TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

PHAN VĂN HÙNG

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN VIRUS HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khóa học: 2010 – 2014

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Ts. Nguyễn Tất Toàn

An Giang, Tháng 04 năm 2014

Bài I

KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN

THẠCH

I. Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô)

1. Mục đích

Xác định sự hiện diện của virus Newcastle trong phôi trứng gà, ứng dụng sâu hơn là sản xuất

Vắc xin.

1

2. Dụng cụ - hóa chất

Hình 1: Một số dụng cụ và hóa cần thiết

2

Muối sinh lý 10-20%

Nước muối sinh lý 10- 20%

Cồn

Iod

Parafin lỏng

Kim tiêm

3. Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi

Hình 2: Trứng 9 – 11 ngày tuổi

Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng ở nồng độ 10-3, liều lượng là 0.1-0.2ml/trứng

3

Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ

Pha vắc xin với nước muối sinh lý ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3.

Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước khi đem pha

4

Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý

Hình 6: Lắc để trộn điều vắc xin

Tiến hành pha loãng với các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

5

Hình 7: Virus Niu-cát-xơ ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

Sử dụng ở nồng độ 10-3 để tiêm vào trứng, đối với virus Newcastle. Ta tiến hành tiêm ở xoang

niệu mô, liều lượng là 0,1-0,2 ml/trứng.

4. Quy trình thực hiện

6

Hình 8: Trứng đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi

Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi

7

Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod

Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa

8

Hình 12: Tiến hành tiêm (liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng)

Lưu ý: Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi

Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 370c

5. Xem kết quả

II. Kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa (kỹ thuật tạo buồng hơi giã)

1. Mục đích

Xác định sự hiện diện của Virus đậu mùa trong phôi trứng gà, thông qua bệnh tích biểu hiện

trên màng CAM (nốt pock trên màng CAM).

Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phòng bệnh đậu mùa

2. Dụng cụ - hóa chất

Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su…..

9

3. Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi.

Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các nồng độ 10 -1,10-2,10-3. Sử dụng nồng

độ 10-3, liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng. Cách pha loãng thực hiện tương tư như trên.

Hình 14: Vắc xin Đậu gà

4. Quy trình thực hiện

Hình 15: Chuẩn bị trứng đã ấp 9-11 ngày tuổi

10

Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng hơi giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ

Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở buồn hơi giã ra, cho màng cam tuột khỏi

vỏ lụa

11

Hình 18: Đục lỗ trên vỏ

Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch một góc 30 - 450

III. KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH

1. Mục đích

Xem sự khuếch tán của kháng nguyên (kháng thể gà) và kháng thể (kháng thể thỏ) khuếch tán

trên mặt thạch như thế nào ?

2. Chuẩn bị

Kháng nguyên : là kháng thể gà

12

Kháng thể : là kháng thể thỏ

Chuẩn bị môi trường : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol trong 1 lít nước cất

Hình 20: Đun môi trường trên bếp cách thủy

Dùng vải lượt, lọc môi trường vừa nấu xong

13

Hình 21: Môi trường được lọc xong cho vào chai

Chú ý : Môi trường rất mao đông đặc lại, cần nên tiến hành ngay sao khi lọc xong

Dùng pipet hút 4 - 5 ml thạch nhỏ vào lame, đặt pipet vuông góc với lame, cho thạch chảy

xuống từ từ. chảy đều trên lame không được có vết nhăn và lồi lỗm chỗ nào, độ dày khoảng 3

mm

14

Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày 3 mm trên Lame

15

Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu những vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ

Cho kháng nguyên (kháng thể gà) và kháng thể (kháng thể thỏ) vào những vị trí đã đục lỗ

theo quy định như sau: lỗ trung tâm là kháng thể thỏ, 4 lỗ xung quanh là kháng thể gà, từ 20µl

- 50µl cho mỗi lỗ trên thạch.

Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào 4 lỗ còn lại, đặt những

miếng bông gòn để giữ độ ẩm

16

Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 370c, sau 48h để quan sát kết quả

Bài 2

THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO

I. Mục đích

Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan

về công ty. Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin được

anh Tú nhiệt tình hướng dẫn

Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là: cách nuôi Virus dùng để sản xuất

vắc xin, và kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin. Điều thiệt thòi nhất là chỉ được ngồi

trên giảng đường, mà không được chứng kiến tận mất. do công ty tan ca làm việc.

II. Một số vắc xin sản xuất được tại công ty

Vắc xin heo tai xanh

Vắc xin cúm

Vắc xin viêm não nhật bản

Vắc xin uốn ván…..

