TRƯỜNG ĐẠI H C BÀ R Athuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19850/1/Tong-Thi-Ngoc-Be.pdf ·...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT

POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI

TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG

DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM

Chủ nhiệm đề tài: Sinh viên: Tống Thị Ngọc Bé, lớp DH15HC

GVHD: TS. Tống Thị Minh Thu

đồng hướng dẫn TS. Nguyễn Thị Tuyết

BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019

1. Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại

tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong Dược Mỹ Phẩm. Mã số:

1459/HD-BVU

2. Chủ nhiệm đề tài: Tống Thị Ngọc Bé, sinh viên lớp DH15HC, Viện: Kỹ thuật –

Kinh Tế biển, Trường: Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.

3. Nội dung chính:

- Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật

khác.

- Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp

mỏng (TLC), UV-VIS.

- Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC).

- Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho

molybdenum.

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định

đường kính vòng vô khuẩn.

4. Kết quả đạt được:

- Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là:

Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ

chiết 65 OC, thời gian: 35 phút.

- Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là

20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là

22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng

là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần.

Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%.

Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất

thấp 1,41%

- Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ

cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá

chè.

- Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các

loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ.

- Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn

Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và

Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml).

- Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất

không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết

để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế.

- Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô

phòng thí nghiệm).

5. Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019.

6. Chữ ký của CNĐT:…………………….

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ......................................................................................................... iv

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5

1.1. Giới thiệu chung về cây chè ..................................................................................... 5

1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè ................................................................ 5

1.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 5

1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam .................................................................... 6

1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè ............................................................... 6

1.1.5. Dược tính của chè ............................................................................................... 8

1.2. Polyphenol trong chè................................................................................................ 9

1.2.1. Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật. ................ 9

1.2.2. Các hợp chất Polyphenol có trong chè ............................................................. 10

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè ......... 16

1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ........................... 17

1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè ............................................................. 22

1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong

chè ................................................................................................................................... 24

1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly .......................................................................... 24

1.3.2. Các phương pháp trích ly .................................................................................. 24

1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng

của sản phẩm ................................................................................................................. 28

1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi ............................................. 28

1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ....................................................................... 30

1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly ...................................................................... 30

1.4.4. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................ 31

1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ..................................................... 31

1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh ........................................................ 32

1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính

kháng khuẩn .................................................................................................................. 33

1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn ......................................................................... 33

1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ........................................... 42

1.5. Phương pháp Sấy thăng hoa ................................................................................. 44

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................ 46

2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 46

2.1.1. Nguyên liệu chè ................................................................................................ 46

2.1.2. Chủng vi sinh vật .............................................................................................. 46

2.1.3. Hóa chất, thiết bị ............................................................................................... 46

2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis ........................ 47

2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số .................................... 47

2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic .............................................. 48

2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè ............................................ 49

2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ ............................................. 49

2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác ......................................................................... 52

2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ

enzym .......................................................................................................................... 52

2.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá............................................................. 53

2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè ............................................ 53

2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè ................................... 54

2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử .. 54

2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) .................. 56

2.4.3. Định tính bằng UV-VIS .................................................................................... 56

2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC ............................................. 57

2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè ................................................... 57

2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè ....................................... 57

2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................... 58

2.6. Khảo sát các quy trình quy trình sấy ................................................................... 61

2.6.1. Sấy nhiệt độ cao ................................................................................................ 61

2.6.2. Sấy thăng hoa .................................................................................................... 61

2.7. Nghiên cứu ứng dụng cao lá chè trong sản phẩm kem dưỡng da ..................... 62

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 64

3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè ......................... 64

3.1.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ .... 64

3.1.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym .. 65

3.1.3. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa .......... 65

3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi

polyphenol ...................................................................................................................... 66

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ............... 66

3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng .............................. 67

3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng . 68

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng ............................... 69

3.2.5. Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng ....................................... 70

3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng

trong cao chiết lá chè..................................................................................................... 71

3.4. Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác ....................................................... 72

3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách

polyphenol ...................................................................................................................... 73

3.5.1. Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol ...... 73

3.5.2. Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol ....... 74

3.6. Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol

tổng ................................................................................................................................. 75

3.7. Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ..................................... 76

3.7.1. Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử ......................................... 76

3.7.2. Định tính bằng TLC .......................................................................................... 77

3.7.3. Định tính bằng UV – VIS ................................................................................. 78

3.7.4. Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC ...................................................... 79

3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè .................................................. 80

3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa ................................................................................. 80

3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn ...................................................................................... 82

3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè .............................. 85

3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao

chiết lá chè .................................................................................................................. 86

3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè ...................................................................... 87

3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da ................................................................... 89

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 92

4.1. Kết luận ................................................................................................................... 92

4.2. Kiến nghị ................................................................................................................. 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 94

i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C Catechin

CG Catechingallate

CK Chất Khô

DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl

EC Epicatechin

ECG Epicatechingallate

EGC Epigallocatechin

EGCG Epigallocatechingallate

GC Gallocatechin

GCG Gallocatechingallate

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MIC Minimum inhibitory concentration

TLC Sắc ký lớp mỏng

UV Vùng tử ngoại

VIS Khả kiến

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu ............................................................. 21

Bảng 3. 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 64



Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng .......... 66

Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng ......................... 67

Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol

tổng ................................................................................................................................ 68

Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .................. 69

Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng .................................. 70

Bảng 3. 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá .................................. 71

Bảng 3. 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác ......................................................... 72

Bảng 3. 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách

polyphenol ..................................................................................................................... 73

Bảng 3. 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách

polyphenol ..................................................................................................................... 74

Bảng 3. 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol ........................... 76

Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất ................................................. 77

Bảng 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol .............................. 78

Bảng 3. 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế ................................. 78

Bảng 3. 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol ....................................................... 79

Bảng 3. 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................. 80

Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ ............................... 81

Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ .................................................. 81

Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè ............................................... 83

Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol ................................. 86

Bảng 3. 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da ................................................ 90

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT ........................................ 5

Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của catechin .................................................................... 11

Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG ................................................................. 11

Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của ECG ......................................................................... 13

Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) ......................................................... 13

Hình 1. 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin ........................................................... 14

Hình 1. 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin ........................................... 16

Hình 1. 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi ............................................... 34

Hình 1. 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi ............................................... 35

Hình 1. 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi ...................................................... 37

Hình 1. 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi ................................... 38

Hình 1. 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi .............................. 41

Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý ..................................................................................... 50

Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách ......................................................................................... 51

Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS ......................................................................................... 51

Hình 2. 4: Hệ thống cô quay chân không ...................................................................... 51

Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme ........................................................................ 53

Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................... 57

Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá ..................................................................... 58

Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 59

Hình 2. 9: Tủ sấy nhiệt độ cao ....................................................................................... 61

Hình 2. 10: Thiết bị sấy thăng hoa ................................................................................ 62

Hình 3. 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 64

Hình 3. 2: Đường chuẩn axit gallic ............................................................................... 64



Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng ................ 66

iii

Hình 3. 6: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol tổng ............... 68

Hình 3. 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng

polyphenol tổng ............................................................................................................. 69

Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .............. 70

Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng ........ 71

Hình 3. 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá .................................................. 72

Hình 3. 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng

polyphenol tổng ............................................................................................................. 73

Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng

....................................................................................................................................... 74

Hình 3. 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng

....................................................................................................................................... 74

Hình 3. 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat ........................ 75

Hình 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol ............................... 76

Hình 3. 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm ............................. 77

Hình 3. 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế .............. 79

Hình 3. 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ........................................................ 80

Hình 3. 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá ......................................................... 81

Hình 3. 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ ................................................... 82

Hình 3. 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè .................... 83

Hình 3. 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè ............................. 84

Hình 3. 24: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol ..... 85

Hình 3. 23: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol .............. 86

Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa ....................................................... 87

Hình 3. 25: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè .............................................................. 90

iv

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1. 1: Phân loại polyphenol ................................................................................... 10

Sơ đồ 1. 2: Quy trình tinh chế polyphenol .................................................................... 32

Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết tách polyphenol .................................................................. 49

Sơ đồ 2. 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol........................................................................... 54

Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu

Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học

GVHD: Tống Thị Minh Thu 1 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây chè là sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta, theo thống kê của

Hiệp hội Chè Việt Nam, khối lượng xuất khẩu chè tháng 8 năm 2017 ước đạt 13 nghìn

tấn đưa khối lượng xuất khẩu chè 8 tháng đầu năm 2017 ước đạt 90 nghìn tấn. Đối với

tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu có thuận lợi về khí hậu và địa hình nương rẫy, phù hợp cho diện

tích trồng chè lớn.[77]

Ngành công – nông nghiệp và thương mại chè đã giải quyết công

ăn việc làm cho hàng triệu lao động, đặc biệt ở các vùng khó khăn, vùng trung du đồi

núi. Theo thống kê của Tổng cục hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kim ngạch

xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD. Điều này cho thấy,

sản phẩm chè Việt Nam đã có chỗ đứng trên thị trường thế giới và đã có đóng góp

không nhỏ vào nền kinh tế nước nhà. Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè và các sản

phẩm từ chè Việt Nam hiện nay chưa tương xứng với tiềm năng của nó, đời sống

người trồng và chế biến chè vẫn khó khăn do giá trị sản phẩm thấp. Do vậy, cần đẩy

mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến,

đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (polyphenol)

nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Việt Nam.

Nhiều kết quả ngiên cứu cho thấy hợp chất trong chè xanh có hoạt tính sinh học

như: hoạt tính chống oxy hóa, chống xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch,

ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm.[78]

Liên quan đến hoạt tính sinh học, Fumio và cộng sự [35]

đã chỉ ra rằng, khả năng quét

gốc tự do DPPH của các catechin chè cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3

đến 11,8 lần vitamin C. Ngoài ra, hoạt tính này của chè xanh cũng cao gấp 1,4 lần so

với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương.[70]

Gần đây, khi so sánh khả năng quét gốc tự do DPPH của chè vàng (một loại chè bán

lên men) với một số đối tượng khác, Barhe và Tchouya[23]

cũng chỉ ra rằng, hoạt tính

này của chất chiết chè vàng > chất chiết đỗ tương > vang đỏ > hibiscus. Bên cạnh hoạt

tính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol (chất

chiết chè) có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối

hỏng thực phẩm.[21][49]

Điều này cho thấy, đối tượng này không chỉ có tiềm năng ứng

dụng cao trong mỹ phẩm, dược phẩm mà còn mở ra những ứng dụng quan trọng trong




chè như một chất bảo quản tự nhiên không độc hại. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong

bối cảnh hiện nay,khi tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang ngày càng trở lên

trầm trọng, mất kiểm soát ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.

Có thể thấy, mặc dù việc nghiên cứu chiết xuất polyphenol trong lá chè xanh

cũng như việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học của chúng đã được báo cáo. Tuy

nhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quả

chiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó áp

dụng trong điều kiện Việt Nam hiện nay như trích ly có hỗ trợ vi sóng hay trích ly

dùng sóng siêu âm, nhiều công trình nghiên cứu và khai thác hoạt tính sinh học của

Polyphenol từ chè xanh, nhưng ở Việt Nam vấn đề này còn khá mới mẻ, nhất là hoạt

tính kháng khuẩn. Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóa

học có hoạt tính sinh học có trong lá chè xanh vẫn cần phải được nghiên cứu sâu hơn

và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường, đặc biệt đối với những khu vực

có trữ lượng trà xanh lớn như các nước Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ.... Vì vậy;

trong nghiên cứu này này, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách hợp chất

POLYPHENOLS ứng dụng trong Dược - Mỹ Phẩm và Thực phẩm từ lá Chè Xanh

được trồng tại xã Suối Nghệ - huyện Châu Đức - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu” nhằm tìm ra

phương pháp chiết tách polyphenol phù hợp ở điều kiện Việt Nam và khảo sát hoạt

tính sinh học của chúng với nguồn chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Từ đó nghiên

cứu ứng dụng của chúng làm mặt nạ dưỡng da nhằm giải quyết các vấn đề: Lợi ích

kinh tế cho người trồng chè, khai thác triệt để hoạt tính sinh học của polyphenol, tạo ra

sản phẩm đẹp da, chất lượng tốt và an toàn.

2. MỤC TIÊU

- Xây dựng được quy trình chiết tách các hợp chất polyphenol từ lá chè xanh.

- Tính chất hóa lý, định tính, định lượng polyphenol trong lá chè.

- Đánh giá được khả năng oxy hóa và kháng khuẩn của polyphenol trong lá chè

- Ứng dụng cao polyphenol trong các sản phẩm làm đẹp da.

3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này các nội dung được giới hạn như sau:

- Đối với lá chè khảo sát: chúng tôi sử dụng chè trồng tại xã Suối Nghệ, huyện Tân

Thành, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.




- Đối với nghiên cứu chiết tách polyphenol: phương pháp trích ly bằng dung môi

được chúng tôi sử dụng. Do đây là phương pháp khá đơn giản, có khả năng cho

hiệu suất thu hồi cao. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng chỉ đòi hỏi đầu tư vừa

phải, dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ, phù hợp với điều kiện Việt

Nam.

- Đối với xác định hoạt tính oxy hóa: Xác định lực kháng oxy hoá tổng (total

antioxydant capacity) theo mô hình phospho molybdenum.[56]

- Đối với hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác

định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên 5 chủng vi khuẩn Escherichia

coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và

Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp

Thành Phố Hồ Chí Minh.

- Đối với nghiên cứu ứng dụng chất chiết polyphenol chè trong dược mỹ phẩm:

Nghiên cứu trên 2 dòng sản phẩm Mặt nạ dưỡng da và kem dưỡng da từ trà xanh.

Các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa

Vũng Tàu.

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác.

- Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng

(TLC), UV-VIS.

- Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum.

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường

kính vòng vô khuẩn.

5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

5.1. Ý nghĩa khoa học

- Kết quả của đề tài tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng

các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng hàm lượng polyphenol

tổng số, các catechin thành phần) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxi

hóa, kháng khuẩn), so sánh hàm lượng polyphenol tổng số của các loại chè non, chè

già..của giống chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Các dữ liệu khoa học này là nguồn




tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu và khai thác chè ở tỉnh Bà Rịa Vũng

Tàu nói riêng và Việt Nam nói chung.

- Kết quả nghiên cứu công nghệ trích ly polyphenol từ lá chè đã bổ sung thêm

các thông tin khoa học quan trọng cho biết ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến

hiệu suất thu hồi polyphenol lá chè. Đây là nguồn thông tin khoa học hữu ích trong

việc nghiên cứu và triển khai sản xuất bột chiết polyphenol từ chè xanh nguyên liệu.

- Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của enzym cenlulozo, pectinase tới

hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài góp phần nâng cao giá trị của cây chè ở nước ta, đồng thời góp phần cải

thiện đời sống người nông dân.

- Sản phẩm của luận án tinh chế polyphenol tạo ra các sản phẩm thực phẩm, thực

phẩm chức năng, dược phẩm và mỹ phẩm.

6. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu tổng thể và đánh giá về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh

học là polyphenol tổng số của giống chè ở Suối Nghệ, Bà Rịa Vũng Tàu.

- Việc sử dụng hệ dung môi etanol nước trong trích ly polyphenol từ lá chè, đã đề

xuất được quy trình công nghệ chiết tách chế phẩm polyphenol cho hiệu suất thu hồi

và chất lượng chế phẩm cao (bao gồm độ tinh sạch và khả năng kháng oxy hóa, kháng

khuẩn). Với quy trình này, việc chuyển giao cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ ở Việt

Nam là hoàn toàn khả thi và thuận lợi, không phải đầu tư lớn, tận dụng được nguồn

phụ phẩm chế biến chè.

- Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của 2 loại enzym cenlulozo và pectinase đối với

hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè.

- Nghiên cứu ứng dụng trong các sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên. Thúc

đẩy nền công nghiệp Mỹ phẩm sản xuất hàng Việt Nam chất lượng cao.




CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè

Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis (L) O. Kuntze được phát hiện bởi

người Trung Quốc vào khoảng 2700 TCN. Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho rằng, cây

chè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núi

phía Bắc Việt Nam [6]

. Chè phân bố khá rộng, trong những điều kiện tự nhiên rất khác

nhau, từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 43 độ vĩ bắc (Grudia), tập trung ở vùng

nhiệt đới và á nhiệt đới. [9]

Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT

1.1.2. Phân loại

Cây chè thuộc: Ngành hạt kín (Angiospermae), Lớp song tử diệp

(Dicotyledonae), Bộ chè (Theales), Họ chè (Theaceae), Chi chè (Camellia) và Loài

(Camellia (Thea) sinensis). Hiện nay, chè được chia thành 4 giống chính:[9]

* Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. bohea)

Thuộc loại cây bụi thấp, phân cành nhiều, lá nhỏ (dài 3,5 – 6,5 cm), dày nhiều

gợn sóng, màu xanh đậm, răng cưa nhỏ, không đều. Giống này có đặc điểm năng suất

thấp, chất lượng trung bình nhưng khả năng chịu rét tốt. Phân bố chủ yếu ở miền

Đông, Đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác.

* Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. macrophylla)




Cây thuộc loại thân gỗ nhỡ, cao tới 5 m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên. Lá

to trung bình, màu xanh nhạt, bóng, răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn. Giống có

đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt. Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung

Quốc).

* Chè Shan (Camellia sinensis var. shan)

Cây thuộc loại thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m. Lá to, màu xanh nhạt, đầu lá dài,

răng cưa nhỏ và dày. Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết nên còn

gọi là chè tuyết. Giống có đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng thích

ứng trong điều kiện ấm ẩm, phát triển tốt ở vùng có địa hình cao. Nguyên sản ở Vân

Nam - Trung Quốc, miền bắc của Miến Điện và Việt Nam.

* Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. assamica):

Thân gỗ cao tới 17 m, phân cành thưa, lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có

màu xanh đậm, dạng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài. Giống này thuộc

loại có năng suất cao, phẩm chất tốt nhưng không chịu được rét hạn. Giống được trồng

nhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng khác.

1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Năm 2012, Việt Nam đã vươn lên hàng thứ sáu thế giới về diện tích (115.964

ha), thứ năm về sản lượng chè (216.900 tấn), chỉ đứng sau Trung Quốc, Ấn Độ,

Srilanka, Kenya và tương đương Indonesia. Trong 15 năm, từ 1995 – 2010, diện tích

chè của nước ta đã tăng 2,2 lần từ 52.100 ha lên 113.200 ha, sản lượng tăng 4,94 lần từ

40.200 tấn lên 198.466 tấn.[79]

Theo ước tính của Hiệp hội chè Việt Nam, cả nước hiện có khoảng 6 triệu lao

động sống dựa vào ngành công – nông nghiệp trồng và chế biến chè, và 116 doanh

nghiệp tham gia xuất khẩu chè, hàng năm thu về gần 200 triệu đô la, đóng góp không

nhỏ vào sự phát triển chung của nền kinh tế nước nhà.

Về các giống chè ở Việt Nam, bên cạnh giống truyền thống (Trung du), hiện

chúng ta đã chọn lọc và lai tạo được khá nhiều giống mới.

1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè

1.1.4.1. Nước

Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè, thường chiếm từ 75 - 82% trọng

lượng búp. Hàm lượng nước trong búp thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ




thuật canh tác và tiêu chuẩn thu hái....[4]

1.1.4.2. Tannin chè

Tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của gallic acid và digallic acid ở dạng tự do

cũng như kết hợp với glucose. Đây là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật và

được chia làm hai dạng: tannin thủy phân (tannin pyrogallic) và tannin không bị thủy

phân (tannin pyrocatechin). Tannin trong chè tồn tại ở cả hai dạng trên nhưng chủ yếu

là dạng pyrocatechin. Pyrocatechin là hỗn hợp polymer của catechin và

leucoanthocyanidin.[10]

Hàm lượng tannin trong chè vào khoảng 32-40% CK, phụ

thuộc vào giống, độ non già của lá, mùa vụ thu hoạch và chế độ canh tác.[9]

1.1.4.3. Polyphenol

Polyphenol là thành phần quan trọng nhất, quyết định chính đến màu sắc,

hương vị và tính chất dược lý của nước chè pha. Thành phần chính của polyphenol chè

là các hợp chất catechin. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của polyphenol chè

không giống nhau mà thay đổi theo từng giống, tiêu chuẩn và mùa vụ thu hái, điều

kiện vĩ độ, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác,..

