ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Trần Thị Sao Mai

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH

CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN

TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62420107

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN

TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2014

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM

2. TS. LÊ QUANG HÒA

Phản biện : .........................................................................

Phản biện : .........................................................................

Phản biện : .........................................................................

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm Luận án Tiến sĩ họp tại...................................................

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm thông tin Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Ngộ độc thực phẩm đã có từ lâu và hiện vẫn xảy ra ở nhiều nơi trên thế

giới cũng nhƣ ở Việt Nam làm ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và

kinh tế xã hội. Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ

(FDA), hiện tại mỗi năm trên thế giới vẫn có khoảng 76 triệu ca ngộ độc

thực phẩm (NĐTP) với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện và khoảng 5 nghìn

ngƣời chết vì NĐTP. Nguyên nhân gây ra NĐTP có thể từ hóa chất, vi sinh

vật, độc tố tự nhiên hoặc không rõ nguyên nhân nhƣng ghi nhận từ thực tế

các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy nguyên nhân chính là do thực phẩm bị

nhiễm vi sinh vật. Trong số các tác nhân từ vi sinh vật gây NĐTP thì

Staphylococcus aureus (S.areus) là một trong những vi khuẩn gây ngộ độc

phổ biến nhất. S. aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dƣơng, phân bố rải rác

trong tự nhiên nhƣng chủ yếu đƣợc phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi của

ngƣời và gia súc. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đƣợc định nghĩa là sự tiêu

thụ các độc tố đƣờng ruột, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng

tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên.

Các phƣơng pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus

Enterotoxin – SE) trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức

tạp trong sử dụng, giá thành cũng nhƣ yêu cầu về trang thiết bị. Phƣơng pháp

tiêu chuẩn để phát hiện SE trong thực phẩm hiện nay là phƣơng pháp

ELISA. Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện

các SE trong thực phẩm nhƣ TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và

VIDAS. Nguyên tắc của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên kỹ thuật ELISA

kẹp đôi. Toàn bộ quy trình phân tích này thƣờng kéo dài từ 90 phút đến 4

giờ. Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động từ 0,1-5

ng/g hoặc ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích. Tuy nhiên, một

trong những nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy

đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả. Yêu cầu này hạn chế đáng kể

khả năng phân tích hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Mặt khác, giá thành

của các bộ sinh phẩm nhập ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp.

Xu hƣớng trên thế giới hiện nay là phát triển các phƣơng pháp phân tích

2

nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lƣợng lớn mẫu ngay tại hiện

trƣờng. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc

phát triển que thử phát hiện SE dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn

giản hóa và rút gọn thời gian phân tích xuống còn 30 phút. Hơn nữa, tại Việt

Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn mới chỉ dừng lại ở việc

phát hiện vi khuẩn tụ cầu mà chƣa phân tích tới SE, nguyên nhân chính gây

NĐTP do tụ cầu. Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu

tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong

thực phẩm”.

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ

thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh các SE từ SEA đến SEE trong

thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Sản xuất và tinh sạch SE tái tổ hợp SEA, SEC1 và ứng dụng để phát

triển que thử;

- Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng: IgY kháng BSA và

IgY kháng các SE (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), ứng dụng để

tạo que thử ;

- Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình cố định kháng thể lên que thử;

- Nghiên cứu xác định độ nhạy của que thử.

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

Đến nay, ở nƣớc ta việc đánh giá rủi ro vi sinh vật đối với S. aureus

chỉ dựa vào việc xác định và định lƣợng tụ cầu có phản ứng coagulase dƣơng

tính đƣợc phân lập trong các sản phẩm thực phẩm, phƣơng pháp này cần

nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và thời gian để trả lời kết quả

khoảng 1 tuần. Tuy vậy, kết quả phân tích chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm

có vi khuẩn tụ cầu vàng hay không mà không tìm ra có độc tố do vi khuẩn

tiết ra, là nguyên nhân thực sự gây NĐTP do tụ cầu. Kết quả nghiên cứu của

đề tài luận án đã giải quyết hạn chế này. Việc tạo ra que thử đã phát hiện

đƣợc các SE với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, thích hợp

với các phân tích hiện trƣờng không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền. Các

nguyên liệu chính để sản suất que thử (các kháng nguyên và kháng thể) đều

3

đƣợc chúng tôi chủ động tạo ra. Kết quả của đề tài luận án góp phần vào việc

kiểm soát tốt hơn các độc tố ruột tụ cầu, qua đó giảm thiểu các vụ NĐTP và

số ngƣời bị NĐTP do tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Điểm mới của luận án

Kết quả nghiên cứu nổi bật của đề tài luận án là đã tạo ra que thử phát

hiện đƣợc các SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất đƣợc kháng nguyên tái

tổ hợp SEA, SEC1 và việc sản xuất, tinh sạch đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng

gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng các đƣợc tố ruột tụ cầu (SEA,

SEB, SEC1, SED, SEE).

