Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk · (GABA-szintetizáló enzim- GAD65)...

Erdélyi Ferenc

MTA KOKI

Orvosi Géntechnológiai Részleg

Transzgenikus egerek

előállítása és felhasználásuk

Transzgenikus állatok

Géntranszfer eredményeként a genomba (random) beépülve

egy idegen DNS darabot tartalmaznak.

Mesterségesen megváltozatott genetikai állománnyal

rendelkeznek.

Génaddíció

Célzott génmódosítás

Endogén gén célzott mesterséges megváltoztatása.

Genom módosítás

Öröklődő: a gén/genom módosítás érinti az ivarsejtet is. (ivarsejt- embrionális őssejt módosítás)

Szomatikus: gén/genom módosítás csak a testi sejteket érinti.

(módosítás testi sejtekbe történik, a DNS integrálódhat a

genomba, vagy lehet episzómális is )

A genom módosítás lehet térben és időben szabályozott és reverzibilis is.

Genetikai állatmodellek

random

• spontán mutánsok

• kémiai mutagenezis tervezett (transzgenikus)

szomatikus csíravonal

öröklődő

funkciónyeréses mutáns

(gain-of-function)

funkióvesztéses mutáns

(loss-of-function)

túltermelés domináns negatív null-mutáns

knockout

részleges

(hipomorf)

mutáns

knockdown

mutáció

knockin sejt-abláció

kondicionális/indukálható térben és/vagy időben szabályozott

Transzgenikus állatok felhasználása

• szövet- és fejlődés- specifikus

génszabályozás (promoter vizsgálat)

• génfunkciós és fejlődéstani vizsgálatok

• sejtazonosítás

• sejtfunkciós vizsgálatok

• emberi betegségek állatmodelljeinek

létrehozása

• gyógyszercélpontok validálása-fejlesztés

• gyógyászatban fontos fehérjék előállítása

(bioreaktorok)

• haszonállatok előnyös tulajdonságainak

javítása

kutatás

gyakorlat

Miért pont egér?

• Régóta tenyésztik

• Sok jól definiált törzse ismert

• Kis helyigény

• Felhasználó barát

• Könnyen manipulálható

Egerek embrionális fejlődése

Donor nőstények előkészítése 5-8 hetes nőstény: 5U Pregnant Mare Serum Gonadotropin

(FSH)

5U Human Chorionic Gonadotropin

Időzítés: PMSG 14 h

47 órával később

HCG 13 h

Pároztatás donor hímmel

Másnap reggel plugolás

Embrió

Donor nőstény X Donor hím

Álvemhes anya

Recipiens nőstény X Vazektomizált hím

Embrió preparálás

ampulla

Hyaluronidáz

Mikroinjektált embrió beültetése

Az eukarióta génexpresszió

szabályozásának lépései

DNS primér mRNS mRNS

transzkriptum

transzkripció

RNS

processzing

RNS

transzport

sejtmag citoplazma

transzlációs

szabályozás

inaktív mRNS

fehérje

aktív inaktív

poszttranszlációs

modifikáció

mRNS

degradáció

Gének általános szerkezete 5’-upstream

régió

3’-downstream

régió exon inron

ATG

Kozák konszenzus

GCCACCATGGCTG

PoliA addiciós szignál

Határoló szekvenciák

MAR, SAR, LCR

Genetikai módosítás fajtái 1.

transzgén

A

„transzgenikus”

A’ A’’ transzgén transzgén

A mikroinjektált transzgén sorsa

•Fej-farok irányú konkatamér képződés

•Beépülés a genomba általában egy helyre

•Koinjektált DNS együttes beépülésének esélye magas

•Integráció helye random (preferenciális helyek?)

•Bépülés helye hatással van az expresszióra

(heterokromatikus régió- néma)

Hagyományos pronukleáris

mikroinjektálás

Előnyök

• Felszerelés igénye kicsi

• Olcsó

• Gyors

• Hatékony (1-25%)

• Nagy kópiaszám

• Expresszió szintje magas

Hátrányok

• Véletlenszerű beépülés

• Transzgén beépülése

konkatamer formában

• Inaktiváció esélye magas

• Csak génaddíció

lehetséges.

Riportergéneket expresszáló

transzgenikus egerek A riportergén egy olyan fehérjét kódol, amelynek az expressziója egy

meghatározott génhez kötött és nem befolyásolja a sejtfunkciót.