III. Quy trình sản xuất vắc xin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấm

men, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin.

BÀI 3

KỸ THUẬT PCR

I. Mục đích

Kỹ thuật pcr là một kỹ thuật khuếch đại đoạn gen, mà không cần nhờ vào sinh vật sống như

ecoli, hay nấm men.

Có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong y học, cũng như trong di truyền, nhưng ứng dụng

quan trọng nhất đó chính là chuẩn đoán bệnh tìm ra tác nhân gây bệnh, qua đó xóm đưa ra

biện pháp can thiệp kiệp thời. Được ứng dụng rất nhiều trong việc chuẩn đoán bệnh trên động

17

vật. Đặc biệt hiện nay một số bệnh quan trọng như virus heo tai xanh (PRRS), hay virus vịt

cúm gia cầm (H5N1),…

II. Quy trình ly trích ARN cho b nh PRRS, DNA cho b nh Porcine ệ ệCircovirus Type 2 (PCV2) và ch y PCRạ

1.Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất

Mầu phổi, thận, lách, hạch của heo ngi ngờ mắt bệnh

Hình 25: Mô heo ngi ngờ mất bệnh PRRS(a), PCV2(b)

Bộ kit thương mại để tiến hành phân lập

Hình 26: Bộ kít Promega dùng để trích ly RNA, bộ kít Việt Á dùng để trích ly DNA

2.Dụng cụ và thiết bị

Máy chạy PCR

Máy ly tâm có tốc độ cao

Vortex

Máy homogenizer hay chày cối

Pipette, đầu col

Tube

Máy chạy điện di

18

Eppendorf

3.Cách th c hi nự ệ

3.1 Trích ly RNA c a b nh heo tai xanh(PRRS)ủ ệ

Bước 1: xử lý mẫu

Lấy 5gr mẫu đã chuẩn trước đó, cắt nhỏ cho vào cối giã nhiễn ra

Hình 27: Cắt mẫu và giã nhiễn

Cho 5ml dung dịch PBS vào mẫu đã giã nhiễn và trộn điều

Hình 28: Hút dd PBS cho vào mẫu đã giã nhiễn

Hút mẫu mô cho vào eppendorf, bỏ cặn. Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút

Hình 29: Hút mẫu vào eppendorf và đem ly tâm

Bước 2: Cho 200µl mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000µl RNA Lysis Buffer trộn đều, để yên

30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá vỡ tế bào, phóng thích RNA.

19

Hình 30: Cho mẫu vào eppendorf chứa sẵn RNA Lysis Buffer sau đó trộn đều mẫu

Bước 3: Cho 175µl hỗn hợp dung dịch trên vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer,

trộn đều, ủ 65oc trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút Tủa protein tạp và các tạp chất.

Hình 31: Cho hỗn hợp vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly tâm

Bước 4: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 960. Cho tất cả vào eppendof lọc, ly tâm 13000 vòng/1 phút Giữ RNA trên màng lọc.

Hình 32: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 960 và Cho tất cả vào eppendof lọc

Bước 5: Đổ hết phần nước, cho 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc ly tâm 13000 vòng/1

phút Loại bỏ protein tạp và tạp chất.

20

Hình 32: Hút 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc

Bước 6:

4. Thu hoạch trứng tiêm ở màng CAM

Cắt đầu quả trứng hút hết nước lấy phôi quan sát

Cắt đầu quả trứng chỉ lấy màng CAM xem nốt pock

5. Thu hoạch trứng tiêm ở xoang niệu mô

5.1. Phản ứng HA trên kính

Phản ứng này dùng để xét nghiệm nhanh các virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết

hồng cầu của một số loài.

Chuẩn bị

Huyễn dịch hồng cầu 10%.

Gốc virus Newcastle chuẩn làm đối chứng.

21

Cắt đầu quả trứng

Hút hết nước trong ở xoang niệu

mô

Thử nghiệm phản ứng HA trên kính

Xác định kích thước của virus Newcastle

Lam kính.

Nước trứng.

Thời gian xảy ra phản ứng là 1 phút.

Thực hiện`

Nước trứng ly tâm 1500- 3000 vòng/phút, lấy nước trong phía trên nhỏ một giọt nước trứng

lên lam sau đó nhỏ một giọt hồng cầu rồi trộn lẫn với nhau.

