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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EMPLANTAS
Luciano da Silva Pinto
Doutorando em Biotecnologia
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Definição
É a introdução controlada de ácidos nucléicos em um
genoma receptor, excluindo-se a introdução por
fecundação
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Usos da Transformação de Plantas
• A. Testar a função de genes ou partes de genes
• B. Modificar a expressão de genes endógenos– Desligar genes– Aumentar a expressão– Modificar a expressão
• C. Mover genes entre organismos.
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Aplicações • Resistência a insetos:
• uso de inibidores de proteinases,• toxinas bacterianas (gene Bt )-Milho, algodão, batata e soja
• Tolerância a herbicidas: • Soja Roundup Ready ,• Milho, Cana-de-açúcar e Eucalipto
• Resistência a vírus: • os gene da capa protéica ou capsídeo do próprio vírus foi
introduzido na planta, funcionando assim como uma espécie de "vacina".
• Alteração de coloração de flores:
• envolvidos de rotas bioquímicas
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• Alteração da qualidade nutricional: • Empresa Calgene obteve óleos ricos e ácido esteárico, um
ácido graxo saturado,
• arroz que produz beta- caroteno, precursor de vitamina
• Produção de vacinas:• Batata, tabaco, banana e alface.
• PLANTICORPOS - Cuba
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Possíveis Impactos no Meio Ambiente
Fluxo gênico: transgene população silvestre
Poluição genética ou contaminação gênica de espécies silvestres
Cultivos próximos de parentes silvestres Cevada, alface, arroz, aveia, batata, sorgo e trigo
• Reações alérgicas ou de hipersensibilidade
• Reações de intolerância – alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais e toxicidade
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Etapas da Produção de Plantas Transgênicas
- Identificação e isolamento do gene;
- transferência do gene;
- seleção das células que contenham o gene transferido;
- regeneração de plantas;
- expressão do gene nas plantas adultas.
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Isolamento de genes
• Busca de genes de interesse em bancos de dados;
• Construção de primers e amplificação por PCR;
• Quantificação e sequenciamento.
TGTGAACACACGTGTGGATTGG...
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Cassete de Expressão
= região promotora = região terminadora
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Promotores e terminadores mais utilizados
Promotores constitutivos– CaMV 35S : 35S do vírus do mosaico da
couve-flor– pNOS: Nopalina Sintetase do pTiC58 de A.
tumefaciens Promotores Orgão/ tecido específico
– Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes
– pPATATIN : tubérculos de batata– RuBisCo: tecido clorofilado– pLECTINA: expressão em sementes de
feijão• Promotores induzidos
– phsp70 : "Heat shock gene" de milho
Terminadores
• 3'OCS: Octopina sintetase do pTiB6S3;
• 3'NOS:Nopalina sintetase do pTiC58;
• 3'G7 : Gene 7 do pTiAch5
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Estratégias mais utilizadas de transferência de DNA para plantas
Vetor biológico: •Agrobacterium (uma bactéria do solo com duas espécies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)•Vetores virais: O CaMV permite inserções de no máximo 0.8 Kb. POUCO USADO
Plantas intactas - Bombardeamento com micropartículas, de ouro ou tungstênio (com cerca de 1 μm de diâmetro)
Transferência direta: De protoplastos - A membrana celular é permeabilizada por choques eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) – eletroporação
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Transformação via vetor natural
• Agrobacterium tumefaciensrhizogenes
Transferência naturalde DNA para plantas
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Plasmídio Ti
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1) injuriada e liberação de compostos fenólicos pela célula vegetal; 2) ligação de Agrobacterium à superfície da célula, mediada por proteínas bacterianas e vegetais; 3) interação de composto fenólico com a proteína VirA; 4) fosforilação da proteína VirG; 5) ativação da transcrição dos genes de virulência (genes vir); 6) formação da fita-T, ligada à proteína VirD2; 7) produção da proteína VirE2; 8) organização do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferência do complexo-T para a célula vegetal; 10) entrada do complexo-T no núcleo celular; 11) integração do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996).
Representação esquemática da interação Agrobacterium-planta
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Representação esquemática de um plasmídeo Ti/Ri e da estratégia usada para a transferência
de genes no sistema de transformação via Agrobacterium com vetor binário
pTi, plasmídeo indutor de tumor de A. tumefaciens; pRi, plasmídeo indutor de rizogênese de A. rhizogenes; Região vir, região de virulência; Região-T, região (DNA) transferida; BD, borda direita da região-T; BE, borda esquerda da região-T.
