日皮会誌:100 (2), 215-217, 1990 (平２）

Tｒichoｔｈｙtｏｎ　ｒｕhｒｕＴｎ　<Ｄ産生する酸性及びアルカリ性

プロテアーゼの動態と菌増殖・培地pH変化との関連

関口かおる

古池　高志＊

西山

坪井

　　　　　　　　　　要　　旨

　Ｔｒichoｔhｙtｏｎ　ｒｕbｒｕｍの産生するプロテアーゼの生

物学的意義を探る目的で，酸性・アルカリ性両プロテ

アーゼの動態と周囲のpH環境との関連を検討した.

Ｔ，ｒｕbｒｕｍをＢＳＡ培地にて37℃の条件下で振逢培養

したところ，①培養初期は酸性（ｐＨ 4.5)プロテアー

ゼ活性が急激に高まるが，培養３～４週には低下，代

わってアルカリ性（ｐＨ 8.0)プロテアーゼ活性が遅れ

て増加した.②培地pHは当初6.0であったが培養と共

に徐々に上昇し，４週頃にはｐＨは7.0付近に固定され

た．③菌量も徐々に増加し，培地ｐＨ力貳〇付近に固定

すると同時にその増加度は止った．

　以上よりＴ,ｒｕhｒｕｍの産生する酸性，アルカリ性プ

ロテアーゼには時差発動というユニークな現象がみら

れ，また菌は時差発動しやすい条件（夕月）を作りなが

ら増殖していくと考えられた．

　　　　　　　　　　緒　　言

　最も一般的な白癖菌の一つであるＴｒｉｃｈｏｐｈｙtｏｎ　ｒｕ-

hｒｕｍ(Ｔ，ｒｕbｒｕｍ)は従来，アルカリ性の至適pHを

有するセリン系プロテアーゼを産生することが知られ

ている1)2)一方，糸状菌か産生するプロテアーゼにっ

いてはＹｕらｔi'->　Ｔｒichcｙｂｈｙtｏｎ ｍｅｎtａｅｒｏｔｈｙtｅｓ＾)4)滝内

らかＭｉｃｗｓｂｏｒｕｍ ｇｙpｓｅｕｍ＾>, Miびｏｓpoｒｕｍ ｃａｔiiｓ＊)7)

からそれぞれプロテアーゼを分離し，報告している．

いずれも分離されたプロテアーゼは中～弱アルカリ性

に至適pHをもっセリソ系プロテアーゼに近い性質を

示していた．我々は最近, fetal　calf　serumおよび

bovine serum albumin培地を用いてＴ，ｒｕhｒｕｍを培

養することによりアルカリ性プロテアーゼ以外にも酸

　日本大学医学部皮膚科学教室（主任　森嶋隆文教授）

り綴天堂大学医学部皮膚科学教室（主任　小川秀興教

　授）

　平成元年９月ｎ日受付，平成２年12月７日掲載決定

　別刷請求先:（〒101)千代田区神田駿河台1－8

　－13　駿河台日本大学病院皮膚科　関口かおる

千秋

良治＊

森嶋

小川

隆文

秀興＊

性側に至適ｐＨを有する菌体外プロテアーゼの存在す

ることを報告した8).この酸性プロテアーゼは至適pH

4.5,キモスタチソ, phenylmethyl sulfonyl fluoride

(PMSF)で100％阻害され，セリソ系プロテアーゼと

しての性質を有する胞

　Ｃａれｄｉｄａ　alhicaれｓ(Ｃ，fllbtｃｆｌｗｓM0)~I4)やＳｐｏｒｏt紅廠

Sichenckii(Ｓ.ｓchenckiiう15)16)を用いて，我々はそれら

の産生する菌体外プi=1テアーゼの有する生物学的特性

を従来検討してきた．その結果. (1)これらのプロテ

アーゼが生物学的基質を分解し，菌増殖にあずかるこ

と，そして(2)菌は自らそのプロテアーゼ活性に至適

なｐＨ条件を整えることを示した．このような知見を

もとに,本稿ではＴ，ｒｕbｒｕｍの２種のプロテアーゼ活

性と菌増殖の関係，そしてそれらの培地pHに与える

影響を検討した．

　　　　　　　　　　材料と方法

　1.菌株：小水庖型足白癖患者から得たＴ，ｒｕbｒｕｍ

の臨床分離株を用いた．サブローブドウ糖寒天斜面培

地とスライドカルチャーに,よる形態学的観察により

Ｔ，ｒｕhｒｕｍと同定した.

