Trusa SPOT-Light HER2 CISH -...

PI84-0150 Rev 0.0 Pagina 1 din 25

Trusa SPOT-Light® HER2 CISH

Cat. Nr. 84-0150

20 de teste utilizând lamele de 24 mm x 30 mm

Domeniul de utilizare

Pentru utilizarea la diagnosticul in vitro Trusa SPOT-Light® HER2 CISH se utilizează pentru a determina cantitativ amplificarea genelor HER2 în secţiunile de ţesut cu carcinom de sân fixate în formalină, încastrate în parafină (FFPE) utilizând hibridizarea cromogenică in situ (CISH) şi microscopia cu câmp luminos. Acest test trebuie să fie efectuat într-un laborator de histopatologie.

Trusa SPOT-Light® HER2 CISH este indicată ca ajutor în evaluarea pacienţilor pentru care se ia în considerare tratamentul cu Herceptin® (trastuzumab). Rezultatele analizei se intenţionează să fie folosite ca un auxiliar la informaţiile clinicopatologice care se folosesc în prezent ca parte a gestionării pacienţilor cu cancer la sân. Interpretarea rezultatelor testului trebuie să se facă în contextul antecedentelor clinice ale pacientului de către un patolog calificat. Sumar şi explicaţie Gena umană HER2, sau c-erbB-2, şi gena echivalentă a şobolanilor, neu, au fost identificate ca proto-oncogene(1-3) fiind omoloagă cu oncogena strâns înrudită v-erbB.(1) Gena HER2 este localizată pe cromozomul 17 (17q11.2-21) şi codifică o proteină de tip receptor de membrană, de 185 kDa. Proteina HER2 are o activitate tirozinkinazică şi este omologă cu, dar este distinctă de, receptorul factorului de creştere epidermică (cunoscut ca EGFr, HER1, sau c-erbB-1).(2)

Amplificarea genei HER2 sau supraexprimarea proteinei HER2 a fost identificată în 18–30% din cancerele la sân umane.(8-9) Identificarea stării de amplificare a genei HER2 este importantă pentru determinarea prognosticului pacienţilor diagnosticaţi cu cancer de sân invaziv, dar şi pentru selectarea pacienţilor eligibili pentru terapia cu trastuzumab (Herceptin®, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Elveţia şi Genentech, Inc., South San Francisco, CA).(4-6) Trastuzumab este un anticorp monoclonal specific pentru proteina HER2. S-a arătat că Trastuzumab este o terapie eficientă doar la pacienţii ale căror tumori prezintă o amplificare a genei HER2 şi/sau supraexprimarea proteinei HER2.(7,11) În cancerul de sân timpuriu, o cură scurtă de trastuzumab administrat concomitent cu docetaxel sau vinorelbine s-a arătat a fi eficientă la femeile cu cancer la sân care au o genă amplificată HER2/neu.(12) Alte studii au arătat, de asemenea, că starea HER2 a prezis sensibilitatea sau rezistenţa la anumite regimuri de chimioterapie.(13) De aceea, metodele exacte, consecvente şi directe pentru evaluarea stării genei HER2 şi a proteinei HER2 au devenit foarte importante.


Principiile procedurii Tehnica CISH utilizează sonde ADN etichetate cu digoxigenin care sunt specifice pentru locusul genei HER2 pe cromozomul 17q11.2-21 pentru a hibridiza la acizii nucleici complementari prezenţi în proba de cancer la sân. Sonda HER2 etichetată se fabrică folosind Subtraction Probe Technology (SPT™), o tehnologie proprietară şi patentată care creează anumite sonde reducând semnificativ secvenţele repetitive (de ex., elementele Alu şi LINE) găsite în acizii nucleici umani. S-a demonstrat prin PCR că sonda conţine gena HER2 şi se leagă în mod specific la locusul genei HER2 pe cromozomul 17q11.2-21 prin metafază FISH în limfocitele normale. În consecinţă, sondele SPT™ de la Invitrogen sunt inerent specifice şi nu necesită blocarea secvenţei repetitive, aşa cum este necesar la sondele ADN citogenetice tradiţionale. Tehnica CISH permite evaluarea aberaţiilor genetice la un microscop cu câmp luminos folosind detectarea cromogenică. Rezultatele coloraţiei CISH pot fi vizualizate clar cu un microscop cu câmp luminos standard şi o lentilă uscată 40X. Starea amplificării genei HER2 poate fi vizualizată în contextul morfologiei ţesutului înconjurător.

După deparafinare, probele sunt pretratate printr-o etapă de recuperare a căldurii urmată de digestia enzimatică. Probele sunt apoi deshidratate şi uscate cu aer înainte de adăugarea sondei HER2. În urma adăugării sondei şi lamelei la probă, combinaţia este denaturată şi hibridizată peste 10 ore sau peste noapte. Apoi, proba este spălată pentru a înlătura sonda nehibridizată iar semnalul este detectat cromogenic prin adăugarea secvenţială de anticopri la digoxigenin şi conjugat peroxidază de hrean-polimer (HRP). Culoarea este dezvoltată prin reacţia HRP legat cu cromogenul DAB şi substratul H2O2. În cele din urmă, proba este colorată pentru contrast cu hematoxilină Mayer pentru a identifica morfologia ţesutului şi acoperită cu o lamelă. Semnalul genei HER2 este identificat printr-un punct unic, maro închis când este prezent în copii scăzute, sau aglomerări maro când semnalul prezintă multe copii. Suprafeţele celulelor tumorale pot fi identificate cu uşurinţă sub obiectivul de putere scăzută al unui microscop cu câmp luminos iar copiile genei HER2 pot fi cuantificate folosind obiectivul 40X. Folosind un microscop cu câmp luminos cu un obiectiv 40X, celulele tumorale sunt localizate iar copiile genei HER2 sunt cuantificate. DAB formează un precipitat colorat, aşa că rezultatele pot fi arhivate şi revăzute mai târziu. Materialele furnizate Trusa SPOT-Light® HER2 CISH conţine toţi reactivii necesari pentru a efectua procedura CISH pe ţesuturi fixate în formalină, încastrate în parafină. Materialele prezentate mai jos sunt suficiente pentru un total de 20 de teste şi până la 2 rulări cu cele două lame de control, folosind probe de ţesut puse pe lamele de 24 mm x 30 mm. Dacă se folosesc lamele mai mici se pot efectua mai multe teste. Trusa SPOT-Light® HER2 CISH este livrată pe perne răcitoare. Pernele răcitoare trebuie să fie încă reci la primirea transportului pentru a asigura faptul că coletul nu a fost expus la temperaturi înalte. Totuşi, unele componente pot rămâne neîngheţate şi aceasta nu va afecta performanţa trusei. Vă rugăm să consultaţi Depozitarea reactivilor pentru depozitatea imediată la primirea acestor componente.

Reactiv A. Soluţie de pretratare la cald 1 L, conţinând tampon Tris-EDTA (Gata de folosire)

Reactiv B. Reactiv pretratare enzime 5 ml, conţinând soluţie de pepsină cu 0,05% azidă de sodiu şi detergent (Gata de folosire) PRECAUŢIE: Nociv

Reactiv C. Sondă HER2 Sondă SPOT-Light® HER2 0,4 ml etichetată cu digoxigenin în tampon de hibridizare conţinând formamidă (Gata de folosire) PRECAUŢIE: Nociv Reactiv D. Tampon SSC

500 ml, conţinând citrat de sodiu salin (SSC) (Gata de folosire)

Reactiv E1. Pudră PBS 3 pachete, fiecare fiind suficient pentru 1 L de PBS Reactiv E2. Tween 20 (50%) 2 ml, Tween 20 în soluţie 50%


Reactiv F. CAS-BlockTM 3 ml, conţinând tampon, stabilizator şi azidă de sodiu 0,1% (Gata de folosire) PRECAUŢIE: Nociv

Reactiv G. Anticorpi anti-digoxigenin de şoarece 3 ml, conţinând BSA, tampon şi azidă de sodiu 0,1% (Gata de folosire) PRECAUŢIE: Nociv

Reactiv H. Conjugat polimer HRP anti-şoarece de capră 3 ml, conţinând stabilizator, tampon, sulfat de gentamicină 0,005% şi Proclin 300 0,1%. (Gata de folosire)

Reactiv I1. Tampon substrat DAB (20x) 1 ml, concentrat conţinând tampon

Reactiv I2. Soluţie DAB, (20x) 1 ml, concentrat conţinând metanol 85% gr/vol PRECAUŢIE: Inflamabil şi toxic

Reactiv I3. Peroxid de hidrogen (20x) 1 ml, 0,6% H2O2

Reactiv J. Hematoxilină Mayer 100 ml (Gata de folosire)

Reactiv K. Soluţie de montare HistomountTM 4 ml (Gata de folosire) PRECAUŢIE: Foarte inflamabil şi nociv

Lamă control L. Lame celule control procedural 2 lame, fiecare cu 2 linii celulare fixate în formalină, încastrate în parafină (FFPE), plasate una lângă cealaltă: A) HER2 neamplificată (MCF-7), şi B) HER2 amplificată (SK-OV-3) [Linia celulară neamplificată cu rezultate numărabile este recomandată pentru controlul optim al analizei.]

REACTIVI/MATERIALE ŞI ECHIPAMENT NECESARE DAR NEFURNIZATE Reactivi/materiale auxiliare Cat. Invitrogen. nu

1. Lame SuperFrost Plus SAU Adeziv lamă HistogripTM 00-8050

2. Control pozitiv ţesut: carcinom de sân FFPE (ductal, tubular, lobular sau tip mixt) secţiune ţesut cu amplificare a genei HER2, anterior confirmată prin CISH sau FISH

3. Control negativ ţesut: carcinom de sân FFPE (ductal, tubular, lobular sau tip mixt) secţiune ţesut cu amplificare a genei HER2 anterior confirmată cu CISH sau FISH

4. Apă deionizată sau distilată (dH2O) 5. Xilen 6. Etanol 70%, 85%, 95% şi 100% (EtOH) 7. Lame, ciment cauciucat, ac 18G ½” şi seringă de 5 ml SAU 8. Benzi UnderCoverTM (18 x 18 mm) 00-8403 9. Benzi UnderCoverTM (22 x 22 mm) 00-8404 10. Peroxid de hidrogen 30% (H2O2) 11. Metanol 100%


Echipament 1. Cronometru 2. Pipetă (20 µl, 1000 µl) 3. Vârfuri de pipetă 4. Stativ lame 5. Placă fierbinte, folie de aluminiu şi pahar analitic de 1 L 6. Încălzitor de lame 7. Incubator 37°C 8. Ciclor termic PCR cu blocaj pentru lamele SAU

Bloc încălzire cu termometru digital şi incubator 37°C (± 1°C) şi cutie lamele umiditate 9. Baie de apă (capabilă să menţină o gamă a temperaturii de 70–80°C) cu termometru calibrat 10. Vase Coplin şi vase colorare 11. Microscop cu câmp luminos cu obiective de 20X şi 40X

Precauţii

• Pentru utilizarea la diagnosticul in vitro. • Pentru utilizatori profesionişti instruiţi. • Nu utilizaţi trusa după data expirării tipărită pe etichetă. • Dacă produsul este depozitat în alte condiţii decât cele specificate în prospect, atunci acele condiţii de

depozitare trebuie verificate de către utilizator. • Nu mâncaţi, beţi, fumaţi sau aplicaţi cosmetice când se manipulează materialele din trusă. Bunele practici

de laborator universale trebuie respectate. • Nicio metodă de testare disponibilă nu poate oferi o asigurare completă de eliminare a riscului potenţial de

pericol biologic. Manipulaţi toate materialele la un nivel de siguranţă biologică 2, aşa cum se recomandă pentru orice material uman cu potenţial infecţios din manualul Centrelor pentru controlul bolilor/Institutelor Naţionale de Sănătate. „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, ediţia a 4-a, Aprilie 1999.