1.1.4.4. Alkaloid

Trong chè có nhiều loại alkaloid nhưng nhiều nhất là caffeine. Hàm lượng

caffeine trong chè vào khoảng 2 - 4% CK, thay đổi theo giống, độ non già của lá, thời

vụ thu hoạch và điều kiện canh tác. Caffeine có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung

ương, hoạt động của thận, của tim và có tác dụng lợi tiểu.[9]

1.1.4.5. Amino acid và protein

Trong chè, protein chiếm khoảng 18% CK và có khoảng 17 loại amino acid.

Protein trong lá chè chủ yếu là dạng glutelin hoà tan trong kiềm. Trong quá trình chế

biến, protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị của

nước chè pha.[4]

1.1.4.6. Carbohydrate

Glucid trong chè rất đa dạng, bao gồm các monosacharide (chiếm khoảng 1 -

2%) và các polysaccharide (chiếm 10 – 12%). Ở chè, các dạng đường tan trong nước

có hàm lượng không nhiều nhưng rất cần thiết cho việc hình thành chất lượng đặc

trưng của chè thành phẩm.[4]




1.1.4.7. Tinh dầu

Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè tươi vào khoảng

0,007 – 0,009% và trong chè bán thành phẩm khoảng 0,024 – 0,025%. Hàm lượng này

phụ thuộc nhiều vào giống và độ cao trồng trọt.[9]

1.1.4.8. Vitamin

Có nhiều loại vitamin trong chè. Chính vì vậy, giá trị dược liệu cũng như giá trị

dinh dưỡng của chè rất cao. Hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000 g

chất khô như sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,7; B2: 12,2; PP: 47,0; C: 27,0 v.v... Đáng

chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4

lần.[4]

1.1.4.9. Enzyme

Trong búp chè có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ yếu gồm hai nhóm chính:

nhóm thủy phân (amylase, glucosidase, protease...) và nhóm oxi hóa khử (peroxidase

và polyphenoloxidase). Các enzym này đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế

biến chè.[4]

1.1.4.10. Chất tro

Hàm lượng tro trong chè tươi vào khoảng 4 - 5% CK và lên tới 5 - 6% CK

trong chè thành phẩm. Các chất khoáng có nhiều trong chè là K, Se, Mn, Zn...[4]

1.1.5. Dược tính của chè

Chè là loại nước uống tốt nhất trên thế giới, mọi người điều biết chè đã được sử

dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu. Căn cứ vào các

sách đông y dược, ghi chép qua các thời đại và thực tiễn chứng minh chẳng những bảo

vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị nhiều loại bệnh, nên người ta coi chè là loại

thuốc chữa bệnh.

Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác đông của lá chè mới được bắt đầu nghiên

cứu mạnh mẽ trong thế kỉ 20. Trước đây tác dụng của trà được cho rằng do tác động

của các thành phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ

20, việc nghiên cứu chi tiết về chè đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của

chè là do sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất như; alcoloid: caffeine, theophyllin,

theobromin, purin. Các flavonoid, chất catechin, lipid, dẫn chất phenol, tinh dầu, các

acid amin và nhiều sinh tố cùng các nguyên tố hằng lượng và vi lượng như P, sắt, iod,




Mg, Cu….tổng cộng trên 300 loại thành phần. các thành phần này có tác dụng trọng

yếu trong phòng và chữa bệnh đối với cơ thể con người.

Một số tác dụng cụ thể của trà:

- Tinh thần nâng cao, đầu óc tỉnh táo: khi đầu óc xây xẩm, tinh thần mệt mỏi,người

ta uống một chén chè mới pha, sẽ cảm thấy tinh thần sảng khoái.

- Thanh lợi đầu và mắt: uống trà lâu dài có thể thanh lợi đầu và mắt, đạt tác dụng

làm tinh thần sảng khoái, mắt tinh, tai sáng. Trong trà có chứa nhiều thành phần

dinh dưỡng có quan hệ tới thị lực như là: tiền sinh tố A ( β − caroten ), vitamin B1,

B2, và C, đều là những chất cần thiết duy trì thị lực.

- Tiểu thử giải khát: sau khi uống trà nóng, tinh dầu thơm trong trà và caffeine mau

phát huy tác dụng, làm giãn huyết quản, mở tuyến mồ hôi, thân thể hơi toát mồ

hôi, tán phát nhiệt lượng trong cơ thể, do đó đạt được mục đích tiêu thử giáng thấp

thanh nhiệt, sau khi uống trà nóng gia tăng được lượng nước tiểu, làm cho tiểu tiên

bài tiết điều hòa, tự nhiên sẽ có bộ phận nhiệt lượng thoe đường tiểu tiện tiết ra

ngoài, làm cho ra mồ hôi. Ngoài ra, làm co dãn cơ trơn dạ dày, ruột giãn giải co

thắt trường vị, cho nên uống trà điều trị được thử nhiệt, sa khí, đau bụng.

- Giảm béo: chè xanh chứa nhiều thành phần như chứa chất dẫn phenol, flavonoid,

quereetin cùng nhiều loại sinh tố, nhất là vitamin C với lượng lớn. dẫn chất phenol

trong lá chè giáng giải chất mỡ, flavonoid, quereetin hỗ trợ việc giáng thấp

cholesterol. Vitamin C hỗ trợ lợi tiểu làm cholesterol bài tiết ra ngoài nhanh

chóng. Các vitamin khác cải thiện cơ năng chuyển hóa của cơ thể, hỗ trợ và để

phòng mạch máu bị xơ cưng. Trong lá chè có diệp lục (chlorophyll ) sau khi vào

cơ thể, sẽ loại cholesterol từ thức ăn, ngăn cản tiêu hóa hấp thụ cholesterol trong

cơ thể.

Ngoài ra còn trà còn rất là nhiều công dụng khác như sử dụng trong mỹ phẩm,

vì chúng có tác dụng làm ẩm da và chống nếp nhăn, có trong thuốc đánh răng có tác

dụng diệt khuẩn.

1.2. Polyphenol trong chè

1.2.1. Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật.

Các hợp chất phenol là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật, rất đa dạng

về cấu trúc và chức năng. Trong cây, nhìn chung hàm lượng của chúng ở các bộ phận




khác nhau là khác nhau. Các phenol không hòa tan trong nước (lignin,

hydroxycinnamic acid...) thường là thành phần của thành tế bào, trong khi loại hòa tan

thường cư trú ở không bào.[73]

Sơ đồ 1. 1: Phân loại polyphenol

1.2.2. Các hợp chất Polyphenol có trong chè

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong

chè. Nhờ các hợp chất này mà chất chiết từ chè xanh có những đặc tính quý giá như

khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, giảm cholesteron trong máu…

Các hợp chất polyphenol trong chè chủ yếu là các hợp chất flavonoid, trong đó chia

thành 5 nhóm chính:

• Hợp chất catechin

• Hợp chất anthoxanthin

• Hợp chất anthocyanin

• Hợp chất leucanthocyanidin

• Các axit phenol cacboxylic và một số chất khác

1.2.2.1. Hợp chất catechin

Trong các loại thực vật, catechin thường tồn tại ở trạng thái tự do hoặc ở dạng

este với axit gallic. Catechin trong chè thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3- ol, là thành

phần chính của polyphenol chè. Đồng thời nó cũng có vai trò quyết định trong hoạt

tính sinh học và tính chất cảm quan của nước chè pha.[21], [49]

Catechin có công thức

cấu tạo chung như sau:




Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của catechin

Trong các hợp chất catechin, R1 và R2 có thể cùng là nguyên tử H-, R2 có thể là

gốc galloyl, R1 cũng có thể là gốc –OH.

Khi R1 = R2 = H ta có catechin (C); khi R1 = H, R2 = OH ta có gallocatechin

(GC). Khi R2 là gốc galloyl, còn R1 là OH thì chất trên sẽ là catechingallate (CG) và

nếu R2 là gốc galloyl, còn R1 là H thì chất tạo thành là gallocatechingallate (GCG).

Bên cạnh đó, cấu trúc phân tử của catechin có phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng

6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2; 3; 4, hình thành một dị

vòng C chứa một nguyên tử oxy. Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở

vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2; 3 và nhóm 4-oxo nên có thể tạo ra nhiều

đồng phân khác nhau. Hiện nay đã nhận diện được 7 catechin trong chè là

Epigallocatechingallate (EGCG), Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin (EGC),

Gallocatechingallate (GCG), Epicatechin (EC), Gallocatechin (GC) và Catechin (C).

Trong đó, các catechin chủ yếu là EGCG, EGC, ECG, EC và C.[18]

Hàm lượng

catechin trong chè có thể lên đến 15 - 20 % CK và thường chiếm trên 70 % tổng lượng

polyphenolcủa lá chè.[10]

EGCG

Đây là thành phần chính trong các hợp chất catechin của chè, công thức phân tử

C22H18O11, không màu, kết tinh hình kim nhỏ, vị chát hơi đắng, có khả năng kết tủa

với gelatin, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate...[4]

Trong công thức cấu tạo, R2 là nhóm –OH và R1 là gốc galloyl.

Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG




Do trong công thức phân tử vừa có gốc galloyl, vừa có 3 nhóm –OH ở vòng B

nên EGCG được cho rằng có cấu trúc phân tử và các trung tâm hoạt động chống oxi

hóa hiệu quả nhất trong các catechin chè. Khi nghiên cứu hiệu quả quét gốc tự do

DPPH của catechin và các dẫn xuất của nó, Nanjo và cộng sự [52]

đã chỉ ra rằng, hiệu

quả quét gốc tự do của các catechin được galloyl hóa (EGCG, ECG, CG) mạnh hơn

nhóm không có gốc galloyl (C, EC, GC, EGC) và các catechin mà vòng B có 03 nhóm

–OH thì hiệu quả hơn so với các catechin chỉ có 2 nhóm -OH. Tuy nhiên các tác giả

cũng chỉ ra rằng, ngoài đặc tính cấu trúc thì mức độ phân cực, trạng thái ion hóa và cấu

hình không gian cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả kháng oxi hóa của các hợp chất

này.

Về hàm lượng EGCG trong lá chè, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng

này phụ thuộc rất lớn vào giống chè, độ non già của lá và mùa vụ thu hoạch.[22]

[27]

Lin

và cộng sự [44]

đã phân tích 10 giống chè Đài Loan vào vụ hè (chiết bằng nước ở

700C/30 phút, tỷ lệ chè/nước là 1/10) cho kết quả trung bình về hàm lượng EGCG là

2,6 ± 0,2% CK. Tuy nhiên hàm lượng này lên tới 9,1 đến 12,9% CK trong búp chè tại

Australia.[74]

EGC

Trong chè, EGC là thành phần catechin có hàm lượng đứng thứ 2, chỉ sau

EGCG. Thành phần này có công thức phân tử C15H14O7, kết tinh hình kim nhỏ không

màu, vị chát mạnh nhưng có vị ngọt, không tác dụng với gelatin, tan trong nước và

ethylacetate, dễ tan trong acetone.[4]

Trong lá chè, hàm lượng EGC thay đổi theo giống, độ non già của lá và mùa vụ

thu hoạch.[27][74]

Với thành phần này, Lin và cộng sự [44]

thu được kết quả 1,1 ± 0,1%

CK, trong khi nó lên tới 3,6 đến 5,2% CK trong nghiên cứu của Yao và cộng sự

(2005).[74]

ECG

Epicatechingallate là thành phần có hàm lượng thường đứng thứ 3 sau EGCG

và EGC. Đây là một trong các catechin được galloyl hóa. Trong công thức cấu tạo, gốc

galloyl được gắn vào vị trí C3 ở vòng C (hình 1.4). Cấu tử này có công thức phân tử

C15H18O10, kết tinh hình kim nhỏ không màu, vị chát hơi đắng, tác dụng với gelatin

cho kết tủa màu trắng, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate...[4]




Hàm lượng ECG cũng thay đổi tùy theo giống chè, độ non già của lá và mùa vụ

thu hoạch. Kết quả nghiên cứu của Lin [44]

và Yao [74]

về hàm lượng catechin này là 1,1

± 0,1% CK và từ 3,2 đến 4,1% CK tương ứng.

Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của ECG

EC và C

Đây là 2 cấu tử catechin có hàm lượng thấp nhất trong các catechin chè. Công

thức phân tử của nó là C15H11O6, ở dạng tinh khiết không màu, kết tinh hình lăng trụ,

chát dịu có dư vị ngọt, không kết tủa với gelatin, khó tan trong nước lạnh nhưng dễ tan

trong nước nóng, ethanol, acetone...[4]

Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B)

Cũng giống như các thành phần khác, hàm lượng EC và C thay đổi theo giống,

độ non già của lá... [74]

Kết quả phân tích của Lin và cộng sự [44]

trong 10 giống chè Đài

Loan cho hàm lượng trung bình của chúng là 0,33% và 0,13% CK tương ứng.

Tính chất của các hợp chất catechin có trong chè

Các hợp chất catechin trong lá chè đã được tách ra từng chất ở dạng tinh khiết,

ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu, hình kim hoặc hình lăng trụ, có vị

chát ở mức độ khác nhau, riêng hai chất L-EGC và este gallat của nó có vị chát hơi

đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng thành các catechin.

Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, axeton, etyl axetat tạo

dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít




phân cực như benzen hoặc clorofooc.

Các catechin tác dụng với FeCl3 cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo

số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử. Các catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bị

oxy hóa bởi dung dịch KMnO4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môi

trường kiềm, chúng có thể tự oxy hóa trong không khí ẩm. Dưới tác dụng của các men

oxy hóa khử hoặc nhiệt độ cao, các chất catechin bị oxy hóa và tiếp đến sản phẩm oxy

hóa trung gian của chúng lại gây ra hàng loạt các biến đổi hóa học làm chuyển hóa các

chất có trong lá chè, góp phần tạo ra các chất thơm đặc trưng cho các loại chè.

1.2.2.2. Hợp chất anthoxanthin (flavonol)

Các hợp chất anthoxanthin trong chè đã được nhận dạng là kaempferol,

quercetin và myricetin. Các hợp chất này thường tồn tại ở cả dạng tự do và kết hợp

(dạng glycoside). Hàm lượng anthoxanthin trong chè rất thấp nếu so sánh với các

catechin. Trong giống chè Trung Quốc, chúng chỉ dao động từ 0,4 – 1,5% CK.[4]

Chúng có công thức cấu tạo chung như sau [7]:

Hình 1. 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin

Trong đó:

- Nếu R1 = R3 = (-H); R2 = (-OH): ta có chất Kaempferol.

- Nếu R1 = R2 = (-OH); R3 = (-H): ta có chất Quercetin.

- Nếu R1 = R2= R3 = (-OH): ta có chất Myricetin.

Các anthoxanthin trong lá chè tươi tồn tại cả hai dạng tự do và kết hợp, hơn nữa

các glycosid của chúng thường đính gốc đường tại vị trí thứ 3.

1.2.2.3. Hợp chất anthocyanin

Hợp chất anthocyanin thuộc nhóm flavonoid dẫn xuất croman. Trong thực vật,

hầu như các hợp chất anthocyanin đều tồn tại ở trạng thái kết hợp với các gốc đường

(glycosid).

Tất cả các anthocyanin đều có chứa trong vòng pyran oxy hóa trị tự do.




Ở trạng thái tự do, anthocyanin gồm 3 aglycon chủ yếu là pelargonidin, cyanidin và

delphinidin.

Các glycosid của anthocyanin được tạo thành do gốc đường glucoza,

galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglycon có màu gọi là anthocyanidin. Do đó,

khi thủy phân các glycosid của anthocyanin thì được đường và anthocyanidin.[6][7]

Chúng tan trong nước và có trong dịch bào thực vật, có vị đắng và màu sắc thay đổi

phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: hàm lượng catechin và anthoxanthin, nhiệt độ dung

dịch và nồng độ của chúng. Nhìn chung, các giống chè có búp màu tím thường hàm

lượng anthocyanin cao hơn búp màu xanh.[4]

1.2.2.4. Phenol carbocylic acid

Axit phenol cacboxylic là nhóm chất tự nhiên có trong thực vật, trong phân tử

có chứa nhóm phenol và nhóm cacbonyl.

Trong lá chè tươi có nhiều acid hữu cơ như: gallic acid, ellagic acid,

methadigallic acid, chlorogenic acid, cafeic acid, para-coumaric acid, galloylquinic

acid. Tuy nhiên hàm lượng của chúng không cao. Trong các acid này, gallic acid có

vai trò quan trọng trong việc hình thành chất chát và hoạt tính kháng oxi hóa của dich

chiết chè [4]

. Fernandez và cộng sự [33]

đã phân tích hàm lượng gallic acid trong 12 mẫu

chè xanh có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, các tác giả cho biết hàm lượng

này rất thấp, chỉ dao động từ 0,004% CK đến 0,12% CK.

1.2.2.5. Hợp chất leucoanthocyanin

Hợp chất leucoanthocyanin là sự kết hợp của các gốc aglycol với gốc đường

(glycosid). Các leucoanthocyanin trong thành phần polyphenol chè thường gặp là

leucoxyanidin và leucodelphinidin. Chúng tồn tại ở cả trạng thái tự do và dạng

glycoside. Hàm lượng của chúng trong lá chè tươi cũng rất ít nếu so sánh với các

catechin. Các leucoanthocyanin là dạng trung gian giữa catechin và anthocyanin.[4]




Hình 1. 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè

Giống chè: Hàm lượng polyphenol/catechin phụ thuộc rất lớn vào giống chè.

Nhìn chung, chè Ấn Độ (Asammica) thường có hàm lượng polyphenol cao hơn giống

chè Trung Quốc (Sinensis).[9]

Wu và cộng sự [71]

cho biết, hàm lượng catechin tổng số

trong 04 giống chè Trung Quốc (Ziya, Wuniuzao, Huangyezao, Fudingdabaicha) dao

động từ 11,4% CK đến 22,5% CK. Ở Việt Nam, Vũ Hồng Sơn và Hà Duyên Tư [7]

đã

chỉ ra rằng, hàm lượng polyphenol tổng số của giống chè Shan > PH1 > Trung du >

LDP1. Nhìn chung hàm lượng này trong lá non thu hái vụ đông dao động trong

khoảng từ 17,5 – 19,6% CK.

Độ non già của nguyên liệu: Độ non già của lá chè có ảnh hưởng rất lớn đến

hàm lượng polyphenol. Nhìn chung, lá càng non hàm lượng polyphenol/catechin càng

lớn. Trong một búp chè, hàm lượng này giảm theo thứ tự: lá 1 > lá 2 > lá 3 > cuộng.[10]

Trong nghiên cứu của Baptista và cộng sự,[22]

hàm lượng polyphenol tổng số đạt

18,5% CK trong búp 1 tôm 2 lá, trong khi nó chỉ là 11,5% CK trong các lá bánh tẻ và

già (hỗn hợp từ lá thứ 3 đến lá thứ 8).

Mùa vụ thu hoạch: Sự tổng hợp tannin hay polyphenol trong lá chè chịu ảnh

hưởng rất lớn bởi cường độ chiếu sáng, khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng

này tăng và ngược lại.[9][74]

Do vậy trong một năm, hàm lượng polyphenol trong lá chè

thường đạt cực đại vào mùa hè và thấp hơn ở mùa thu và mùa xuân.

Chế độ canh tác: Dinh dưỡng cho cây chè cũng ảnh hưởng đến hàm lượng

tannin và polyphenol trong nguyên liệu. Nhìn chung, khi tăng lượng bón phân đạm thì

hàm lượng polyphenol trong lá chè giảm và hàm lượng này tăng khi tăng lượng lân và

ka li.[17]

Ngoài các yếu tố trên thì hàm lượng polyphenol trong lá chè cũng chịu ảnh

hưởng của các yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu, tuổi cây...[45]

Nguyễn Văn Chung và

Trương Hương Lan [2]

đã khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số trong chè xanh tại

Phú Thọ, Thái Nguyên và Lâm Đồng, các tác giả cho biết hàm lượng này đạt trung

bình 14,8% CK, 18,5% CK và 18,8% CK tương ứng.




1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè

1.2.4.1. Phương pháp định tính bằng thuốc thử

- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger.

- Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann –

Burchard, Rosenthaler,...

- Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner.

- Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc.

- Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt.

Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid

Phản ứng Borntraeger

Nguyên tắc: Trong thiên nhiên các hợp chất Anthranoid có thể tồn tại dưới dạng

oxy hoá (Anthraquinone) hoặc dạng khử (Anthranol, Anthrone), dạng tự do (aglycone)

hoặc dạng kết hợp (glycoside). Các hợp chất Anthranoid khi tác dụng với kiềm

(amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolate có màu

đỏ tím.

Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid

Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên,

cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường

hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh

tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc

nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc

saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol,

β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của

cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất

không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các

dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng

các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường

là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà

phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu

cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn.

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:




Thuốc thử Liebermann – Burchard:

Anhidrid acetic 1 ml

H2SO4 đậm đặc

Dung dịch xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh

tím là phản ứng dương tính.

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:

- Vanilin 1%/ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất.

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Dung dịch sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid

Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base,

thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật.

Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ

nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether,

chloroform,…

Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine).

Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối

với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người

(như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành

phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…).

Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các

loại nấm độc.

Một số thuốc thử Alkaloid:

Thuốc thử Mayer:

• Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất.

• Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất.

• Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Dung dịch xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

Thuốc thử Wagner:

• I2 : 1,27g




• KI: 2 g

• H2O: vừa đủ 100 ml

Dung dịch xuất hiện tủa màu nâu.

Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều

màu cho rau, quả, hoa,... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ

hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng.

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối

với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh

số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A,

còn vòng B đánh số phụ.

Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.

Một số thuốc thử Flavnoid:

Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản

ứng dương tính.

Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến

xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

Khảo sát sự hiện diện của saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

- Thuốc thử: HCl : 0,1N

NaOH : 0,1N

- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin

steroid.

1.2.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC

Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh

khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.

Định nghĩa: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi

cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.

Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được

trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim

loại.




Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo

tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử

được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau.

Kết quả

Ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.

Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc

phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất

làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch

chuyển của dung môi:

Rf =b

a

Trong đó:

a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi

của vết, tính bằng cm.

b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

.

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.

1.2.4.3. Phương pháp UV-VIS

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang,

phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tích

công cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế

hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện




nay, gọi là máy quang phổ hấp thụ phân tử UV - VIS. Các máy đo quang làm việc

trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) từ 190nm đến khoảng 900nm.

Sự hấp phụ ánh sáng của dung dịch màu:

Dung dịch có màu là do bản thân dung dịch đã hấp thụ một phần quang phổ

(một vùng phổ) của ánh sáng trắng, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch, chính

là màu phụ của phần ánh sáng trắng đã bị hấp thụ (vùng quang phổ còn lại).

Sự hấp thụ của dung dịch theo màu được trình bày trong bảng :

Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu

TIA SÁNG ĐƠN SẮC BỊ HẤP THỤ MÀU CỦA DUNG DỊCH

400nm ÷ 450nm: vùng tím lục ánh vàng

450nm ÷ 480nm: vùng chàm vàng

480nm ÷ 490nm: vùng chàm lục da cam

490nm ÷ 510nm: vùng lục chàm đỏ

510nm ÷ 560nm: vùng lục đỏ tía

5600nm ÷ 575nm: vùng lục ánh vàng tím

575nm ÷ 590nm: vùng vàng chàm

590nm ÷ 640nm: vùng da cam chàm lục

640nm ÷ 720nm: vùng đỏ lục chàm

720nm ÷ 800nm: vùng đỏ tía lục

Sự hấp thụ bức xạ đơn sắc (BXĐS) của dung dịch còn phụ thuộc vào nồng độ

của chất hấp thụ.

1.2.4.4. Phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu

phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến

đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ

chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ).




1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè

1.2.5.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của polyphenol chè

Ngày nay mối quan tâm trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa

trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng. Mối

quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với

nhiều phân loại, ví dụ như lão hóa sớm, ung thư và một loạt các bệnh trong đó có liên

quan đến các gốc tự do. Ngoài ra, thực hiện các quy định rất nghiêm ngặt về việc sử

dụng chất bảo quản thực phẩm, do đó họ chỉ cho phép sử dụng chất chống oxy hóa tự

nhiên.

Các ứng dụng tiềm năng là chất bảo quản trong thực phẩm, mỹ phẩm và các

ngành công nghiệp dược phẩm. Sự quan tâm về việc loại bỏ chất độc của trong quá

trình tổng hợp các chất chống oxy hóa trong thực vật và trong việc xác định các nguồn

chất chống oxy hóa tự nhiên đã thúc đẩy chúng tôi phát triển để xác định giá trị của

chất tan trong nước.

Khi nghiên cứu khả năng quét gốc tự do tổng hợp như 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

(ABTS)…, các polyphenol-catechin đều thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất

kháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E. Nanjo và cộng sự [52]

đã chỉ ra

rằng, các catechin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao gấp 6 đến 16,4 lần α –

tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C. Trong các hợp chất catechin, nhìn chung

dạng galloyl hóa có khả năng quét DPPH cao hơn so với dạng khác. Trong các thành

phần của catechin chè, khả năng quét DPPH được xếp theo trật tự giảm dần như sau:

EGCG > ECG > EGC > EC > C .[41][47]

Đối với chè, thành phần các catechin đóng góp

khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.[49]

Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo cũng chỉ ra rằng, polyphenol chè có hiệu

quả cao trong việc giảm cholesterol tổng số cũng như phần LDL trong huyết

thanh,[59][76]

chống oxy hóa các acid béo,[28][31]

hay quét các gốc tự do superoxyl,

hydroxyl.[19][66]

Trong nghiên cứu về tác dụng của polyphenol đối với độc tố

ochratoxin A ở tế bào gan, Hundhausen và cộng sự [39]

đã chỉ ra rằng, EGCG có hoạt

tính kháng oxi hóa cao gấp 4 lần trolox và genistein, 3,4 lần daidzein và khoảng 1,3

lần quercetin.




Khả năng kháng oxi hóa của chất chiết chè xanh cũng là chủ đề của nhiều

nghiên cứu. Khi đánh giá khả năng này của chè xanh, hoa nhài, oải hương, hoa hồng,

sả và hương thảo thông qua khảo sát khả năng quét DPPH, khả năng kháng oxi hóa

tương đương trolox (TEAC) và khả năng hấp phụ gốc oxygen (ORAC assay). Tsai và

cộng sự [70]

đã nhận thấy rằng, trong tất cả các thử nghiệm, chè xanh có hoạt tính

kháng oxi hóa mạnh nhất. Cụ thể với DPPH, hoạt tính này của chất chiết chè xanh cao

gấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với

oải hương (bảng 1.2). Trong thí nghiệm khác với cùng đối tượng, Aoshima và cộng sự

[15] cũng cho quy luật tương tự.

Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity)

khác dựa theo mô hình phospho molybdenum [56]

bằng phép đo quang phổ trên cơ sở

việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo

của phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được

tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số

hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa.

Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường

Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác

định lực kháng oxy hóa của Polyphenol lá chè xanh.

1.2.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol chè

Về cơ chế kháng khuẩn của polyphenol chè, các catechin đặc biệt là EGCG đã

can thiệp vào quá trình tổng hợp acid béo type II của tế bào vi khuẩn.[75]

Bên cạnh đó,

gốc galloyl của catechin cũng gây ra sự rối loạn đặc hiệu trong cấu trúc của lớp đôi

phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine trong thành màng tế bào.[26]

Ngoài

ra, hiệu quả sát khuẩn của catechin còn có thể liên quan đến việc tạo hydrogen

peroxide – kết quả từ tác động của oxygen với EGCG.[16]

Khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm của polyphenol/chất chiết chè

được tổng hợp qua bảng 1.3 [49]

. Đối với vi khuẩn, polyphenol chè có tác dụng tốt đối

với nhiều loài vi khuẩn gây ngộ độc cũng như gây thối hỏng thực phẩm.[21]

Mendel [49]

đã chỉ ra rằng, EGCG, CG, EGC thể hiện hoạt tính kháng B. cereus

ở mức độ nmol, chất chiết chè xanh và chè đen đều có thể ức chế sự phát triển của C.

jejuni và C. coli trong vòng 4 giờ [30]

, nồng độ ức chế tối thiểu (minmum inhibitory




concentration) trung bình của các catechin chè đối với S. aureus và một số chủng

Vibrio là 192 ± 91 và 162 ± 165 µg/ml tương ứng trong khi đối với các vi khuẩn gram

(-) như Salmonella và E. coli là 795 ± 590 và 1519 ± 949 µg/ml tương ứng.[68]

Một số nghiên cứu đã tiến hành về ảnh hưởng của polyphenol chè đối với các vi

sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Fukai và cộng sự [34]

đã nghiên cứu ảnh hưởng của

chất chiết catechin chè trên 8 chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách, súp lơ,

cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh (wilt), thối ướt (spring

rot), đốm lá (necrotic leaf spot) trên tỏi, súp lơ, xà lách…, kết quả chỉ ra rằng, catechin

chè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của các

polyphenol chè đều dưới 100 ppm. Trong số 4 cấu tử catechin thử nghiệm (EGC,

EGCG, EC, ECG), thì EGCG và EGC hiệu quả hơn cả. Liên quan đến khả năng kháng

một số vi khuẩn gây thối hỏng thực phẩm, Yam và cộng sự [72]

cũng kết luận rằng, chất

chiết chè cũng như thành phần polyphenol chè có tiềm năng trong bảo quản thực

phẩm, đặc biệt khả năng kháng lại P. vulgaris, P. aeruginosa và S. marcescens.

1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong

chè

1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly

Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất

rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán các chất có

nồng độ khác nhau. Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng gọi là trích ly lỏng – lỏng,

còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly rắn – lỏng [21]

.

1.3.2. Các phương pháp trích ly

Hiện nay tùy theo mục đích (mục đích khai thác và mức độ tinh sạch mong

muốn hay mục đích phân tích) cũng như điều kiện áp dụng công nghệ mà việc trích ly

các hợp chất có trong thực vật có thể tiến hành theo một số phương pháp sau:

1.3.2.1. Kỹ thuật soxhlet

Chiết soxhlet là một trong các kỹ thuật cổ điển nhất, được đề xuất bởi nhà hóa

học người Đức Franz Ritter Von Soxhlet. Đầu tiên nó được thiết kế chủ yếu cho việc

tách chất béo nhưng hiện nay được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau, trong đó

có chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Trong chiết soxhlet, dung môi thích

hợp liên tục được bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với vật liệu rắn để tách chất mục tiêu




trong một thiết bị chuyên dụng (bộ soxhlet). Đối với kỹ thuật này, do những hạn chế

như làm việc gián đoạn, năng suất thấp, thời gian chiết dài nên hiện nay thường chỉ

được sử dụng trong nghiên cứu, phân tích và để đối sánh với các kỹ thuật mới khác

[31].

1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm (maceration)

Với kỹ thuật này, quá trình chiết thường gồm các bước cơ bản sau:

i) vật liệu được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, ii) dung môi

thích hợp được đưa vào trong bình chiết và được trộn đều với vật liệu, iii) tách dung

môi có chứa chất mục tiêu ra khỏi bã và ép bã để thu hồi triệt để chất mục tiêu, iv) lọc

làm sạch dung môi chứa chất mục tiêu thu được. Ngoài ra, trong phương pháp này

người ta thường kết hợp với khuấy đảo để tăng quá trình khuếch tán của chất tan và

làm mới dung môi trên bề mặt vật liệu. Từ đó làm tăng hiệu suất trích ly.[20]

Ưu điểm của phương pháp là rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu

thiết bị phức tạp, thích hợp với việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt nhưng có

nhược điểm là thời gian trích ly dài và có hạn chế về hiệu suất trích ly.

1.3.2.3. Kỹ thuật ngấm kiệt (percolation)

Trong kỹ thuật này, vật liệu được ngâm ngập trong dung môi và không có

khuấy đảo. Khi sự chênh lệch nồng độ chất tan trong vật liệu và ngoài dung môi gần

đạt trạng thái cân bằng, dung môi chứa chất tan sẽ được chiết rút từ từ nhỏ giọt ra khỏi

bình chiết. Đồng thời với quá trình này, dung môi mới sẽ được đưa vào để chiết kiệt

chất mục tiêu trong vật liệu. Kỹ thuật này có thể thực hiện đơn giản như trên hoặc có

thể tiến hành theo cách phân đoạn. Trong chiết phân đoạn, dịch chiết loãng được sử

dụng làm dung môi để chiết vật liệu mới.

Kỹ thuật này cũng có ưu điểm là khá đơn giản, dễ áp dụng. Tuy nhiên thời gian

chiết dài và lượng dung môi tiêu thụ lớn.

1.3.2.4. Trích ly có hỗ trợ siêu âm

Cơ sở của phương pháp này là sử dụng sóng siêu âm làm tăng cường quá trình

phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường quá trình chuyển khối, từ đó có thể làm tăng hiệu

suất trích ly. Bên cạnh đó, phương pháp này cũng cho phép rút ngắn thời gian trích ly

và làm giảm tiêu tốn dung môi…[3].

Tuy nhiên kỹ thuật này có thể làm tăng nhiệt của

hệ dung môi – vật liệu trong quá trình, do đó có thể không thích hợp trong trích ly các




hoạt chất nhạy cảm nhiệt như polyphenol. Ngoài ra, những khó khăn trong việc triển

khai công nghiệp cũng là điểm hạn chế của kỹ thuật này [58]

.

Cuối cùng, hiện nay phương pháp này vẫn chưa có các đánh giá toàn diện như

ảnh hưởng của sóng siêu âm đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt tính sinh học của chất

cần trích ly, hiệu suất trích ly polyphenol có thực sự được cải thiện hay không vẫn

chưa có những kết luận đồng thuận. Ví dụ như trong khi Tao và cộng sự [69]

cho biết,

trích ly polyphenol từ chè có hỗ trợ siêu âm cho phép nâng hàm lượng polyphenol

trong dịch chiết từ 22,04% lên 22,67% thì Amir và cộng sự [14]

lại không nhận thấy có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa trích ly polyphenol từ vỏ quả hồ trăn

(Pistachia vera) có và không có hỗ trợ của sóng siêu âm với cả hai dung môi là nước

và methanol.

1.3.2.5. Trích ly có hỗ trợ vi sóng

Trích ly có hỗ trợ vi sóng cũng được xem là một phương pháp mới trong trích

ly các hợp chất tự nhiên. Trong kỹ thuật này, trường điện từ trong dải tần từ 300 MHz

tới 300 GHz thường được sử dụng. Chúng tạo ra hai trường dao động trực giao là

trường từ và trường điện. Trong quá trình này, năng lượng điện từ sẽ được chuyển hóa

thành năng lượng nhiệt.[20]

Kỹ thuật này thường gồm 3 bước:[13]

i) đầu tiên có sự phân

tách chất mục tiêu khỏi các vị trí hoạt động của vật liệu do sự tăng nhiệt độ và áp suất,

ii) tiếp theo có sự di chuyển của dung môi vào trong vật liệu, iii) cuối cùng, chất mục

tiêu được hòa tan vào dung môi.

Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nâng nhiệt và chiết tách nhanh, ít

tiêu tốn dung môi, hiệu suất thu hồi cao.[13]

Tuy nhiên, nó cũng gặp những hạn chế như

trong kỹ thuật trích ly có hỗ trợ siêu âm như kém phù hợp trong chiết tách các hợp

chất nhạy cảm nhiệt và những vấn đề về thiết bị trong triển khai công nghiệp.[103]

1.3.2.6. Trích ly siêu tới hạn

Cơ sở của phương pháp: khi chất khí ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn

(gọi là chất lỏng tới hạn) nó bộc lộ khả năng của một dung môi, nhưng có độ nhớt và

khả năng khuếch tán của một chất khí. Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán

cao, tính vận chuyển tốt hơn một chất lỏng thường vì vậy nó có khả năng thích ứng với

quá trình chiết tách. Trong kỹ thuật này, CO2 thường được lựa chọn vì nó có mật độ

tới hạn cao (0,47 g/cm3).

[63]




Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp, có thể

giảm thiểu sự oxi hóa các chất cần trích ly, an toàn không độc hại và không tốn năng

lượng để tách dung môi (chất lỏng tới hạn) sau trích ly.[63][58]

Tuy nhiên nhược điểm

chính của phương pháp này là đầu tư trang thiết bị lớn và hiệu quả thấp đối với việc

trích ly các hợp chất phân cực như catechin chè. Để sử dụng phương pháp này cho

trích ly polyphenol, người ta thường phải kết hợp CO2 siêu tới hạn với một dung môi

phân cực khác như ethanol.

Sau hơn 30 năm phát triển, phương pháp này hiện đã được phát triển ở quy mô

công nghiệp trong việc tách caffeine từ cà phê và hoa húp lông.[58]

1.3.2.7. Chiết dung môi ở áp suất cao

Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi Richter và cộng sự vào năm

1996.[20]

Cơ sở của phương pháp là sử dụng áp suất cao trong quá trình chiết để lưu

giữ trạng thái lỏng của dung môi trên điểm sôi của nó. Do vậy, điều kiện làm việc này

(nhiệt độ và áp suất cao) sẽ làm tăng khả năng hòa tan của chất mục tiêu, giảm độ nhớt

và sức căng bề mặt của dung môi. Điều này cho phép làm tăng tốc độ chuyển khối và

cải thiện hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, khả năng có thể tự động hóa quá trình cũng là

một trong các ưu thế của kỹ thuật này.[40]

Tuy vậy, với điều kiện làm việc ở nhiệt độ và

áp suất cao có thể kém phù hợp trong việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt như

catechin chè.

1.3.2.8. Trích ly bằng dung môi có hỗ trợ enzym

Xử lý enzyme của các mẫu thực vật là một kỹ thuật khác phù hợp để giải phóng

các hợp chất phenolic. Phenolics trong vật liệu thực vật dường như được liên kết với

các polysacarit vách tế bào thực vật bởi cả hai liên kết kỵ nước và kỵ nước.Việc bổ

sung các enzyme có thể làm tan rã các liên kết thành tế bào phenolic và tăng cường

chiết xuất phenolic. Gần đây, thủy phân enzyme sử dụng kết hợp pectinase, cellulase

và hemiaellulase đã được chứng minh là tăng cường chiết xuất phenolic từ chất thải

rắn mâm xôi. Maier et al. đã phát triển ứng dụng enzyme để chiết xuất phenolic từ

bưởi nho. Kapasakalidis và cộng sự đã báo cáo rằng các chế phẩm enzyme cellulose

thương mại thúc đẩy việc chiết xuất polyphenol và anthocyanin từ quả bưởi đen.

Trong một nghiên cứu khác, việc so sánh ứng dụng của ba loại chế phẩm enzyme khác

nhau bao gồm-amylase, Viscozyme L và Ultraflo L đã được tiến hành trên thân cây




Ipomoea batatas (khoai lang). Ultraflo L và Viscozyme L tạo điều kiện phục hồi

phenolic và dẫn đến sản lượng axit ferulic và axit vanillic cao hơn, tương ứng, trong

chiết xuất. Hong và Van Veit. đã so sánh các kỹ thuật của UAE và chiết xuất các hợp

chất phenol có hỗ trợ enzyme từ quả acerola, ngược lại, sản lượng phenolics cao hơn

bằng phương pháp mới của UAE so với chiết xuất enzyme.

Nhận xét chung về các phương pháp trích ly:

Như đã trình bày ở phần trên, Tất cả các kỹ thuật chiết tách polyphenol từ lá

trà xanh đều có lợi thế và hạn chế riêng. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên

cứu các điều kiện chiết tách cho phương pháp chiết polyphenol trong lá chè bằng

dung môi, ngoài ra khảo sát thêm sự hỗ trợ của một số enzym nhằm cải thiện và tối

ưu hóa cả hiệu suất trích ly cùng hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol/catechin

đồng thời phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu và

dễ dàng triển khai ở quy mô nhỏ so với các nghiên cứu đã từng được tiến hành ở Việt

Nam.

1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của

sản phẩm

Những nghiên cứu trên thế giới về chiết tách polyphenol chè nhìn chung cũng

tập trung chủ yếu đến việc tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất

trích ly và chất lượng của sản phẩm thu được (hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn

của dịch chiết/chất chiết polyphenol).

