 1 4 5 3 10 1 24
Psychrobacter 2 1 14 8 25
Pseudomonas 3 1 14 1 53 1 2 21 6 16 12 130
Aeromonadales Aeromonas 2 12 2 14 4 34
Oceanimonas 2 2
Vibrionales Vibrio 31 27 16 74
Xanthomonadales Stenotrophomonas 5 2 10 9 1 27
Alteromonadales Shewanella 2 1 20 10 12 45
Pseudoalteromonas 1 1
Oceanospirillales Halomonas 2 4 6
Flavobacteriales Myroides 2 6 8
Chryseobacterium 2 2
Sphingobacteriales Sphingobacterium 2 2
Caulobacterales Brevundimonas 11 2 1 21 35
Rhizobiales Pseudochrobactrum 2 2
Ochrobactrum 1 1 2
Non identifiées 1 11 45 9 13 34 34 38 41 15 10 4 3 259
Total souches 27 78 392 147 113 156 237 345 174 6 53 39 37 78 1882
Nombre de genres
par gélose 10 15 28 8 14 17 22 23 25 1 5 6 6 11
* TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL=
ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA=
ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA.
Le nombre d’isolats de caractéristiques morphologiques (forme, couleur, taille) différentes
prélevées sur les géloses ChromID® allait de 6 colonies différentes sur la gélose ChromID®OXA-48 à
78 colonies sur la gélose ChromID®MRSA. L’identification de tous les isolats prélevés sur la gélose
ChromID®OXA-48 a été obtenue alors que 28 % des isolats prélevés sur la gélose ChromID®ESBL
n’ont pas été identifiés. Le nombre d’isolats de caractéristiques différentes prélevés sur les autres
géloses sélectives variait de 27 sur le milieu TBX à 392 sur le milieu PEMBA. Les proportions d’isolats
non identifiés par gélose allaient de 4 % pour le milieu TBX à 24 % pour la gélose GSP.
Les isolats prélevés sur les géloses Brillance salmonella, CFC, GSP , ChromID®BLSE,
ChromID®Carba, ChromID®VRE et TBX étaient des bactéries Gram négatif, pour 100 %, 99 % 93 %, 89
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
82
%, 87 % et 75 % respectivement. Les isolats identifiés sur les autres géloses étaient majoritairement
des bactéries Gram positif, 96 % des isolats obtenus sur les milieux ChromID®MRSA, 93 % sur Slanetz
& Bartley, 77 % sur ALOA, 71 %sur PEMBA, 70 % sur Chapman et 50 % sur TCBS.
La diversité des genres bactériens isolés sur les géloses ChromID® était faible (1 à 11 genres
bactériens identifiés). La performance d’isolement des genres bactériens ciblés par ces milieux
spécifiques était faible allant de 0 à 13 % selon les géloses. Les genres bactériens non ciblés, mais
décrits dans les fiches techniques, représentaient de 0 à 50 % des isolats obtenus sur les différentes
géloses ChromID®. La plus sélective était la gélose ChromID®OXA-48, seulement 6 isolats de
Pseudomonas sp. ont été obtenus. L’isolement de ce genre bactérien sur cette gélose n’était pas
décrit sur la fiche technique du produit. Au contraire, la gélose ChromID®MRSA était la moins
sélective des ChromID® avec 78 isolats prélevés et 11 genres bactériens identifiés. Une seule souche
de Staphylococcus stepanovicii a été isolée de cette gélose. Elle était blanche et non caractéristique.
Bacillus spp. (30 %) et Enterococcus spp. (19 %) ont également été isolés sur la gélose
ChromID®MRSA. Selon le fournisseur, ces genres peuvent être isolés de ce milieu sélectif. De plus,
35 % des isolats étaient des Vagococcus spp., un genre bactérien qui n’était pas décrit dans la fiche
technique du produit. Sur la gélose ChromID®ESBL, cinq genres bactériens ont été identifié donc
Serratia (n=7) qui était le seul identifié ciblé par cette gélose. Trois colonies étaient caractéristiques
(bleu-vert) mais les autres étaient blanches. Cependant, la majorité des souches isolées de cette
gélose étaient Pseudomonas (30 %) et Stenotrophomonas (19 %). L’isolement de Pseudomonas était
décrit dans la fiche technique du produit mais pas Stenotrophomonas. De même, une seule souche
de Citrobacter freundii a été isolée sur la gélose ChromID®CARBA. Bien que ce genre bactérien soit
ciblé, la colonie ne présentait pas la couleur caractéristique bleu-vert mais elle était blanche. De plus,
la majorité des souches isolées ont été identifiées comme Pseudomonas spp. (31 %) et
Stenotrophomonas spp. (23 %), comme sur la gélose ChromID®ESBL. Le genre ciblé par cette gélose
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
83
était Pseudomonas mais pas Stenotrophomonas. En outre, 4 souches ont été isolées et identifiées
comme le genre Enterococcus sur la gélose ChromID®CARBA ce qui correspond au genre ciblé décrit
dans la fiche technique. Par ailleurs, six genres bactériens ont été isolés à partir de la gélose
ChromID®VRE, le genre principal ciblé par cette gélose était Enterococcus. Deux souches ont été
identifiées comme E. thailandicus avec des colonies blanches et non caractéristiques sur le milieu. La
majorité des isolats étaient des Brevundimonas spp. (58 %) et ce genre bactérien n’était pas attendu
sur cette gélose.
En ce qui concerne les géloses autres que les milieux ChromID®, les plus sélectives étaient le
TBX et la Slanetz & Bartley car moins de 10 genres bactériens différents ont été identifiés sur
chacune d’elles. Au contraire, une diversité bactérienne plus ou moins importante a été observée sur
les autres géloses allant de 14 genres bactériens sur l’ALOA à 28 genres sur le PEMBA. Les
proportions des genres ciblés, isolés sur les géloses utilisés, allaient de 0 à 52 %. La gélose Slanetz &
Bartley était la plus performante pour isoler le genre bactérien cible Enterococcus. Il représentait
52 % des isolats prélevés sur cette gélose. Selon les genres bactériens ciblés, Bacillus représentait 24
% des isolats sur le milieu PEMBA, Pseudomonas 34 et 12 % des isolats sur les géloses CFC et GSP
respectivement, Vibrio 13 % des isolats sur le milieu TCBS, Staphylococcus 9 % des isolats sur le
milieu Chapman et Aeromonas 8 % des isolats sur la gélose GSP. La totalité des autres genres
bactériens isolés sur les géloses Slanetz & Bartley (48 %), TBX (85 %), Chapman (91 %) et GSP (80 %)
n’étaient pas décrits dans les fiches techniques des milieux de culture. Les proportions les plus
importantes d’isolats bactériens non décrits étaient Aerococcus (19 %) sur la gélose Slanetz &
Bartley, Enterobacteriales (63 %) sur le TBX, Exiguobacterium (17 %) sur la gélose Chapman et Vibrio
(9 %) sur la gélose GSP, Vagococcus (12 %) sur la gélose PEMBA, Staphylococcus (13 %) sur le milieu
ALOA Proteus (13 %) sur la gélose CFC et Exiguobacterium (23 %) sur la gélose TCBS. La majorité des
colonies isolées sur la gélose Brillance salmonella (99 %) étaient des Enterobacterales. Les genres
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
84
bactériens attendus sur la gélose Brillance Salmonella représentaient 45 % des isolats, les autres
(55 %) n’étaient pas décrits sur la fiche technique du produit.
Lors de l’analyse de résultats d’identification à l’espèce, les plus importantes diversités ont
été observées sur les milieux PEMBA (57 espèces) et Chapman (56 espèces) (Annexe I). Certaines des
espèces isolées de ces géloses étaient de potentiels pathogènes alimentaires (B. cereus, E. coli,
S. aureus) (Tableau 9). D’autres espèces isolées étaient des marqueurs d’hygiène
(Staphylococcus spp., E. coli, Enterococcus faecalis et E. faecium).
Tableau 9: Nombre d'isolats par gélose des espèces bactériennes. Les espèces présentées appartiennent aux genres bactériens avec plus de 100 isolats et aux genres bactériens dont au moins une espèce est potentiellement un pathogène alimentaire. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.
Genres bactériens
Espèces bactériennes
Géloses sélectives* ChromID®* Total souch
e TB
SA
PE
SL AL
CF
TC
CH
GS
OX
ES
CA
VR
MR
Bacillus
B. altitudinis 1 2 3
B. aquimaris 1 1
B. cereus 12
6 8 5 17 48
B drentensis 1 1
B. firmus 5 5
B. flexus 1 1
B. horikoshii 1 1
B. infantis 1 1
B. invictae 1 1
B. licheniformis 1 4 2 7
B. marisflavii 5 5
B. megaterium 1 1
B. nealsonii 3 3
B. oceanisediminis 7 7
B. oshimensis 1 1
B. paralicheniformis 1 1 2
B. pumilus 8 3 6 17
B. safensis 1 1
B. stratosphericus 3 3
B. subtilis 7 1 8
B. thuringiensis 2 1 3
B. vallismortis 1 1
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
85
Genres bactériens
Espèces bactériennes
Géloses sélectives* ChromID®* Total souch
e TB
SA
PE
SL AL
CF
TC
CH
GS
OX
ES
CA
VR
MR
B. xianamensis 1 1
Bacillus sp. 59
5 1 28 2 5 100
Nombre d’espèces Bacillus 8 5 18 1 3
Exiguobacterium
E. acetylicum 2 4 6
E. aestuarii 4 33
30 1 1 69
E. aurantiacum 4 2 6
E. marinum 3 4 7
E. profundum 1 3 5 9
Exiguobacterium sp. 1 11
12 24
Nombre d’espèces Exiguobacterium 3 4 5 1 1
Staphylococcus
S. aureus 2 1 2 3 8
S. cohnii 3 1 4
S. epidermidis 2 1 3
S. equorum 3 4 7
S. haemolyticus 2 1 3
S. hominis 1 1
S. lentus 3 5 7 1 16
S. pasteuri 5 3 8
S. saprophyticus 1 2 1 4
S. sciuri 2 3 4 2 11
S. stepanovicci 1 1
S. warneri 1 3 4
Staphylococcus sp. 3 5 2 10 20
Nombre d’espèces Staphylococcus 1 8 1 5 4 8 1 1
Enterococcus
E. aquamarinus 1 1 2
E. casseliflavus 1 7 8
E. durans 1 1
E. faecalis 2 7 29
3 5 4 3 9 69
E. faecium 1 3 6 1 11
E. gallinarum 2 2
E. italicus 1 1 2
E. malodoratus 1 5 6
E. thailandicus 7 21
5 1 1 1 1 2 2 41
Enterococcus sp. 5 5 2 1 3 16
Nombre d’espèces Enterococcus 2 7 8 3 1 1 1 2 2 1 3
Vagococcus
V. carniphilus 6 6
V. fluvialis 26
5 7 6 22 66
V. lutrae 2 2
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
86
Genres bactériens
Espèces bactériennes
Géloses sélectives* ChromID®* Total souch
e TB
SA
PE
SL AL
CF
TC
CH
GS
OX
ES
CA
VR
MR
V. penaei 2 2 1 5
Vagococcus sp.
13 6 2 1 4
26
Nombre d’espèces Vagococcus 3 2 2 1 2
Pseudomonas
P. alcaliphila 1 1
P. brenneri 1 1 4 1 4 11
P. cichorii 2 1 2 5
P. fluorescens 2 5 7
P. fragi 1 1 2
P. frederikbergensis 1 1
P. helmanticensis 2 1 1 4
P. libanensis 1 1
P. marginalis 2 2 4
P. mendocina 1 1
P. mosselii 1 1
P. putida 3 1 1 5
P. stutzeri 2 1 3
P. tolaasii 1 1 2
P. trivialis 1 1
P. weihenstephanensis
1 1 2
Pseudomonas sp. 1 1 7
30 1
12 6
12 9
79
Nombre d’espèces Pseudomonas 1 5 1 11
2 5 4 2
Vibrio
V. alginolyticus 5 3 8
V. casei 1 1
V. metschnikovii 10
6 8 24
V. mytili 1 1
V. natriegens 2 2
Vibrio sp. 14
16 8 38
Nombre d’espèces Vibrio 3 4 1
Escherichia E. coli 4 3 7
E. hermanii 1 1
Nombre d’espèces Escherichia 1 1
* TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL=
ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA=
ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
87
Les bactéries du genre Bacillus ont été isolées principalement sur 4 géloses, PEMBA (42 %),
Chapman (33 %), ChromID®MRSA (11 %) et ALOA (10 %). La diversité des espèces de Bacillus isolées
sur la gélose Chapman (18 espèces) était plus importante que celle obtenue sur la gélose PEMBA (8
espèces) ou l’ALOA (5 espèces). Sur la gélose Chapman, les colonies de Bacillus spp. étaient roses ou
jaunes alors que sur le milieu PEMBA, elles étaient blanches, bleues, vertes ou jaunes. Pour l’espèce
pathogène alimentaire B. cereus, des colonies ont été détectées sur 5 milieux sélectifs,
ChromID®MRSA (35 % des isolats), PEMBA (25 %), Chapman (17 %), ALOA (13 %) et GSP (10 %). Les
colonies de cette espèce étaient caractéristiques (bleue) ou non caractéristiques (vertes) sur le milieu
PEMBA, turquoise ou blanches sur le milieu ALOA, blanche sur le milieu ChromID®MRSA et roses ou
jaunes sur le milieu Chapman.
Les souches du genre Staphylococcus ont été isolées majoritairement sur les géloses
Chapman (36 %), PEMBA (28 %), ALOA (17 %) et TCBS (16 %). Huit espèces de ce genre ont été
isolées sur les géloses Chapman et PEMBA, 4 sur ALOA et 5 sur TCBS. Les colonies étaient jaunes,
roses et orange sur le milieu Chapman et jaunes ou vertes sur le milieu PEMBA, turquoise, jaunes et
blanches sur le milieu ALOA et vertes sur le milieu TCBS. Les colonies de l’espèce pathogène
alimentaire S. aureus étaient jaunes (colonies caractéristiques) ou orange sur le milieu Chapman,
jaunes sur le milieu PEMBA, blanches sur le milieu ALOA et jaunes ou vertes sur la gélose TCBS.
Pour le genre Enterococcus, les colonies ont été isolées principalement sur la gélose selon
Slanetz & Bartley (50%) puis à 19 % sur le milieu PEMBA et 10 % sur la gélose ChromID®MRSA. Huit
espèces de ce genre ont été isolées sur la gélose Slanetz & Bartley, 7 sur le milieu PEMBA et 3 sur la
gélose ChromID®MRSA. Les espèces E. faecalis et E. faecium sont des marqueurs de contamination
fécale. Elles font des colonies roses/rouges/bordeaux sur la gélose Slanetz & Bartley (colonies
caractéristiques), jaunes ou blanches sur le milieu PEMBA et turquoise sur le milieu ChromID®MRSA.
Pour le genre Vibrio, les isolats ont été détectés sur les milieux TCBS (42 %), Chapman (36 %)
et GSP (22 %). Un enrichissement a été réalisé dans du bouillon EPSA pour sélectionner ce genre
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
88
bactérien puis isolé sur le milieu TCBS (colonies vertes ou jaunes), sur le milieu Chapman (colonies
jaunes ou roses) et sur le milieu GSP (colonies roses ou jaunes). Aucune espèce pathogène
alimentaire du genre Vibrio n’a été isolée. Sur le milieu TCBS, 3 espèces ont été identifiées, 4 sur la
gélose Chapman et seul V. metschnikovii a été isolée sur la gélose GSP.
Les souches de Pseudomonas spp. ont été majoritairement isolées sur les milieux CFC (41 %),
GSP (16 %), ChromID®BLSE (12 %), PEMBA (11 %) et ChromID®CARBA (9 %) avec une diversité
d’espèces de 2 sur la gélose ChromID®CARBA à 11 sur le milieu CFC. Les colonies de Pseudomonas
spp. étaient roses sur le milieu GPS, marron/beiges sur la gélose ChromID®BLSE, jaunes et vertes sur
le milieu PEMBA et blanches, jaunes ou jaune fluo sur le milieu CFC.
Des colonies Escherichia coli potentiellement pathogènes pour l’homme, de couleur
turquoise (colonies caractéristiques) et blanche, ont été isolées sur le milieu TBX (50 %) et de couleur
incolore ou beige sur le milieu Brillance Salmonella (50 %).
Deux genres bactériens, Exiguobacterium et Vagococcus, ont été également fréquemment
isolés, plus de 100 souches par genre. Les souches du genre Exiguobacterium ont été principalement
isolées des géloses Chapman (47 %) et TCBS (45 %). La diversité bactérienne obtenue pour ce genre
bactérien sur ces géloses était similaire. Les colonies de ce genre bactérien apparaissaient en grande
majorité jaunes sur les deux géloses, parfois roses sur le milieu Chapman ou vertes sur le milieu
TCBS. L’espèce majoritaire E. aestuarii a été isolée à 43 % du milieu TCBS et 49 % du milieu Chapman.
Les souches de Vagococcus spp. ont été isolées majoritairement des géloses PEMBA (45 %),
ChromID®MRS (26 %), Slanetz & Bartley (12 %), et TCBS (10 %). Les colonies de Vagococcus spp.
étaient jaunes, vertes ou bleues sur PEMBA, roses, rouges, bordeaux sur Slanetz & Bartely et jaunes
ou vertes sur TCBS. Sur la gélose ChromID®MRSA, elles formaient des microcolonies blanches ou
vertes. L’espèce V. fluvialis a été isolée majoritairement des géloses PEMBA (39 %) et
ChromID®MRSA (33 %).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
89
IV.3. Discussion
Une première étape de sélection de la flore bactérienne présente dans les produits de la
pêche et de l’aquaculture a été faite par l’enrichissement à 30 °C dans un bouillon nutritif. Cette
température a favorisé la croissance et la sélection de la flore mésophile. De plus, tous les
échantillons ont été congelés avant d’être analysés. Cette étape est stressante pour les bactéries et
elles ont pu entrer en état viable non cultivable (Semanchek et Golden 1998). En raison des étapes
de congélation et d’enrichissement, des genres bactériens comme Aeromonas, Shewanella et Vibrio,
considérés comme naturellement présents dans le milieu aquatique était attendu dans plus de
produits (Ronholm et al. , Poirel et al. 2004, Richards et al. 2008, Janda et Abbott 2010, Usui et al.
2016, Baker-Austin et al. 2017, Baron et al. 2017a, Ceccarelli et al. 2017). Cependant, l’utilisation
d’un bouillon nutritif salé, EPSA, a favorisé la sélection de bactéries halophiles comme certaines
espèces de Vibrio spp. En effet, Vibrio spp. a été isolé sur les géloses TCBS, Chapman et GSP qui ont
été ensemencées à partir du bouillon EPSA enrichi. De plus, les échantillons de homard et de noix de
Saint-Jacques ont été préparés comme décrit dans la norme ISO/TS 21872-1 et 2 de détection des
Vibrio pathogènes alimentaires pour l’homme, ce qui aurait pu favoriser la sélection de certaines
espèces de ce genre.
La diversité bactérienne observée peut en partie s’expliquer par le nombre et la sélectivité
des agents sélectifs présents dans les différentes géloses utilisées. En effet, ces agents sélectifs sont
utilisés pour empêcher la croissance de bactéries non ciblées sur la gélose. Cependant, plusieurs
genres/espèces bactériennes peuvent également être résistants à l’agent sélectif. Par exemple, dans
la gélose Slanetz & Bartley, l’azide de sodium est utilisé comme agent sélectif. Ce sel inhibe la
croissance de la plupart des bactéries Gram négatif et quelques genres bactériens Gram positif,
comme Bacillus. Les genres bactériens qui ont pu être isolés sur cette gélose comme Staphylococcus,
Aerococcus, Streptococcus, sont naturellement résistants à l’azide de sodium (Lichstein et Soule
1944). De même, la polymyxine B est utilisée dans la gélose PEMBA et cet antibiotique est inactif sur
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
90
les bactéries Gram positif et certaines bactéries Gram négatif comme Proteus spp. et Morganella
spp. Il est donc normal d’avoir des variétés bactériennes différentes selon les géloses utilisées.
De plus, sur les géloses sélectives les espèces ou les genres bactériens ciblés sont mis en
évidence visuellement grâce à leurs caractéristiques biochimiques. Par exemple, sur la gélose Slanetz
& Bartley, Enterocccus spp. réduit le chlorure de tétrazolium, donnant aux colonies une couleur
rouge/marron. Les bactéries ne pouvant pas réduire ce sel donnent des colonies roses. Cependant, la
fiche technique du produit indique que des souches d’Enterococcus spp. ne sont pas capables de
réduire ce sel, ce qui a été noté dans cette étude. De même, un substrat chromogénique est utilisé
dans la gélose ALOA, pour mettre en évidence la production d’une β-glucosidase. Les colonies de
Listeria spp. sont colorées en turquoise. Cependant, dans cette étude, aucune Listeria n’a été
identifiée et des colonies de Bacillus spp. turquoise ont été observées sur cette gélose. Ce
phénomène a déjà été décrit sur ALOA, les colonies de Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus avaient
la même couleur que celles de Listeria spp. (Angelidis et al. 2015).
Les agents sélectifs contenus dans les géloses de la gamme ChromID® ne sont pas toujours
indiqués dans les fiches techniques des produits. De ce fait, il est difficile de savoir si les bactéries
présentant des colonies non caractéristiques isolées sur ces milieux sont naturellement résistantes
aux antibiotiques sélectifs ou si elles ont acquis une résistance. C’était notamment le cas pour les
géloses ChromID®MRSA et ChromID®OXA-48. Cependant, pour les géloses ChromID®BLSE,
ChromID®CARBA et ChromID®VRE un des agents sélectif est connu. Le cefpodoxime, qui est une
céphalosporine 3ème génération, est utilisé comme marqueur de β-lactamases à spectre étendu dans
le milieu ChromID®BLSE. La grande majorité des genres isolés sur cette gélose (Enterococcus,
Pseudomonas, Stenotrophomonas) sont naturellement résistants à cet antibiotique. De même, un
carbapénème est utilisé dans la gélose ChromID®CARBA, des bactéries comme Enterococcus
résistants à la vancomycine, Stenotrophomonas et Pseudomonas peuvent se développer sur ce
milieu. Le constat est le même pour le milieu ChromID®VRE où la vancomycine est utilisée comme
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
91
agent sélectif. Certaines espèces du genre Enterococcus sont naturellement résistantes et peuvent se
développer sur ce milieu. De plus, des souches du genre Brevundimonas ont été isolées sur cette
gélose. Cette bactérie Gram négatif doit être naturellement à l’ensemble des agents sélectifs utilisés.
Enfin, la sélection des colonies a été réalisée sur leurs morphologies, or les caractères visuels sont
subjectifs. La sélection des colonies dépend donc du manipulateur et des conditions environnantes
(luminosité, couleur du support de lecture, …). De plus, sur certaines géloses, un changement de pH
entraine le changement de couleur de la gélose et des colonies ce qui peut donner une « fausse »
coloration à ces colonies.
V. Diversité de la flore bactérienne des produits de la pêche et de
l’aquaculture
Ces travaux n’avaient pas pour but d’être exhaustif sur toute la flore bactérienne présente dans
les produits de la pêche mais nous nous sommes focalisés sur la flore mésophile cultivable.
Au total, 1882 souches bactériennes ont été isolées des produits de la pêche et de
l’aquaculture analysés (Annexe II). Trente et un pourcents ont pu être identifiés jusqu’au genre et 55
% jusqu’à l’espèce. Il y avait 969 bactéries Gram positif (26 genres, 80 espèces) et 656 bactéries Gram
négatif (31 genres et 70 espèces). La composition des flores bactériennes ne changeaient pas entre
les branchies et les prélèvements de peau des poissons. De ce fait, nous avons décidé de ne pas tenir
compte de l’origine des isolats (peau ou branchie) pour l’analyse de la flore bactérienne isolée des
poissons.
V.1. Diversité et proportion des bactéries Gram positif isolées des
produits de la pêche et de l’aquaculture
Les bactéries Gram positif isolées des prélèvements appartenaient à 3 ordres bactériens, 504
souches de Bacilliales (13 genres), 428 souches de Lactobacilliales (7 genres) et 46 souches de
Micrococcales (6 genres) (Tableau 10).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
92
Tableau 10: Proportion des genres bactériens Gram positif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=978).
Ordres
bactériens Genres bactériens
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca
(n=15)
Pp
(n=15)
Cr
(n=91)
Ho
(n=15)
Mo
(n=15)
Hu
(n=15)
St
(n=15)
Bacilliales
Bacillus
Halobacillus
Paenibacillus
Lysinibacillus
Virgibacillus
Exiguobacterium
Brochothrix
Kurthia
Planococcus
Salinicoccus
Savagea
Macrococcus
Staphylococcus
Micrococcales
Arthrobacter
Cellulosimicorbium
Microbacterium
Kocuria
Micrococcus
Rothia
Lactobacilliales
Aerococcus
Carnobacterium
Desemzia
Enterococcus
Lactococcus
Vagococcus
Streptococcus
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
93
Au moins une souche appartenant à l’ordre des Bacilliales a été détectée dans toutes les
catégories de produits analysés. Staphylococcus (n=90) était le seul genre bactérien isolé de toutes
les catégories de produits analysés, et principalement des échantillons de cabillaud (87 %), des
poissons plats (60 %) et des moules (40 %). Les souches du genre Bacillus (n=220) étaient également
isolées de toutes les catégories de produits de la pêche et de l’aquaculture sauf des noix de Saint-
Jacques. Ils ont été principalement isolés des crevettes (66 %), des homards (47 %), des cabillauds
(33 %) et des huîtres (20 %). Par ailleurs, des souches du genre bactérien Exiguobacterium (n=121)
ont été isolées dans 25 à 47 % des échantillons de poissons et de crustacés. Parmi les mollusques
analysés, seul 1 échantillon de noix de Saint-Jacques était positif pour le genre Exiguobacterium.
Des souches appartenant à l’ordre des Lactobacilliales ont été isolées de toutes les catégories
de produits sauf des huîtres. Le genre Enterococcus (n=151) a été détecté dans le plus grand nombre
de produits. Il était présent dans 80 % des échantillons de noix de Saint-Jacques, 60 % des
échantillons de poissons plats, 40 % des échantillons de cabillaud, et 20 % des échantillons de
homard et de moules. De même, les souches du genre Vagococcus (n=105) ont été isolées de 87 %
des échantillons de poissons plats, 67 % des cabillauds, 47 % des échantillons de noix de Saint-
Jacques et 40 % des échantillons de homard.
Par contre, les bactéries de l’ordre des Micrococcales ont été peu isolées des produits
analysés. Elles ont été détectées dans les échantillons de poissons et de crevettes. Un seul
échantillon de moule était positif pour le genre Micrococcus. Les souches d’Arthrobacter (n=15)
étaient les plus fréquemment isolées des échantillons, et principalement des cabillauds (47 %).
V.1.A. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Bacilliales
La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Bacilliales était la plus importante avec 13
genres et 51 espèces bactériennes (Tableau 10 & 11).
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
94
Tableau 11: Bacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.
Genres bactériens (proportion de
souches identifiées à l’espèce dans le
genre)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Bacillus (55 %)
B. altitudinis
B. aquimaris
B. cereus
B. drentensis
B. firmus
B. flexus
B. horikoshii
B. infantis
B. invicate
B. licheniformis
B. marisflavii
B. megaterium
B. nealsonii
B. oceanisediminis
B. oshimensis
B. paralicheniformis
B pumilus
B. safensis
B. stratosphericus
B. subtilis
B. thuringiensis
B. vallismortis
B. xianamensis
Brochotrix (100 %) B. thermosphacta
Exiguobacterium (80 %)
E. acetylicum
E. aestuarii
E. aurantiacum
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
95
Genres bactériens (proportion de
souches identifiées à l’espèce dans le
genre)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
E. marinum
E. profundum
Kurthia (100 %) K. gibsoni
K. zopfii
Lysinibacillus (18 %)
L. boronitolerans
L. fusiformis
L. sphaericus
Macrococus (75 %) M. caseolyticus
Paenibacillus (100 %) P. lactis
Planococcus (100 %) P. maritimus
Staphylococcus (82 %)
S. aureus
S. cohnii
S. epidermidis
S. equorum
S. haemolyticus
S. hominis
S. lentus
S. pasteuri
S. saprophyticus
S. sciuri
S. stepanovicii
S. warneri
S. xylosus
Virgibacillus (14 %) V. halodenitrificans
Pour les matrices alimentaires, les crevettes étaient celles contenant la plus grande diversité
d’espèces bactériennes cultivables appartenant à l’ordre des Bacilliales. Il y avait 40 espèces
bactériennes identifiées dans l’ensemble des échantillons de crevettes analysés. La diversité
d’espèces bactériennes était la plus importante pour les genres Bacillus (21 espèces), Staphylococcus
(9 espèces) et Exiguobacterium (4 espèces). Dans les prélèvements de cabillauds et de poissons plats,
il y avait 15 espèces de Bacilliales différentes, dont 7 et 9 espèces de Staphylococcus respectivement.
La diversité des Bacilliales isolées des autres matrices était faible ; 5 espèces dans les moules et les
homards, 3 dans les huîtres et 4 dans les noix de Saint-Jacques.
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
96
Pour les genres bactériens, la plus grande diversité en nombre d’espèces bactériennes a été
observée dans le genre Bacillus. En effet, 46 % des espèces de Bacilliales appartenaient à ce genre
bactérien suivi des genres Staphylococcus (26 % des espèces de Bacilliales) et Exiguobacterium (10 %
des espèces de Bacilliales). En effet, les espèces de Bacillus étaient principalement isolées des
crustacés et en particulier des crevettes (21 espèces). Bacillus cereus était la principale espèce isolée
(48 isolats) dans 23 % des échantillons de crevettes et 20 % des échantillons de homard. De plus, les
espèces de Staphylococcus ont été isolées de toutes les catégories de produits mais le nombre
d’échantillons positifs était variable. En effet, l’espèce S. lentus a été détectée dans 33 % des
échantillons de cabillauds suivi de l’espèce S. aureus qui a été isolée dans 27 % des cabillauds et 7 %
des poissons plats. Parmi les 5 espèces identifiées du genre Exiguobacterium, la plus fréquemment
isolée était E. aestuarii (n=69) dans 33 % des échantillons de poissons plats, 27% des échantillons de
cabillauds, 20 % des échantillons de homards et 19% des échantillons de crevettes. Enfin, d’autres
espèces bactériennes ont été détectées de plusieurs catégories de matrices analysées mais en moins
grand nombre comme par exemple Brochotrix thermosphacta isolé des cabillauds (2/15
échantillons), des poissons plats (1/15 échantillons), des noix de Saint-Jacques (1/15 échantillons) et
des crevettes (1/15 échantillons).
V.1.B. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des
Lactobacilliales
La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Lactobacilliales était plus faible que celle des
Bacilliales, il y avait 7 genres et 21 espèces (Tableau 10 et 12).
Les bactéries de l’ordre bactérien Lactobacilliales étaient isolées de l’ensemble des
catégories de produits sauf des huîtres avec une diversité des espèces qui était la plus importante
dans les genres Enterococcus (9 espèces), Vagococcus (4 espèces) et Lactococcus (3 espèces). Les
espèces du genre Enterococcus les plus fréquemment isolées étaient E. faecalis (n=62) et E.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
97
thailandicus (n=41). E. faecalis a été principalement détecté dans les noix de Saint-Jacques (47 %) et
des poissons plats (33 %). De même, E. thailandicus a été principalement isolé des poissons plats
(27%). Parmi les espèces de Vagococcus, V. fluvialis était la plus présente dans les produits analysés
(n=66). Elle a été détectée dans 80 % des échantillons de poissons plats, 47 % des échantillons de
cabillauds et 33 % des échantillons de noix de Saint-Jacques et de homards. Enfin, trois espèces de
Lactococcus ont été isolées uniquement des échantillons de moules et de crevettes de 7 à 13 % de
prévalence.
Tableau 12: Lactobacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.
Genres bactériens (proportion de
souches identifiées à l’espèce dans le
genre)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Aerococcus (73 %) A. urinaeequi
A. viridans
Carnobacterium (13 %)
C. maltaromaticum
Desemzia (100 %) D. incerta
Enterococcus (89 %)
E. aquamarinus
E. casseliflavus
E. durans
E. faecalis
E. faecium
E. gallinarum
E. italicus
E. malodoratus
E. thailandicus
Lactococcus (84 %)
L. garvieae
L. lactis
L. raffinolactis
Streptococcus (18 %) S. parauberis
Vagococcus (75 %)
V. carniphilus
V. fluvialis
V. lutrae
V. penaei
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
98
De plus, certaines espèces bactériennes ont été isolées principalement des cabillauds comme
Desemzia incerta (53 % des échantillons) ou Aerococcus urinaeequi (80 % des échantillons).
V.1.C. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Micrococcales
La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Micrococcales était la plus faible des familles
bactériennes Gram positif identifiées, il y avait 6 genres et 9 espèces (Tableau 10 et 13).
Tableau 13: Micrococcales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats.
Genres bactériens (proportion de souches
identifiées à l’espèce dans le genre)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Arthrobacter (20 %) A. soli
A. woluwensis
Cellulosimicrobium (50 %) C. cellulans
Kocuria (100 %) K. palustris
Microbacterium (88 %)
M. arborescens
M. esteraromaticum
M. paraoxydans
Micrococcus (100 %) M. aloeverae
M. luteus
Peu d’isolats de cet ordre bactérien ont été obtenus en comparaison des autres ordres
(n=46). Les crevettes étaient les matrices contenant la plus grande diversité d’espèces bactériennes
cultivables, 8 des 9 espèces bactériennes identifiées appartenant à l’ordre des Micrococcales. La
diversité des Micrococcales était faible dans les cabillauds (4 genres ; 1 espèce), les poissons plats (2
genres ;1 espèce) et les moules (1 genre ; 1epsèce). De plus, aucun isolat de l’ordre des
Micorcoccales n’a été identifié dans les homards, les huîtres et les noix de Saint-Jacques.
V.2. Diversité et proportion des bactéries Gram négatif isolées des
produits de la pêche et de l’aquaculture
La diversité bactérienne des bactéries Gram négatif étaient plus importante que celle des
Gram positif. La majorité des souches identifiées était des γ-proteobacteria (589 souches). Il y avait 7
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
99
ordres bactériens identifiés : Enterobacteriales (236 souches), Pseudomonodales (173 souches),
Vibrionales (74 souches), Alteromondales (46 souches), Aeromonales (37 souches), Xanthomonadales
(17 souches) et Oceanospiralles (6 souches). Les autres souches identifiées étaient des α-
proteobacteria (39 souches) dont 35 Caulobacteriales et 4 Rhizobiales, des Flavobacteriia (10
Flavobacteriales) et des Sphingobacteriia (2 Sphingobacteriales) (Tableau 14).
Tableau 14 : Proportion des genres bactériens Gram négatif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=640).