• Nu pipetaţi reactivii cu gura şi evitaţi contactul pielii şi al membranelor mucoase cu probele şi reactivii. Dacă reactivii intră în contact cu pielea sau membranele mucoase, clătiţi suprafeţele afectate cu mari cantităţi de apă.

• Reactivii B, F, şi G conţin azidă de sodiu 0,1%, Reactivul H conţine sulfat de gentamicină 0,005% şi Proclin 0,1%, Reactivul I2 conţine metanol 85% gr/vol iar Reactivul I3 conţine peroxid de hidrogen 0,6%. La concentraţiile produsului, aceşti reactivi nu necesită etichetarea pentru pericol. Vă rugăm să consultaţi FTS specifice componentelor pentru mai multe informaţii.

• Reactivul B conţine pepsină, iar această enzimă poate cauza reacţii alergice în contact cu pielea. • Utilizaţi baie de apă cu temperatură calibrată, bloc de încălzire şi cuptor de hibridizare pentru rezultate

optime. • Unii dintre reactivii din această trusă conţin azidă de sodiu ca şi conservant. Azida de sodiu poate reacţiona

cu instalaţiile de plumb sau cupru pentru a forma azide metalice explozive, în special dacă se acumulează. Când evacuaţi reactivii conţinând azidă de sodiu, lăsaţi să curgă multă apă pentru a evita formarea de pericole chimice în instalaţii.

• Unii reactivi din această trusă conţin Proclin, azidă de sodiu sau peroxid de hidrogen. Aceşti reactivi sunt clasificaţi ca nocivi pentru că sunt iritanţi pentru piele şi membranele mucoase. Aceste substanţe sunt furnizate în formă diluată ca şi componente ale acestei truse, micşorând astfel semnificativ, dar nu complet, riscurile de expunere. Evitaţi contactul cu pielea, ochii şi hainele. Vă rugăm să consultaţi FTS specifice componentelor pentru mai multe informaţii

• 3,3’-tetraclorura de diaminobenzidină (DAB) poate fi nocivă dacă este înghiţită, inhalată sau absorbită prin piele şi poate fi iritantă pentru ochi, piele, membranele mucoase şi tractul respirator superior. DAB este suspectată a fi carcinogenă; consultaţi reglementările federale, statale şi/sau locale pentru recomandări privind eliminarea.

• Evitaţi evaporarea Reactivului I2. Metanolul se evaporă uşor. Luaţi măsuri pentru evitarea evaporării cum ar fi sigilarea containerului şi închiderea capacului imediat după utilizare. Evaporarea metanolului poate cauza precipitarea DAB, care poate afecta rezultatele colorării.

• Evitaţi evaporarea în timpul hibridizării asigurându-vă că lamelele sunt etanşate corespunzător şi că există umiditatea adecvată în camera de hibridizare.

• Pretratarea enzimelor poate varia în funcţie de fixare şi grosimea ţesutului. Pentru majoritatea secţiunilor de ţesut (4–5 µm) fixată cu formalină tamponată neutră 10%, intervalul de 5 minute de pretratare a enzimei este optim. Pentru ţesuturile cu fixare necunoscută trebuie efectuată o titrare a enzimei (de ex. 2 min., 5 min. şi 10 min.) cu timpul optim de digestie reglat pe baza rezultatelor iniţiale.


• Reactivul C – Sonda HER2 etichetată conţine formamidă, care este nocivă. R21 – Nociv în contact cu pielea R22 – Nociv în caz de înghiţire R61 – Poate provoca efecte nefaste asupra copilului în timpul sarcinii S24 – A se evita contactul cu pielea S36 – A se purta echipamentul de protecţie corespunzător S37 – A se purta mănuşi corespunzătoare S39 – A se purta masca de protecţie a ochilor/a feţei

• Reactivul I2 – soluţia DAB conţine metanol, care este inflamabil şi toxic. Vă rugăm să consultaţi FTS pentru mai multe informaţii. R10 – Inflamabil R23/24/25 – Toxic prin inhalare, în contact cu pielea sau prin înghiţire S45 – În caz de accident sau boală, a se consulta imediat medicul S36 – A se purta echipamentul de protecţie corespunzător S37 – A se purta mănuşi corespunzătoare

• Reactivul K – Soluţia de montare Histomount conţine toluen, care este foarte inflamabil şi nociv când este inhalat. Consultaţi FTS pentru mai multe informaţii. R11 – Foarte inflamabil R20 – Nociv prin inhalare S2 – A nu se lăsa la îndemâna copiilor S16 – A se păstra departe de orice flacără sau sursă de scântei – Fumatul interzis S25 – A se evita contactul cu ochii S29 – A nu se arunca la canalizare S33 – A se evita acumularea de sarcini electrostatice

• Toţi reactivii desemnaţi ca fiind gata pentru folosire au fost diluaţi în mod optim. O diluare mai mare a acestora ar putea afecta în mod advers rezultatele analizei.

• Timpii de incubare, reactivii şi temperaturile sunt optimizate. Utilizarea unor valori diferite ale timpilor de incubare, reactivilor sau temperaturilor ar putea afecta în mod advers rezultatele analizei.

• Nu se recomandă utilizarea unor fixativi de ţesut sau grosimi diferite, acestea putând afecta în mod advers rezultatele analizei.

• Consultaţi reglementările locale pentru eliminarea componentelor potenţial toxice. • Reduceţi la minimum contaminarea microbiană pentru a evita colorarea nespecifică. • Utilizaţi măsuri importante de precauţie când manipulaţi reactivii. Purtaţi mănuşi, halat şi ochelari de

protecţie de unică folosinţă când manipulaţi materiale suspecte ca fiind carcinogeni. Depozitarea reactivilor

• Trusa SPOT-Light® HER2 CISH trebuie depozitată la 2–8° C. • Depozitaţi Reactivul J la temperatura camerei (15–30°C).

Notă: Reactivul B poate fi afectat în mod advers dacă este expus la temperatură mare. Depozitaţi acest reactiv la 2–8°C imediat după utilizare. Nu depozitaţi acest reactiv la temperatura camerei.

• Depozitaţi tamponul PBS Tween 20 de lucru la temperatura camerei (15–30°C) pentru cel mult o săptămână.

Nu utilizaţi trusa după data expirării înscrisă pe etichetă. Dacă produsul este depozitat în alte condiţii decât cele specificate în prospect, atunci acele condiţii de depozitare trebuie verificate de către utilizator. Nu există semne vizibile care să indice instabilitatea acestui produs; prin urmare, este important să evaluaţi lamele de control. Vă rugăm să contactaţi Asistenţa tehnică dacă se suspectează vreo problemă cu această trusă.


Instrucţiuni de utilizare

A. Pregătirea probei Secţiunile de ţesut încastrate în parafină:

• Ţesuturile fixate în formalină tamponată neutră timp de 6–48 ore înainte de încastrarea în parafină sunt potrivite pentru utilizare.

• Alte fixative decât formalina tamponată neutră 10% nu au fost optimizate pentru acest protocol şi nu sunt potrivite pentru utilizare.

• Secţiunile de ţesut (4–5 µm grosime) trebuie să fie montate pe lamelele de microscop tratate cu HistoGrip™ sau Superfrost Plus. Ori de câte ori este posibil, utilizaţi secţiuni de ţesut de grosime standardizată pentru a asigura colorarea uniformă a detectării CISH şi colorarea de contrast a reactivilor.28

• Uscaţi cu aer lamelele, sau uscaţi-le la 37°C, şi apoi coaceţi-le timp de 2–4 ore la 60°C. • Ţesuturile corespunzător fixate şi încastrate vor dura pe timp nedefinit înainte de secţionare şi montarea

lamelelor dacă sunt depozitate într-un loc uscat şi răcoros (15–30°C).26,27 • Secţiunile de ţesut de 2–3 µm grosime pot da rezultate fals scăzute ale copiilor genelor.

B. Procedura CISH standard pentru secţiunile de ţesut FFPE Note procedurale

• Toţi reactivii cu excepţia Reactivului C (sonda HER2) trebuie echilibraţi la temperatura camerei (15–30°C) înainte de utilizare. Sonda HER2 se poate folosi rece fără a fi echilibrată la temperatura camerei. Fiecare incubare ar trebui efectuată la temperatura camerei (15–30°C), dacă nu se indică altfel.

• Pe parcursul întregii proceduri, dacă nu se indică altfel, este important ca secţiunea de ţesut să nu se usuce

între etape.

• Pe parcursul procedurii sunt necesare spălări multiple. Pentru fiecare spălare, trebuie folosită soluţie proaspătă.

• Lamele de control urmează să fie rulate împreună cu fiecare rulare a lamelor cu testele pacienţilor şi

trebuie tratate în aceeaşi manieră ca şi probele de test, în toate etapele.

• Dacă nu se indică altfel, toate etapele sunt efectuate la temperatura camerei (15–30°C).

• Această procedură necesită mai mult de opt ore pentru a se încheia: mai jos este evidenţiată o împărţire convenabilă, începând din Ziua 1 cu Deparafinizarea prin Denaturare şi Hibridizare (peste noapte), şi continuând în Ziua 2 cu Spălarea riguroasă până la microscopia în câmp luminos.

• Reactivii Invitrogen furnizaţi cu trusa sunt necesari pentru procedura CISH. Utilizarea altor reactivi poate

duce la un fond înalt sau la o scădere sau pierdere a semnalului CISH. Înlocuirea oricăruia dintre reactivii furnizaţi ca şi componente ale trusei poate anula rezultatele analizei.

Procedura Zilei 1 1. Pregătirea reactivilor

• Xilen (2 containere lame), 100% EtOH (3 containere lame) o Acoperiţi etanş şi depozitaţi până la o săptămână la temperatura camerei (15–30°C) sau până ce au fost

procesate 100 de lame.