Cấu trúc của luận án

Ngoài phần mở đầu và kết luận, kiến nghị, luận án gồm 3 chƣơng:

- Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

- Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

- Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

- Phần phụ lục: Một số kết quả và hình ảnh nghiên cứu

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỤ CẦU KHUẨN

1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn

Tụ cầu khuẩn còn gọi là tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus là những

cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8-1,0 μm và xếp lại với nhau thành hình chùm

nho, bắt màu Gram dƣơng, coagulase và catalase dƣơng tính, không có lông,

không có vỏ, không sinh nha bào [1].

1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu vàng

Ở các điều kiện thông thƣờng, tụ cầu vàng phát triển đạt số lƣợng khoảng

106 cfu/g là đã có thể tạo ra độc tố. Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau

cho quá trình sinh trƣởng và sản sinh độc tố [82]. Nhiệt độ tối thiểu cho sản

sinh độc tố ruột tụ cầu là 100C và nhiệt độ tối đa là 48

0C, khoảng tối ƣu là từ

40 đến 450C [97]. Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất độc tố là dƣới 12%,

nhƣ vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ cầu sẽ bị

ức chế [82]. Điều kiện thích hợp nhất cho quá trình hình thành độc tố là pH

trung tính, quá trình này bị giảm hay bị ức chế ở pH axit.

4

1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU VÀNG

1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, lý hóa và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu

Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc ít nhất có 21 loại SE, có bản

chất là những chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp (khoảng từ 22

đến 29 kDa), mỗi chuỗi có những vị trí kháng nguyên chuyên biệt. Các độc

tố này dễ tan trong nƣớc và trong các dung dịch muối. Đặc biệt, các SE đƣợc

mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và không bị

protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy

phân vì thế chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời

[82].

1.2.2. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu

Hoạt tính sinh học của SE bao gồm hoạt tính siêu kháng nguyên

(superantigen) và hoạt tính gây nôn. Hoạt tính siêu kháng nguyên: gây sốt,

kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T không chuyên biệt.

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

1.3.1 Phép thử sinh học

Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng

gây các triệu chứng điển hình nhƣ nôn, tiêu chảy trên các động vật thí

nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào. Liều lƣợng

SE tối thiểu cần sử dụng là khoảng 200 ng [80].

1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử

Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần

đây là real-time PCR [24, 40, 85].

1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch

Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất hiện nay để phát hiện SE

trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch. Những phƣơng pháp này

bao gồm: phƣơng pháp khuếch tán trên gel, phƣơng pháp ngƣng kết hạt latex

– RPLA sử dụng các bộ kit RPLA và phƣơng pháp ELISA [40].

1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG

5

1.4.1. Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch

Cấu trúc của hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng gồm các

hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.1 dƣới đây [69]:

Hình 1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thƣờng đƣợc chia làm hai loại chính là sắc

ký miễn dịch kẹp đôi và sắc ký miễn dịch cạnh tranh.

- Sắc ký miễn dịch kẹp đôi: tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể

thứ hai (khác với kháng thể cộng hợp có màu) có khả năng bắt cặp với kháng

nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân

tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng

nguyên-kháng thể cộng hợp có màu. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung

dịch sẽ chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể và

kháng nguyên cố định. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi

chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng

thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên. Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm

đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng

hợp dƣơng tính (có độc tố trong mẫu phân tích) sẽ xuất hiện hai vạch màu.

Ngƣợc lại trƣờng hợp âm tính chỉ có một vạch màu. Ƣu điểm của sắc ký

miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng

thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên ở những vị trí khác nhau

mà không gây cản trở về mặt không gian. Nhƣợc điểm của nó là khó có khả

năng phát hiện đƣợc cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB,

6

SEC, SED, SEE do trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể nào có thể bắt

cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên.

- Sắc ký miễn dịch cạnh tranh:

+ Dạng 1: tại vị trí vạch thử nghiệm, kháng nguyên (hoặc một biến thể

của kháng nguyên) đƣợc cố định. Nếu độc tố có mặt trong mẫu phân tích,

chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng

nguyên-kháng thể cộng hợp. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ

chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa kháng nguyên cố định.

Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch

thử nghiệm sẽ không bị giữ lại do các vị trí liên kết đặc hiệu của kháng thể

đã bị bão hòa bởi kháng nguyên trong mẫu phân tích. Do đó, sự không xuất

hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đƣờng

ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân

tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu ở vị trí vạch kiểm chứng. Ngƣợc lại, mẫu

âm tính sẽ có hai vạch màu ở cả vị trí vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng.

+ Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể có khả năng bắt

cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này,

cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu

độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động lên

trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng

hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng

nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự xuất hiện vạch thử

nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột của tụ cầu.

Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh

tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm.

Chính vì vậy, sự không xuất hiện vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có

chứa độc tố ruột tụ cầu.

Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký miễn

dịch cạnh tranh dạng 2 để ứng dụng sản xuất que thử phát hiện 5 loại độc tố

(SEA-SEE) trong thực phẩm. Các ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn

7

dịch cạnh tranh để phát hiện 5 loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE bao

gồm: đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một

kháng thể.

1.4.2. Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu

trong thực phẩm

Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự tạo que thử

phát hiện SEB trong sữa với ngƣỡng phát hiện nằm trong khoảng từ 500

ng/ml đến 5 µg/ml [19]. Khi sử dụng máy đo từ để phát hiện tín hiệu, que

thử có thể phát hiện đƣợc nồng độ độc tố SEB trong các sản phẩm sữa thấp

từ 5 đến 0,25 ng/ml. Năm 2013, Keiko Yamada tạo que thử phát hiện SEA

với độ nhạy cao, phát hiện đƣợc nồng độ thấp đến 0,2 ng/ml [83].

1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) VÀ ỨNG DỤNG

CỦA IgY

Kháng thể lòng đỏ trứng IgY đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp gây

miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà.

Hiện nay, một số phƣơng pháp tách chiết và tinh chế IgY gà đã đƣợc

mô tả và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: Phƣơng pháp kết tủa: liên

quan đến amoni, natri sulfat, natriclorua [65, 71], polyetylenglycol (PEG),

axit caprylic và caragenean [71]; Phƣơng pháp sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký

trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, sắc ký tƣơng tác thiophylic, và sắc ký

gel lọc [71].

1.6. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S. aureus và từ phƣơng pháp tái tổ

hợp

Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu hiện trên E. Coli các độc tố ruột tụ

cầu ở dạng dung hợp với đuôi His hoặc đuôi GST nên có thể giúp đơn giản

hóa quy trình tinh sạch. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã

sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST. Vector đƣợc sử

dụng là pGEX-6P-1 và chủng E. Coli BL21 để biểu hiện protein. Sau khi

8

tinh sạch bằng bộ kit GST SpinTrap, protein tƣơng ứng có kích thƣớc 53

kDa ở dạng dung hợp với GST đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di

SDS-PAGE [3].

1.6.2. Phƣơng pháp tinh sạch độc tố ruột tụ cầu

Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong việc tinh sạch SE nuôi

trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh sạch bằng trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện

phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và FPLC (sắc

ký lỏng nhanh protein). Phƣơng pháp sắc ký ái lực có thể cho phép thu

protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch lên tới hơn 90%. Đuôi

His có ái lực cao với Ni2+

do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung

hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+

,

còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này.

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

- Các SE (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) của Toxin Technology, Mỹ.

- Gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, cân nặng 35-40g, có nguồn gốc từ

Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì.

- Kháng thể lòng đỏ trứng IgY thu đƣợc từ trứng gà Leghorn trắng tự

nuôi và đƣợc gây miễn dịch bằng các độc tố ruột tụ cầu và BSA.

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1. Vi sinh vật và plasmid

- Tế bào S.aureus mang gen sec1 đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh,

Viện Dinh dƣỡng Quốc gia.

- Tế bào vi khuẩn E. coli khả biến BL21 mua của Biolab.

- Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA ở dạng dung hợp

với đuôi GST (glutathione-S-transferase) đƣợc cung cấp bởi phòng công

nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học

Bách Khoa Hà Nội.

9

- Plasmid pGS-21a (Genescript), dùng làm vector biểu hiện cho nhân

dòng và biểu hiện gen sec1

2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm

Các môi trƣờng, sinh phẩm, các hóa chất, dung môi, các dụng cụ, vật

tƣ tiêu hao chuyên biệt của phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử nhƣ

các môi trƣờng nuôi cấy, các kháng thể đơn dòng, các hóa chất nhập khẩu từ

nƣớc ngoài, màng lọc, các dãy giếng ELISA,….

2.2.3. Máy, thiết bị:

Các máy và thiết bị chuyên dụng nhƣ máy ly tâm, tủ ổn nhiệt, bộ điện

di,… có ngồn gốc từ Mỹ, Đức và Trung Quốc.