Alkalmazása ✦ gének szabályozó elemeinek azonosítása, jellemzése ✦ sejtek jelölése ✦ fehérjék jelölése fehérje expresszió, aktivitás

lokalizáció sejtben, szövetben, szervezetben

fehérje-fehérje kapcsolat

fehérje mozgás

jelátviteli funkciók

Biolumineszcencia és fluoreszcencia alapján

élőben, egész állatban is kimutathatók, nyomon

követhetők (hűtött CCD kamera).

Riporterfehérjék

bakteriális -galaktozidáz enzim: LacZ gén kódolja

kimutatása enzimhisztokémiával/enzimaktivitás alapján

Luciferáz enzim (szentjánosbogár)

kimutatása: biolumineszcenciával/enzimaktivitás alapján

fluoreszkáló fehérjék (GFP, DsRED)

kimutatása autofluoreszcencia alapján

A génexpresszió helye in vivo detektálható a

biolumineszcens markergént hordozó

transzgenikus modellben

• könnyű valós in vivo detektálás

• ugyanazon kísérleti állaton több időpontban

is elvégezhető a vizsgálat

5000

10000

15000

20000

25000 kontrol

IFNg+sLPS

IFNg+sLPS

+ Dex

IFN+sLPS

transzkripció

a májban

gyulladásos állapotokban

aktiválódik:

• zimozán-indukálta arthritis

• bőrsérülés gyógyulása

Gyulladáscsökkentő

szerek tesztelésére

Az iNOS gén transzkripciós aktivitásának in vivo

egész állatban történő valós detektálása

iNOS

luciferáz

30000

Genetikailag kódolt fluorogének

fluoreszcens riporter fehérjék

fluoreszcens szenzorok (PF-k)

Genetikailag kódolt fluoreszkáló fehérjék

használatának előnyei, hátrányai

! detektálásához nem kell szubsztrát ! expresszáló sejtek élőben és fixálatlan szeletben is azonosíthatók ! fixálás után is működik ! ellenanyaggal is kimutatható ! mivel nincs amplifikálás a kimutatásnál nem túl érzékeny ! nagyon stabil, ezért az expresszió gyors változásainak kimutatására

kevésbé alkalmas

! sokféleképpen módosítható aminósavcsere fúzió

inszerció

cirkuláris permutáció

Prototípus: zöld fluoreszkáló fehérje (GFP)

GFP fehérje GFP fehérje

GFP mesterséges színvariánsok

Spectra are normalized to the excitation and emission peak for each protein.

(a,b) Excitation (a) and emission (b) curves are shown as solid or dashed lines

for monomeric variants and as a dotted line for dTomato and tdTomato, with

colors corresponding to the color of each variant. (c,d) Purified proteins (from left

to right, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry,

and mCherry) are shown in visible light (c) and fluorescence (d). The

fluorescence image is a composite of several images with excitation ranging

from 480 nm to 560 nm.

mRFP variánsok

Transzgenikus egérben: DsRedT3

kódoló régió

poli(A)

• mRNS másolat (cDNS)

•minigén hibrid gén

„valódi” gén

intakt/mutáns

ATG

start

TGA

stop

riportergén: sejtek jelölése/fehérjék

-galaktozidáz

zöld fluoreszkáló fehérje (GFP)

luciferáz

„valódi” gén megváltozott sejtfunkció

mutáns, hibrid,csonkolt

Transzgén kódoló régiója

jelző

funkció

promoter

sejt

fehérje

mindes sejtjében

„transzgenikus” egér

transzgenikus agy

transzgenikus

idegsejt

promoter

Általános (CAG)

Agyspecifikus (NSE)

Purkinje sejt specifikus (L7)

Transzgén kifejeződés specificitását a

DNS szabályozó elem határozza meg

GFP

-gal

-gal

kisagy

Transzgenikus kisagyi Purkinje sejtek

L7 Purkinje sejt specifikus gén

E1 E2 E3

-galaktozidáz

zöld fluoreszkáló fehérje

Purkinje sejt

GABAerg idegsejt-specifikus gén

(GABA-szintetizáló enzim- GAD65)

transzgén

fluoreszáló GABAerg idegsejtek

az agyban

szaglógumó kisagyi Purkinje

sejt

medúza zöld

fluoreszkáló

fehérje gén

Gátló (GABAerg) idegsejtek genetikai módosítása

eGFP

embrió agy

hippocampus

cortex

GFP+ Purkinje sejtek izolálása FAX-szal

tiszta Purkinje sejt tenyészet

L7/gfp transzgenikus egér

FAX

Purkinje sejt

általános, minden sejtben működő promoter CAG (csirke aktin promoter CMV enhancer)