• Seria alcool ethilic (EtOH) o Preparaţi containere separate de EtOH 70%, 85%, 95% şi 100%. o Acoperiţi etanş şi depozitaţi până la o săptămână la temperatura camerei (15–30°C) sau până ce au fost

procesate 100 de lame.


Etichetaţi fiecare reactiv de spălare în mod corespunzător şi notaţi ordinea de utilizare în procedură, menţinând acea ordine.

2. Deparafinizarea

Notă: Preparaţi reactivi suficienţi pentru fiecare container de lame necesar pentru numărul de lame din rulaj. Fiecare spălare necesită un volum separat de reactiv. Dacă etapa următoare nu poate începe imediat, uscaţi cu aer lamele după ce le-aţi umezit în EtOH 100% de trei ori, în loc să spălaţi lamele în dH2O de trei ori.

a) Cufundaţi în xilen de 2 ori, 5 min. fiecare b) Umeziţi în EtOH 100% de 3 ori, 3 min. fiecare c) Spălaţi în dH2O de 3 ori, 2 min. fiecare

Deparafinizarea completă este necesară pentru rezultate optime şi reproductibile.

3. Pretratarea la cald

Notă: Lamele trebuie să fie fierte sau încălzite la o temperatură ≥ 98°C timp de 15 min. în soluţie de pretratare la cald (Reactiv A). Lamele nu trebuie supraîncălzite, asigurându-vă că temperatura rămâne în intervalul 98°C - 100°C. Recomandăm să se folosească placa caldă pentru această etapă. (Pentru protocoalele care utilizează un aparat de gătit cu presiune cu un indicator de presiune şi temperatură sau un cuptor cu microunde cu indicator de temperatură, vă rugăm să contactaţi Asistenţa tehnică a Invitrogen la adresa [email protected]). Soluţia de pretratare la cald (Reactivul A) se poate folosi de până la două ori înainte de a fi aruncată.

a) Puneţi lamele în stativul pentru lame. b) Încălziţi soluţia de pretratare la cald (Reactivul A) într-un pahar gradat pe o placă caldă până ce fierbe

constant iar temperatura este ≥ 98°C. Pentru a preveni evaporarea tamponului, paharul gradat trebuie acoperit fie cu un capac de sticlă fie cu folie de aluminiu.

c) Puneţi lamele în soluţia care fierbe, acoperiţi paharul gradat, începeţi cronometrarea când temperatura ajunge la 98°C sau când bulele de fierbere apar din nou şi fierbeţi timp de 15 min. Asiguraţi-vă că temperatura rămâne în intervalul 98°C–100°C.

d) Transferaţi lamele imediat în dH2O la temperatura camerei (15–30°C). e) Spălaţi-le de trei ori în dH2O, 2 min. fiecare.

4. Digestia enzimatică

Notă: Pentru majoritatea ţesuturilor de sân, 5 min. digestia enzimatică la temperatura camerei (15–30°C) va produce rezultate CISH optime. Timpul de digestie trebuie reglat pe baza rezultatelor iniţiale cu 5 min. timp de digestie. Poate fi necesar un timp diferit de incubare a enzimelor, în funcţie de grosimea ţesutului şi metoda de fixare. Un studiu de digestie enzimatică a indicat că timpul de digestie enzimatică poate fi cuprins între 2 şi 20 min. şi va produce un semnal CISH potrivit pentru evaluarea HER2 într-un set de eşantioane de ţesut de sân arhivate. Într-un studiu de concordanţă pentru a sprijini utilizarea CISH vs. FISH, care a utilizat probe de ţesut cu cancer la sân care au fost procesate în termen de 12 luni de la data studiului, timpul de digestie enzimatică de 5 min. a produs semnale CISH optime pentru evaluarea genei HER2.(28)

a) Echilibraţi Reactivul de pretratare enzimatică (Reactivul B) la temperatura camerei (15–30°C). b) Adăugaţi destul Reactiv B pentru a acoperi secţiunea de ţesut şi incubaţi timp de 5 min. la temperatura

camerei (15–30°C). c) Spălaţi în dHO de 3 ori, 2 min. fiecare.

5. Deshidratarea în seria gradată de etanol:

a) 70% EtOH 2 min. b) 85% EtOH 2 min. c) 95% EtOH 2 min. d) 100% EtOH 2 min. e) 100% EtOH 2 min.

6. Uscaţi lamele cu aer ≥ 20 min sau până se usucă. Etichetaţi lamele cu creionul, dacă este necesar.

7. Denaturarea şi hibridizarea

Notă: Utilizaţi un ciclor termic PCR cu blocaj pentru lame sau un bloc de încălzire cu afişaj digital al temperaturii şi cameră de umezire a lamelor cu incubator la 37°C, sau instrumentar similar. Asiguraţi-vă că umiditatea camerelor este menţinută în mod adecvat. Hibridizarea efectuată pe perioade de timp mai scurte


poate duce la un semnal mai slab. Denaturarea sondei la o temperatură mai scăzută decât cea recomandată de protocol poate duce la un semnal CISH slab sau absent. Schimbarea timpilor de incubaţie poate duce fie la semnal slab, fie la colorarea fondului.

a) Adăugaţi 15 µl de sondă HER2 (Reactiv C) pe centrul lamei de 22 x 22 mm. În funcţie de mărimea

ţesutului, ar putea fi necesar un volum mai mare sau mai mic de sondă. Utilizaţi următorul volum de sondă, în funcţie de mărimea lamei: • 18 mm x 18 mm 10 µl • 22 mm x 22 mm 15 µl • 24 mm x 30 mm 20 µl

b) Puneţi lama, cu faţa cu sonda în jos, pe zona corespunzătoare a eşantionului de ţesut de pe lamă. Se pot

folosi lamele CISH UnderCover™ de la Invitrogen în locul unei lame standard. Când utilizaţi lamele CISH UnderCover™, decolaţi hârtia de pe spate şi puneţi partea cu lama de acoperire expusă (de unde tocmai aţi scos hârtia) pe zona corespunzătoare a lamei pentru a acoperi eşantionul de ţesut. Marginile benzii trebuie apăsate pentru a etanşa lama de acoperire şi a împiedica evaporarea. NU APĂSAŢI CENTRUL LAMEI DE ACOPERIRE.

c) Când utilizaţi o lamă de acoperire standard, lama de acoperire trebuie etanşată pentru a împiedica evaporarea în timpul incubării. Etanşarea se poate realiza folosind o seringă de 5 ml şi un ac de 18G ½”. Umpleţi seringa cu ciment cauciucat şi aplicaţi un strat subţire pe marginile lamei de acoperire, suprapunând uşor pe lamă.

d) Lăsaţi cimentul cauciucat să se usuce (~10 min.) pentru a împiedica lama de acoperire să alunece de pe lamă.

e) Denaturarea şi hibridizarea se pot realiza folosind un ciclor termic PCR cu blocaj pentru lame sau un bloc de încălzire cu afişaj digital al temperaturii împreună cu o cutie de umidificare a lamelor şi un incubator la 37°C.

1) Dacă folosiţi un ciclor termic PCR cu blocaj pentru lame: Denaturaţi la 95ºC (± 1ºC) timp de 5 min., urmat de incubarea peste noapte (10–18 ore) la 37ºC (± 1ºC).

2) Dacă folosiţi un bloc de încălzire şi cameră de umidificare cu incubator la 37°C: Denaturaţi la 95ºC (± 1°C) timp de 5 min., urmat de incubarea peste noapte (10–18 ore) la 37ºC (± 1°C) într-o cameră de umidificare.

Procedura Zilei 2 8. Pregătirea reactivilor

• PBS (tampon fosfat salin) o Adăugaţi 1 pachet de pudră PBS (Reactiv E1) la 1 L de dH2O. Amestecaţi.

• PBS/tampon Tween 20 (0,01% Tween) o Adăugaţi 10 picături de Tween 20 50% (Reactiv E2) la 1 L de PBS (de mai sus). Amestecaţi. o Depozitaţi la temperatura camerei timp de cel mult o săptămână.

• Soluţia substrat-cromogen (DAB) o Preparaţi această soluţie imediat înainte de utilizare. o Adăugaţi 1 picătură din fiecare reactiv (I1, I2, I3) la 1 mL dH2O. Amestecaţi bine.

• 3% H2O2 în metanol absolut o Adăugaţi 1 parte de H2O2 30% la 9 părţi de metanol. o Acoperiţi etanş şi depozitaţi timp de cel mult o săptămână la temperatura camerei (15–30ºC) sau până

ce au fost procesate 100 de lame. • Xilen (2 grătare de lame)

o Acoperiţi etanş şi depozitaţi timp de cel mult o săptămână la temperatura camerei (15–30ºC) sau până ce au fost procesate 100 de lame.

9. Spălarea riguroasă

Notă: Utilizând temperaturi mai mari decât cele recomandate de procedură se poate produce o scădere sau pierderea completă a semnalului CISH. Spălările la temperatură prea scăzută pot duce la un fond înalt. Trebuie folosit un termometru calibrat pentru a vă asigura că temperatura exactă a băii de apă a fost atinsă şi menţinută.

a) Porniţi baia de apă de 70ºC (±1°C) şi aduceţi-o la temperatură. b) Preparaţi două vase Coplin care conţin tampon SSC (Reactiv D), unul la temperatura camerei, celălalt

încălzit la 70°C.


c) Decolaţi cimentul cauciucat sau lama UnderCover™. Nu lăsaţi secţiunea de ţesut să se usuce. d) Pentru a scoate lama de acoperire fără a rupe ţesutul: Pre-umeziţi lamele în SSC la temperatura camerei

timp de ~2–3 min., până ce lama de acoperire alunecă uşor. Apoi treceţi la următoarea etapă. e) Clătiţi scurt lamele în vasul care conţine SSC la temperatura camerei (15–30°C), apoi cufundaţi lamele

timp de 5 min. în vasul Coplin care conţine SSC în baia de apă la 70ºC (±1°C). f) Spălaţi lamele în dH2O de 3 ori, 2 min. fiecare.

10. Imunodetecţia

a) Cufundaţi lamele în H2O2 3% în metanol 100%, 10 min. b) Spălaţi-le în PBS/Tween 20 (0,01%) de 3 ori, 2 min. fiecare. c) Adăugaţi CAS-BlockTM (Reactiv F): 2–3 picături/lamă sau destul pentru a acoperi ţesutul şi incubaţi timp

de 10 min. la temperatura camerei (15–30°C). d) Ştergeţi Reactivul F cu o ţesătură de laborator. Nu clătiţi. e) Adăugaţi anticorp anti-digoxigenin de şoarece (Reactiv G): 2–3 picături/lamă sau destul pentru a acoperi

ţesutul şi incubaţi timp de 30 min. la temperatura camerei(15–30°C). f) Spălaţi-le în PBS/Tween 20 (0,01%) de 3 ori, 2 min. fiecare. g) Adăugaţi conjugat polimer HRP anti-şoarece de capră (Reactiv H): 2–3 picături/lamă sau destul pentru a

acoperi ţesutul şi incubaţi 30 min. la temperatura camerei (15–30°C) într-o cameră de umidificare. h) Spălaţi-le în PBS/Tween 20 (0,01%) de 3 ori, 2 min. fiecare. i) În timpul spălării, preparaţi soluţia substrat-cromogen DAB: adăugaţi o picătură din fiecare reactiv

(Reactivii I1, I2, I3) la 1 ml de dH2O. j) Adăugaţi soluţie substrat-cromogen (DAB): 2–3 picături/lamă sau destul pentru a acoperi ţesutul şi incubaţi

timp de 30 min. la temperatura camerei (15–30°C) într-o cameră de umidificare. k) Puneţi lamele în stativul pentru lame. l) Spălaţi cu apă curgătoare de la robinet timp de 2 min.