Quan sát

Nếu có sự ngưng kết hồng cầu thì trong nước trứng có virus Newcastle, kết quả dương tính

(+) và không có sự ngưng kết hồng cầu cho kết quả âm tính (-).

5.2. Xác định kích thước của virus Newcastle

Thực hiện

- Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm.

- Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên.

- Bơm kim tiêm đã hút nước huyễn dịch vào màng lọc có kích thước 0.45 µm và 0.22 µm.

- Thu dịch lọc.

Thử nghiệm phản ứng HA trên kính và ghi nhận kết quả

Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trên

kính, có 2 trường hợp xảy ra:

+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có

kích thước lớn hơn 0.45µm.

+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch

có kích thước nhỏ hơn 0.45µm. Ở trường hợp HA dương tính ứng với dịch nước đã lọc được

ở màng lọc 0.45µm, tiếp tục lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.22µm thực hiện kiểm tra

phản ứng HA trên kính.

* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn

dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm.

22

* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có

kích thước lớn hơn 0.22µm.

6. Kết quả và thảo luận

Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đỏ tươi do virus Đậu gây xuất

huyết phôi nhưng không làm chết phôi. (Hình 1)

Hình 1 : Phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM

So sánh phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM và tiêm ở xoang niệu mô

- Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu

đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu

mô thì sau 24 giờ ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi. Phôi đã chết nên không có màu

đỏ tươi. (Hình 6)

Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết

23

Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock trên màng

CAM.

Hình 3: Nốt Pock trên màng CAM

Phản ứng HA trên kính:

5 mẫu đều xảy ra phản ứng ngưng kết hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của virus Newcastle.

Hình 4: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

24

Bài 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu

(HA: Haemagglutination)

1. Nguyên lý

Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng nguyên haemagglutine, có khả năng kết hợp

với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt… nên nó làm ngưng kết các loại hồng cầu

này lại với nhau.

2. Mục đích

Xác định hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.

3. Chuẩn bị và cách tiến hành

Chuẩn bị

Huyễn dịch hồng cầu gà 1%.

Virus Newcastle.

Nước muối sinh lý 0.9%.

Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U.

Micropipette 1 đầu và 8 đầu.

Cách chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1%.

Chọn gà trống khỏe mạnh, lấy máu có chất kháng đông ở tĩnh mạch cánh.

Lấy máu gà vừa thu nhận trộn với nước muối sinh lý, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút,

loại bỏ phần nước trong bên trên, giữ lại phần hồng cầu lắng dưới đáy. Tiếp tục pha hồng cầu

với nước muối sinh lý, ly tâm. Thực hiện thao tác này đến khi nào hồng cầu được rửa thậtt

sạch (thường thực hiện thao tác ly tâm khoảng 3 – 4 lần). Lần cuối cùng loại bỏ phần nước

trong bên trên, phần hồng cầu pha với nước muối sinh lý để được hồng cầu 1%.

25

Hình 5: Hồng cầu 1%

Tiến hành

Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µl

Cho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều. sau đó lấy 50µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho

vào lỗ 2, trộn đều và cứ tiếp tục làm cho đến lỗ thứ 11, hút 50µl huyễn dịch từ lỗ thứ 11 bỏ ra

ngoài. Lỗ thứ 12 dùng làm đối chứng.

Cuối cùng cho 50µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ từ 1 đến 12, lắc đều, để yên

30 phút rồi đọc kết quả.

Ta tiến hành 3 lần lặp lại.

4. Kết quả

Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở:

Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại vị trí thứ 7 . Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó

virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64.

Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.

Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó

virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 512.

Hàng IV: từ vị trí thứ 1- 10 ( n =10), đóng nút tại vị trí thứ 11. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở

đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 1024.

Hàng V: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.

Hàng VI: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.

Kết quả: Xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” có thể do sai sót thao tác không cho huyễn dịch

virus vào lỗ nên không thể ngưng kết hồng cầu gà tạo hiện tượng đống nút.

26

Bài 3: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu

(HI: Haemagglutination inhibition)

1. Nguyên lý

Khi Newcastle gặp kháng thể đặc hiệu tuơng ứng sẽ bị kháng thể này kết hợp,không còn khả

năng gây ngưng kết hồng cầu, hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu

của virus.