2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S.aureus

Sử dụng các chất tẩy rửa (SDS, CTAB) và chloroform làm biến tính

thành tế bào, protein dạng Histon và polysaccharide của S. aureus. Sau đó bổ

sung lysozyme, protease K phá vỡ thành tế bào và liên kết peptid . Bổ sung

EDTA ức chế hoạt động của Dnase và nồng độ muối CH3COONa cao hỗ trợ

cho việc kết tủa DNA. Sau khi ly tâm, hút lớp dung môi phân cực phía trên

chứa DNA và thêm ethanol 1000, 1 giờ, nhiệt độ phòng. DNA kết tủa thu

đƣợc sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc rửa trong ethanol 700 trƣớc khi hòa tan

trong đệm TE (Tris-EDTA).

2.3.2. Kỹ thuật PCR

Gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc

hiệu (SEC-F và SEC-R) có gắn vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn BamHI và

HindIII. Trong đó, các thành phần của phản ứng PCR đã đƣợc chuẩn hóa với

tổng thể tích là 50 µl và chu trình nhiệt nhƣ sau: biến tính ở 950C, 4 phút và

quá trình nhân bản với 35 chu kỳ, kéo dài thêm ở 720C, 5 phút và bảo quản

ở 100C. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: biến tính ở 95

0C, 30 giây, gắn mồi ở 55

0C,

30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp

đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.

2.3.3. Thu nhận DNA từ gel agarose

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET Gel Extraction

Kit (Fermentas) theo phƣơng pháp của nhà sản xuất.

10

2.3.4. Phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn và nối với vector tạo

dòng

Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) đƣợc cắt bằng enzyme

giới hạn là BamHI và HindIII và kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel

agarose 0,8%.

Sau khi làm tan các hóa chất (trừ T4 DNA ligase) ở nhiệt độ thƣờng,

tiến hành đảo trộn bằng máy vortex và ly tâm góp mẫu.

2.3.5. Phƣơng pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.Coli

BL21

Phƣơng pháp này làm theo hƣớng dẫn của nhà cung cấp tế bào khả

biến E.Coli BL21.

2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào E. coli và chuẩn bị dịch protein thô

Các dòng tế bào chuyển gen đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng

có bổ sung thêm 100 mg/L ampicillin. Canh trƣờng đƣợc nuôi ở 370C trong

điều kiện lắc 150 vòng/phút cho đến khi OD600nm đạt khoảng 0,8 thì bổ sung

chất cảm ứng IPTG và tiếp tục nuôi cấy ở các điều kiện thí nghiệm về nhiệt

độ (160C, 30

0, 37

0), thời gian (từ 2h, 5h, 7h, 8h) và chất cảm ứng từ 0,05 đến

1mM IPTG.

2.3.7. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực GST

Trong nghiên cứu này, bộ kit GST SpinTrap (GE Healthcare) đã đƣợc

sử dụng để tinh sạch SEA ở dạng dung hợp với GST.

2.3.8. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực His

Tiến hành tinh sạch protein theo kit His Mag SepharoseTM

Ni để thu

đƣợc protein tinh sạch cho độ tinh khiết cao theo hƣớng dẫn của nhà sản

xuất.

2.3.9. Phƣơng pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE)

Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) đƣợc tiến hành

theo các phƣơng pháp của Laemmli.

2.3.10. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Để đánh giá lƣợng SEA trong dịch chiết protein thô, phƣơng pháp

ELISA kẹp đôi đã đƣợc sử dụng.

2.3.11. Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng OD

11

Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím

cực đại ở bƣớc sóng 280nm.

2.3.12. Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà

Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và

kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE)

theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu của Agro-Bio 2011.

2.3.13. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn

bằng PEG

Tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bằng

PEG 6000 theo mô tả của Polson 1980.

2.3.14. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nƣớc, chỉnh

pH và gây kết tủa bằng Natri clorua

Tinh sạch theo phƣơng pháp pha loãng trong nƣớc chỉnh pH và gây

kết tủa bằng Natri clorua đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013.

2.3.15. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng cột “ Hi Trap IgY Purification

HP”

Tinh sạch IgY theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất GE Healthcare Bio-

Sciences AB.

2.3.16. Cố định IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE

(A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose

Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl

Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể

IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) đƣợc phun lên trên

màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm bằng

thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng

đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Cutter 4000

(Biodot, Anh).

2.3.17. Chuẩn bị phức hợp phát hiện kháng nguyên - nanocarbon

Kháng nguyên tinh sạch SEC1 ở dạng dung hợp đƣợc gắn với hạt

nanocarbon ở trạng thái huyền phù theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi nhà

sản xuất Maiia Diagnostics.

