Trucos y consejos en la resolución de problemas en hplc
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Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC
Resolución de Problemas en HPLC:TroubleshootingHPLC:Troubleshooting Técnicas, Consejos , y Trucos
Agilent Technologies
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Pasos en la Resolución de ProblemasUna vez que has detectado que hay un problema!Una vez que has detectado que hay un problema!
¿Cómo lo solucionas?•1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra?
Hacer Blancos2 d R i l li i d l é d•2nd Revisar el cumplimiento del método– ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?– ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?
•3rd Hágase más preguntas!– ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez?– ¿ Se ha cambiado alguna cosa?
•4th Revise TODOS los parámetros!•4 Revise TODOS los parámetros!– Lo obvio no es siempre la causa– ¿Hubo más de un cambio?
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¿
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Componentes del Sistema HPLCComponentes del Sistema HPLC
BombaInyector /Automuestreadoryecto / uto uest eadoColumnaDetectorDetectorSistema de datos/Integrador
Los problemas pueden estar relacionados con todos los p pcomponentes del sistema
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Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas
Column Problem Percentage of RespondentsColumn Problem Percentage of Respondents
Alta presión, fritas obstruidas 24%Pobre reproducibilidad (formas de pico, retención)
16%
Recuperación de muestra 14%Recuperación de muestra 14%
Perdida de resolución 13%
Inestabilidad 11%
Volumenes muertos 8.1%
Fugas, conexiones 4.8%
%Rango de pH 2.0%
Bajo numero de platos 2.0%
Saturación de la columna 2 0%Saturación de la columna 2.0%
Cost 1.7%
Miscellaneous 15%
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Tipos de problemas del Sistema y la Columna
A. PresiónA. Presión
B. Forma del PicoB. Forma del Pico
C. RetenciónC. Retención
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Problemas de Presión
Sintomas de la columna Posibles causas
Alta - Frita obstruidaAlta Frita obstruida
- Contaminación de la columnacolumna
- Obstrucción en el empaquetamientoempaquetamiento
Baja presión - Fuga
- Flujo incorrecto
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Corrección de la sobrepresiónDeterminación de la causa y corrección de una presión alta
Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistemaMuchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema.Comprobar la presión del sistema con y sin columna.
Si la presión con columna es alta:Si la presión con columna es alta:• Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)• Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)• Lavar la columnaLavar la columna
Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueadoRetirar compuestos adsorbidos de alto peso molecularLimpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampónLimpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón
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Obstrucción del empaquetado
Tamaño de partícula
Area(um2)
Diam intersticial medio (um)
Porosidad de la frita(um)
5.0 2.7 0.9 2.0
3.5 1.3 0.6 2.0
3 0 1 0 0 6 2 03.0 1.0 0.6 2.0
2.7 0.7 0.5 2.0
1.8 0 4 0.4 0 51.8 0.4 0.4 0.5
1.7 0.3 0.3 0.5
C id d l f ó il t dCuidado con las fases móviles tamponadasLos tampones contienen material insoluble– filtrarLa solubilidad del tampón decrece con el aumento del %La solubilidad del tampón decrece con el aumento del % de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
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Solubilidad del tampón
La Tabla I presenta una estimación de la concentration a ab a p ese ta u a est ac ó de a co ce t at osoluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0) en tres solventes orgánicos
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Solubilidad de 5 tampones en mezclas con(a) metanol (b) acetonitrilo y (c) tetrahidrofurano(a) metanol, (b) acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano
metanolmetanolacetonitrilo THF
El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico a pH 3 0 --- representa fosfato potásico a pH 3 0 –••– representa fosfatoa pH 3.0, --- representa fosfato potásico a pH 3.0, –••– representa fosfato amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.
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Cambiar la frita puede no ser buena ideaPuede que no sea posible con columnas de nueva generaciónPuede que no sea posible con columnas de nueva generación
Puede dañar columnas de alto rendimiento
CompressionColumnInlet Frit
Ferrule
Wear glovesDo not allow bed to dry
Column Body
yDo not touch the column - body heat will extrude packingDo not overtighten
Female End Fitting
Male End Fittingg
Consejo: Prevenir es mucho mejor!