Ordres bactériens Genres bactériens
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca
(n=15)
Pp
(n=15)
Cr
(n=91)
Ho
(n=15)
Mo
(n=15)
Hu
(n=15)
St
(n=15)
Enterobacterales
Escherichia/Shigella
Klebsiella
kluyvera
Lelliottia
Morganella
Citrobacter
Enterobacter
Proteus
Pantoea
Rahnella
Providencia
Moellerella
Yersinia
Hafnia
Serratia
Pseudomonadales
Acinetobacter
Psychrobacter
Pseudomonas
Aeromonadales Aeromonas
Oceanimonas
Oceanospirillales Halomonas
Vibrionales Vibrio
Xanthomonadales Stenotrophomonas
Alteromonadales Shewanella
Pseudoalteromonas
Flavobacteriales Myroides
Chryseobacterium
Sphingobacteriales Sphingobacterium
Caulobacterales Brevundimonas
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
100
Ordres bactériens Genres bactériens
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca
(n=15)
Pp
(n=15)
Cr
(n=91)
Ho
(n=15)
Mo
(n=15)
Hu
(n=15)
St
(n=15)
Rhizobiales Pseudochrobactrum
Ochrobactrum
Les bactéries Gram négatif ont surtout été détectées dans les échantillons de poissons et de
noix de Saint-Jacques. Et l’ordre bactérien avec le plus de diversité de genre bactérien était les
Enterobacterales qui ont été isolés dans toutes les matrices analysées. Le genre le plus détecté était
Proteus (n=93) dans 47 % des échantillons de poissons plats, 20 % de ceux de cabillauds et 13% de
ceux de homards, moules et noix de Saint-Jacques. Le genre Morganella (n=41) était également
présent dans 40 et 33 % des échantillons de noix de Saint-Jacques et de poissons plats
respectivement. De plus, les souches du genre Serratia (n=29) et Citrobacter (n=15) étaient plus
fréquentes dans les échantillons de noix de Saint-Jacques (47 % et 33%).
En comparaison, les isolats de l’ordre Pseudomonadales étaient plus associés aux
échantillons de poissons. Les souches de Pseudomonas (n=130) ont été isolées dans 93 % et 80 % des
cabillauds et poissons plats respectivement. De plus, les autres genres bactériens de cet ordre,
Psychrobacter (n = 25) et Acinetobacter (n = 24) étaient principalement isolés des cabillauds.
De plus, d’autres genres bactériens comme Vibrio (n = 74), Shewanella (n = 45) et
Brevundimonas (n = 35) ont été détectés. Par exemple, 73 et 47 % des échantillons de noix de Saint-
Jacques étaient positifs pour les genres Vibrio et Shewanella et 67 et 40 % des échantillons de
poissons plats étaient positifs pour les genres Brevundimonas et Shewanella.
V.2.A. Diversité bactérienne des γ-proteobacteria
V.2.A.a. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des
Enterobacteriales
La diversité bactérienne des souches dans cet ordre était la plus élevée parmi les ordres
Gram négatif. Il y avait 27 espèces bactériennes (tableau 15).
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
101
La diversité la plus importante d’Enterobacteriales a été détectée dans les échantillons de
poissons plats et de noix de Saint-Jacques. Les différentes espèces de Proteus et de Citrobacter ont
été isolées principalement des échantillons de poissons plats, mais aussi des échantillons de moules
et de noix de Saint-Jacques. De même, les espèces de Serratia ont été principalement isolées des
noix de Saint-Jacques. De plus, l’espèce Morganella morganii (n=22) a été isolée dans 33 et 20 % des
échantillons de noix de Saint-Jacques et de poissons plats respectivement. Enfin, l’espèce E. coli a été
détectée dans 1 échantillon de poissons plats et 1 échantillon de moule.
Tableau 15: Enterobacteriales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches. Les espèces bactériennes en rouge sont les potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.
Genres bactériens (proportion de
souches identifiées à l’espèce dans le
genre)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Citrobacter (60 %)
C. braakii
C. farmeri
C. freundii
C. gillenii
Enterobacter (80 %) E. cloacae
Escherichia (100 %) E. coli
E. hermannii
Hafnia (67 %) H. halvei
Klebsiella (33 %) K. oxytoca
Klyuvera (100 %) K. intermedia
Lelliottia (100 %) L. amnigena
Moellerella (100 %) M. wisconensis
Morganella (59 %) M. morganii
M. psychrotolerans
Pantoea (80 %) P. aglomerrans
Proteus (63 %)
P. cibarius
P. hauseri
P. terrae
P. vulgaris
Providencia (63 %) P. rettgeri
P. vermicola
Rahnella (50 %) R. inusitata
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
102
Serratia (48 %)
S. fonticola
S. glossinae
S. marcesens
S. quinivorans
Yersinia (50 %) Y. massiliensis
V.2.A.b. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des
Pseudomonadales
Au total, 3 genres bactériens et 22 espèces appartenant à l’ordre des Pseudomonadales ont
été isolés des produits de la pêche et de l’aquaculture analysés (Tableau 16).
Tableau 16: Pseudomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches.
Genres bactériens (proportion de
souches identifiées à l’espèce)
Espèces bactériennes
Proportion d’échantillons positifs (%)
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Acinetobacter (54 %) A. guillouiae
A. puyangensis
Pseudomonas (38 %)
P. alcaliphila
P. brenneri
P. cichorii
P. fluorescens
P. fragi
P. frederikbergensis
P. helmanticensis
P. libanensis
P. marginalis
P. mendocina
P. mosselii
P. putida
P. stutzeri
P. tolaasii
P. trivialis
P. weihenstephanensis
Psychrobacter (32 %)
P. arenosus
P. celer
P. faecalis
P. maritimus
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
103
Les taux d’identification à l’espèce des genres Acinetobacter, Pseudomonas et Psychrobacter
étaient faibles. Les espèces identifiées dans ces genres étaient associées principalement aux
échantillons de poissons avec une grande diversité d’espèces (16 espèces) pour le genre
Pseudomonas. La moitié de ces espèces étaient du groupe P. fluorescens (P. fluorescens, P. brenneri,
P. libanensis, P. tolaasii, P. fragi, P. frederikbergensis, P. marginalis, P. trivialis) avec P. brenneri qui
était la plus isolée (47 % des échantillons de cabillauds).
V.2.A.c. Diversité bactérienne des souches appartenant aux autres γ-
proteobacteria : Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles
et Xanthomonadales
Le tableau 17 montre les 14 espèces bactériennes des γ-proteobacteria qui n’appartenaient
pas aux ordres des Enterobacterales et des Pseudomonadales.
Tableau 17: Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles et Xanthomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches.
Genres bactériens (proportion de souches identifiées à l’espèce)
Espèces bactériennes
Proportion
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Aeromonas (3 %) A. salmonicida
Halomonas (67 %) H. alkaphila
H. glacei
Shewanella (76 %)
S. algae
S. haliotis
S. indica
S. putrefaciens
Stenotrophomonas (74 %) S. maltophilia
S. rhizophila
Vibrio (49 %)
V. alginolyticus
V. casei
V. metschnikovii
V. mytili
V. natriegens
Les différentes espèces de Shewanella ont été isolées des poissons plats (7 à 33% des
échantillons selon les espèces) et des noix de Saint-Jacques (13 % à 27 % des échantillons selon les
espèces). De plus, l’espèce Vibrio metchnikovii a été isolée dans 60 % des noix de Saint-Jacques et
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
104
dans 20 % des homards. Enfin, la souche identifiée Aeromonas salmonicida a été isolée des noix de
Saint-Jacques.
V.2.B. Diversité bactérienne des souches appartenant aux α-proteobacteria :
Caulobacteriales, Flavobacteriales, Rhizobiales et Sphingobacteriales
La diversité des espèces bactériennes des α-proteobacteria (4 espèces), Sphingobacteriia (1
espèce) et Flavobacteriia (2 espèces) étaient faibles (tableau 18).
Tableau 18: α-proteobacteria, Sphingobacteriia et Flavobacteriia isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases grisées représentent l’absence de souches.
Genres bactériens (proportion de souches identifiées à l’espèce)
Espèces bactériennes Proportion
Ca (n=15)
Pp (n=15)
Cr (n=91)
Ho (n=15)
Mo (n=15)
Hu (n=15)
St (n=15)
Brevundimonas (71 %) B. diminuta
B. naejangsanensis
Myroides (75 %) M. odoratimimus
M. phaeus
Ochrobactrum (50 %) O. tritici
Pseudochrobactrum (100 %)
P. asaccharolyticum
Sphingobacterium (100 %) S. mizutaii
Les espèces bactériennes Brevundimonas naejangsanensis et B. diminuta ont été isolées dans
47 % et 40 % des échantillons de cabillaud et des poissons plats respectivement.
V.3. Discussion
Dans cette étude, 1882 isolats ont été obtenus sur 14 géloses sélectives à partir de 181
matrices alimentaires. Au total, 58 genres bactériens et 150 espèces bactériennes ont été identifiés
avec une diversité bactérienne différente selon les produits analysés. En effet, les produits avec les
plus grandes diversités bactériennes étaient les poissons et les crevettes. Ensuite, il y avait les
moules, les noix de Saint-Jacques et les homards. Enfin les huîtres avaient la plus faible diversité
bactérienne. La différence de diversité s’accompagnait de flores bactériennes spécifiques à des
produits ou à des catégories de produits comme les poissons, les crustacés et les mollusques. La
diversité bactérienne de la flore cultivable mésophile présente sur les produits aquatiques est peu
connue. Elle apparait principalement être liée à l’animal analysé et à son mode de vie. En effet, les
0 %
100 %
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
105
crustacés possèdent un exosquelette composé de chitine. Des travaux ont montré que certaines
bactéries comme Vibrio spp. ou Enterococcus spp. pouvaient adhérer plus facilement que d’autres à
ce polymère (Signoretto et al. 2005). Il existait une diversité bactérienne importante entre les
différents mollusques bivalves (33 genres, 46 espèces) mais aucune bactérie ne semble spécifique à
ces produits. Enterococcus, Staphylococcus et Bacillus étaient les genres bactériens les plus isolés des
noix de Saint-Jacques, des moules et des huîtres, respectivement Ces animaux se nourrissent en
filtrant l’eau et donc concentrent les bactéries dans leur tube digestif (Lee et al. 2010). La législation
française impose, pour les mollusques bivalves commercialisés vivants, dont les moules et les huîtres,
de passer par une étape de purification, ce procédé diminue la charge bactérienne et
potentiellement de la diversité (Lee et al. 2010). A l’inverse, les coquilles Saint-Jacques ne subissent
pas cette étape de purification et seule la flore de la noix (muscle adducteur) a été étudiée. De plus,
la particularité des coquilles Saint-Jacques par rapport aux autres mollusques bivalves étudiés est
leur capacité de s’enfouir dans les sédiments marins et de se mouvoir. Ces facteurs peuvent
influencer la diversité bactérienne présente dans ces coquillages et donc dans la noix par rapport aux
moules et aux huîtres qui sont statiques et accrochées à leurs rochers. Des isolats du genre
Vagococcus, Serratia et Morganella ont été isolés des noix de Saint-Jacques et pas dans les autres
mollusques analysés.
Pour les poissons, la flore bactérienne avait la plus grande diversité en comparaison des
autres produits étudiés (45 genres, 89 espèces). Le mucus présent sur la peau et les branchies ont un
rôle de barrière de protection qui peut favoriser le développement d’une flore bactérienne
spécifique (Smith et al. 2007, Reverter et al. 2017). En effet, entre les poissons plats (benthiques) et
les cabillauds (démersaux) des particularités dans la flore bactérienne ont été remarquées. En effet,
la diversité des Enterobacteriales était plus importante sur les poissons plats que sur les autres
matrices. Au contraire, les bactéries du genre Desemzia ont été isolées uniquement des cabillauds.
L’environnement, le mode de vie des animaux (benthique/pélagique, côtier/pleine mer) et des
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
106
interactions spécifiques hôte-bactéries semble avoir également un impact sur la composition des
flores bactériennes.
Les genres bactériens Gram positif étaient plus fréquemment isolés des poissons et des
crustacés. De plus, les genres Bacillus, Exiguobacterium, Staphylococcus, Enterococcus et Vagococcus
étaient les plus identifiées. Les bactéries des genres Bacillus et Exiguobacterium semblaient être plus
présentes dans les crustacés que dans les autres matrices analysées. Les bactéries du genre
Exiguobacterium sont natives dans divers écosystèmes du milieu aquatique: glaciers, fonds
océaniques, sources chaudes, eaux de mer, effluents industriels et animaux marins (poissons et
crustacés)(Austin 2006, Vishnivetskaya et al. 2009, Broekaert et al. 2013, Chen et al. 2016, Dabadé et
al. 2016, Lunestad et al. 2018). Cependant, sa présence dans les produits alimentaires d’origine
aquatique n’est pas commentée (Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016, Lunestad et al. 2018).
Dans ces travaux, Exiguobacterium spp. a été isolé des poissons et principalement des crustacés
étudiés mais pas des mollusques bivalves.
En outre, le genre Staphylococcus était plus détecté dans les poissons que dans les
mollusques et les crustacés. Les poissons pêchés sont plus manipulés par l’homme (éviscération à
bord) que la chair des crustacés et des mollusques, ce qui peut expliquer les différences de
contamination car l’espèce S. aureus est un marqueur de contamination humaine et d’hygiène des
aliments (Falconnet 2011). II est également possible que les souches de Staphylococcus spp.
adhèrent mieux à la peau et au mucus des poissons que sur les carapaces de chitine des crustacés. En
effet, ces bactéries colonisent naturellement la peau et les muqueuses de divers animaux, et
principalement les animaux à sang chaud, dont l’homme (Becker et al. 2014). Certaines espèces ont
été isolées d’animaux marins, comme S. scuiri de la peau de mammifères marins ou S. xylosus et S.
lentus isolées de mollusques bivalves. Staphylococcus spp. est halophile et donc capable de persister
sur des surfaces soumises à de fortes concentrations de sel, comme sur les bateaux et les animaux
marins.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
107
De plus, Enterococcus spp. étaient isolés des différentes matrices analysées sauf des huîtres.
Ces bactéries ont été fréquemment décrites dans la flore d’altération des produits aquatiques, et
principalement des produits à base de poisson (Jaffrès et al. 2009, Sorroza et al. 2012, Calliauw et al.
2016, Kim et al. 2017). Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont des
marqueurs de contamination fécale des eaux (Salam et al. 2014). Il a été démontré que les espèces E.
faecalis et E. faecium étaient capables de survivre et de persister dans un état viable non cultivable à
la surface des copépodes et dans les sédiments marins (Signoretto et al. 2004, Signoretto et al. 2005)
ce qui favorise sa présence sur de nombreux animaux marins, dont les animaux benthiques. La
présence du genre Enterococcus dans les produits de la pêche est peu documenté mais a été détecté
dans des crevettes et des poissons fumés (Jaffrès et al. 2009, Leroi 2010, Dabadé et al. 2016). Boss et
al. (2016) ont montré que 59 % des leurs produits aquatiques étudiés (huîtres, saumon, panga et
crevettes) étaient porteurs de souches E. faecalis. Les produits les plus contaminés étaient les
crevettes (82 %), les pangas (75 %) et le saumon (64 %). De plus, dans une étude sur des crevettes
importées d’Asie du sud-est en Pologne, 45 % des échantillons étaient positifs pour Enterococcus spp.
(Chajęcka-Wierzchowska et al. 2016).
Pour le genre Vagococcus, des souches ont été isolées des poissons, des homards et des noix
de Saint-Jacques. Ces bactéries sont associées aux animaux aquatiques (Lebreton et al. 2017) et font
également partie de la flore d’altération des produits aquatiques et principalement des produits à
base de poisson (Jaffrès et al. 2009, Sorroza et al. 2012, Calliauw et al. 2016, Kim et al. 2017).
En outre, dans cette étude, les bactéries Gram négatif étaient plus associées aux poissons et
aux mollusques bivalves qu’aux crustacés. Les principaux genres isolés étaient Pseudomonas, Vibrio,
Shewanella, Brevundimonas et les genres appartenant à l’ordre des Enterobacterales.
Les bactéries de l’ordre des Enterobacterales sont fréquemment isolées d’échantillons de
poissons, mollusques et crustacés (Gram et Dalgaard 2002, Linton et al. 2003). Par exemple, des
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
108
bactéries des genres Serratia, Hafnia et Yersinia ont été isolées de saumons fumés (Jørgensen et al.
2000, Olofsson et al. 2007), des Proteus, Klebsiella et Citrobacter ont été détectées dans des
crevettes d’aquaculture au Bénin (Dabadé et al. 2016). Dans notre étude, les bactéries de cet ordre
ont principalement été isolées des animaux benthiques. Serratia spp.et Morganella spp. ont été
isolés principalement des noix de Saint-Jacques et Proteus spp. et Citrobacter spp. des poissons plats.
Des souches de l’espèce E. coli ont été isolées d’échantillons de poissons et de moules. Cette bactérie
est un indicateur de contamination fécale et peut être un pathogène alimentaire s’il y a présence des
gènes de pathogénicité. Sa prévalence dans les produits de la pêche est variable. En effet, Boss et al.
(2016)ont montré que 83 % des pangas et 64 % des crevettes étaient positifs pour E. coli alors que
seulement 10 % des huîtres. Dans une autre étude au Maroc, E. coli a été détecté dans 8 % des
échantillons de produits aquatiques (Badri et al. 2009).
Pour le genre Pseudomonas, des souches ont été isolées principalement des échantillons de
poissons et peu des échantillons de moules, de crevettes et de noix de Saint-Jacques. Ce genre
bactérien a été montré pour faire partie de la flore d’altération des produits alimentaires, dont les
produits aquatiques (Gram et Dalgaard 2002) comme des poissons et moins dans les crustacés et les
mollusques (Liston 1957, Georgala 1958, Cahill 1990, Linton et al. 2003). En outre, des souches du
genre Shewanella ont été isolées dans des poissons plats et les noix de Saint Jacques qui sont des
bactéries naturellement présentes dans le milieu aquatique. Elles peuvent être isolées de sédiments
marins et divers animaux aquatiques (Ziemke et al. 1998, Bozal et al. 2002, Satomi et al. 2003). Ces
bactéries ont également été isolées de crustacés (Broekaert et al. 2013, Parlapani et al. 2015,
Parlapani et al. 2018). La présence de Pseudomonas, Shewanella et Psychrobacter dans les produits
aquatique est rarement commentée, excepté pour leur rôle dans l’altération des produits aquatiques
(Bjørkevoll et al. 2003, Broekaert et al. 2013).
Enfin, cinq espèces du genre Vibrio ont été détectées principalement dans les noix de Saint
Jacques et dans les homards. Aucune des espèces pathogènes pour l’homme (V. cholerae, V.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
109
parahaemolyticus et V. vulnificus). Vibrio spp. est naturellement présent dans le milieu marin, sous
forme planctonique ou en biofilm sur des particules biotiques (plancton) ou abiotiques (plastique)
(Carman et Dobbs 1997, Ogonowski et al. 2018). Ces bactéries peuvent être isolées de tous les
animaux aquatiques et surtout des coquillages et des crustacés. Par exemple, dans une étude sur des
produits importés en Suisse, Vibrio spp. a été isolé dans 18 % des poissons de mer et dans 83 % des
mollusques bivalves (Schärer et al. 2011). Les espèces V. alginolyticus, V. fluvialis,
V. parahaemolyticus et V. cholerae sont le plus fréquemment isolées des produits aquatiques
destinées à la consommation humaine {Zavala-Norzagaray, 2015 #348;Ronholm, #183;Schärer, 2011
#120;Banerjee, 2018 #519}.
Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne
110
- La technique MALDI-TOF et l’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S ont été
performants pour l’identification des genres bactériens isolés des produits de la pêche et de
l’aquaculture analysés, 80 % et 93 % des isolats ont été identifiés au genre respectivement.
- L’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S a été moins performant pour l’identification à
l’espèce (44 % des isolats) en comparaison de la technique MALDI-TOF (54 % des isolats).
- La sélectivité des géloses utilisées a été globalement médiocre. La gélose la plus sélective et
spécifique était la gélose Slantez et Bartley, 52 % des isolats étaient Enterococcus.
- Les genres bactériens majoritairement Enterococcus, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio,
Psychrobacter, Aerococcus, Vagococcus, Pseudomonas, Brevundimonas, Aeromonas, Vibrio
ont été principalement isolés de 6 géloses : Brillance Salmonella, PEMBA, Slanetz & Bartley,
CFC, TCBS et Chapman.
- Cinquante-sept genres bactériens et 150 espèces ont été isolés des cabillauds, poissons plats,
crevettes, homards, huîtres, moules et noix de Saint-Jacques.
- Cinq genres bactériens ont été isolés dans au moins 6 des 7 matrices alimentaires :
Enterococcus, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio et Psychrobacter.
- La flore bactérienne observée dépend des produits analysés.
- Plus de la moitié des échantillons de poissons étaient porteurs des genres Aerococcus,
Vagococcus, Pseudomonas, Brevundimonas et Staphylococcus.
- Plus de la moitié des échantillons de crustacés étaient porteurs de souches du genre Bacillus.
- Les genres Aeromonas, Enterococcus et Vibrio ont été isolés dans plus de la moitié des
échantillons de noix de Saint Jacques. Les bactéries isolées des échantillons de moules et
d’huîtres présentaient une faible diversité. Il n’y avait pas de genre bactérien
majoritairement isolé, ni spécifique à ces produits.
113
Chapitre 2 : E tude de la re sistance aux antibiotiques des bacte ries isole es des produits marins
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
114
I. Contexte
Le suivi de la résistance des bactéries zoonotiques est particulièrement important pour
mieux évaluer les risques pour la santé humaine liés aux contacts avec les animaux ou à la
consommation des denrées d’origine animale. Il correspond aux recommandations internationales
portées par l’OMS (WHO 2001), l’OIE (OIE 2018), le Codex Alimentarius (Commission 2011), et au
niveau européen par le conseil de l’Europe, la commission européenne et l’EFSA. La directive
2003/99/CE sur la surveillance des zoonoses et des agents zoonotiques oblige les états membres à la
mise en place d’une surveillance de la résistance aux antibiotiques chez les agents zoonotiques. La
surveillance des bactéries indicatrices, réservoirs potentiels de gènes de résistance qui peuvent être
transmis aux bactéries pathogènes ou commensales de l’homme est également encouragée. En
France, la surveillance réglementée de la résistance des bactéries zoonotiques (Salmonella enterica,
Campylobacter spp.…) et indicatrices (Escherichia coli, Enterococcus faecium et E. faecalis) est
organisée par les autorités compétentes et les données peuvent être complétées par celles
provenant des réseau nationaux (RESAPATH, réseau Salmonella), ou encore des enquêtes et des
plans de surveillance. Cela permet ainsi d’obtenir régulièrement des données représentatives des
principales filières de production d‘origine animale françaises (bovins, porcins, volailles). Cependant,
le milieu aquatique marin n’est pour le moment pas couvert pas ces différents réseaux. Il apparait
donc important de faire un état des lieux sur ce point car le milieu aquatique marin est une source
potentielle de bactéries résistantes peu explorée de façon pérenne.
Le but de cette étude a été de tester la résistance aux antibiotiques des genres bactériens les
plus isolés des échantillons analysés dans le chapitre 1, afin d’évaluer la contamination des produits
aquatiques avec des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, cette étude visait à trouver
de(s) bactérie(s) potentielle(s) candidate(s) pour être des indicatrice(s) de la résistance aux
antibiotiques dans les produits aquatiques.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
115
Dans un premier temps, la résistance aux antibiotiques des genres bactériens Gram positif et
Gram négatif les plus fréquemment isolés a été étudié par diffusion. Les molécules antibiotiques ont
été choisies pour détecter des mécanismes de résistance pour des classes d’antibiotiques
d’importance critiques et élevées pour la santé humaine définies par l’OMS (OMS 2017b). Les classes
d’antibiotiques ciblées dans cette étude étaient les β-lactamines, les quinolones, les glycopeptides,
les oxalodinones, les aminosides, les macrolides, les phénicolés, les tétracyclines, les inhibiteurs de la
synthèse des folates, les ansamycines et les stéroïdes antibactériens (OMS 2017a).
Dans un deuxième temps, nous avons voulu estimer si les produits analysés (nature, origine
géographique, mode de production) avaient un rôle dans la contamination en bactéries résistantes
aux antibiotiques.
Dans un dernier temps, nous avons cherché si les genres bactériens étudiés pouvaient être
de potentielle(s) candidate(s) indicatrice(s) de la résistance aux antibiotiques dans les produits
marins.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
116
II. Antibiorésistance de la flore des produits de la pêche et de
l’aquaculture
II.1. Matériel et méthodes
II.1.A. Sélection des souches
Après isolement des souches dans les produits de la pêche et de l’aquaculture et leur
identification (chapitre I), nous les avons sélectionnées et « dédoublonnées » comme suit :
-La première étape de sélection a été de garder toutes les souches identifiées au genre
bactérien pour chaque échantillon de produits de la pêche.
-La seconde étape a été de conserver une souche de chaque espèce bactérienne par
échantillon. Le milieu d’isolement a été le principal critère de sélection des souches identifiées à
l’espèce. Les souches isolées des milieux de la gamme ChromID® étaient sélectionnées en premier.
De manière arbitraire, en premier nous avons sélectionné les souches isolées sur les milieux de
détection des β-lactamases des bactéries Gram négatif. Puis plus le spectre de la β-lactamase
recherchée était large plus le milieu correspondant était prioritaire. Ensuite, les souches étaient
sélectionnées sur le milieu ChromID®MRSA puis sur le milieu ChromID VRE. Puis les souches étaient
sélectionnées sur les géloses sélectives en fonction de la présence et le nombre de familles
d’antibiotiques critiques pour la santé humaine. Et en dernier, nous avons sélectionné les géloses
pour lesquelles il n’y a pas d’antibiotique comme agent sélectif. Les critères de priorité pour ces
milieux étaient le nombre d’agents sélectifs et la durée du temps d’incubation.
L’ordre de priorité des milieux était donc le suivant : ChromID® CARBA, ChromID® OXA,
ChromID® ESBL, ChromID® MRSA, ChromID® VRE, ALOA, brillance salmonella, CFC, GSP, PEMBA,
TCBS, TBX, Slanetz & Bartley, Chapman. Enfin, aucune différence n’a été faite entre les souches
isolées des branchies et celles de la peau.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
117
La troisième étape de sélection a été de conserver les genres bactériens majoritaires qui ont
été isolés dans les différentes matrices alimentaires. Après l’étape de « dédoublonnage », les genres
bactériens étaient sélectionnés comme suite :
Il fallait au minimum 30 souches dans un genre/ et ou une espèce bactérienne,
Il fallait que les souches aient été isolées dans au moins 20 % des échantillons de 3 produits
de la pêche et de l’aquaculture différents pour les bactéries Gram positif et dans au moins 20% des
échantillons de 2 produits de la pêche et de l’aquaculture différents pour les bactéries Gram négati.
II.1.B. Antibiogramme par diffusion
II.1.B.a. Choix des antibiotiques testés
Dans le but de tester la résistance aux antibiotiques des genres bactériens les plus
fréquemment isolées des produits analysés, deux plaques, une pour détecter des mécanismes de
résistance des bactéries Gram positif et une pour ceux des bactéries Gram négatif ont été
développées.
La plaque pour tester la résistance aux antibiotiques des bactéries Gram positif comportait 2
β-lactamines : la pénicilline et la céfoxitine, des aminosides (kanamycine, tobramycine, gentamicine),
des macrolides et apparentée (érythromycine et clindamycine), une quinolone (fluoroquinolone),
une oxazolidinone (linézolide), un glycopeptide (vancomycine), une tétracycline (tétracycline), un
phénicolé (chloramphénicol), une ansamycine (rifampicine), des inhibiteurs de la synthèse des
folates (sulfamide et triméthoprime) et un stéroïde antibactérien (acide fusidique). La céfoxitine a
été utilisée pour détecter la résistance à la méticilline. De plus, le disque de clindamycine a été
positionné à côté du disque d’érythromycine pour visualiser les mécanismes de type MLSb (EUCAST
2017).
La plaque pour tester la résistance aux antibiotiques des Gram négatif comportait 7 β-
lactamines, deux pénicillines (ampicilline et témocilline), l’association pénicilline et inhibiteur de β-
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
118
lactamase (amoxicilline et clavulanate), une céphalosporine de 1ère génération (céfalotine), une
céphalosporine de deuxième génération (cefoxitine), deux céphalosporines de 3ème génération
(ceftazidime et cefotaxime). Les céphalosporines de 3ème génération ont été placées à côté du disque
contenant du clavulanate pour détecter les β-lactamases à spectre étendu (EUCAST 2017). Aucun
carbapénème n’a été testé, la présence d’une enzyme de ce type pouvant s’observer par la perte
d’activité de l’ensemble des β-lactamines et avec des tests complémentaires. De plus, nous avons
utilisé la témocilline car cette pénicilline est très stable face à des β-lactamases et elle permet de
détecter les carbapénémases de type OXA-48 (EUCAST 2017). Il y avait également des quinolones
(acide nalidixique et ciprofloxacine) et un macrolide (azithromycine), deux aminosides
(streptomycine et gentamicine), un phénicolé (chloramphénicol), une tétracycline (tétracycline), les
inhibiteurs de la synthèse des folates (sulfamétoxazole et triméthoprime utilisés en combinaison que
nous appellerons cotrimoxazol).
II.1.B.b. Antibiogramme par diffusion
À partir des cryotubes, chaque souche a été ensemencée sur une gélose nutritive salée à 2 %
(GNS) ou su une gélose PCA et incubée à 37°C pendant 24h. Les antibiogrammes ont été effectués
selon les recommandations indiquées dans le référentiel de l’EUCAST (EUCAST 2012). Les colonies
ont été suspendues dans de l’eau physiologique (Biomérieux) pour obtenir une culture bactérienne
avec une turbidité de 0,5 McFarland. La suspension était ensuite étalée sur une gélose Mueller-
Hinton (Biorad) à l’aide d’un écouvillon stérile. Les disques d’antibiotiques étaient ensuite déposés et
la gélose était incubée pendant 16 à 18h à 35°C. Nous avons veillé à ne pas dépasser un délai de 15
minutes entre la préparation de la suspension et l’étape d’ensemencement, l’étape
d’ensemencement et le dépôt des disques, et le dépôt des disques et l’incubation de la gélose.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
119
Les disques d’antibiotiques (Biorad) utilisés pour les bactéries Gram positif étaient les
suivants : pénicilline G (1 U), céfoxitine (30 µg), ciprofloxacine (5 µg), kanamycine (30 µg),
tobramycine (10 µg), gentamicine (10 µg), érythromycine (15 µg), clindamycine (2 µg), vancomycine
(5 µg), linézolide (10 µg), sulfamides (200 µg), triméthoprime (5 µg), tétracycline (30 µg),
chloramphénicol (30 µg), rifampicine (5 µg) et l’acide fusidique (10 µg) (Figure 7).
Les disques d’antibiotiques testés pour les bactéries Gram négatif étaient les suivants :
ampicilline (10 µg), témocilline (30 µg), amoxicilline-acide clavulanique (20/10 µg), céfalotine (30 µg),
céfoxitine (30 µg), ceftazidime (30 µg), céfotaxime (30 µg), acide nalidixique (30 µg), ciprofloxacine (5
µg), streptomycine (10 µg), gentamicine (10 µg), azithromycine (15 µg), chloramphénicol (30 µg),
tétracycline (30 µg), triméthoprime-sulfamétoxazole (1,25/ 3,75 µg) et colistine (10 µg). Un disque de
colistine a été utilisé dans un but de qualité, pour s’assurer de l’identification des souches et de
l’absence de contamination (Figure 8).
Figure 7:Antibiogramme des bactéries Gram positif.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
120
La résistance aux antibiotiques des souches de Pseudomonas spp. a été testée dans les conditions
expérimentales décrites dans le document M42-A du CLSI (CLSI 2016a). Les géloses étaient incubées
à 28°C pendant 24 à 28 h.
Les souches de Staphylococcus aureus ATCC 25923 et E. coli ATCC 25922 ont été utilisées
comme contrôle qualité pour les antibiogrammes des bactéries Gram positif et Gram négatif
respectivement.
Les diamètres d’inhibition ont été mesurés avec un appareil Biomic®V3 (Gilles Scientific,
Santa Barbara, États-Unis).
II.1.B.c. Interprétation des résultats
Les résultats des antibiogrammes ont été analysés pour définir les populations sauvages et
non-sauvages par genre/ espèce bactérienne :
- selon les seuils cliniques établis dans les référentiels du CLSI (CLSI 2015, CLSI 2016b) et de
l’EUCAST (EUCAST 2018),
- selon les seuils épidémiologiques (ECOFF) définis dans le référentiel EUCAST (EUCAST).
Figure 8 : Antibiogramme des bactéries Gram négatif.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
121
- lorsque les ECOFFs n’existaient pas, nous avons calculé des seuils épidémiologiques
expérimentaux (COWT). Ces seuils épidémiologiques expérimentaux sont appelés COWT, car
l’appellation ECOFF est celle des seuils épidémiologiques officiels définis dans l’EUCAST (Smith et al.
2016). Les COWT ont été définis selon la méthode normalized resistance interpretation (NRI) décrite
par Kronvall et al.(2003). La méthode NRI a été utilisée avec la permission du détenteur du brevet
européen No 1383913 et américain 7,465,559 (Bioscand AB, TÄBY, Sweden). Il faut au minimum 30
souches/ genre ou espèce pour calculer un COWT. En raison du nombre de souches inférieur à 30 pour
chaque espèce et chaque clade, les seuils épidémiologiques expérimentaux ont été calculés par
genre bactérien toutes espèces confondues. Pour chaque antibiotique, la distribution des souches a
été faite selon le diamètre d’inhibition de croissance. Lorsque cette distribution suivait une loi
normale, la moyenne et l’écart-type ont été déterminés. Le COWT était la valeur entière la plus proche
de la moyenne moins 2,5 fois l’écart-type. Les COWT ont été calculés grâce à une feuille de calcul Excel
mis à disposition gracieusement par P. Smith, W. Finnegan et G. Kronvall.
Les référentiels du CLSI et l’EUCAST ont défini des critères d’interprétation pour des
quantités données d’antibiotiques dans les disques qui sont différents entre eux. Dans les conditions
choisies dans cette étude, certains critères d’interprétation n’ont pas été utilisés car les charges de
disques utilisées ne sont pas disponibles dans l’un ou l’autre des référentiels. Les souches ayant
acquis des résistances à 3 classes d’antibiotiques et plus sont dites multi-résistantes (Magiorakos et
al. 2012).
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
122
III. Etude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées dans
les produits de la pêche et de l’aquaculture
III.1. Contexte
Le but de cette étude épidémiologique était d’identifier les populations bactériennes
sauvages et non-sauvages c’est à dire celle qui avait acquis un mécanisme de résistance aux
antibiotiques pour un genre/ espèce bactérienne. Pour cela, les résultats ont été interprétés avec les
ECOFFs disponibles dans le référentiel EUCAST. Lorsque qu’il n’y avait pas d’ECOFF, nous avons
calculé des COWT. En parallèle, les résultats des antibiogrammes ont été interprétés selon les seuils
cliniques des référentiels du CLSI ou EUCAST. Les seuils cliniques classent les bactéries en sensible,
intermédiaire et résistant et nous avons considérés que les bactéries classées intermédiaires et
résistantes avaient acquis un mécanisme de résistance. Elles ont été considérées comme une
population non-sauvage. Lorsqu’une souche est résistante à une molécule testée in vitro, elle est
alors considérée comme résistante à la classe d’antibiotique correspondante.
Après l’application des critères de sélection que nous avons définis, nous avons étudié le
panel de souches suivantes : 46 Enterococcus spp., 43 Staphylococcus spp., 40 Exiguobacterium
spp.,54 Pseudomonas spp., 46 Vibrio spp. et 32 Proteus spp.