11. Colorarea de contrast şi montarea

Notă: Coloraţi scurt pentru contrast timp de 3–5 sec. şi examinaţi ţesutul la microscop fără lama de acoperire. Coloraţi pentru contrast timp de încă 3–5 sec. dacă doriţi o colorare nucleară mai puternică. Timpul colorării de contrast depinde de ţesuturile folosite. Nu se recomandă o colorare întunecată de contrast pentru că ar putea acoperi semnalele pozitive apărute la colorare.

a) Coloraţi pentru contrast ţesutul cu hematoxilină (Reactiv J): 3–5 sec. b) Spălaţi cu apă curgătoare de la robinet timp de 2 min. c) Deshidrataţi în seria EtOH graduală timp de 2 min. în fiecare grad. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%, păstrate

din Ziua 1 şi folosite în aceeaşi ordine.) d) Cufundaţi în xilen: de 2 ori, 2 min. fiecare. Acest xilen de spălare trebuie să fie diferit de cel folosit în Ziua

1. El poate fi refolosit în această etapă timp de o săptămână sau până la 100 de lame. e) Acoperiţi cu lamă folosind soluţia de montare Histomount™ (Reactiv K). f) Depozitaţi lamele la temperatura camerei (15–30°C) pentru analiza ulterioară a rezultatelor.

Limitările procedurii • Trusa SPOT-Light® HER2 CISH poate să nu detecteze cele 5% raportate(10) de cazuri de cancer la sân care

sunt pozitive la imunohistochimie (IHC) dar negative la amplificarea genei HER2. • CISH este o procedură cu mai multe etape care necesită instruire specializată în folosirea reactivilor

potriviţi, selectarea ţesutului, fixare, procesare, pregătirea lamei CISH şi interpretarea rezultatelor colorării. • Colorarea ţesutului depinde de manipularea şi procesarea eşantionului de ţesut anterioare colorării.

Colorarea de contrast excesivă sau incompletă poate compromite interpretarea corespunzătoare a rezultatelor.

• Orice deviere de la procedura de test recomandată poate invalida rezultatele aşteptate declarate; trebuie să se folosească şi să se documenteze controalele potrivite. Utilizatorii care se abat de la procedura de test recomandată trebuie să accepte responsabilitatea pentru interpretarea rezultatelor probelor în aceste circumstanţe.

• Trusa SPOT-Light® HER2 CISH a fost optimizată doar pentru identificarea şi cuantificarea genei HER2/neu în nuclei interfază din probele de ţesut cu cancer de sân fixate în formalină şi încastrate în parafină. Alte tipuri de probe sau fixative nu au fost validate.

• Interpretarea clinică a oricăror rezultate ale testului trebuie evaluată în contextul antecedentelor medicale ale pacientului şi al altor rezultate ale testelor de laborator cu rol diagnostic.


Controlul calităţii Controale pozitive şi negative pe o singură lamă

• Semnalul CISH trebuie să fie maro, distinct şi uşor de evaluat. • Lamele de control incluse (Lama L) conţin două secţiuni de 4 µm tăiate din blocurile de celule FFPE

pregătite din două linii de celule diferite. Aceste lame trebuie folosite ca şi controale procedurale. Linia de celule A (MCF-7) este neamplificată şi va avea ≤ 5 semnale sau puncte per nucleu. Linia de celule B (SK-OV-3) este amplificată şi va apărea ca aglomerări DAB de dimensiuni mici până la mari în nucleu.

• Lama cu liniile de celule de control urmează să fie rulată împreună cu fiecare rulare a lamelor de test provenite de la pacienţi şi trebuie tratate în acelaşi mod ca şi secţiunile de ţesut.

• Dacă lama de control (Lama L) este negativă atât pentru linia de celule A cât şi pentru cea B, aceasta este o indicaţie că a survenit o eroare în timpul procedurii CISH.

• Linia de celule de control pozitivă (B), cunoscută a demonstra amplificarea HER2, trebuie examinată mai întâi pentru a stabili că toţi reactivii funcţionează corespunzător. Prezenţa aglomerărilor de gene, sau >5 semnale sau puncte individuale, în nucleul unei singure celule indică reactivitatea pozitivă aşteptată. Dacă controlul pozitiv nu demonstrează prezenţa aglomerărilor sau >5 semnale per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase, rezultatele obţinute pentru probele pacientului trebuie considerate invalide.

• Linia de celule de control negativă sau normală (A), cunoscută a demonstra neamplificarea HER2, trebuie să conţină ≤ 5 puncte în nucleul fiecărei celule.

• Dacă survine o colorare nespecifică în nucleele controlului normal (A), rezultatele obţinute pentru probele pacientului trebuie considerate invalide.

• Dacă survine o colorare nespecifică, ea expune de obicei o aparenţă de colorare difuză. Ocazional, se poate observa o colorare sporadică maro în afara nucleilor, în secţiunile de ţesut care au fost fixate excesiv cu formalină. Rezultatele în aceste cazuri trebuie interpretate cu grijă. Colorarea nespecifică nu trebuie confundată cu semnalele CISH pozitive.

• Un control de ţesut pozitiv constând dintr-un ţesut de cancer la sân cunoscut a demonstra amplificarea HER2, dacă este folosit, trebuie să arate prezenţa aglomerărilor de gene sau >5 semnale sau puncte individuale per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase, indicând reactivitatea pozitivă aşteptată. Dacă controlul pozitiv nu demonstrează prezenţa aglomerărilor sau >5 semnale per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase, rezultatele obţinute pentru probele pacientului trebuie considerate invalide.

• Un control tisular negativ constând dintr-un ţesut de cancer la sân cunoscut a demonstra neamplificarea HER2, dacă este folosit, trebuie să conţină <5 semnale per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase.

• În general, prezenţa a nu mai mult de două semnale sau puncte în nucleii din ţesutul normal (celule epiteliale normale sau celule stromale din tumoră) duplicate ale controlului tisular pozitiv confirmă faptul că reactivii sondă şi de imunodetecţie nu reacţionează încrucişat cu componentele celulare sau tisulare. Dacă survine o colorare nespecifică în nucleii duplicatului de ţesut normal al controlului tisular pozitiv, rezultatele obţinute pentru probele pacientului trebuie considerate invalide.

• Variaţiile în procesarea ţesutului şi procedurile tehnice din laboratorul utilizatorului trebuie să fie validate pentru că ele pot produce o variabilitate semnificativă a rezultatelor, necesitând efectuarea regulată a controalelor interne în plus faţă de procedurile menţionate mai jos.

Interpretarea Evaluarea adecvării lamelor Punctele (semnalele) HER2 CISH trebuie să fie mici dar uşor de decelat folosind un obiectiv 20X–40X. Punctele vor apărea maro pe coloraţia de contrast. Dacă nu există puncte apărute pe eşantion, atunci analiza trebuie repetată. Vă rugăm să sunaţi la Asistenţa tehnică a Invitrogen la 1-800-955-6288 (doar pentru S.U.A.) pentru a discuta posibilele cauze ale problemei.

Lama de control L. A B

Imaginea 1. Lama de control L conţine linia de celule neamplificate A (MCF-7) şi linia de celule amplificate B (SK-OV-3). Notă: liniile de celule nu sunt desenate la scară şi sunt mai mici decât sunt indicate în diagramă.


Apariţia semnalelor CISH – consultaţi Anexa A, „Ghidul de interpretare a testului HER2 CISH” Punctele HER2 CISH vor apărea ca:

• Un punct unic (Figura G). Un punct unic are o margine netedă, rotundă în celulele normale sau carcinomatoase. Un punct unic reprezintă o singură copie a genei HER2.

• Un dublet (Figura H). Punctele apar ca „perechi” şi nu reprezintă o adevărată aglomerare mică. Dacă două semnale sunt separate printro distanţă mai mică decât diametrul unui semnal, aceste semnale trebuie numărate ca un punct unic. Dubletul este rezultatul divizării cromozomilor, cu fiecare semnal aflat pe perechea cromatidelor surori.29

• O aglomerare mică (Figura E). O aglomerare mică este un grup de semnale cu formă neregulată care are de 3–5 ori diametrul unui punct unic. Un punct unic din celulele carcinomatoase sau epiteliale normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă.

• O aglomerare mare (Figura A). O aglomerare mare este un grup de semnale cu formă neregulată care este de 5 ori mai mare decât diametrul unui punct unic. Un punct unic din celulele carcinomatoase sau epiteliale normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă.

Selectarea câmpurilor-ţintă pentru numărarea semnalelor HER2 CISH:

• Utilizând obiectivele 4X–20X, scanaţi proba colorată CISH pentru a identifica cele mai reprezentative zone din punct de vedere histopatologic ale carcinomului invaziv. Evitaţi zonele de necroză, suprapunerea semnalelor din cauza nucleilor care se suprapun şi nucleii cu intensitate slabă a semnalului. Evitaţi componentele carcinomului intraductal (DCIS) din carcinoamele invazive. Evaluaţi posibila heterogenitate intratumorală a stării genei HER2 înainte de numărarea CISH.

• Dacă eşantionul este omogen, selectaţi o zonă de ţesut cu semnale CISH puternice pentru numărarea semnalelor. Procedaţi la numărarea semnalelor.

• Dacă eşantionul prezintă heterogenitate intratumorală a stării genei HER2 în componenta de carcinom invaziv, selectaţi zonele care reprezintă fiecare stare a genei HER2 pentru numărarea semnalelor. Un eşantion de ţesut este heterogen dacă starea genei HER2 (celule amplificate şi neamplificate) variază în zone diferite ale aceleiaşi secţiuni a unui cancer de sân primar. Trebuie să fie evaluate celule din fiecare zonă de heterogenitate pentru a determina care stare HER2 (amplificată sau neamplificată) predomină în peste 50% din secţiunea tumorală. Procedaţi la numărarea semnalelor din zona unde starea HER2 este predominantă pentru această tumoră.

Numărarea semnalelor

• Folosiţi un obiectiv 40X. Se poate folosi un obiectiv mai mare dacă este necesar, dar imersia în ulei nu este necesară.