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Genótipo-específico (planta - bactéria)
AGROBACTERIUM - Desvantagens
Monocot X Dicot
Dependência do sistema de regeneração
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MÉTODOS DIRETOS DE
TRANSFORMAÇÃO
Dois grupos:
• aqueles que se utilizam de células desprovidas de parede celular (protoplastos)
• e aqueles que possibilitam a transformação de células intactas ou tecidos.
Em ambos métodos, o gene de interesse juntamente com o marcador seletivo e/ou repórter são transferidos como constituintes de um pequeno
plasmídio de E. coli.
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Obtenção de protoplastos
Um protoplasto é uma célula "nua": perdeu a parede, mantém a membrana e adquire aspecto circular. A perda da parede celular é conseguida pelo uso de enzimas capazes de a degradar (ex.: celulase).
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MICROINJEÇÃO
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Biobalística
EquipamentoProcesso
Micro partículas de ouro
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Vantagens
Diversos protocolos de cultura de tecidos
Não exige vetores especializados
Transformação de organelas
Rapidez e simplicidade
Desvantagens
Equipamento especializado
Integração múltipla de transgenes
Variabilidade do processo
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Genes de seleção de transformantes
Genes marcadores para resistência a antibiótico. Os mais utilizados são:
•Gene neo: isolado do traposon Tn5 de Escherichia Coli, codifica para a enzima neomicina fosfotransferase II (NPT II). Resistência a canamicina•Gene hpt: codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) foi isolado de Escherichia coli e confere resistência ao antibiótico higromicina.
•Gene csrl: codifica para uma forma alterada da enzima sintase do ácido acetohidroxil (AHAS), também conhecida como acetato sintase (ALS).•Gene aroA: foi isolado de Salmonela tyhimurium tratada com mutagênico e selecionada para a resistência ao herbicida glifosato.•Gene bar: clonado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para a enzima fosfinotricina acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinonotricina (PPT).
Resistência a algum herbicida.Os mais utilizados são:
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GENES REPÓRTERES
• genes nos e ocs: foram isolados do T-DNA de Agrobactérium e codificam para a síntese da neopalina (NOS) e para a síntese de octopina (OCS), respectivamente.
• Gene lacZ: foi isolado de Eschirichia coli e codifica para a B-galactosidase, más é pouca usado em plantas porque estas possuem uma alta atividade endógena de B-galactosidase, de difícil quantificação.
• Gene cat: codifica a enzima clorafenicol acetiltransferase (CAT), que não é encontrada normalmente em plantas. Bastante usado em plantas, apesar da utilização de radioatividade.
• Gene neo: O NPT II usado também como gene marcador de seleção. • Gene luc: codifica para luciferase de Photinus pyralis e tem sido usado
como gene repórter em plantas.• Gene uidA: este gene foi isolado de Escherichia coli e é o gene repórter
mais utilizado atualmente. Ele codifica para a B-glucuronidase GUS.• Gene gfp: foi isolado de Aequorea victória (medusa) e codifica para a
‘grenn fluorescent protein’ (GFP).
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Epicótilo alongado cocultura
Formação pró-gemas
Multiformação de pró-gemas
Multibrotação
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Gene uidAGene uidAGene uidAGene uidA
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Tipos de transgênicos
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Primeira geração – Características agronômicas
• São aqueles que já existem no mercado mundial, obtidos com o objetivo de melhorar características agronômicas como a resistência a insetos e doenças e a tolerância a herbicidas. Estes produtos, na maioria dos casos trazem muitos benefícios ao produtor, como por exemplo:– aumento de produtividade;– diminuição de custos de produção, por meio da
redução do uso de defensivos agrícolas e combustível;
– melhoria da qualidade do produto final, com menores índices de fungos e micotoxinas;
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Segunda geração – Qualidade alimentar
• São aqueles que já estão sendo pesquisados e incluem os alimentos com maior qualidade (maior teor de nutrientes por exemplo) e que trazem benefícios também ao consumidor, tais como:– Alimentos com maior teor de proteínas e minerais (como o
ferro);– Óleos com teores mais elevados de ácidos graxos do tipo
ômega 3 (mais saudáveis).
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Terceira geração – Produtos especiais
• Ainda em fase de desenvolvimento, são os produtos de utilização farmacêutica (vacinas, hormônios, proteínas humanas, biorretores) e industrial (plásticos biodegradáveis e lubrificantes).