Les souches des genres Bacillus (n=180) et Vagococcus (n=65) n’ont pas été étudiées car dans
les référentiels CLSI et EUCAST, il n’est pas recommandé d’étudier la résistance aux antibiotiques des
souches de Bacillus par antibiogramme par diffusion, qui est la technique utilisée dans ces travaux
(Hernàndez-Guinàt 2012). De plus, dans les conditions expérimentales de cette étude, les souches de
Vagococcus spp. ne croissaient pas ou peu sur la gélose Mueller-Hinton, ce qui ne permettait pas
l’interprétation des antibiogrammes.
L’analyse des résultats a été présentée par genre bactérien.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
123
III.2. Enterococcus
III.2.A. Contexte
Enterococcus spp. sont des bactéries Gram positif qui font parties de la flore lactique
(Signoretto et al. 2004, Naser et al. 2005). Elles sont présentes dans le tube digestif humain et animal
et sont également isolés de produits fermentés et de l’environnement (eaux, plantes,…). De plus, les
espèces E. faecalis et E. faecium sont utilisés comme bactéries indicatrices de la résistance aux
antibiotiques dans les aliments (EFSA 2012). Ces bactéries résistent naturellement aux
céphalosporines, à l’acide fusidique, aux aminosides, aux lincosamides et aux sulfamides (Leclercq et
al. 2013, CLSI 2016b). Selon le référentiel du CLSI, les souches Enterococcus spp. sont également
résistantes naturellement au triméthoprime et selon le référentiel de l’EUCAST, aux macrolides.
III.2.B. Panel de souches étudiées
Les souches du genre Enterococcus étudiées (n=46) ont été groupées selon les clades décrits
par Naser et al. (2005) (Naser et al. 2005). L’espèce E. faecalis (n=14) apparentait au clade éponyme.
Les espèces E. faecium (n=3) et E. durans (n=1) étaient dans le clade E. faecium, E. casseliflavus (n=4)
et E. gallinarum (n=2) au clade E. casseliflavus. De plus, les espèces E. thailandicus (n=9), E.
aquamarinus (n=1) et E. italicus (n=1) n’appartenaient à aucun clade et 11 souches n’ont pas été
identifiées à l’espèce.
III.2.C. Détermination de la population non-sauvage
Des seuils étaient disponibles dans les référentiels du CLSI et EUCAST pour 11 antibiotiques
pour le genre Enterococcus et 5 ont été calculés (Tableau 19). Les distributions des diamètres
d’inhibitions sont dans l’Annexe III.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
124
Tableau 19: Population bactérienne Enterococcus spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques
Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal
de souches
ayant acquis
une résistan
ce
ECOFF (mm)
(EUCAST)
Nombre de
souches non-sauvag
es
COwt (mm
)
Nombre de
souches non-sauvag
es
Seuil S/IR
(mm) EUCAS
T
Nombre de
souches avec
un diamètre <au seuil S/IR
Seuil
S/IR (mm
) CLSI
Nombre de
souches avec
un diamètre <au seuil S/IR
Pénicilline SP - - Céfoxitine ND - -
Ciprofloxacine SP - 15 0 21 11 11
Kanamycine EC - - Tobramycine 8 0 0 Gentamicine SP - -
Erythromycine 19 4 23 12 12 Clindamycine 6 - -
Vancomycinea 12 0 SP - 12 0 0
Linézolidea 19 0 18 0 19 0 0
Acide fusidique
26 7 7
Triméthoprimea,b 21 1
EC/SP
- 50 46 46
Sulfamides ND - -
Tétracycline 20 12 19 12 12
Chloramphénicol
EC - 18 1 1
Rifampicine ND - 20 18 18
a) Les ECOFFs ont été défini pour les espèces E. faecalis et E. faecium
b) Selon le référentiel du CLSI, toutes les souches du genre Enterococcus sont naturellement
résistantes au triméthoprime. Selon le référentiel de l’EUCAST, l’activité du triméthoprime
n’est pas certaine sur les souches du genre Enterococcus. Les souches sauvages sont donc
classées intermédiaires au niveau clinique.
Des seuils cliniques pour 4 antibiotiques sont présents uniquement dans le référentiel CLSI ce
qui a permis de déterminer des souches ayant acquis une résistance à la ciprofloxacine (11 souches),
la rifampicine (18 souches) et le chloramphénicol (1 souche). Pour la tétracycline, le seuil clinique du
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
125
CLSI et le COWT calculé était à un millimètre d’écart. En interprétant les diamètres d’inhibition avec
ces deux seuils, 12 souches avaient un phénotype non-sauvage à la tétracycline. Au contraire, le seuil
clinique du CLSI pour l’érythromycine était plus élevé de 4 mm que le COWT calculé. Le nombre de
souches ayant acquis un mécanisme de résistance était plus élevé en interprétant les diamètres
d’inhibition avec le seuil clinique (12 souches) qu’avec le COWT (4 souches). Enfin, le COWT de l’acide
fusidique a permis de détecter une population non-sauvage de 7 souches.
Aucune acquisition de résistance au triméthoprime n’a pu être détectée avec les seuils
cliniques. En effet, toutes les souches étaient considérées naturellement résistantes à cet
antibiotique par le CLSI ou modérément résistantes selon l’EUCAST. Pourtant, des ECOFFs ont été
définis pour les espèces E. faecalis et E. faecium pour le triméthoprime. Grâce à cela, l’acquisition
d’une résistance à cet antibiotique a été observée pour une unique souche E. faecalis, AF16-253-
OUCARB2.
Dans le référentiel EUCAST, des ECOFFs ont été définis uniquement pour les espèces E.
faecalis et E. faecium. Des COWT ont donc été calculés pour tous les antibiotiques et pour l’ensemble
des souches Enterococcus spp. . La distribution des diamètres d’inhibition suivait une loi normale
pour 6 antibiotiques testés. Pour 5 antibiotiques (tobramycine, érythromycine, linézolide,
tétracycline, acide fusidique), nous avons pu déterminer des COwt . Cependant, celui calculé pour la
clindamycine était à 6 mm. Sachant que le plus petit diamètre mesurable est celui du disque
d’antibiotique (6 mm), tous les isolats Enterococcus testés par cette méthode étaient une population
sauvage. Le COWT calculé pour la clindamycine est inutilisable pour détecter des résistances à cet
antibiotique.
Aucun COWT n’a été déterminé pour les 9 autres antibiotiques : soit la distribution des
diamètres d’inhibition ne suivait pas une loi normale et aucun seuil épidémiologique n’a pu être
calculé (Figure 99) ; soit l’écart-type était trop grand, supérieur à 3,35 mm, la population était trop
hétérogène pour valider la valeur de COwt calculée.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
126
Figure 9:Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la rifampicine.
Enfin, une distribution non-homogène des espèces bactériennes au sein de la distribution des
diamètres d’inhibition pour la vancomycine, la ciprofloxacine, la pénicilline, le triméthoprime et la
gentamicine a été observée (Figure 10). Deux sous-populations ont été observées avec la première
qui était principalement composée des souches de l’espèce E. faecalis et la seconde des souches de
l’espèce E. thailandicus. Les souches appartenant à la première avaient toujours un diamètre
s’inhibition plus faible que la seconde et les COWT calculés classaient toujours les populations des
souches E. faecalis en non-sauvage. Il n’y avait pas assez de souches de chaque espèce pour calculer
des seuils épidémiologiques expérimentaux par espèce et confirmer cette observation. Les COWT
calculés pour ces antibiotiques n’ont donc pas été pris en compte pour l’interprétation des
antibiogrammes.
Figure 10: Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la vancomycine.
0
1
2
3
4
5
6
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
0
2
4
6
8
10
12
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
127
III.2.D. Multi-résistance
Nous avons observé des populations non-sauvages pour plusieurs antibiotiques ce qui
représentait au total 82 % des souches du genre Enterococcus (Tableau 20).
Tableau 20 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Enterococcus spp. (n = 38).
Nombre de classes d’antibiotiques avec un phénotype non-sauvage
Classes d’antibiotiques Nombre de
souches Espèces
bactériennes
1
Quinolone 2 1 E. faecalis 1 E. faecium
Tétracycline 2 1 E. faecalis 1 E. italicus
Stéroïde antibactérien 1 1 E. faecalis
Ansamycine 6 2 E. faecalis
2 E. thailandicus 2 Enterococcus sp.
2
Macrolides- Stéroïde antibactérien
1 1 E. faecium
Macrolide-Ansamycine 2 1 E. casseliflavus
1 Enterococcus sp.
Quinolone-Macrolide 2 1 E. faecium
1 E. gallinarum
Tétracycline-Ansamycine 5 1 E. casseliflavus 3 E. thailandicus
1 Enterococcus sp.
Ansamycine-Stéroïde antibactérien
1 1 Enterococcus sp.
Ansamycine - Macrolide 1 1 Enterococcus sp.
Tétracycline- Macrolide 1 1 E. faecalis
Quinolone-Ansamycine 4 2 E. faecalis
2 Enterococcus sp.
3
Quinolone-Stéroïde antibactérien- Ansamycine
1 1 E. faecalis
Tétracycline-Ansamycine- Macrolide
1 1 E. thailandicus
Ansamycine-Stéroïde antibactérien - Macrolide
1 1 E. thailandicus
Quinolone -tétracycline- Macrolide
1 1 E. casseliflavus
4
Macrolide -Tétracycline-ISF*- Ansamycine
1 1 E. faecalis
Macrolide -Tétracycline-Stéroïde antibactérien-
Phénicolé 1 1 E. thailandicus
Quinolone-Stéroïde antibactérien- Ansamycine -
Macrolide 1 1 E. faecalis
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
128
*Inhibiteur de la synthèse des folates
Au total, sept souches étaient multi-résistantes. En effet, quatre souches avaient cumulé des
résistances à 3 classes d’antibiotiques et chaque souche avait un profil de résistance différent. De
même, 3 souches avait acquis des résistances à 4 classes antibiotiques, et chacune des souches avait
un profil de résistance différent. Ces 3 souches étaient résistantes à l’érythromycine.
III.2.E. Discussion
Les populations non-sauvages du genre Enterococcus observées étaient élevées pour les
ansamycines (39 %), les macrolides (26 %), les tétracyclines (26 %) et les quinolones (24 %). En ce qui
concerne les résistances aux macrolides, elles sont souvent causées, pour les souches cliniques, par
l’acquisition des gènes erm(B) et mef(A) (Leclercq 2012a). Le phénotype de résistance à cette famille
d’antibiotique est beaucoup plus élevé en clinique (50-60 % des souches) (Leclercq 2012a) que dans
notre étude. Pour la résistance à la tétracycline que nous avons observé c’est un phénomène décrit
avec un taux élevé dans le milieu hospitalier (environ 71 % des souches isolées) (Tazi et Poyart 2012).
Il a également été montré que 16 % des souches de l’espèce Enterococcus faecalis isolées de pangas
et de crevettes importés en Suisse étaient résistantes à cet antibiotique (Boss et al. 2016). Les
déterminants de ces résistances ne sont pas connus, mais dans plus de 75 % des cas la résistance à la
tétracycline chez Enterococcus spp s’acquiert par le gène tet(M) (Tazi et Poyart 2012).
Pour les quinolones, aucun COWT n’a été déterminé mais 11 souches étaient classés comme
ayant acquis une résistance au regard du référentiel CLSI. Le taux de résistance à cette famille
d’antibiotiques a connu une augmentation dans les années 1990 dans le milieu hospitalier en Europe
(Tankovic et al. 1996, el Amin et al. 1999). En effet, la prévalence de souches Enterococcus
résistantes aux quinolones a augmenté de 11-14 % à 25 %. Les bactéries Gram positif deviennent
résistantes à cette classe par des mutations dans les gènes parC et gyrA ou des pompes à efflux.
Cependant, la prévalence de la résistance aux quinolones parmi les souches Enterococcus est peu
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
129
documentée. Dans l’étude de Boss et al. (2016), aucune résistance aux quinolones n’a été détectée
pour les souches Enterococcus qu’ils ont isolé.
De plus, nous avons détecté 7 souches multi-résistantes isolées de 3 noix de Saint-Jacques, 2
poissons plats, 1 homard et de 1 crevette. Chaque souche avait un profil de résistance différent. Les
ont acquis des résistances aux macrolides, aux tétracyclines et, pour une souche aux inhibiteurs de la
synthèse des folates et pour l’autre souche à l’acide fusidique.
Les antibiotiques testés ont été choisi pour détecter des mécanismes de résistances à des
classes d’antibiotiques critiques définis par l’OMS. Ces antibiotiques n’étaient pas les plus pertinents
à tester pour Enterococcus, des seuils étaient définis pour 8 molécules testées par les référentiels du
CLSI et EUCAST. De plus, il n’existait pas d’ECOFF pour Enterococcus spp. et seulement 6 COWT ont pu
être calculé.
Des différences de sensibilité aux antibiotiques selon les espèces, notamment entre E.
faecalis et E. thailandicus, ont été observées. Deux sous-populations étaient visibles et pour certains
antibiotiques cela a pu empêcher le calcul d’un COWT ou de calculer un COWT erroné comme par
exemple pour la vancomycine. Le COWT calculé a pris en compte les diamètres d’inhibition les plus
grands qui était ceux de la population de l’espèce E. thailandicus. En effet, l’autre population
bactérienne était constituée principalement de l’espèce E. faecalis qui avait des diamètres
d’inhibition plus faibles et qui était systématiquement considéré comme une population non-
sauvage. Pour résoudre ce problème, il faudrait cumuler plus de souches de chaque espèce ou clade
et interpréter les résultats par espèce bactérienne ou clade.
En outre, les molécules auxquelles les espèces Enterococcus sont naturellement résistantes
ont été testées dans cette étude. Elles appartenaient aux classes des céphalosporines, macrolides et
apparentés, inhibiteurs de la synthèse des folates et l’acide fusidique (Leclercq et al. 2013, CLSI
2016b). Les COWT des molécules de ces classes n’ont pas pu être calculés ou étaient inexploitables,
comme la céfoxitine (céphalosporine), les sulfamides (inhibiteur de la synthèse des folates) et les
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
130
lincosamides (macrolides et apparenté). Le choix des molécules antibiotiques utilisés n’était pas le
plus pertinent pour tester la résistance aux antibiotiques du genre Enterococcus. La cefoxitine a été
utilisée pour détecter la présence de résistance à la méticilline et la recherche de ce type de
résistance n’est pas utile pour ce genre bactérien (EUCAST 2017).
Pourtant, nous avons testé des classes d’antibiotiques pour lesquelles des résistances
naturelles ont été décrites (inhibiteur de la synthèse des folates et macrolides) mais une population
non-sauvage a été détectée. Les bactéries du genre Enterococcus sont considérées comme
naturellement résistantes au triméthoprime (inhibiteur de la synthèse des folates) dans le référentiel
CLSI et classé dans la catégorie intermédiaire dans le référentiel EUCAST. Cette catégorisation a un
intérêt purement clinique pour déterminer l’efficacité d’un traitement qui peut être incertaine lors
de l’utilisation de cette molécule sur les bactéries du genre Enterococcus. Par ailleurs, ce même
référentiel a défini un seuil épidémiologique pour cette molécule pour E. faecalis, et nous avons
décrit l’acquisition d’une résistance à cet antibiotique. De même, nous avons pu déterminer des
seuils épidémiologiques expérimentaux et détecter des souches non-sauvages pour l’érythromycine
(macrolides) et l’acide fusidique alors que les bactéries du genre Enterococcus sont considérées
naturellement résistantes à ces classes d’antibiotiques. Les résistances naturelles sont
principalement connues pour les espèces isolées de patients mais peu connues pour les espèces
isolées de l’environnement. De plus, dans les référentiels il y a principalement des seuils cliniques
pour interpréter les antibiogrammes des souches Enterococcus spp. dans un but thérapeutique et
pas dans un but d’étude épidémiologique de la résistance aux antibiotiques. Des espèces
naturellement résistantes à des concentrations thérapeutiques d’antibiotiques peuvent quand même
acquérir des résistances, comme observée dans cette étude pour le triméthoprime.
Enteroccoccus spp. présente également une faible résistance naturelle aux molécules de la
classe des aminosides. Il est recommandé d’utiliser des disques de charge élevée en aminosides (120
µg pour la gentamicine et 300 µg pour la streptomycine) car les charges classiques des disques
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
131
d’antibiotiques, qui ont été utilisées dans cette étude ne permettent pas de détecter les résistances à
cette classe d’antibiotique. Nous l’avons observé par les faibles diamètres d’inhibition de nos
souches pour ces antibiotiques et les seuils épidémiologiques faibles. De même, il est recommandé
d’utiliser une charge de disque plus élevé pour tester la résistance aux pénicillines (10 µg
d’ampicilline ou de pénicilline) (CLSI 2016b). Il est également préconisé de tester l’ampicilline, qui a
une activité plus importante sur les bactéries de ce genre par rapport à la pénicilline (Mainardi 2012).
En conclusion, nous avons montré par l’étude de la résistance aux antibiotiques du genre
Enterococcus que des souches de chaque espèce identifiée ont acquis des résistances. Ces souches
ont été isolées des crustacés et des poissons benthiques mais pas des autres produits. Cependant,
nous n’avons pas pu établir de seuils épidémiologiques pour tous les antibiotiques à cause de la
sensibilité différente entre les espèces et de la faible pertinence du test de certains antibiotiques
pour le genre Enterococcus. De plus, nous n’avons pas étudié les déterminants de ces résistances et il
serait intéressant de comparer ces déterminants avec ceux identifiés en clinique.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
132
III.3. Staphylococcus
III.3.A. Contexte
Les bactéries du genre Staphylococcus sont Gram positifs, halophiles. Elles sont
principalement isolées de la peau et des muqueuses des animaux à sang-chaud (Chapman 1945,
Becker et al. 2014). Ces bactéries sont considérées comme des marqueurs d’hygiène des produits
alimentaires et notamment des produits aquatiques (Hammad et al. 2012). Les espèces de
Staphylococcus sont divisées en Staphylococcus coagulase positif et Staphylococcus coagulase
négatif. Tous les Staphylococcus sont résistants à la ceftazidime (Leclercq et al. 2013) et la plupart
des souches cliniques de Staphylococcus coagulase positif et négatif sont productrices de
pénicillinases (Lowy 2003, Cattoir et Leclercq 2012). Les autres résistances naturelles décrites sont
dépendantes des espèces bactériennes, par exemple les souches de S. saprophyticus sont résistantes
à l’acide fusidique, la novobiocine et la fosfomycine (Leclercq et al. 2013, CLSI 2016b).
III.3.B. Panel de souches étudiées
Dans un premier temps, la résistance aux antibiotiques des souches de Staphylococcus
coagulase positif (n=8) a été étudiée. Il n’y avait qu’une seule espèce S. aureus. Dans un second
temps, les résistances aux antibiotiques des souches de Staphylococcus coagulase négatif (n=31) ont
été étudiées. Les espèces ont été groupées selon leur phylogénie ADNr 16S (Takahashi et al. 1999).
Douze souches appartenaient au clade S. scuiri (S. sciuri (n=7), S. lentus (n=4) S. stepanovicii (n=1)), 8
souches au clade S. warneri (S. pasteuri (n=5), S. warneri (n=3)), 4 souches au clade S. saprophyticus
(S. xylosus (n=2) et S. saprophyticus (n=2)), 4 souches au clade S. haemolyticus (S. haemolyticus (n=3)
S. hominis (n=1)) et 3 souches au clade S. epidermidis, les trois souches appartenaient à l’espèce
éponyme. La résistance aux antibiotiques des 4 souches qui n’ont pas été identifiées à l’espèce a été
étudiée avec les souches de Staphylococcus coagulase négatif.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
133
III.3.C. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus
coagulase positif
Des seuils épidémiologiques et cliniques étaient définis pour 13 des 16 antibiotiques testés.
Le nombre de souches de S. aureus était inférieur à 30 et donc trop faible pour calculer des COwt pour
les antibiotiques pour lesquels aucun ECOFF n’était défini. (Tableau 21)
Tableau 21 : Population bactérienne Staphylococcus aureus (n=8) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques
Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal
de souche ayant acquis
une résistance
ECOFF (mm) Staphylococcus
aureus
Nombre de
souches non
sauvage
Seuil S/IR
(mm) EUCAST
Nombre de
souches avec un
diamètre inférieur Seuil S/IR
Seuil S/IR
(mm) CLSI
Nombre de
souches avec un
diamètre inférieur Seuil S/IR
Pénicilline 26 7 26 7 7 Céfoxitine 22 0 22 0 0
Ciprofloxacine 20 0 21 0 21 0 0
Kanamycine - Tobramycine 18 0 18 0 0 Gentamicine 18 0 18 0 15 0 0
Erythromycine 21 0 21 0 23 0 0 Clindamycine 22 0 22 0 21 0 0
Vancomycine -
Linézolide 19 0 21 0 0
Acide fusidique 24 0 24 0 0
Sulfamides - Triméthoprime 19 0 17 0 16 0 0
Tétracycline 22 0 22 0 19 0 0
Chloramphénicol 18 0 18 0 18 0 0
Rifampicine 25 0 26 0 20 0 0
Seule 7 souches de S. aureus coagulase positif ont acquis une résistance clinique à la
pénicilline.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
134
III.3.D. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus
coagulase négatif
Les autres souches de Staphylococcus (n=35) étaient toutes coagulases négatif. Des seuils
étaient disponibles pour 12 des antibiotiques testés (Tableau 22). Des COWT ont pu être calculés pour
2 antibiotiques. Les distributions des diamètres d’inhibition sont dans l’annexe IV
Tableau 22 : Population bactérienne de Staphylococcus spp. coagulase négatif (n=35) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotique
Seuils épidémiologiques Seuils cliniques
Nombre maximal
de souche ayant acquis
une résistance
ECOFF (mm) Staphylococcus spp. coagulase
négatif
Nombre de
souches non
sauvage
COwt
(mm)
Nombre de
souches Non-
sauvage
Seuil S/IR
(mm) EUCAST
Nombre de
souches avec un
diamètre inférieur au seuil
S/IR
Seuil S/IR
(mm) CLSI
Nombre de
souches avec un
diamètre inférieur au seuil
S/IR
Pénicilline SP - - Céfoxitine
(Staphylococcus spp.)
25 2 25 2 2
Cefoxitine (S. epidermidis)
22 0 0
Ciprofloxacine 24 0 24 0 21 0 0
Kanamycine 22 1 1 Tobramycine 22 2 22 2 2 Gentamicine 22 0 22 0 15 0 0
Erythromycine 21 8 21 8 23 8 8 Clindamycine 22 6 22 6 21 3 6
Vancomycine 14 0 0
Linézolide 19 0 21 0 0
Acide fusidique 24 5 24 5 5
Sulfamides EC - - Triméthoprime SP - 17 2 16 1 2
Tétracycline 22 2 22 2 19 2 2
Chloramphénicol 23 0 18 0 18 0 0
Rifampicine 26 0 26 0 20 0 0
Des souches résistantes à la céfoxitine (2 souches), la tobramycine (2 souches), la
kanamycine (1 souche), la clindamycine (6 souches), l’acide fusidique (2 souches), le triméthoprime
(2 souches) et la tétracycline (2 souches) ont été détectées. Les deux souches résistantes à la
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
135
céfoxitine étaient potentiellement résistantes à la méticilline. Il s’agissait d’une souche de S.
saprophyticus et une souche Staphylococcus sp. De plus, une image d’induction entre
l’érythromycine et la clindamycine a été observée pour 3 souches (AF16-53-CCTC1 [S. xylosus], AF16-
62-CCCH3 [S. haemolyticus] et AF16-252-OUPE1 [S. haemolyticus]) (Figure 11).
Figure 11: Antibiogramme d'une souche de S. aureus ATTC 25923 présentant un phénotype sauvage à gauche et d’une souche de S. haemolyticus AF16-62-CCCH3 à droite présentant un phénotype MLSB (en rouge). Pénicilline (PEN), céfoxitine (FOX), sulfamides (SSS), triméthoprime (TMP), linézolide (LZD), vancomycine (VAN), acide fusidique (FUS), tétracycline (TET), kanamycine (KAN), tobramycine (TOB), gentamicine (GEN), chloramphénicol (CHL), ciprofloxacine (CIP), érythromycine (ERY), clindamycine (CLI) et rifampicine (RIF).
L’induction d’une résistance de la clindamycine par l’érythromycine est un marqueur d’un
phénotype MLSB. Ces souches ont été isolées de crevettes (n=2) et de poissons plats (n=1).
Les antibiotiques pour lesquels il n’existait pas d’ECOFF (kanamycine, vancomycine,
pénicilline, sulfamides et triméthoprime), des COWT ont pu être définis pour la kanamycine et la
vancomycine. La souche avec un phénotype non-sauvage pour la kanamycine a été détectée grâce à
ce COWT. Nous n’avons pas pu déterminer de COwt pour les 3 autres antibiotiques : la pénicilline car
les diamètres d’inhibition étaient regroupés en 3 sous-populations de sensibilités différentes, les
sulfamides car l’écart-type était non valide et le triméthoprime car deux populations contenant des
espèces différentes étaient visibles (Figure 12a et 12b).
PEN FOX SSS
TMP
LZD VAN FUS TET
KAN TOB
GEN CHL
CIP ERY
CLI RIF
PEN FOX SSS TMP
LZD VAN FUS TET
KAN TOB
GEN CHL
CIP ERY
CLI RIF
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
136
Figure 12 : Distribution des diamètres d'inhibition de Staphylococcus spp. pour a) la pénicilline, b) le triméthoprime.
III.3.E. Multi-résistance
Au total, 67 % des souches de Staphylococcus avaient une population non-sauvage (Tableau
23).
Tableau 23 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Staphylococcus spp. (n = 29).
Nombre de classes d’antibiotiques avec
phénotype non-sauvage Classes d’antibiotiques
Nombre de souches
Espèces bactériennes
1
Macrolide 6
2 S. pasteuri 2 S. epidermidis
1 S. haemolyticus 1 Staphylococcus sp.
β-lactamines 9 7 S. aureus
1 S. saprophyticus 1 Staphylococcus sp.
Lincosamides 4 4 S. scuiri
Aminosides 2 2 S. pasteuri
ISF* 2 1 S. lentus
1 S. epidermidis
Stéroïde antibactérien 1 1 S. scuiri
Macrolide-Stéroïde antibactérien
1 1 S. haemolyticus
2
Tétracycline-Stéroïde antibactérien
1 1 S. hominis
Lincosamide-Stéroïde antibactérien
2 1 S. lentus 1 S. scuiri
Macrolide-Tétracycline 1 1 S. xylosus
*ISF=inhibiteur de la synthèse des folates
0
1
2
3
4
5
6
7
8
6 8 10121416182022242628303234363840
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibiton (mm)
a)
0
1
2
3
4
5
6
7
6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp
b)
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
137
Des résistances acquises ont été observées pour 9 des 10 espèces de Staphylococcus
étudiées. De plus, 5 souches appartenant à 5 espèces différentes ont cumulées des résistances à
deux classes d’antibiotiques.
III.3.F. Discussion
Des populations non-sauvages de Staphylococcus ont été détectées pour les macrolides (33
% des souches), β-lactamines (21 % des souches), acide fusidique (12 % des souches), tétracyclines (5
% des souches), aminosides (5 % des souches) et les inhibiteurs de la synthèse des folates (5 % des
souches). En ce qui concerne la classe d’antibiotiques des macrolides et apparentés (macrolide,
lincosamide et streptogramine), les gènes de résistance à l’origine des phénotypes non-sauvages
sont encore à identifier. La présence du phénotype MLSB inductible a déjà été détectée pour des
souches de Staphylococcus coagulase positif et négatif (Leclercq 2012b). Les gènes erm(A) et erm(C),
responsables de ce phénotype, sont les plus fréquemment identifiés dans les souches de
Staphylococcus (Leclercq 2012b). Les autres souches présentant soit un phénotype de résistance aux
macrolides, ou phénotype M, soit un phénotype de résistance aux lincosamides, ou phénotype L,
pouvaient avoir acquis des mécanismes de différentes natures : pompes à efflux, mutations
ribosomales, la production d’enzyme inactivant les molécules antibiotiques. L’étude de la résistance
d’une autre molécule (Streptogramine B ou lincomycine) appartenant à la classe des macrolides et
apparenté, serait utile pour orienter, in vitro, le diagnostic du type de mécanisme de résistance
présent (Leclercq 2012b).
Pour les β-lactamines, nous avons testé la pénicilline et la céfoxitine. Des seuils cliniques et
épidémiologiques pour la pénicilline ont été définis uniquement pour l’espèce S. aureus. Dans cette
étude, 88 % des souches de S. aureus étaient résistantes à la pénicilline. Aujourd’hui, près de 90 %
des souches de S. aureus sont productrices de pénicillinases blaZ (Lowy 2003). Ce gène a largement
diffusé au sein des populations de S. aureus pendant la deuxième moitié de XXe siècle par le biais de
transposon et de plasmides. De plus, la diffusion de β-lactamases semble également avoir impacté
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
138
les souches de Staphylococcus coagulase négatif isolées dans un contexte clinique (Cattoir et Leclercq
2012, Becker et al. 2014). Ceci peut expliquer les différentes sous-populations observées dans la
distribution des diamètres d’inhibition de la pénicilline, selon la présence/absence de pénicillinases
et le niveau d’expression de celles-ci. La résistance par ce mécanisme est privilégiée car la résistance
par la mutation des PLP est rare pour ce genre bactérien (Cattoir et Leclercq 2012). Pour autant, une
confirmation de la présence de pénicillinase par un test à la nitrocéfine est nécessaire.
En outre, 2 souches de Staphylococcus coagulase négatif avaient un phénotype non-sauvage
pour la céfoxitine. Elles étaient potentiellement résistantes à la méticilline. La résistance à la
méticilline est un problème de santé publique car elle confère une résistance à toutes les β-
lactamines, mais une confirmation de la présence de la cassette SCCmec, élément génétique mobile
porteur de la résistance à la méticilline, est indispensable. De plus, des souches de Staphylococcus
résistantes à la méticilline ont déjà été isolées de sashimi à base de maquereaux, saumon, thon, flet
et sériole (Hammad et al. 2012). La diversité de la structure de cette cassette est importante, 11
types ont été décrits, et plusieurs techniques ont été développés pour détecter et typer cet élément
génétique (Becker et al. 2014). Ces méthodes consistent à chercher les marqueurs génétiques par
PCR multiplexe ou directement par un séquençage du génome total (Deurenberg et Stobberingh
2008).
Les autres classes d’antibiotiques pour lesquelles des souches non-sauvages ont été
détectées, étaient les tétracyclines et l’acide fusidique. Des études ont montré des taux de résistance
aux tétracyclines allant de 7,5 à 20 % pour des souches hospitalières, ce qui est supérieur aux taux
observés dans notre étude (Becker et al. 2014). Les principaux gènes conférant la résistance aux
tétracyclines connus pour les bactéries du genre Staphylococcus sont tet(K) et tet(L) qui sont des
pompes à efflux, tet(M), tet(O) et tet(W) qui codent pour des enzymes modificatrices du ribosome
(Tazi et Poyart 2012). La prévalence de la résistance à l’acide fusidique est variable selon les pays
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
139
entre 4 et 30 % (Cattoir 2012). L’acquisition des résistances à cet antibiotique se fait soit par la
mutation de la cible fusA soit par l’acquisition d’un déterminant plasmidique fusB (Cattoir 2012).
De plus, un phénotype de résistance à la kanamycine et à la tobramycine, marque
l’acquisition d’une enzyme à activité ANT(4’)-I. En revanche, nous avons une souche avec un
phénotype de résistance à la tobramycine mais pas à la kanamycine, ce phénotype n’a pas été décrit
dans des souches de bactéries Gram positif (Bismuth et Courvalin 2012). Le diamètre d’inhibition a
été mesuré à 22 mm pour la kanamycine. Il est possible que le COWT calculé pour la kanamycine (22
mm) ne soit pas assez précis, du fait du faible nombre de souches utilisées pour le calculer, ou que le
diamètre mesuré soit dans l’incertitude de mesure de 2 mm (Barry et al. 1979). En outre, au vu du
nombre important d‘enzymes possédant des mécanismes d’action différents pouvant inactiver les
molécules antibiotiques de la famille des aminosides, il est possible d’avoir une enzyme non décrite
et présente dans le milieu aquatique (Shaw et al. 1993). Ces enzymes sont le principal mécanisme de
résistance acquise des bactéries du genre Staphylococcus et elles sont associées à des transposons,
ce qui facilite leur diffusion au sein des populations bactériennes (Shaw et al. 1993).
En conclusion, nous avons montré que toutes les espèces de Staphylococcus isolées de nos
produits ont pu acquérir des résistances pour la plupart des antibiotiques testés. De plus, la présence
de souches résistantes à la méticilline reste à confirmer. De plus, il pourrait être intéressant d’étudier
les mécanismes de résistance présents dans les souches ayant acquis des résistances.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
140
III.4. Exiguobacterium
III.4.A. Contexte
Les bactéries du genre Exiguobacterium sont des bacilles Gram positif isolés
d’environnements variés (glaciers, eau marines, sources chaudes, …) (Vishnivetskaya et al. 2009). Les
souches Exiguobacterium spp. peuvent croître dans une gamme de température comprise entre -
12°C et 55°C. Les espèces de ce genre sont divisées en deux groupes, le groupe I contient les espèces
isolées d’environnements froids (permafrost, glacier,…) et le groupe II contient les espèces isolées
d’environnement plus chaud (eaux de mer, sources chaudes,…) (Vishnivetskaya et al. 2009). De plus,
il a été montré que certaines souches étaient capables d’acquérir des résistances aux métaux lourds
comme le mercure (Petrova et al. 2002). Cependant, les résistances naturelles ainsi que les capacités
d’acquisition de résistance aux antibiotiques des espèces du genre Exiguobacterium ne sont pas
connues.
III.4.B. Panel de souches étudiées
Au total, 40 souches Exiguobacterium ont été sélectionnées pour l’étude de la résistance aux
antibiotiques. Les souches E. acetylicum (n=2) appartenaient au groupe I et les souches E. aestuarii
(n=14), E. profundum (n=4), E. marinum (n=2) et E. aurantiacum (n=1) appartenaient au groupe II.
Enfin, 17 souches n’ont pas été identifiées à l’espèce.
III.4.C. Détermination de la population non-sauvage
Il existe aucun seuil clinique ni seuil épidémiologique pour ce genre bactérien. Cependant,
nous avons pu déterminer des seuils épidémiologiques expérimentaux pour 15 antibiotiques
(Tableau 24). Les distributions des diamètres d’inhibition sont dans l’annexe V.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
141
Tableau 24: Population bactérienne Exiguobacterium spp. (n=40) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques COwt (mm) Nombre de souches non-sauvages
Pénicilline 30 20 Céfoxitine 31 7
Ciprofloxacine 19 0
Kanamycine 21 0 Tobramycine 20 3 Gentamicine 21 1
Erythromycine 22 2 Clindamycine 21 0
Vancomycine 16 1
Linézolide 17 0
Acide fusidique ND -
Sulfamides 23 1 triméthoprime 15 3
Tétracycline 26 1
Chloramphénicol 21 0
Rifampicine 23 0
Il n’y a que pour l’acide fusidique que nous n’avons pas pu déterminer de COwt car la
distribution ne suivait pas une loi normale.