　2.培地及び培養方法：培地窒素源としてbovine

serum albumin (ＢＳＡ)を用いた．サブロー寒天培地

上のコロニーより１白金耳とり，濾過減菌した0.5%

BSA (Sigma), 1 %yeast carbon base (Difco)液体

培地70mlに接種した.37℃, 80cycle/niinで振湯培養

し，経時的に菌の乾燥重量とプロテアーゼ活性及び培

地pHを測定した.

　3.プロテアーゼ活性測定法：基質液として，

azocoll (Sigma) 5nigを0.05Mクェソ酸－0.1Mリン

酸水素２ナトリウム緩衝液(ｐＨ 4.5) 0.8mlあるいは

0.05Mマレイソ酸一トリス緩衝液(pH 8.0) 0.8mlに

懸濁，これに培養上清0.2mlを加えた.反応は37℃，2

時間行い，冷水(２～４℃)で停止させた．直ちに４℃，

3,000Xgで15分間遠心後,上清の520nmにおける吸光

度を測定した．酵素活性は吸光度変化を時間当たりで

表わした. pH 4.5で測定した値を酸性プロテアーゼ活

216

７

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　(>”/Ｍ/ｏｚ５ａｏ)

ａ.Ｓ<｡:i―＾r６ｄ/：

関口かおるは力

　0　7　　U 17 21　28　35

　　　　　　培養日数

図　ＢＳＡ培地におげるＴ,ｒｕｈｒｕｍ.培養上清のO.lg

あたりの酸性（ｐＨ ４.5:●－●），アルカリ性（ｐＨ

８.0:○－○）プロテアーゼ活性，菌量（○一一一一

○）および培地pH（○-一一C））の経時的変化

性, pH 8.0での値をアルカリ性プロテフーゼ活性とし

た，尚，対照として菌培養と同じ条件においた培地を

用いた.

　4.菌の乾燥重量の測定：菌増殖は経時的にその乾

燥重量を秤量することにより測定した．即ち, Falcon

のbottle top filter(0.45μｍ）にて濾過し, filterを

50℃，48時間乾燥の上，秤量した．

　　　　　　　　　　　結　　果

　ＢＳＡ培地を用いたＴ，ｒｕｈｒｕｍ培養上清のｐＨ,菌量

及び菌量当たり（乾燥重量O.lg)の酸性（pH 4.5),

アルカリ性（ｐＨ 8.0)プロテアーゼ活性の経時的変化

を図にまとめた．酸性プロテアーゼ活性は培養14日以

前は殆んど活性が認められず，14日目より出現し，17

日目にはピークに達し，その後急激に低下した．とこ

ろが，培養初期には活性の低いアルカリ性プロテアー

ゼは培養と共に徐々に上昇し，培養22日目頃には酸性

プロテアーゼ活性と逆転，その後も28日目まで上昇を

続けた．一方，培地ｐＨは培養開始時に6.0であり，培

養開始後しばらくはpH 6.0付近にとどまるが,培養７

日目以降,徐々にｐＨは上昇した.そしてアルカリ性プ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

　1) Sanyal　AK, Das　SK, Banerjee　AB :

　　　Purification and partial characterization of an

　　　exocellulr proteinase from Trichophyton ru-

　　　brum,Ｓａｂｏｕｒａｕｄｉａ,　13: 165-178, 1985.