1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi

Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợp

chất phenol chiết tách được. Độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng lớn

bởi độ phân cực của dung môi sử dụng. Trong chiết xuất các hợp chất phenol, các

dung môi có độ phân cực cao như nước hoặc ít phân cực như chlorofom hay hexane

thường không cho hiệu suất thu hồi cao.[46]

Dung môi nước tuy an toàn nhưng thường

làm cho dịch chiết có lượng tạp chất lớn, gây khó khăn cho việc làm sạch về sau. Nếu

quá trình chiết hướng tới nhiều loại hợp chất khác nhau cùng tồn tại trong vật liệu,

người ta thường sử dụng hỗn hợp các loại dung môi để tạo ra một dung dịch có độ

phân cực trung bình. Điều này cho phép cải thiện hiệu suất trích ly đối với tổng thể các

hợp chất đích.[46]

Trong chiết tách các hợp chất phenolic chè, dung môi thường được




sử dụng là methanol, ethanol, acetone, diethyl ether và ethyl acetate. Tuy nhiên các

acid có độ phân cực cao (benzoic, cinnamic acid) có thể không được chiết hoàn toàn

với các dung môi hữu cơ nguyên chất mà hỗn hợp của alcohol – nước hoặc acetone –

nước thường được yêu cầu.[36]

Các dung môi ít phân cực như dichloromethane,

chloroform, hexane và benzene thường phù hợp để tách các tạp chất như sáp, sterol và

chlorophyll từ nguyên liệu thực vật.[67]

Các hợp chất phenol ở dạng glycoside (tan nhiều trong nước) nhìn chung

thường được tách bởi hỗn hợp nước với methanol, ethanol hoặc acetone.[60]

Ngược lại,

các hợp chất phenol ít phân cực hơn (dạng aglycone) như isoflavone, flavanone và

flavonol thường tan hơn trong các dung môi kỵ nước.[24]

Độ hòa tan của catechin

(nhóm flavanol) trong dung môi phân cực được tăng cường với việc xử lý nhiệt trung

bình, do đó làm tăng hiệu suất trích ly. Bên cạnh đó, hiệu suất này cũng được cải thiện

với việc áp dụng các biện pháp như khuấy đảo, lắc hay kết hợp tác động siêu âm.[36]

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành về chủ đề này, Nihal và cộng sự [53]

đã sử

dụng nước, ethanol, methanol và dimethyl formamide (DMF) (dung môi hữu cơ được

sử dụng ở 50%, 80% và 100% v/v) trong trích ly chè đen và chè cây nhựa ruồi (Ilex

paraguariensis). Kết quả chỉ ra rằng, loại dung môi và nồng độ dung môi có ảnh hưởng

lớn đến hiệu suất thu hồi polyphenol cũng như khả năng kháng oxi hóa của dịch chiết.

Đối với chè đen, dung môi DMF 50% cho hiệu suất trích ly polyphenol cao nhất trong

khi với chè nhựa ruồi dung môi tốt nhất là acetone 50% (v/v). Về hoạt tính kháng oxi

hóa, dịch chiết chè đen có hoạt tính này cao nhất với dung môi acetone 50% (v/v)

trong khi ethanol 50% (v/v) lại cho kết quả tốt nhất với dịch chiết chè nhựa ruồi.

Tương tự, Perva- Uzunalic và cộng sự [55]

cũng kết luận, acetone 50% hiệu quả

nhất trong chiết tách các hợp chất catechin và proanthocyanidins trong chè xanh khi so

sánh giữa acetone, methanol, ethanol, acetonitrile ở các nồng độ 25%, 50%, 80% và

100%. Hiệu suất trích ly catechin bằng acetone 50% cao gấp 2,7 lần so với trích ly

bằng nước ở nhiệt độ sôi.

Đánh giá hiệu suất trích ly catechin và caffeine từ chè xanh khi sử dụng hệ

dung môi ethanol/nước (25%, 50%, 75% và ethanol tuyệt đối), Hu và cộng sự [38]

cũng

nhận thấy, hiệu suất này cao nhất ở hệ ethanol/nước 50% (v/v). Bên cạnh đó, khi

nghiên cứu trích ly polyphenol từ cây nhựa ruồi (Ilex paraguariensis), Sari và cộng sự




[64] còn chỉ ra rằng, loại dung môi không những ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly

polyphenol mà còn ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết. Cụ thể,

acetone 50% có hiệu quả ức chế tốt nhất đối với S. aureus, H. alvei, Y. enterocolica và

L. monocytogens khi so sánh với ethanol, methanol và dimethyl formamide ở cùng

nồng độ 50%. Đặc biệt, chất chiết dimethyl formamide 50% có hiệu quả tốt đối với S.

aureus, Y. enterocolica và L. monocytogens nhưng không có tác dụng với H. alvei.

Cùng nghiên cứu vấn đề này nhưng trên đối tượng chè đen, Nihal và cộng sự

[54] cũng kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của dịch chiết phụ thuộc vào dung môi

sử dụng và chủng vi khuẩn thử nghiệm. Trong 6 chủng vi khuẩn nghiên cứu (S.

aureus, Y. enterocolica, L. monocytogens, H. alvei, B. cereus và E. coli O157:H7) thì

S. aureus tỏ ra nhạy cảm nhất đối với dịch chiết chè đen.

1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly

Cacace và mazza [25]

đã chỉ ra rằng, hiệu suất trích ly polyphenol được tăng

cường khi tăng nhiệt độ trích ly. Nhiệt độ cao làm giảm độ nhớt của dung môi, tăng

tính bán thấm của thành tế bào, tăng độ hòa tan và hệ số khuếch tán của chất cần chất

ly. Do đó có thể cải thiện được năng suất chiết [32]

.

Tuy vậy, polyphenol rất không ổn định và bị phá hủy ở nhiệt độ cao.[37]

Perva-

Uzunalic và cộng sự [55]

đã chỉ ra rằng, hiệu suất chiết tách catechin chè với nước đã

giảm khi tăng nhiệt độ chiết từ 80 lên 950C. Thời gian chiết thích hợp với hai mức

nhiệt độ trên là 20 phút và 10 phút tương ứng. Ngoài ra, quá trình oxi hóa và epimer

hóa các catechin chè cũng diễn ra ở nhiệt độ trích ly cao.[36]

Điều này cho thấy, yếu tố

nhiệt độ không những ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol chiết tách được mà còn

ảnh hưởng đến thành phần polyphenol và có thể cả hoạt tính sinh học của nước chiết.

Nhìn chung trong trích ly polyphenol, nhiệt độ trích ly thường phải giới hạn dưới nhiệt

độ sôi của dung môi (hữu cơ) còn trong trích ly bằng nước, nhiệt độ khuyến cáo

thường nằm trong khoảng 80 - 950C.

[55][62]

1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly

Đây là một trong các yếu tố không những ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi

polyphenol mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của dịch chiết và hiệu quả kinh tế của

quá trình. Thời gian trích ly ngắn sẽ làm giảm hiệu suất, ngược lại nếu thời gian quá

dài sẽ gây tốn kém và có thể làm tăng nguy cơ oxi hóa các hợp chất polyphenol.[50]




Perva-Uzunalic và cộng sự [55]

cũng chỉ ra rằng, với dung môi nước, hiệu suất

thu hồi catecchin chè giảm mạnh khi kéo dài thời gian chiết quá 20 phút ở nhiệt độ 80

0C và quá 10 phút ở 95

0C.

Ngược lại, trong dung dịch ethanol 40% được acid hóa bằng 2% phosphoric

acid, Choung và Lee [29]

không nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hiệu

suất chiết tách catechin tổng số cũng như EGCG trong thời gian từ 0,5 h đến 24 h

(chiết ở 25 0C).

Ngoài ra, Labbé và cộng sự [43]

còn cho thấy, cặp nhiệt độ và thời gian trích ly

có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách các catechin thành phần. Cụ thể, nhiệt độ 500C

trong 20 - 40 phút cho kết quả tốt nhất để thu hồi EGC và EC, 90 0C trong 80 phút là

tối ưu với nhóm C, EGCG, GCG và ECG và để trích ly cafein, nhiệt độ 70 – 80 0C

trong 20 - 40 phút là thích hợp hơn cả.

1.4.4. Ảnh hưởng của pH

Việc acid hóa dung môi chiết có thể có tác dụng đến độ ổn định của các hợp

chất phenol như anthocyanin,[61]

ảnh hưởng đến độ hòa tan của các polyme có thể thủy

phân như lignin, hydroxycinnamic và procyanidin.[50]

Bên cạnh đó nó cũng có thể làm

yếu cấu trúc thành tế bào, từ đó giúp quá trình hòa tan các hợp chất phenol được dễ

dàng hơn. Ngoài ra, do polyphenol là các hợp chất khử mạnh nên trong môi trường

acid thấp nó sẽ được bảo vệ tốt hơn.

Tuy nhiên, Malgorzata và cộng sự [48]

lại kết luận, hoạt tính kháng oxi hóa của

cả 7 catechin chè xanh đều tăng cùng với sự tăng pH của môi trường (khoảng khảo sát

pH từ 2 đến 10) và hoạt tính này của các catechin ở dạng ester gallate cao hơn dạng

không có nhóm galloyl.

1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol.

Tỷ lệ này càng cao tức nồng độ chất cần trích ly trên bề mặt pha rắn càng thấp. Do đó,

chênh lệch gradient nồng độ giữa bên trong và bề mặt vật liệu rắn càng cao và làm

tăng sự khuếch tán của chất tan từ vật liệu ra môi trường hay làm tăng hiệu suất trích

ly. Tuy vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao sẽ gây tốn kém và gây khó khăn cho quá

trình tinh chế về sau. Trong trích ly các hợp chất polyphenol, các nghiên cứu thường

được tiến hành ở tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/10 đến 1/60.[37][65]




1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh

Nguyên tắc cơ bản là sử dụng dung môi hòa tan tốt polyphenol nhưng ít hòa tan

các chất khác không mong muốn như chất màu, protein, chất sáp… Nhìn chung, quy

trình này gồm 4 công đoạn chính:

- Sử dụng dung môi/nước trích ly polyphenol từ nguyên liệu chè đã được nghiền

nhỏ.

- Loại bỏ chất màu, cafein…bằng các dung môi thích hợp (chloroform,

dichloromethan…).

- Chuyển pha ethyl acetate để thu hồi catechin.

- Đuổi dung môi ethyl acetate và sấy đông khô để thu hồi bột polyphenol. Row và

Jin [108]

đã đề xuất quy trình sản xuất bột polyphenol chè xanh.

Sơ đồ 1. 2: Quy trình tinh chế polyphenol




1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng

khuẩn

1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn

Chúng tôi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau (100;

200; 400; 800 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram

âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi - ATCC 14028,

Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus

aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).

1.5.1.1. Escherichia coli

Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá

trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí

sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi

khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình

nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học.

Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề

"Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung".

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Division): Proteobacteria

Lớp (Class): Gammaproteobacteria

Bộ (Order): Enterobacteriales

Họ (Family): Enterobacteriaceae

Giống (Genus): Escherichia

Loài (Species): E.coli

Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi

khuẩn có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu

nóng. Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và

nhiễm trùng sinh mủ. Các chủng gây bệnh được phân loại bởi cơ chế sinh bệnh đặc

biệt như các độ tố chẳng hạn.




Hình 1. 8: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi

Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn

E.coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể

di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng

không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác.

Sinh trưởng ở 15 – 40 ℃ nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 ℃, pH từ 6,4 –

7,4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc

tròn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3mm.

Tính chất sinh hóa và đề kháng:

- Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic.

- Hầu hết các loại vi khuẩn E.coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi.

- Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 100 ℃ trong 2 giờ.

- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.

- Bị hủy bởi formol 5%.

- Rất độc, chỉ cần 0,05 mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ.

Độc tố:

Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể

dẫn đến bệnh nặng. Các E. coli sản sinh ra độc tố Shiga này đôi khi được gọi là STEC

(phát âm là "S-TECK").

Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm

hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến

triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng.

Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác

trong cơ thể.




1.5.1.2. Bacillus cereus

Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng

hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc

thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng

độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca

bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.

Theo phân loại khoa học:


Ngành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Bacillaceae

Giống (Genus): Bacillus

Loài (Species): Bacillus cereus

Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 – 1,5 x 2 – 4 µ. Vi khuẩn

không tạo giáp mô, không có khả năng di động.

Hình 1. 9: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức

ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.

Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở

nhiệt độ thích hợp 5 – 50 oC, tối ưu 35 – 40

oC, độ ph 4,5 - 9,3; thích hợp 7 - 7,2.

- Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.

- Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.

- Trên môi trường MYP: khóm hồng chung quanh có vòng sáng.




- Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh

có vòng sáng.

- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn.

Tính chất sinh hóa:

Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí,

không lên men mannitol.

- Khử nitrat thành nitrit.

- Phản ứng VP (+).

- Phân giải Tyroxin.

- Catalase (+), Citrate (+).

- Mọc trên NB + 0,001% lyzozym.

Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố

Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên

thịt , rauquả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột

gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.

Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm

nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân

hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có

thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh

nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.

1.5.1.3. Salmonella

Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và

gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz

và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loài vi rút gây ra và đã xác định

Salmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông

gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là

Salmonella enteritidis.







Lớp (Class): Gammaproteobacteria

Bộ (Order): Enterobacteriales

Họ (Family): Enterobacteriaceae

Giống (Genus): Salmonella lignieres 1900

Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi,

không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính

khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát

triển tốt ở 6 ℃ – 42 ℃, thích hợp nhất là 35 ℃ – 37 ℃, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là

7,2 , ở nhiệt độ 18 ℃ – 40 ℃ vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Trên môi trường

phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường

chuyển sang màu vàng.

Hình 1. 10: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi

Tính chất sinh hóa và đề kháng:

- Lên men đường manit, sorbitol (+).

- Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-).

Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố:

Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây

độc thần kinh, hôn mê, co giật.

Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi

colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10

lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố

chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kị khí. Ngoại độc tố tác động vào




thần kinh và ruột.

1.5.1.4. Staphylococcus aureus

Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày

tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng

khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,

phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời

kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.


Giới (Kingdom): Eubacteria

Ngành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Staphylococcaceae

Giống (Genus): Staphylococcus

Loài (Species): Staphylococcus aureus

Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các

cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và

thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi

khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể

đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ.

Hình 1. 11: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi




Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí,

bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.

Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò

trong y học: Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây

bệnh.

o Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).

o Staphylococcus saprophyticus.

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không

thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh

trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃,

hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ

làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu

vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S.

aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn

khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao.

Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt

độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng

trưởng ở 35 – 37 ℃.

Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống

ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus

(SA) xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác

nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm

trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.

Tính chất sinh hoá và đề kháng:

Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,

chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu

vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.

S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành

nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol,

trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S.

aureus đều mẫn cảm với novobiocine.




Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta –

lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh

như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất

tác dụng.

Ngoài ra, tụ cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn

Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng

thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn.

Cấu trúc kháng nguyên:

Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở

vách tế bào.

Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề

mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy

nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn.

Độc tố - Enzym:

Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn

rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc

loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm

Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi

trường có nhiệt độ trên 15 ℃ hơn cả vi khuẩn.

Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S.aureus là một protein ổn định nhiệt,nhiều

nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng

30 – 700 phút.

Các enzyme ngoại bào:

- Protease phân giải protein của tế bào chủ.

- Lipase phân giải lipid.

- Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo

(FAME).

1.5.1.5. Pseudomonas aeruginosa

Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống

Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và

những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92




loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan

nhiều đến y học.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng

riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một

cực. Có pili, không bào tử.




Lớp (Class): Gamma proteobacteria

Bộ (Order): Pseudomonadales

Họ (Family): Pseudomonas

Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa

Sức đề kháng:

Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá.

Có khả năng đề kháng kháng sinh cao.

Kháng nguyên:

Kháng nguyên liên kết với tế bào:

+ Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS

tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh.

+ Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những

chủng P. aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R.

Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong

môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố

độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử

dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.

Hình 1. 12: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi




Phân loại trực khuẩn mủ xanh:

Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự

phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế

tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa.

Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch

tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là

serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của

90 – 95% số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type

kháng nguyên O (serotype) chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký

hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16).

Nội độc tố:

Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và

một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS

đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc

nhiễm khuẩn huyết.

Ngoại độc tố:

Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động

tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán

và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P.

aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức

năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu

hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A

nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng.

1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

1.5.2.1. Phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của

Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên

môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng

và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC. đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải

100μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có

chứa môi trường LB đặc. Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5%




thành các nồng độ theo yêu cầu. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin

10μg/ml, Tetracyclin 30 μg/ml, Amoxilin 10μg/ml); đối chứng âm là DMSO. Hoạt

tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật

bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d =

đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung

bình.

1.5.2.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration) là

thuật ngữ chỉ nồng độ tối thiểu của dung dịch thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

MIC được sử dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của dịch thử.

Phương pháp môi trường lỏng

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất

của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi

trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng theo cấp độ giảm 1⁄(2 )trong môi

trường nước thịt. Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng tới mật độ xác định và được

nuôi với thời gian, nhiệt độ thích hợp cùng với sự hiện diện của kháng sinh trong môi

trường nước thịt. Với nồng độ thấp nhất của kháng sinh khi không thấy sự phát triển

của vi khuẩn (trong như ban đầu) được ghi nhận là giá trị MIC của dung dịch thử đó

trên chủng vi khuẩn đó.

Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm thứ nhất a ml dung dịch thử, thêm đồng

thể tích (a mL) dung dịch môi trường (pha loãng gấp 2 lần). Từ ống thứ nhất lắc đều

lấy a mL chuyển sang ống thứ hai đã có a mL môi trường (pha loãng gấp 4), cứ tiếp

tục sang các ống nghiệm sau cho hết các ống đã định, cuối cùng lấy a mL dung dịch ở

ống cuối bỏ đi. Như vậy ta có một dãy đã pha loãng dần. Một ống làm chứng thì chứa

a mL môi trường, thêm vào mỗi ống một lượng hỗn dịch vi khuẩn như nhau rồi để tất

cả trong tủ ấm trong một thời gian thích hợp. Nếu với mục đích định lượng thì tiến

hành song song với một dãy ống khác có những nồng độ đã biết của chất kháng khuẩn.

Muốn đánh giá kết quả ta đọc độ pha loãng lớn nhất mà vi khuẩn không mọc được.

Muốn biết với độ pha loãng đó vi khuẩn bị diệt hay chỉ bị kìm hãm thì từ ống có độ

pha loãng đó ta lấy một phần và chuyển vào một ống nghiệm khác có chứa môi trường




vô trùng. Nếu sau khi ở tủ ấm mà vi khuẩn mọc tức là kìm hãm, nếu vi khuẩn không

mọc tức là diệt.

Phương pháp môi trường đặc

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất

của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi

trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng trong môi trường thạch theo cấp độ

giảm ½. Vi khuẩn được cấy trên đĩa kháng sinh và được ủ ấm cho phát triển. Nồng độ

thấp nhất khi quan sát bằng mắt thường với khuẩn lạc ≤ 3 được xác định là giá trị

MIC.

1.5. Phương pháp Sấy thăng hoa

Sấy thăng hoa (freeze drying) là một kỹ thuật còn được gọi là “làm khô lạnh”

hay còn gọi là kỹ thuật khử nước, thường được sử dụng để bảo quản các loại nguyên

liệu và thực phẩm, giúp thuận tiện hơn cho vận tải, cũng như giữ được các phẩm chất

của sản phẩm ban đầu.

Ưu điểm của phương pháp sấy thăng hoa:

- Công nghệ sấy thăng hoa đã tạo ra những sản phẩm có chất lượng tốt. Thành phần

dinh dưỡng (protein, lipit, gluxit), vitamin, enzyme và hoạt chất sinh học, màu sắc,

mùi, vị …v.v gần như được bảo toàn không bị phá hủy.

- Đặc biệt sản phẩm sau khi sấy có độ xốp mềm, khi ngâm vào nước nó hoàn ẩm

trương nở trở lại và gần giống như nguyên liệu ban đầu.

- Sản phẩm sau khi sấy cho vào túi rồi ép chân không, quản bảo ở nhiệt độ phòng,

thời gian sử dụng kéo dài, chi phí bảo quản thấp, chất lượng ít bị thay đổi.