Mục đích: xác định hàm lựơng kháng thể chống lại bệnh Newcastle

2. Chuẩn bị

Huyễn dịch hồng cầu gà 1%

Huyễn dịch virus newcastle pha loãng ở nồng độ n – 2 (4 đơn vị HA)

Nuớc muối sinh lý 0.9%

Huyết thanh gà thí nghiệm

Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U

Micropipette 1 đầu và 8 đầu

27

Hình 6: Kết quả phản ứng HA

3. Tiến hành

Cho nuớc muối sinh lý vào hàng thứ nhất từ lỗ thứ 1 đến 12, mỗi lỗ 50 µl.

Cho thêm 50 µl huyết thanh gà vào lỗ 1, trộn đều. Sau đó lấy 50 µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho vào

lỗ 2, trộn đều lên và cứ tiếp tục như thế cho đến lỗ thứ 10, hút 50 µl huyễn dịch ở lỗ thứ 10 bỏ

ra ngoài. Lỗ 11 dùng làm đối chứng âm, lỗ 12 dùng làm đối chứng duơng.

Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ thứ 11 mỗi lỗ 50 µl huyễn dịch virus đã pha loãng ở nồng độ 4

đơn vị HA. Để yên 10 – 15 phút

Cuối cùng cho 50 µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ từ 1 đến 12, lắc đều, để yên

30 phút rồi đọc kết quả.

4. Kết quả và thảo luận

Qua hình ảnh ta thấy:

Sự ngưng kết và đóng nút không rõ rệt. Kết quả này không được chính xác. Có thể do thao tác

pha loãng và trình tự thực hiện phản ứng HI. Do đó trong quá trình thực hiện phản ứng HI cần

phải: Sử dụng thành thạo các thao tác trong quá trình thực hiện phản ứng HI.

28

Hình 7: Phản ứng HI của Virus Newcastle

Bài 4: Qui trình tách chiết DNA tổng số và chạy PCR

1. Dụng cụ và thiết bị

Máy chạy PCR

Máy ly tâm có tốc độ cao ( khoảng 13000 vòng/10 phút)

Vortex

Máy homogenizer hay chày cối

Pipette, đầu col

Tube

2. Nguyên liệu và hóa chất

Mô gang động vật

Bộ kit gồm các dung dịch: dung dịch pED1, dung dịch pEX2, dung dịch pEX3, dung dịch

EX4, dung dịch ED5.

3. Các bước tiến hành

Bước 1: Xử lý mẫu (nghiền mẫu, ly tâm, thu dịch mô)

Nghiền mẫu: 1gram mô + 2ml PPS

Hút nước mô vào đầy 2 tube vô trùng

29

Hình 9 : Nghiền mẫu

Hinh 8: Bộ kit

Ly tâm: 13000 vòng/5 phút

Thu dịch mô

Bước 2: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu

Bước 3: Cho 200µl mẫu vào một tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1, voxtex 30s,

để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong

tube phải chuyển thành màu trắng đục. Ly tâm 13000 vòng /10 phút.

30

Hình 10: Ly tâm 13000 vòng/5 phút

Hình 11 : Thu dich mô sau khi ly tâm

a b

Hình 12: a) hút 900µl dung dịch pED1 vào tube vô trùng Hình b) hút 200µl mẫu vào tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1

Bước 4: Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào một tube vô trùng có sẵn 600µl dung dịch

pEX3. Trộn đều để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

Bước 5: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng ( hoặc xanh). Cho từ từ 900µl dung dịch EX4

vào. Ly tâm 13000 vòng /5 phút

Bước 6: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC trong 10 – 15 phút. Cho vào 50µl dung

dịch ED5.

Bước 7: Trước khi sử dụng, dung pipet trộn đều đến khi phần cặn tan hoàn toàn.

Bước 8: Bảo quản mẫu ở -20oC.

Bước 9: Lấy mẫu cho vào eppendorf cho vào máy PCR và thiết lập chương trình chạy.

Hình 13: Chạy PCR

31

Hình 13 : vortex mẫu Hình 14: mẫu sau khi vortex

Hình 14: Chu trình chạy PCR

4. Kết quả thảo luận

Bài 4: Phản ứng kết tủa và khuếch tán trên thạch

(Agar gel immunodiffustion test – AGID test)

1. Nguyên tắc

- Kháng nguyên và kháng thể khuếch tán trong thạch.

- Khi gặp nhau sẽ kết hợp tạo thành đường kết tủa trắng mờ đục.

2. Chuẩn bị

- Kháng nguyên: huyết thanh gà.

- Kháng thể đưa kháng huyết thanh gà.

32

Hình 15: Kết quả chạy điện di

- Đun cách thuỷ cho đến khi tan hết.