ROSA26

ubiqutin,

RNS pol. II

szövetspecifikus

sejttípus-specifikus

indukálható

promoter típusok

természetes

hibrid/mesterséges szövetspecfikus enhancer-

hsp68 (tk) minimál promoter

szövetspecifikus enhancerek

azonosítására

Transzgén expresszió térbeni szabályozása

transzgén regulációs

régiója kódoló régió enhancer-promoter

Meghatározza a transzgén expressziójának:

helyét

idejét

szabályozását

intron

poli(A)

Tipikus emlős génregulációs régió

Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer

és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer ≈ 500 bp hosszú ≈10

Kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós

faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.

A transzkripció szabályozásában

résztvevő transz elemek

Nagyméretű inszertet tartalmazó

klónozó vektorok

Plazmid: ~10 kb

l-fág: ~20 kb

cosmid: 34-40 kb

• P1 fág: 100 kb

• PAC/BAC: 350 kb

• YAC: 2 Mb

P1 fág – BAC vector

YAC vector

cortex hippocampus

cerebellum Purkinje sejtek izom

PV-GFP transzgenikus egerek plazmid: csak izom expresszió

BAC: izom és agy expresszió

agy


mikroinjektálás

Előnyök


• Olcsó

• Gyors




Hátrányok






lehetséges.


„knock-out”

NeoR gén

Homológ rekombináció

Transzláció nem megy végbe

X X

A exon1 exon2

P

NeoR gén

P


„knock-in”

Homológ rekombináció

kifejezendő gén

A exon1

exon2 Transzlációs start

P X X

Transzlációs start P


Speciális fajtája a „speedy mouse”, ahol egy olyan konstitutív génbe

inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek

hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete

lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon

ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26)

Transzlációs start P P

Kiméra előállítás

Szőrszín kimérák

C57BL/6NTac-Atm1.1ArteTyrtm1Arte

• Blasztociszta donor

cc,AA

• ES sejt CC,aa

• C57Bl6 CC,aa

• Hibridek Cc, Aa aguti

ES-sejt gén manipuláció

Előnyök

• A génbevitel nagy

hatásfokú

• Szelekciós lehetőségek

állnak rendelkezésre

• Könnyen archiválható

• Szinte bármilyen gén és

genom manipulációra

lehetőség van.

• Knockout Mouse Project

Hátrányok

• Korlátozott a sejtvonalak

száma

• Folyamatos kromoszóma

és fertilitás ellenőrzés

• Drága

• Csak olyan laborokban

működik, ahol

folyamatosan nagyszámú

mutánst állítanak elő

• Neo kazetta problémás

Taconic rendszer

exon

exon

Neo loxP loxP

flp flp


mikroinjektálás

Előnyök


• Olcsó

• Gyors




Hátrányok







lehetséges.

Transzpozícióra képes

segédfehérjék használata

• Lentivírus

– Vírus mediált beépülés

– Módosított, defektív HIV vírus

– Helper vírussal burok generálás

– Korlátozott cargo kapacitás

– BLS2 szintű labor és állatház

• Transzpozonok

Genetikai módosítás fajtái 1b.

A

„transzgenikus”

A’ A’’

transzgén

LTR LTR

transzgén

LTR LTR

Transzpozáz

Transzpozon mediált genom módosítás A 2. típusú transzpozonok olyan mobil genetikai elemek, amelyek

önkivágó/beépítő aktivitással rendelkező transzpozázt kódolnak és annak

felismerő helyét is tartalmazzák.

„cut and paste” transzpozició

önkivágás

beépülés új helyre

1. a transzpozáz felismerő helyekkel (IR) körülvett beültetendő gént tartalmazó vektor

2. A transzpozázt hordozó vektor RNS-sel helyettesíthető

Amennyiben mindkettő jelen van a sejtben a kivágás és a genomiális DNS-be való

Integráció megtörténik.

transzpozon alapú géntranszfer rendszer

1

2

Transzpozon mediált genom módosítás Gerincesekben aktív 2-es típusú transzpozon rendszerek

Név/forrás Transzpozon

család

Cargo méret Integrációs preferencia

Sleeping beauty (SB)*

Tc1/mariner 5-7 kb?

Méret növelésével

csökken a hatásfok

nincs gén preferencia

inkább intron

piggyBac piggyBac Hatásfok csökken 9 kb

felett -pronukl. injektálás

gén kódoló régió

preferencia

Frog prince Tc1/mariner ua. min egyéb

Tc1/mainer

intron preferencia

Tol1/2 hAT nagyobb mint a többi

10-20 kb (BAC transzgén

70 kb)

gének 5’-régiója?