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El Truco:El Truco: Tecnicas de Prevención- La mejor elección!
• Usar protección de la columna- Filtros en linea- Salva columnas
• Filtrar las muestrasFácil
• Filtrar fases móviles tamponadas
• Extracción de la muestra(i.e. SPE) No tan fácil
• Lavado apropiado de la columna
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Limpieza de la columnaLimpiar con solventes más fuertes que la fase
móvil
Opciones de Solventes de Fase Reversaen orden de fuerza creciente
Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas
• Fase Móvil sin sales de tampónp• 100% Metanol• 100% Acetonitrilo• 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
Debe revertirse para
Esto lleva tiempo, amenudo se realiza 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol
• 100% Isopropanol• 100% Cloruro de Metileno* • 100% Hexano*
revertirse para
Re-Equilibrar
amenudo se realiza Offline
• 100% Hexano
*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna conIsopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa
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Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa.
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Li i d l l f l
Use al menos 50mL o 20 30 volumenes de columna para las columnas analíticas
Limpieza de la columna– fase normal
Use al menos 50mL o 20−30 volumenes de columna para las columnas analíticas• Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:
Solvent Composition
Methanol:Chloroform 50:50% Methanol:Chloroform 50:50%
Ethyl Acetate 100%
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¿Cuáles son los problemas más comunes de la forma de pico?de la forma de pico?
1. Picos dividos
2. Colas en los picos (simetría <1 )
3 Picos anchos (mala resolución Rs<2)3. Picos anchos (mala resolución. Rs<2)
• Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i eMuchos problemas de formas de pico son combinaciones i.e. ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención.
•Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el•Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el cromátograma.
C d d t bl d t últi l
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•Cada uno de estos problemas pueden tener múltiples causas.
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Picos dobles por perturbacion en el flujo
•Perturbación en el flujo por un volumen muerto
L t fl dif t i t é d•La muestra fluye por diferentes vias a través de la columna
•Pobre empaquetamiento de las partículasp q p
•El pH alto disuelva la Silice
Picos dobles o partidos
Normal Picos dobles
Consejo: Un efecto similar se produce con una frita parcialmente obstruida
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parcialmente obstruida
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Picos divididos por efectos del solvente de inyecciónde inyección
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H2O : 18% ACNVolumen de inyección: 30 μL Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
A Solvente de inyección B Solvente de inyección
1
A. Solvente de inyección100% Acetonitrilo
B. Solvente de inyecciónFase Móvil
1
22
0 10Time (min)
0 10Time (min)
Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemas en los picos tales como picos divididos o ensanchamientoTruco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil
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C l h i tColas, ensanchamientoy perdida de eficacia
Pueden ser causadas por:
• “Interacciones secundarias” en la Columnala Columna
• Contaminación en la ColumnaE j i i t d l l• Envejecimiento de la columna
• Saturación de la columna• Efectos extra columna
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Forma del pico: Colas en los picos
Simetría > 1.2CausasAlgunos picos con cola:
Interacciones secundarias – Efectos de RetenciónInteracciones con silanoles residuales
Normal Cola
Interacciones con silanoles residuales.Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico mayor.
Todos los picos con colas:
Efectos extra-columna.Acumulación de contaminación en la
Normal Colas
entrada de la columna.Metales pesados.Mala columna.