3. Tiến hành

- Hút 3- 4ml thạch đã nung chảy cho vào lam thủy tinh, chú ý rải thạch theo hình ziczac để

thạch chảy đểu lên mặt lam.

- Lam được để trên mặt bàn bằng phẳng cho đến khi thạch đông lại.

- Thạch phải dày khoảng 3 mm.

- Dùng ống kim loại đục 5 lỗ : 1 lỗ ở giữa thạch, 4 lỗ còn lại đặt vuông góc với nhau.

- Cho kháng nguyên vào 1 lỗ ở giữa thạch, cho kháng thể vào 4 lỗ còn lại hay có thể cho

ngược lại cho kháng thể vào 1 lỗ ở giữa, cho kháng nguyên vào 4 lỗ còn lại.

Chú ý: tùy vào độ lớn của mỗi lỗ mà ta tiêm vào 1 lượng thể tích tương ứng

- Đặt lam vào trong đĩa petri, đặt bông gòn có thấm nước xen kẽ giữa các lam nhằm tạo độ

ẩm cho đĩa..

- Ủ ở 370C.

- Đọc kết quả 2 lần: lần 1 là sau 24 giờ, lần 2 là sau 48 giờ.

Hình 16: Các lam đã tiêm kháng nguyên – kháng thể

4. Kết quả

Lần I: sau 24 giờ chưa có vầng trắng đục như mẫu đối chứng.

Kết quả: do không đủ thời gian nên chỉ có thể quan sát mẫu đối chứng dương đã được giảng

viên chuẩn bị từ trước.

33

Bài 5: Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro

1. Giới thiệu

1.1. Bệnh Gumboro

Bệnh Gumboro (Infections Brusal Disease) là bệnh thường xảy ra trên gà ở giai đoạn 1 - 12

tuần tuổi, rõ nhất là giai đoạn 3 - 6 tuần tuổi.

Tất cả các giống gà đều mắc bệnh. Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệu

chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch. Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10-50%

hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác.

a. Nguyên nhân: Do virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1.

b. Phương thức truyền lây

- Bệnh có thể lây gián tiếp qua trứng, qua không khí, hoặc thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn

nuôi nhiễm mầm bệnh.

- Bệnh lây lan trực tiếp giữa gà mang mầm bệnh và gà khỏe do tiếp xúc.

c. Triệu chứng

34

Hình 17: Phản ứng kết tủa khuếch

tán trên thạch

- Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày.

- Sau khi nhiễm bệnh gà biểu hiện triệu chứng đầu tiên là cắn mổ vào hậu môn của nhau,

biếng ăn, lông xù, lờ đờ, đi run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, loãng còn nhiều chất

nhầy sau đó chuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu môn.

d. Bệnh tích

- Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô.

- Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen.

- Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết lấm tấm hoặc cả đám, thận sưng

nhạt màu. Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề), ruột

sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong.

- Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ  5, 6, 7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ  8 thì

chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu.

1.2. ELISA

ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) có nghĩa là hấp thụ miễm dịch liên kết

với enzyme, là một phân tích sử dụng kháng thể để nhận diện protein. Ở đây kháng thể đặc

hiệu cho kháng nguyên (thường là protein ta quan tâm) được gắn vào đáy giếng. Chất mà ta

quan tâm nằm trong mẫu thử được trộn lẫn với chất chuẩn có liên kết enzyme. Khi ta cho hỗn

hợp này vào giếng thì giếng nào có chất của ta trong mẫu thử sẽ cạnh tranh với chất chuẩn làm

cho giếng đó sau khi bắt màu sẽ nhạt hơn. So kết quả đó với một giếng chuẩn chỉ có chất

chuẩn ta sẽ biết lượng chất ta quan tâm trong mẫu thử của ta là bao nhiêu. ELISA được sử

dụng nhiều trong y học, trong chẩn đoán (ví dụ có thai, ung thư...v.v), trong chẩn đoán bệnh

cho gia súc vật.

Ưu điểm của phương pháp ELISA là: độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ

kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi

mầm bệnh mới xâm nhiễm. Dùng để phát hịên nhiều loại Protein, nhận diện virut, vikhuẩn, và

một số hợp chất phân tử lượng nhỏ trong nhiều mẫu sinh học khác nhau.

2. Dụng cụ - hóa chất

- Vĩ phản ứng có phủ kháng nguyên virus gây bệnh Gumboro.