• Consultaţi Anexa A, „Ghidul de interpretare a testului HER2 CISH”. • O genă HER2 individuală apare ca un punct unic mic, rotund (Figura G). • Nu număraţi nucleii care se suprapun sau toate zonele în care nucleii nu sunt vizibili. Număraţi doar

semnalul CISH care este înăuntrul unui nucleu. Excludeţi semnalele sporadice ocazionale, care pot fi cauzate de resturi ale vărsării HER2 ADN provenite din manevrarea celulelor canceroase, din afara nucleilor.

Neamplificarea

o Definită ca 1–5 puncte unice în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată.

o Nu este necesar să număraţi punctele din 30 de celule. Opţional: folosiţi fişa de lucru din Anexa B, „Fişa de punctaj HER2 CISH” pentru numărarea celulelor. Raportaţi rezultatele ca media numărătorii totale a celor 30 de celule pentru a obţine un diagnostic clar al neamplificării.

Amplificarea

o Definită ca: o >5 puncte în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată sau o Aglomerări mari în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată

sau

Amplificarea semnalului CISH 10X Punctele unice sunt abia vizibile şi uşor de trecut cu vederea. 20X Punctele unice sunt mici dar se pot decela clar. 40X Punctele unice sunt uşor identificate.

60X sau 100X Nu este necesar.


o Un amestec de puncte multiple şi aglomerări mari în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată sau

o Un amestec de puncte multiple şi aglomerări mici în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată sau

o Aglomerări mici în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din zona tisulară selectată. o Pentru oricare dintre cazurile de mai sus, nu este necesar să număraţi punctele din 30 de celule.

Opţional: folosiţi fişa de lucru din Anexa B, „Fişa de punctaj HER2 CISH” pentru numărarea celulelor. Raportaţi rezultatele ca media numărătorii totale a celor 30 de celule pentru a obţine un diagnostic clar al amplificării. Pentru uşurinţa numărării, număraţi o aglomerare mică ca 5 puncte şi o aglomerare mare ca 10 puncte.

o Argumentaţie: Atribuirea unor numere de puncte specifice aglomerărilor mici sau mari este arbitrară, în scopuri de cuantificare. În mod normal celulele au două copii ale genei HER2. Celulele care şi-au replicat ADN dar încă nu s-au divizat au 4 copii ale genei. Prin urmare, o aglomerare mică este o indicaţie de amplificare şi va avea un număr minim de 5 copii ale genei. O aglomerare mare, cu mărimea cel puţin dublă faţă de o aglomerare mică, va avea un număr minim de 10 copii ale genei.

• Cazuri neclare de amplificare sau neamplificare

Interpretaţi cu grijă probele care nu aparţin clar categoriilor de amplificare sau neamplificare. Aceste probe expun 4–6 puncte în majoritatea (>50%) celulelor carcinomatoase din câmpul-ţintă selectat. Când numărul mediu de puncte este între 4 şi 6 după ce au fost numărate 30 de celule carcinomatoase, trebuie numărate alte 30 de celule pentru a obţine un total de 60 de celule. Dacă aveţi încă dubii, analiza trebuie repetată pe o lamă cu o probă proaspătă. Raportaţi rezultatele folosind fişa de lucru din Anexa B, „Fişa de punctaj HER2 CISH.” 1. Număraţi punctele din 30 de celule tumorale din zona tisulară selectată. Consultaţi #4 de mai jos

dacă aglomerările mici sunt evidente. 2. Totalizaţi numărul de puncte din cele 30 de celule şi calculaţi media. 3. Înregistraţi rezultatul pe baza mediei a 60 de celule 4. Dacă se observă un amestec de puncte unice şi aglomerări mici (din cauza aglomerării a mai

multor puncte unice) sau se observă doar aglomerări mici: • Număraţi o aglomerare mică ca 5 puncte. • Un punct unic din celule carcinomatoase sau celulele epiteliale normale de pe aceeaşi lamă

poate fi folosit ca referinţă pentru determinarea a ceea ce reprezintă o aglomerare mică. 5. Raportaţi rezultatele ca media totalului numărării celor 60 de celule pentru a obţine un diagnostic

fie al amplificării, fie al neamplificării, conform Ghidului Invitrogen.

• Raportarea rezultatelor Rezultatele pot fi raportate folosind fişa de lucru din Anexa B, „Fişa de punctaj HER2 CISH”. Raportul stării HER2 trebuie să fie înregistrat conform Ghidului Invitrogen, în special pentru cazurile neclare de amplificare sau neamplificare.


Sumarul interpretării Amplificarea >5 puncte, sau aglomerări mari, sau amestec de puncte multiple şi aglomerări mari, sau

amestec de puncte multiple şi aglomerări mici, sau aglomerări mici ale genei HER2 prezente per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase în zona de ţesut selectată pentru numărare. Vezi Figurile A, B, C, D şi E din Anexa A, „Ghidul de interpretare a testului HER2 CISH”. O aglomerare mare este un grup de semnale cu formă neregulată care este de 5 ori mai mare decât diametrul unui punct unic. Un punct unic din celulele carcinomatoase sau epiteliale normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă. Vezi Anexa A, Figura A. O aglomerare mică este un grup de semnale cu formă neregulată care are de 3–5 ori diametrul unui punct unic. Un punct unic din celulele carcinomatoase sau epiteliale normale de pe aceeaşi lamă poate fi folosit ca referinţă. Vezi Anexa A, Figura E.

Neamplificarea 1–5 puncte ale genei HER2 prezente per nucleu într-o majoritate (>50%) de celule carcinomatoase în zona de ţesut selectată pentru numărare. Vezi Anexa A, Figura F, Figura G şi Figura H.

Un punct unic are o margine netedă, rotundă şi este prezent în celulele normale şi cele carcinomatoase.


Valori aşteptate Prevalenţa genei amplificate HER2 în populaţia generală de femei cu cancer de sân este de 18–30%.(8, 9) La compararea amplificării genei HER2 cu supraexprimarea proteinei HER2, studiile au arătat că până la 5% din pacienţii cu cancer la sân sunt pozitivi pentru supraexprimarea proteinei când au fost testaţi prin imunohistochimie (IHC) dar negativi pentru amplificarea genei HER2.(10) Caracteristici specifice de performanţă Performanţa clinică Siguranţa şi eficacitatea Trusei SPOT-Light® HER2 CISH au fost evaluate într-un studiu comparativ care a utilizat trei teste: Trusa SPOT-Light® HER2 CISH, PathVysion® FISH şi HercepTest™. Studiul a implicat două seturi de cazuri: 226 de cazuri consecutive şi 60 de cazuri suplimentare. Cazurile consecutive au fost selectate dintre cazurile consecutive de cancer invaziv la sân, examinate cu ocazia vizitelor de îngrijire a pacienţilor, la două centre de studiu (centrele A şi B). Cazurile suplimentare au fost cazuri care au fost punctate 2+ prin imunohistochimie (IHC) (folosind anticorpi AB8) în timpul îngrijirii pacienţilor la centrul A. A. Cazurile consecutive

Următorul tabel însumează distribuţia rezultatelor CISH şi FISH în legătură cu punctajele HercepTest™. Un test a fost considerat valabil atunci când lamela colorată care a rezultat a fost acceptabilă pentru evaluare.

Tabelul 1: Rezultatele IHC, FISH şi CISH

Exprimarea proteinelor, Punctajul HercepTest™ 0 1 2 3 Total

Cazuri IHC (N) 141 19 21 40 221 (%)1 63,8% 8,6% 9,5% 18,1% 100% Proporţia genelor cu starea FISH HER2 Numărul cazurilor FISH valabile2 140 19 21 38 218 n amplificat (%)3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 n neamplificat (%)3 139 (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Copii ale genelor cu starea CISH HER2 Numărul cazurilor CISH valabile2 132 17 19 38 206 n amplificat (%)3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 n neamplificat (%)3 131 (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) 170 1 % = N ÷ N total × 100% 2 Numărul cazurilor FISH (sau CISH) valabile cu scorul IHC corespunzător. 3 % = n ÷ Numărul total de cazuri FISH (sau CISH) valabile × 100%

Tabelul 2: Acordul între CISH şi IHC

Rezultate CISH Rezultate IHC

Pozitiv (3+) Negativ (<3+) Total Amplificat 32 4 36 Neamplificat 6 164 170 Total 38 168 206 20 de cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor IHC sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 32/38 = 84,2% (95% IC: 68,8%, 94,0%) Acord negativ = 164/168 = 97,6% (95% IC: 94,0%, 99,4%) Procentaj total acord = (32+164)/206 = 95,1% (95% IC: 91,3%, 97,7%)

Rezultatele au arătat o concordanţă de 95,1% (95% IC: 91,3% –97,7%), indicând un acord puternic între testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH şi HerceptTest™.


Tabelul 3: Acordul între CISH şi FISH

Rezultate CISH Rezultate FISH Amplificat Neamplificat Total Amplificat 34 0 34 Neamplificat 2 169 171 Total 36 169 205 21 de cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor FISH sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 34/36 = 94,4% (95% IC: 81,3%, 99,3%) Acord negativ = 169/169 = 100,0% (95% CI: 97,8%, 100,0%) Procentaj total acord = (34+169)/205 = 99,0% (95% IC: 96,5%, 99,9%)

Rezultatele au arătat o concordanţă de 99,0% (95% IC: 96,5%–99,9%), indicând un acord puternic între testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH şi testul PathVysion® HER2. Astfel, rata acordului a indicat că testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH a dat rezultate care au fost echivalente cu cele ale testului PathVysion® HER2. Un sumar al celor 2 cazuri discordante între testul sondei SPOT-Light® HER2 şi testul sondei PathVysion® HER2 este prezentat mai jos. Datele CISH şi FISH sunt prezentate ca medie şi interval iar coloana IHC arată punctajul HercepTest™.

Tabelul 4: Cazuri discordante între FISH şi CISH

HER2 CISH (Poz)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Poz) Numărul cazului

CISH FISH IHC Numărul cazului

CISH FISH IHC

(2, 0,98%)1 A-095-01 4,07 (1,00–10,00) 2,81 (1,67–5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00–4,00) 2,65 (1,00–6,00) 2+ 1% = numărul de cazuri discordante împărţit la numărul total de cazuri cu rezultate FISH şi CISH valide de la centrul corespondent × 100%

B. Cazurile IHC 2+ suplimentare Un plus de 60 de cazuri suplimentare IHC 2+ au fost furnizate de către centrul de studiu A şi testate la centrele de studiu A şi B. Rezultatele de la fiecare centru de studiu au demonstrat faptul că testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH a dat rezultate care au fost echivalente cu cele ale testului PathVysion® HER2. Rezultatele corelate sunt rezumate în Tabelele 5 şi 6.