Normal Colas
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Colas en los picos- Contaminación en la Columna
Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está Dañada
Truco: Revetir la columna y analizar–Si hay mejora, una limpieza puede ayudar-No hay mejora-Columna Dañada y necesita ser reemplazada
Test QC dirección Test QC dirección inversaTest QC despues lavado
100% IPA 35°C
ayudar No hay mejora Columna Dañada y necesita ser reemplazada
3
3
3Platos TF
1. 7629 2.082 12043 1 64
Platos TF
1. 7906 1.43
Platos TF
1. 7448 1.062 12237 1 21
correctaQ 100% IPA, 35 C
2
2
2
2. 12043 1.643. 13727 1.694 13355 1.32
2. 12443 1.213. 17999 1.194 17098 1.25
2. 12237 1.213. 15366 1.114 19067 1.17
41
41 41
0.0 2.5 5.0Time (min)
0.0 2.5 5.0Time (min)
0.0 2.5 5.0Time (min)
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min
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Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno
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Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)
2000
1500
1000
mAU
500
0
0 5 10 15 20 25
Ti ( i )
Normal FrontingSimetría < 0.9
Tiempo(min)
Causas:
Saturación de columna
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Colas en los picos/EnsanchamientoEfectos de carga de muestra
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/minT t 40°C M t 1 D i i 2 N t i tili 3 D i 4 I i i 5 A it i tili 6 T i i iTemperatura: 40°C Muestra: 1. Desipramina 2. Nortriptilina 3. Doxepina 4. Imipramina 5. Amitriptilina 6. Trimipramina
Ensanchamiento A. CAlta CargaFactor de ColaPlatos de una C8
A. C.gx10
C D
Factor de Cola Eclipse XDB-C8USP TF (5%) i
A B
B
1. 850 59412. 815 78423. 2776 62314. 2539 8359
A B1. 1.60 1.702. 2.00 1.903. 1.56 1.564. 2.13 1.70
0 5 10Time (min)
0 5 10Time (min)
B. D.Baja Carga5. 2735 100226. 5189 10725
5. 2.15 1.866. 1.25 1.25
0 5Time (min)0 5
Time (min)
Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada
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Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada
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Forma de Picos: Picos Anchos
Todos los picos ensanchan:
• Pérdida de Eficacia de la columna.• Volumen muerto.• Gran Volumen de Inyección• Gran Volumen de Inyección.
Algunos picos ensanchan:
• Elución tardía de una muestra previa (Pico fantasma)(Pico fantasma).– Alto Peso Molecular.– Muestra - Proteina o Polímero.
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Dispersión Extra-Columna
Aumentando el Volumen Extra-Columna
n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector y la columna y entre la columna y el detector.
n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos están hechas con los fittings adecuados.
n Use una celda de detector de bajo volumen.
n Inyecte pequeños volumenes de muestra.
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Consejo: Malas Conexiones en el HPLC d C E h i t d Pipueden Causar Ensanchamiento de Picos
El Sistema se ha optimizado y :El Sistema se ha optimizado y :– Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas
S ó l di t á ñ d t b– Se usó el diametro más pequeño de tubo– Una celda de flujo de volumen adecuado
Los Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiadoLos Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiado Volumen Extra-Columna
Q é tá l?¿Qué está mal?
¿ha hecho las conexiones adecuadamente?
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Conectores de Columna Usados en HPLC
Troubleshooting LC Fittings Part II J W Dolan and P Upchurch LC/GC Magazine 6:788 (1988)
Swagelok Waters
Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988)
0.090 in.
0.130 in.
g
0.090 in.
0.170 in.
Parker Rheodyne
in.
Valco Uptight0.090 in.
0.080 in.
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¿Qué Ocurre si las conexiones no son correctas?
Incorrecto … demasiado largo
La Férrula no asienta adecuadamente
Incorrecto … demasiado corto
Si la distancia X es muy larga, habrá fugaCámara de mezclaX
X
Si la distancia X es demasiado corta, se generará un volumen muerto o cámara de mezcla
X
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Los cambio en Retención puedes ser Químicos o Físicos
P d t dPueden estar causados por:
• Envejecimiento de la columnaj• Contaminación de la columna• Equilibración insuficienteEquilibración insuficiente• Pobre combinación columna/fase móvil• Cambio en la fase móvil• Cambio en la fase móvil• Cambio en el flujo.