12

2.3.18. Phân tích mẫu bằng que thử

Mỗi mẫu phân tích có từng loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE

với nồng độ khác nhau đƣợc pha trong 100 µl dung dịch đệm chạy và đƣợc

đƣa vào giếng. Tiếp đó, cắm que thử vào giếng và ủ trong 15 phút. Sau đó,

bổ sung kháng nguyên cộng hợp. Kết quả âm tính sẽ ứng với việc xuất hiện

vạch, kết quả dƣơng tính ứng với việc không xuất hiện vạch tại vị trí vạch in

kháng thể.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU

3.1.1. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEA

3.1.1.1. Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEA vào tế bào E.Coli

Plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA đƣợc biến nạp vào tế bào E.

coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt trên môi trƣờng LB có bổ sung

ampicillin

3.1.1.2.Chọn dòng các chủng mang gen mã hóa SEA

Sau khi tiến hành biến nạp và thu nhận các dòng tế bào E. coli đƣợc

chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc các dòng tế bào E. coli để chọn

ra những dòng tạo độc tố ruột SEA nhiều nhất bằng việc sử dụng kỹ thuật

ELISA kẹp đôi để đánh giá lƣợng SEA đƣợc tạo ra trong canh trƣờng nuôi

cấy. Sau khi chọn đƣợc 5 dòng khuẩn lạc cho khả năng sinh SEA cao nhất,

chúng tôi tiến hành lặp lại quy trình trên có tính đến nồng độ protein trong

mỗi mẫu để tìm ra khuẩn lạc có khả năng sinh SEA cao nhất là dòng tế bào

số 2.

3.1.1.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA

Tiến hành khảo sát trên ba yếu tố là nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và

thời gian cảm ứng, lựa chọn nuôi ở hai nhiệt độ là 300C và 16

0C. Quy trình

nuôi cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trong quá trình sàng lọc, nuôi tế bào

trong môi trƣờng LB lỏng tới khi đạt OD600 = 0.8 thì thêm chất cảm ứng

IPTG với các nồng độ tƣơng ứng là 0,25mM, 0,5mM và 1mM, sau đó tiến

hành lấy mẫu ở các mốc thời gian: với nhiệt độ 300C, thời gian lấy mẫu là

2h, 5h, 7h; với nhiệt độ là 160C, thời gian lấy mẫu là 12h, 16h,19h.

13

Hình 3.1. Đồ thị tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA

Trong các điều kiện nuôi cấy đã đƣợc thử nghiệm, điều kiện tốt nhất

cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng là

1mM và thời gian cảm ứng là 5h.

3.1.1.4. Tinh sạch SEA từ dịch chiết protein thô

Tinh sạch theo phƣơng pháp sắc ký ái lực để thu đƣợc SEA ở dạng

tinh khiết. Để kiểm tra về kích thƣớc của protein thu đƣợc trong dịch rửa

giải, chúng tôi tiến hành điện di theo phƣơng pháp điện di biến tính protein

SDS-PAGE. Kết quả điện di đã thể hiện rõ: trong dịch rửa giải có sự xuất

hiện một vạch protein với khối lƣợng trong khoảng từ 50-60 kDa khi so sánh

với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein mà chúng tôi

mong đợi là SEA trong trạng thái dung hợp với GST có khối lƣợng là 53

kDa.

Hình 3.2. Điện di đồ protein SEA

tái tổ hợp sau tinh sạch

Ghi chú: 1: Dịch chiết protein

thô, tế bào E. coli không qua biến

nạp; 2: Dịch chiết protein thô, tế

bào E. coli đã qua biến nạp; 3:

Dịch rửa giải thu được từ quá

trình tinh sạch; 4: Thang chuẩn

protein.

14

3.1.2. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEC1

3.1.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus

Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng

Staphylococcus aureus cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên

cao chính là DNA tổng số của S. aureus. Điều này chứng tỏ DNA tổng số

sau khi tách chiết không bị đứt gãy, còn nguyên vẹn nên đƣợc chúng tôi

dùng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.

Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số

của chủng Staphylococcus aureus

Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb;

1-5: DNA tổng số S.aureus

3.1.2.2. Kết quả khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR

Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ chủng S.aureus, chúng tôi tiến

hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R để

khuếch đại gen sec1 khoảng 801 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra

trên gel agarose 1,2%.

Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR

trên gel agarose 1,2%

Ghi chú: Kênh M: Thang DNA

chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1

Kết quả điện di cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã

thu đƣợc đoạn DNA đặc hiệu, rõ nét không có vạch phụ k m theo, có kích

thƣớc khoảng 801 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. Do

vậy, sản phẩm PCR này đƣợc chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pGS-21amang gen sec1

15

Sản phẩm PCR sau khi đƣợc xử lý bằng hai enzymegiới hạn BamHI

và HindIII đƣợc tinh sạch theo quy trình bộ kit GeneJET PCR Purification

Kit (Fermentas) và sản phẩm sẽ là nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu

hiện.

Tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn

BamHI và HindIII trong 3 giờ ở 370C để tạo vết cắt giống với đoạn gen sec1

sẽ đƣợc cài vào. Vector sau khi mở vòng bằng hai enzyme là một băng duy

nhất có kích thƣớc khoảng 6169 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector

pGS-21a nhƣ trong lý thuyết.

Hình 3.5. Điện di đồ plasmid

pGS-21asau khi cắt bằng enzym

cắt giới hạn

Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn

1kb; 1, 2: vector pGM-1 mở vòng

Sau khi mở vòng và tinh sạch vector pGS-21a, chúng tôi ghép nối

vector này với gen sec1 nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối

là Plasmid pGM-1-sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli BL21.

3.1.2.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp SEC1

Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1

đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, sau

đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng có ampicillin. Để nghiên

cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành

công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin,

lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 370C cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 thì bổ

sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 300C trong

5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel

polacrylamide và cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ

đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh

với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein SEC1 mà chúng

tôi đã tính toán trên lý thuyết.

16

Hình 3.6. Điện di đồ biểu hiện gen

SEC1 trong protein tổng số của các

tế bào E.coli BL21

Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1:

Đối chứng âm (protein tổng số trong

dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli

BL21); 2: Protein trong dịch chiết

dòng E. coli đã biến nạp được cảm

ứng IPTG.

3.1.2.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen sec1

Để xác định đƣợc điều kiện tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành thử biểu

hiện gen ở các điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ, thời gian

cảm ứng khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein

SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiệnnồng độ chất cảm ứng IPTG (0,05 -1 mM),

nhiệt độ (300C và 37

0C) và thời gian (2 giờ, 5 giờ và 8 giờ). Dịch chiết thu

đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel acrylamide

12%. Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamide cho thấy điều kiện tốt nhất

cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEC1 là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng

IPTG là 0,3mM và thời gian cảm ứng là 8h.

Hình 3.7. Điện di đồ protein SEC1 biểu hiện

ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian với nồng

độ IPTG 0,3mM.

Ghi chú: 1: Thang protein chuẩn, 2-8:

điều kiện nhiệt độ và thời gian lần lượt

là: 8h, 370C; 8h30

0C; 5h,37

0C; 5h,30

0C;

2h, 370C; 2h,30

0C, 0h

3.1.2.6. Tinh chế protein tái tổ hợp SEC1

Chúng tôi tinh sạch protein tái tổ hợp theo phƣơng pháp sắc ký ái lực

sử dụng bi từ HisMag SepharoseTM

Ni để thu đƣợc SEC1 ở dạng tinh khiết.

17

Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy protein SEC1 thu nhận đƣợc có độ

tinh sạch cao, không tạp nhiễm các protein của vi khuẩn.

Hình 3.8. Điện di đồ protein SEC1 tái

tổ hợp sau tinh sạch

Ghi chú:

Kênh 1,4 : Protein trước khi tinh sạch;

Kênh 2,3: Protein sau khi tinh sạch;

M: Marker.

3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY

3.2.1. Kết quả tinh sạch kháng thể IgY

Chúng tôi lựa chọn tách chiết IgY bằng hai phƣơng pháp sau: phƣơng

pháp tách phân đoạn bằng nƣớc và muối natri clorua đã đƣợc tối ƣu hóa

năm 2013 [ 6 5 ] và phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bởi PEG [27].

Đây là những phƣơng pháp có quy trình đơn giản, hiệu quả, dễ thực hiện,

xử lý mẫu đơn giản, sản lƣợng tách chiết và độ tinh sạch IgY c a o , đang

đƣợc áp dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu [77]. Chúng tôi so sánh hai

phƣơng pháp tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng này để lựa chọn phƣơng pháp

phù hợp cho tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà. Kết quả điện di của cả hai

phƣơng pháp đều cho thấy hình ảnh IgY gồm hai băng đậm, rõ nét có khối

lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử của chuỗi nặng (khoảng

67kDa) và chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa), ngoài ra trên các đƣờng điện di vẫn

còn các vạch khác rất mờ. Do vậy, có thể kết luận rằng đã tách chiết thành

công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà với độ tinh sạch khá cao. Tuy

nhiên, khi so sánh hình ảnh điện di IgY của đƣờng số 1 và đƣờng số 2 cho

thấy vạch protein tạp không phải kháng thể ở đƣờng số 1 ít hơn so với

đƣờng số 2, điều này chứng tỏ phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng tách phân

đoạn nƣớc và NaCl có độ tinh sạch cao hơn so với phƣơng pháp pháp kết

tủa phân đoạn bởi PEG.