Tabelul: 5 Acordul între CISH şi FISH la centrul de studiu A la cazurile IHC 2+

Rezultate CISH Rezultate FISH

Amplificat Neamplificat Total Amplificat 6 0 6 Neamplificat 2 46 48 Total 8 46 54 6 cazuri au fost raportate fie lipsă, fie invalide Acord pozitiv = 6/8 = 75,0% (95% IC: 34,9%, 96,8%) Acord negativ = 46/46 = 100,0% (95% IC: 92,3%, 100,0%) Procentaj total acord = (6+46)/54 = 96,3% (95% IC: 87,3%, 99,6%)

Tabelul 6: Acordul între CISH şi FISH la centrul de studiu B, pentru cazurile IHC 2+


Amplificat Neamplificat Total Amplificat 7 2 9 Neamplificat 2 45 47 Total 9 47 56 4 cazuri au fost raportate fie lipsă, fie invalide Acord pozitiv = 7/9 = 77,8% (95% IC: 40,0%, 97,2%) Acord negativ = 45/47 = 95,7% (95% IC: 85,5%, 99,5%) Procentaj total acord = (7+45)/56 = 92,9% (95% IC: 82,7%, 98,0%)


Tabelul 7: Cazuri IHC 2+ cu discordanţe între CISH şi FISH



CISH FISH IHC

Centrul A (2, 3,70%)1 S-156-01 2,77 (1,00–5,00) 2,48 (0,50–5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00–7,00) 2,34 (0,50–8,00) 2+

Centrul B (4, 7,14%)1 S-171 5,20 (2,00–8,00) 1,08 (0,50–2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00–9,00) 2,23 (1,00–5,00) 3+ S-178 20,00 (20,00–20,00) 1,25 (0,50–2,00) 0 S-183 4,13 (3,00–6,00) 2,73 (1,00–6,00) 0

1 % = numărul de cazuri discordante împărţit la numărul total de cazuri cu rezultate FISH şi CISH valide de la centrul corespondent × 100%

C. Cazurile HercepTest 2+

Toate cazurile consecutive şi suplimentare au fost testate cu HercepTest™. Cazurile care au produs punctaje HercepTest™ 2+ au fost combinate şi testate la ambele centre de studiu. Rezultatele de la fiecare centru de studiu au demonstrat faptul că testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH a dat rezultate care au fost echivalente cu testul PathVysion® HER2. Rezultatele corelate sunt rezumate în Tabelele 8 şi 9.

Tabelul 8: Acordul între CISH şi FISH la cazurile HercepTest 2+ de la centrul de studiu A


Amplificat Neamplificat Total Amplificat 3 0 3 Neamplificat 4 27 31 Total 7 27 34 2 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor FISH sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 3/7 = 42,9% (95% CI: 9,9%, 81,6%) Acord negativ = 27/27 = 100,0% (95% CI: 87,2%, 100,0%) Total acord procentaj = (3+27)/34 = 88,2% (95% CI: 72,6%, 96,7%)

Tabelul 9: Acordul între CISH şi FISH la cazurile HercepTest 2+ de la centrul de studiu B


Amplificat Neamplificat Total Amplificat 4 1 5 Neamplificat 1 35 36 Total 5 36 41 2 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor FISH sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 4/5 = 80,0% (95% IC: 28,4%, 99,5%) Acord negativ = 35/36 = 97,2% (95% IC: 85,5%, 99,9%) Procentaj total acord = (4+35)/41 = 95,1% (95% IC: 83,5%, 99,4%)

Tabelul 10: Cazuri HercepTest 2+ cu discordanţe între CISH şi FISH



CISH FISH IHC

Centrul A (4, 11,76%)1 A-095-01 4,07 (1,00–10,00) 2,81 (1,67–5,00) 2+ B-008-08 1,77 (1,00–4,00) 2,45 (1,00–5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00–5,00) 2,48 (0,50–5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00–7,00) 2,34 (0,50–8,00) 2+

Centrul B (2, 4,88%)1 A-023 5,20 (2,00–8,00) 1,49 (0,67–3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00–4,00) 2,65 (1,00–6,00) 2+ 1 % = numărul de cazuri discordante împărţit la numărul total de cazuri cu rezultate FISH şi CISH valide de la centrul

corespondent × 100%


D. Cazurile de polisomie Două centre de studiu au evaluat cazurile de polisomie pe baza practicilor lor clinice instituţionale respective. La centrul A, polisomia cromozomului 17 a fost definită ca prezenţa a ≥ 3 semnale CEP17 în cel puţin 10% din celulele tumorale, în timp ce la centrul B criteriul a fost prezenţa a ≥ 3 semnale CEP17 în cel puţin 30% din celulele tumorale. Frecvenţa tumorilor cu polisomia cromozomului 17 a fost de 18,68% la centrul A şi de 7,91% la centrul B. Rata de detecţie a polisomiei pe acelaşi set de tumori a variat substanţial între cele două centre de testare datorită diferenţei de definire a polisomiei folosite la fiecare centru. Nivelul de acord obţinut independent la fiecare centru de studiu a indicat faptul că testul cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH a dat rezultate care au fost echivalente cu cele ale testului PathVysion® HER2. Rezultatele sunt rezumate în Tabelele 11 şi 12.

Tabelul 11: Acordul între CISH şi FISH în cazurile de polisomie de la centrul de studiu A


Amplificat Neamplificat Total Amplificat 12 0 12 Neamplificat 2 34 36 Total 14 34 48 3 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor FISH sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 12/14 = 85,7% (95% IC: 57,2%, 98,2%) Acord negativ = 34/34 = 100,0% (95% IC: 89,7%, 100,0%) Procentaj total acord = (12+34)/48 = 95,8% (95% IC: 85,8%, 99,5%)

Tabelul 12: Acordul între CISH şi FISH pentru cazurile de polisomie de la centrul de studiu B


Amplificat Neamplificat Total Amplificat 12 1 13 Neamplificat 0 9 9 Total 12 10 22 0 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor FISH sau CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Acord pozitiv = 12/12 = 100,0% (95% IC: 73,5%, 100,0%) Acord negativ = 9/10 = 90,0% (95% IC: 55,5%, 99,8%) Procentaj total acordj = (12+9)/22 = 95,5% (95% IC: 77,2%, 99,9%)

Tabelul 13: Cazuri discordante de polisomie între CISH şi FISH

HER2 CISH (Poz)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Poz)

Numărul cazului


CISH FISH IHC

Centrul A (2, 4,17%)1 A-095-01 4,07 (1,00–10,00) 2,81 (1,67–5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00–5,00) 2,48 (0,50–5,00) 2+

Centrul B (1, 4,55%)1 A-023 5,20 (2,00–8,00) 1,49 (0,67–3,50) 2+ 1 % = numărul de cazuri discordante împărţit la numărul total de cazuri cu FISH şi CISH valabile de la centrul corespondent ×

100%


E. Sumarul rezultatelor comparaţiei între Trusa SPOT-Light® HER2 CISH şi Trusa de sonde PathVysion® HER2 ADN

Tabelul 14: Sumarul rezultatelor trusei SPOT-Light® HER2 CISH şi trusei de sonde PathVysion®

HER2 ADN

Cazurile suplimentare Cazurile echivoce Cazurile de polisomie Tipul cazurilor Cazurile

consecutive Centrul B Centrul A Centrul B Centrul A Centrul B Centrul B

Numărul de eşxantioane

205 54 56 34 41 48 22

Acord pozitiv, % 94,4% 75,0% 77,8% 42,9% 80,0% 85,7% 100,0%

Acord negativ, % 100,0% 100,0% 95,7% 100,0% 97,2% 100,0% 90,0%

Acord total, % 99,0% 96,3% 92,9% 88,2% 95,1% 95,8% 95,5%

Sensibilitatea analitică Sensibilitatea Trusei SPOT-Light® HER2 CISH a fost testată folosind secţiuni de ţesut cu cancer la sân FFPE cu stare HER2 neamplificată şi amplificată, dar şi liniile de celule FFPE folosite pe lamele de control. Gena HER2 a fost detectată ca un punct unic pe secţiunea de ţesut şi secţiunea bloc de celule cu gena HER2 normală. Fiecare eşantion amplificat şi neamplificat a demonstrat o intensitate a colorării de 3+ şi o bună morfologie a ţesutului. Eficienţa hibridizării Eficienţa hibridizării a fost stabilită testând două eşantioane de ţesut (1 amplificat, 1 neamplificat, fiecare de 10 secţiuni) şi 4 eşantioane de linii celulare (2 amplificate, 2 neamplificate). Fiecare eşantion a fost analizat din punctul de vedere al numărului de celule cu semnale HER2 din numărul total de celule analizate (100–300 celule). Eficienţa hibridizării a fost stabilită a fi de 94,7–100%. Pentru colorarea CISH pe 226 de probe clinice de la 3 laboratoare, rata eşecului la fiecare centru a fost de 8,4% (19), 1,3% (3) şi 0,9% (2).(28) Specificitatea analitică Pentru a determina specificitatea, s-au efectuat studii de metafază pe lamele pregătite citogenetic, a fost efectuat PCR folosind o pereche de primeri specifici genei HER2 pe şablonul sondei HER2 ADN şi secvenţierea ADN a fost efectuată pentru ambele capete ale clonelor BAC folosite în sonda HER2 ADN. S-a demonstrat că sonda SPOT-Light® CISH HER2 se leagă în mod specific la locusul genei HER2 de pe banda cromozomială 17q11.2-21. Localizarea cromozomului s-a stabilit prin metafaza FISH în limfocitele normale; testarea PCR a indicat banda ADN dorită iar secvenţierea ADN a indicat localizarea corectă a cromozomului şi acoperirea genei HER2.

Limitele procedurale Procedura SPOT-Light® HER2 CISH a fost testată pentru extremele fiecăruia dintre următorii parametri: grosimea ţesutului, pretratarea, denaturarea, hibridizarea, spălarea riguroasă, imunodetecţia şi colorarea de contrast. Nu s-au observat diferenţe semnificative în rezultatele CISH în următoarele condiţii:

Tabelul 15: Limitele procedurale

Intervaele acceptabile ale parametrilor analizei Grosimea ţesutului 4–6 µm

Pretratarea la cald 99–100°C 10–20 min

Digestia enzimatică 4–14 min

Denaturarea Ciclorul termic PCR 93–98°C 2–8 min

Hibridizarea 30–39°C 10–18 h

Spălarea riguroasă 60–78°C 2–8 min

Imunodetecţia Conjugatul polimer HRP 25v60 min

Cromogenul DAB 15–60 min

Colorarea de contrast 3–30 sec.