Des résistances acquises ont été observées pour 9 antibiotiques. La pénicilline était
l’antibiotique pour lequel le plus de souches étaient résistantes. Vingt de ces souches avaient acquis
un phénotype non sauvage pour la pénicilline, et deux populations étaient bien distinctes (Figure 13).
Figure 13 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour la pénicilline. La ligne rouge représente le COWT.
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. acetylicum
E. marinum
E. profundum
E. aurantiacum
E. aestuarii
Exiguobacterium sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
142
De même, deux sous-populations ont été observées pour le triméthoprime(Figure 14). Le
COwt a été calculé en ne prenant pas en compte la sous-population de souches avec des diamètres
d’inhibition supérieures à 24 mm (n=6).
Figure 14 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour le triméthoprime. La ligne rouge représente le COWT.
III.4.D. Multi-résistance
Parmi toutes les souches testées, 55 % avaient acquis au moins un phénotype de résistance
(Tableau 25).
Tableau 25: Cumul de phénotype-non sauvage pour Exiguobacterium spp. (n = 22)
Nombre de classes d’antibiotiques avec
phénotype non-sauvage
Antibiotiques Nombre de souches Espèces bactériennes
1 β-lactamines 13
5 E. aestuarii 2 E. acetylicum 1 E. profundum
5 Exiguobacterium sp.
ISF* 1 1 Exiguobacterium sp.
2
β-lactamines-Aminosides
3 2 E. aestuarii 1 E. marinum
β-lactamines- Macrolide
1 1 E. profundum
β-lactamines-ISF 1 1 E. aestuarii
Macrolide-ISF 1 1 E. aurantiacum
β-lactamines-Glycopeptide
1 1 Exiguobacterium sp.
3 β-lactamines -ISF-
Tétracycline 1 1 Exiguobacterium sp.
*Inhibiteurs de la synthèse des folates.
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Diamètre d'inhibition (mm)
E. acetylicum
E. marinum
E. profundum
E. aurantiacum
E. aestuarii
Exiguobacterium sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
143
Treize souches avaient cumulé des résistances à des familles d’antibiotiques différentes : 7
souches avaient acquis des résistances à 2 classes antibiotiques et 1 souche à 3 classes
d’antibiotiques (multi-résistante). Cette dernière a été identifiée au genre Exiguobacterium sp. .
III.4.E. Discussion
La résistance aux antibiotiques n’a jamais été étudiée pour le genre Exiguobacterium. Ces
travaux étaient les premiers à établir des seuils épidémiologiques pour ce genre bactérien pour 15
antibiotiques. Seuls les résultats de l’acide fusidique n’ont pas pu être interprétés. De plus, notre
étude n’a pas mis en évidence de résistance naturelle de ce genre bactérien pour les antibiotiques
testés. Cependant, une sensibilité naturelle différente d’Exiguobacterium semble exister en fonction
des espèces du groupe I (psychrophile) ou au groupe II (mésophile, thermophile).
Des populations non-sauvages ont été observées pour les β-lactamines (50 % des souches),
les inhibiteurs de la synthèse des folates (10 % des souches), les aminosides (5 % des souches), les
macrolides (5 % des souches), les glycopeptides (2,5 %) et les tétracyclines (2,5 %). Deux populations
bien distinctes ont pu être mises en évidence sans influence de l’espèce d’Exiguobacterium. De plus,
certaines souches ont également acquis une résistance à la céfoxitine. Les mécanismes connus de
résistance aux β-lactamines pour les bactéries Gram positif sont variés : production de β-lactamases,
mutation au niveau des PLPs ou acquisition de PLP non sensible aux β-lactamines. Une étude plus
approfondie des phénotypes de résistance de ces souches à d’autres molécules de la famille des β-
lactamines : pénicillines, céphalosporines et carbapénèmes pourrait être faite. De plus, la production
de β-lactamase peut être vérifiée par un test à la nitrocéfine. Une étude moléculaire permettrait
d’identifier de potentielles β-lactamases, des mutations dans les séquences de PLP ou des
mécanismes comme la cassette SCCmec connu dans le genre Staphylococcus.
Des phénotypes de résistance aux aminosides ont été observés. Comme pour
Staphylococcus, aucune population non-sauvage pour la kanamycine n’a été mise en évidence, alors
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
144
que des populations non-sauvages ont été détectées pour la tobramycine et la gentamicine. Ces
phénotypes ne correspondaient pas à des mécanismes de résistance
Une souche non-sauvage pour la vancomycine a été détectée. Cet antibiotique est classé par
l’OMS comme hautement prioritaire parmi les antibiotiques d’importance critique (OMS 2017b).
Toutefois, le diamètre d’inhibition de cette souche est à un millimètre du seuil épidémiologique.
Cette différence est considérée comme non significative : la lecture de l’antibiogramme dépend de
l’expérimentateur, le CLSI considère qu’une variation de plus ou moins 2 mm est acceptable entre
deux lectures (CLSI 2018). L’éventuel phénotype non-sauvage de cette souche (AF16-48-CCCH1) pour
la vancomycine devra être confirmé par une autre méthode de détection phénotypique (CMI) ou
moléculaire. Les différents mécanismes connus sont une accumulation de mutations qui vont
entrainer une modification complexe du métabolisme de la synthèse de la paroi bactérienne
(épaississement de la paroi, surproduction des précurseurs de la paroi) et l’acquisition d’opérons de
résistance aux glycopeptides de type Van (EUCAST 2017). Les opérons de type Van sont détectables
par PCR ou séquençage du génome total (Dutka-Malen et al. 1995).
Enfin, nous avons détecté une souche multi-résistante (AF16-19-CCCH2) aux antibiotiques
suivant : tétracycline, pénicilline et sulfamide. Une autre souche identifiée Exiguobacterium sp
porteuse de gènes homologues aux gènes mec, tet, aad, fex, mph et dhfr sur différents plasmides a
été isolée de sédiments d’une ferme d’aquaculture en Chine (Yang et al. 2014). Les mécanismes de
résistance associés aux souches de la population non-sauvage sont toujours inconnus. Cependant, les
potentiel de transferts horizontaux de gènes de ce genre bactériens est peu décrit (Vishnivetskaya et
al. 2009). La description de plasmides est rare (Jakubauskas et al. 2009).
En conclusion, en absence de résistance naturelle aux antibiotiques testés, la méthode de
diffusion en milieu gélosé pour les 16 antimicrobiens testés ici semble pertinente pour détecter des
résistances acquises pour les bactéries du genre Exiguobacterium.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
145
III.5. Pseudomonas
III.5.A. Contexte
Les bactéries du genre Pseudomonas sont ubiquistes, elles sont isolées de nombreux
biotopes (Silby et al. 2011). De plus, ce genre bactérien est fréquemment isolé dans les poissons,
crustacés et différents invertébrés marins (Heinsz et al. 1988, Harris 1993, Austin 2006).
Pseudomonas est également reconnu pour altérer les aliments à base de poissons (Bjørkevoll et al.
2003, Parlapani et al. 2015).
Les résistances naturelles pour l’ensemble des bactéries du genre Pseudomonas sont peu
connues (Lupo et al. 2018). En revanche, celles de l’espèce P. aeruginosa sont abondamment décrites
dans la littérature scientifique (Leclercq et al. 2013, Dreier et Ruggerone 2015, Lupo et al. 2018).
Cette espèce est naturellement résistante aux pénicillines, inhibiteurs de β-lactamines,
céphalosporines 1ère et 2ème génération, certaines céphalosporines 3ème génération, certains
carbapénèmes (ertapénème), inhibiteurs de la synthèse des folates, macrolides, quinolones 1ère
génération, phénicolés, tétracyclines, certains aminosides (kanamycine)(Leclercq et al. 2013).
III.5.B. Panel de souches étudiées
L’étude de la résistance de 54 souches Pseudomonas spp. a été réalisée. Les souches que
nous avons identifiées à l’espèce appartenaient majoritairement au groupe P. fluorescens : P.
brenneri (n=7), P. helmanticiencis (n=2), P. libanensis (n=1), P. weihenstephanensis (n=1) et P. fragi
(n=2). Les autres souches identifiées à l’espèce étaient du groupe P. putida (n=2) : P. mosseli (n=1) et
P. putida (n=1) et une souche appartenait au groupe P. syringae : P. chicorii (n=1). La souche
identifiée P. alcaliphila n’appartenait à aucun groupe de Pseudomonas. Enfin, 41 souches ont été
identifiées qu’au genre.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
146
Dans des études préliminaires au laboratoire, une partie des souches de Pseudomonas
isolées des produits aquatiques ne poussaient pas à 35°C, la température classiquement utilisée pour
incuber les antibiogrammes. Pour étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries de ce genre,
les conditions d’incubation décrites dans le M02 du CLSI ont donc été appliquées (28°C/24h) (CLSI
2006a).
III.5.C. Détermination de la population non-sauvage
Les seuils cliniques et épidémiologiques présents dans les référentiels du CLSI et de l’EUCAST
pour Pseudomonas spp. n’étaient pas exploitables dans cette étude car ils ont été définis dans
d’autres conditions expérimentales (35 °C/16-20 h). Les distributions des diamètres d’inhibition sont
dans l’annexe VI. Des seuils épidémiologiques expérimentaux ont été calculés pour 5 antibiotiques
(ceftazidime, cefotaxime, ciprofloxacine, streptomycine, gentamicine) car la distribution des
diamètres d’inhibition suivait une loi normale (Tableau 26).
Tableau 26 : Population bactérienne Pseudomonas spp. (n =54) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques COWT (mm) Nombre de
souches non-sauvages
Pénicilline ND - Témocilline ND -
Amoxicilline-acide clavulanique
ND -
Céfalotine ND - Céfoxitine ND -
Ceftazidime 23 13 Cefotaxime 15 15
Acide nalidixique 2 - Ciprofloxacine 27 0
Streptomycine 9 16 Gentamicine 19 2
Azithromycine ND -
Cotrimoxazole ND -
Chloramphénicol ND -
Tétracycline ND -
Avec ces seuils, nous avons pu déterminer que 50 % des souches avaient acquis un
phénotype non sauvage pour au moins un antibiotique. La population non-sauvage pour la
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
147
streptomycine représentait 30 % des souches, 4 % pour la gentamicine, 28 % pour le cefotaxime et
24 % pour la ceftazidime.
Pour 5 des β-lactamines testées (ampicilline, témocilline, amoxicilline/clavulanate, céfalotine,
céfoxitine) l’ensemble des souches de Pseudomonas spp présentaient une croissance au contact du
disque d’antibiotique (Figure 15).
Figure 15:Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’ampicilline
Pour l’azithromycine, le cotrimoxazole, le chloramphénicol et la tétracycline, la distribution
des diamètres d’inhibition ne suivait pas une loi normale (Figure 16).
Figure 16 : Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour la tétracycline
Le seuil épidémiologique expérimental calculé pour l’acide nalidixique était de 2 mm (Figure
17). Sachant que le plus petit diamètre qui peut être mesuré est celui du disque d’antibiotique, 6
mm, toutes les souches ont été considérées comme faisant parti de la population sauvage. Le COWT
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Diamètre d'inhibition (mm)
P. alcaliphilaP. putidaP. mosseliiP. cichoriiP. weihenstephanensisP. marginalisP. helmanticiensisP. brenneriP. libanensisP. fragiP. fluorescensPseudomonas sp.
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Diamètre d'inhibition (mm)
P. alcaliphilaP. putidaP. mosseliiP. cichoriiP. weihenstephanensisP. marginalisP. helmanticiensisP. brenneriP. libanensisP. fragiP. fluorescensPseudomonas sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
148
calculé pour l’acide nalidixique n’a pas pu être exploité pour détecter des résistances acquises à cet
antibiotique.
Figure 17: Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’acide nalidixique
III.5.D. Multi-résistance
Huit souches avaient cumulé des phénotypes de résistance à des classes d’antibiotiques
différentes (Tableau 27). Elles avaient acquis des résistances aux céphalosporines 3èmes génération
et/ou aux aminosides.
Tableau 27 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Pseudomonas spp. (n = 27).
Nombre de classes d’antibiotiques avec
phénotype non-sauvage Classes d’antibiotiques
Nombre de souches
Espèces bactériennes
1
Aminoside 8 1 P. mosseli
7 Pseudomonas spp.
β-lactamines 11
2 P. helmanticiencis 3 P. brenneri
1 P. marginalis 5 Pseudomonas spp.
2 β-lactamines - Aminoside 8 2 P. fluorescens 1 P. libanensis
5 Pseudomonas spp.
Les souches de Pseudomonas ont acquis des résistances aux aminosides et aux β-lactamines.
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Diamètre d'inhibition (mm)
P. alcaliphilaP. putidaP. mosseliiP. cichoriiP. weihenstephanensisP. marginalisP. helmanticiensisP. brenneriP. libanensisP. fragiP. fluorescensPseudomonas sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
149
De plus, pour 13 souches, nous avons détecté un antagonisme entre la ceftazidime et la
céfoxitine (Figure 18a et 18b) en sachant que la céfoxitine induit un mécanisme de résistance à la
ceftazidime. Il faut également noter que pour 8 d’entre elles le mécanisme de résistance à la
ceftazidime semblait être aussi induit par l’association amoxicilline/clavulanate (Figure 18b) et que
sept de ces souches appartenaient au groupe P. fluorescens. Les souches présentant ces phénotypes
ont été isolées, pour 14 de cabillauds et pour 2 de poissons plats.
Figure 18: Antibiogrammes des souches de Pseudomonas spp. présentant un phénotype d’induction de résistance à la ceftazidime. a) Souche AF16-309PEPE3. b) Souche AF16-280PECF1. Les antibiotiques écrits en rouge sont ceux impliqués dans le phénotype. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).
III.5.E. Discussion
Les souches de Pseudomonas spp. de notre collection ne poussaient pas dans les conditions
recommandées dans les référentiels CLSI et EUCAST (35°C, 16-18 h). Nous avons donc utilisé les
conditions expérimentales définies dans le M42-A le CLSI pour les bactéries isolées des animaux
aquatiques (28°C, 24h) et nous avons calculé des COWT pour 5 molécules testées. Il y avait une
population non-sauvage pour les céphalosporines 3ème génération (35 % des souches) et les
aminosides (30 % des souches).
FOX FOX AMP AMP AMC AMC CAZ CAZ
CEF CEF CTX CTX TMC TMC CHL CHL
STR STR GEN GEN SXT SXT TET TET
AZM AZM NAL NAL CIP CIP CST CST
a) b)
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
150
En outre, un phénotype d’induction de résistance à la ceftazidime pour les souches du
groupe P. fluorescens a été détecté, il pourrait être dû à la présence d’une céphalosporinase
inductible, comme cela a été montré pour les bactéries de l’espèce P. aeruginosa mais avec un
système d’induction différent (Bagge et al. 2002). Il pourrait également s’agir d’un mécanisme de
résistance acquise. Le(s) mécanisme(s) responsable(s) de ce phénotype restent à déterminer.
Les souches de Pseudomonas spp. ont eu une croissance au contact des disques de
pénicillines, inhibiteur de β-lactamines, céphalosporines 1ère et 2ème génération, inhibiteur de la
synthèse des folates, macrolides et quinolones 1ère génération, phénicolés et tétracyclines. Il semble
que Pseudomonas spp. soit naturellement résistant à ces classes d’antibiotiques. Ce résultat est en
accord avec les résistances intrinsèques de P. aeruginosa décrites dans le référentiel EUCAST
(Leclercq et al. 2013).
De plus, le changement de protocole, en diminuant la température d’incubation des
antibiogrammes, a pu entraîner une moins bonne diffusion des antibiotiques. Une perte de précision
dans la mesure des diamètres pourrait être observée, accentuant la difficulté à établir des seuils
épidémiologiques expérimentaux (Smith et Kronvall 2015, Smith et al. 2018). Les distributions des
diamètres d’inhibition au niveau du genre n’ont pas montré l’apparition de sous-population liée à
des espèces de Pseudomonas. Les COWT calculés pour Pseudomonas spp. apparaissent pertinent pour
l’ensemble des molécules testées, excepté pour les céphalosporines 3ème génération.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
151
III.6. Vibrio
III.6.A. Contexte
Les bactéries du genre Vibrio sont naturellement présentes dans le milieu aquatique. Ces
bactéries ont deux chromosomes, des plasmides et sont réputées pour leur plasticité génétique. Elles
possèdent des intégrons chromosomiques pouvant cumuler jusqu’à 180 cassettes de gènes (Rowe-
Magnus et al. 2003). De plus, Les souches de Vibrio peuvent acquérir des éléments génétiques
mobiles comme des plasmides ou des ICEs (Waldor et al. 1996, Makino et al. 2003, Hazen et al.
2010). Elles ont donc un potentiel d’acquisition de gènes de résistance. Les résistances naturelles des
souches de ce genre bactérien sont peu décrites. Dans le référentiel du CLSI, il est indiqué que les
souches de Vibrio halophiles sont souvent résistantes aux sulfamides, pénicillines et céphalosporines
1ère génération (CLSI 2015).
III.6.B. Panel de souches étudiées
La résistance aux antibiotiques a été testée pour 46 souches de Vibrio spp. donc 33 souches
qui n’étaient pas identifiées à l’espèce, 8 identifiées V. metschnikovii, 4 identifiées V. alginolyticus, et
1 identifiée V. natriegens.
III.6.C. Etude de la résistance aux antibiotiques
Il n’existe pas d’ECOFF pour le genre Vibrio. Il y avait 9 antibiotiques pour lesquels des seuils
cliniques ont été définis dans le référentiel du CLSI. Les distributions de diamètres d’inhibitions sont
présentées dans l’annexe VII. De plus, nous avons pu déterminer des COWT pour 9 antibiotiques pour
Vibrio spp. (Tableau 28).
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
152
Tableau 28: Population bactérienne Vibrio spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques
Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal de
souche ayant
acquis une résistance
COwt
(mm) Vibrio spp.
Nombre de souches non-sauvages (%)
Seuil S/IR (mm) CLSI
Nombre de souches avec un
diamètre inférieur au seuil S/IR
Ampicilline ND - 16 23 23 Témocilline 16 1 0 Amoxicilline
acide clavulanique
SP - 17 0 0
Céfalotine SP - - Céfoxitine 15 0 17 1 0
Cefotaxime 28 0 25 0 0 Ceftazidime 21 1 20 0 0
Acide nalidixique EC - - Ciprofloxacine EC - 20 0 0
Streptomycine 8 0 0 Gentamicine 12 0 14 0 0
Azithromycine EC - -
Chloramphénicol 25 0 18 0 0
Tétracycline 22 0 14 0 0
Cotrimoxazole 24 0 15 0 0
Au total, 50 % des souches étaient résistantes à l’ampicilline et il y avait une seule souche,
identifiée Vibrio spp., avec un phénotype non-sauvage pour la témocilline et la ceftazidime. En
étudiant les diamètres d’inhibition, nous avons remarqué que leur distribution pour l’ampicilline ne
suivait pas une loi normale (Figure 19) et que pour 3 antibiotiques (acide nalidixique, ciprofloxacine
et azithromycine), les écart-types étaient trop grands pour valider le COWT.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
153
Figure 19: Distribution des diamètres d'inhibition de Vibrio spp pour l'ampicilline.
De plus, pour la céfalotine et l’association amoxicilline/clavulanate, deux sous-populations
distinctes ont pu être observées. La première constituée de V. metschnikovii et la seconde, avec des
diamètres d’inhibition plus faibles, constitués par les autres Vibrio identifiées à l’espèce (Figure 20).
Les effectifs des souches n’étaient pas assez élevés pour déterminer des seuils épidémiologiques
pour chaque sous-population.
Figure 20 : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio spp. a) amoxicilline/clavulanate, b) céfalotine.
III.6.D. Discussion
Nous n’avons pas détecté d’acquisition de résistance des souches de Vibrio spp. isolées des
produits aquatiques analysés. Les résistances naturelles et acquises des bactéries du genre Vibrio
sont peu décrites dans la littérature scientifique, exceptées des taux élevés (supérieurs à 80 %) de
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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re d
e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp.
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3
4
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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
No
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ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
a) Vibrio sp V. alginolyticus V. natriegens V. metschnikovii
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Diamètre d'inhibition (mm)
b) Vibrio sp V. alginolyticus V. natriegens V. metschnikovii
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
154
souches présentant des CMI supérieures à 256 µg.mL-1 aux pénicillines pour les souches des espèces
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi et V. ichthyoenteri (Joseph et al. 1978, Teo et al.
2000, Lee et al. 2012). Nos résultats ont montré que V. metschnikovii et la plupart des Vibrio spp. que
nous avons isolés étaient également tous résistants à l’ampicilline. Les génomes séquencés des
souches V. alginolyticus, V. splendidus, V. campbelli, V. angustum, V. shilonii, V. coralliiitycus et V.
parahaemolyticus contiennent des β-lactamases chromosomiques de type carbénicillinase
responsables de la résistance intrinsèque des Vibrio spp. aux pénicillines (Fosse 2012, Chiou et al.
2015). La variabilité de ces séquences protéiques et de leur expression explique les niveaux de
résistance aux β-lactamines plus ou moins grands observés pour Vibrio spp. (Chiou et al. 2015). Enfin,
la précision de mesure des diamètres d’inhibition est de ±2 mm (Barry et al. 1979, CLSI 2012, Smith
et al. 2018). Les souches, dont les diamètres d’inhibition sont proches des seuils épidémiologiques (±
2 mm), soit ont acquis un mécanisme de résistance, soit avait un phénotype sauvage et le diamètre
mesuré était dans l’incertitude de mesure. Des études plus approfondies de recherche des
mécanismes de résistance permettrait de savoir s’il y a la présence de mécanisme de résistance
(mécanismes peu efficaces, mal exprimés, inconnus) ou si nous étions dans la limite de précision de
la méthode. La question se pose notamment pour les souches ayant acquis un phénotype non-
sauvage pour le chloramphénicol et la témocilline. De plus, il n’a pas été possible de valider des COWT
pour les macrolides et les quinolones pour le genre Vibrio car il faudrait calculer des COWT par
espèces de Vibrio mais notre collection ne contenait pas assez de souches par espèce espèce pour
calculer des COWT.
Enfin, le disque de streptomycine n’est pas pertinent à tester in vitro. Le COWT calculé est très
bas et ne permet pas de détecter une population non -sauvage de Vibrio. Pourtant de nombreuses
études ont mis en évidence, par des méthodes phénotypiques comme génotypiques, l’acquisition de
mécanismes de résistance à la streptomycine par Vibrio spp. (Bier et al. 2015, Baron et al. 2017b). Si
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
155
la streptomycine n’est pas une molécule d’intérêt pour le traitement des zoonoses alimentaires, son
intérêt comme marqueur épidémiologique pour évaluer la richesse d’un réservoir en gène de
résistance est moins contestée. Il pourrait être intéressant de tester des disques de streptomycine
avec une charge plus élevée que celle recommandée dans le CLSI (10 µg), en testant par exemple les
disques chargés à 300 µg, utilisés habituellement pour caractériser les phénotypes de résistance aux
aminosides des entérocoques (CLSI 2016b).
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
156
III.7. Proteus
III.7.A. Contexte
La classification bactérienne des espèces au sein de l’ordre des Enterobacteriales a été
redéfinie récemment (Adeolu et al. 2016). L’ordre s’intitule Enterobacterales et 7 familles
bactériennes ont été définies : Enterobacteriaceae, Hafniaceae, Morganellaceae, Erwiniaeceae,
Yersiniaceae, Pectobacteriaceae et Budviciaeae. Nous avons étudié plus spécifiquement le genre
Proteus. Ces bactéries sont naturellement résistantes aux pénicillines et céphalosporines 1ère
génération sauf l’espèce P. mirabilis. De plus, les souches de Proteus spp. sont naturellement
résistantes aux tétracyclines, polymyxines et nitrofuranes (Leclercq et al. 2013, CLSI 2016b).
III.7.B. Panel de souches étudiées
L’étude de la résistance aux antibiotiques a été réalisée pour les souches de Proteus spp. car
c’était le seul genre bactérien pour lequel il y avait plus de 30 souches. Vingt-une n’ont pas
d’identification à l’espèce, 6 étaient identifiées comme P. vulgaris, 3 comme P. hauseri et 2 comme P.
terrae.
III.7.C. Etude de la résistance aux antibiotiques
Il n’y avait pas d’ECOFF défini pour Proteus spp. ou les espèces que nous avons identifiées.
Des seuils cliniques existaient dans les référentiels du CLSI et de l’EUCAST (Tableau 29). Les
distributions des diamètres d’inhibitions sont présentées dans l’annexe VIII.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
157
Tableau 29: Population bactérienne Proteus spp. (n=32) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.
Antibiotiques
Seuils épidémiologiques
Seuils cliniques
Nombre de
souches maximal
COwt
(mm)
Nombre de
souches non-
sauvage
Seuil S/IR (mm)
EUCAST
Nombre de souches avec un
diamètre inférieur seuil S/IR
Seuil S/IR (mm) CLSI
Nombre de souches avec un
diamètre inférieur seuil S/IR
Ampicilline ND - 14 29 16 29 29 Témocilline 23 0 0 Amoxicilline
acide clavulanique
SP - 19 0 17 0 0
Céfalotine ND - - Céfoxitine 14 0 19 0 17 0 0
Cefotaxime 27 0 17 0 0 Ceftazidime 30 0 25 0 0
Acide nalidixique 23 0 18 0 0 Ciprofloxacine 33 14 26 0 20 0 14
Streptomycine 17 0 14 0 0 Gentamicine 22 1 17 0 14 0 1
Azithromycine 6 0 0
Chloramphénicol SP - 17 1 17 2 2
Tétracyclinea SP - 14 26 26
cotrimoxazole 23 0 14 0 15 0 0
a) Résistance naturelle
Au total, 29 souches étaient classées résistantes à l’ampicilline et 26 souches étaient
considérées résistantes à la tétracycline. Dans les référentiels, les bactéries du genre Proteus spp.
sont naturellement résistantes à ces antibiotiques.
Deux souches avaient acquis une résistance au chloramphénicol et une seule à la
gentamicine.
De plus, le COwt calculé pour la ciprofloxacine a permis de détecter une population non-
sauvage pour 14 souches, or aucune de ces souches n’avait de phénotype non-sauvage pour l’acide
nalidixique. Ce phénotype de résistance est impossible et le seuil défini pour la ciprofloxacine n’a pas
été pris en compte pour la suite de l’analyse des résultats.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
158
Dans le référentiel de l’EUCAST, il n’y a pas d’ECOFF pour le genre Proteus donc des COWT ont
été calculés pour tous les antibiotiques. Pour l’ampicilline et la céfalotine, la population bactérienne
avait majoritairement une croissance au contact du disque et donc aucun seuil n’a pu être calculé
(Figure 21).
Figure 21 : Distribution des diamètres d’inhibition de Proteus spp. pour l’ampicilline.
Pour l’association amoxicilline/clavulanate, la tétracycline et le chloramphénicol, des sous-
populations d’espèces de résistance différentes ont été observées (Figure 22) ce qui fait que nous
n’avons pas pu calculer de seuils épidémiologiques expérimentaux pour ces antibiotiques.
Figure 22 : Distribution des diamètres d'inhibition du chloramphénicol pour Proteus spp
0
5
10
15
20
25
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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
No
mb
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s
Diamètre d'inhibition (mm)
P. terrae
P. hauseri
P.vulgaris
Proteus sp.
0
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2
3
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6
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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
P. terrae
P. hauseri
P.vulgaris
Proteus sp.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
159
III.7.D. Discussion
Trois souches ont été montrées pour avoir acquis des résistances aux aminosides ou aux
phénicolés mais les mécanismes restent à déterminer.
Les résistances naturelles des bactéries de la famille des Enterobacteriales sont décrites dans
la littérature. Les bactéries du genre Proteus, excepté P. mirabilis, produisent naturellement une
céphalosporinase inductible (Bonnet 2012). Cela confère une résistance naturelle aux pénicillines et
aux céphalosporines 1ère génération (Bonnet 2012, Leclercq et al. 2013). De plus, les bactéries du
genre Proteus sont également naturellement résistantes à la tétracycline. Cela explique, pour ces
antibiotiques, que la quasi-totalité des souches soient catégorisées résistantes ou intermédiaires
cliniquement pour ces antibiotiques. Le phénotype de résistance naturelle n’a pas été observée pour
3 souches de P. hauseri, 2 souches de P. vulgaris et 1 Proteus sp. Il est possible les mécanismes de
résistance ne soient pas exprimés ou alors que l’identification bactérienne ne soit pas bonne.
Néanmoins, ces souches ont été identifiées par séquençage de l’ADNr 16S, ce gène n’est pas
pertinent pour identifier les Enterobacteriales. L’identification bactérienne de ces souches peut être
erronée.
Pour les quinolones, nous avons détecté des souches ayant acquis des résistances à la
ciprofloxacine mais pas à l’acide nalidixique. Ces phénotypes de résistance sont impossibles car les
mécanismes connus pour cette famille d’antibiotiques affectent d’abord l’activité des quinolones 1ère
génération et ensuite les fluoroquinolones (Soussy 2012). Il est possible que le faible nombre de
souches, l’hétérogénéité de sensibilité des espèces ait artificiellement augmenté la valeur du COwt. Il
est également possible que l’étude de l’acide nalidixique par diffusion par disque ne permette pas de
différencier les populations bactériennes sauvages des populations non-sauvages ayant acquis des
résistances.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
160
IV. Antibiorésistance et produits de la pêche et de l’aquaculture
IV.1. Contexte
Les bactéries étudiées ont été isolées de matrices alimentaires de différentes catégories
(poissons, crustacés, mollusques). De même, ces matrices provenaient soit de la pêche au niveau
européen (cabillaud et poissons plats) ou international (homards, noix de Saint-Jacques) soit de
l’aquaculture au niveau européen (moules et huîtres) ou international (crevettes). Après avoir
analysé les résultats des antibiogrammes par genre bactérien, nous avons analysé ces mêmes
résultats en fonction de la catégorie des produits et de leur origine géographique afin de déterminer
si ces facteurs avaient un impact sur la présence spécifique ou non de souches/ genres bactériens
résistants à certains antibiotiques.
IV.2. Résultats
Un total de 30 % des souches bactériennes étudiées en antibiorésistance (Enterococcus spp.,
Staphylococcus spp., Exiguobacterium spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp. et Proteus spp.) avait un
phénotype non-sauvage pour au moins une classe d’antibiotique, 13 % pour au moins deux classes
d’antibiotiques, 2 % pour 3 classes d’antibiotiques et 1 % pour 4 classes d’antibiotiques. En regardant
le mode de production des animaux dans lesquels ces bactéries résistantes ont été détectées, 73 %
des isolats étaient présents dans des produits provenant de l’aquaculture (crevettes, moules et
huîtres) contre 35 % dans des animaux provenant de la pêche en mer (cabillauds, poissons plats, noix
de Saint-Jacques et homards) (Figure 23).
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
161
Figure 23: Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés en fonction du mode de production des matrices d’isolement. Les produits issus de la pêche sont les cabillauds, poissons plats, noix de Saint-Jacques et homards. Les produits issus d’aquaculture sont les crevettes, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Pr=Proteus, Ps=Pseudomonas, Vr=Vibrio.
Les proportions de souches résistantes isolées des produits de la pêche étaient de 35 %. Les
proportions de souches résistantes étaient comprises de 0 % pour le genre Vibrio à 85 % pour le
genre Enterococcus. La population bactérienne non-sauvage représentait 73 % des souches isolées
des animaux d’élevage, de 0 % pour le genre Vibrio à 95 % pour le genre Exiguobacterium. La
différence de taux de bactéries résistantes, en fonction du mode de production des matrices, était
plus importante pour les genres Exiguobacterium et Pseudomonas par rapport aux autres genres. En
effet, les populations non-sauvages dans les produits issus de la pêche étaient de 15 % des souches
pour Exiguobacterium et 41 % pour Pseudomonas contre 95 % des souches d’Exiguobacterium et 79
% des souches de Pseudomonas dans les produits d’aquaculture. Par contre, pour le genre
Staphylococcus, la proportion de population non-sauvage représentait 74 % des souches isolées des
produits de la pêche contre 52 % des souches isolées des produits de l’aquaculture. Enfin, il est
important de noter que des souches multi-résistantes du genre Enterococcus (6/7 souches) ont été
isolées dans des produits issus de la pêche et des genres Enterococcus (1/7 souches) et la souche
multi-résistante Exiguobacterium a été isolée des produits de l’aquaculture.
En outre, les populations bactériennes non-sauvages étaient équivalentes dans les produits
importés (crevettes, homards et noix de Saint-Jacques) et dans les produits français (cabillauds,
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
St En Ex Pr Ps Vr St En Ex Pr Ps Vr
pêche aquaculture
Tau
x d
e s
ou
che
s
Genres bactériens selon le mode de production des matrices alimentaires
résistant à 4 classes
résistant à 3 classes
résistant à 2 classes
résistant à 1 classe
phénotype sauvage
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
162
poissons plats, moules et huîtres) où elles représentaient 47 % et 43 % des souches résistantes
respectivement (Figure 24). Les proportions de souches résistantes allaient de 0% pour le genre
Vibrio à 91 % pour le genre Enterococcus dans les produits importés et de 0 % pour le genre Vibrio à
80 % pour le genre Enterococcus dans les produits français. Enfin, il est important de noter que des
souches multi-résistantes des genres Enterococcus (5/7souches) et la souche multi-résistante
Exiguobacterium ont été isolées dans des produits importés et le genre Enterococcus (2/7 souches)
isolées des produits français.
Figure 24 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés selon le lieu de production. Les produits importés sont les crevettes, Saint-Jacques et homards. La production Européenne comprend les cabillauds, poissons plats, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio.
En revanche, si nous regardons les proportions de souches résistantes aux antibiotiques par
genre bactérien et par nature de produits de la pêche et de l’aquaculture, celles-ci étaient distribuées
de manière très hétérogène (Figure 25).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
St En Ex Pr Ps Vr St En Ex Pr Ps Vr
Importé Production française
Tau
x d
e s
ou
che
s
Genre bactériens isolés en fonction du lieu de production de la matrice
résistant à 4 classes
résistant à 3 classes
résistant à 2 classes
résistant à 1 classe
phénotype sauvage
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
163
Figure 25 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par matrice alimentaire et par genres bactériens étudiés. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio.
Il faut noter que tous les genres bactériens étudiés en antibiorésistance n’ont pas été isolés
dans toutes les matrices alimentaires analysées. En effet, les 6 genres bactériens ont été détectés
dans 3 matrices alimentaires (cabillaud, poissons plats, noix de Saint-Jacques) alors qu’il y avait 4-5
genres dans les crevettes, homards et moules et seulement le genre Staphylococcus dans les huîtres.
Globalement, la proportion la plus importante de souches ayant acquis une résistance était dans la
matrice crevettes (88 %) avec les genres Staphylococcus, Enterococcus, Exiguobacterium et
Pseudomonas. Les proportions des souches résistantes dans les autres produits étaient plus faibles,
de 0 % dans les huîtres à 50 % dans les échantillons de moules et très dépendant des genres
bactériens. En effet, la totalité des souches de Staphylococcus spp. isolées des noix de Saint-Jacques
(2/2 souches) et des homards (1/1 souches) étaient résistantes à au moins une classe d’antibiotiques.