18

Hình 3.9. Điện di đồ kháng thể IgY

sau tinh sạch

Ghi chú: 1: IgY tinh sạch theo

phương pháp tách phân đoạn bằng

nước và muối natri clorua; 2: IgY

tinh sạch theo phương pháp kết tủa

phân đoạn bởi PEG.

Để tạo ra kháng thể IgY có độ tinh sạch cao, hoạt tính kháng thể

mạnh hơn làm nguyên liệu cho que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu,

kháng thể IgY đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp tinh sạch bằng tách phân đoạn

nƣớc và NaCl đƣợc tinh sạch trên cột sắc ký tƣơng tác thiophylic (Hi Trap

IgY Purification HP).

Hình 3.10. Điện di đồ các giai đoạn tinh sạch kháng thể IgY qua cột

sắc ký

Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: IgY sau tinh sạch bằng tối ưu hóa

kết tủa NaCl; 2, 3: Dịch rửa cột sau khi cho mẫu vào; 4: IgY thu được

sau tinh sạch; 5:Dịch rửa cột của đệm làm sạch.

3.3. ỨNG DỤNG SEC1 TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ

TRỨNG IGY ĐỂ TẠO QUE THỬ

3.3.1. Xác định lƣợng kháng thể lên vạch kiểm chứng

19

Kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng là kháng thể đa dòng kháng BSA

đƣợc tách chiết và tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà. Tiến hành pha loãng IgY tới

các nồng độ 0,1; 0,3; 1 µg/µl và in lên màng nitrocellulose với liều lƣợng

1µl/cm. Chúng tôi sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng là 0,3 μg/μl để in

màng với liều lƣợng là 1 μl/cm.

1 2 3

Hình 3.11. Lựa chọn lượng kháng

thể đa dòng kháng BSA để cố định lên vạch

kiểm chứng.

1. Nồng độ kháng thể là 400 ng /que thử

2. Nồng độ kháng thể là 120 ng /que thử

3. Nồng độ kháng thể là 40 ng /que thử

3.3.2. Xác định lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm

Chúng tôi đã sử dụng kháng thể lòng đỏ trứng IgY từ lô gà tiêm 5 loại

độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ D+E), sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp

tách phân đoạn nƣớc và NaCl, đƣợc tinh sạch tiếp bằng cột sắc ký in lên

vạch thử nghiệm của que thử. Pha loãng kháng thể tới các nồng độ 5; 1,5;

0,5μg/μl và in các dung dịch này lên màng nitrocellulose với liều lƣợng 1

μl/cm. Sau đó sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều

lƣợng kháng nguyên cộng hợp là 5 μl/100 μl đệm chạy. Dựa vào kết quả của

các thí nghiệm, chúng tôi tiến hành sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng là

1,5 μg/μl để in màng với liều lƣợng là 1 μl/cm.

Hình 3.12. Lựa chọn lượng kháng thể cố định

lên vạch thử nghiệm

1. Nồng độ kháng thể là 2 µg/que thử

2. Nồng độ kháng thể là 0,6 µg /que thử

3. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg /que thử

3.3.3. Xác định lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng

Vì sử dụng phƣơng pháp cạnh tranh để phát hiện SEA – SEE nên

lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần dùng phải có liều lƣợng ít nhất nhƣng vẫn

20

phải đảm bảo mẫu âm tính phải xuất hiện vạch. Chúng tôi tiến hành sử dụng

1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 µl kháng nguyên cộng hợp cho mẫu âm tính.

Các kết quả chỉ ra rằng lƣợng kháng nguyên cộng hợp nhỏ nhất vẫn cho các

tín hiệu vạch khá rõ ràng là 2µl. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo,

chúng tôi sử dụng 2µl kháng nguyên cộng hợp cho một que thử.

Hình 3.13. Lựa chọn lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng

Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Lượng kháng nguyên cộng hợp sử dụng

cho 1 phản ứng là 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 và 1 µl.

3.3.4. Xác định độ nhạy phát hiện của que thử với 5 loại độc tố

Chúng tôi đã chuẩn bị các mẫu kháng nguyên SEA, SEB, SEC1, SED và SEE với nồng độ ban đầu là: 1000ng/ml rồi tiến hành pha loãng đến

các nồng độ 300 ng/ml, 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml và 1 ng/ml.

Các kết quả thí nghiệm với từng độc tố cho thấy:

Với SEA, SEB và SED khi phân tích bằng mắt thƣờng, độ nhạy phát

hiện của que thử là khoảng 30-100 ng/ml.

Hình 3.14. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong đệm

Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1

ng/ml và mẫu âm tính không chứa SEA.

21

Với SEC1, SEE độ nhạy phát hiện của que thử là khoảng 10-30 ng/ml.

Hình 3.15. Thử độ nhạy của que thử với SEC1

Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1

ng/ml và mẫu âm tính không chứa SEC1.