　2) Asahi M, Lindquist Ｒ, Fukuyama K, Apodaca

　　　G, Epstein WL, Mckerrow JH :　Purification

ロテアーゼ活性の高い28日目以降はpH 7.0付近に固

定した，菌の増殖は培養７回目以降認められ，経時的

に徐々に増加し，培養28日目以降，増殖は停止しか．

即ち，培地ｐＨが7.0付近に固定する時期にそれに伴

なって菌の増殖も一定となった．

　　　　　　　　　　考　　按

　病原性真菌の育生する菌体外プロテアーゼの役割に

ついては, (1)侵入･寄生部位タンパクを基質として，

宿主への侵襲を可能ならしめること，（2）それら生物

学的基質を分解して菌増殖にあずかること, (3)自ら

プロテアーゼの至適ｐＨ条件を整えることによって菌

増殖を一層容易にすることなどを我々はＣ. ａｌｈｉｃａｎｓ,

Ｓ.ｓchenckilz｀などをモデルとして示してきたJ0)~16) 'p

ｒｕhｒｕｍはよく知られるアルカリ性プロテアーゼ1)2)以

外にも酸性プロテアーゼ活性8)9)を菌体外に産生する

ことが最近我々により明らかにされている．今回検討

したＴ-　ｒｕbｒｕｍ.の産生するプロテアーゼと菌増殖,培

地ｐＨとの関係はアルカリ性プロテアーゼに関する限

り，従来の他の病原性真菌における知見と概ね類似す

る．既ち，アルカリ性プロテアーゼ活性の上昇に伴い，

菌増殖が促され，培地pHも8.0にまでは至らぬもの

の，上昇することによってアルカリ性プロテアーゼに

より適した条件となる．

　ところか，酸性プロテアーゼ活性の挙動はきわめて

興味深いといえよ≒それは培養初期に一過性に上昇

したのち，アルカリ性プロテアーゼ活性の上昇ととも

に下降していく．酸性プロテアーゼ活性の低下は，こ

れがアルカリ性プロテアーゼに比べより不安定である

ことに起因するのかもしれない．培地pHもまた両プ

ロテアーゼ活性の時差発動に合わせるごとく，酸性か

ら中性へと上昇する．この酸性プロテアーゼの初期発

動の意義は現時点では不明といわざるを得ないが，71

ｒｕbｒｕｍの侵入･寄生における初期条件,維持条件の違

いによる両プロテアーゼの役割分担が想定できよう．

本稿では7こａろ回心の産生する両プロテアーゼの時

差発動というユニークな特性を記載するにとどめ，今

後その意義について更に検討したい．

献

　　and　characterization　of　major　extracellulr

　　proteinase from Trichophyton rubrum, 1 Bio-

　　ｃｈｅｍ.232: 139-144, 1985.

3) Yu RJ, Harmon SR, Blank Ｆ:　Isolator! and

　　purification of an extracellular keratinase of

　　Trichophyton mentagrophytes,} Ｂａｃtｅｒiol,96:

T_　ｙｉｉｈｒｕｍ産生proteinaseの動態と菌増殖

　　1435-1436, 1968.

4) Yu RJ, Harmon SR, Grappel SF, Blank Ｆ:

　　Two eel-bound keratinase of Trichophyton

　　mentagrophytes,J　Inｖｅｓt　Ｄｅｒｍａtol　56　'.　２７-32，

　　1971.

　5）滝内石夫，樋口道生:Microsporum gypseumの

　　産生するヶラチナーゼの分離，精製ならびにその

　　生化学的症性について，日皮会誌，87 : 305-309,

　　1977.

6) Takiuchi I, Higuchi D, Sei Y, Koga Ｍ :　Isola-

　　tion of an extracellular proteinase (keratinase)

　　from Microsporum canis, Ｓａｈａｕｒａｕｄｉａ，20:

　　281-288, 1982.

7) Takiuchi I, Sei Y, Takagi H, Negi Ｍ :　Partial

　　characterization of the extracellular keratinase

　　from microsporum canis, Ｓａｈｏｕｒａｕｄｉａ,22:

　　219-224, 1984.