De même, la totalité des souches du genre Enterococcus isolées des homards (2/2 souches) et des
crevettes étaient résistantes à au moins un antibiotique ainsi que 81 % de celles isolées des poissons
plats. Des souches multi-résistantes du genre Enterococcus ont également été détectées dans les
poissons plats (2/7 souches), les crevettes (1/7 souches ), les homards (1/7 souches) et des noix de
Saint-Jacques (3/7 souches). Presque toutes les souches du genre Exiguobacterium isolées des
échantillons de crevettes avaient acquis au moins une résistance (19/20 souches). Dans les autres
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr
Cabillaud Poisson plat Crevette Homard Saint-Jacques Moule Huître
Tau
x d
e s
ou
che
s
Genres bactériens par matrice alimentaire
phénotype sauvage résistant à 1 classe résistant à 2 classes résistant à 3 classes résistant à 4 classes
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
164
produits où ce genre bactérien a été isolé les proportions de souches résistantes étaient plus faibles :
2/7 souches dans les homards et 1/9 dans les cabillauds. En revanche, la souche multi-résistante du
genre Exiguobacterium a été isolée dans les crevettes. Enfin, les proportions de Pseudomonas spp.
ayant acquis une résistance était plus importante dans les échantillons de moules (5/6 souches), de
cabillauds (12/23 souches) et de crevettes (5/7 souches) que dans les autres matrices alimentaires.
IV.3. Discussion
Nous avons observé que les animaux provenant de l’aquaculture étaient plus contaminés (70
%) par des bactéries résistantes aux antibiotiques avec même deux genres bactériens multi-résistants
(Enterococcus, Exigobacterium) que les animaux de capture (26 %) dans lesquels un genre bactérien
multi-résistant a été isolé (Enterococcus). De plus, le taux de bactéries résistantes isolées des
crevettes était plus élevé que dans les autres matrices. Un certain nombre de produits aquatiques
importés sont issus de l’aquaculture dont les pratiques d’usage des antibiotiques ne sont toujours
pas bien connues. Les données françaises relatives aux ventes d’antibiotiques indiquent que 0.5% des
antibiotiques sont utilisées en élevage piscicole. D’autres données sont très variables selon les pays
mais il a été montré par exemple une augmentation de la consommation des quinolones et
fluoroquinolones au Chili pour un usage principalement en aquaculture. Certaines molécules
antibiotiques sont stables et se dégradent très lentement si bien que ces pratiques peuvent
engendrer un relarguage très important de principe actif dans l’environnement aquatiques, on
estime que 80% des antibiotiques utilisés se retrouvent de façon active dans l’environnement
potentiellement à l’origine de sélection de bactéries résistantes dans le milieu (Cabello et al. 2013).
Les crevettes sont des animaux principalement élevées dans les pays en développement tropicaux
dont 87 % se fait en Asie (ifremer 2011). En effet, Boss et al. (2016) ont remarqué que des pangas et
des crevettes, élevés en Asie, étaient contaminés avec des bactéries multi-résistantes (E. coli, E.
faecalis et S. aureus) alors que des saumons et des huîtres, élevés dans des pays tempérés, ne
l’étaient pas. Les causes de ces différences de contamination entre les produits d’élevage de pays
tropicaux ou de pays tempérés restent à déterminer : différences dans l’usage des antibiotiques
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
165
utilisés en aquaculture, eaux chaudes favorisant plus le développement bactérien et/ ou de certains
genres bactériens que les eaux tempérées. En outre, dans les pays en tropicaux, des crues ou des
inondations causées par des pluies importantes lors de la saison humide (ouragans, tempêtes
tropicales, moussons) peuvent favoriser l’apport massif de bactéries fécales humaines et animales et
donc de leurs résistances vers le milieu aquatique (Yu et al. 2018). Cela pourrait favoriser la
dissémination des bactéries résistantes et de leurs gènes de résistance entre les milieux terrestre et
aquatique. De plus, l’aquaculture intégré, utilisé notamment en Asie est également un facteur de
transmission et de sélection de résistance aux antibiotiques dans le milieu aquatique (Petersen et
Dalsgaard 2003). En outre, ces dernières années, des crevettes d’aquaculture importées d’Asie du
sud-est et du Viêt-Nam, porteuses de bactéries Vibrio et Enterobacter productrices des
carbapénémases VCC-1, NDM-1 et IMI-1 ont été décrites (Mangat et al. 2016, Briet et al. 2018,
Brouwer et al. 2018). Il est estimé que 80 % des antibiotiques données en aquaculture partent
directement dans le milieu aquatique environnant, créant une pression de sélection favorisant les
bactéries résistantes dans l’eau et les sédiments autour des fermes d’élevage (Cabello et al. 2016,
Watts et al. 2017). De plus, les courants marins peuvent également disséminer les antibiotiques et
les bactéries résistantes présentes autour des fermes d’élevage aquatique.
D’ailleurs, une proportion non négligeable de souches résistantes a été observée dans les
produits marins de capture. L’origine de ces contaminations reste à déterminer. En effet, ces
bactéries peuvent être naturellement présentes sur les animaux ou alors provenir de bactéries
résistantes provenant du milieu terrestre. En effet, l’eau et les sédiments marins, notamment des
estuaires et des côtes sont soumis à de fortes pressions anthropiques. Des résidus de médicaments
utilisés en médecine humaine ou vétérinaire et des bactéries porteuses de résistance aux
antibiotiques peuvent se retrouver directement ou indirectement dans l’environnement via les
stations d’épuration qui n’éliminent que partiellement les micro-organismes et les substances
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
166
médicamenteuses, via les rejets des fermes aquacoles, ou via les eaux de ruissellement dans le milieu
agricole(Abraham 2010, Davies et Davies 2010, Bousquet-Mélou et Madec 2012), et peuvent
contaminer les animaux marins et les oiseaux comme décrit par Bogomolni et al. (2008). Une étude
sur l’estuaire de la Seine, un fleuve subissant une forte pression anthropique et agricole, a montré
que 50 % des souches E. coli isolées avaient acquis des résistances à au moins une classe
d’antibiotiques (Laroche et al. 2009). Cependant, des questions se posent toujours sur le devenir de
ces bactéries résistantes et de leur résistance, une fois arrivée dans le milieu marin (disparition par
prédation par les phages et les protozoaires, l’intégration dans un biofilm, dissémination des gènes
de résistance aux bactéries aquatiques, présence d’un effet de dilution, …). De plus, des études ont
montré que des bactéries comme Enterococcus spp. pouvaient adhérer et persister dans un état
viable non cultivable sur du plancton (Signoretto et al. 2004). En parallèle, d’autres études ont
montré que les particules inorganiques comme des microplastiques présentes dans le milieu
aquatique pouvaient servir de support pour la formation de biofilms bactériens (Zettler et al. 2013,
Ogonowski et al. 2018) et donc se posent la question de la présence possible de bactéries avec des
résistances acquises au sein de ces biofilms qui sont mixtes. De plus, des bactéries résistantes (et
leurs gènes de résistance) charriées par les effluents terrestres, pourraient se loger dans des biofilms
sédimentaires ou sur des particules organiques ou inorganiques en suspension et se déplacer au gré
des courants marins (Cabello et al. 2016). Les animaux marins sauvages peuvent être contaminés par
des bactéries résistantes en contact avec ces particules en suspensions ou les sédiments marins.
Il est également possible que certaines résistances que nous avons considérées comme
acquises étaient des résistances naturelles. Cette question s’est posée principalement pour les
souches de Pseudomonas spp. vis-à-vis des céphalosporines 3èmes génération. En effet, un phénotype
d’induction de résistance à la ceftazidime par la cefoxitine a été remarqué pour certaines souches qui
étaient identifiées comme faisant partie du clade P. fluorescens. Malheureusement, le taux
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
167
d’identification à l’espèce était faible et il n’a pas été possible de déterminer si ce mécanisme était
une résistance naturelle spécifique à des espèces de ce clade ou une acquisition de résistance. Il est
possible qu’il y ait eu une surestimation du nombre de résistances acquises.
De même, les produits importés comportaient plus de bactéries résistantes que les produits
français ce qui est très lié à la catégorie de produits analysés. En effet, les produits importés étaient
principalement constitués des crevettes issus de l’aquaculture par rapport aux produits français qui
étaient plus issus de la pêche (cabillauds, poissons plats, moules et huîtres). Cependant, la notion de
produits français est vague pour les produits de la pêche car les produits ont été obtenus auprès de
bateaux de pêche sous pavillon français. Cependant, des espèces comme le cabillaud ne sont pas
pêchées dans les eaux territoriales françaises mais dans les eaux de pays membres de l’Union-
Européenne ou internationales. Par exemple, certains échantillons de cabillauds ont été pêchés par
un bateau français, puis débarqués en Ecosse et transportés en camion jusque Boulogne sur mer.
En conclusion, la présence de bactéries ayant acquis des résistances à au moins une classe
d’antibiotiques, dont deux genres bactériens (Enterococcus et Exigobacterium) avec des souches
multi-résistantes, montrent que les produits marins, qu’ils proviennent d’élevage ou de la pêche,
sont un réservoir de bactéries résistantes aux antibiotiques. D’autres études font le même constat,
pour des produits importés en Suisse ou produits au Japon (Ahmed et al. 2015, Boss et al. 2016).
V. Bactérie (s) candidate(s) potentielle(s) indicatrice(s) de la
résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche et de
l’aquaculture
V.1. Contexte
Il est important de pouvoir surveiller des bactéries indicatrices dans le milieu terrestre mais
également dans le milieu marin. En effet, les bactéries aquatiques autochtones représentent des
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
168
vecteurs intermédiaires potentiels permettant le transfert de gènes de résistance présents
naturellement dans les bactéries environnementales vers les bactéries zoonotiques. Ainsi de
nombreuses résistances bactériennes identifiées et largement disséminés parmi les pathogènes de
l’Homme et des animaux terrestres, proviennent initialement de bactéries aquatiques. Cela
comprend par exemple, l’émergence de la résistance aux quinolones d’origine plasmidique, portée
par les gènes qnr (Plasmid mediated quinolone resistance) identifié pour la première fois chez Vibrio,
Shewanella et Aeromonas(Poirel et al. 2005, Cattoir et al. 2008, Xia et al. 2010), la détection de
nouvelles β-lactamases présentes chez Photobacterium damselae (Morii et al., 2004) et
Oceanobacillus iheyensis (Toth et al. 2010), la détection d’un nouveau déterminant de la résistance à
la fosfomycine isolé de l’environnement aquatique (Xu et al. 2011), la très large dissémination du
gène floR parmi les bactéries pathogènes chez l’Homme (Arcangioli et al. 1999, Bolton et al. 1999,
Cloeckaert et al. 2000, Cloeckaert et al. 2001) et encore d’autres gènes de résistance au
chloramphénicol identifiés à partir de bactéries aquatiques telles que Photobacterium, Vibrio,
Shewanella (Van Hoek et al. 2011, Roberts et al. 2012). La sélection de bactéries résistantes dans le
milieu aquatique peut survenir de plusieurs façons, comme par sélection spontanée de bactéries
mutantes au sein de l’environnement aquatique présentant une densité importante de bactéries,
cette densité augmente considérablement en aquaculture ce qui va favoriser la sélection, les
transferts et diffusion de bactéries résistantes d’autant plus que le milieu pourra contenir des doses
sub-inhibitrices d’antibiotiques. Ces échanges et transferts peuvent notamment avoir lieu au sein du
tractus gastro-intestinal des espèces aquatiques qui vont alors encore amplifier la diffusion via divers
éléments génétiques mobiles. D’autres facteurs peuvent intervenir dans la sélection de bactéries
résistantes comme l’alimentation apportée aux espèces élevées en aquaculture. Mais à ce jour, pour
le milieu aquatique, il n’y a pas de genres bactériens définis comme bactéries indicatrices comme
dans le milieu terrestre avec Escherichia coli, Enterococcus faecium et E. faecalis. La question se pose
de savoir s’il est pertinent de surveiller les mêmes bactéries indicatrices dans le milieu terrestre et
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
169
dans le milieu aquatique car ce sont deux milieux très différents au niveau par exemple de la
diversité des animaux, de la possibilité de dissémination des bactéries et/ ou gènes de résistance.
De plus, pour être reconnue comme bactérie(s) indicatrice(s) de la résistance aux
antibiotiques dans les produits aquatiques, le(s) genre(s) ou espèce(s) bactérienne(s) doivent
respecter plusieurs critères :
En premier lieu, les bactéries indicatrices doivent être isolées facilement d’une grande
majorité des échantillons analysés. Dans les plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques
des animaux de rentes, E. coli est isolée de 95 à 100 % des échantillons de fèces tandis que les taux
d’isolement pour Enterococcus spp. des fèces est plus faible, près de 50 % des échantillons de fèces
de volailles (EFSA 2014). Dans le cas contraire, il faudrait un nombre trop importants d’échantillons
pour avoir un plan d’échantillonnage robuste.
Dans un deuxième temps, l’identification de l’espèce bactérienne doit être facile. Certaines
résistances naturelles sont liées aux espèces, et pour interpréter un antibiogramme correctement, il
est nécessaire de connaitre les résistances naturelles.
Dans un troisième temps, il faut qu’elles puissent être cultivées dans les conditions classiques
de l’antibiogramme (gélose Mueller-Hinton, 35 °C) et qui ne dégradent pas l’antibiotique.
Enfin, la bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques doit être capable d’acquérir et
perdre des mécanismes de résistance. Cela se traduit par une diversité de profil de résistances et une
richesse des mécanismes de résistance.
Si une espèce bactérienne ne respecte pas ces critères, il ne sera pas possible de mettre en
place une surveillance de la résistance aux antibiotiques pertinente. Il serait également intéressant
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
170
d’avoir une bactérie indicatrice Gram positif et une Gram négatif car elles n’ont pas les mêmes
mécanismes de résistance.
Dans l’idéal, il faudrait que des critères d’interprétation épidémiologiques soient disponibles.
Ce critère n’est pas rédhibitoire comme les autres ; en effet, ces seuils sont définis pour un nombre
restreint d’espèces et de genres bactériens, notamment les espèces pathogènes (www.eucast.org).
Pourtant, les seuils épidémiologiques permettent de s’affranchir du facteur pharmacodynamie
(patient/hôte) pour la détection de résistance. En effet, dans un but d’études épidémiologiques, de
surveillance de l’évolution et de l’émergence des résistances aux antibiotiques, il est important de
prendre en compte la résistance microbiologique des bactéries à un antibiotique, sans prendre en
compte l’éventuel impact clinique.
Dans cette partie, nous avons discuté de la pertinence des 6 genres bactériens dont la
résistance aux antibiotiques a été étudiée (Enterococcus, Staphylococcus, Exiguobacterium,
Pseudomonas, Vibrio et Proteus).
V.2. Résultats
Chaque genre bactérien dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée respecte à
différents degrés les différents critères définis (Tableau 30).
Tableau 30: Caractéristiques des genres bactériens dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée selon les critères pour être une bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques. ECOFF= seuils épidémiologiques définis pas EUCAST.
Genres bactériens
Prévalence dans les types de produits Taux
d’identification à l’espèce
Conditions antibiogramm
e
Nombre profil de résistanc
e
ECOFF existants
. Po*
(n=30)
Cr* (n=106
)
Mo* (n=45
)
Enterococcus 50 % 11 % 33 % 89 % 35 °C 18-20h 19 Oui Staphylococcus 73 % 9 % 20 % 82 % 35 °C 18-20h 10 Oui Exiguobacteriu
m 43 % 28 % 2 % 80 % 35 °C 18-20h 8 Non
Pseudomonas 87 % 3 % 8 % 39 % 28 °C-24h 3 Non Vibrio 13 % 4 % 27 % 49 % 35 °C 18-20h 0 Non
Proteus 33 % 2 % 9 % 63 % 35 °C 18-20h 2 Non
*Po=poissons, Cr= crustacés, Mo=mollusques
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
171
Aucun des genres bactériens n’a été isolé dans plus de 50 % des échantillons de crustacés ou
de mollusques. Par contre, les genres bactériens Enterococcus, Staphylococcus et Pseudomonas ont
été isolés dans plus de 50 % des échantillons de poissons. Mais le genre Pseudomonas est éliminé car
les conditions d’antibiogramme sont particulières. En outre, les techniques d’identification utilisées
dans ces travaux étaient efficaces pour identifier les espèces des genres Enterococcus,
Staphylococcus et Exiguobacterium mais non pertinentes pour obtenir les espèces de Pseudomonas,
Vibrio et Proteus. De même le nombre de profils de résistance différents détectés était le plus
important pour Enterococcus (19 profils). Au contraire, les genres bactériens Vibrio, Proteus et
Pseudomonas avaient un nombre de résistance de profil de résistance faible, de 0 à 3
respectivement. Enfin, il y avait 8 à 10 profils de résistance différents pour les autres genres
bactériens. Au final, seul le genre Staphylococcus remplissait les différents critères pour être de
potentielles bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques, mais uniquement pour les
poissons.
V.3. Discussion
A ce jour, pour le milieu aquatique, il n’y a pas de genres bactériens définis comme bactéries
indicatrices comme dans le milieu terrestre avec comme bactérie Gram négatif Escherichia coli, et
comme bactérie Gram positif Enterococcus faecium et E. faecalis.
Dans cette étude, les bactéries Gram négatif qui ont été étudiées en antibiorésistance étaient
Pseudomonas, Vibrio et Proteus. Le genre Vibrio a été une piste envisagée comme indicatrice de la
résistance aux antibiotiques dans le milieu aquatique (Baron et al. 2017b). Cependant, malgré une
plasticité génétique, aucun mécanisme de résistance acquis n’a été détecté dans notre étude. Des
travaux dans l’estuaire de la Rance ont montré que 9 %, 16 % et 8 % des souches de V. cholerae
avaient acquis des résistances aux sulfamides, à la streptomycine et l’ampicilline respectivement
(Baron et al. 2017b). Les gènes de résistance associés étaient sul1 et sul2 pour la résistance aux
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
172
sulfamides et les gènes strA et strB pour la résistance à la streptomycine. Des souches de V. cholerae
avec des profils de résistance similaires (11 % pour l’ampicilline et 2 % pour la streptomycine) ont été
isolées dans la mer Baltique (Bier et al. 2015). De plus, des souches productrices de
céphalosporinases et carbapénémases ont été décrites ; par exemple le gène blaCMY-2 a été trouvé
dans des souches alimentaires de V. parahaemolyticus et V. alginolyticus (Li et al. 2015, Ye et al.
2016). De même, une nouvelle carbapénèmase blaVCC-1 a été décrite dans une souche de V. cholerae
isolée de crevettes (Mangat et al. 2016). De plus, ces bactéries sont capables de transmettre des
résistances aux Enterobacteriales par conjugaison (Abe et al. 1966). Vibrio spp. peut donc
transmettre des résistances acquises à la flore intestinale des consommateurs. Le genre Vibrio
semble donc intéressant pour surveiller la résistance dans le milieu aquatique, mais d’autres études
sur la résistance aux antibiotiques des Vibrio spp. sont nécessaires en ciblant peut être plutôt une
espèce de Vibrio que le genre.
Ensuite, les bactéries du genre Pseudomonas ont, comme pour l’espèce Pseudomonas
aeruginosa, de nombreuses résistances naturelles à de nombreuses familles d’antibiotiques (Leclercq
et al. 2013). Cela limiterait la surveillance à quelques classes d’antibiotiques comme certaines β-
lactamines (carbapénèmes, céphalosporines 3ème génération), les aminosides ou les quinolones. De
plus, les bactéries de l’espèce P. aeruginosa sont capables d’acquérir des résistances par de
nombreux mécanismes, dont des mécanismes non transférables comme des surexpressions de
pompes d’efflux MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM conférant des résistances à
plusieurs familles d’antibiotiques ou des mutations de la porine OprD2 conférant une résistance aux
carbapénèmes (Nordmann et Naas 2012, Dreier et Ruggerone 2015). Cependant, ces résistances sont
connues pour l’espèce P. aeruginosa, mais l’extrapolation de ces résistances pour l’ensemble des
bactéries du genre Pseudomonas n’est pas démontrée. De plus, les conditions d’incubation de
Pseudomonas, que nous avons utilisées, ont été modifiées par rapport aux conditions classiques d’un
antibiogramme par diffusion (M42 du CLSI (CLSI 2006a)) car les souches ne poussaient pas. De plus,
un autre inconvénient de l’utilisation de ces conditions d’incubation est le faible nombre de contrôle
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
173
qualité existants à 28 °C. Sur les 16 molécules antibiotiques que nous avons testées pour
Pseudomonas spp. , il n’existe qu’un contrôle qualité pour l’ampicilline (10 µg), la gentamicine (10
µg) et le cotrimoxazole (25 µg) (CLSI 2016a). La diffusion des autres antibiotiques n’a pas pu être
validée pour les autres molécules testées. Les bactéries du genre Pseudomonas ont surtout été
associées aux poissons et pourraient être des indicateurs de la résistance aux antibiotiques des flores
bactériennes de cette catégorie de produit, à condition de revoir les conditions de culture, si elles
sont espèces dépendantes, et de définir les résistances naturelles et les espèces ou groupe d’espèces
d’intérêt.
Enfin, le genre Proteus a été principalement isolé des poissons plats et des cabillauds. Les
souches ont été isolées d’autres animaux aquatiques comme des crustacés : homards, crabes,
crevettes (Drzewiecka 2016). Le nombre de souches de Proteus spp. était faible (n=32) et une seule
souche résistante a été observée. D’autres études, optimisant l’isolement de ces bactéries, sont
nécessaires pour estimer leur prévalence dans les produits aquatiques et déterminer s’il serait un
bon indicateur.
En outre, les bactéries Gram positif, que nous avons étudiées en antibiorésistance, étaient
Staphylococcus, Enterococcus et Exigobacterium. À part Staphylococcus, les autres genres bactériens
Gram positif étudiés ne semblaient pas pertinent pour être des bactéries indicatrices de la résistance
aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Il a été isolé de toutes les catégories de produits, les
espèces de ce genre ont été facilement identifiées, des ECOFFs existent dans le référentiel EUCAST et
des souches avec des profils de résistance variés ont été détectées. Cependant, les bactéries du
genre Staphylococcus sont associées aux animaux à sang-chaud et aliments fermentés et sont
considérées comme des marqueurs d’hygiène dans les produits alimentaires aquatiques (Hammad et
al. 2012, Becker et al. 2014).Il n’est pas possible de certifier que la contamination des produits de la
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
174
pêche par Staphylococcus spp. soit naturelle du milieu aquatique ou faite par l’homme (Hammad et
al. 2012).
Pour le genre Enterococcus, il est déjà utilisé avec les espèces, Enterococcus faecium et E.
faecalis, comme bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques du milieu terrestre (EFSA
2012). D’après nos travaux, les espèces à étudier dans les produits aquatiques serait plutôt E. faecalis
et/ ou E. thailandicus ce qui a été également proposé par Boss et al. (2016) pour E. faecalis.
Cependant, des seuils épidémiologiques sont à définir pour les différentes espèces de ce genre
bactérien.
Enfin, l’étude de la résistance aux antibiotiques du genre Exiguobacterium dans les
conditions classiques d’un antibiogramme par diffusion a été possible. Des seuils épidémiologiques
expérimentaux ont pu être calculés. Pour autant, les résistances naturelles des espèces de ce genre
ne sont pas connues et il semble qu’une sensibilité soit différentes selon si les souches sont
psychrophiles (groupe I) ou mésophiles/thermophiles (groupe II). D’autres études sur la prévalence
de ce genre bactérien dans les produits aquatiques et son potentiel d’acquisition de résistance aux
antibiotiques sont nécessaires pour valider l’intérêt d’utiliser ce genre bactérien comme indicateur.
De plus, les conditions d’enrichissement et d’isolement utilisés dans l’étude ont été choisies
pour sélectionner la flore mésophile cultivable dans différents buts :
pouvoir réaliser des antibiogrammes à 35°C (conditions indiquées dans les référentiels),
étudier une flore qui pourra être un risque pour la santé du consommateur. En effet, les
bactéries aquatiques autochtones représentent des vecteurs intermédiaires potentiels permettant le
transfert de gènes de résistance présents naturellement dans les bactéries environnementales vers
les bactéries zoonotiques. Ainsi de nombreuses résistances bactériennes identifiées et largement
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
175
disséminés parmi les pathogènes de l’Homme et des animaux terrestres, proviennent initialement de
bactéries aquatiques.
De plus, une seule colonie de chaque morphologie a été sélectionnée. Ces conditions de
sélection ont entrainé un biais sur la flore bactérienne isolée des différents produits, même si des
spécificités ont pu être observées (Pseudomonas/poissons, Vibrio/noix de Saint-Jacques, …). Il
faudrait optimiser les conditions d’enrichissement (température, durée, milieu,…) et sélectionner
plusieurs colonies de chaque morphologie pour avoir un meilleur aperçu de la prévalence des
bactéries pouvant être de potentielles indicatrices de la résistance aux antibiotiques dans les
produits de la pêche et de l’aquaculture. Par exemple, pour optimiser l’isolement du genre
Enterococcus, les échantillons pourraient être enrichis à 37 °C pendant 18 à 28h, comme cela est fait
pour isoler ces bactéries des fèces de volaille (EFSA 2008).
En outre, tous les échantillons étudiés ont été conservés à -20 °C entre le prélèvement et
l’étape d’enrichissement. Ce stress thermique change les capacités de croissance des bactéries et
donc modifie la flore bactérienne cultivable d’un échantillon (Semanchek et Golden 1998, Ghafir et
Daube 2007). Il s’agit probablement d’une des raisons pour lesquelles des bactéries attendues,
comme Vibrio spp. ou Aeromonas spp., n’ont pas ou peu été isolées. Pour ces raisons, il faudrait
optimiser les conditions d’enrichissement et d’isolement de ces genres bactériens.
En parallèle, les seuils épidémiologiques ont été définis pour les genres bactériens. Pourtant,
l’observation de la distribution des diamètres d’inhibition selon les espèces bactériennes laisse
penser que les seuils épidémiologiques peuvent être établis au niveau du genre ou en fonction du
groupement d’espèce au sein du genre bactérien, selon le couple antibiotique/bactérien considéré.
D’autres auteurs ont montré que pour Aeromonas spp., les seuils épidémiologiques ont pu être
définis au niveau du genre bactérien (Smith et al. 2012, Baron et al. 2017a). Cependant, ces auteurs
ont également montré que pour certaines molécules comme les quinolones et les céphalosporines,
les seuils n’ont pas pu être définis au niveau du genre et qu’il faudrait les définir pour les différentes
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
176
espèces Aeromonas. De même, le calcul de seuils épidémiologiques au niveau du genre bactérien
s’est révélé être peu pertinent pour les β-lactamines principalement et pour d’autres classes
d’antibiotiques (quinolones) où la sensibilité étaient différentes selon les espèces (Enterococcus,
Staphylococcus, Vibrio, …). En général, cela est dû à des résistances naturelles et des sensibilités
spécifiques selon les espèces. Pour les β-lactamines, l’identification des souches bactériennes à
l’espèce et le calcul des seuils pour les espèces bactériennes est donc indispensable.
Enfin, le nombre de souches dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée par genre
bactérien était faible, de 32 à 58 souches. La faible diversité des profils de résistance peut s’expliquer
par la collection de souches étudiées. D’autres études sont nécessaires pour confirmer la faible
diversité des profils de résistance de Vibrio spp. et Proteus spp.
Finalement, des études complémentaires sont nécessaires pour valider l’intérêt des genres
Enterococcus, Exiguobacterium, Staphylococcus, Pseudomonas, Vibrio et Proteus en tant que bactérie
indicatrice de la résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche et de l’aquaculture.
Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins
177
- Établir des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) nécessite d’identifier les espèces
bactériennes.
- Les résistances naturelles des espèces Exiguobacterium, Vibrio et Pseudomonas sont à
déterminer.
- Les crevettes étaient porteuses de plus de bactéries résistantes aux antibiotiques que les
autres produits.
- Les produits d’aquaculture étaient porteurs de plus de bactéries résistantes que ceux issus
de la pêche.
- Une souche Exiguobacterium et trois souches Enterococcus multi-résistantes ont été isolées
de deux crevettes et d’un poisson plat.
- Staphylococcus (Gram positif) peut être une bonne bactérie indicatrice de la résistance aux
antibiotiques dans le milieu aquatique.
179
Chapitre 3 : E tude de la re sistance aux antibiotiques de Vibrio
parahaemolyticus isole s de produits de la pe che et de l’aquaculture
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
180
I. Contexte de l’étude
Vibrio parahaemolyticus est une bactérie Gram négatif naturellement présente dans le milieu
marin, dans des eaux présentant une température supérieure à 15°C (Su et Liu 2007b). Cette bactérie
est responsable de toxi-infections alimentaires liées à la consommation de produits aquatiques, et
plus spécifiquement à la consommation de coquillages et de crustacés (Su et Liu 2007b). Elle est
également un des agents étiologiques de la diarrhée du voyageur (Diemert 2006a). En Europe, les
données de surveillance sur la présence de Vibrio spp dans les produits aquatiques importés ou
locaux sont rares et l’incidence des toxi-infections alimentaires à V. parahemolyticus est
probablement sous-estimée car cette bactérie n’est pas systématiquement recherchée en cas de
gastro-entérites (Baker‐Austin et al. 2010). Toutefois, des infections liés à la consommation de
produits importés ont été décrites en Espagne, où suite à un banquet sur un bateau de croisière, 100
personnes ont été contaminées par V. parahaemolyticus (Martinez-Urtaza et al. 2016) et en France
en 1997, où 44 personnes ont été infectées suite à l’ingestion de crevettes ou de moules importées
d’Asie (Lemoine et al. 1999). D’autre part, des études montrent sa présence dans les eaux côtières de
Galice, de France et dans la mer Baltique (Baker-Austin et al. 2017) et sur des crabes élevés dans la
Tamise(Wagley et al. 2009). Avec le réchauffement des océans, cette espèce bactérienne devient un
risque émergent dans les zones tempérées (Vezzulli et al. 2016).
Les bactéries du genre Vibrio sont connues pour avoir une certaine plasticité génétique grâce
à la présence d’intégrons chromosomiques, d’îlots génétiques d’ICEs et de plasmides (Hazen et al.
2010). Cependant, la diversité et l’évolution des éléments génétiques mobiles dans le genre Vibrio
sont encore peu connus (Iwanaga et al. 2004, Ceccarelli et al. 2006) et elle est capable de transférer
des gènes de résistance aux antibiotiques par conjugaison avec les bactéries de la famille
Enterobacterieaceae (Abe et al. 1966). Ces caractéristiques semblent indiquer que les bactéries du
genre Vibrio, dont V. parahaemolyticus, pourraient être un réservoir de gènes de résistance et/ou un
vecteur de ces gènes entre le milieu marin et la flore digestive de l’homme.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
181
Les études sur la résistance aux antibiotiques de l’espèce V. parahaemolyticus sont peu
nombreuses et les seuls seuils définis pour Vibrio spp. Sont des seuils cliniques dans le référentiel du
CLSI. En sachant que ces seuils cliniques sont dérivés de ceux des Enterobacteriaceae (CLSI 2015). Les
résistances naturelles sont également peu décrites dans la littérature, le CLSI signale que Vibrio spp
halophiles, dont V. parahaemolyticus, sont généralement résistants à l’ampicilline, aux
céphalosporines première et deuxième génération, ainsi qu’aux sulfamides (CLSI 2015).
Le but de ces travaux a été d’étudier la résistance aux antibiotiques d’un panel de souches de
V. parahaemolyticus isolées de produits de la pêche et de l’aquaculture.
Dans une première partie, nous avons d’abord testé les familles d’antibiotiques permettant
de détecter des mécanismes de résistance pour des familles d’antibiotiques d’importance critiques
pour la santé humaine définie par l’OMS : β-lactamines, dont les pénicillines, céphalosporines 1ère,
2ème , 3ème et 4ème génération, carbapénèmes, quinolones, aminosides, macrolides, phénicolés,
tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates (OMS 2017a). Pour chaque molécule testée, nous
avons établi des seuils épidémiologiques selon la méthode décrite par Kronvall et al. (Kronvall et al.
2003). A partir de ces seuils, nous avons ensuite cherché la présence d’intégrons de classe 1,2 et 3 et
des ICE SXT/R391 pour les souches présentant des phénotypes non-sauvages.
Dans une deuxième partie, nous avons caractérisé les mécanismes de résistance rencontrés
dans la collection et leur capacité de diffusion au sein d’autres bactéries.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
182
II. Définition des seuils épidémiologiques avec la recherche des
intégrons/SXT
II.1. Contexte
Dans la première partie de ces travaux sur le souchier V. parahaemolyticus, nous avons
déterminé des seuils épidémiologiques pour 15 antibiotiques. Les antibiotiques testés ont été les
mêmes que ceux utilisés pour étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries Gram négatif
isolées des produits de la pêche et de l’aquaculture dans le chapitre 2. Ensuite, pour les souches
présentant un phénotype non-sauvage pour au moins un antibiotique, la présence des marqueurs
épidémiologiques des intégrons de classe 1,2 et 3 et des ICE SXT/R391 ont été recherchés par PCR
(Barraud et al. 2010, Bioteau et al. 2018).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
183
II.2. Matériel et méthodes
II.2.A. Sélection des souches
Les souches ont été collectées au laboratoire dans le cadre des travaux de référence et de
recherche de l’unité. Elles ont été isolées selon la norme NF ISO/TS 21872 relative à la recherche de
Vibrio spp. potentiellement entéropathogène dans les coquillages et les produits de la pêche. Elles
ont été conservées en cryotube dans du bouillon cœur cervelle (BCC) avec 20 % de glycérol à -80°C.
II.2.B. Antibiogramme par diffusion
À partir d’un cryotube, la souche a été ensemencée sur une gélose nutritive salée à 2 % (GNS)
et incubée à 37°C pendant 24h. Les antibiogrammes ont été effectués selon les recommandations du
M45 du référentiel CLSI (CLSI 2015). Des colonies ont été suspendues dans de l’eau physiologique
(Biomérieux) pour obtenir une culture bactérienne à 0,5 McFarland de turbidité. La suspension était
ensuite étalée sur une gélose Mueller-Hinton (Biorad) à l’aide d’un écouvillon stérile. Les disques
d’antibiotiques étaient ensuite déposés et la gélose était incubée pendant 16 à 18h à 35°C. Nous
avons veillé à ne pas dépasser un délai de 15 minutes entre la préparation de la suspension et l’étape
d’ensemencement, l’étape d’ensemencement et le dépôt des disques, et le dépôt des disques et
l’incubation de la gélose. La souche E. coli ATCC 25922 a été utilisée comme contrôle qualité de
l’antibiogramme. Les disques d’antibiotiques (Biorad) testés ont été les suivants : ampicilline (10 µg),
témocilline (30 µg), amoxicilline-acide clavulanique (20/ 10 µg), , céfalotine (30 µg), céfoxitine (30
µg), ceftazidime (30 µg), céfotaxime (30 µg), acide nalidixique (30 µg), ciprofloxacine (5 µg),
streptomycine (10 µg), gentamicine (10 µg), azithromycine (15 µg), chloramphénicol (30 µg),
tétracycline (30 µg), triméthoprime-sulfamétoxazole (1,25/3,75 µg) et colistine (10 µg). Le disque de
colistine a été utilisé dans un but de qualité, pour s’assurer de la pureté de la culture. Les diamètres
d’inhibition ont été mesurés avec un appareil Biomic®V3 (Gilles scientific).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
184
II.2.C. Interprétation des résultats
Il n’existe pas d’ECOFF définis pour V. parahaemolyticus. Les résultats ont été analysés pour
définir des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) et pour définir les populations sauvages et
non-sauvages.