Các giai đoạn của sấy thăng hoa:

Giai đoạn làm lạnh lạnh đông

Giai đoạn đầu tiên của quá trình sấy thăng hoa là làm lạnh đông sản phẩm. Quá

trình này được thực hiện bằng hai cách:

Cách 1: trong thiết bị làm lạnh đông thông thường hoặc nitơ lỏng để làm lạnh

đông sản phẩm bên ngoài buồng sấy thăng hoa.

Cách 2: sản phẩm tự lạnh đông ngay trong buồng sấy thăng hoa khi buồng sấy

được hút chân không.




Sản phẩm cần được làm lạnh đông rất nhanh để hình thành cá tinh thể băng nhỏ

ít gây hư hại đến cấu trúc tế bào của sản phẩm. Đối với sản phẩm dạng lỏng, phương

pháp làm lạnh đông chậm được sử dụng để băng tạo thành từng lớp, các lớp này tạo

nên các kênh giúp cho hơi nước dich chuyển dễ dàng.

Giai đoạn thăng hoa

Giai đoạn kế tiếp là tách nước trong suốt quá trình sấy tiếp theo để làm khô sản

phẩm. Nếu áp suất nước được giữ dưới 4,58 mmHg (610,5 Pa) và nước ở dạng băng,

khi sản phẩm được cung cấp nhiệt, thì băng rắn sẽ thăng hoa trực tiếp thành hơi mà

không bị tan chảy. Hơi nước tiếp tục được tách khỏi sản phẩm bằng cách giữ cho áp

suất trong buồng sấy thăng hoa thấp hơn áp suất hơi nước trên bề mặt của băng, đồng

thời tách hơi nước bằng máy bơm chân không và ngưng tụ nó bằng các ống xoắn ruột

gà lạnh, các bản lạnh hoặc bằng hóa chất. Khi quá trình tiếp diễn, bề mặt thăng hoa di

chuyển vào bên trong sản phẩm đông lạnh, làm sản phẩm được sấy khô. Nhiệt lượng

cần thiết để dịch chuyển bề mặt thăng hoa (ẩn nhiệt thăng hoa) được truyền đến sản

phẩm do sự dẫn nhiệt hoặc do vi sóng cung cấp. Hơi nước di chuyển ra khỏi sản phẩm

qua các kênh được hình thành do băng thăng hoa và được lấy đi.

Như vậy nếu không tính quá trình mất ẩm trong phương pháp để vật ẩm tự lạnh

đông trong buồng sấy khi hút chân không thì sản phẩm được sấy trong hai giai đoạn:

trước tiên do quá trình thăng hoa xuống khoảng 15% độ ẩm và sau đó do bay hơi của

phần nước đóng băng đến 2% độ ẩm bằng quá trình nhả ẩm đẳng nhiệt. Quá trình nhả

ẩm đẳng nhiệt (desorption) đạt được bằng cách nâng nhiệt độ máy sấy lên gần nhiệt độ

môi trường xung quanh trong khi vẫn giữ áp suất thấp giống như quá trình sấy ở các

thiết bị sấy chân không thông thường.




CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu chè

Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là lá chè được trồng tại Suối Nghệ, Tân

Thành, Bà Rịa Vũng Tàu, mẫu nguyên liệu được lấy là lá chè thứ 2; 3 và 4. Sau thu

hái, các lá chè được vô hoạt enzym ngay bằng cách hấp ở 100 oC trong 3 phút, sau đó

được phơi tự nhiên trong điều kiện tránh ánh sáng đến độ ẩm 3 - 5% và được bảo quản

trong lọ kín để nơi khô ráo, tránh ánh sáng.

2.1.2. Chủng vi sinh vật

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn trên 5 chủng vi khuẩn


Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp Thành

Phố Hồ Chí Minh.

2.1.3. Hóa chất, thiết bị

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ và hóa chất được

liệt kê như sau:

Hóa chất:

Thuốc thử của Folin-Ciocalteau

Axit gallic (Merck, Đức)

Axit Sunfuric (Merck, Đức)

Axit Citric (Merck, Đức)

Natri Hidro Cacbonat (Merck, Đức)

Axit axetic (Xilong, Trung quốc)

Natri phosphat (Xilong, Trung quốc)

Amoni molybdate (Merck, Đức)

Dung môi Ethanol (Việt nam)

Etyl axetat, Methanol (Merck, Đức)

Clorofom (Merck, Đức)

Natri Cacbonat (Xilong, Trung quốc)

Cenlulozo (Novozymes, Đan Mạch).




Pectinase Ultra (Đan Mạch).

Môi trường TSB, MHA, MHB (Merck, Đức)

DMSO (Merck, Đức)

Thiết bị:

Máy cô quay chân không

Máy chiết Siêu âm gia nhiệt

Bếp điện

Bể ổn nhiệt

Máy ly tâm

Máy hấp

Cân phân tích 4 số

Máy khuấy từ gia nhiệt + cá từ

Dụng cụ

Nhiệt kế 200 oC

Ống nghiệm

Bình cầu 2 cổ

Bình cầu 1 cổ

Phễu chiết 500 ml

Beacher 250 ml

Beacher 100 ml

Bộ sinh hàn

2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis

2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Áp dụng phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số theo TCVN

9745-1-2013 (ISO 14502-1-2005) [8]

chúng tôi hiệu chỉnh phương pháp cho phù hợp

với nghiên cứu như sau:

Mẫu chè khô (2 g) đã nghiền nhỏ (độ ẩm 5%, kích thước 0,5-1mm) được cho

vào bình chiết 100 ml. Chiết trong dung môi ethanol với thời gian, nồng độ, tỉ lệ khảo

sát. Sau khi trích ly, làm nguội tự nhiên xuống nhiệt độ phòng và lọc lấy phần dịch

chiết. Hút chính xác 1 ml dịch chiết vào bình định mức 100 ml và lên thể tích tới vạch,




lắc đều thu được dịch pha loãng. Tiến hành so màu theo trình tự: hút 1 ml dịch chiết

pha loãng, thêm 5 ml thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và lắc đều, tiếp tục thêm 4 ml

dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc đều và để yên 1h sau đó tiến hành so màu ở bước sóng

765 nm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng polyphenol

tổng số theo % chất khô được tính dựa vào đường chuẩn của gallic acid trong khoảng

nồng độ 10 -50 µg/ml theo công thức:

wT = (Dmẫu - Dgiao điểm) x Vmẫu x d x 100

Schuẩn x mmẫu x 10 000 x wDM,mẫu

Trong đó

Dmẫu là mật độ quang thu được đối với dung dịch mẫu thử;

Dgiao điểm là mật độ quang tại điểm đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất

cắt với trục y;

Schuẩn là độ dốc thu được từ hiệu chuẩn tuyến tính phù hợp nhất;

mmẫu là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

Vmẫu là thể tích của dịch chiết mẫu (50 ml đối với chè hòa tan và 10 ml

đối với chè), tính bằng mililit (ml);

d là hệ số pha loãng được dùng trước khi xác định phép đo màu (điển

hình từ 1,0 ml đến 100 ml, vì vậy hệ số pha loãng là 100);

wDM,mẫu là hàm lượng chất khô của mẫu thử, xác định được theo 8.2, tính

bằng phần trăm khối lượng (%).

2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic

Áp dụng TCVN 9745-1-2013 (ISO 14502-1-2005) [8]

chúng tôi xây dựng

phương trình đường chuẩn như sau:

Dùng pipet chuyển 1,0 ml dung dịch chuẩn axit gallic tương ứng với khoảng 10

µg, 20 µg, 30 µg, 40 µg và 50 µg axit gallic khan vào các ống nghiệm, thêm 5,0 ml

thuốc thử Folin Ciocalteu 10% và lắc đều, tiếp tục thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7,5%,

lắc đều và để yên 1h sau đó đo mật độ quang trong cuvet có chiều dài đường quang 10

mm so với nước trên máy đo quang phổ đặt ở bước sóng 765 nm.

Dựng đường chuẩn tuyến tính phù hợp nhất từ khối lượng của axit gallic khan

trong các chất chuẩn.

Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b




Với X: Hàm lượng của axit gallic khan, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml)

Y: Mật độ quang, 765 nm

2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè

2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ

Theo nguyên tắc, làm việc trên 1 yếu tố thí nghiệm còn cố định các yếu tố còn

lại, kết quả tốt nhất của thí nghiệm trước được rút ra làm thông số cho các thí nghiệm

tiếp theo. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Chỉ tiêu đánh giá là hàm lượng

polyphenol tổng số trong dịch chiết (tiến hành phản ứng và phép đo quang phổ theo

TCVN 9745-1-2013).

Từ các công trình nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành chiết tách polyphenol

bằng dung môi ethanol theo quy trình được trình bày ở sơ đồ (2.1) như sau:

Rửa, diệt enzym, Nghiền nhỏ

Nồng độ dung môi

Thời gian chiết

Khảo sát các điều kiện chiết Tỉ lệ NL:DM

Nhiệt độ

PH

Cô quay

Sấy thăng hoa

Lá chè

Định tính Thuốc

thử và TLC

Cao chiết

lá chè

Dịch chiết lá chè

Xác định hàm lượng

polyphenol tổng

Bột chè

Ứng dụng

Bột chiết lá chè

Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết tách

polyphenol




Quy trình được thực hiện các bước cụ thể như sau:

- Bước 1: Thu hái lá chè xanh trực tiếp tại vườn, xử lý thu được bột chè có độ ẩm 3-

5%, kích thước 0,5-1 mm.

Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý

- Bước 2: Tiến hành khảo sát chiết tách polyphenol, tối ưu hóa các yếu tố công nghệ

như sau:

a) Ảnh hưởng của nồng độ dung môi

Thí nghiệm được tiến hành với dung môi ethanol, nhiệt độ trích ly: 65 oC, thời gian

trích ly 35 phút, trích ly 1 lần, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/25.

Nồng độ ethanol được khảo sát 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 96%.

b) Ảnh hưởng của thời gian chiết

Thời gian trích ly được khảo sát trong khoảng từ 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55 phút.

c) Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Thí nghiệm được khảo sát với các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:15; 1:20; 1:25;

1:30; 1:40; 1:50; 1:60.

d) Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly

Nhiệt độ trích ly được khảo sát trong khoảng từ 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 0C.

e) Ảnh hưởng của pH

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH bằng cách điều chỉnh độ pH bằng

axit citric và natri hidro cacbonat. Với mẫu đối chứng là dung môi ethanol chưa có sự

điều chỉnh pH có độ pH = 4,3.

Nồng độ pH được khảo sát từ 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9.




Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách

- Bước 3: Dịch chiết thu được đo hàm lượng Polyphenol tổng bằng phương pháp

Folin-Denis thu được điều kiện tối ưu.

Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS

- Bước 4: Dịch chiết thu được mang đi cô quay chân không thu được cao chiết lá

chè ở điều kiện tối ưu để Định tính bằng thuốc thử và Sắc ký lớp mỏng. Thử hoạt

tính oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn.

Hình 2. 4: Hệ thống cô quay chân không




2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác

Các polyphenol có nhiệt độ sôi khác nhau nên sau khi khảo sát được các yếu tố

công nghệ và thu được quy trình tối ưu, chúng tôi khảo sát thêm một số yếu tố như

nhiệt độ, số lần chiết nhằm khảo sát sự ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol.

- Mẫu đối chứng: Nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và

nhiệt độ trích ly: 65 0C, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:25 đã được khảo sát ở mục

(2.3.1).

- Thí nghiệm 1: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng

polyphenol tổng.

Quy trình chiết: Chiết với điều kiện như mẫu đối chứng, nồng độ dung môi là 70%

v/v; thời gian trích ly 35 phút và nhiệt độ trích ly: 65 0C, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là

1:25 nhưng lọc lấy bã và thêm dung môi chiết tiếp tương tự lặp lại 3 lần.

- Thí nghiệm 2: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng

polyphenol tổng.

Nồng độ dung môi là 70% v/v và tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25.

Quy trình chiết theo 2 bước:

Bước 1: chiết trong 60 0C trong 35 phút. Thu được dịch chè, lọc lấy bã, thêm dung

môi chiết tiếp bước 2.

Bước 2: thêm dung môi mới, chiết với nhiệt độ 80 0C trong 35 phút.

Gộp dịch sau 2 lần chiết đo polyphenol tổng.

- Thí nghiệm 3: Thí nghiệm nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của chiết với hexan loại

béo đến hàm lượng polyphenol tổng.

Quy trình chiết: Nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và

nhiệt độ trích ly 65 oC, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25.

Thu được dịch chè, lắc với hexan thu được dịch chè đã tách béo.

2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ

enzym

Mục đích của thí nghiệm này là để kiểm tra việc tách chiết enzyme phenolic

chống oxy hóa từ lá chè bằng cách sử dụng các chế phẩm enzyme phân hủy tế bào

thực vật thương mại. Việc khai thác các phenol được tối ưu hóa bằng cách thay đổi các

thông số tỉ lệ enzym : nguyên liệu trong các thí nghiệm giai đoạn được thiết kế thống




kê. Năng suất của các mẫu được chọn sau đó được so sánh với các mẫu của lá chè

không có sự hỗ trợ của enzym.

Mẫu lá chè sau khi xử lý được cho vào Erlen với cái điều kiện đã được tối ưu ở

mục (2. 3.1) Nồng độ Ethanol, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi. Nồng độ pH được điều

chỉnh bằng Axit citric và Natri hidro cacbonat.

Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme

a) Khảo sát với enzym cenlulozo

Enzym cellulase được thêm vào erlen có tỉ lệ khác nhau. Nồng độ enzyme đã

được thay đổi giữa 0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5% v/w, và ủ trong bể điều nhiệt ở 50

°C trong 60 phút ở pH 5,5.

b) Khảo sát với enzym pectinase

Enzym pectinase được thêm vào erlen có tỉ lệ khác nhau. Nồng độ enzyme đã

được thay đổi giữa 0; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5% v / w, và ủ ở 40 °C trong 60 phút ở

pH 4,5.

2.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá

Độ non già của lá cũng ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol tổng, lá càng non

hàm lượng polyphenol càng lớn, tuy nhiên nụ lá và các lá 1; 2 thường được thu hái với

mục đích thương mại. Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát trên các loại lá: Lá tươi, nụ

lá, lá già với loại lá 2; 3; 4 đã tối ưu thu được ở mục (2. 3.1) nhằm so sánh sự chênh

lệch hàm lượng polyphenol tổng. Các thí nghiệm được thực hiện dựa trên các thông số

đã được ở mục (2. 3.1).

2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè

Sau khi tối ưu hóa quy trình và chọn được các thông số công nghệ tối ưu, chúng

tôi tiến hành tinh chế dịch chiết thu được nhằm loại các chất không mong muốn như

diệp lục, axit béo, protein bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau như Nước,




Clorofom, etyl axetat. Dựa vào quy trình của Row và Jin, chúng tôi hiệu chỉnh quy

trình cho phù hợp được trình bày trên sơ đồ sau:

Cô quay

Chiết với Clorofom/Nước

Chiết với Etyl axetat

Cô quay

Quy trình tinh chế được sử dụng theo đề xuất của Row và Jin [108]

có hiệu chỉnh.

Theo đó, dịch chiết polyphenol sau cô quay chân không sẽ được thu hồi cồn. Sau đó,

bổ sung vào dịch trích ly (trong nước) một lượng nước tương đương với lượng cồn thu

hồi, rồi đem trích ly bằng dichloromethane để loại bỏ caffeine và các chất màu. Loại

bỏ lớp dưới (dung dịch trong dichloromethane), phần lớp trên (dung dịch trong nước)

sẽ được trích ly lại bằng ethyl acetate. Loại bỏ lớp nước, dung dịch trong ethyl acetate

được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không. Sản phẩm thu được sau cô đuổi

dung môi được làm khô bằng cô quay chân không và định lượng bằng HPLC.

2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè

2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử

a) Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid

Phản ứng Borntraeger

Thực nghiệm:

Cao Chiết Lá chè

Dịch Chiết Lá chè

Dịch (Pha nước)

Dịch Eyl axetat

Hoạt tính sinh học

hoạt

HPLC

Cao

Polyph

enol

Khảo sát nhiệt độ sấy

Sơ đồ 2. 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol




Cho erlen chứa các dung dịch sau:

- Dịch ethanol 1 ml

- HCl 4N 4 ml

- FeCl3 20% 4 ml

- Dịch lá chè 4 ml

Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml.

Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏ nước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.

Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến

hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.

Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.

b) Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

Thuốc thử Liebermann – Burchard:

• Anhidrid acetic 1 ml

• H2SO4 đậm đặc

Dung dịch màu xanh lục.

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc.

Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung

dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.

Dung dịch màu xanh tím.

c) Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid

Thuốc thử Wagner:

• I2 1,27g

• KI 2g

• H2O vừa đủ 100 ml

Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt

thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên.

Có xuất hiện tủa màu nâu.

d) Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Một số thuốc thử Flavnoid:

Với dung dịch FeCl3 bão hòa:




Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ

từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.

Dung dịch màu xanh đen.

Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến

xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt

đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.

Dung dịch màu vàng cam.

Khảo sát sự hiện diện của saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

- Thuốc thử: HCl 0,1N

NaOH 0,1N

- Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử.

- Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.

- Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên,

quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.

- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau,

có thể có saponin triterpenoid.

- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin

steroid.

2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silicagel (Merck) tráng sẵn:

Hệ dung môi khai triển:

Cloroform: Methanol: Axit axetic (9: 3: 3)[139]

Nhận dạng bởi Iốt: được giữ trong buồng Iốt trong vài phút.

Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

2.4.3. Định tính bằng UV-VIS

Chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp phụ phân tử và bước sóng cực đại của

dịch chiết lá chè theo TCVN 9745-1:2013, và gửi mẫu tới VIỆN Y TẾ CÔNG CỘNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH (Địa chỉ: 159 Hưng Phú, Phường 8, Quận 8, Thành Phố

Hồ Chí Minh).




Phép đo quang được thực hiện trên máy quang phổ UV VIS 1700 PC (Nhật Bản) có

kết nối máy tính với các điều kiện đo như sau:

Phạm vi bước sóng (nm): 300-1000

Cuvet thạch anh chiều dày 1cm

Tốc độ quét: Trung bình

Khoảng lấy mẫu: 0.5

2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC

Cao chiết lá Chè được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được mẫu ở dạng

cao gửi mẫu rắn này đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT

NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí

Minh) để định lượng các hợp chất polyphenol sau: Epigallocatechingallate (EGCG),

Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin (EC).

Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè

2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè

Lực kháng oxy hoá tổng của các mẫu khảo sát dịch chiết lá chè được đánh giá

theo phương pháp phospho molybdenum của Prieto[56]

có hiệu chỉnh cho phù hợp với

mục đích nghiên cứu như sau:

Một lượng 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 10𝜇g/ml chứa một loại chất khử (trong

nước, metanol, ethanol, dimethyl sulfoxide hoặc hexane) đã được kết hợp trong một

ống Eppendorf với 3 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M; natri phosphat 28

mM; và 4 mM amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ trong bể điều nhiệt ở ở

95 °C trong 90 phút. Sau khi các mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, độ hấp thụ




của dung dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Trong mẫu

trắng, dung dịch cần phân tích được thay bằng nước cất. Lực kháng oxy hoá tổng được

biểu diễn theo độ hấp thụ của mẫu, mật độ quang càng lớn thì dung dịch càng có tính

oxy hóa mạnh. Acid gallic được sử dụng làm chất so sánh.

Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số sau:

- Nồng độ dịch chiết tăng dần 10μg/ml; 20μg/ml; 30μg/ml nhằm khảo sát ảnh

hưởng của nồng độ dịch chiết đến khả năng kháng oxy hóa.

- Ảnh hưởng của quá trình tách béo bằng hexan đến khả năng kháng oxy hóa.

- Ảnh hưởng của quá trình tinh chế và thời gian lưu mẫu đến khả năng kháng oxy

hóa.

Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá

2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn

a) Chuẩn bị giống

Bảo quản giống: vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch

dinh dưỡng TSB, đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc

đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem

tăng sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong

10 – 12 giờ. Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.