Ứng dụng que thử phát hiện SEA-SEE trong sữa

Chúng tôi áp dụng kết quả của lƣợng kháng nguyên cộng hợp cho mẫu

âm tính là 3 µl để thử nghiệm với các nồng độ sữa pha loãng khác nhau

nhằm tìm ra nồng độ sữa pha loãng thấp nhất mà vẫn đảm bảo mẫu âm tính

xuất hiện vạch.

Hình3.16. Lựa chọn nồng độ sữa pha loãng cho que thử

Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Độ pha loãng sữa sử dụng cho 1 phản ứng

là 1; 2; 3; 4; 5; 6 ; 7; 8; và 10 lần

Để tối ƣu hóa đƣợc độ pha loãng sữa dùng cho thử nghiệm, chúng tôi

tiến hành pha loãng ở các mức độ: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 lần trong

dung dịch đệm chạy. Các kết quả đã chỉ ra rằng mức độ pha loãng sữa thích

hợp cho thử nghiệm là 3 lần.

Xác định độ nhạy phát hiện của toàn bộ quá trình phân tích

Từ các kết quả sau khi phân tích bằng que thử với 5 loại độc tố ruột

của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) khi phân tích trong đệm chạy và

22

khi sử dụng chất nền là sữa, chúng tôi có thể kết luận rằng độ nhạy phát hiện

của toàn bộ quá trình phân tích nhƣ sau :

- Với SEA và SEB, SED: trong dung dịch đệm chạy thì độ nhạy phát

hiện của que thử khoảng 30-100 ng/ml; trong sữa thì độ nhạy phát hiện

khoảng 30-90 ng/ml.

Hình 3.17. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong sữa

Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9;

3 ng/ml, mẫu âm tính sữa không chứa SEA và mẫu âm tính đệm không

chứa SEA.

- Với SEC1, SEE trong dung dịch đệm chạy thì độ nhạy phát hiện của

que thử khoảng 10-30 ng/ml; trong sữa thì độ nhạy phát hiện khoảng 9-30

ng/ml.

Hình 3.18. Thử độ nhạy của que thử với SEC1 trong sữa

Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30;

9; 3 ng/ml, mẫu âm tính sữa không chứa SEC1.

23

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Nghiên cứu của đề tài luận án đã đã đạt đƣợc các kết quả sau:

1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa

cho độc tố ruột tụ cầu SEC1.

2. Đã biến nạp thành công plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA

và plasmid pGS-21a- sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu vào tế bào

E. coli BL21. Đã sàng lọc đƣợc dòng tế bào E. coli có khả năng sinh SEA

và SEC1 cao.

3. Đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh tổng hợp SEA và

SEC1: nhiệt độ 30oC; nồng độ chất cảm ứng IPTG với SEA là 1 mM,

còn với SEC1 là 0,3 mM; thời gian cảm ứnglần lƣợt là 5 giờ và 8 giờ. Đã

tinh sạch SEA tinh khiết ở dạng dung hợp với GST, SEC1 ở dạng dung

hợp với đuôi GST và 2 vùng đuôi His.

4. Đã sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và

kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ C2+ D+E) từ

gà Leghorn trắng với độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao.

5. Đã tạo thành công que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu với độ nhạy

phát hiện với SEA và SEB, SED trong đệm chạy khoảng 30-100 ng/ml,

trong sữa thì độ nhạy phát hiện khoảng 30-90 ng/ml; với SEC1, SEE

trong đệm chạy khoảng 10-30 ng/ml, trong sữa thì độ nhạy phát hiện

khoảng 9-30 ng/ml.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu nhằm tối ƣu hóa que thử để tăng độ nhạy phát hiện

với 5 loại độc tố ruột của tụ cầu (SEA-SEE), đơn giản hóa quy trình phân

tích để có thể đi vào sản xuất, ứng dụng để phát hiện các loại độc tố này

trong nhiều loại thực phẩm trên hiện trƣờng.

|

24

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC

ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN

1). Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn

Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2012), “Ứng dụng kỹ thuật sắc ký

miễn dịch cạnh tranh để tạo que thử phát hiện nhanh độc tố ruột A của

tụ cầu”, Y học thực hành, 842, tr.213-217.

2) . Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị

Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2012), “Sản xuất và thử nghiệm bộ sinh

phẩm ELISA phát hiện nhanh độc tố ruột dạng A của tụ cầu”, Y học

thực hành, 842, tr.217- 220.

3). Le Quang Hoa, Tran Thi Sao Mai, Nguyen Thị Khanh Tram, Tô Kim

Anh (2014), “Development of a Lateral Flow Immunoassay for

theRapid Detection of Staphylococcal Enterotoxin A in Milk”, VNU

journal of Science, 30, pp 153-157.

25