35

- Đối chứng dương : có kháng thể.

- Đối chứng âm : không có kháng thể.

- Kháng kháng thể chế từ dê có gắn enzyme (Horseradish Peroxidase Conjugate).

- Dung dịch phát hiện màu (TMB Substrate): conzurat + chất hiện màu.

- Dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution): dừng phản ứng tạo màu.

- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent) dùng để pha loãng mẫu huyết thanh.

- Nước cất hoặc nước tiệt trùng: rửa mẫu.

3. Chuẩn bị

- Bộ kit phải được để ở nhiệt độ phòng 1 giờ trước khi thực hiện phản ứng.

Mẫu

- Dùng µl pipet hút huyết thanh từ ống chích sang các tube có nắp.

- Chuẩn bị 10 tube có nắp chứa 1500µl dung dịch pha loãng.

- Hút 3µl huyết thanh từ tube chứa huyết thanh sang các tube chứa dung dịch pha loãng.

- Thực hiện pha loãng mẫu với dung dịch pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:500 (3µl huyết thanh +

1500µl dung dịch pha loãng mẫu).

Chú ý :

- Thay đầu type ở mỗi mẫu.

- Không pha loãng đối chứng.

36

Hình 18: Mẫu huyết thanh Hình 19: Mẫu huyết thanh pha loãng 1: 500

4. Tiến hành

- Ghi kí hiệu mẫu.

- Nhỏ 100µl đối chứng âm vào giếng A1 và A3.

- Nhỏ 100µl đối chứng dương vào giếng A2 và A4.

- Lần lượt nhỏ 100µl mẫu vào 10 giếng tương ứng : B3, B4, C3, C4, D3, D4, E3, E4, F3, F4.

Hình 20: Vĩ phản ứng có phủ kháng

Hình 21: Nhỏ mẫu pha loãng vào giếng nguyên virus

37

- Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

- Vẩy bỏ dung dịch bên trong các giếng.

- Rửa bằng nước cất hoặc nước tiệt trùng, 350µl/lần, quá trình rửa được thực hiện từ 3-5 lần.

- Vẩy khô.

- Nhỏ 100µl Horseradish peroxidase conjugate vào các giếng.

- Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

- Rửa nước cất hoặc nước tiệt trùng, 350µl/lần, quá trình rửa được thực hiện từ 3-5 lần.

- Vẩy khô.

- Nhỏ 100µl TMB solution vào các giếng.

- Ủ 15 phút trong chỗ tối, ở nhiệt độ phòng.

- Nhỏ 100µl Stop Solution vào các giếng để ngừng phản ứng trong các giếng.

- Đọc kết quả ở bước sóng 650nm.

5. Kết quả

Bảng 1: Kết quả phản ứng ELISA ở bước sóng 650nm

Tính toán:

Điều kiện

phản ứng:

PCx – NCx =

0.0225 < 0.075 (Không thỏa)

NCx = 0.07 >

0.015 (Không thỏa)

Do kết quả thu

được không

38

8 9 10 11 12

A 0.066 0.087 0.076 0.123(+) 0.07(-)

B 0.05 0.065 0.062 0.062(+) 0.07(-)

C 0.059 0.056 0.082 0.057 0.053

D 0.083 0.052 0.083

E

F

thỏa cả hai điều kiện trên nên ta có thể suy ra quá trình thực hiện có sai sót nên không thể tính

ra được trị số S/P chính xác như công thức:

Chỉ số S/P = (sample mean - NCx)/ (PCx - NCx)

S/P > 0.2 : dương tính (titer > 396)

S/P<0.2: âm tính

Ý nghĩa của chỉ số S/P: từ chỉ số S/P âm tính hay dương tính ta có thể xác định được hiệu

giá kháng thể titer (biểu thị khả năng bảo hộ của kháng thể trong đàn gà):

Log10 Titer = 1.09 (log10S/P) + 3.36

Thảo luận nhóm về kết quả:

Kết quả thử nghiệm ELISA sai ở 2 mẫu đối chứng dương (gần bằng đối chứng âm) có thể xảy

ra 2 trường hợp:

Cho quá ít hoặc không cho kháng nguyên chuẩn vào nên kháng kháng thể có gắn enzyme

sinh ra quá ít hoặc không có làm cho kết quả không chính xác.

Quá trình thực hiện có một số nhầm lẫn khi cho mẫu đối chứng âm vào mẫu đối chứng

dương nên kết quả của cả 2 đối chứng đều gần như nhau.

39