Nous avons déterminé des seuils selon la méthode normalized resistance interpretation
(NRI), décrite par Kronvall et al. (Kronvall et al. 2003). La méthode NRI a été utilisée avec la
permission du détenteur du brevet européen No 1383913 et américain 7,465,559 (Bioscand AB,
TÄBY, Sweden). Pour chaque antibiotique, la distribution des souches selon le diamètre d’inhibition
de croissance a été réalisée. Lorsque cette distribution suivait une loi normale, nous avons déterminé
la moyenne et l’écart-type. La valeur entière la plus proche de la moyenne moins 2,5 fois l’écart-type
a été définie comme étant le COWT. Les COWT ont été comparés aux seuils cliniques disponibles pour
Vibrio spp dans la table 20 du M45 du CLSI (CLSI 2015). Nous avons utilisé une feuille de calcul Excel,
mis à disposition gracieusement par P. Smith, W. Finnegan et G. Kronvall, pour calculer les COWT. Les
souches ayant acquis des résistances à 3 classes d’antibiotiques et plus sont dites multi-résistantes
(Magiorakos et al. 2012).
II.2.D. Recherche des intégrases des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase
des ICE SXT/R391 par PCR
A partir d’un cryotube, la souche a été repiquée sur une GNS et incubée à 37°C pendant 24h.
Plusieurs colonies ont été suspendues dans 200 μL d’InstageneTM matrix (Bio-rad) dans un tube
Eppendorf. La suspension était incubée pendant 30 min à 56°C puis agitée pendant 10 s et incubée
pendant 8 min à 100°C. Enfin, les tubes étaient centrifugés pendant 5 min à 13 000 x g. Les solutions
d’ADN pouvaient être utilisées immédiatement ou conservées à -20°C. Par contre pour les solutions
congelées, elles devaient être agitées et centrifugées 5 min à 13 000 x g avant leur utilisation. Ensuite
les PCR ont été réalisés comme suit en fonction des gènes ciblés :
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
185
- Le mélange réactionnel de la PCR pour la recherche des intégrases IntI1, IntI2 et IntI3
était préparée avec 41,40 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X
(Qiagen), 1 µL de dNTP à 100mM (Eurobio), 0,20 µL d’amorces du gène cible (Tableau
311) (Eurobio, Les Ulis, France) et 0,20 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1
(Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti dans une plaque et 2 µL de l’extrait d’ADN
étaient ajoutés.
- Le mélange réactionnel de la PCR pour la détection de l’intégrase de l’ICE SXT/R391 était
préparé avec 40,75 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL
de dNTP à 100mM (Eurobio), 0,25 µL pour chaque amorce (Tableau 311) et 0,25 µL de
Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1 (Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti
dans une plaque et 2,5 µL d’extrait d’ADN étaient ajoutés.
- Le mélange réactionnel de la PCR pour l’amplification du gène R72H était fait à partir de
35,75 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL de dNTP à
100mM (Eurobio), 3 µL de MgCl2 à 25 mM (Qiagen), 1 µL d’amorces du gène cible
(Tableau 311) et 0,25 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1 (Qiagen). Le
mélange réactionnel était réparti dans une plaque et 2 µL de contrôle interne
d’amplification et 1 µL d’extrait d’ADN étaient ajoutés. L’amplification du gène R72H,
spécifique de l’espèce V. parahaemolyticus, a été effectuée pour valider l’étape
d’extraction d’ADN (Lee et al. 1995).
Les conditions de PCR utilisées sont décrites dans le tableau 32.
Tableau 31: Amorces pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et l’intégrase des ICE SXT/R391 et la confirmation de l’espèce V. parahaemolyticus.
Gènes cibles
Amorces Taille attendu de l’amplicon (pb)
Références
IntI1 Int1F6 : (5’-GCATCCTCGGTTTTCTGG-3’) 457 (Shibata et al. 2003)
Int1R6 : (5’-GGTGTGGCGGGCTTCGTG-3’)
IntI2 Int2F (5’-GTAGCAAACGAGTGACGAAATG-3’) 798 (Dillon et al. 2005)
Int2R (5’- CACGGATATGCGACAAAAAGGT-3’)
IntI3 Int3F (5’-GCCTCCGGCAGCGACTTTCAG-3’) 979
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
186
Int3R (5’- ACGGATCTGCCAAACCTGACT-3’)
ICE SXT SXT-F (5’-GCTGGATAGGTTAAGGGCGG-3’) 592 (Ceccarelli et al. 2006) SXT-B (5’- CTCTATGGGCACTGTCCACATTG-3’)
R72H VP32(5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC-3’) 387 320 si délétion
(Lee et al. 1995)
VP33(5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC-3’)
Tableau 32: Conditions de PCR pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase SXT.
Gènes Conditions de PCR
IntI1 94°C-5 min, 35 x (94°C-1 min, 55°C-1 min, 72°C-1 min 30s), 72°C-10 min
IntI2 et IntI 3
95°C-15 min, 35 x (94°C-1 min, 59°C-1 min, 72°C-1 min), 72°C-10 min
SXT 94°C-5 min, 35 x (94°C-30 s, 60°C-1 min, 72°C-2 min), 72°C-10 min
R72H 95°C-15 min, 35 x (94°C-1 min, 60°C-1 min, 72°C-1 min), 72°C-5 min
Quinze µL de l’amplicon était mélangé à du tampon de charge (Eurobio) puis déposé dans un
gel d’agarose (Eurobio) à 0,8% (m/v) préparé avec du tampon Tris-Borate-EDTA 10X (Eurobio)
préalablement dilué au 1/10 auquel était ajouté du bromure d’éthidium à 1% (v/m) (BET, Eurobio).
La migration s’effectuait à 125 V pendant 90 min puis le gel était visualisé sous UV avec l’appareil
Quantum (Neuilly-sur-Seine, France).
La souche E. coli DH5α/pTRC99A :intI1/intI2/intI3 ampR (E. coli pTRC), qui a été utilisée comme
témoin positif pour les intégrases intI1, intI2 et intI3, a été fournie par M. Olivier Barraud (Université
de Limoges, France). Une souche E. coli contenant l’ICE SXT a été utilisée comme témoin positif pour
l’intégrase des ICE SXT/R391 et a été fournie par M. Didier Mazel (Institut Pasteur, Paris). Enfin les
souches V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089+ ont été utilisées comme témoin pour la PCR
R72H.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
187
II.3. Résultats
II.3.A. Origine des souches
Entre 2012 et 2016, 384 souches de V. parahaemolyticus ont été obtenues à partir de
différents produits de la pêche et de l’aquaculture. La majorité ont été isolées dans des crevettes
(n=304) et des gambas (n=28) et pour 49 souches la matrice d’origine n’était pas renseignée (Figure
26).
Figure 26: Matrices d'origine des souches des souches de V. parahaemolyticus.
De plus, l’origine géographique des matrices alimentaires des souches n’était pas toujours
documentée. Toutefois, pour 44 % des souches, cette information avait été enregistrée et elles
provenaient d’Amérique (n=72), d’Asie (n=70) et d’Afrique (n=32) et plus spécifiquement de
l’Équateur (n=54) et du Vietnam (n=45) (Figure 27).
79%
7%
2%1% 11%
crevette
gambas
poisson
autre (calamar, homard,huître, friture, langouste)
inconnue
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
188
Figure 27: Origines géographiques des matrices dans lesquelles les souches de V. parahaemolyticus ont été isolées.
II.3.B. Définition des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT)
La distribution des diamètres d’inhibition a été faite pour tous les antibiotiques sauf la
colistine (annexe IX). Sur les 15 antibiotiques testés, 14 seuils épidémiologiques expérimentaux ont
pu être établis (Tableau 33).
12%
4% 1%
1%
5%
2%1%
14%
3%1%1%
55%
Vietnam
Inde
Indonésie
autre Asie (Thaïlande, Malaisie)
Madagascar
Nigeria
autre Afrique (Afrique du Sud,Sénégal)Equateur
Honduras
Nicaragua
autre Amérique (Panama,Argentine, Pérou, États-unis)inconnue
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
189
Tableau 33: Définition des COwt de V. parahaemolyticus et des populations non-sauvages (n = 384). ND non déterminé.
Classes d’antibiotiques Antibiotiques COWT
(mm)
Nombre de souches non-
sauvages
β-lactamines
Ampicilline ND ND Témocilline 24 3
Amoxicilline/clavulanate 18 1 Céfalotine 15 9 Cefoxitine 15 1
Cefotaxime 26 1 Ceftazidime 23 1
Quinolones Acide nalidixique 23 3
Ciprofloxacine 20 1
Aminosides Streptomycine 9 6 Gentamicine 14 0
Macrolides Azithromycine 18 3
Phénicolés Chloramphénicol 26 8
Tétracyclines Tétracycline 22 49
Inhibiteur de la synthèse des folates
cotrimoxazole 19 13
Plusieurs cas de figure ont été observés :
- La distribution des diamètres pour l’ampicilline ne suivait pas une loi normale, et un seuil
épidémiologique expérimental n’a pas pu être défini (Figure 28 a),
- Pour les autres antibiotiques, la distribution des diamètres suivait une loi normale et des
seuils épidémiologiques ont pu être établis (annexe IX),
- Pour la gentamicine, toute la population avait un phénotype sauvage (Figure 28 b),
- Pour les autres antibiotiques analysés, une partie de la population de V. parahaemolyticus
présentait un phénotype non-sauvage plus ou moins proche du COWT défini (Figure 28 c et 28 d
annexe IX).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
190
Figure 28: Distribution des diamètres d'inhibition de V. parahaemolyticus par antibiotiques a) ampicilline ; b) gentamicine ; c) tétracycline ; d) chloramphénicol. Les histogrammes représentent la population sauvage et les histogrammes représentent la population non-sauvage. Le trait rouge représente le COwt.
Tous antibiotiques confondus, la population non-sauvage de V. parahaemolyticus
représentait 16 % des souches. Les antibiotiques, pour lesquels le plus de souches avec un phénotype
non-sauvage ont été observées, étaient la tétracycline (13 %), le cotrimoxazole (3 %), la céfalotine (3
%) et le chloramphénicol (2 %). Parmi ces souches, 43 avaient une résistance acquise à un
antibiotique donc 34 à la tétracycline. De plus, 17 isolats avaient cumulé plusieurs résistances
(Tableau 34) :
- 6 souches avaient un phénotype non-sauvage pour deux antibiotiques appartenant à deux
classes différentes,
0
20
40
60
80
100
120
6 8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
0
20
40
60
80
100
120
6 8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
0
20
40
60
80
100
120
6 8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
0
20
40
60
80
100
120
6 8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
b)
d) c)
a)
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
191
- 4 souches avaient un phénotype non-sauvage pour 3 antibiotiques (= multi-résistantes): les
antibiotiques appartenaient à 3 classes différentes pour 3 souches et les antibiotiques appartenaient
à deux classes différentes pour une souche,
- 6 souches avaient un phénotype non-sauvage pour 4 antibiotiques (= multi-résistantes)
appartenant à 4 classes différentes,
-1 souche avait un phénotype non-sauvage pour 9 antibiotiques (= multi-résistantes)
appartenant à 5 classes différentes.
Tableau 34: Phénotypes non-sauvages des souches de V. parahaemolyticus (n = 60).
Nombre de classes d’antibiotiques avec un phénotype non-
sauvage
Antibiotiques avec un phénotype non-sauvage Nombre de
souches
1
Tétracycline 34
Céfalotine 4
Témocilline 3
Cotrimoxazole 2
2
Tétracycline-cotrimoxazole 5
Tétracycline-acide nalidixique 1
Tétracycline-acide nalidixique-ciprofloxacine 1
3
Tétracycline-céfalotine-chloramphénicol 1
Tétracycline-azithromycine-céfalotine 1
Céfalotine-azithromycine-chloramphénicol 1
4
Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-chloramphénicol 4
Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-acide nalidixique 1
Tétracycline-chloramphénicol-azithromycine-céfalotine 1
5 Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-chlorampénicol-amoxicilline/clavulanate-céfalotine-céfoxitine-ceftazidime-
cefotaxime 1
Onze des 18 souches qui ont cumulées des résistances avaient un phénotype non-sauvage
pour la tétracycline et le cotrimoxazole. Six de ces 11 souches cumulaient des phénotypes non-
sauvages pour la tétracycline, le cotrimoxazole et la streptomycine. Parmi ces souches, 5 souches
avaient un phénotype non-sauvage supplémentaire pour le chloramphénicol. Enfin, la souche multi-
résistante, 16-B3PA-006, présentait un phénotype non-sauvage pour la tétracycline, le
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
192
cotrimoxazole, la streptomycine, le chloramphénicol et toutes les β-lactamines testées sauf la
témocilline (Figure 29).
Concernant l’origine des souches avec une population non-sauvage, tous antibiotiques
confondus, 88% ont été isolées de crevettes, 1,5 % de rouget, 1,5 % de fritures et pour 8 % la matrice
alimentaire n’était pas renseignée. Les produits, dans lesquels les souches résistantes de V.
parahaemolyticus ont été isolées, provenaient principalement d’Equateur (16 %), du Vietnam (13 %),
d’Inde (5 %), du Nicaragua (3 %), d’Indonésie (1,5 %) et de Madagascar (1,5 %). Pour les souches
multi-résistantes, à au moins 3 classes d’antibiotiques, elles ont été isolées de crevettes (70 %) et de
rouget (10 %). La matrice alimentaire n’était pas connue pour 20 % des isolats. Les origines
géographiques des matrices n’étaient pas connues pour 60 % des souches et 30 % et 10 % des
matrices étaient originaires du Vietnam et d’Indonésie respectivement. Une souche était multi-
résistante à 9 antibiotiques et elle a été isolée de crevettes provenant du Vietnam.
Les COWT calculés et les seuils cliniques présents dans le référentiel CLSI ont pu être
comparés pour 8 antibiotiques (Tableau 35). Il n’y avait pas de seuils cliniques pour Vibrio spp. pour
GEN
CIP
AMC FOX
TEM
AMP
SXT STR
AZM NAL CST
CTX
CAZ
CHL
TET
CEF
AMC FOX
TEM
AMP
SXT STR
AZM NAL CST
CTX
CAZ
CHL
TET
CEF
GEN
CIP
Figure 29: Antibiogramme de la souche de V. parahaemolyticus 15-B3PA-0752 présentant un phénotype sauvage à gauche et de la souche 16-B3PA-006 à droite présentant un phénotype non-sauvage pour 9 molécules testées (en rouge). Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
193
la témocilline, la céfalotine, l’acide nalidixique, la streptomycine, l’azithromycine et le
chloramphénicol.
Tableau 35: Comparaison des COWT et seuils cliniques du CLSI pour V. parahaemolyticus (CLSI 2015). ND : COWT non déterminé, S : sensible, I : intermédiaire, R : résistant. Les cases bleues représentent l’absence de seuil.
Classes d’antibiotiques
Antibiotiques COWT
(mm)
Seuils cliniques du CLSI (mm)
S≥ I R≤
β-lactamines
Ampicilline ND 17 14-16 13 Témocilline 24
Amoxicilline/clavulanate 18 18 14-17 13 Céfalotine 15 Cefoxitine 15 18 14-17 14
Cefotaxime 26 26 23-25 22 Ceftazidime 23 22 18-21 17
Quinolones Acide nalidixique 23
Ciprofloxacine 20 21 16-20 15
Aminosides Streptomycine 9 Gentamicine 14 15 13-14 12
Macrolides Azithromycine 18
Phénicolés Chloramphénicol 26
Tétracyclines Tétracycline 22 15 12-15 11
Inhibiteur de la synthèse des folates
cotrimoxazole 19 16 11-16 10
Nous n’avons pas pu déterminer de COWT pour l’ampicilline alors que des seuils cliniques
existent. Nous avons remarqué que pour 5 antibiotiques (amoxicilline/clavulanate, cefotaxime,
ceftazidime, ciprofloxacine et gentamicine), les COWT étaient identiques ou à un 1 mm d’écart avec
les seuils cliniques sensibles/ intermédiaires. Le même nombre de souches ont été décrites comme
non sauvage et résistante/intermédiaire pur ces antibiotiques. Le COWT et le seuil
intermédiaire/résistant de la cefoxitine était différent de 1 mm, et le même nombre de souche était
non sauvage et résistantes cliniquement. Pour la tétracycline et le cotrimoxazole, le COWT était plus
élevé que les seuils sensibles intermédiaires de 7 et 3 mm respectivement, donc plus de souches ont
été classées comme non sauvage (49 et 13 souches respectivement) que comme
intermédiaire/résistantes (44 et 12 souches respectivement).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
194
Les COWT calculés pour le genre Vibrio dans le chapitre 2 et ceux calculés pour la collection de
V. parahaemolyticus étaient le plus souvent cohérents (Tableau 36).
Tableau 36: Comparaison des COWT pour Vibrio spp. et pour V. parahaemolyticus. ND : COWT non déterminé, SP : présence sous-population dans la distribution, EC : écart-type non validé. Les cases vertes montrent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V. parahaemolyticus étaient identiques ou avaient une différence inférieure à l’incertitude de mesure (±2 mm). Les cases roses représentent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V. parahaemolyticus avaient une différence supérieure à l’incertitude de mesure (±2 mm).
Antibiotiques
COwt (mm)
V. parahaemolyticus Vibrio spp.
Ampicilline ND ND Témocilline 24 17
Amoxicilline/ acide clavulanique 18 SP Céfalotine 15 SP Céfoxitine 15 12
Cefotaxime 26 26 Ceftazidime 23 22
Acide nalidixique 23 EC Ciprofloxacine 20 EC Streptomycine 9 6 Gentamicine 14 12
Azithromycine 18 EC Chloramphénicol 26 24
Tétracycline 22 23 cotrimoxazole 19 19
Les COWT définis pour la céfotaxime et le cotrimoxazole étaient identiques pour Vibrio spp. et
V. parahaemolyticus. Les COWT définis pour la ceftazidime, la gentamicine, le chloramphénicol et la
tétracycline étaient différents pour Vibrio spp. et V. parahaemolyticus. Ces différences étaient
inférieures ou égales à l’incertitude de mesure de la méthode (±2 mm). Pour les autres antibiotiques
les COwt étaient plus bas pour Vibrio spp que pour V. parahaemolyticus de 3 à 7 mm.
II.3.C. Recherche d’intégrons
La présence d’intégrons de classe 1,2 et 3 et l’ICE SXT/R391 a été recherchée pour les 60
souches de V. parahaemolyticus qui avait au moins une résistance. Toutes les souches testées étaient
négatives pour les intégrons de classe 2 et 3 et seule la souche 16-B3PA006 était positive pour
l’intégron de classe 1 (Figure 30). De plus, 3 souches étaient positives pour la présence de l’intégrase
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
195
de SXT, 2 souches présentaient le phénotype de résistance souvent associé à cet ICE : streptomycine,
cotrimoxazole et chloramphénicol. L’autre souche positive n’avait pas de phénotype de résistance
pour le chloramphénicol. Les trois autres souches montrant un phénotype non-sauvage à la
streptomycine, au cotrimoxazole et au chloramphénicol étaient négatives pour l’ICE SXT.
Figure 30: Exemple de PCR de détection de l'intégrase intI1. La souche E. coli pTRC99A était le témoin positif de la réaction. Les souches E. coli SXT, V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089 étaient les témoins négatifs. Les puits avec le mélange réactionnel étaient des témoins de contamination de la PCR. MP : marqueur de poids moléculaire en paire de base.
II.4. Discussion
Des COWT ont pu être calculés pour 14 des 15 antibiotiques testés avec la méthode
d’antibiogramme de diffusion en milieu gélosé. Des populations bactériennes non-sauvages ont pu,
in vitro, être discriminées des populations sauvages. En effet, la grande majorité des souches de V.
parahaemolyticus était de phénotype sauvage cependant des résistances acquises aux β-lactamines,
quinolones, aminosides, macrolides, tétracyclines, phénicolés et inhibiteurs de la synthèse des
folates ont été détectées. Des souches de V. parahaemolyticus résistantes à ces familles
d’antibiotiques ont été décrites mais à des fréquences variables, 0 à 12 % des souches de V.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
196
parahaemolyticus pour le chloramphénicol (Baker-Austin et al. 2008, Zavala-Norzagaray et al. 2015),
0 à 17 % pour les tétracyclines (Jiang et al. 2014, Tan et al. 2017), 0 à 3 % des souches pour les
quinolones (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Lopatek et al. 2018), 0,3% à 15 % pour les
inhibiteurs de la synthèse des folates (Baker-Austin et al. 2008, Zavala-Norzagaray et al. 2015) et 3 à
46 % pour les aminosides (Baker-Austin et al. 2008, Tan et al. 2017, Lopatek et al. 2018). Par contre,
la résistance aux macrolides de Vibrio spp. est rarement testée et les référentiels ne donnent pas de
seuils. Comme il n’existe pas de seuils épidémiologiques, les seuils cliniques définis pour V.
parahaemolyticus par le CLSI sont utilisés dans de nombreux travaux pour interpréter les résultats
des antibiogrammes (Ronholm et al. , Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Zavala-Norzagaray et
al. 2015, Tan et al. 2017, Lopatek et al. 2018 , Zhao et al. 2018). Pour autant, certains seuils cliniques,
comme pour la streptomycine, ont été définis pour les Enterobacteriaceae et ont été repris pour
Vibrio spp. (CLSI 2015). Pour les Enterobacteriaceae, le seuil clinique de la streptomycine entre
sensible et intermédiaire est à 15 mm et celui entre intermédiaire/résistant est à 11 mm. Dans nos
travaux, d’un point de vue épidémiologique, la distribution des diamètres d’inhibition du panel de
souches V. parahaemolyticus a permis de conclure que nous avions une population sauvage. Mais
lorsque nous comparons nos résultats aux seuils cliniques, une partie de la population sauvage de
V. parahaemolyticus était classée comme intermédiaire et l’autre partie comme résistante. Cela peut
entraîner une surestimation du nombre de souches résistantes de V. parahaemolyticus à la
streptomycine. Par exemple, dans les travaux Tan et al. (2017), 53 % de souches V. parahaemolyticus
isolées de maquereaux en Malaisie ont été classées cliniquement résistantes à la streptomycine. Des
précautions sont donc nécessaires pour interpréter des résultats d’antibiogrammes de couples
antibiotiques/ bactéries dont les seuils n’existent pas dans les référentiels ou lorsqu’ils sont extrapolé
d’un autre ordre/ genre bactérien. Une étude de la distribution des diamètres/ CMI serait plus
judicieuse que d’utiliser des seuils définis pour un autre couple antibiotique/bactérie.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
197
En ce qui concerne la famille des β-lactamines, en utilisant les seuils cliniques, des études ont
montré un fort taux de résistance à différentes molécules de la famille des pénicillines comme
l’ampicilline ou la pénicilline G de 75 % à 100 % des souches de V. parahaemolyticus testés (Ronholm
et al. , Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Zavala-Norzagaray et al. 2015, Tan et al. 2017,
Lopatek et al. 2018, Zhao et al. 2018). Dans nos travaux, la distribution des populations bactériennes
de V. parahaemolyticus pour l’ampicilline ne suivait pas une loi normale donc nous n’avons pas pu
calculer de COWT et il n’existe pas d’ECOFF. Pourtant des génomes séquencés de souches du genre
Vibrio ont montré la présence de β-lactamases chromosomiques de type carbénicillinase (Fosse 2012,
Chiou et al. 2015). Il semblerait que V. parahaemolyticus soit naturellement résistant aux pénicillines
et que les pénicillines ne sont pas pertinentes à tester dans les antibiogrammes pour cette espèce
bactérienne.
En outre, la témocilline, classée parmi les carboxypénicillines, n’a pas permis d’établir de
valeurs de COWT cohérentes entre les résultats que nous avons obtenus sur le genre Vibrio et ceux
obtenus sur l’espèce V. parahaemolyticus. La variabilité des séquences de la β-lactamase
chromosomique des Vibrio spp., souvent qualifiées aussi de carbenicillinases, est probablement à
l’origine de la variation des valeurs des COWT de la témocilline entre les différentes espèces de Vibrio.
De même, la variation de la valeur des COWT observée de la cefoxitine (C2G) entre Vibrio spp. et V.
parahaemolyticus peut être causé par des spectres d’activité différents des différentes
carbénicillinases chromosomiques. Cependant, des études plus approfondies sur le spectre d’action
de cette enzyme, le gène blaCARB-17 et son environnement génétique, pourraient permettre de mieux
comprendre le phénotype naturel de résistance de V. parahaemolyticus aux β-lactamines. En effet,
nous avons décrit 12 souches avec des résistances acquises à la céfalotine ou à la témocilline et des
mutations ou une surproduction de cette enzyme pourrait être une explication de ces phénotypes.
De plus, dix souches étaient multi-résistantes car elles avaient acquis des résistances pour au
moins 3 classes d’antibiotiques (Magiorakos et al. 2012). La souche avec le plus de résistances (9),
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
198
16-B3PA-006, était la seule souche à avoir un phénotype non-sauvage pour toutes les β-lactamines
testées, sauf la témocilline. Cette souche a été étudiée plus en détail dans la seconde partie de ce
chapitre. La description de souche de V. parahaemolyticus avec un phénotype multi-résistant a été
décrite mais leur nombre est probablement surestimé (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Tan
et al. 2017, Lopatek et al. 2018). En effet, dans ces travaux, les souches multi-résistantes de V.
parahaemolyticus étaient résistantes aux pénicillines (probablement une résistance naturelle) et à la
streptomycine (seuils cliniques des Enterobacteriaceae qui ne sont pas adaptés). Cependant, des
souches multi-résistantes ont été décrites, comme une souche portant sur un plasmide conjugatif les
gènes de résistance aux β-lactamines (blaPER-1), aux quinolones (qnrVC6), aux aminosides (aacA3,
aadA1), aux phénicolés (catB2), et aux inhibiteurs de la synthèse des folates (dfrA1) (Liu et al. 2013)
et une autre souche portant, sur un plasmide conjugatif, les gènes de résistance aux β-lactamines
(blaVEB-2, blaOXA-10), aux aminosides (aadB, aadA1, strA et strB), aux phénicolés (cmlA, floR), aux
tétracyclines (tetA, tetR ) et aux inhibiteurs de la synthèse des folates (sul1) (Li et al. 2016). De ce fait,
nous avons voulu voir quels mécanismes d’acquisition de résistance étaient associés avec les
souches-multi-résistantes que nous avions observées. Une seule souche ayant acquis des résistances
portait un intégron de classe 1. La faible prévalence d’intégrons de classe 1 et l’absence d’intégron de
classe 2 et 3 dans les génomes de V. parahaemolyticus a également été constatée dans d’autres
études (Taviani et al. 2008, Ottaviani et al. 2013). De plus, lorsque des intégrons de classe 1 ont été
identifiés, ils étaient vides ou n’étaient pas sur des éléments génétiques transférables (Ceccarelli et
al. 2006, Jiang et al. 2014).
En outre, pour les souches multi-résistantes, les phénotypes de résistance concernaient les
tétracyclines, les aminosides, les phénicolés et les inhibiteurs de la synthèse des folates. Ce motif de
résistance est typique des ICE SXT/R391 décrits dans le genre Vibrio et, lors de sa description, cet
élément génétique mobile pouvait porter les gènes de résistance tet(A), strA, strB, floR, sul2, dfrA1 et
dfrA18 (Iwanaga et al. 2004, Ceccarelli et al. 2006). Cependant, ces ICEs sont peu décrits pour V.
parahaemolyticus et peu de nos souches ayant acquis des résistances ou ayant le phénotype des ICEs
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
199
SXT/R391 étaient positives pour leurs intégrases (Ceccarelli et al. 2006, Taviani et al. 2008, Jiang et al.
2014). Récemment, une comparaison de la structure génétique des ICEs SXT/R391 a montré une
variabilité du gène de l’intégrase, qui est utilisé comme leur marqueur épidémiologique. Cela
pourrait entrainer une sous-estimation de la prévalence des ICEs SXT/R391 dans les génomes
bactériens, notamment pour les souches avec le phénotype de résistance classique de ces éléments
génétique. Les auteurs recommandent l’utilisation d’un autre marqueur plus conservé comme setCD
(Bioteau et al. 2018).
En outre, dans cette étude, une majorité des souches a été isolée de crevettes issues de
l’aquaculture. Les classes d’antibiotiques pour lesquels des résistances ont été détectées étaient
celles dont un usage en aquaculture a été déclaré à l’OIE : phénicolés, tétracyclines, macrolides,
quinolones et inhibiteurs de la synthèse des folates (OIE 2017b). Les phénicolés et les tétracyclines
sont les antibiotiques les plus utilisés en aquaculture, 65,9 % et 23,6 % des usages respectivement.
Ces valeurs sont à prendre avec précaution car les données d’usages d’antibiotiques dans
l’aquaculture ne sont pas systématiquement reportées à l’OIE. De plus, la plupart des souches ayant
acquis des résistances sont originaires de pays faisant partie de l’association des nations d’Asie du
sud-est (ASEAN), où un document préconise l’utilisation d’antibiotiques de ces classes sauf les
phénicolés en aquaculture (ASEAN 2013). L’usage de ces antibiotiques entraîne un risque de
sélection des résistances dans des bactéries naturellement présentes dans l’eau, les sédiments et sur
les animaux. Ces résistances peuvent être naturellement présentes dans le milieu aquatique ou être
issues d’un apport exogène aux bassins d’aquaculture ; via des bactéries résistantes provenant du
milieu aquatique ou du milieu terrestre par ruissèlement. Les résistances observées pourraient être
liées à la pression de sélection causée par l’utilisation de ces familles d’antibiotiques.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
200
De plus, V. parahaemolyticus est un des agents étiologique de la diarrhée du voyageur. Pour
traiter ces infections les fluoroquinolones ou l’azithromycine sont prescrits en première intention
(Diemert 2006a, CDC 2017a). Dans nos travaux, la prévalence des souches de V. parahaemolyticus
ayant acquis des résistances à ces antibiotiques était faible, le constat était le même dans d’autres
travaux scientifiques (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Lopatek et al. 2018). Une utilisation
importante de ces molécules, tant en médecine humaine que vétérinaire pourrait entrainer
l’apparition et la dissémination de résistance à ces antibiotiques.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
201
III. Caractérisation des résistances de la souche V. parahaemolyticus
16-B3PA-006
III.1. Contexte
La souche 16-B3PA-006 avait un phénotype non-sauvage pour 5 classes d’antibiotiques
testées : la tétracycline, la streptomycine, le chloramphénicol, le cotrimoxazole et l’ensemble des β-
lactamines testées sauf la témocilline. Le phénotype de résistance aux β-lactamines suggère la
présence d’une céphalosporinase ou de l’action combinée de plusieurs enzymes comme d’une
céphalosporinase et d’une BLSE. Nous avons d’abord caractérisé plus précisément le mécanisme de
résistance aux β-lactamines en testant sa sensibilité à d’autres β-lactamines et en effectuant un test
enzymatique. Un criblage génétique par puce à ADN a également été réalisé pour identifier la classe
de la β-lactamase présente dans la souche. Enfin, nous avons séquencé le génome total pour
identifier les gènes de résistance portés par la souche et les structures génétiques portant ces gènes
de résistance. En parallèle de ces travaux, nous avons regardé la capacité de dissémination des
résistances en effectuant une conjugaison bactérienne.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
202
III.2. Matériel et méthodes
III.2.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines
III.2.A.a. Activité vis-à-vis des β-lactamines
III.2.A.a.i Sensibilité aux β-lactamines
Un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé a été réalisé comme décrit dans le chapitre
II.2.B. . Des disques de céfépime (30 µg) (céphalosporine de 4ème génération) et d’imipénème (10 µg)
(carbapénème) (Biorad) ont été utilisés. Les diamètres d’inhibition ont été interprétés selon la table
20 du M45 du CLSI (CLSI 2015).
III.2.A.a.ii Carbapenemase Inactivation Method
Cette méthode a été appliquée selon le protocole décrit par van der Zwaluw (van der Zwaluw
et al. 2015). La souche de V. parahaemolyticus a été resuspendue dans 400 µL d’eau physiologique.
Un disque d’antibiotique contenant 10 µg de méropénème (Biorad) a été plongé dans la suspension
et celle-ci a été incubée pendant au moins 2h à 35°C. Après cette incubation, le disque a été déposé
sur une gélose Mueller-Hinton (Biorad) préalablement ensemencée avec une suspension à 0,5
McFarland d’une souche E. coli ATCC 25922 sensible aux carbapénèmes, puis incubée une nuit à
35°C. Si la souche testée produit une carbapénèmase, le méropénème contenu dans le disque est
hydrolysé pendant la première incubation. Il ne reste plus d’antibiotique pour inhiber la culture de la
souche E. coli sensible pendant la deuxième incubation. La souche sensible E. coli peut alors croître
au contact du disque : le test est positif. Dans le cas contraire, le méropénème n’a pas été inactivé
pendant la première incubation et une zone d’inhibition de croissance sera visible sur la culture E.
coli sensible : le test est négatif. La souche V. parahaemolyticus 15-B3PA-775 a été utilisée comme
témoin négatif.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
203
III.2.A.b. Criblage d’enzyme par puce à ADN
Deux puces à ADN, check-MDR CT 101 et check MDR CT 103XL (Check-Point, Wageningen,
Pays-Bas), ont été utilisées selon les recommandations du fabricant.
III.2.B. Séquençage et analyse du génome total
III.2.B.a. Séquençage
Le séquençage du génome total a été effectué par la plateforme iGenSeq (Institut de la
Moëlle et du Cerveau, Hôpital Pitié Salpêtrière, Paris, France) sur un appareil NextSeq (Illumina, San
Diego, CA, USA).
III.2.B.b. Assemblage
Les reads bruts ont été triés avec une taille minimum de 35 pb et un score de qualité de 0,03.
L’assemblage a été effectué par le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.1. Nous avons d’abord
alignée l’ensemble des reads contre les deux chromosomes du génome de référence de V.
parahaemolyticus RIMD 2210633. Les reads appariés restants ont été considérés comme faisant
partie du matériel génétique acquis et ont été assemblés de novo.
III.2.B.c. Analyse du génome total
Les gènes de résistance aux antibiotiques, la présence de plasmides et la séquence type (ST)
de la souche 16-B3PA-006 contigs obtenus ont été identifiés grâce aux outils de la plateforme du CGE
(The Center for Genomic Epidemiology server, https://cge.cbs.dtu.dk/services/). La séquence
assemblée de la souche 16-B3PA-006 a été déposée dans Resfinder (Zankari et al. 2012),
PlasmidFinder (Carattoli et al. 2014) et MLST (Larsen et al. 2012).
III.2.C. Conjugaison bactérienne
La souche V. parahaemolyticus 16-B3PA-006 a été utilisée comme donneuse et la souche E.
coli UB5201, résistante à l’acide nalidixique, a été utilisée comme la souche réceptrice. Une souche E.
coli porteuse de l’ICE SXT et résistante au chloramphénicol, la tétracycline, au cotrimoxazole et la
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
204
streptomycine et la souche V.parahaemolyticus 15-B3PA-0752 ont été utilisée comme témoin
d’efficacité de la fabrication des milieux gélosés de sélection des transconjuguants.
À partir des cryotubes, les suspensions bactériennes ont été diluées au 1/10 dans 2 ml
d’EPSA et incubée pendant la nuit à 37 °C. La culture de nuit a été diluée au 1/100 dans de l’EPSA. Le
volume final pour les cellules donneuses était de 2 mL et pour la souche réceptrice il était de 10 mL.