Reproductibilitatea Trei loturi separate din trusa SPOT-Light® HER2 CISH au fost testate pe 3 eşantioane de ţesut cu cancer la sân şi 4 eşantioane de linii celulare, cu niveluri diferite ale genei HER2. Nu a fost constatată nicio schimbare a performanţei analizei pe cele trei loturi testate. Reproductibilitatea inter-rulări (de la o zi la alta) Studiul a testat reproductibilitatea inter-rulări CISH în trei zile diferite, folosind probe de cancer la sân cu trei tipuri de stare HER2 şi 3 probe pentru fiecare tip. Rezultatele sunt sumarizate mai jos:

Tabelul 16: Reproductibilitatea inter-rulări (de la o zi la alta)

Copie genă (N) Neamplificat Neamplificat, polisomie Amplificat N mediu = 9 1,79 3,45 20,22 Dev. std. 9 0,05 0,12 1,72 CV 9 3% 4% 8% Reproductibilitatea de la un observator la altul Trei patologi au fost instruiţi să citească lamele pregătite şi colorate folosind Trusa SPOT-Light® HER2 CISH. Pentru a valida gradul de exactitate, fiecărui patolog i s-au dat opt lame precolorate (6 neamplificate şi 2 amplificate) oferite de către Invitrogen. În ambele tipuri de cazuri (neamplificate şi amplificate) toate eşantioanele (100%) au fost interpretate exact.

Tabelul 17: Reproductibilitatea de la un observator la altul

Semnalul CISH, media punctelor/celulă HER2 CISH şi starea genei HER2

ID lamă

Nr. lamă Observator 1 Observator 2

Observator 3

1 Eşantionul 1

(NAM) 2 puncte NAM

1-5 puncte NAM

1-2 NAM

2 Eşantionul 2 (AM)

Aglomerare mare + puncte multiple AM

Aglomerare mare + puncte AM

>10 AM

3 Eşantionul 3 (NAM)

2-5 NAM

1-5 NAM

3-5 NAM


2-4 NAM

2,8 NAM

3-5 NAM


2 NAM

1-5 NAM

1-2 NAM


2-5 NAM

1-5 NAM

4 NAM

7 Eşantionul 7 (AM)


Aglomerare mare AM



2-5 NAM

3,4 NAM

4,3 NAM

Reproductibilitatea de la un centru la altul Studierea reproductibilităţii CISH de la un centru la altul s-a bazat pe 226 de cazuri consecutive repetate la trei centre de studiu. Procentajele totale ale acordului pentru reproductibilitatea CISH folosind >5 ca limita de pozitivitate au fost de 99,0%, 98,6% şi 98,1%, indicând o puternică reproductibilitate pentru testarea cu trusa SPOT-Light® HER2 CISH.


Tabelul 18: Reproductibilitatea CISH pentru toate cazurile consecutive

Examinat de Centrul A şi B

Centrul A Centrul B: Rezultate CISH Rezultate CISH Amplificat Neamplificat Total Amplificat 34 0 34 Neamplificat 2 170 172 Total 36 170 206 20 de cazuri au fost raportate cu rezultate ale testelor CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Procentaj total acord = (34+170)/206 99,0% (95% IC: 96,5%, 99,9%)

Tabelul 19: Reproductibilitatea CISH pentru toate cazurile consecutive

Examinat de Centrul C şi Centrul B

Centrul C Centrul B: Rezultate CISH Rezultate CISH Amplificat Neamplificat Total Amplificat 35 0 35 Neamplificat 3 184 187 Total 38 184 222 4 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testului CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Procentaj total acord = (35+184)/222 98,6% (95% IC: 96,1%, 99,7%)

Tabelul 20: Reproductibilitatea CISH pentru toate cazurile consecutive Examinat de Centrul C şi Centrul A

Centrul C Centrul A: Rezultate CISH Rezultate CISH Amplificat Neamplificat Total Amplificat 32 1 33 Neamplificat 3 171 174 Total 35 172 207 19 cazuri au fost raportate cu rezultate ale testului CISH lipsă sau invalide şi au fost excluse din tabel. Procentaj total acord = (32+171)/207 98,1% (95% IC: 95,1%, 99,5%)

Studiile de repetabilitate şi reproductibilitate pe secţiuni consecutive de ţesut şi diverse grosimi de ţesut Studiile de repetabilitate şi reproductibilitate au fost desfăşurate pentru a evalua repetabilitatea şi reproductibilitatea trusei SPOT-Light® HER2 CISH™ in cayul testării ţesuturilor cu cancer de sân consecutive, amplificate şi neamplificate, de diferite grosimi. Eşantioanele supuse evaluării au inclus lame provenite din trei blocuri de ţesuturi cu cancer la sân: fără amplificare HER2 (normal), amplificare minimală HER2 şi amplificare HER2 (mare). Au fost procesate şi testate zece eşantioane de secţiuni consecutive de 4 µm grosime pentru fiecare bloc, conform procedurilor standard (condiţia de control) iar eşantioanele de grosimi diferite (interval 2-8 µm) din fiecare bloc au fost procesate şi testate în mod similar în duplicat, conform procedurilor standard. Rezultatele acestei testări sunt prezentate în Tabelele 21-23.


Tabelul 21. Media punctelor per celulă HER2 CISH în secţiuni consecutive la 4 µm (cancer la sân cu HER2 normal)

Numărul secţiunii

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media punctelor/nucleu HER2 CISH

1,8 2,0 1,9 2,0 1,6 1,7 1,7 1,6 1,7 2,0

Media HER2 1,8 STD 0,16 %CV 8,9

Tabelul 22. Media punctelor per celulă HER2 CISH în secţiuni consecutive la 4 µm (cancer la sân cu amplificare minimală a HER2)

Numărul secţiunii 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Media punctelor/nucleu HER2 CISH

5,4 5,5 5,3 5,8 5,2 6,2 5,7 5,4 5,5 5,8

Media HER2 5,6 STD 30 %CV 5,4

Tabelul 23. Media punctelor per celulă HER2 CISH în secţiuni consecutive la 4 µm (cancer la sân cu HER2 amplificat)

Numărul secţiunii 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Media punctelor/nucleu HER2 CISH

BC BC BC BC BC BC BC BC BC BC

Depanare Problemă Cauză posibilă Măsura sugerată Semnal slab sau lipsă 1. Instrucţiunile de pretratare nu au fost urmate.

a) Condiţii de pretratare la cald (timpul sau temperatura de incubare) incorecte

b) Condiţii de pretratare enzime (timpul sau temperatura) incorecte

c) Secţiunea ţesutului mai groasă decât

valoarea optimă 2. Condiţii de denaturare incorecte a) Temperatura de denaturare incorectă b) Timpul de denaturare incorect

1. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de pretratare. Consultaţi procedura.

a) Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de pretratare la cald: 15 minute la 98–102ºC.

b) Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile

corecte de pretratare enzimatică (recomandat 5 min., interval 2–20 min.). Asiguraţi-vă că enzima este adusă la temperatura camerei (15–30°C) înainte de utilizare.

c) În funcţie de grosimea ţesutului (4–

6 µm) şi condiţiile de fixare, este posibil ca timpul de incubare optim pentru pretratarea enzimatică să trebuiască mărit sau micşorat.

2. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de denaturare. Consultaţi procedura.

a) Asiguraţi-vă că temperatura de denaturare este de 95°C (interval de 95–98°C) pentru ciclorul termic PCR şi blocul de încălzire, 90°C (interval de 85–90°C)

b) Asiguraţi-vă că timpul de denaturare

este 5 min. pentru ciclorul termic PCR.


Problemă Cauză posibilă Măsura sugerată 3. Condiţii de spălare riguroasă incorecte

a) Temperatura de spălare riguroasă incorectă (depăşeşte 80ºC)

b) Timpul de incubare al spălării riguroase

incorect 4. Temperatură excesiv de înaltă în timpul depozitării sau transportului

3. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de spălare riguroasă. Consultaţi procedura.

a) Asiguraţi-vă că spălarea riguroasă se realizează la 70ºC. Se recomandă utilizarea unui termometru calibrat pentru a verifica temperatura. b) Asiguraţi un timp corect de incubare pentru spălarea riguroasă (5 min.)

4. Verificaţi condiţiile de depozitare. Trusa SPOT-Light® HER2 CISH trebuie depozitată la 2–8° C. Depozitaţi Reactivul J la temperatura camerei (15–30ºC).

Morfologia slabă a ţesutului

1. Condiţii de pretratare la cald (timpul sau temperatura) incorecte 2. Condiţii de pretratare enzime (timpul sau

temperatura) incorecte 3. Condiţii de denaturare incorecte (timpul sau temperatura) 4. Scoaterea lamei de acoperire a cauzat deteriorarea fizică a ţesutului 5. Ţesutul a fost lăsat să se usuce în timpul procedurii CISH 6. Grosime incorectă a ţesutului 7. Timp de fixare incorect 8. Fixativ incorect

1. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de pretratare la cald. 2. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de digestie enzimatică. Pentru majoritatea ţesuturilor provenite din cancere la sân, timpul de 5 min. la temperatura camerei (15–30ºC) este optim. În funcţie de grosimea ţesutului şi timpul de fixare, este posibil să fie necesar ca timpul optim de incubare pentru digestie să fie mărit sau micşorat. 3. Asiguraţi-vă că s-au folosit condiţiile corecte de denaturare. Consultaţi procedura. 4. Nu apăsaţi lama de acoperire. Pre-umeziţi lamele în tampon SSC la temperatura camerei (15–30 ºC) timp de 2–3 min. sau până ce lama de acoperire alunecă uşor. 5. Dacă nu se specifică acest lucru, nu lăsaţi ţesutul să se usuce nici un moment în timpul procedurii CISH. 6. Asiguraţi-vă că ţesutul este de 4–6 µm. 7. Asiguraţi-vă că ţesutul este fixat timp de 6–48 ore. 8. Asiguraţi-vă că ţesutul este fixat în formalină tamponată neutră 10%.

Colorarea fondului 1. Temperatură incorectă a spălării riguroase (<70ºC) 2. Incubare excesivă cu DAB 3. Reactivi incorecţi folosiţi ca tampon de spălare

1. Asiguraţi temperatura corectă a spălării riguroase (70°C). 2. Asiguraţi-vă că timpul de incubare DAB corect este de 30 min. la temperatura camerei (15–30°C). 3. Tamponul de spălare (Reactivii E1 + E2) trebuie folosit în timpul etapelor de imunodetecţie.

Semnale aparente dar dificil de văzut

1. Exces de colorare de contrast cu hematoxilină 1. Asiguraţi-vă că ţesutul primeşte coloraţie de contrast timp de 3–5 secunde. Dacă nu sunteţi siguri de timpul de colorare optim, aplicaţi coloraţie de contrast pe ţesut timp de 3 sec., apoi spălaţi timp de 2 min. sub apă de la robinet. Verificaţi la microscop ţesutul care a primit coloraţie de contrast. Dacă este încă prea deschis, aplicaţi coloraţie contrast timp de încă 3–5 sec. înainte de a trece la acoperirea cu lama.