Diferentes volumenes de retraso del gradiente• Diferentes volumenes de retraso del gradiente
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Envejecimiento de la fase móvil/Equilibración j qCausan Cambios en la Retención/Selectividad
Columna 1 – Tras lavado con C l 1 Di i i t 1% H3PO4 /EquilibraciónColumna 1 – Dia siguienteColumna 1 - Inicial
1 1
2
1
2
1
0 3 5 9 12 15Time (min)
0 3 5 9 12 15Time (min)
• El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase movil/ acondicionamiento de la columna o / aco d c o a e to de a co u a
• La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto quelante de metal)resuelto por “des-activación” de la
contaminación activa del metal
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contaminación activa del metal
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Los compuestos sensibles a los metales d Q lpueden Quelarse
Pista: Busca un par solitario de Electrones en :
C OHO
:
CH
:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6 miembros con un Metal
C O
OH
HM +2O
OH + M +2
CH ::
:Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros
OH
::
M +2C O
OHC N
N: M +2 ::
:
8-hidroxiquinolinaComplejo Anillo de 5-
miembros
a-benzoinoxominaComplejo Anillo de 5-
miembros
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miembros miembros
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Un lavado Acido puede mejorar la forma de ipico
Antes del lavado id
Después del lavado ácido50 100 L 1% H PO
OH
OH
OHHOOHHO OH
OH1. 2. 1. 2.
acido 50 – 100 mLs 1% H3PO4
M+2--
Columnas:ZORBAX SB-Phenyl4.6 x 150 mm1
2Fase Móvil: 75% 25 mM tampón fosfato amónico / 25% CAN
Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura: RT
1
2
2
Temperatura: RTTamaño muestra: 5 mL
2
Tf: 1.2Tf: 3.7Tf: 3.7
• Se usó una solución del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse
Page 31
un 0.5 % .
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pH de la Fase Móvil y pH de tampones¿Porqué son tan importantes en HPLC?¿Porqué son tan importantes en HPLC?•El pH afecta la Ionización
– Superficie de la Silica de la Columna– Componentes de Interés de Muestra
• TamponesResisten Cambios de pH y Mantienen la Retención– Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retención
– Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables
• Efectos en el tiempo de Vida de la Columna– pHs bajos liberan las cadenas alquilicas de la Fase estacionariap s bajos be a as cade as a qu cas de a ase es ac o a a– pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote
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Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote
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¿Porqué preocuparse del pH?pH pKa y Ácidos DébilespH, pKa y Ácidos Débiles
RCOOH RCOO- + H+ Ka =[[RCOO-][H+]
[RCOOH]RCOOH RCOO + H
Ka = 6.4 x 10-5
a [RCOOH]COOH COO
_
Ka 6.4 x 10pKa = 4.2+ H+
A pH 4.2 – la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporciónde 1:1. La forma de Pico puede ser pobre
A pH 5.2 – el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye.A pH 3.2 – el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta.
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Efecto del pH en la Forma de Pico a o cerca del pK de la Muestraa o cerca del pKa de la Muestra
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN /Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT
pH 4 4 pH 3 0
CH3CHCOOH
pH 4.4 pH 3.0
CH2CH(CH3)2
IbuprofenopKa = 4.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (min) Time (min)
• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto debe evitarse
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debe evitarse.
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¿Porqué preocuparse del pH?pH, pKa y Bases DébilespH, pKa y Bases Débiles
[R3N][H+]R3NH+ R3N + H+Ka =
[R3N][H ][R3NH+]
K = 1 x 10-9
3 3
+ Ka = 1 x 10 9
pKa = 9CHOCH CH N
2 2
CH3
CH
∅
∅
+H
CH3
CH
∅
∅
CHOCH CH N2 2 + H+
CH3
∅ CH3
∅
A pH 9 – la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadasen relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre
A H 10 91% d l t dif hid i d t dA pH 10 – 91% de la muestra es difenhidramina desprotonada.A pH 8 – 91% de la muestra es difenhidramina protonada.
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pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases
5
Columna: Nucleosil-C18Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostatoMuestra: Acidos Biliares
Columna: mBondapak-C18Fase Móvil: 60% 25 mM tampón fostato
40% Metanol1 Ácido Salicílico
SCD1.5
540
6
1. Ácido Salicílico2. Fenobarbital3. Fenacetin4. Nicotina5. Metamfetamina
5
1.0
g k«
30
on
UDCSOC4
2 +0.5
log
4
20
Reten
tio
+++
3
1 7,12 - OC
C12-OC J.C. 111(1975) 149
++
1
0.0
2
310J.C. 268(1983) 1
-0.53 4 5 6 7 8 pH
A B C
23 5 7 9
ELUENT pH
10
•La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el pH
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•La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el pH.