Elles ont été incubées à 37 °C pendant 3 h. Puis, 200 µL de la suspension de la souche réceptrice ont
été mélangés avec 200 µL de la suspension de la souche donneuse dans un tube Eppendorf stérilisé.
En parallèle, des filtres en esters de celluloses (Millipore, Darmstadt, Allemagne) de 25 mm de
diamètre et avec une maille de 0,45 µm ont été déposés sur une gélose GNS. Chaque suspension
bactérienne a été déposée sur un filtre et incubée pendant 4 h à 37 °C. Le filtre a été récupéré et
placé dans un tube falcon de 15 mL contenant 5 mL d’EPSA. Les tubes ont été agités pendant 30 s,
puis les suspensions ont été diluées 4 fois de suite au 1/10. Cent microlitres de la solution mère et de
la dilution 1/100 ont été étalés avec l’ensemenceur automatique easyspiral® (Interscience, Saint
Nom, France) sur GNS avec de l’acide nalidixique (Sigma-Aldrich, Lyon, France) et un des
antibiotiques (Sigma-Aldrich) testés (Tableau 37). Cent microlitres des dilutions 1/100 et 1/10 000
ont été étalés avec l’ensemenceur spiral sur une gélose GNS contenant un des antibiotiques testés et
sur une GNS contenant de l’acide nalidixique et l’antibiotique testé. Les géloses ont été incubées à
37°C pendant 24h.
Tableau 37: Concentrations d'antibiotiques utilisées pour la conjugaison bactérienne.
Antibiotiques Concentrations (µg.mL-1)
Acide nalidixique 30
Méropénème 2
Triméthoprime 15
Streptomycine 30
Chloramphénicol 15
Tétracycline 8
Les colonies ont été dénombrées avec un compteur de colonies Scan 500 (Interscience). La
fréquence de conjugaison a été calculée avec la formule suivante :
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
205
𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑔𝑢𝑎𝑛𝑡
𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑑𝑜𝑛𝑛𝑒𝑢𝑠𝑒 𝑒𝑡 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑔𝑢𝑎𝑛𝑡
Les colonies dénombrées sur la gélose contenant l’antibiotique testé correspondaient au
nombre de souches donneuses et transconjugantes. Les colonies dénombrées sur la gélose
contenant l’acide nalidixique et l’autre antibiotique correspondaient au nombre de transconjugants.
Trois colonies ont été prélevées des géloses contenant l’acide nalidixique et l’antibiotique
testé et dilués chacune dans une goutte d’eau. Chaque suspension a été étalée sur gélose Mueller-
Hinton avec un écouvillon stérile et les antibiotiques utilisés dans le chapitre II.2.B. ont été déposés.
La boite a été incubée à 35 °C pendant 16-18 h. Pour chaque profil de résistance différent, un
antibiogramme a été réalisé d’après le protocole du chapitre II.2.B. et chaque souche a été
conservée à-80°C dans du BCC avec 20 % de glycérol.
III.3. Résultats
III.3.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines
Le diamètre d’inhibition pour l’imipénème était de 24 mm, et celui pour le céfépime était de
14 mm ; la souche 16-B3PA006 était donc catégorisée sensible à l’imipenème et résistante au
céfépime. Cependant, seul un gène de la famille des carbapénèmases blaNDM a été détecté par les
deux puces à ADN et le CIM test a confirmé la production d’une carbapénèmase par cette souche
(Figure 31).
Figure 31: Résultats du CIM test.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
206
III.3.B. Séquençage du génome total et analyse bio-informatique
Un total de 190 contigs, dont la taille variait entre 990 pb et 238 282 pb ont été obtenus.
Soixante n’avaient pas d’homologie avec le génome de référence et faisaient partis du matériel
génétique acquis. Par typage MLST, la souche 16-B3PA-006 était classée ST864. L’intégrase intI1 était
sur le contig 12. De plus, nous avons identifié grâce à Resfinder, 9 gènes de résistance : blaNDM-1, strA,
strB, aadA2, sul1, sul2 et dfrA16 avec 100% d’identité et tet(A) et florR avec, respectivement, 98,19 %
et 99,83 % d’identité. Le gène strB était sur le contig 29, les gènes strA et sul2 ont été assemblés sur
le contig 53 et étaient contigus, de même pour les gènes aadA2 et dfrA16 qui étaient localisés sur le
contig 12 juste en aval du gène de l’intégrase de l’intégron de classe 1. Les gènes blaNDM-1 et sul1
étaient sur le contig 11 mais à une distance de 14 kb. Enfin les gènes floR et tet(A) étaient assemblés
sur le contig 20 et leurs séquences se chevauchaient. Une analyse par Blastn de ces contigs a permis
d’identifier une partie du transposon Tn125 : ΔISAba125, blaNDM-1, ble, trpF, tat, dct, groS, groL et
IS91 sur le contig 11. Aucune autre structure génétique n’a été identifiée sur les autres contig portant
des gènes de résistance aux antibiotiques identifiés. Cependant, Plasmidfinder a identifié un
plasmide IncA/C2 sur le contig 2 mais aucun gène de résistance n’était présent sur ce contig.
III.3.C. Conjugaison bactérienne
Les sélectivités des géloses supplémentées en méropénème, streptomycine, triméthoprime
et les géloses supplémentées avec ces antibiotiques et l’acide nalidixique ont été validées. Pour le
chloramphénicol et la tétracycline, les sélectivités des géloses n’ont pas été validées et les géloses
supplémentées avec ces antibiotiques n’ont pas été utilisées pour la suite des expérimentations.
Nous avons observé la présence de transconjugants pour les 3 antibiotiques sélectifs testés.
Le phénotype de résistance observé était identique pour les trois antibiotiques: résistance à toutes
les β-lactamines testées, au cotrimoxazole et à la streptomycine. Cependant, le phénotype était plus
prononcé lorsque la sélection était faite sur la streptomycine (Figure 32). Le phénotype de résistance
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
207
le moins prononcé a été appelé phénotype A et le phénotype de résistance le plus prononcé a été
appelé phénotype B.
Les fréquences de conjugaison étaient, pour la sélection au méropénème de 10-1, pour la
sélection au triméthoprime de 10-4 et pour la sélection à la streptomycine de 10-7.
Figure 32: Antibiogrammes de la souche E. coli réceptrice UB 5201 et les deux phénotypes obtenus après la conjugaison avec V. parahaemolyticus 16-B3PA-006. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).
AMP
CST
STR
CHL TEM CTX CEF
FOX CAZ AMC
CIP NAL AZM
TET SXT GEN
AMP
CST
STR
CHL TEM CTX CEF
FOX CAZ AMC
CIP NAL AZM
TET SXT GEN
AMP
CST
STR
CHL TEM CTX CEF
FOX CAZ AMC
CIP NAL AZM
TET SXT GEN
Phénotype A Phénotype B
E. coli UB 52210
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
208
III.4. Discussion
La séquence type ST864 que nous avons utilisé a été associée à une souche
environnementale décrite en Chine. Le phénotype multi-résistant de la souche V. parahaemolyticus
16-B3PA-006 a été confirmé par l’étude génotypique. En effet, au moins un gène de résistance était
détecté pour chaque résistance acquise observée phénotypiquement. Ces gènes de résistance
étaient dispersés sur 5 contigs différents et il n’a pas été possible d’associer ces contigs au
chromosome ou à des éléments transférables par conjugaison bactérienne (plasmides, ICE).
La souche portait le transposon Tn125, qui a déjà été partiellement décrit dans une souche
clinique de V. fluvialis, mais il n’était pas complet (Chowdhury et al. 2016). Ce transposon, contenant
blaNDM-1, a été décrit dans d’autres souches cliniques d'Enterobacteriaceae et d’Acinetobacter. Ce
transposon semble diffuser parmi un grand nombre d’espèces bactériennes de la classe des γ-
Proteobacteria (Poirel et al. 2012a). Cela montre la capacité de dissémination de ce transposon et de
la carbapénèmase qu’il contient à travers des espèces bactériennes et des biotopes divers : milieu
marin, sol, tube digestif. Elle portait également un intégron de classe 1 avec deux cassettes de gènes
de résistance : aadA2 et dfrA16. Dans les travaux, de Ceccarelli et al. (2006) des intégrons de classe 1
ont également été identifiés et ils portaient le gène de résistance dfrA15.
Le phénotype de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux inhibiteurs de la
synthèse des folates a été transféré entre V. parahaemolyticus et E. coli. L’observation d’un même
phénotype de résistance aux antibiotiques plus accentué et une fréquence de conjugaison différente
semble indiquer que certains gènes de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux inhibiteurs
de la synthèse des folates soient sur des éléments génétiques conjugatifs et/ou mobilisables
différents. Un des éléments conjugatifs portant certains gènes, dont blaNDM-1, donnait le phénotype
A. Le phénotype B a pu être obtenu par un élément conjugatif qui conjuguait moins fréquemment
que celui donnant le phénotype A. Il a pu être également obtenu par un élément génétique, portant
d’autres gènes de résistance ou une pompe favorisant l’efflux d’antibiotiques, mobilisés lors du
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
209
transfert d’un élément conjugatif. Nous n’avons pas observé de transfert des phénotypes de
résistance à la tétracycline et au chloramphénicol en sélectionnant avec un carbapénème, un
aminoside ou un inhibiteur de la synthèse des folates, ces gènes sont certainement présents sur
d’autres éléments génétiques. La présence de ces deux gènes sur un même contig semble appuyer
cette hypothèse. La sélection sur ces antibiotiques pourrait être intéressante pour étudier la capacité
de dissémination des gènes tet(A) et floR. Le séquençage des souches transconjugantes permettrait
de comparer et aider à la reconstitution des éléments génétiques conjugatifs présents dans la souche
16-B3PA-006.
Même si la souche 16-B3PA-006 portait le gène blaNDM-1, elle était sensible cliniquement pour
l’imipénème selon les critères du CLSI et sauvage pour la témocilline. De plus, la croissance de la
souche V.parahaemolyticus 16-B3PA-006 était faible sur la gélose sélective contenant 2 µg.mL-1 de
méropénème. Elle était résistante à bas niveau pour les carbapénèmes et la concentration en
méropénème dans les géloses sélectives devait être trop élevée pour permettre une croissance
optimale de cette souche. D’où la fréquence de conjugaison calculée très élevée. En outre, les
caractéristiques phénotypiques de cette souche n’orientaient pas la recherche d’une
carbapénèmase. Ce sont des tests complémentaires (criblage moléculaire et tests enzymatiques) qui
ont montré une activité enzymatique de type carbapénèmase. Des souches V. fluvialis isolées de
selles de patients en Inde étaient productrices de NDM-1 (Chowdhury et al. 2016). Les CMI pour
l’imipenème de ces souches étaient supérieures à 4 µg.mL-1 et elles étaient résistantes cliniquement
à l’imipenème. De même, des souches de V. parahaemolyticus et V. vulnificus productrices de NDM-1
isolées d’eau de baignade au Nigeria étaient résistantes cliniquement à l’imipenème et à
l’ertapénème (Oyelade et al. 2018). Leurs CMI pour ces carbapénèmes étaient supérieures à 4 µg.mL-
1. Des souches de V. cholerae, productrices de NDM-1 ont été également isolées dans des
échantillons cliniques ou environnementaux, mais leur sensibilité in vitro aux carbapénèmes n’a pas
été décrite à ce jour (Walsh et al. 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015).
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
210
En revanche, les antibiogrammes par diffusion ne semblent pas pertinents pour détecter in
vitro l’activité de la carbapénèmase NDM-1 pour V. parahaemolyticus. Les marqueurs de détection
utilisés, comme la témocilline ou l’imipénème ne semble pas efficace pour détecter ces enzymes par
antibiogramme en milieu gélosé. Dans le référentiel du CLSI, les seuils cliniques de l’imipénème pour
Vibrio spp. sont dérivés de ceux des Enterobacteriales. La production de NDM-1 aurait peut-être été
détectée par antibiogramme par diffusion pour V. parahaemolyticus si des seuils épidémiologiques
avaient été définis. Des souches bactériennes productrices de carbapénèmase et sensibles aux
carbapénèmes ont également été décrites pour des Enterobacteriales (Nordmann et al. 2012a). Dans
tous les cas, une confirmation de la présence de carbapénèmases par des tests enzymatiques et/ou
génotypiques est nécessaire. NDM-1 a été décrit pour la première fois en 2009 dans une souche de
Klebsiella pneumoniae chez un patient revenant d’Inde (Yong et al. 2009). Depuis, le gène blaNDM-1 a
été détecté dans de nombreuses de souches Gram négatif (Enterobacteriales, Acinetobacter,
Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas,…) isolées d’échantillons environnementaux, humains et
alimentaires (Jovcic et al. 2011, Walsh et al. 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015, Chowdhury et
al. 2016, Janecko et al. 2016, Khan et al. 2017, Wang et al. 2017b).
Le sous-continent Indien semble être le réservoir d’origine du gène blaNDM-1, les Balkans et le
Moyen Orient semble également être des réservoirs secondaires (Dortet et al. 2014). Les voyageurs,
colonisés par des bactéries porteuses de blaNDM-1, sont des acteurs dans la dissémination du gène
blaNDM-1 depuis des régions où ce gène est endémique, vers des régions où ce gène est non
endémique (van der Bij et Pitout 2012).
L’Homme peut également être exposé à des bactéries produisant des carbapénémases par
son alimentation. Des souches de Salmonella et Enterobacter cloacae produisant NDM-1 ont été
isolées de viandes de poulet et de palourdes respectivement (Wang et al. 2017b). De même des
souches de Salmonella et E. coli produisant VIM-1 ont été isolées de viande de porc et de praires
(Borowiak et al. 2017, Roschanski et al. 2017). C’est la première description d’une souche de V.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
211
parahaemolyticus produisant NDM-1 isolée de crevettes importées d’Asie du Sud-Est. Dans les
travaux de Janecko et al. (2016) et Roschanski et al. (2017), les souches E. cloacae et E. coli ont été
isolées de produits aquatiques importés d’Asie du Sud-Est ou d’Italie (Janecko et al. 2016, Roschanski
et al. 2017). L’importation d’aliment devrait également pris en considération comme un vecteur
potentiel de dissémination de carbapénèmase comme NDM-1. Le rôle du commerce international ne
devrait pas être sous-estimé comme une route alternative pour la dissémination des
carbapénémases.
Le phénotype carbapénèmase a pu diffuser de V. parahaemolyticus à E. coli et être
sélectionné par des antibiotiques qui ne font pas partis de la famille des β-lactamines. La sélection
croisée des résistances, notamment de mécanismes ayant un impact en santé publique comme les
carbapénèmases, est un phénomène favorisant la diffusion de ces mécanismes de manière sous-
jacente et discrète. Ce problème de co-sélection de résistance devrait être pris en compte pour
encourager les bonnes pratiques visant à réduire l’exposition des animaux et des hommes aux
antibiotiques.
Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture
212
- Des seuils épidémiologiques expérimentaux ont été définis pour V. parahaemolyticus pour
tous les antibiotiques testés, sauf l’ampicilline et la colistine.
- 60 souches (16 %) avaient un phénotype non-sauvage pour au moins une classe
d’antibiotique.
- L’intégrase de l’ICE SXT/R391 a été détectée dans 3 souches résistantes et un intégron de
classe 1 a été détectée dans une seule souche résistante.
- 10 souches (2,5 %) étaient multi-résistantes, dont 4 souches résistantes aux tétracyclines,
aux inhibiteurs de la synthèse es folates, aux aminosides et aux phénicolés.
- La souche 16-B3PA-006 était multi-résistante à 5 classes d’antibiotiques (β-lactamines,
tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates, aminosides, phénicolés) et elle produisait
une carbapénèmase NDM-1.
- Le phénotype de résistance aux β-lactamines, aux inhibiteurs de la synthèse des folates et
aux aminosides a été transféré de la souche 16-B3PA-006 à E. coli par conjugaison.
215
Conclusion et perspectives
Conclusion et perspectives
216
L’objectif de ces travaux était de faire un état des lieux de la flore bactérienne mésophile
cultivable présente dans des produits de la pêche et de l’aquaculture et d’étudier sa résistance aux
antibiotiques. Les différentes catégories de produits analysés étaient des poissons (poissons plats,
cabillauds), crustacés (crevettes, homards) et mollusques (moules, huîtres et noix de Saint-Jacques).
Pour la partie étude de la flore bactérienne, nous avons employé différentes températures
d’incubation, bouillons d’enrichissement, géloses sélectives, et temps d’incubation pour isoler le
maximum de bactéries mésophiles cultivables de ces produits. Le nombre d’isolats de
caractéristiques morphologiques (forme, couleur, taille) différentes prélevé sur les géloses était très
variable, comme par exemple pour les milieux ChromID® qui allait de 6 colonies différentes sur la
gélose ChromID®OXA-48 à 78 colonies sur la gélose ChromID®MRSA. Au total, 1882 souches ont été
isolées de 181 produits aquatiques. Ensuite, les techniques MALDI-TOF et l’amplification et le
séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB, rpoB, et tuf) ont été utilisées et nous a permis
d’identifier 86 % des isolats. Ces techniques étaient complémentaires mais leurs bases de données
étaient un point critique qui ne permettait pas toujours d’identifier les isolats. Il est donc important
d’employer au moins deux techniques pour obtenir une identification fiable au moins au genre
bactérien si ce n’est à l’espèce.
Une grande diversité dans la flore bactérienne a été observée avec l’identification de 57
genres bactériens et 150 espèces, dont la majorité n’était pas ciblée par les géloses sélectives
utilisées (colonies non caractéristiques). Des différences de flores ont été observées, certaines
étaient spécifiques à des produits ou à des catégories de produits (poissons, crustacés, mollusques)
qui pouvaient être liés au mode de vie des animaux étudiés (benthique, filtreurs, migrateurs,…).
Néanmoins, 5 genres bactériens ont été isolés de l’ensemble des matrices : Enterococcus, Bacillus,
Staphylococcus, Vibrio et Psychrobacter. Les genres Aerococcus, Vagococcus, Pseudomonas,
Brevundimonas et Staphylococcus étaient les plus abondants dans les échantillons de poissons,
Bacillus et Exiguobacterium dans les échantillons de crustacés et Aeromonas, Enterococcus et Vibrio
Conclusion et perspectives
217
les échantillons de noix de Saint-Jacques. Il n’y avait pas de genre bactérien majoritaire ni spécifique
aux moules ou aux huîtres.
Pour la partie antibiorésistance de ces travaux, nous avons réalisé une étude
épidémiologique de la résistance de la flore mésophile présente dans les produits en déterminant les
populations sauvages et non-sauvages de 6 genres bactériens. Des critères d’interprétation
épidémiologiques (ECOFFs) des antibiogrammes des genres Enterococcus, Staphylococcus,
Exiguobacterium, Pseudomonas, Proteus et Vibrio ne sont pas toujours définis dans les référentiels
du CLSI ou l’EUCAST. Nous avons alors calculé des COWT au niveau du genre bactérien car les
techniques d’identification n’ont pas permis une bonne identification des isolats à l’espèce. En effet,
l’identification au genre était bonne pour les 2 techniques employées (entre 81 % et 91%) sur le
panel de souches étudiées mais moins performant (entre 37% et 50%) pour identifier à l’espèce
bactérienne. Nous avons observé la présence de population non-sauvage pour des couples genre
bactérien/ antibiotique mais pour être plus précis dans nos observations, il aurait été important
d’aller à une identification de l’espèce bactérienne. En effet, pour certains antibiotiques, il y a avait
plusieurs sous-populations dans un genre bactérien qui étaient liées à des résistances différentes en
fonction d’espèces bactériennes. En outre, la présence de bactéries résistantes et même multi-
résistantes a quand même puis être détectée dans toutes les catégories de produits analysés, sauf
dans les huîtres, et il y en avait plus dans les produits importés que dans les produits français. Nous
nous sommes intéressés plus spécifiquement à l’espèce V. parahaemolyticus qui est naturellement
présente dans le milieu aquatique et qui part ses caractéristiques physiologiques est un potentiel
vecteur de résistance. Nous avons défini 14 COWT et la présence de population non-sauvage pour
16% des souches, tous antibiotiques confondus, avec 11 souches multi-résistantes. Dans ces 11
souches, la souche 16-B3PA-006, isolée de crevettes, était résistante à 5 classes d’antibiotiques et
elle était productrice de la carbapénèmase NDM-1.
Conclusion et perspectives
218
Les produits de la pêche et de l’aquaculture présentent donc une voie de transmission de
bactéries résistantes aux antibiotiques entre l’environnement aquatique et l’Homme. Le risque
semble plus important avec les produits d’aquaculture importés des pays tropicaux comme les
crevettes. Les échanges commerciaux internationaux sont donc une voie possible de dissémination
de la résistance aux antibiotiques.
Pour continuer ces travaux, il est important de pouvoir identifier les isolats à l’espèce
bactérienne car les résistances aux antibiotiques sont souvent spécifiques à celle-ci. Pour cela, il faut
utiliser plusieurs techniques d’identification pour aller à l’espèce bactérienne comme celles que nous
avons utilisé et qu’il faut compléter par l’utilisation du séquençage d’autres gènes de ménages (rpoA,
rpoC, rpoD, gyrA, recA, recN,…) ou pyrH pour Vibrio pourrait aider à identifier les espèces
bactériennes de ces genres bactériens (Das et al. 2014). Le point faible de toutes les techniques
d’identification était leurs bases de données qui manquent de profils de référence de bactéries de
l’environnement. En effet, nous avons remarqué que la base de données de spectres de référence de
la technique MALDI-TOF n’était pas complète pour identifier toutes les espèces bactériennes isolées
des produits de la pêche et de l’aquaculture, notamment celles du genre Exiguobacterium. Nous
pourrions utiliser notre collection de souches pour créer des spectres de référence des espèces
comme celle d’Exiguobacterium et compléter la base de données du MALDI-TOF. Il est donc
important de travailler en collaboration avec d’autres équipes scientifiques pour l’amélioration de
ces bases. De plus, des espèces bactériennes potentiellement pathogènes alimentaires pour l’homme
(E. coli, S. aureus et B. cereus) ont été isolées des produits analysés sans résistances acquises. Les
gènes de pathogénicité de ces espèces n’ont pas été recherchés dans ces souches. Il serait
intéressant de se rapprocher d’équipes de recherches spécialisés et/ou des laboratoires nationaux de
références de ces espèces pour caractériser le risque que représentent ces bactéries pour le
consommateur.
Conclusion et perspectives
219
De même, les espèces E. coli, E. faecalis, E. faecium et Staphylococcus spp. donc S. aureus
sont des marqueurs de contaminations fécales et/ou humaines. Cependant, les espèces des genres
Enterococcus et Staphylococcus ont été isolées de la plupart des produits analysés et cela questionne
sur l’origine de ces genres bactériens sur les produits de la pêche et de l’aquaculture « Sont-elles
naturellement présentes dans le milieu aquatique ? Sont-elles des contaminants provenant du milieu
terrestre? ». Les animaux marins peuvent être contaminés par ces bactéries par les effluents ou dans
la chaîne de production à partir de la récolte/pêche jusqu’à l’arrivée au laboratoire (bateau de pêche,
opérateurs, bassins de purification, glace, …). Il serait intéressant de typer (MLST, PFGE, …) les
souches Enterococcus et Staphylococcus isolées des produits aquatiques et de les comparer avec des
souches humaines ou d’animaux terrestres. Des profils de typage proches indiqueraient une
potentielle origine commune et des profils différents indiqueraient des origines différentes.
De plus, dans nos travaux, nous nous sommes focalisés sur la flore cultivable mésophile. Un
isolat de chaque morphologie sur 14 milieux sélectifs a été sélectionné. Les compositions des flores
bactériennes obtenues ne reflètent qu’une partie de la flore présente sur les produits. Des études
métagénomiques de la composition de la flore bactérienne des produits de la pêche permettraient
de mieux appréhender la composition de la flore bactérienne des produits aquatiques, notamment
de la flore bactérienne non cultivable. En outre, cela aidera à mieux comprendre les facteurs
influençant la composition de la flore bactérienne des animaux aquatiques (physiologie,
alimentation, migrations, place de l’animal dans la colonne d’eau,…). De plus, le développement
d’outils moléculaires de diagnostic plus performants (rapide, spécifique, peu coûteux) doit être
poursuivie sur des échantillons complexes et diversifiés provenant du milieu aquatique (poissons et
prélèvements d’eau douce/ eau de mer). Cela pourra servir à l’analyse d’échantillons biologiques
complexes qui seront prélevés de l’amont, eau de rivière, (eau douce/ pisciculture) à l’aval, le milieu
marin (eau mer/ poisson de pêche). Le but de ces analyses sera de quantifier et de caractériser le
résistome bactérien présent dans l’environnement aquatique.
Conclusion et perspectives
220
La résistance aux antibiotiques des bactéries présentes dans le milieu marin est peu connue,
les distributions des diamètres d’inhibition des souches dont les espèces bactériennes ont été
identifiées pourront être envoyées aux référentiels du CLSI et de l’EUCAST. Cela enrichirait leurs
bases de données et pourrait contribuer à l’établissement de seuils épidémiologiques pour des
couples antibiotiques/bactéries pour lesquels il n’existe pas d’ECOFF, comme pour Vibrio. Il pourrait
également être intéressant d’étudier la résistance aux antibiotiques des genres bactériens comme
Bacillus et Vagocccus, qui étaient également isolés des matrices analysées (poissons, crustacés et
mollusques), en étudiant les concentrations minimales inhibitrices par microdilution. Après une
identification à l’espèce de tous les isolats de la collection que nous avons créée, celle-ci pourra être
étudiée en réalisant des antibiogrammes pour déterminer de nouvelles résistances naturelles et
acquises.
Dans ces travaux de thèse, la résistance aux antibiotiques a été détectée phénotypiquement
pour toutes les souches sauf pour la souche V. parahemolyticus 16-B3PA-006. Les antibiotiques
testés dans cette étude ont été utilisés pour détecter des résistances à un nombre important
d’antibiotiques pour des bactéries Gram positif et Gram négatif. Il serait intéressant de développer
des antibiogrammes spécifiques pour les genres bactériens étudiés comme Enterococcus et
Pseudomonas. De même, les phénotypes de résistance pourraient être confirmés en étudiant les
concentrations minimales inhibitrices de ces genres par microdilution.
Il serait également intéressant d’identifier les mécanismes de résistance et les supports
génétiques présents dans les souches non-sauvages détectées, comme cela a été fait pour la
collection de V. parahaemolyticus. Nous pourrions chercher par PCR des marqueurs de résistance de
gènes de résistance connus comme la cassette SCCmec pour détecter la présence du gène
responsable de la résistance à la méticilline pour la population de Gram positif non-sauvage pour la
céfoxitine. Un séquençage du génome total, comme cela a été réalisé pour la souche de
Conclusion et perspectives
221
V. parahemolyticus 16-B3PA-006, pourrait également être effectué sur les souches multi-résistantes
des genres Enterococcus, Exiguobacterium et de l’espèce V. parahaemolyticus. Par exemple, le
séquençage du génome total des souches de V. parahaemolyticus multi-résistantes aiderait à
comprendre les mécanismes d’acquisition des résistances aux antibiotiques car les questions qui se
posent sont : les connait-on ? (plasmides, transposons,…) Sont-ils des intégrons autres que ceux
étudiés ? Sont-ils des intégrons chromosomiques ou d’autres structures génétiques comme des ICEs
ou des IMEs peu ou non décrits ? De même, la localisation plasmidique ou chromosomique du gène
blaNDM-1 et des autres gènes de résistance pour la souche V. parahemolyticus 16-B3PA-006 n’ont pas
été determinés. Une extraction plasmidique et leur séquençage permettrait de répondre à cette
interrogation. En outre, le génome des souches E. coli transconjugantes pourrait être séquencé. En
effet, nous avons observé deux phénotypes de résistance pour ces souches et le séquençage du
génome total et des plasmides présents dans ces souches permettraient d’identifier le matériel
génétique qui a transféré depuis la souche 16-B3PA-006. De plus, en comparant les résultats de
séquençage entre les deux souches transconjugantes, nous pourrions identifier des éléments
génétiques expliquant les différences de phénotype de résistance comme des éléments génétiques
mobilisables ou éléments génétiques conjugatifs avec des fréquences de conjugaison différentes.
Nous pourrions également caractériser phénotypiquement les résistances des différentes
espèces de Pseudomonas et Vibrio vis-à vis des β-lactamines en testant les sous-familles de cette
classe d’antibiotique : aminopénicillines, carboxypénicillines, uréïdopénicillines, monobactam et les
carbapénèmes. Cela permettrait de mieux comprendre les phénotypes de résistance naturelle aux β-
lactamines de ces genres bactériens. De plus, l’identification et la caractérisation des β-lactamases et
de leur contexte génétique pourrait aider à mieux comprendre le déterminisme de ces résistances,
notamment la carbénicillinase chromosomique de Vibrio qui été caractérisée que pour
V. parahaemolyticus. De plus, il serait important d’élargir l’étude faite pour V. parahaemolyticus,
(définition de seuils épidémiologique, caractérisation des mécanismes de résistances et les supports
génétiques) aux autres espèces de Vibrio pathogènes alimentaires pour l’homme comme V. cholerae
Conclusion et perspectives
222
et V. vulnificus et des espèces pathogènes pour les animaux aquatiques comme V. harveyi et V.
anguillarum.
Sur du plus long terme, nous pourrions cumuler des souches de différentes espèces
bactériennes isolées de produits aquatiques (comme les espèces des genres Enterococcus,
Exiguobacterium, Vibrio, Pseudomonas,…), par le biais de projets de recherche, afin de pouvoir
calculer des seuils épidémiologiques expérimentaux pour des couples espèces
bactériennes/antibiotiques. Cela nous aiderait à définir des résistances naturelles des différentes
espèces bactériennes du milieu aquatique, et les antibiotiques pertinents à tester pour des études
futures.
Notre étude a porté sur l’étude la flore bactérienne et des résistances aux antibiotiques
associés de produits aquatiques frais. Il y a deux approches possibles pour continuer ce projet : la
première porte sur le risque lié à l’antibiorésistance de la pêche au consommateur, et la deuxième
question porte sur le risque de bioaccumulation dans les réseaux trophiques.
En effet, certains de ces produits sont disponibles directement à la consommation, en vente
directe ou chez les poissonniers, mais d’autres vont subir des transformations en atelier agro-
alimentaire. Les transformations peuvent être plus ou moins importantes (filetage, empaquetage
sous atmosphère modifiée, congélation, cuisson, fumaison, salaison, appertisation…). Toutefois, la
résistance aux antibiotiques des flores bactériennes des ateliers agro-alimentaires n’est pas étudiée.
Pourtant, un transfert de bactéries ou de gènes de résistance est possible depuis les matières
premières vers la flore des ateliers agro-alimentaires. De plus, l’impact des produits utilisés dans les
procédures des nettoyage/désinfection des ateliers sur le maintien de ces résistances est peu étudié.
Plusieurs questions se posent « Comment évolue les résistances aux antibiotiques entre le
prélèvement du produit depuis le milieu aquatique et le moment où il est disponible à la
Conclusion et perspectives
223
consommation ?, Le risque pour le consommateur d’ingérer des bactéries résistantes aux
antibiotiques est-il plus important avec des produits frais ou des produits transformés ? ».
Des études de la résistance aux antibiotiques de la flore bactérienne présente sur une filière
de production entière pourraient être intéressantes pour estimer le risque pour le consommateur. La
filière du saumon serait un bon exemple. Ce poisson est consommé sous différentes formes : cru,
surgelé, fumé, cuisiné… Des comparaisons pourraient être faites sur les différents produits finaux et
les différents procédés de fabrication. Il y a également la possibilité de pouvoir comparer entre les
différentes sources de production du saumon : sauvage, élevage Européen (Norvège, Royaume-Uni),
élevage d’Amérique du Sud (Chili).
De plus, les résistances aux antibiotiques de la flore bactérienne dans la filière de production
de crevettes pourraient également être intéressantes à étudier. En effet, au travers de cette étude le
taux de bactéries résistantes aux antibiotiques étaient plus importants dans les bactéries isolées des
crevettes importées de pays tropicaux. Une spécificité dû à la nature de ces animaux, leur mode
d’élevage (intégré, bassins terrestres) est peut être à l’origine de cette contamination élevée en
bactéries résistantes aux antibiotiques. Un moyen de comparer serait d’étudier plus en détails la
présence de bactéries résistantes sur des crevettes d’élevage et de comparer avec des poissons
élevés de la même manière comme les siluriformes (panga et poisson-chats). Une comparaison entre
les différents pays de production des crevettes (Inde, Madagascar, Equateur, Thaïlande, …) pourrait
également être faite.
Enfin, il existe des campagnes d’échantillonnages annuelles en mer, comme IBTS conduite
par l’IFREMER. Le but de cette campagne est d’estimer les stocks de poissons présents en
Manche/mer du Nord. Dans la suite de nos travaux, des filtres d’eaux de mer et des poissons ont été
obtenus grâce à la campagne IBTS de 2017. Des analyses sont en cours au laboratoire pour comparer
les flores bactériennes et leurs résistances entre l’eau de mer filtrées et les espèces de poissons
pêchés. De plus, une comparaison entre les zones de prélèvement (estuaires, côte, pleine mer) est
Conclusion et perspectives
224
possible. La participation à des campagnes scientifiques annuelles comme celle-ci permettrait
d’étudier des réseaux trophiques benthiques et pélagiques en prélevant différentes espèces de
poissons, zooplanctons, phytoplanctons, animaux brouteurs et eau de mer. Le but serait de suivre
dans le temps l’évolution les flores bactériennes de ces échantillons et également d’examiner la
position et la présence de bactéries qui ont cumulé des résistances tout au long de réseaux
trophiques benthiques et pélagiques. La position d’organismes autotrophiques et/ ou de poissons
dans les réseaux est un facteur majeur qui peut expliquer la bioaccumulation de bactéries résistantes
aux antibiotiques et le risque potentiel que cela peut poser aux consommateurs finaux de ces
produits.
Ces travaux préliminaires ont montré que les genres bactériens étudiés en antibiorésistance,
Enterococcus, Staphylococcus et Exiguobacterium, pourraient être de bonnes bactéries indicatrices
de la résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche, principalement des poissons. Au
contraire les genres Pseudomonas, Proteus et Vibrio ne semblent pas pertinentes. Cependant,
aucune bactérie commune à tous les animaux aquatiques n’a été identifiée et plusieurs bactéries
pourraient être nécessaire pour surveiller la résistance aux antibiotiques des produits de la pêche et
de l’aquaculture. Afin de confirmer cette hypothèse d’autres études sont nécessaires. Il serait
intéressant d’étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées d’autres poissons (thons,
saumons, lieus, maquereaux, sardines, pangas….), crustacés (crabes, écrevisses,…), mollusques
(calmars, palourdes,…).
225
Valorisation des travaux de the se
Valorisation des travaux de thèse
226
Publications
A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Debuiche, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A. Granier (2018)
NDM-1-producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood. Journal of
antimicrobial chemotherapy doi: 10.1093/jac/dky200
Communications Orales
A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Copin, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A Granier (2017)
NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimps.
- Colloque international francophone Environnement et Santé (CES, Dunkerque 2017).