Tăng sinh: Để hoạt hóa vi khuẩn tiến hành tăng sinh với 3 ml môi trường TSB

cho 40 gl dịch vi khuẩn rồi 10 ml môi trường với 0,5 ml dịch và 100 ml môi trường

với 1 ml dịch, ở mỗi giai đoạn này đều ủ ở 37 oC trong 100 rpm từ 10 - 12 giờ. Thực

hiện lấy tế bào vi khuẩn: huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000




rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước

cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0,5 MC

Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng trong các khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.

b) Chuẩn bị pha cao Lá chè ở các nồng độ khác nhau

Cao Lá chè được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với các nồng độ 800,

400 và 200, 100 mg/ml. Cao với các nồng độ khác nhau sau đó được cho lên khoanh

giấy (đường kính 6 mm) vô trùng. Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng là

ampicillin và tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch

DMSO 5% vô trùng.

Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn

c) Phương pháp xác định hoạt tính kháng

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng

phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt

tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo đường kính vòng ức chế

vi sinh vật (ĐK) theo công thức ĐK (mm) = D - d với D là đường kính vòng vô khuẩn

và d là đường kính khoanh giấy kháng. Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán

vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn

với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh

khoanh giấy kháng sinh.




ĐK (mm) = D - d với

D là đường kính vòng vô khuẩn

d là đường kính khoanh giấy kháng.

Cách tiến hành:

Bước 1: Tăng sinh VSV từ ống gốc sang môi trường lỏng MP. Thời gian 12

– 24 giờ, điều kiện nhiệt độ 37 ℃. Cách tiến hành: nhỏ từ ống gốc 1 – 2 giọt

sang ống môi trường MP.

Bước 2: Cấy trên môi trường thạch MP hoặc MHA hoặc môi trường phân

lập

Bước 3: Chọn 2-3 khuẩn lạc đẹp cấy vào môi trường lỏng TSB. Thời gian 12

– 24 giờ.

Bước 4: Ly tâm ống VSV của môi trường TSB sau nuôi cấy 24 giờ, bỏ phần

nước ở trên, sau đó cho nước cất đã khử trùng vào. So sánh với ống nghiệm

này với ống độ đục McFarland đã chuẩn bị.

Bước 5: Nếu xác định vòng kháng khuẩn thì hút 100 l cấy trang lên môi

trường thạch MHA, để khô, cho đĩa giấy 6 mm vào theo nồng độ pha loãng

khác nhau. Kháng dương dùng kháng sinh tetracylin và ampicillin nồng độ

10 g/ml.

Bước 6: Nếu xác định chỉ số MIC, thì hút 20 l (100l) vi sinh vật cho vào

ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MHB và cho vào các ống nghiệm 5 ml

nồng độ cao pha loãng khác nhau.




Bước 7: Nuôi cấy trong điều kiện 37 ℃, sau 12 – 24 giờ lấy ra quan sát và

xác định vòng kháng khuẩn, chỉ số MIC (ống nghiệm không đục).

c) Xử lý số liệu

Kết quả vòng kháng khuẩn đo được sẽ được tính từ trung bình của các lần lặp

lại.

2.6. Khảo sát các quy trình quy trình sấy

2.6.1. Sấy nhiệt độ cao

Chúng tôi tiến hành khảo sát các nhiệt độ sấy cao khác nhau nhằm tạo cơ sở dữ

liệu cho ứng dụng cao lá chè trong thực phẩm.

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Chiết lá chè bằng các điều kiện đã tối ưu ở

mục (2. 3.1), sau đó cô quay dịch chiết thu được cao chiết lá chè. Sấy cao chiết lá chè

với thời gian 1 tiếng, khảo sát các nhiệt độ sấy 90; 100; 110; 120 oC. Đo hàm lượng

polyphenol tổng sau khi sấy, so sánh với polyphenol tổng trước khi sấy.

Hình 2. 9: Tủ sấy nhiệt độ cao

2.6.2. Sấy thăng hoa

Hàm lượng polyphenol tổng bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ nên chúng tôi tiến

hành sấy thăng hoa cao chiết nhằm hạn chế sự oxy hóa polyphenol và giữ lại các thành

phần có lợi cho sức khỏe khác như protein, lipit, gluxit, vitamin, enzyme và hoạt chất

sinh học, màu sắc, mùi, vị …v.v

Cao lá chè được gửi sấy thăng hoa đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi –

Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh) với quy trình sấy như sau:




Mẫu cao được đông cứng tức thì bằng tuyết carbonic (- 80 oC). Sau đó được sấy

khô với nhiệt độ - 18 oC, áp suất buồng duy trì từ 0,05 mmHg đến 0,2 mmHg. Tiếp

theo được hấp phụ trong khuôn bằng cách khử hấp phụ, làm giảm ẩm còn lại tới mức

thấp nhất có thể, thường khoảng 2 - 5%.

Hình 2. 10: Thiết bị sấy thăng hoa

2.7. Nghiên cứu ứng dụng cao lá chè trong sản phẩm kem dưỡng da

Kem tan dùng ban ngày để bảo vệ da và làm đẹp da đã được tẩy sạch, làm mất

lớp dầu trên da để các mỹ phẩm khác dễ dàng bám lên da. Khi sử dụng, kem phải lan

nhanh ra trên da và dường như biến mất ngay sau khi bôi lên da. Kem còn có tác dụng

giữ ẩm làm mềm mại da. Tùy theo yêu cầu mà kem tan còn có khả năng chống nắng

để bảo vệ da khi sử dụng (ZnO + TiO2) nếu sản phẩm đục, hoặc ester anthranilat của

alcol mạch dài trong sản phẩm trong.

Kem tan ở dạng nhũ o/w với 15 - 30% O, to

nc > 50 oC, kem nền ở dạng nhũ o/w

với 20 - 35% O, to

nc = 40 – 55 oC. Công thức truyền thống dựa trên tướng dầu là acid

stearic.

Tướng dầu (tonc > 50

oC) kết tinh ở dạng thích hợp nên khi dùng sẽ không nhìn

thấy và để lại lớp film không dầu trên da. Tướng dầu sử dụng acid stearic không bị ảnh

hưởng bởi nhiệt độ và tạo nên màu hấp dẫn cho sản phẩm (màu óng ánh ngọc trai).

Công thức sử dụng chất nhũ hóa là xà phòng và thường được thêm một lượng

thích hợp kiềm để trung hòa acid béo tự do.




Ngoài ra còn chứa các chất làm mềm, chất làm ẩm, chất chống nắng, hương và

chất bảo quản.

Cách tiến hành:

(i) Chuẩn bị tướng dầu (cốc O): Cho acid stearic, alcol cetyl vào cốc thủy tinh đun

nhẹ, lắc đều, không khuấy cho đến khi chảy hoàn toàn trên bếp điện. Khi đun phải lót

lưới amiang.

(ii) Chuẩn bị tướng nước (cốc W): Hòa tan KOH, glycerine vào nước.

(iii) Khuấy tạo kem (Thực hiện trong bể điều nhiệt)

- Đặt cốc W vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ khoảng 50−60 oC.

- Lấy cốc O ra khỏi bếp điện, dùng khăn lau nhẹ để giảm nhiệt độ từ từ, sau đó đặt

vào bể điều nhiệt, để ổn định nhiệt độ trong 2 phút.

- Sau khi ổn định nhiệt độ, tiến hành khuấy tạo kem bằng cách cho từng giọt tướng

nước vào tường dầu. Sau đó tiếp tục khuấy trong 45 phút.

- Khi kem đã nhũ bền, kiểm tra pH và hiệu chỉnh nếu cần thiết bằng dung dịch acid

citric bão hoà, đưa về pH 5.5−6.5.

- Cho Cao polyphenol vào với tỉ lệ thích hợp.

- Rót kem vào bình lưu trữ, để ổn định




CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè

Áp dụng phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic đã trình bày ở mục

(2.2.2) chúng tôi xây dựng được phương trình đường chuẩn gallic cho các thí nghiệm

khảo sát yếu tố công nghệ, khảo sát ảnh hưởng của enzym và khảo sát hoạt tính oxy

hóa.

3.1.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ

Đường chuẩn axit gallic được xây dựng với các nồng độ 0; 10; 20; 30; 40; 50

(μg/ml), kết quả mật độ quang đo ở bước sóng 765 nm được trình bày ở bảng 3.1 dưới

đây:

Bảng 3. 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic

C (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 Y = 0,0152x + 0,003

A 0,000 0,168 0,303 0,434 0,638 0,757

Hình 3. 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic

Hình 3. 2: Đường chuẩn axit gallic




3.1.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym



đây:


C (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 Y = 0,0129x + 0,0282

A 0,000 0,193 0,286 0,419 0,544 0,669


3.1.3. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa



đây:


C (𝜇g/ml) 10 20 30 40 50

A 0,171 0,265 0,388 0,514 0,638





3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi

polyphenol

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hệ dung môi là một trong các yếu tố quan

trọng nhất trong việc chiết tách polyphenol thực vật. Việc lựa chọn dung môi có thể

ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợp chất phenol chiết tách được [46]

[51]

. Độ

hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng lớn bởi độ phân cực của dung môi sử

dụng. Nghiên cứu vấn đề này chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.4.

Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng

Nồng độ (%) 50 55 60 65 70 75 80 96

PP tổng (%) 16,09 16,45 17,01 18,55 19,67 19,28 13,29 12,76

KL cao (g) 0,41 0,42 0,43 0,42 0,43 0,41 0,40 0,40

Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng

y = 0.0118x + 0.0403

R² = 0.9973

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

10 20 30 40 50 60

Mật

độ q

uan

g

Nông độ C (𝜇g/ml)




Chúng tôi nhận thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng tăng từ 16,09% đến

18,55% khi nồng độ dung môi từ 50 - 60% và ổn định ở nồng độ dung môi 65 - 75%,

sau đó giảm mạnh ở 80 - 96% còn 12,76%, điều đó cho thấy nồng độ dung môi có ảnh

hưởng lớn đến hiệu suất chiết polyphenol chè nhưng không ảnh hưởng nhiều tới khối

lượng cao thu được (Khối lượng cao thu được lớn nhất là 0,43 (g) và thấp nhất là 0,4

(g)).

Điều này có thể giải thích là do độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng

lớn bởi độ phân cực của dung môi sử dụng. Do quá trình chiết hướng tới nhiều loại

hợp chất khác nhau cùng tồn tại trong llas chè nên sử dụng hỗn hợp các loại dung môi

để tạo ra một dung dịch có độ phân cực trung bình. Trong chiết tách các hợp chất

phenolic chè, dung môi thường được sử dụng là methanol, ethanol, acetone, diethyl

ether và ethyl acetate. Các acid có độ phân cực cao (benzoic, cinnamic acid) có thể

được chiết với hỗn hợp của alcohol – nước hoặc acetone – nước. Các hợp chất phenol

ở dạng glycoside (tan nhiều trong nước) được tách bởi hỗn hợp nước với methanol,

ethanol hoặc acetone.

Vậy ở đây chúng tôi lựa chọn Etanol ở nồng độ 70%, hàm lượng polyphenol

tổng là 19,67% cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng

Thời gian là yếu tố không những ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách mà còn

ảnh hưởng đến chi phí và đặc biệt là chất lượng của dịch chiết [89]

, [100]

.

Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng

Thời gian (phút) 20 25 30 35 40 45 50 55

PP tổng (%) 12,76 16,84 18,48 19,97 18,03 16,31 16,02 14,87

KL cao (g) 0,40 0,40 0,41 0,42 0,42 0,41 0,40 0,39




Hình 3. 6: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian tới hàm lượng polyphenol tổng

Chúng tôi nhận thấy rằng, thời gian chiết có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất

chiết tách polyphenol từ chè. Thật vậy, khi tăng thời gian từ 20 phút lên 35 phút giờ thì

hiệu suất chiết tăng đáng kể (từ 12,763% lên tới 19,97%). Tuy nhiên, nếu ta kéo dài

thêm thời gian trích ly thì lại có ảnh hưởng xấu đến hàm lượng polyphenol thu được.

Cụ thể, khi thời gian chiết tăng từ 40 phút lên 55 phút thì hàm lượng polyphenol đã

giảm từ 18,026% CK xuống còn 14,87% CK.

Điều này có thể giải thích là do khi thời gian chiết quá ngắn, polyphenol trong lá

chè chưa được chiết hoàn toàn ra khỏi nguyên liệu nên hàm lượng polyphenol tổng

không cao nhưng nếu càng kéo dài thời gian chiết, các polyphenol tồn tại trong dịch

chiết bị oxy hóa làm giảm hàm lượng polyphenol tổng trong dịch chiết.

Như vậy chúng tôi lựa chọn thời gian chiết 35 phút với hàm lượng polyphenol

tổng là 19,97% CK cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tăng hiệu suất chiết, tiết kiệm

thời gian và hiệu quả kinh tế.

3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (Tỉ lệ NL/DM) là yếu tố không chỉ ảnh hưởng đến

hiệu suất chiết tách mà còn ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế và quá trình tinh sạch về

sau.

Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol

tổng

Tỉ lệ NL/DM 1:15 1:20 1:25 1:30 1:40 1:50 1:60

PP tổng (%) 15,05 16,54 20,35 20,22 20,29 20,50 20,31

KL cao (g) 0,40 0,41 0,41 0,41 0,42 0,42 0,41




Hình 3. 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng

polyphenol tổng

Kết quả chỉ ra rằng, khi tăng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1:15 đến 1:25 thì

hàm lượng polyphenol tổng tăng rõ rệt (từ 15,05% lên 20,345%). Tuy nhiên, khi tỷ lệ

này tiếp tục tăng từ 1:25 đến 1:60 thì hàm lượng thay đổi không đáng kể (chỉ dao động

từ 20,345% đến 20,31%).

Điều này có thể giải thích là do tỉ lệ này càng cao tức nồng độ chất cần trích ly

trên bề mặt pha rắn càng thấp, chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bề mặt vật liệu

rắn càng cao và làm tăng sự khuếch tán của chất tan từ vật liệu ra môi trường hay làm

tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao sẽ gây tốn kém và

gây khó khăn cho quá trình tinh chế về sau, do đó, xét về yếu tố kinh tế, tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi là 1/25 với hàm lượng polyphenol tổng là 20,345 % là phù hợp nhất và

chúng tôi lựa chọn tỷ lệ này cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng

Cùng với thời gian chiết, dung môi/nồng độ dung môi thì nhiệt độ cũng được

xem là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến hiệu suất chiết tách và hoạt tính sinh học của

dịch chiết.[70]

[100]

Bảng 3.7 thể hiện kết quả của nghiên cứu này.

Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng

Nhiệt độ (oC) 45 50 55 60 65 70 75 80

Pp tổng (%CK) 9,44 10,82 14,05 16,71 20,13 19,37 15,20 13,10

KL cao (g) 0,39 0,40 0,40 0,42 0,42 0,40 0,41 0,41




Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng

Chúng tôi nhận thấy rằng, trong khoảng 45 °C đến 80 °C, khi tăng nhiệt độ thì

hàm lượng polyphenol tổng số thu được tăng và dẫn đến hiệu suất chiết tăng. Tuy

nhiên, nếu tiếp tục tăng thêm nữa thì hàm lượng polyphenol và hiệu suất chiết giảm.

Điều này có thể là do: chiết ở nhiệt độ thấp đã làm chậm quá trình chuyển khối, lượng

polyphenol chiết rút được ít, vì vậy mà hiệu suất chiết thấp. Còn nếu nhiệt độ quá cao,

dung môi bị bay hơi nhiều, đồng thời có thể một phần polyphenol đã bị oxi hoá và làm

giảm hiệu suất chiết. Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng polyphenol tổng đạt cao

nhất (20,13%) khi nhiệt độ chiết là 65 °C và đạt thấp nhất (9,44%) khi chiết ở 45 °C.

Như vậy chúng tôi lựa chọn Nhiệt độ 65 0C, hàm lượng polyphenol tổng là

20,13 % CK cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.5. Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng

Nồng độ PH cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách polyphenol,

ở đây chúng tôi khảo sát nồng độ PH ở các khoảng từ 2 - 9, mẫu lá đối chứng là mẫu lá

được chiết với dung môi ethanol chưa qua hiệu chỉnh PH đo được PH là 4,3. PH được

điều chỉnh bởi axit citric và natri hidrocacbonat. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.8

dưới đây.

Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng

PH Mẫu đối

chứng 2 3 4 5 6 7 8 9

PP tổng (%) 20,03 19,84 20,79 20,29 18,59 16,81 16,51 15,10 13,95

KL cao (g) 0,42 0,41 0,42 0,42 0,42 0,43 0,42 0,41 0,41




Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng

Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng polyphenol tổng ổn định ở PH dung môi từ

2-4 và giảm nhẹ khi PH tăng lên 5, bắt đầu giảm mạnh từ 18,59% xuống còn 13,95%

khi PH tăng dần từ 6-9, như vậy PH càng tăng hàm lượng polyphenol tổng càng giảm,

PH bằng 3 có hàm lượng polyphenol tổng 20,79%K cao hơn mẫu đối chứng, tuy

nhiên ảnh hưởng không đáng kể. Do đó xét về yếu tố kinh tế cũng như độ tinh sạch

của polyphenol, chúng tôi quyết định không hiệu chỉnh nồng độ PH cho các nghiên

cứu tiếp theo.

Kết luận Tối ưu hóa các thông số nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly:

Như đã trình bày, các yếu tố hệ dung môi, nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly là những

yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi và thành phần các

polyphenol thu được. Từ kết quả khảo sát ở trên, chúng tôi đã lựa chọn miền khảo sát

tối ưu cho nồng độ dung môi là 70% v/v; thời gian trích ly 35 phút và nhiệt độ trích ly

650C, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:25.

3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng

trong cao chiết lá chè

Độ non già và độ ẩm của lá ảnh hưởng lớn tới hàm lượng polyphenol tổng,

chúng tôi khảo sát các loại lá tươi, nụ lá và lá già, lá đối chứng là lá 2; 3; 4; được tối

ưu ở mục (3.2), kết quả được trình bày ở bảng 3.12 như sau:

Bảng 3. 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá

Loại lá Lá đối chứng Lá Tươi Nụ lá Lá già

Pp tổng (%) 20,30 20,13 21,94 17,00

KL cao (g) 0,42 0,45 0,46 0,41




Hình 3. 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá

Từ kết quả trên cho thấy Hàm lượng polyphenol tăng theo chiều sinh trưởng

của lá từ lá già tới nụ lá. Hàm lượng polyphenol tổng của nụ lá 21,94% gấp 1,3 lần

hàm lượng polyphenol của lá già 17%.

Lá khô có hiệu suất chiết lớn hơn lá tươi, nguyên nhân có thể là do ở độ ẩm

cao, sự thẩm thấu dung môi vào trong vật liệu giảm, điều này ảnh hưởng đến độ phân

cực của hệ dung môi – nước trong vật liệu, từ đó ảnh hưởng đến độ hòa tan các hợp

chất phenol.

3.4. Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác

Sau khi khảo sát thêm một số yếu tố như nhiệt độ, số lần chiết với quy trình cụ

thể đã trình bày ở mục (2.3.2), chúng tôi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.10 như

sau:

Bảng 3. 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác

Mẫu Mẫu đối chứng TN 1 TN 2 TN 3

PP tổng (%CK) 20,03 20,30 20,26 19,54

KL cao (g) 0,42 0,43 0,43 0,32




Hình 3. 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng

polyphenol tổng

Như vậy Khi chiết ở nhiệt độ cao và lặp lại số lần chiết, hiệu suất chiết có tăng,

hàm lượng polyphenol tổng thu được cao hơn nhưng không đáng kể. Sau khi lắc với

hexan, hàm lượng polyphenol giảm cho thấy có thất thoát 1 lượng nhỏ polyphenol

trong quá trình tách béo.

3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách

polyphenol

3.5.1. Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol

Giữ nguyên các điều kiện tối ưu, emzym cenlulozo được thêm vào dung môi

với các tỉ lệ khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.11 như sau:

Bảng 3. 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách

polyphenol

Tỉ lệ

Enzym : NL 0% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 3,5% 4% 4,5%

Pp tổng 19,93 20,00 20,46 21,61 22,07 21,28 20,63 19,31 17,47

KL cao (g) 0,41 0,42 0,44 0,45 0,45 0,46 0,45 0,46 0,46




Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng

Enzyme Cellulase có ảnh hưởng tích cực đến việc tách polyphenol trong lá chè.

Hiệu suất chiết polyphenol tăng 1,107 lần so với nguyên liệu không sử dụng enzym.