Izsvák Zs, Ivics Z, Matés L

SB100 X- 100X aktívabb: 35-50% hatékonyság stem sejtekben, 45% stabil transzgenikus egér

Transzpozon mediálta genom módosítás

• Alapja random inszerciós mutagenezis (funkció vesztés funkció nyerés)

• két-komponensű rendszer: (1) transzpozon vektor tartalmazza a bevinni kívánt cDNS-t, vagy a gén inaktiváláshoz (aktiváláshoz) szükséges elemeket

(2) transzpozáz RNS/vektor formában. Mindkét komponenst be kell juttatni a

sejtbe

• Néhány kópiába épül be (függ a transzpozon/transzpozáz mennyiségétől) • Szomatikus és ivarsejt módosításra is alkalmas • Nem vírus-eredetű géntranszfert tesz lehetővé • Nagy hatásfokú, gyors módszer

Használható

• Transzgenikus modellállatok előállítása (egér, patkány, nyúl stb) génaddíció

RNAi knock down- kiválthatja a lentivírust

• Inszerciós mutagenezis- nem homológ rekombináción alapuló KO technológia- ES sejt független - nagyléptékű patkány KO projekt

• génterápia • Humán (és egyéb) KO sejtvonalak előállítása • iPSC vonalak előállítása vírus nélkül

sb-cag/eyfp transzgén kópiaszáma

az alapító egyedekben

line # founder offspring F1 offspring F2

ID copy number pups/Tg copy number ID/copy number pups/Tg copy number

22 105798 mosaic 8/3 1

5/2 1

23 105799 mosaic 4/4 1

7/3 24 105800 2 11/0 25 105801 2 0

26 105802 3-4 4/4 2

108977 male/2 5/4 1-2

10/8 1-2

27 105803 6 6/6 1-6 110175 female/6 6/5 3-4

110176 female/4 8/8 1-4

28 105804 4-5 6/6 1-4

8/8

43 105815 1 7/5 1 7/6

7/6 6/5

44 105816 ~1 7/2 1

6/2

45 105817 ~2 6/1 ~2

11/0 4/1

46 105818 1 9/5 1-2

7/3

47

105819 5 9/9 3-5 108961 male/4

108964 female/5 4/4 2-4

108967 female/5 7/7

A

C

B

D

SB-CAG/eYFP mouse brain sagittal sections. A: Cerebral Cortex, B: Cerebellum, C: Hippocampus

D: Detailed part of prefrontal cortex. As figures show, however the brain itself seems to be green, CAG

promoter is not active in neurons oposite of endothel layer of vessels.

Transzpozáz mediált genom

módosítás

Előnyök

• Nagy hatásfokú (15-85%)

• Az integrálódás egyedi,

így a transzgén

inaktiválódás esélye

alacsonyabb

• A transzgén

továbbörökítés aránya

magas

Hátrányok

• RNS munkát igényel, ami

drágább és nagyobb

odafigyelést igényel.

• Az alacsony kópiaszámból

adódóan a transzgén

expressziója alacsony

lehet

• A „cargo” méretre korlátoz

• A random integrálódásból

adódó gén inaktiválódás

előfordulhat

PhiC31 integráz mediált géntranszfer

attB helyek elhelyezése a ROSA26 locusba

Streptomyces ΦC31fág integráz

Genetikai módosítás fajtái 4. Speciális fajtája a „speedy mouse”, ahol egy olyan konstitutív génbe

inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek

hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete

lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon

ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26)

Transzlációs start P P

Meganukleázok

• Endonukleáz aktivitással bíró enzimek

• DNS duplaszál törést követően megnő

a repair aktivitás, ami rekombinációs hot

spotot alakít ki

• Target specifitással bíró hibrid

meganukleázok kialakítása

Genetikai módosítás fajtái 2b.

„knock-out”

Transzláció nem megy végbe

X X

A

MN MN

TALEN, ZFN, CRISPR

P

P

XX

P

„ZN-finger” nukleáz mediált genom módosítások

„ZN-finger” nukleáz mediálta genom

módosítások ZNF kettőszálú törést okoz a genom

meghatározott helyén.

Specificitást a ZF biztosítja.