- 7th symposium sur la résistance aux antibiotiques dans l’environnement et chez les animaux
(ARAE, Brunschweig 2017). Présentation flash (180seconds)
Présentation affichée
A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Debuiche, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A. Granier
NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimps.
- Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-Infectieuse (RICAI, Paris 2016) - Congrès de la société américaine de microbiologie (ASM, Nouvelle-Orleans 2017)
- Congrès de la société française de microbiologie (SFM, Paris 2017)
- Challenges and new concepts in antibiotics research at the Pasteur institute (Paris, 2018)
- 7th symposium sur la résistance aux antibiotiques dans l’environnement et chez les animaux
(ARAE, Brunschweig, 2017)
A. Briet, N. Helsens, L. Guillier, S. Debuiche, A. Brisabois, , S.A. Granier, G. Midelet-Bourdin Antimicrobial resistance of Vibrio parahaemolyticus
- Congrès de la société française de microbiologie (SFM, Paris 2017)
- Challenges and new Concepts in antibiotics research at the Pasteur institute (Paris, 2018)
A. Briet, S. Trigueros, S.A Granier, B. Gassilloud, G. Midelet-Bourdin
Identification of microbial flora isolated from seafood by PCR and/or Malditof technics.
- Congrès de la société française de microbiologie (SFM 2017)
227
Re fe rences bibliographiques
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255
Annexes
Annexes
256
Table des Annexes
ANNEXE I : Nombre d’isolats de chaque espèce bactérienne par gélose sélective ............................ 257
ANNEXE II : Nombre d’isolats de chaque espèces bactérienne par matrice ....................................... 262
ANNEXE III : Distribution des diamètres d’inhibition pour Enterococcus spp. .................................... 268
ANNEXE IV : Distribution des diamètres d’inhibition pour Staphylococcus spp à coagulase négatif . 274
ANNEXE V : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium spp. ............................... 280
ANNEXE VI : Distribution des diamètres d’inhibition pour Pseudomonas spp. .................................. 286
ANNEXE VII : Distribution des diamètres d’inhibition pour Vibrio spp ............................................... 291
ANNEXE VIII : Distribution des diamètres d’inhibition pour Proteus spp. .......................................... 297
ANNEXE IX : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio parahaemolyticus ............................. 302
ANNEXE X : Article “NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood” 307
Annexes
257
ANNEXE I : Nombre d’isolats de chaque espèce
bactérienne par gélose sélective Tableau du nombre d'isolats de chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés. TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL= ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA= ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA. Les cases grises représentent l’absence d’isolats.
Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total
souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Acinetobacter
A. guillouiae 1 1
A. puyangensis 3 5 2 2 12
Acinetobacter sp. 1 1 1 7 1 11
Aerococcus
A. urinaeequi 10 9 2 11 28 3 63
A. viridans 3 4 2 9
Aerococcus sp. 6 15 5 26
Aeromonas A. salmonicida 1 1
Aeromonas sp. 2 12 2 13 4 33
Arthrobacter
A. soli 1 1
A. woluwensis 1 1 2
Arthrobacter sp. 2 10 12
Bacillus
B. altitudinis 1 2 3
B. aquimaris 1 1
B. cereus 12 6 8 5 17 48
B. drentensis 1 1
B. firmus 5 5
B. flexus 1 1
B. horikoshii 1 1
B. infantis 1 1
B. invictae 1 1
B. licheniformis 1 4 2 7
B. marisflavii 5 5
B. megaterium 1 1
B. nealsonii 3 3
B. oceanisediminis 7 7
B. oshimensis 1 1
B. paralicheniformis 1 1 2
B. pumilus 8 3 6 17
B. safensis 1 1
B. stratosphericus 3 3
B. subtilis 7 1 8
B. thuringiensis 2 1 3
B. vallismortis 1 1
B. xianamensis 1 1
Bacillus sp. 59 5 1 28 2 5 100
Annexes
258
Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total
souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Brevundimonas
B. diminuta 1 8 9
B. naejangsanensis 6 1 9 16
Brevundimonas sp. 5 1 4 10
Brochotrix B. thermosphacta 4 4
Carnobacterium C. maltaromaticum 1 1
Carnobacterium sp. 7 7
Cellulosimicrobium C. cellulans 1 1
Cellulosimicrobium sp. 1 1
Chryseobacterium Chryseobacterium sp. 2 2
Citrobater
C. braakii 1 2 1 4
C. farmeri 1 1
C. freundii 1 1 1 3
C. gillenii 1 1
Citrobacter sp. 1 4 1 6
Desemzia D. incerta 1 13 15 1 30
Enterobacter E. cloacae 2 1 1 4
Enterobacter sp. 1 1
Enterococcus
E. aquamarinus 1 1 2
E. casseliflavus 1 7 8
E. durans 1 1
E. faecalis 2 7 29 3 5 4 3 9 62
E. faecium 1 3 6 1 11
E. gallinarum 2 2
E. italicus 1 1 2
E. malodoratus 1 5 6
E. thailandicus 7 21 5 1 1 1 1 2 2 41
Enterococcus sp. 5 5 2 1 3 16
Escherichia
E. coli 3 2 5
E. hermannii 1 1
Escherichia sp. 1 1 2
Exiguobacterium
E. acetylicum 2 4 6
E. aestuarii 4 33 30 1 1 69
E. aurantiacum 4 2 6
E. marinum 3 4 7
E. profundum 1 3 5 9
Exiguobacterium sp. 1 11 12 24
Hafnia H. halvei 1 1 2
Hafnia sp. 1 1
Halobacillus Halobacillus sp. 3 3
Halomonas
H. alkaphila 2 2
H. glacei 1 1 2
Halomonas sp. 1 1 2
Klebsiella K. oxytoca 1 1
Annexes
259
Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total
souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Klebsiella sp. 1 1 2
Kluyvera K. intermedia 3 2 1 6
Kocuria K. palustris 1 1
Kurthia K. gibsoni 2 5 7
K. zopfii 1 1
Lactococcus
L. garvieae 3 8 2 1 14
L. lactis 4 1 1 6
L. raffinolactis 1 1
Lactococcus sp. 2 1 1 4
Lelliottia L. amnigena 3 3
Lysinibacillus
L. boronitolerans 1 1
L. fusiformis 1 1
L. sphaericus 1 1
Lysinibacillus sp. 8 5 1 14
Macrococcus M. caseolyticus 12 8 1 21
Macrococcus sp. 4 3 7
Microbacterium
M. arborescens 1 1
M. esteraromaticum 2 2
M. paraoxydans 4 4
Microbacterium sp. 1 1
Micrococcus M. aloeverae 1 1
M. luteus 2 1 3
Moellerella M. wisconensis 1 1 1 3
Morganella
M. morganii 10 6 2 1 3 22
M. psychrotolerans 2 2
Morganella sp. 1 4 4 2 6 17
Myroides
M. odoratimimus 2 2
M. phaeus 1 3 4
Myroides sp. 1 1 2
Oceanimonas Oceanimonas sp. 2 2
Ochrobactrum O. tritici 1 1
Ochrobactrum sp. 1 1
Paenibacillus P. lactis 1 1
Pantoea P. agglomerans 4 4
Pantoea sp. 1 1
Planococcus P. maritimus 1 1
Proteus
P. cibarius 1 1
P. hauseri 4 1 5
P. terrae 4 2 4 1 2 13
P. vulgaris 5 7 12 10 5 1 40
Proteus sp. 1 10 8 7 3 5 34
Providencia P. rettgeri 3 1 1 1 1 7
P. vermicola 1 1 1 3
Annexes
260
Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total
souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
Providencia sp. 2 3 1 6
Pseudochrobactrum P. asaccharolyticum 2 2
Pseudolalteromonas Pseudoalteromonas sp. 1 1
Pseudomonas
P. alcaliphila 1 1
P. brenneri 1 1 4 1 4 11
P. cichorii 2 1 2 5
P. fluorescens 2 5 7
P. fragi 1 1 2
P. frederikbergensis 1 1
P. helmanticensis 2 1 1 4
P. libanensis 1 1
P. marginalis 2 2 4
P. mendocina 1 1
P. mosselii 1 1
P. putida 3 1 1 5
P. stutzeri 2 1 3
P.tolaasii 1 1 2
P. trivialis 1 1
P. weihenstephanensis 1 1 2
Pseudomonas sp. 1 1 7 30 1 12 6 12 9 79
Psychrobacter
P. arenosus 1 1
P. celer 3 3
P. faecalis 1 1
P. maritimus 1 2 3
Psychrobacter sp. 2 10 5 17
Rahnella R. inusitata 1 1
Rahnella sp. 1 1
Rothia Rothia sp. 5 1 1 7
Salinicoccus Salinicoccus sp. 1 1
Savagea Savagea sp. 1 1
Serratia
S. fonticola 2 2 3 7
S. glossinae 1 1
S. marcesens 3 3
S.quinivorans 2 1 3
Serratia sp. 3 3 3 1 1 4 15
Shewanella
S. algae 5 2 7
S. haliotis 1 7 2 5 15
S. indica 4 5 2 11
S. putrefaciens 1 1
Shewanella sp. 1 4 1 5 11
Sphingobacterium S. mizutaii 2 2
Staphylococcus S. aureus 2 1 2 3 8
S. cohnii 3 1 4
Annexes
261
Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total
souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR
S. epidermidis 2 1 3
S. equorum 3 4 7
S. haemolyticus 2 1 3
S. hominis 1 1
S. lentus 3 5 7 1 16
S. pasteuri 5 3 8
S. saprophyticus 1 2 1 4
S. sciuri 2 3 4 2 11
S. stepanovicci 1 1
S. warneri 1 3 4
S. xylosus 2 2 4
Staphylococcus sp. 3 5 8 16
Stenotrophomonas
S. maltophilia 1 1 4 3 1 10
S. rhizophila 3 1 2 4 10
Stenotrophomonas sp. 1 4 2 7
Streptococcus S. parauberis 2 2
Streptococcus sp. 2 7 9
Vagococcus
V. carniphilus 6 6
V. fluvialis 26 5 7 6 22 66
V. lutrae 2 2
V. penaei 2 2 1 5
Vagococcus sp. 13 6 2 1 4 26
Vibrio
V. alginolyticus 5 3 8
V. casei 1 1
V. metschnikovii 10 6 8 24
V. mytili 1 1
V. natriegens 2 2
Vibrio sp. 14 16 8 38
Virgibacillus V. halodenitrificans 2 2
Virgibacillus sp. 1 4 5
Yersinia Y. massiliensis 1 1 2
Yersinia sp. 1 1 2
Non identifiées 1 11 45 9 13 34 34 38 41 15 10 4 3 258
Total souche 27 78 392 145 114 155 236 345 174 6 55 41 37 77 1882
Annexes
262
ANNEXE II : Nombre d’isolats de chaque
espèces bactérienne par matrice Tableau du nombre d’isolats de chaque espèce bactérienne selon les matrices d’isolements (n=1182). Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases grises représentent l’absence d’isolats (n=978).
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
Acinetobacter
A. guillouiae 1
A. puyangensis 1
Acinetobacter sp. 19 1 2
Aerococcus
A. urinaeequi 1 57 5
A. viridans 5 1 3
Aerococcus sp. 4 2 14 6
Aeromonas A. salmonicida 1
Aeromonas sp. 4 1 3 23 2
Arthrobacter
A. soli 1
A. woluwensis 2
Arthrobacter sp. 3 8 1
Bacillus
B. altitudinis 3
B. aquimaris 1
B. cereus 45 3
B. drentensis 1
B. firmus 5
B. flexus 1
B. horikoshii 1
B. infantis 1
B. invictae 1
B. licheniformis 2 4 1 1
B. marisflavii 5
B. megaterium 1
B. nealsonii 3
B. oceanisediminis 5 2
B. oshimensis 1
B. paralicheniformis 1
B. pumilus 14 1 2
B. safensis 1
B. stratosphericus 2 1
B. subtilis 8
B. thuringiensis 1 2
B. vallismortis 1
Annexes
263
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
B. xianamensis 1
Bacillus sp. 83 12 1 2 2
Brevundimonas
B. diminuta 3 6
B. naejangsanensis 12 4
Brevundimonas sp. 4 6
Brochotrix B. thermosphacta 2 1 1
Carnobacterium C. maltaromaticum 1
Carnobacterium sp. 1 1 2 3
Cellulosimicrobium C. cellulans 1
Cellulosimicrobium sp. 1
Chryseobacterium Chryseobacterium sp. 2
Citrobater
C. braakii 1 1 2
C. farmeri 1
C. freundii 3
C. gillenii 1
Citrobacter sp. 6
Desemzia D. incerta 30
Enterobacter E. cloacae 2 2
Enterobacter sp. 1
Enterococcus
E. aquamarinus 2
E. casseliflavus 3 2 3
E. durans 1
E. faecalis 3 7 1 26 25
E. faecium 4 3 4
E. gallinarum 1 1
E. italicus 2
E. malodoratus 4 2
E. thailandicus 5 33 2 1
Enterococcus sp. 1 7 1 6 1
Escherichia
E. coli 3 2
E. hermannii 1
Escherichia sp. 2
Exiguobacterium
E. acetylicum 6
E. aestuarii 37 6 15 9 2
E. aurantiacum 2 4
E. marinum 7
E. profundum 4 4 1
Exiguobacterium sp. 9 3 8 4
Hafnia H. halvei 2
Hafnia sp. 1
Annexes
264
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
Halobacillus Halobacillus sp. 3
Halomonas
H. alkaphila 1 1
H. glacei 2
Halomonas sp. 2
Klebsiella K. oxytoca 1
Klebsiella sp. 1 1
Kluyvera K. intermedia 1 4 1
Kocuria K. palustris 1
Kurthia K. gibsoni 7
K. zopfii 1
Lactococcus
L. garvieae 12 2
L. lactis 6
L. raffinolactis 1
Lactococcus sp. 1 1 2
Lelliottia L. amnigena 1 2
Lysinibacillus
L. boronitolerans 1
L. fusiformis 1
L. sphaericus 1
Lysinibacillus sp. 4 1 2 7 1
Macrococcus M. caseolyticus 7 12 1 1
Macrococcus sp. 5 1
Microbacterium
M. arborescens 1
M. esteraromaticum 1 1
M. paraoxydans 4
Microbacterium sp. 1
Micrococcus M. aloeverae 1
M. luteus 2 1
Moellerella M. wisconensis 3
Morganella
M. morganii 4 18
M. psychrotolerans 2
Morganella sp. 3 14
Myroides
M. odoratimimus 2
M. phaeus 3 1
Myroides sp. 2
Oceanimonas Oceanimonas sp. 1 1
Ochrobactrum O. tritici 1
Ochrobactrum sp. 1
Paenibacillus P. lactis 1
Pantoea P. agglomerans 4
Pantoea sp. 1
Annexes
265
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
Planococcus P. maritimus 1
Proteus
P. cibarius 1
P. hauseri 1 2 2
P. terrae 5 2 3 3
P. vulgaris 11 4 25
Proteus sp. 13 2 15 1 3
Providencia
P. rettgeri 4 3
P. vermicola 2 1
Providencia sp. 2 4
Pseudochrobactrum P. asaccharolyticum 1 1
Pseudolalteromonas Pseudoalteromonas sp. 1
Pseudomonas
P. alcaliphila 1
P. brenneri 9 2
P. cichorii 1 4
P. fluorescens 6 1
P. fragi 2
P. frederikbergensis 1
P. helmanticensis 4
P. libanensis 1
P. marginalis 4
P. mendocina 1
P. mosselii 1
P. putida 1 4
P. stutzeri 3
P.tolaasii 2
P. trivialis 1
P. weihenstephanensis 2
Pseudomonas sp. 9 31 31 8
Psychrobacter
P. arenosus 1
P. celer 1 2
P. faecalis 1
P. maritimus 3
Psychrobacter sp. 3 3 7 1 2 1
Rahnella R. inusitata 1
Rahnella sp. 1
Rothia Rothia sp. 7
Salinicoccus Salinicoccus sp. 1
Savagea Savagea sp. 1
Serratia S. fonticola 2 5
S. glossinae 1
Annexes
266
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
S. marcesens 3
S.quinivorans 3
Serratia sp. 1 4 10
Shewanella
S. algae 2 5
S. haliotis 7 8
S. indica 1 1 6 3
S. putrefaciens 1
Shewanella sp. 2 8 1
Sphingobacterium S. mizutaii 1 1
Staphylococcus
S. aureus 7 1
S. cohnii 3 1
S. epidermidis 1 1 1
S. equorum 1 2 4
S. haemolyticus 1 1 1
S. hominis 1
S. lentus 1 13 2
S. pasteuri 1 1 2 4
S. saprophyticus 4 3 1
S. sciuri 1 1 2 4
S. stepanovicci
S. warneri 1 3
S. xylosus 2 2
Staphylococcus sp. 2 8 3 1 2
Stenotrophomonas
S. maltophilia 10
S. rhizophila 5 5
Stenotrophomonas sp. 1 2 4
Streptococcus S. parauberis 1 1
Streptococcus sp. 1 2 6
Vagococcus
V. carniphilus 4
V. fluvialis 9 10 39 8
V. lutrae 1 1
V. penaei 2 3
Vagococcus sp. 3 8 6 5 6
Vibrio
V. alginolyticus 1 1 5 1
V. casei 1
V. metschnikovii 1 23
V. mytili 1
V. natriegens 2
Vibrio sp. 2 6 28 1
Virgibacillus V. halodenitrificans 2
Annexes
267
Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement
Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)
Virgibacillus sp. 5
Yersinia Y. massiliensis 2
Yersinia sp. 1 1
Non identifiées 33 13 75 110 14 10 4
Total souche 425 135 459 512 251 83 17
Annexes
268
ANNEXE III : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Enterococcus spp.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine d’Enterococcus
0
2
4
6
8
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No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètre d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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No
mb
re d
e s
osu
hce
s
Diamètre d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
269
Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine d’Enterococcus
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No
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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No
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s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
270
Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT
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No
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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No
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ou
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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ou
che
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
271
Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT
Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine d’Enterococcus
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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ou
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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ou
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Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
272
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol d’Enterococcus
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le triméthoprime d’Enterococcus
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2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
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2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
273
Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides d’Enterococcus
0
5
10
15
20
25
30
35
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45
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. faecalis
E. durans
E. faecium
E. gallinarum
E. casseliflavius
E. aquamarinus
E. italicus
E. thailandicus
Enterococcus sp.
Annexes
274
ANNEXE IV : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Staphylococcus spp à
coagulase négatif
Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline de Staphylococcus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
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No
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ou
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Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. stepanovicii
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
275
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine de Staphylococcus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
0
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No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
0
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mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
276
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine de Staphylococcus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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ou
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s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
277
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
0
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No
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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ou
che
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Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
278
Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.
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No
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
279
Distribution des diamètres d’inhibition pour le triméthoprime de Staphylococcus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides de Staphylococcus.
0
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Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
S. warneri
S. epidermidis
S. pasteuri
S. xylosus
S. saprophyticus
S. lentus
S. sciuri
S. hominis
S. haemolyticus
Staphylococcus sp.
Annexes
280
ANNEXE V : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Exiguobacterium spp.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
4
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. acetylicum
E. marinum
E. profundum
E. aurantiacum
E. aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. acetylicum
E. marinum
E. profundum
E. aurantiacum
E. aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
281
Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.marinum
E.acetylicum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
282
Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
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16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
283
Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique d’Exiguobacterium.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
1
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3
4
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6
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
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16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
284
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
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16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E. acetylicum
E. marinum
E. profundum
E. aurantiacum
E. aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
285
Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
4
6
8
10
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14
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
E.acetylicum
E.marinum
E.profundum
E.aurantiacum
E.aestuarii
Exiguobacterium sp.
Annexes
286
ANNEXE VI : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Pseudomonas spp.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Pseudomonas.
0
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20
30
40
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
10
20
30
40
50
60
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
5
10
15
20
25
30
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
Annexes
287
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ceftazidime de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.
0
10
20
30
40
50
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
10
20
30
40
50
60
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
re d
e s
ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
2
4
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
Annexes
288
Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.
0
2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
2
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6
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18
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
s
Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
2
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
mb
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ou
che
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
Annexes
289
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.
0
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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ou
che
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
2
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6
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
Annexes
290
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Pseudomonas.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Pseudomonas.
0
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che
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
0
2
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6
8
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12
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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
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Diamètres d'inhibition (mm)
P. alcaliphila
P. putida
P. mosselii
P. cichorii
P. weihenstephanensis
P. marginalis
P. helmanticiensis
P. brenneri
P. libanensis
P. fragi
P. fluorescens
Pseudomonas sp.
Annexes
291
ANNEXE VII : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Vibrio spp
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Vibrio.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
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Diamètres d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
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Diamètres d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
292
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Vibrio.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Vibrio.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
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V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
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V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
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Diamètres d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
293
Distribution des diamètres d’inhibition pour le ceftazidime de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Vibrio.
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V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
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Diamètres d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
294
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Vibrio.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Vibrio.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
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V. alginolyticus
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V. alginolyticus
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V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
295
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT..
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
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V. alginolyticus
Vibrio sp
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Diamètres d'inhibition (mm)
V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
296
Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.
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V. metschnikovii
V. natriegens
V. alginolyticus
Vibrio sp
Annexes
297
ANNEXE VIII : Distribution des diamètres
d’inhibition pour Proteus spp.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Proteus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Proteus.
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Proteus sp.
Annexes
298
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Proteus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT La ligne rouge
représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le ceftazidime de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
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Diamètres d'inhibition (mm)
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Proteus sp.
Annexes
299
Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
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Annexes
300
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.
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Annexes
301
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénciol de Proteus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Proteus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Proteus. La ligne rouge représente le COWT
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Annexes
302
ANNEXE IX : Distribution des diamètres
d’inhibition de Vibrio parahaemolyticus
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Vibrio parahaemolyticus.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
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Diamètres d’inhibition (mm)
Annexes
303
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ceftazidime de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
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Diamètres d’inhibition (mm)
Annexes
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Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage
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Diamètres d’inhibition (mm)
Annexes
305
Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage.
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Annexes
306
Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.
Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage
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Diamètres d’inhibition (mm)
Annexes
307
ANNEXE X : Article “NDM-1 producing Vibrio
parahaemolyticus isolated from imported
seafood”
NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood
Arnaud BRIET 1 ; Nicolas HELSENS 1 1; Sabine DELANNOY 2 ; Sabine DEBUICHE 1 ; Anne
BRISABOIS 1 , Grazie l la MIDELET-BOURDIN1 , Sophie A. GRANIER 2 2
1 Anses, Laboratory for food safety, F -62200 Boulogne-sur-Mer, France
2 Université Paris-Est, Anses, Laboratory for food safety, F -94700 Maisons-
Alfort, France
Short running t it le: NDM-1 producing Vibr io parahaemolyticus
1 Present address : SECALIM, INRA, Oniris, Université Bretagne Loire, F-44307 Nantes, France 2Corresponding author: ANSES, 14 rue Pierre et Marie Curie, F-94701 Maisons-Alfort, France;
[email protected] , tel: +33 6 26 45 32 18
Annexes
308
Sir,
Vibrio parahaemolyt icus is a marine microorganism, frequent ly isolated from
seafood, at water temperatures above 15°C .(Su et L iu 2007a) It is also a foodborne
pathogen, often l inked to consumption of raw or uncooked seafood, mostly
encountered in patients in Asia or the USA.(Su et L iu 2007a) Ingestion of V.
parahaemolyt icus -contaminated seafood can lead to gastroenterit is. S ymptoms are
abdominal cramps, nausea, diarrhoea, fever, headache and chi l ls . (Su et L iu 2007a)
In most cases, V. parahaemolyt icus infect ions are seIf - l imit ing, but, in pat ients
with underlying diseases, V. parahaemolyticus can cause septicaemia. (Su et L iu
2007a) To treat severe or prolonged infections, antibiotics such as
f luoroquinolones, azithromycin or r i famixin can be prescribed. (Diemert 2006b)
Wild-type V. parahaemolyticus are characterized as being susceptible to al l
antibiotic c lasses, except penici l l ins . (Chiou et al . 2015)
V. parahaemolyticus strain 16-B3PA-006 was isolated in January 2016, from a
shelled shr imp tai l imported from Vietnam to France. Ant imicrobial susceptibi l ity
was tested by the disk di ffusion method (Bio-Rad, Marne-La-Coquette, France) ,
fol lowing the CLSI recommendations. (Cl inical and Laboratory Standards Inst itute
2015) Genomic characterizat ion of the isolate was performed by WGS on a NextSeq
(I l lumina, USA). The raw reads were trimmed (minimum length, 35 bp; quality
score, 0.03) and assembled in CLC Genomics Workbench 7.5.1 by, f irst, mapping
chromosome 1 and 2 from the V. parahaemolyticus reference genome (Vibrio
parahaemolyt icus RIMD 2210633), and then, de novo assembly of the remaining
paired-end reads. A total of 190 contigs were obtained including 60 contigs that
did not map the reference genome, indicating presence of acquired genetic
material . The CGE server (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ last access October
Annexes
309
30th, 2017) was used to ident ify acquired antimicrobial resistance genes
(Resfinder) , p lasmid presence (PlasmidFinder) and sequence type (MLST) .
Strain 16-B3PA-006 was ass igned to V. parahaemolyt icus ST-864. PlasmidFinder
ident if ied a unique IncA/ C2 plasmid. V. parahaemolyt icus strain 16-B3PA-006 was
phenotypically res istant to amoxici l l in -clavulanate, cefoxit in, cefotaxime,
ceftazidime, cefuroxime, cefepime and trimethoprim-sulfamethoxazole, but
remained susceptible to imipenem, tetracycline, c iprofloxacin and gentamicin .
Resfinder identif ied with 100% identity the resistance genes: blaN D M - 1 , sul1, sul2,
dfrA16, strA, strB, aadA2 . Moreover, f loR and tet(A) were detected with 98.19%
and 99.83% of identity, respectively. No resistance gene was neighbouring
bla N D M - 1 , only sul1 was on the opposite side of the cont ig, at a distance of 14kb. A
Blastn analysis of this contig with the NCBI nucleotide database ident if ied a part
of transposon Tn125 : Δ ISAba125, bla N D M - 1 , b le , trpF, tat, dct, groS, groL, IS91 , but
there was no evidence of plasmidic or chromosomal location. Despite the apparent
suscept ibi l ity to imipenem, the CIM test was posit ive, confirming carbapenemase
production by this strain .(van der Zwaluw et al. 2015) The carbapenemase
phenotype had been transferred by conjugation assays to E. col i UB5201 strain.
V. parahaemolyt icus 16-B3PA-006 was conf irmed to be mult idrug resistant, by both
genotype and phenotype, as being resistant to more than three antibiotic classes :
β- lactams, folate pathway inhibitors , phenicols, aminoglycosides and tetracycl ines .
The tn125 transposon, carried by strain 16-B3PA-006, has been partia l ly descr ibed
in a cl inical case of Vibr io f luvial is , but the transposon was not
complete.(Chowdhury et al . 2016)
Since its f i rst descr iption in 2009 in a pat ient returning from India, NDM-1 had
been descr ibed in a lmost al l parts of the world and is considered as one of the
Annexes
310
most cl inical ly signif icant carbapenemases. (Nordmann et Poire l 2014) In many of
the f i rst cases reported, patients were reporting recent inter -country travel
history, not only to the Indian subcontinent, but a lso to the Balkans states, the
Arabian Peninsula and North Africa; some of them having been repatr iated on
medical purposes. (Nordmann et Poire l 2014) NDM-1-producing Vibrio spp. have
been reported to a lesser extend in V. f luvial is and V . cholerae c l in ical or
environmental samples .(Walsh et al . 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015,
Chowdhury et al . 2016) This report is the f irst description of a V. parahaemolyt icus
strain producing NDM-1 isolated from a food item. Other carbapenemase-
producing bacteria isolated from foodstuff have already been reported: NDM -1-
producing Salmonella and Enterobacter cloacae from chicken and c lam; VIM-1-
producing Salmonella and E. col i f rom pork and Venus c lam.(Nicol et al. 2016,
Borowiak et al. 2017, Roschanski et al . 2017, Wang et al . 2017a) Food products
from Nicol et al . and Roschanski et al . reports were being imported. (Nicol et al .
2016, Roschanski et al . 2017)
Interest ingly, strain 16 -B3PA-006 was proved to both carry blaN D M - 1 gene and
display in v itro carbapenemase act ivity , nonetheless ant ibiogram categorized it as
cl in ical ly susceptible to imipenem according to the CLSI criteria. In vitro
suscept ibi l ity to any carbapenem had not been described previously in NDM -1
producing Vibr io spp. (Walsh et al. 2011, Darley et al . 2012, Diep et al . 2015,
Chowdhury et al. 2016) Cl inical microbio logists should be aware that NDM -1
carbapenemase activity in V. parahaemolyt icus might be challenging to evidence
through routine susceptibi l ity tests.
It is generally assumed that travel lers, colonized by carbapenamase -producing
bacteria, import it f rom endemic to non-endemic parts of the world .(van der Bij et
Annexes
311
Pitout 2012) However, imported food should also be taken into consideration as a
potentia l vector of dissemination of cl inical ly signif icant carbapenemases such as
NDM-1. The role of global food trade should certainly not be underestimated
anymore as an alternative route for carbapenemase disseminat ion.
Nucleotide sequence accession number
Strain 16-B3PA-006 sequence is available under GenBank Accession Number
PETB00000000.
Acknowledgment
Authors would l ike to thank Stéphanie Copin, Virginie Raguenet, Guylaine Leleu
and Régine Quenu for their assistance. Authors are especia l ly grateful to Didier
Mazel for his ass istance in the conjugaison assay and for providing rec ipient
strain. Authors would l ike to thank the iGenSeq core faci l ity (Brain & Spine
Inst itute, Hôpital Pit ié Salpêtrière , Par is, France) for excel lent sequencing
services.
Funding
This work was supported by a doctoral fe l lowship from Région Haut -de-France and
by the French national effort to reduce antimicrobial resistance in veterinary
medicine called “EcoAntibio2017” from the Ministry of Agriculture.
Transparency declarat ion
None to declare
Annexes
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References
1. Su Y-C, Liu C. Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety. Food Microbiol 2007; 24: 549-58. 2. Diemert DJ. Prevention and self-treatment of traveler's diarrhea. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 583-94. 3. Chiou J, Li R, Chen S. CARB-17 family of beta-lactamases mediates intrinsic resistance to penicillins in Vibrio parahaemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 3593-5. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial dilution and disk suseptibility testing for infrequently isolated or fastidious bacteria M45-3rd ed. CLSI, Wayne, PA, USA, 2015. 5. van der Zwaluw K, de Haan A, Pluister GN et al. The carbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for the carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in Gram-negative rods. PLOS ONE 2015; 10: e0123690. 6. Chowdhury G, Pazhani GP, Sarkar A et al. Carbapenem resistance in clonally distinct clinical strains of Vibrio fluvialis isolated from diarrheal samples. Emerg Infect Dis 2016; 22: 1754-61. 7. Nordmann P, Poirel L. The difficult-to-control spread of carbapenemase producers among Enterobacteriaceae worldwide. Clin Microbiol Infect 2014; 20: 821-30. 8. Darley E, Weeks J, Jones L et al. NDM-1 polymicrobial infections including Vibrio cholerae. Lancet 2012; 380: 1358. 9. Diep TT, Nguyen NT, Nguyen TN et al. Isolation of New Delhi metallo-beta-lactamase 1-producing Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strain carrying ctxA, st and hly genes in southern Vietnam. Microbiol Immunol 2015; 59: 262-7. 10. Walsh TR, Weeks J, Livermore DM et al. Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect Dis 2011; 11: 355-62. 11. Borowiak M, Szabo I, Baumann B et al. VIM-1-producing Salmonella Infantis isolated from swine and minced pork meat in Germany. J Antimicrob Chemother 2017; 72: 2131-3. 12. Nicol J, Sarah-Lynn M, Brent PA et al. Carbapenem-resistant Enterobacter spp. in retail seafood imported from Southeast Asia to Canada. Emerg Infect Dis 2016; 22: 1675. 13. Wang W, Baloch Z, Peng Z et al. Genomic characterization of a large plasmid containing a bla NDM-1 gene carried on Salmonella enterica serovar Indiana C629 isolate from China. BMC Infect Dis 2017; 17: 479. 14. Roschanski N, Guenther S, Vu TTT et al. VIM-1 carbapenemase-producing Escherichia coli isolated from retail seafood, Germany 2016. Eurosurveillance 2017; 22: 17-00032. 15. van der Bij AK, Pitout JDD. The role of international travel in the worldwide spread of multiresistant Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 2012; 67: 2090-100.
Résumé La résistance aux antibiotiques est un enjeu de santé publique mondiale. L’alimentation est une des voies de
contamination des bactéries résistantes aux antibiotiques entre l’environnement et l’Homme. Toutefois, les
données concernant les bactéries résistantes aux antibiotiques dans les produits aquatiques sont rares.
L’objectif de ces travaux a été d’étudier la flore bactérienne et sa résistance aux antibiotiques dans les produits
de la pêche et de l’aquaculture. Dans un premier temps, la flore bactérienne mésophile cultivable a été isolée
de 9 matrices différentes puis identifiée par la technique MALDI-TOF et/ ou du séquençage de différents gènes
de ménage. Au final, 1882 isolats bactériens ont été obtenus, et 150 espèces et 57 genres bactériens ont été
identifiés. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la résistance aux antibiotiques des genres bactériens
les plus fréquemment isolés de ces produits. La résistance aux antibiotiques des genres Enterococcus,
Staphylococcus, Exiguobacterium, Pseudomonas, Vibrio and Proteus a donc été étudiée. Au total, 46 % des
isolats étaient résistants aux antibiotiques et 3 % étaient multi-résistants. Les crevettes étaient le produit dans
lequel le plus de souches résistantes aux antibiotiques ont été identifiée. Et dans un troisième temps, la
résistance aux antibiotiques d’une collection de souches de Vibrio parahaemolyticus, espèce bactérienne
pathogène alimentaire pour l’homme, a été étudiée. Concernant V. parahaemolyticus, 15 % des souches
étaient résistantes et 3 % des souches étaient multi-résistantes. Une souche, 16-B3PA-006, isolées de crevettes
importées d’Asie du Sud-Est produisait une carbapénèmase NDM-1 et était résistante à 5 classes
d’antibiotiques.
Abstract Antimicrobial resistance is a threat to global public health. Human can be contaminated by antibiotic resistant
bacteria through food. However, data on antimicrobial resistant bacteria in seafood are scarce. The aim of this
thesis was to study seafood bacterial flora and its antimicrobial resistance. First, mesophilic flora was obtained
from 9 matrixes and MALDI-TOF and housekeeping genes sequencing technics were used to identify isolates.
Antimicrobial resistance of most frequently bacteria were tested. In total, 1882 isolates were obtained and 150
bacterial species and 57 genera were identified. Enterococcus, Staphylococcus, Exiguobacterium, Pseudomonas,
Vibrio and Proteus were most frequently isolated and their antimicrobial resistance was studied. Antibiotic
resistant bacteria accounted for 46 % of isolates and multidrug resistant bacteria accounted for 3 % of isolates.
Antimicrobial resistant bacteria were mostly isolated from shrimps. On a side study, antimicrobial resistance of
a V. parahaemolyticus strain collection isolated from seafood was characterized. Antimicrobial resistant strains
accounted for 15 % and multi-drug resistant bacteria accounted for 3 %. A NDM-1-producing multidrug
resistant strain, 16-B3PA-006 was identified from shrimps imported from South-East Asia.