Điều kiện xử lý tối ưu khi sử dụng cellulase để hỗ trợ chiết xuất bao gồm: tỷ lệ

cellulase và nguyên liệu thô là 2,5% (v / w), pH 5,5 và quá trình chiết được tiến hành ở

50 °C trong 60 phút.

3.5.2. Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol

Emzym pectinase được thêm vào dung môi với các tỉ lệ khác nhau, kết quả

được trình bày ở bảng 3.12 như sau:

Bảng 3. 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách

polyphenol

Tỉ lệ

Enzym : NL 0% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 3,5% 4% 4,5%

Pp tổng 19,97 20,13 20,33 20,63 20,66 20,79 20,03 19,64 18,62

KL cao (g) 0,42 0,42 0,43 0,43 0,44 0,44 0,44 0,43 0,44

Hình 3. 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng




Enzyme pectinase có ảnh hưởng tích cực đến việc tách polyphenol trong lá chè.

Hiệu suất chiết tăng 1,04 lần so với nguyên liệu không sử dụng enzym. Điều kiện xử

lý tối ưu khi sử dụng pectinase để hỗ trợ chiết xuất bao gồm: tỷ lệ pectinase và nguyên

liệu thô là 3,5% (v / w), pH 4,5 và quá trình chiết được tiến hành ở 40 °C trong 60

phút.

Việc áp dụng các enzym để khai thác polyphenol là một đề xuất hấp dẫn. Việc

xử lý tiền xử lý nguyên liệu thô thường dẫn đến giảm thời gian khai thác, giảm thiểu

việc sử dụng dung môi và tăng năng suất và chất lượng sản phẩm . Giảm sử dụng

dung môi trong quá trình chiết đặc biệt quan trọng đối với môi trường, cung cấp một

giải pháp 'xanh hơn' so với chiết xuất phi enzyme truyền thống. Qua kết quả khảo sát

enzym cho thấy cả hai loại enzym đều có tác dụng tăng hiệu suất chiết polyphenol, tuy

nhiên enzym cenlulozo có hiệu quả cao hơn, enzym pectinase hầu như tác dụng không

đáng kể.

3.6. Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol

tổng

Cao chiết lá chè được tinh chế với Clorofom được tách thành 2 phân lớp, chiết

lấy phân lớp trên là pha nước màu vàng cam, sau đó lắc với etyl axetat lấy phân lớp

trên là pha etyl axetat. Cô quay được cao polyphenol tinh khiết màu nâu nhạt.

Cao chiết chè lắc với clorofom Pha nước lắc với etyl axetat

Hình 3. 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat




Sau tinh chế chúng tôi tiến hành đo lại hàm lượng polyphenol tổng nhằm nghiên

cứu ảnh hưởng của quá trình chiết tới hàm lượng polyphenol tổng, kết quả được trình

bày ở bảng 3.13 như sau:

Bảng 3. 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol

Mẫu chè Mẫu trước tinh chế Mẫu sau tinh chế

(Đo ngay)

Mẫu sau tinh chế

(Lưu 2 ngày)

PP tổng (%) 20,06 19,51 15,89

KL cao (g) 0,42 0,087 0,09

Hình 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol

Quá trình tinh chế làm giảm một phần hàm lượng polyphenol tổng. Mẫu sau

chiết để 2 ngày cũng làm giảm lượng polyphenol tổng, nguyên nhân có thể là do

polyphenol bị oxy hóa theo thời gian.

3.7. Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè

Mẫu chè sau chiết tách bằng các điều liện tối ưu đã thu được hàm lượng polyphenol

tổng 20,06 % Chất Khô và 0,42 (g) cao chiết. Sản phẩm này được tiến hành định tính

bằng thuốc thử, sắc ký lớp mỏng TLC và UV – VIS.

Cao chiết lá chè sau tinh chế thu được 0,087 (g) cao, gửi mẫu định lượng bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

3.7.1. Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử

Chúng tôi tiến hành định tính 7 chỉ tiêu trong cao lá chè bằng thuốc thử, kết quả

được trình bày ở bảng 3.14 dưới đây:




Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất

STT Hợp chất Thuốc thử Hiện tượng Kết quả

1 Anthranoid Ethanol; HCl 4N; FeCl3 20%;

NaOH %

Màu đỏ +

2 Steroid –

triterpenoid

(CH3

CO)2O; H

2SO

4 Màu xanh tím +

3 Vitamin C K3[Fe(CN)

6] 5%; FeCl

3 5% Kết tủa xanh +

4 Saponin Nước cất/ HCl/NaOH Có sự tạo bọt +

5 Alkaloid Thuốc thử Wagner Kết tủa nâu +

6 Polyphenol K3[ Fe(CN)

6] 1% +FeCl

3 1% Kết tủa xanh đen +

7 Glycozittim Phản ứng Keller - Kaliani Vòng màu tím đỏ +

Qua kết quả định tính cho thấy sự hiện diện của hầu hết các hợp chất như

saponin, vitamin C, Anthranoid … và polyphenol xuất hiện rất rõ.

3.7.2. Định tính bằng TLC

Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi

Hệ dung môi khai triển:

Cloroform: Methanol: Axit axetic (9: 3: 3)

Kết quả thu được ở hình 3.16 như sau:

Thực nghiệm Của Tác giả Ashray Gupta

Hình 3. 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm

Kết quả định tính bằng TLC cho thấy ở hệ 1 có 1 vết tròn to với Rf = 0,77, còn

ở hệ 2 có 3 vết tròn phân lớp rõ rệt với Rf đo được lần lượt là 0,76; 0,6; 0,5. So sánh




với tài liệu tham khảo “Extraction, Purification, Identification and Estimation of

Catechins from Camellia sinensis” của tác giả Ashray Gupta với hệ dung môi như trên

thì các vết xuất hiện ở vị trí tương tự, chúng tôi dự đoán có thể là 3 trong 7 hợp chất

catechin Epigallocatechingallate (EGCG), Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin

(EGC), Gallocatechingallate (GCG), Epicatechin (EC), Gallocatechin (GC) và

Catechin (C).

3.7.3. Định tính bằng UV – VIS

Dịch chè phản ứng với thuốc thử pha loãng Folin-Ciocalteau phenol (FC) và natri

cacbonat (Na2CO3), sau đó được so sánh với dung dịch trắng của thuốc thử Folin-

Ciocalteau và natri carbonate. Màu xanh lục của dung dịch biểu thị sự xuất hiện của

polyphenol.

Chúng tôi tiến hành quét phổ nhằm xác định bước sóng cực đại và sự có mặt của

polyphenol trong dịch chè trước và sau tinh chế.

Kết quả được trình bày ở các bảng 3.15 và 3.16 như sau:

Bảng 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol

Số thứ tự Bước sóng (nm) Mật độ quang (Abs)

1 962,0 0,18077

2 832,5 0,13155

3 735,0 0,14960

Bảng 3. 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế

Số thứ tự Bước sóng (nm) Abs

1 963,0 0,13765

2 835,0 0,07445

3 755,0 0,08452




Kết quả quét phổ dịch chè trước và sau tinh chế có các bước sóng hấp thụ tối ưu

gần giống nhau (962 và 963; 832,5 và 835; 735 và 755) và giống với TCVN 9745-

1:2013 về bước sóng hấp thụ tối ưu là 765 (nm) cho thấy có thể có sự có mặt của

polyphenol trong dịch chiết lá chè trước và sau tinh chế.

Hình 3. 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế

3.7.4. Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC

Điều kiện thử nghiệm: Môi trường thử nghiệm ở nhiệt độ (25 ± 30C).

Bảng 3. 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol

STT

/Item

No.

Tên mâu

/Name of

samples

Chi tiêu

phân tich

/Analyzed item

Đơn

vi

/Unit

Kêt

qua

/Test

Results

Phương

phap

phân tich

/Test

Methods

1 Cao chiết lá

chè

Epigallocatechingallate mg/g 118.54 HPLC

Epicatechin mg/g 15.09




Hình 3. 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Bảng 3. 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Qua kết quả phổ HPLC ta thấy có xuất hiện 15 hợp chất trong đó định danh

được 4 chợp chất là EGC (Epigallocatechine), EC (Epicatechin), EGCG

(Epigallocatechingallate ) và ECG (Epicatechingallate), và định lượng được 2 hợp chất

là EGCG (118,54 mg/g) và EC (15,09mg/g). Qua đó ta thấy quá trình tinh chế cao

chiết thu được cao polyphenol khá tinh khiết, lẫn tạp chất không đáng kể.

3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè

3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa

Tsai và cộng sự[123]

đã nhận thấy rằng trong tất cả các thử nghiệm, lá chè có

hoatj tính kháng oxy hóa mạnh nhất, nên chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính oxy




hóa trên 4 loại lá: lá chè, lá lô hội, lá neem, lá xoài, thu được kết quả đo mật độ quang

như trình bày ở bảng 3.19.

Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ

Một số loại lá Mật độ quang

Lá Chè xanh 3,10

Lá Lô hội 0,46

Lá Neem 0,31

Lá Xoài 0,14

Hình 3. 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá

Từ kết quả trên ta thấy trong các loại lá, độ hấp thụ quang ở nồng độ 10 𝜇g/ml

của cao lá Chè xanh cao nên lực kháng oxy hóa của cao lá Chè xanh vượt trội so với

các lá còn lại, cao gấp 22,1 lần lá xoài, gấp 10 lần lá neem, gấp 6,74 lần lá lô hội.

Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ

Mẫu Nồng độ Mật độ quang

Mẫu trước tinh chế 10 μg/ml 3,42



Mẫu tách béo bằng hexan 10 μg/ml 3,03

Mẫu sau tinh chế (Đo ngay) 10 μg/ml 3,10

Mẫu sau tinh chế (Lưu mẫu 2 ngày) 10 μg/ml 2,90

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

Lá Chè xanh Lá Lô hội Lá Neem Lá Xoài

Độ

hấp

th

ụ q

uan

g




Hình 3. 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ

Kết quả cho thấy tính oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ cao chiết, nồng độ càng

tăng, tính oxy hóa càng tăng. Mẫu sau khi tinh chế có tính oxy hóa kém hơn mẫu trước

khi tinh chế, mẫu sau chiết để 2 ngày có tính oxy hóa kém hơn mẫu mới, nguyên nhân

có thể là mẫu sau khi tinh chế hoặc để lâu tiếp xúc với không khí và ánh sáng, bị oxy

hóa làm giảm hàm lượng polyphenol tổng.

Mẫu tách béo bằng hexan có tính oxy hóa kém hơn mẫu không tách béo, như vậy

quá trình tách béo cũng làm ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol tổng.

3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn

Chúng tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 5 loại vi khuẩn: E.coli; B.

cereus; S. typhi; P.aeruginosa; S. aureus. Kết quả bảng 3.21 trình bày đường kính

vòng kháng khuẩn của 5 loại vi khuẩn trên, khả năng kháng khuẩn được xác định dựa

trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiên qua đường kính kháng

khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri, đường kính càng lớn hoạt tính kháng khuẩn càng cao,

vi khuẩn đó hoạt động càng kém.




Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè

STT

Đường kính

vòng kháng

khuẩn

Nồng…… D (mm)

độ ………………

(mg/ml)……………

E.coli B. cereus S. typhi P. aeruginosa S. aureus

1 Dịch chè 800 7,0 8,0 6,0 6,5 6,7

2 Dịch chè 400 6,5 7,5 4,0 6,0 4,0

3 Dịch chè 200 5,3 6,0 4,0 4,0 4,0

4 Dịch chè 100 5,3 5,0 4,0 3,0 3,5

5 Chloramphenicol 13 15 13 14 12

6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 4,0 4,3

Từ kết quả cho thấy nồng độ dịch chè càng giảm, đường kính kháng khuẩn càng

giảm, khi pha loãng nồng độ dịch chè tới nồng độ 100 mg/ml thì vẫn thấy đường kính

vòng kháng ở cả 5 loại vi khuẩn tức là khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá chè rất

cao dù nồng độ cao chiết chè rất thấp. Các vòng kháng đều rất to, rõ ràng và có sự

chênh lệch ít.

Hình 3. 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè




Hình 3. 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè

Chú thích: 1: 800 mg/ml

2: 400 mg/ml

3: 200 mg/ml

4: 100 mg/ml

5: chứng (+) tetracyline

6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5%

Trên chủng E.coli khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm nhẹ từ nồng độ

800 mg/ml và 400 mg/ml là 7 mm và 6,5 mm. Khi giảm nồng độ còn 200 mg/ml và

100 mg/ml thì đường kính kháng khuẩn không thay đổi là 5,3 mm cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn của cao chiết lá chè đối với chủng E.coli tương đối ổn định, dù giảm

nồng độ xuống thấp 100 mg/ml thì vẫn có khả năng kháng.

Trên chủng vi khuẩn B.cereus khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự

giảm nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 8 mm xuống 5 mm cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao

chiết lá chè.




Trên chủng vi khuẩn S.typhi khi khảo sát ở nồng độ 800 mg/ml thì đường kính

vòng kháng là 6 mm, sau đó giảm còn 4mm và không thay đổi dù giảm xuống các

nồng độ 200mg/ml, 100mg/ml.

Trên chủng P.aeruginosa khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy có sự giảm

nhẹ từ nồng độ 800 mg/ml - 100 mg/ml là 6,5 mm xuống 3 mm cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn của dịch lá chè đối với chủng giảm dần theo chiều giảm nồng độ cao

chiết lá chè

Trên chủng S.aureus khi tiến hành khảo sát với 4 nồng độ trên, nhận thấy sự

giảm mạnh từ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml là 6,7 mm xuống 4 mm, sau đó giảm

không đáng kể 4 mm xuống 3.5 mm khi giảm nồng độ từ 400 mg/ml xuống 100

mg/ml.

3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè

3.9.1. Ảnh hưởng của hàm lượng polyphenol tổng theo thời gian lưu mẫu

Các hợp chất thiên nhiên có nhược điểm là không bền theo thời gian, vì vậy

chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian lưu mẫu để kiểm tra xem mẫu có thể bền trong

khoảng thời gian nào, sau đây là kết quả thu được:

Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol

Ngày 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18

PP tổng (%) 19.45 18.55 17.54 17.47 17.16 16.81 16.15 15.42 12.92 12.3

Khối lượng cao 11.01 11.3 11.01 10.68 11.04 10.84 11.1 10.98 10.89 10.81

Hình 3. 23: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng

polyphenol




Từ kết quả cho thấy mẫu cao polyphenol có nồng độ polyphenol tổng giảm nhẹ

từ ngày 1 đến ngày 8 ( từ 19,45% - 18,55%), giảm mạnh từ ngày 14-16 và thấp nhất ở

ngày thứ 18 (12,3%).

3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao

chiết lá chè

Các sản phẩm ứng dụng thực phẩm, dược mỹ phẩm thường được xử lý ở nhiệt

độ, điều đó làm ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol của chế phẩm, vì vậy chúng tôi

tiến hành khảo sát các điều kiện nhiệt độ sấy tới chất lượng cao chiết lá chè. Mẫu đối

chứng là mẫu không sấy bằng nhiệt độ cao.

Bảng 3. 23: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol

Nhiệt độ Mẫu đối chứng 90 100 110 120

Pp tổng (%) 20,51 19,23 15,69 15,38 1,41

KL cao (g) 0,42 0,40 0,38 0,35 0,18

Hình 3. 24: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol

Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ càng cao hàm lượng polyphenol tổng càng

giảm, ở nhiệt độ 120 0C hàm lượng polyphenol giảm mạnh còn 1,41% ,vì vậy chúng

tôi quyết định sấy thăng hoa cao chiết lá chè nhằm giữ lại các thành phần có lợi cho

sức khỏe khác như protein, lipit, gluxit, vitamin, enzyme và hoạt chất sinh học, màu

sắc, mùi, vị …v.v




3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè

Sản phẩm sấy thăng hoa cao chiết lá chè giữ được màu và mùi thơm đặc trưng

của lá chè so với sấy ở nhiệt độ cao.

Hình 3. 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa

So sánh hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của bột polyphenol sau khi

sấy thăng hoa và cao polyphenol sau khi chiết thu được kết quả sau:

Cao polyphenol Bột sấy thăng hoa

PP tổng (%) 19,45 18,75

Tính oxy hóa 3,025 2,88

Qua bảng kết quả trên ta thấy hàm lượng polyphenol tổng và tính oxy hóa của

bột sấy thăng hoa giảm không nhiều so với cao polyphenol (từ 19,45 xuống còn 18,75

và 3,025 xuống còn 2,88) cho thấy tính ổn định của polyphenol trước và sau khi sấy

thăng hoa.




Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa trên 4 loại vi khuẩn

E.coli; B. cereus; S. typhi; P.aeruginosa; S. aureus, kết quả thu được ở bảng sau:

Bảng 3. 24: Hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa

STT

Đường kính

vòng kháng

khuẩn

Nồng…… D (mm)

độ ………………

(mg/ml)……………

E.coli B. cereus S. typhi S. aureus

1 Dịch chè 800 7,0 8,0 7,0 7,0

2 Dịch chè 400 6,0 7,0 6,5 6,5

3 Dịch chè 200 5,0 6,0 6,0 6,0

4 Dịch chè 100 3,0 4,0 6,0 5,0

5 Chloramphenicol 11,0 12 13,0 14,0

6 Tetracycline 7,3 8,0 6,0 8,0

Hình 3. 26: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của bột sấy thăng hoa




Hình 3. 27: Khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn của Bột sấy thăng hoa

Chú thích: 1: 800 mg/ml

2: 400 mg/ml

3: 200 mg/ml

4: 100 mg/ml

5: chứng (+) tetracyline

6: chứng (+) Ampicyline7: chứng (-) DMSO 5%

Kết quả thu được cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa vẫn có khả năng kháng

khuẩn cao so với trước khi sấy thăng hoa dù giảm nồng độ xuống còn 100 mg/ml cho

thấy quá trình sấy thăng hoa không làm ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của cao

polyphenol trong lá chè.

Từ đó ta rút ra kết luận sau: Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng

polyphenol tổng, tính oxy hóa và khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương

pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng

trong thực tế.

3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da

Kem tan dùng ban ngày để bảo vệ da và làm đẹp da đã được tẩy sạch, làm mất

lớp dầu trên da để các mỹ phẩm khác dễ dàng bám lên da. Khi sử dụng, kem phải lan

nhanh ra trên da và dường như biến mất ngay sau khi bôi lên da. Kem còn có tác dụng




giữ ẩm làm mềm mại da. Chất lượng kem dưỡng da được đánh giá trên các chỉ tiêu

cảm quan sau:

Bảng 3. 25: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da

(i) Cảm quan (35%)

Trên sản phẩm

Dạng và màu tự nhiên của nền

Độ phân pha

Độ bóng có ánh bạc

Độ linh động

Trên đối tượng sử dụng

Độ gây chỉnh da

Độ gây mát

Độ gây mùi lạ

(ii) Định lượng (45%)

Trên sản phẩm

Độ pH

Độ lún kim (mm)

Sai biệt độ lún kim (mm)

Điểm bắt đầu chảy (oC)

Trên đối tượng sử dụng

Độ tan trên da (giây)

(iii) Tính an toàn cho người sử dụng (10.0%)

Gây dị ứng cho da

(iv) Tính an toàn cho môi trường (5.0%)

(v) Tính tiện dụng (5.0%)

Hình 3. 28: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè




Kem dưỡng da làm từ cao chiết lá chè có màu xanh nhạt nhưng khi bôi lên da

có thể rửa được, màu xanh không bám lâu vào da, kem bôi lên mát và mịn, không kích

ứng da.




CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được những kết quả như sau:

1. Về mặt lý thuyết

- Tìm hiểu được tình hình trồng trọt, tiêu dùng và thương mại hóa lá chè ở Việt Nam

và trên thế giới.

- Tìm hiểu được các công trình nghiên cứu chiết tách polypheno, ưu nhược điểm của

các phương pháp chiết tách trong nước và trên thế giới.

- Tìm hiểu về các chủng vi khuẩn, lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp để nghiên cứu.

2. Về mặt thực nghiệm

- Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là:

Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ

chiết 65 oC, thời gian: 35 phút.

- Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có

hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu

suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và

hiệu suất tăng 1,04 lần.

Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%.

Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất

thấp 1,41% cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng. Vì

vậy chúng tôi sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của

nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban

đầu của lá chè.

- Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại

lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ.

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn


Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml).

- Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không

đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng

dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế.