1. A törést a sejt NHEJ

mechanizmussal javítja

mikrodeléció/inszerció

potenciális KO

2. A törést a sejt HR

mechanizmussal javítja

+ módosított homológ régió

knock in

deléció

mutáció

ZN-finger” nukleáz mediálta genom módosítással

KO sejtek és modellállatok is létrehozhatók

Előnye

• Homológ rekombináció nélkül

létrehozható KO sejtvonal, vagy modellállat

• Azokba az állatfajokban is alkalmazható,

amelyeknél nem áll rendelkezésre

pluripotens ES sejt

• Nagy a hatásfoka és gyors

A kívánt specificitású ZNF-et elő kell állítani

Ez nem egyszerű és drága

Hátránya

Transzgenikus patkány előállítása

ZNF technológiával

mutáció a kódoló

exonban

KO

SIGMA-SAGE labs

• ZNF

• KO sejtvonalak előállítása

• GMO állatmodellek előállítása: egér, patkány és nyúl bármely törzs

constitutive KO

humanization

reporter tagging

point mutations Kész patkány KO modellek

Xanthomonas sp.

Transcriptional

activator like effectors

TALE

34 aminosav modulok

(repeat variable

diresidues RVD)

12., 13. aminosav a

nukleotid kötésért

felelős aminosavak

NI = A,

HD = C,

NG = T,

NN = G or A)

TRESK mutáns egerek szekvenciája

Wt CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCTGTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm48 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT-TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm57 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm7 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm57 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATG--GTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm60 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAAGC----TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG

Tm51 CTGAGGAGCCA---------------------CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG




Tm43 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGG---------------------------------GGATGCTGCCCCG

Tm61 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGA---------------------------------TGAGGCCCCG

TALEN felismerő hely

Nucleotid mutáció

--- deléció

9bp hosszú repeat

CRISPR/Cas

Lehetséges történések

Target specifikus nukleázok

Cink finger TALEN CRISPR/Cas

Tervezés közepes könnyű könnyű

Konstruálás közepes könnyű nagyon könnyű

Hatékonyság alacsony 80-90% magas

Aktivitás alacsony/

változó

magas magas

Off-targeting

vágás

változó alacsony magas

Toxikusság változó alacsony alacsony

Költség magas közepes alacsony

ES sejt vs target specifikus

nukleázok

ES

• Csak dedikált laborokban

• Folyamatos ES sejt ellenőrzés

• Egy konstrukció 1 vonal

• Egy sejtvonal még nem

garantálja az egész egeret és

a továbbörökítés sem 100%

• ~40.000 €

• 40 hét

TSN

• Nem igényel nagy befektetést

• RNS munka

• Egy konstrukció több féle vonal

(knock-out, potenciális knock-

down és knockin)

• Vonal kialakítás közel 100%

• ~4-6.000 €

• 16-20 hét

Konstitutív - indukálható

• Korai megnyilvánulás, vagy korai

génhiány sok esetben káros

• A szervezet gyakorta kompenzál, így egy

gén hiányát más, hasonló funkcióval bíró

gének veszik át

• Egy gén sok szövet - és sejtféleségben

nyilvánulhat meg, az általános génkiütés

elfedheti a specifikus működést.

Indukálható promóterek I. indukálható endogén promoterek használata:

transzgén expresszió szabályozása endogén kontrol szekvenciákkal

heat shock promoter;

metallothionein MAF kötődik a MRE-hez Cd/Zn jelenlétében;

interferon aktiválható promoter;

steroid regulált promoterek;

GRE (glukokortikoid- MMTV)

indukálhatóság nem túl magas, “mellékhatások”

Indukálható promóterek II.

Mesterségesen indukálható génexpresszió: indukálható transzgenezis

Szövetspecifikus promóter TRANSZKRIPCIÓS faktor

Reszponzív promóter Target transzgén

RNS

pol

Szövetspecifikus promóter rtTA-VP16

tetO – CMV IE Target transzgén

RNS

pol

Térbeli szabályozás Cre

rekombinázzal

Cre mediált génkifejezés

Brainbow egér

1. Konstrukció elkészítése

2. Génbevitel

3. „founder” kiválasztása – genotipizálás

4. Transzgenikus vonal kialakítása

5. Kísérletezés

6. Egyéb állattechnológiai eljárások

Genomiális DNS izolálás farok mintákból

2-3 mm darab - Proteináz K feltárás

• fenol-kloroform extrakció

- etanol/izopropanol kicsapás

Előny: nagy mennyiségő tiszta DNS, olcsó

Hátrány: munkaigényes, veszélyes szerves oldószer

• magas ionerő mellett szilikátos megkötés

- mosás guanidin izo tiocianát hidroklorid oldattal

- elúció alacsony ionerő mellett

Előny: automatizálható

Hátrány: rossz kitermelés, drága

Transzgenikus egyedek azonosítása

és jellemzése

Transzgenikus egyedek azonosítása

és jellemzése II. Génexpresszió alapján

RNS - Northern hibridizáció

- RT-PCR

Fehérje - Western blot

- enzim aktivitás

- fenotípus

Homozigóta egyedekben a transzgén expresszió szintje

magasabb lehet.