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Importancia del pH y los Tampones Un Ejemplo PrácticoUn Ejemplo Práctico
•Por qué la Muestra impone las condiciones de uso
•Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad
Q é d i l t ó•Qué pasa cuando se ignora el tampón o se usa inadecuadamente
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Tampones más usados en Fase Reversa HPLC
Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)Phosphate 2.1 1.1-3.1 200
7.2 6.2-8.212.3 11.3-13.3
Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210 Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210Citrate 3.1 2.1-4.1 230
4.7 3.7-5.75.4 4.4-6.4
Tris 8.3 7.3-9.3 205Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200* Volatile buffers for LC/MS applications
La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un pH igual al pKa del tampon. La mayoría de l i id d d d d i l l H d l flos tampones tienen una capacidad adecuada de tamponamiento para controlar el pH de la fase movil solo en ±1 unidades de su pKa
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Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Práctico Condiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos CardíacosCondiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos Cardíacos
1
Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mmFase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4 pH 3 0 (1 1-3 1)Fase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 (1.1-3.1)
55% MeOHFlujo: 2.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección: UV 254 nmMuestra: Fármacos Cardíacos
1. Diltiazem2. Dipyridamol3. Nifedipina4 Lidoflazina
5
4
32
4. Lidoflazina5. Flunarizina
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time (min)
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No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el pHpH …
Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 20% H2OFase Móvil: A: 20% H2OB: 80% MeOH
Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección UV:254 nmFuertesMuestra: Fármacos Cardíacos
Incluso a muy alto % MeOH La mayóría de
Fuertes interacciones secundarias d l t
y ycomponentes fuertemente retenidos muestran pobre forma de pico debido al IEX en la superficie
de la muestra (aminas) con la superficie de la columna
0 5 10 15 20 25Time (min)
• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones
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• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones.
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¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?
2
Columna: StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponadoB: 70% MeOH
Flujo: 1 0 mL/minSe añadió t ó
1
Flujo: 1.0 mL/min.Temperatura:35°CDetección UV:254 nmMuestra: Fármacos Cardíacos
1 Diltiazem
tampón, pero no controla el 1. Diltiazem
2. Dipyridamol3. Nifedipina4. Lidoflazina5. Flunarizina
Forma de Pico Inadecuada
controla el pH a 4.8
5
34
0 5 10 15 20 25Time (min)
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No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la Fase Móvil para el Máximo Tiempo de VidaFase Móvil para el Máximo Tiempo de Vida pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)
Fase Móvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA(~ pH 11, disolución de la sílica)
InicialInicial
Después de 30 inyecciones
Consejo: Usar las columnas diseñadas para el pH elegido
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Consejo: Usar las columnas diseñadas para el pH elegido
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Efecto del Tiempo de Respuesta del DetectorEl Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!El Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!
Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y Reducir la Sensibilidad
0.1 segTiempo de Respuesta
Agilent 1100 DADAgilent 1100 WPS with ADVR
Columna: Poroshell 300SB-C182 1 x 75 mm 5 um
0.2 seg1er pico = 1.2 segA 20 pts/seg = 24 pts
2.1 x 75 mm, 5 umFase Móvil:A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFAB: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
Flujo: 2 mL/min
0.5 seg
1 0 seg1er pico = 1.2 segTemperatura:70°C
Detector: UV 215 nm
Embolada de Piston : 20
1.0 seg
2.0 seg
p gA 5 pts/seg = 6 pts
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9Time (min)
1.0
Muestra:1. Neurotensina 3. Lisozima2. RNasaA 4. Mioglobina
2.0 seg
• Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos
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Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos.
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Conclusiones
Los problemas en Columnas HPLC más comunes son:
• Alta Presión (Prevenir mejor que curar)( j q )• Malas Formas de Pico• Cambio en la Retención/Selectividad
A menudo estos problemas no están asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento o por problemas químicos:• pH de la Fase MóvilpH de la Fase Móvil• Conexiones del Instrumento• Parámetros del Detector• Contaminación por Metales
Comenzar con las pregunta correctasEncontrar las resp esta• Encontrar las respuesta
• Las respuestas conducirán a soluciones
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