8）関口かおる，西山千秋，古池高志，小川秀興:Tri-

　　chophyton rubrumにおける菌増殖と菌体外プ９

　　テアーゼ活性の関係一肉芽腫株と浅在性株との比

　　較一，日皮会誌，99：1117-1119, 1989.

9）関口かおる，西山千秋:Trichophyton rubrum の

　　産生する菌体外タンパク分解酵素一浅在性株と肉

　　芽腫株の違いについて．第31回日本医真菌学会報

　　告.

10) Hattori M， Yoshiura Ｋ， Negi Ｍ， Ogawa Ｈ:

　　Keratinolytic proteinase produced by Candida

　　albicanｓ, Ｓａｂｏｕｒａｚｉｄｉｔｔ.　１２　"　175-183,1984.

217

11) Negi M, Tsuboi R, Matsui T, Ogawa Ｈ :　Isola-

　　tion and characterization of proteinase from

　　Candida albicans, / /れｖｅｓtＤｅｒｍａｌｏｌ,83: 32-36,

　　1984.

12) Tsuboi R， Kurita Ｙ， Negi Ｍ， Ogawa Ｈ:　Ａ

　　specific inhibitors of keratinolytic proteinase

　　(Kpase) from Candida albicans could inhibit the

　　cell growth of C， albicans,I Inｖeｓt Ｄｅｒｍａｉｏｌ，

　　85 : 438-440, 1985.

13）松田和子:Candida albicansの増殖に及ぼす培

　　地の窒素源，ｐＨ及びプフテアーゼ（ＣＡＰＰ丿日名

　　KP-ase)の影響について，真菌誌，27 : 100-106，

　　1986.

14）松田和子，佐藤壮彦，坪井良治，高　益俊，矢口秀

　　男，小川秀興:Candida albicans の増殖に及ぼす

　　培地ｐＨおよびproteinase (CAPP)の影響一特に

　　培地ｐＨの変化とグルコースおよびアンモニア濃

　　度の関連について，日皮会誌，98 : 57-60, 1988.

15) Tsuboi R， Sanada Ｔ， Takamori K， Ogawa Ｈ:

　　Isolation　and　properties　of　extracellular

　　proteinase from Sporothrix schenckii, / Ｂａｘｔｅｒ-

　　iol, 159 : 4104-4109, 1987.

16) Tsuboi R， Sanada T, Ogawa Ｈ :　Influence of

　　culture medium pH and proteinase inhibitors on

　　extracellular　proteinase　activity　and　cell

　　growth of Sporothrix schenckii, / C/加訂八

　　ｃｒohiol,　26 : 1431-1433, 1988.

Relation Between Movement of Acid or Alkaline Proteinase from Trichophyton

　　　　　　　　Rubrum and the Growth of Fungus, pH in Medium

　　　Kaoru Sekiguchi, Chiaki Nishiyama, Takafumi Morishima, Takashi Yoshiike*.

　　　　　　　　　　　　　Ryoji Tsuboi* and Hideoki Ogawa*

　　　　　　　　Department of Dermatology,Nihon UniversitySchool0fMedicine

　　　　　　　*Department ofDermatology,Juntendo UniversitySchool0fMedicine

　　　　　　　(ReceivedSeptember 11，1989;acceptedforpublicationDecember 7,1989)

　　We have previously reported that Ｔ. rubrum produced ａ new type of extracellular proteinase in 】iquid medium

containing bovine serum albumin. This enzyme had an optimal pH 4.5 for azocoU. In this paper, we studied about

the relation between movement of aicd or alkaline proteinase and environmental pH. In the beginning of

cultivation, acid proteolytic activity increased radically, and ３０r 4 weeks later, it was decreased. In place of acid

proteinase, alkaline proteinase which had an optimal pH 8.0 was increased gradually. During incubation of Ｔ.

rubrum in bovine serum albumin medium which was adjusted to pH 6.0, the pH of medium was gradually increased

to about pH 7.0 toward 4 weeks. The growth of T. rubrum increased until pH in medium was fiχedto pH 7.0｡

　　apn J Dermatol 100: 215～217,1990)

Key words:　Trichophyton rubrum, proteinase, pH