2. Génbevitel



5. Kísérletezés


Transzgenikus egyedeket nem transzgenikus egyedekkel

keresztezik, felszaporított heterozigóta egyedek

keresztezésével homozigóta vonalakat alakítanak ki.


2. Génbevitel



5. Kísérletezés


Kísérletezés

Mit használjunk, és hogyan?

Egér fajok elterjedése

Laboratóriumi egerek eredete

W.E. Castle C.C. Little

Kedvtelésből tartott egerek -

Ázsia, Európa

(XVIII-XX. Sz.)

Abbie Lathrop összegyűjtötte

és tenyésztette őket

Granby, MA – 1900

Castle, Little és

Mások folytatták Lathrop

munkáját és alakították ki

Az első inbred törzseket

(1908-tól)

Swiss

Castle’s egerek

C57- leszármazott

Kína Japán

Egyéb törzsek

vad eredetű

Egér Családfa

Felhasznált egértörzsek

C57/BL6

FVB/N

NMRI

129

Outbred/F1 Inbred

Magatartás

Szív és érrendszer élettana

Fejlődési defektek

Diabetes

Immunitás and gyulladás

Metabolizmus

Tumor képzés és gyakoriság

A genetikai háttér hatása a genetikai módosítás

fenotípusos megjelenésére

Adapted from Almind et al., Diabetes 52:1535, 2003

15

10

5

0

n 100

200

300

400

500

Blood glucose (mg/dL)

129

B6

2 típusú diabetes

Obese ob/ob (Lepob)

C57BL/6 (B6.V-Lepob/J)

elhízás tranziens diabetes-szel

C57BLKS (BKS.V-Lepob /J)

elhízás megnyilvánuló diabetes-szel

Diabetes db/db (Leprdb) C57BL/6 (B6.Cg-m +/+ Leprdb/J)

elhízás tranziens diabetes-szel

C57BLKS (BKS.Cg- m +/+ Leprdb /J)

elhízás megnyilvánuló diabetes-szel

Episztatikus faktorok hatása a

transzgén megnyilvánulásra

25

30

35

40

45

50

5 10 15 20 25 30 35

weeks

Bo

dy

we

igh

t (g

)

WT

HDC -/-

Fülöp et al. Endocrinology 2003

FVB/N-FVB/Ant

Co-isogenic Congenic

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

A. Hagyományos B. “SPEED CONGENIC”

Strain A

a/amt

Strain B

b/b

b/amt

Strain B

b/b

b/amt

N5-N11

b/amt

N12F1

amt/amt

N12F1

a/amt

N12F1

a/amt

N12F1

a/a

N12F1

amt/amt

Beltenyésztett

kongenikus törzs

N12F1

a/a

Strain B-amt Strain B

Generation

F1

F1N2

F1N3

F1N4

F1N1

F1N12

% loci A/B

100%

25%

12.5%

6.25%

50%

Alom kontrol

cb1Z cb1 cypD D2R net

+/+ 29% 27% 31% 30% 31%

+/- 50% 50% 47% 48% 56%

-/- 21% 23% 22% 22% 13%

utódszám 288 2145 221 330 327

tenyészpár 16 78 7 12 13


2. Génbevitel



5. Kísérletezés


• Rederiválás

• Embrió mélyhűtés

Befogadó állatház

Rederiválás

Tripszin

kezelés

SPF space

♀

SPF „béranya”

Elválasztás után

higiéniai státusz

ellenőrzése

Szuperovuláció kiváltása

hormoninjekcióval

Kórokozó mentes kolónia

barrier

♂ ♀ X

Fertőzött kolónia

zigóta/hólyagcsíra

állapotú embrió

preparálás


2. Mikroinjektálás



5. Kísérletezés


• Rederiválás



2. Génbeviteli eljárás



5. Kísérletezés


• Rederiválás


Technológiai sor

Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk · (GABA-szintetizáló enzim- GAD65)...

Documents

Transcript of Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk · (GABA-szintetizáló enzim- GAD65)...