Zone fără semnal 1. Bule de aer formate sub lama de acoperire la adăugarea sondei

1. Asiguraţi-vă că nu s-au format bule de aer când adăugaţi sonda şi acoperiţi cu lama.


Problemă Cauză posibilă Măsura sugerată 2. Volum de sondă insuficient pentru mărimea ţesutului

2. Adăugaţi ~15 µl pentru ţesutul care este adecvat acoperit cu o lamă de acoperire de 22 x 22 mm. Ar putea fi necesare un volum mai mare de sondă şi o lamă de acoperire mai mare pentru ţesuturile mai mari (folosiţi 20 µl de sondă pentru un ţesut la care folosiţi o lamă de acoperire de 24 x 30 mm.)

NOTĂ: Dacă problema nu este prezentată mai sus sau dacă măsura sugerată nu rezolvă problema, vă rugăm să sunaţi serviciul de asistenţă tehnică la 1-800-955-6288, (numai pentru SUA) sau trimiteţi un e-mail la adresa [email protected].


BIBLIOGRAFIE 1. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Science 229(4717):974-976, 1985. 2. Schechter AL, Hung MC, Vaidyanathan L, et al. Science 229:976-978, 1985. 3. Semba K, Kamata N, Toyoshima K, et al. PNAS 82(19):6497-6501, 1985. 4. Ross JS, Fletcher JA. Am J Clin Pathol 112:S53-S67, 1999. 5. Shak S. Semin Oncol 4 (Suppl 12):71-77, 1999. 6. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, et al. J Clin Oncol 17:2639-2648, 1999. 7. Ross JS, et al. The Oncologist 8: 307-325, 2003. 8. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Science 235:177-82, 1987. 9. Slamon DJ, et al. Science 244-707-12, 1989. 10. Pauletti G, et al. J Clin Oncol 18(21):3651-3664, 2000. 11. Herceptin (trastuzumab) package insert, Genentech, South San Francisco, CA, www.fda.gov, 2004 12. Heikki Joensuu, et al. N Engl J Med 354(8):809-820, 2006 13. Nicols DW, et al. Ann Clin Laboratory Sci, 32(1),2002. 14. Bhargava R, et. al. Am J Clin Path 123:237-243. 2005. 15. Gong Y, et. al. Mod Path 18(8):1015-21, 2005. 16. Zhao J, Wu R, Au A, et al. Mod Pathol 15(6):657-665, 2002. 17. Dandachi N, Dietze O, Hauser-Kronberger C. Anticancer Res 24(4):2401-6, 2004. 18. Wixom CR, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 12(3): 248-251, 2004. 19. Diaz LK, et al. J Histochem Cytochem 52(4): 501-507, 2004. 20. van de Vijver M, et al. Chromogenic in-situ hybridization (CISH) compared with FISH and IHC for

detection of HER2 gene amplification: An international validation ring study. 26th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium, 2003.

21. Arnould L, et al. Br J Cancer 88:1587-91, 2003. 22. Gupta D, et al. Am J Clin Pathol 119:381-87, 2003. 23. Loring P, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 13(2):194-200, 2005. 24. Rueschoff J, et al. HER2 status assessment by chromogenic in situ hybridization (CISH) demonstrates high

sensitivity for predicting response to Herceptin. 27th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium, 2004. 25. Wolff AC, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline

recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med 131:18-43, 2007.

26. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St Louis: CV Mosby Company, 1980. 27. 24. Kiernan, JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press,

1981. 28. Data on file, PMA application & USCAP 2008 Annual Meeting poster presentations, numbers 138, 139, &

140. 29. Cooper K, et al. J Clin Pathol 44:406-409, 1991.

MĂRCI COMERCIALE Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ şi SPT™ sunt mărci comerciale ale Invitrogen Corporation. SPOT-Light® şi Zymed® sunt mărci comerciale înregistrate ale Invitrogen Corporation. Herceptin® este o marcă comercială înregistrată a Genentech, Inc. HercepTest™ este o marcă comercială a Genentech, Inc. PathVysion® este o marcă comercială înregistrată a Abbott Molecular, Inc.


Invitrogen Corporation 542 Flynn Road Camarillo • CA 93012 1-800-955-6288 Pentru problemele tehnice trimiteţi e-mail la adresa: [email protected] Pentru informaţii generale privind trusa SPOT-Light® HER2 CISH, trimiteţi e-mail la adresa [email protected] URL: www.invitrogen.com/her2cish Explicarea simbolurilor

Numărul catalogului

Numărul lotului

Limitarea temperaturii

Fabricant

Conţine o cantitate suficientă pentru <n> teste

Reprezentant autorizat pentru CE

A se utiliza de către Diagnostic in vitro

Consultaţi instrucţiunile de utilizare

Consultaţi documentele însoţitoare

pentru IVDD 98/79/CE: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, UK

Copyright © Invitrogen Corporation. 16 iulie 2008

Anexa A: Ghidul de interpretare a testului HER2 CISH

Amplificarea genelor HER2Amplificarea

Amplificare mare: >10 puncte, sau aglomerări mari, sau un

amestec de puncte multiple şi aglomerări mari ale genei HER2

prezente per nucleu în >50% din celulele canceroase. Vezi Fig-

urile A, B şi C.

O aglomerare mare este un grup de semnale cu formă neregulată

care este de 5 ori mai mare decât diametrul unui punct unic. Un

punct unic din tumoră sau din celulele epiteliale normale de pe

aceeaşi lamă trebuie folosit ca referinţă. Vezi Figura A.

Amplificare scăzută: >5 puncte până la 10 puncte, sau aglomerări

mici, sau un amestec de puncte multiple şi aglomerări mici ale

genei HER2 prezente per nucleu în >50% din celulele canceroase.

Vezi Figurile D şi E.

O aglomerare mică este un grup de semnale cu formă neregulată

care are de 3–5 ori diametrul unui punct unic. Un punct unic din

tumoră sau din celulele epiteliale normale de pe aceeaşi lamă

trebuie folosit ca referinţă. Vezi Figura E.

A. Aglomerări mari. B. Puncte multiple (>10 puncte).

C. Aglomerări mari şi puncte multiple.

D. >5 până la 10 puncte.

E. Aglomerări mici.

www.invitrogen.comwww.invitrogen.com

Neamplificarea genelor HER2Neamplificare

Polisomia: 3–5 puncte ale genei HER2 prezente per nucleu în >50%

din celulele canceroase. Vezi Figura F.

Un punct unic are o margine netedă, rotundă în celulele normale

sau tumorale. Vezi Figura F.

Diploidia: 1–2 puncte ale genei HER2 prezente per nucleu în >50%

din celulele canceroase. Vezi Figura G.

Un punct unic are o margine netedă, rotundă în celulele normale

sau tumorale. Vezi Figura G.

Dublet

Dacă două semnale sunt separate printr-o distanţă mai mică decât

diametrul unui singur semnal, aceste semnale trebuie numărate

ca un punct unic. Dubletele apar ca o pereche şi nu reprezintă

adevărate aglomerări mici.

F. Polisomia: 3-5 puncte. G. Diploid: 1-2 puncte.

H. Dublet = 1 punct. Imagine prezentată prin amabilitatea Dr. Adrienne Morey.

©2008 Invitrogen Corporation. Toate drepturile rezervate. Aceste produse pot fi acoperite de una sau mai multe Licenţe de marcă pentru utilizare limitată (vezi catalogul Invitrogen sau www.invitrogen.com). Utilizând aceste produse, acceptaţi termenii şi condiţiile tuturor licenţelor de marcă pentru utilizare limitată aplicabile. Nu este destinat pentru utilizarea terapeutică sau cu scop diagnostic, la animale sau la om, cu excepţia cazului în care se specifică altfel. O-079226-r1 0808

Anexa B: Fişa de punctaj HER2 CISHTrusa SPOT-Light® HER2 CISH, Cat. Nr. 84-0150

ID de conectare pentru rularea colorării: ___________________________________________________________________________

Trusa SPOT-Light® HER2 CISH (84-0150) Lot #: ________________________________________________________________________

ID probă: ____________________________________________________________________________________________________

Rezultatele CISH (înregistraţi numărul semnalelor HER2 pentru fiecare dintre celulele evaluate):

Graficul 1. Rezultate CISH

Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2 Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2 Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2

1 11 21

2 12 22

3 13 23

4 14 24

5 15 25

6 16 26

7 17 27

8 18 28

9 19 29

10 20 30

Notă: Pentru aglomerări. vă rugăm să furnizaţi cea mai bună apreciere a punctelor/ copiilor genei (aglomerare mică = 5 puncte, aglomerare mare = 10 puncte).

Suma punctelor din 30 de celule __________________________

Media punctelor din 30 de celule __________________________

Dacă media este între 4 şi 6 puncte, număraţi punctele din alte 30 de celule pentru a obţine un total de 60 de celule şi înregistraţi rezul-

tatele în Graficul 2. Dacă media este <4 sau >6, nu este necesar să număraţi alte 30 de celule iar eşantionul poate fi înregistrat ca ampli-

ficare sau neamplificare.

Punctajul CISH

Ghidul de punctaj HER2 CISH al Invitrogen Neamplificare: 1–5 semnale/nucleu în celulele tumorale•

Amplificare: >5 semnale/nucleu, sau aglomerare de semnale amplificate/nucleu în >50% din celulele tumorale•

Rezultat: Neamplificare (≤5) Amplificare (>5)

Semnătura tehnicianului şi data: __________________________________________________________________________________

Semnătura patologului şi data: ___________________________________________________________________________________

www.invitrogen.com

Graficul 2 (rezultatele CISH). Dacă este nevoie, introduceţi numărul de puncte din al doilea set de 30 de celule:

Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2 Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2 Nr. celulă Puncte sau aglomerări HER2

1 11 21

2 12 22

3 13 23

4 14 24

5 15 25

6 16 26

7 17 27

8 18 28

9 19 29

10 20 30

Suma punctelor în celulele 31–60 _________________________

Suma punctelor în celulele 1–30 __________________________

Media punctelor din 60 de celule __________________________

Punctajul CISH

Ghidul de punctaj HER2 CISH al Invitrogen Neamplificare: 1–5 semnale/nucleu în celulele tumorale •

Amplificare: >5 semnale/nucleu, sau aglomerare de semnale amplificate/nucleu în >50% din celulele tumorale•

Rezultat: Neamplificare (≤5) Amplificare (>5)

Semnătura tehnicianului şi data: __________________________________________________________________________________

Semnătura patologului şi data: ___________________________________________________________________________________

©2008 Invitrogen Corporation. Toate drepturile rezervate. Aceste produse pot fi acoperite de una sau mai multe Licenţe de marcă pentru utilizare limitată (vezi catalogul Invitrogen sau www.invitrogen.com). Utilizând aceste produse, acceptaţi termenii şi condiţiile tuturor licenţelor de marcă pentru utilizare limitată aplicabile. Nu este destinat pentru utilizarea terapeutică sau cu scop diagnostic, la animale sau la om, cu excepţia cazului în care se specifică altfel. O-079226-r1 0808

Trusa SPOT-Light HER2 CISH -...

Documents

Transcript of Trusa SPOT-Light HER2 CISH -...