- Cao polyphenol sau khi sấy thăng hoa hàm lượng polyphenol tổng, tính oxy hóa và

khả năng kháng khuẩn ổn định cho thấy phương pháp sấy thăng hoa nhằm bảo quản

polyphenol có tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tế.

- Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng

thí nghiệm).

3. Đào tạo và khoa học

- Đề tài này đã được tham gia cuộc thi nghiên cứu khoa học học sinh sinh viên 2018 –

2019.

- Đã được tham dự Triển lãm Khoa học & Công nghệ 2019.

4.2. Kiến nghị

1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè thể hiện ở cả 5 chủng vi khuẩn dù ở

nồng độ thấp, cần nghiên cứu thêm về nồng độ tối thiểu (MIC) khả năng kháng khuẩn

của từng loại khuẩn nhằm ứng dụng cho các sản phẩm như thuốc đánh răng, nước

súc miệng ngừa sâu răng, chống viêm khớp răng, khử hơi mồm, thơm hơi thở…

2. Mở rộng nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của các điều kiện nhiệt độ, PH, Thời gian..

tới hiệu suất chiết polyphenol có hỗ trợ enzym và hoạt tính sinh học của nó. Điều này

cho phép tạo cơ sở dữ liệu tổng quát để sử dụng enzym cho mục đích khai thác các

hợp chất có hoạt tính sinh học cao trong chè và có thể cung cấp một giải pháp thay thế

thân thiện môi trường cho việc chiết dung môi hữu cơ thông thường.

3. Mở rộng nghiên cứu sử dụng chế phẩm polyphenol chè cho Dược Mỹ phẩm như

thực phẩm chức năng, sản phẩm làm đẹp, bánh kẹo…và nghiên cứu chuyển giao cho

sản xuất công nghiệp.

4. Hợp chất polyphenol có tính Oxy hóa cao nên dễ bị oxy hóa ngoài môi trường,

cần bảo quản nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản các hợp chất polyphenol

đễ dễ dàng vận chuyển và sử dụng.

5. Cao polyphenol sau tinh chế vẫn còn một số tạp chất nên cần nghiên cứu xây dựng

quy trình quy trình tinh chế phân tách từng hợp chất polyphenol tinh khiết hơn.




TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Mai Thanh Nga, Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học,tách chiết hợp chất

poliphenol trong cây chè xanh Thái Nguyên, tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ,

80(04): 159-161.

2. Nguyễn Văn Chung và Trương Hương Lan (2007), Nghiên cứu công nghệ sản xuất

polyphenol từ chè xanh Việt Nam. Trong: các công trình nghiên cứu ứng dụng công

nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, NXB Lao động – Xã

hội, tr. 256 – 260.

3. Trần Chí Hải, Nguyễn Tấn Dân, Nguyễn Đình Nam, Lê Thị Hồng Ánh, Mẫn Phan

Vãn Mẫn (2016), Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly polyphenol từ lá

trà già, Tạp chí KHCN ĐHĐN, 9(106), tr. 69-72.

4. Ngô Hữu Hợp (1983), Hóa sinh chè, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

5. Nguyễn Tiến Lực (2016), Công nghệ chế biến thịt và thủy sản, NXB ĐH Quốc gia

HCM.

6. Đỗ Ngọc Quỹ, Nguyễn Kim Phong (1997), Cây chè Việt Nam, NXB Nông nghiệp,

Hà Nội.

7. Vũ Hồng Sơn, Hà Duyên Tư (2008), Khảo sát hàm lượng polyphenol trong một số

giống chè vùng trung du và miền núi các tỉnh phía bắc thu hái vào vụ đông, Tạp chí

hóa học, 46 (5A), tr. 198-202.

8. TCVN 9745-1-2013, Chè – Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen –

Phần 1: Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè – Phương pháp đo màu dùng thuốc

thử Folin – Ciocalteu.

9. Nguyễn Duy Thịnh (2004), Giáo trình công nghệ chế biến chè, ĐH Bách Khoa Hà

Nội.

10. Vũ Thị Thư, Lê Doãn Diên, Nguyễn Thị Gấm, Giang Trung Khoa (2001), Các hợp

chất có trong chè và một số phương pháp phân tích thông dụng trong sản xuất chè ở

Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

11. Lê Bạch Tuyết (1996), Quá trình trích ly, trong: Các quá trình công nghệ cơ bản

trong sản xuất thực phẩm, NXB Giáo dục, tr. 93-101.




Tài liệu tiếng Anh

12. A.O.C.S Official Method Cd 18-90, P-Anisidine value. In AOCS officicial method

Cd 18-90. 1998, Official methods and recommended practices of the American oil

chemists’society: Champaign, IL, USA.

13. Alupului, A. (2012), Microwave extraction of active principles from medicinal

plants, U.P.B. Science Bulletin, Series B, 74(2), pp. 129-142.

14. Amir, H. G., Barzegar, M., Sahari, M. A. (2005), Antioxidant activity and total

phenolic compounds of pistachio (Pistachiavera) hull extracts, Food Chemistry, 92, pp.

521–525.

15. Aoshima, H., Hirata, S., Ayabe, S. (2007), Antioxidative and anti-hydrogen

peroxide activities of various herbal teas, Food Chemistry, 103, pp. 617–622.

16. Arakawa, H., Maeda, M., Okubo, S., Shimamura, T. (2004), Role of hydrogen

peroxide in bactericidal action of catechin. Biol. Pharm. Bull., 27, pp. 277 –281.

17. Ashray Gupta (2012), Extraction, Purification, Identification and Estimation of

Catechins from Camellia sinensis.

18. Astill, C., Birch, M. R., Dacombe, C., Humphrey, P. G., Martin, P. T. (2001),

Factors Affecting the Caffeine and Polyphenol Contents of Black and Green Tea

Infusions, J. Agric. Food Chem., 49, pp. 5340−5347.

19. Atoui, A. K., Mansouri, A., Boskou, G., & Kefalas, P. (2005), Tea and herbal

infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile, Food Chemistry, 89, pp. 27–

36.

20. Azmir, J. Zaidul, I.S.M., Rahman, M.M., Sharif, K.M., Mohamed, A.F., Sahena,

Jahurul, M.H.A., Ghafoor,K., Norulaini, N.A.N., Omar, A.K.M. (2013), Techniques

for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review, Journal of Food

Engineering, 117, pp. 426–436.

21. Bansal, S., Choudhary, S., Sharma, M., Sharad Kumar, S., Lohan, S., Bhardwaj,

V., NavneetSyan, N., Jyoti, S. (2013), Tea: A native source of antimicrobial agents,

Food Research International, 53, pp. 568–584.

22. Baptista, J., Lima, E., Paiva, L., Castro, A.R. (2014), Value of off-season fresh

Camellia sinensis leaves. Antiradical activity, total phenolics content and catechin

profiles, Food science and technology, 59, pp. 1152-1158.




23. Barhe´, T.A., Tchouya, G.R.F. (2016), Comparative study of the anti-oxidant

activity of the total polyphenols extracted from Hibiscus Sabdariffa L., Glycine max L.

Merr., yellow tea and red wine through reaction with DPPH free radicals, Arabian

Journal of Chemistry, 9, pp. 1–8.

24. Bradshaw, M.P., Scollary, G.R., and Prenzler, P.D. (2001), Ascorbic acidinduced

browning of (+)-catechin in a model wine system, Journal of Agriculture and Food

Chemistry, 49, pp. 934-939.

25. Cacace, J.E., Mazza, G. (2003), Mass transfer process during extraction of

phenolic compounds from milled berries, Journal of Food Engineering, 59, pp. 379-

389.

26. Caturla, N., Vera-Samper, E., Villalain, J., Mateo, C. R., Micol, V. (2003), The

relationship between the antioxidant and the antibacterial properties of

galloylatedcatechins and the structure of phospholipid model membranes, Free Radic.,

Biol. Med., 34, pp. 648–662.

27. Chen, C-N., Liang, C-M., Lai, J-R., Tsai, Y-J., Tsay, J-S., Lin J-K. (2003),

Capillary Electrophoretic Determination of Theanine, Caffeine, and Catechins in Fresh

Tea Leaves and Oolong Tea and Their Effects on Rat Neurosphere Adhesion and

Migration, J. Agric. Food Chem., 51, pp.7495−7503.

28. Chen, Z.Y., Chan, P.T. (1996), Antioxidativeacitivity of green tea catechins in

canola oil, Chemistry and physics of lipids, 82, pp. 163 – 172.

29. Choung, M-G.and Lee, M-S. (2011), Optimal Extraction Conditions for

Simultaneous Determination of Catechins and Caffeine in Green Tea Leaves, Food

Sci. Biotechnol., 20(2), pp. 327-333.

30. Diker, K. S., Akan, M., Hascelik, G., Yurdakok, M. (1991), The bacterial activity

of tea against Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, Lett. Appl. Microbiol, 12,

pp. 34–35.

31. Elgawisha, R.A.R., Rahman, H.G.A., Abdelrazek, H.M.A. (2015), Green tea

extract attenuates CCl4-induced hepatic injury in male hamsters via inhibition of lipid

peroxidation and p53-mediated apoptosis, Toxicology, 2, pp. 1149–1156.




32. Escribano-Bailón, M.T., Santos-Buelga, C. (2003), Polyphenol extraction from

foods. In: Williamson, and Santos-Buelga, C., Methods in Polyphenol Analysis,

Cambridge: The Royal Society of Chemistry.

33. Fernaandez, P.L., Pablos, F., Martian, M.J. and Gonzaalez, A.G. (2002), Study of

Catechin and Xanthine Tea Profiles as Geographical Tracers, J. Agric. Food Chem.,

50, pp.1833-1839.

34. Fukai, K., Tadashi I., Hara Y. (1991), Antibacterial activity of tea polyphenol

against phytopathogenic bacteria, Agric. Biol. Chem., 55(7), pp. 1895-1897.

35. Fumio, N., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara Y. (1996), Scavenging

effects of tea catechins and their derivatives on DPPH, Free Radical Biology&

Medicine, 11(6), pp. 895-902.

36. Gadkari, P.V., Balaraman, M. (2015), Catechins: Sources, extraction and

encapsulation: A review, food and bioproducts processing, 93, pp. 122–138.

37. Gertenbach, D.D. (2002), Solid-Extraction technologies for manufacturing

nutraceuticals. In: Shi, J., Mazza G. and Le Moguer, M. Functional Foods.

Biochemical and processing aspect Vol 2. Boca Raton: CRC press LLC.

38. Hu, C-J., Gao, Y., Liu, Y., Zheng, X-Q., Ye, J-H., Liang, Y-R., Lu, J-L. (2016),

Studies on the mechanism of efficient extraction of tea components by aqueous

ethanol, Food Chemistry, 194, pp. 312–318.

39. Hundhausen, C., Bosch-Saadatmandi, C.K., Augustin, R., Blank, S., Wolffram, R.

G. (2005), Effect of vitamin E and polyphenols on ochratoxin Ainduced cytotoxicity in

liver (HepG2) cells. Journal of Plant Physiology, 162, pp.818—822.

40. Ibanez, E., Herrero, M., Mendiola, J.A., Castro-Puyana, M. (2012), Extraction and

characterization of bioactive compounds with health benefits from marine resources:

macro and micro algae, cyanobacteria, and invertebrates. In: Hayes, M. (Ed.), Marine

Bioactive Compounds: Sources, Characterization and Applications. Springer, pp. 55–

98.

41. Katalinic, V., Milos, M., Kulisic, T., &Jukic, M. (2006), Screening of 70 medicinal

plant extracts for antioxidant capacity and total phenols, Food Chemistry, 94(4), pp.

550–557.




42. Komatsu, Y., Suematsu, S., Hisanobu, Y., Saigo, H., Matsuda, R., & Hara, K.

(1993), Studies on preservation of constituents in canned drinks. Effects of pH and

temperature on reaction-kinetics of catechins in green tea infusion, Bioscience

Biotechnology and Biochemistry, 57(6), pp. 907–910.

43. Labbé, D., Tremblay, A. and Bazinet L. (2006), Effect of brewing temperature and

duration on green tea catechinsolubilization: Basis for production of EGC and EGCG-

enriched fractions, Separation and Purification Technology, 49, pp.1-9.

44. Lin, Y-L., Juan, I-M., Chen, Y-L., Liang, Y-C. and Lin, J-K. (1996), Composition

of Polyphenols in Fresh Tea Leaves and Associations of Their Oxygen-Radical-

Absorbing Capacity with Antiproliferative Actions in Fibroblast Cells, J. Agric. Food

Chem., 44, pp. 1387-1394.

45. Lin, Y-S., Tsai, Y-J., Tsay, J-S., Lin J-K.(2003), Factors Affecting the Levels of

Tea Polyphenols and Caffeine in Tea Leaves, Agric. Food Chem., 51, pp. 1864−1873.

46. Liu, F.F, Ang, C.Y.W., and Springer, D. (2000), Optimization of extraction

conditions for active components in Hypericumperforatum using surfacemethodology,

Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48, pp. 3364-3371.

47. Luczaj, W., Skrzydlewska, E. (2005), Antioxidative properties of black tea,

Preventive Medicine, 40(6), pp. 910–918.

48. Malgorzata, M., Szymuslak H., Gliszczyn, A., Wiglo, S-S., Rietjens, I.M.C.M.,

Tyrakowska B. E. (2008), pH-Dependent Radical Scavenging Capacity of

GreenTeaCatechins, J. Agric. Food Chem., 56, pp. 816–823.

49. Mendel, F. (2007), Overview of antibacterial, antitoxin, antiviral, and antifungal

activities of tea flavonoids and teas, Mol. Nutr. Food Res., 51, pp. 116-134.

50. Naczk, M., Shahidi, F. (2004), Extraction and analysis of phenolics in food,

Journal of Chromatography A (1054), pp. 95-111.

51. Naczk, M., Shahidi, F. and Sullivan, A. (1992), Recovery of rapeseed tannins by

various solvent systems, Food Chemistry, 45, pp. 51–54.

52. Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara, Y. (1996), Scavenging

effects of tea catechins and their derivatives on DPPH, Free Radical Biology&

Medicine, 11 (6), pp. 895-902.




53. Nihal, T., Sari, F., Velioglu Y. S. (2006), Effects of extraction solvents on

concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols

determined by ferrous tartrate and Folin–Ciocalteu methods, Food Chemistry, 99, pp.

835–841.

54. Nihal, T., Velioglu, Y. S., Sari, F. and Polat, G. (2007), Effect of Extraction

Conditions on Measured Total Polyphenol Contents and Antioxidant and Antibacterial

Activities of Black Tea, Molecule, 12, pp. 484-496.

55. Perva-Uzunalic, A., Sˇkerget, M., Knez, Z., Weinreich, B., Otto, F., Gruner S.

(2006), Extraction of active ingredients from green tea (Camellia sinensis): Extraction

efficiency of major catechins and caffeine, Food Chemistry, 96, pp. 597-605.

56. Pilar Prieto, Manuel Pineda,2and Miguel Aguilar, Spectrophotometric Quantitation

of Antioxidant Capacity through the F ormation of a P hosphomolybdenum C omplex:

Specific Application to the Determination of Vitamin E1.

57. Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong

Ngoc Tuyen (2006), Microwave – assisted extraction of polyphenols from fresh tea

shoot. Tạp chí Phát triển KH&CN, 9 (8), pp.69-75.

58. Qilong, R., Huabin, X., Zongbi, B., Baogen, S., Qiwei, Y., Yiwen, Y.andZhiguo,

Z. (2013), Recent Advances in Separation of Bioactive Natural Products, Chinese

Journal of Chemical Engineering, 21(9), pp.937-952.

59. Raza, H., John A. (2005), Green tea polyphenol epigallocatec hin-3-gallate

differentially modulatesoxidativ e stress in PC12 cell compartments, Toxicology and

Applied Pharmacology, 207, pp. 212–220.

60. Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., and Paganga, G. (1997), Antioxidants properties of

phenolic compounds, Trends in Plant Science, 2, pp. 152-159.

61. Rodriguez-Saona, L.E., Wrolstad, R.E. (2001), Anthocyanins: Extraction, isolation

and purification of anthocyanins. In: R.E. Wrolstad, Current Protocols in Food

Analytical Chemistry. New York: John Wiley & Sons.

62. Row, K.H., Jin Y. (2006), Recovery of catechin compounds from Korean tea by

solvent extraction, Bioresource Technology, 97, pp.790-793.

63. Rozzi, N. L., Singh R.K. (2002), Supercritical fluids and the food industry,

Comprehensive reviews in food science and food safety, 1, pp. 33-44.




64. Sari, F., Nihal, T., Polat, G. and SedaVelioglu, Y. (2007), Total polyphenol,

antioxidant and antibacteria activities of black mate tea, Food Sci. Technol. Res, 13

(3), pp. 265 – 269.

65. Shahidi, F., Alexander D. M. (1998), Green tea catechins as inhibitors of oxidation

of meat lipids, Journal of Food Lipids, 5, pp. 125-133.

66. Soussi A., Crouteb, F., Soleilhavoup, J-P., Kammoun, A., Feki A. E. (2006),

Impact du thé vert sur l’effet oxydatif du métavanadate d’ammoniumchez le rat male

pubère, C. R. Biologies, 329, pp.775–784.

67. Stalikas, C.D. (2007), Extraction, separation, and detectionmethods for phenolic

acids and flavonoids, J. Sep. Sci., 30, pp. 3268–3295.

68. Taguri, T., Tanaka, T., Kouno, I. (2004), Antimicrobial activity of 10 different

plant polyphenols against bacteria causing foodborne disease, Biol. Pharm. Bull., 27,

pp. 1965–1969.

69. Tao, X., Shi, S., Wan, X. (2006), Impact of ultrasonic-assisted extraction on the

chemical and sensory quality of tea infusion, Journal of Food Engineering 74, pp. 557–

560.

70. Tsai, T-H., Chien, Y-C., Lee, C-W., Tsai, P-J. (2008), In vitro antimicrobial

activities against cariogenic streptococci and their antioxidant capacities:

Acomparative study of green tea versus different herbs, Food Chemistry, 110, pp.

859–865.

71. Wu, C., Xu, H., Héritier, J., Andlaue, W. (2012), Determination of catechins and

flavonol glycosides in Chinese tea varieties, Food Chemistry, 132, pp. 144–149.

72. Yam, T. S., Shah, S., Hamilton-Miller, J. M. (1997), Microbiological activity of

whole and fractionated crude extracts of tea (Camellia sinensis), and of tea

components, FEMS Microbiol. Lett., 152, pp. 169–174.

73. Yamaki, S. (1984), Isolation of vacuoles from immature apple fruit flesh and

compartmentation of sugars, organic acids, phenolic compounds and amino acids,

Plant and Cell Physiology, 25, pp. 151-166.

74. Yao L., Caffin, N., D’arcy, B., Jiang, Y., Shi, J., Singanusong, R., Liu, X., Datta,

N., Kakuda, Y., Xu Y. (2005), Seasonal Variations of Phenolic Compounds in

Australia-GrownTea (Camellia sinensis), J. Agric. Food Chem., 53, pp. 6477−6483.




75. Zhang, Y. and Charles O. R. (2004), Evaluation of EpigallocatechinGallate and

Related Plant Polyphenols as Inhibitors of the FabG and FabIReductases of Bacterial

Type II Fatty-acid Synthase, The journal of Biological chemistry, 279 (30), pp. 30994–

31001.

76. Zhao, Y., Asimi, S., Wu, K., Zheng, J., Li, D. (2015), Black tea consumption and

serum cholesterol concentration: Systematic review and meta-analysis of randomized

controlled trials, Clinical Nutrition, 34, pp. 612 – 619.

Tài liệu Internet

77. Kim ngạch xuất khẩu chè Việt Nam tăng 11,8%. 24/07/2017, trích từ URL: CHÈ

VIỆT The Essence Vietnam.

78. Những công dụng hay của chè xanh với sức khoẻ. 28/05/2017, trích từ URL:

Chexanh.vn.

79. FAOSTAT, (2015)

TRƯỜNG ĐẠI H C BÀ R Athuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19850/1/Tong-Thi-Ngoc-Be.pdf ·...

Documents

Transcript of TRƯỜNG ĐẠI H C BÀ R Athuvienso.bvu.edu.vn/bitstream/TVDHBRVT/19850/1/Tong-Thi-Ngoc-Be.pdf ·...