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Alguns exemplos de plantas geneticamente modificadas
- Tomate longa vida Flavr Savr, produzido pela companhia norte-americana Calgene, com o objetivo de obter frutos com maior conservação. Este tomate transgênico foi o primeiro produto liberado comercialmente para consumo nos Estados Unidos, em 1994.
- Tomate com maior teor de licopeno, pigmento que dá a cor avermelhada ao fruto, é uma substancia antioxidante, que atua no organismo contra vários tipos câncer.
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• Arroz dourado, contendo alta concentração de pró-vitamina A.
• A proeza, realizada por pesquisadores da Suíça e Alemanha, foi possível pela introdução de três genes envolvidos na síntese de beta-caroteno (pigmento vegetal), encontrados em uma flor (o narciso-dos-prados), em plantas de arroz.
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• Arroz contendo maior concentração de ferro nos grãos, para uso na alimentação humana e animal.
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• Soja Roundup Ready (RR) da Monsanto, resistente ao herbicida glifosato. Esta soja traz benefícios ao produtor, pois reduz a aplicação de herbicidas e mão-de-obra, elimina as plantas competidoras, resultando num aumento de produtividade.
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• Milho e algodão Bt, resistentes a insetos (certo tipo de lagarta). Estas plantas contém um gene proveniente da bactéria Bacillus thuringiensis, muito comum na natureza, e há muitas décadas usada como inseticida natural, principalmente na agricultura orgânica. Os principais benefícios ao agricultor são a redução do uso de inseticidas, o aumento da produtividade e a qualidade do produto final.
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Tomate transgênico com altas doses de antioxidantes protegem contra o câncer
• Tomate com mais licopeno,
• Vacinas,
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Produtos em desenvolvimento
• Quanto aos produtos que estão sendo pesquisados e desenvolvidos no Brasil, ainda em caráter experimental, tem-se:
– milho com maior teor de metionina no grão (EMBRAPA);– melão com maior potencial de conservação (UFPEL);– feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA/CENARGEN);– laranja resistente ao cancro cítrico (IAPAR);– batata resistente ao vírus do mosaico PVY (EMBRAPA Hortaliças,
CENARGEN e UFPEL); – soja brasileira resistente ao herbicida glifosato (Roundup) (EMBRAPA
Trigo); – mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA/CENARGEN),
o qual foi recentemente liberado pelo Ministério do meio Ambiente para avaliação a campo.
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A área plantada com transgênicos cresceu 12% em 2007, com valores globais chegando a 700 milhões de dólares.
Área global histórica de cultivos transgênicos
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Área global de cultivos transgênicos por característica genética
Cultivos com duas ou mais características genéticas transgênicas e são se tornando cada vez mais populares,
ganhando daquelas variedades que mostram apenas resistência a insetos.
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Experimentos em campo com cultivos transgênicos na Europa
O número de experimentos em campo com transgênicos na União Européia aumentou discretamente (fonte: European Union, GMO Compass).
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Em 2007 o Brasil ultrapassou os EUA em novas áreas de plantio. A Índia continuou seu rápido crescimento, seguida de perto pelo Paraguai, África
do Sul e Uruguai. Em oposição, na Austrália as áreas com cultivos transgênicos continuam em queda.
Área global de plantios transgênicos no mundo, por país.
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Principais culturas
A vasta maioria do milho, da soja e de algodão plantado nos EUA é transgênico.
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Empresas envolvidas na transformação genética de
plantas
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Produtos produzidos em plantas
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PGMs em testes
Herbicidas
Alfafa
Algodão
Batata
Beterraba
Canola
Chicória
Linho
Milho
Morango
Soja
Tabaco
Trigo
Insetos
Alfafa
Algodão
Batata
Batata-doce
Beringela
Café
Cana
Canola
Milho
Soja
Vírus
Abóbora
Arroz
Batata
Beringela
Mamão
Melão
Petúnia
Soja
Tomate
Tabaco
Qualidade
Banana
Batata
Café
Canola
Cravo
Crisântemo
Kiwi
Soja
Tomate
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Nem tudo são Flores.....
http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./biotecnologia/index.html&conteudo=./biotecnologia/artigos/royal.html
http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./biotecnologia/index.html&conteudo=./biotecnologia/artigos/sementes.htmlRelatório britânico condena as sementes
transgênicas
Onde está a prova de que os alimentos transgênicos são, por natureza, inseguros?, pergunta a Royal
Society
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Limitações
• Silenciamento de genes
• Especificidade de promotores
• Número de cópias
• Efeito posicional
• Presença de genes marcadores
• Diferenças entre espécies/genótipos